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Abstract Bispecific antibodies represent a promising treatment option for acute myeloid leukemia (AML). We have recently described a novel T-cell bispecific antibody (TCB) targeting the intracellular tumor antigen Wilms tumor 1 (WT1) in the context of HLA-A*02 (Augsberger et al. Blood 2021). Based on these findings a multicenter first-in-human clinical trial was initiated in relapse/refractory AML (NCT04580121). Possible immune escape mechanisms against T-cell based immunotherapy are provided by the tumor microenvironment (TME) of the bone marrow by co-inhibition of T cells or stromal cells shielding leukemic cells from immune effector cells. To overcome the immunosuppressive effect of the TME and to enhance T-cell responses, we evaluated the combination of the WT1-TCB with an antibody fusion protein that targets a stromal antigen (Fibroblast-activation protein; FAP) and provides a positive costimulatory signal (4-1BBL) to T cells. FAP is upregulated on cancer-associated fibroblasts after remodulation of the bone marrow niche by leukemic cells, and the FAP specificity of the molecule therefore provides T-cell co-stimulation tightly restricted to the tumor niche. Efficacy of the combination (WT1-TCB + FAP-4-1BBL antibody fusion protein) was evaluated in co-culture assays over 4 days with primary HLA-A*02 + AML cells, healthy donor (HD) T cells and three NIH-3T3 fibroblast cell lines. NIH-3T3 cell lines were genetically modified to express low and high levels of FAP, respectively. Wild-type NIH-3T3 cells were included as control. Additionally, a control (Ctrl)-TCB and a Ctrl-4-1BBL antibody fusion protein recognizing a non-tumor target derived from the human germline repertoire were included. Enhancement of T-cell mediated cytotoxicity by the FAP-4-1BBL antibody fusion protein was evaluated by (1) specific lysis of primary AML cells, (2) upregulation of the T-cell activation markers CD25 and 4-1BB, (3) T-cell expansion calculated as fold change compared to day 0, and (4) Granzyme B-expression which was evaluated by intracellular staining. After 4 days of co-culture, with an E:T ratio of 1:2, we observed a mean specific lysis of 55.1±8.2% (±SEM; n=4) of primary AML cells mediated by HD T cells and WT1-TCB. Notably, this was reduced to 19.4±5.9% (±SEM; n=4) in the presence of NIH-3T3 cells. However, AML cell lysis was restored by the addition of the FAP-4-1BBL antibody fusion protein in the presence of high FAP expressing NIH-3T3 cells (mean specific lysis: 62.8±7.3%; ±SEM; n=4). Concomitantly, the FAP-4-1BBL antibody fusion protein led to increased expression of the activation molecules CD25 (MFI ratio: 22.1±5.3 vs. 10.4±1.3; ±SEM; n=4) and 4-1BB (MFI ratio: 10.4±6.0 vs. 2.1±0.3; ±SEM; n=4) on CD3 + T cells. Furthermore, lysis was accompanied by increased frequencies of granzyme B expressing T cells (45.0±2.5% vs. 16.1±5.3%; n=3). Importantly, the FAP-4-1BBL antibody fusion protein led to improved T-cell proliferation, especially of CD8 + T cells (fold change on day 4 vs day 0: 5.7±2.2 vs. 1.0±0.3; ±SEM; n=4). Overall similar observations were made in the presence of low FAP expressing NIH-3T3 cells. Taken together, we have established an in vitro model system mimicking the immunoprotective bone marrow TME using NIH-3T3 cells resulting in impaired AML cell lysis. Providing additional T-cell co-stimulation by a tumor-stroma targeted 4-1BB agonist, however, restored WT1-TCB-mediated cytotoxicity of primary AML cells in the presence of FAP expressing cell lines. Importantly, the combination overcame the immunosuppressive effect of the NIH-3T3 cells on T cells as further demonstrated by improved T-cell activation and expansion. The tumor-stroma targeted 4-1BB agonist therefore represents a promising combinatorial approach to enhance T-cell activity at the local tumor site and warrants further investigations in an in vivo model system. Disclosures Pulko: Roche: Current Employment, Current equity holder in publicly-traded company, Patents & Royalties. Claus: Roche: Current Employment, Current equity holder in publicly-traded company, Patents & Royalties. Buecklein: Pfizer: Consultancy, Honoraria, Speakers Bureau; Kite/Gilead: Consultancy, Honoraria, Other: Congress and travel support, Research Funding; Novartis: Consultancy, Other: congress and travel support, Research Funding, Speakers Bureau; Miltenyi: Research Funding; BMS/Celgene: Consultancy, Research Funding; Amgen: Consultancy, Honoraria. Umana: Roche: Current Employment, Current equity holder in publicly-traded company, Patents & Royalties. Klein: Roche: Current Employment, Current equity holder in publicly-traded company, Patents & Royalties. Subklewe: Novartis: Consultancy, Research Funding, Speakers Bureau; Klinikum der Universität München: Current Employment; Roche: Research Funding; Seattle Genetics: Consultancy, Research Funding; Pfizer: Consultancy, Speakers Bureau; Janssen: Consultancy; Takeda: Speakers Bureau; MorphoSys: Research Funding; Miltenyi: Research Funding; Gilead: Consultancy, Research Funding, Speakers Bureau; Amgen: Consultancy, Research Funding, Speakers Bureau; BMS/Celgene: Consultancy, Research Funding, Speakers Bureau.

Nel 2006, Takahashi e Yamanaka hanno dimostrato, per la prima volta, che i fibroblasti di topo possono essere riprogrammati ad uno stato simile a quello di cellule staminali embrionali con l’introduzione di una combinazione di quattro fattori di trascrizione. Queste cellule sono state chiamate “cellule staminali pluripotenti indotte” o “cellule iPS”. A differenza delle cellule staminali embrionali, l’uso di cellule iPS non solleva questioni etiche. In questo articolo, si fa riferimento in particolare a: 1. esperimenti preclinici condotti fino ad oggi utilizzando cellule iPS, 2. la creazione di linee cellulari a partire da cellule iPS ottenute da cellule adulte di pazienti affetti da varie malattie e 3. l’ottenimento di animali clonati da cellule iPS. Esperimenti preclinici sono stati condotti con l’anemia falciforme e modelli di topi affetti da emofilia. Nel gennaio 2009, Nelson et al. hanno ampliato le indicazioni terapeutiche delle cellule umane iPS, fornendo la prima prova per la riparazione di disturbi cardiaci. Diverse linee di cellule sono state ottenute da cellule umane iPS. Fino ad ora sono stato ottenuto linee di cellule in pazienti con sclerosi laterale amiotrofica, l’immunodeficienza combinata grave da deficit di adenosina deaminasi, la sindrome di Shwachman-Bodian-Diamond, la malattia di Gaucher di tipo III, la distrofia muscolare di Duchenne e Becker, il morbo di Parkinson, la corea di Huntington, il diabete mellito di tipo 1, la sindrome di Down (trisomia 21) e la malattia di Lesch-Nyhan, il morbo di Parkinson idiopatica, l’atrofia muscolare spinale, l’anemia di Fanconi, le malattie mieloproliferative, il diabete di tipo 1. Ottenere animali vivi da cellule iPS. In base alle nostre conoscenze, Kang et al. sono stati i primi a dimostrare che le cellule iPS possono autonomamente generare topi a termine tramite la complementazione della blastocisti tetraploide. Dopo gli esperimenti di Kang anche Boland et al. hanno prodotto 31 topi vivi da 37 linee di cellule iPS generate dai fibroblasti della pelle. L’uso di cellule di IPS per impedire l’uso di cellule staminali embrionali non può avere altro che una valutazione positiva da un punto di vista etico. Tuttavia, il loro utilizzo per produrre esseri umani clonati, se questo diventasse tecnicamente realizzabile, non sarebbe eticamente ammissibile. ---------- In 2006, Takahashi and Yamanaka demonstrated, for the first time, that mouse fibroblasts can be reprogrammed into an embryonic stem cell-like state by introducing combinations of four transcription factors. These cells were termed “induced pluripotent stem cells” or “iPS cells”. Unlike embryonic stem cells, the use of iPS cells has no ethical difficulty. In this article, we are going to refer specifically to: 1. preclinical experiments conducted to date using iPS cells; 2. the creation of cell lines from iPS cells obtained from the adult cells of patients with different diseases; and 3. the obtaining of cloned animals from iPS cells. Preclinical experiments have been conducted with sickle cell anaemia and haemophilic mice models. In January 2009, Nelson et al. expanded the therapeutic indications of human iPS cells by providing the first evidence for repair of heart disorders. Different disease cell lines obtained from human iPS cells. Up until now it has been obtained cell lines in patients with amyotrophic lateral sclerosis, adenosine deaminase deficiency-related severe combined immunodeficiency, Shwachman-Bodian-Diamond syndrome, Gaucher disease type III, Duchenne and Becker muscular dystrophy, Parkinson’s disease, Huntington’s disease, juvenile onset, type 1 diabetes mellitus, Down’s syndrome (trisomy 21) and the carrier state of Lesch-Nyhan syndrome, idiopathic Parkinson’s disease, spinal muscular atrophy, Fanconi anaemia, myeloproliferative disorders, type 1 diabetes. Obtaining live animals from iPS cells. To our knowledge, Kang et al. were the first to demonstrate that iPS cells can autonomously generate fullterm mice via tetraploid blastocyst complementation. After Kang’s experiments also Boland et al. produced 31 live mice from 37 iPS cell lines generated from skin fibroblasts. The use of iPS cells to prevent the use of embryonic stem cells cannot have anything other than a positive ethical evaluation. However, using them to produce cloned human beings, if this becomes technically feasible, would not be ethically admissible.

L’importanza del microambiente nella progressione metastatica iniziò a delinearsi sin dalla fine del XIX secolo attraverso la teoria del “seed and soil”, proposta dal chirurgo inglese Stephen Paget (1855-1926), secondo la quale determinati tumori sono in grado di formare metastasi in organi specifici, proprio come un seme trova il terreno giusto per poter attecchire. In termini molecolari, Paget intuì come la cellula tumorale potesse esprimere molecole riconosciute solo in determinati tessuti. Negli stessi anni, il patologo americano James Ewing (1866-1943) elaborò una teoria complementaria, la “anatomical-mechanical hypothesis”, suggerendo l’idea che i sistemi linfatico e vascolare svolgessero un ruolo preponderante nella diffusione passiva delle cellule verso un determinato sito anatomicamente accessibile. Nel 1982, Bissell delineò la teoria moderna secondo cui, alla base dello sviluppo del tumore, sia il microambiente sia le mutazioni genetiche svolgono un ruolo fondamentale. Negli ultimi decenni, infatti, accanto alla definizione di cancro come malattia genetica, si è delineata l’importanza fondamentale delle interrelazioni che intercorrono tra l'epitelio tumorale e il microambiente tissutale nel processo di tumorigenesi. Il tumore è da tempo considerato un tessuto complesso, le cui cellule mutate non agiscono da sole durante la progressione del cancro, ma reclutano le normali cellule circostanti come collaboratori attivi per instaurare un fenotipo neoplastico. Se da un lato l’instabilità genomica dei tumori garantisce loro un vantaggio evolutivo continuo, permettendo a cellule sempre più resistenti e aggressive di sopravvivere alle terapie, dall’altro la loro natura malleabile ha evidenziato la necessità di attuare strategie multiple: molti studi pre-clinici e clinici hanno suggerito l’efficacia di terapie combinate che abbiano come target non solo le cellule tumorali, ma anche le componenti del microambiente e, in particolare, quelle dello stroma.
The relevance of the microenvironment in metastatic progression began to take shape since the late nineteenth century through the theory of the "seed and soil", given by the English surgeon Stephen Paget (1855-1926), according to which certain cancers are able to form metastases in specific organs, just like a seed finds the right soil to take root. In molecular terms, Paget understood as cancer cell could express molecules recognized only in certain tissues. In the same years, the American pathologist James Ewing (1866-1943) developed a complementary theory, "anatomical-mechanical hypothesis ", suggesting that the lymphatic and vascular systems could play a predominant role in the passive diffusion of cells toward a particular site anatomically accessible. In 1982, Bissell delineated the modern theory that, at the basis of tumor growth, both the microenvironment and the genetic mutations play a key role. In recent decades, in fact, next to the definition of cancer as a genetic disease, it has outlined the fundamental importance of the interrelationships that exist between the tumor epithelium and tissue microenvironment in the process of tumorigenesis. The tumor has long been considered a complex tissue, the cells of which do not act alone during the progression of cancer, but they can recruit normal surrounding cells as active collaborators to establish a neoplastic phenotype. While the genomic instability of tumors guarantees them a continuous evolutionary advantage, allowing more and more aggressive and resistant cells to survive the therapies, their malleable nature has highlighted the need to implement multiple strategies: many pre-clinical and clinical studies have suggested the efficacy of combination of therapies targeting not only the tumor cells, but also the components of the microenvironment, in particular those of the stroma.

L’importanza del microambiente nella progressione metastatica iniziò a delinearsi sin dalla fine del XIX secolo attraverso la teoria del “seed and soil”, proposta dal chirurgo inglese Stephen Paget (1855-1926), secondo la quale determinati tumori sono in grado di formare metastasi in organi specifici, proprio come un seme trova il terreno giusto per poter attecchire. In termini molecolari, Paget intuì come la cellula tumorale potesse esprimere molecole riconosciute solo in determinati tessuti. Negli stessi anni, il patologo americano James Ewing (1866-1943) elaborò una teoria complementaria, la “anatomical-mechanical hypothesis”, suggerendo l’idea che i sistemi linfatico e vascolare svolgessero un ruolo preponderante nella diffusione passiva delle cellule verso un determinato sito anatomicamente accessibile. Nel 1982, Bissell delineò la teoria moderna secondo cui, alla base dello sviluppo del tumore, sia il microambiente sia le mutazioni genetiche svolgono un ruolo fondamentale. Negli ultimi decenni, infatti, accanto alla definizione di cancro come malattia genetica, si è delineata l’importanza fondamentale delle interrelazioni che intercorrono tra l'epitelio tumorale e il microambiente tissutale nel processo di tumorigenesi. Il tumore è da tempo considerato un tessuto complesso, le cui cellule mutate non agiscono da sole durante la progressione del cancro, ma reclutano le normali cellule circostanti come collaboratori attivi per instaurare un fenotipo neoplastico. Se da un lato l’instabilità genomica dei tumori garantisce loro un vantaggio evolutivo continuo, permettendo a cellule sempre più resistenti e aggressive di sopravvivere alle terapie, dall’altro la loro natura malleabile ha evidenziato la necessità di attuare strategie multiple: molti studi pre-clinici e clinici hanno suggerito l’efficacia di terapie combinate che abbiano come target non solo le cellule tumorali, ma anche le componenti del microambiente e, in particolare, quelle dello stroma.
The relevance of the microenvironment in metastatic progression began to take shape since the late nineteenth century through the theory of the "seed and soil", given by the English surgeon Stephen Paget (1855-1926), according to which certain cancers are able to form metastases in specific organs, just like a seed finds the right soil to take root. In molecular terms, Paget understood as cancer cell could express molecules recognized only in certain tissues. In the same years, the American pathologist James Ewing (1866-1943) developed a complementary theory, "anatomical-mechanical hypothesis ", suggesting that the lymphatic and vascular systems could play a predominant role in the passive diffusion of cells toward a particular site anatomically accessible. In 1982, Bissell delineated the modern theory that, at the basis of tumor growth, both the microenvironment and the genetic mutations play a key role. In recent decades, in fact, next to the definition of cancer as a genetic disease, it has outlined the fundamental importance of the interrelationships that exist between the tumor epithelium and tissue microenvironment in the process of tumorigenesis. The tumor has long been considered a complex tissue, the cells of which do not act alone during the progression of cancer, but they can recruit normal surrounding cells as active collaborators to establish a neoplastic phenotype. While the genomic instability of tumors guarantees them a continuous evolutionary advantage, allowing more and more aggressive and resistant cells to survive the therapies, their malleable nature has highlighted the need to implement multiple strategies: many pre-clinical and clinical studies have suggested the efficacy of combination of therapies targeting not only the tumor cells, but also the components of the microenvironment, in particular those of the stroma.

Le Ceroido Lipofuscinosi Neuronali (CLN) sono un gruppo di malattie degenerative dell’infanzia che colpiscono principalmente il sistema nervoso centrale (SNC). Le CLN appartengo al più vasto gruppo di patologie metaboliche da accumulo lisosomiale e sono caratterizzate dalla persistenza nel citoplasma di cellule neuronali, ma anche di altri tessuti periferici, di materiale di origine endo-lisosomiale che assume specifiche caratteristiche all’analisi ultrastrutturale. Le CLN possono interessare primariamente o secondariamente il compartimento lisosomiale, in quanto le proteine mutate nelle diverse forme di CLN sono localizzate non solo nei lisosomi, ma anche in altre strutture citoplasmatiche della cellula, quali ad esempio il reticolo endoplasmico. Attualmente, attraverso l’utilizzo di criteri clinici, patologici e molecolari, si possono distinguere dieci diverse forme di CLN; inoltre, sono stati finora clonati otto geni-malattia, codificanti per proteine a diversa localizzazione cellulare, le cui funzioni non sono ancora del tutto ben caratterizzate. Pertanto il termine CLN indica un gruppo eterogeneo di malattie neuro-degenerative, geneticamente determinate, che conducono prevalentemente ad un progressiva perdita di cellule neuronali. Un’importante tematica oggetto di studio nel campo delle CLN è la comprensione di quali meccanismi cellulari siano coinvolti in questo processo di morte neuronale, che nelle forme più gravi si manifesta nell’arco di pochi anni dall’insorgenza dei primi sintomi clinici. Lavori recenti hanno posto l’attenzione sugli effetti patogenetici che gli accumuli endo-lisosomiali possono avere sull’omeostasi e la sopravvivenza cellulare, dimostrando anche un coinvolgimento della via apototica caspasi-dipendente. Inoltre si sta cercando di comprendere meglio il ruolo dell’autofagia in questo processo di degenerazione, poiché esistono evidenze di un’attivazione di tale processo sia su campioni bioptici umani che in modelli sperimentali di malattia. L’obiettivo di questo progetto di dottorato è stato quello di analizzare il comportamento cellulare in vitro di linee di fibroblasti umani, derivate da biopsie cutanee di pazienti affetti da forme geneticamente determinate di CLN, in particolare dalle forme CLN1, CLN3, CLN5, CLN6 e CLN7. Tali linee di fibroblasti umani sono state analizzate in un protocollo di ‘crescita protratta’ allo scopo di determinare quali risposte cellulari possano attivarsi per far fronte a questo processo di invecchiamento cellulare ‘forzato’ in vitro, condizione che stressa il compartimento endo-lisosomiale già coinvolto nella malattia. Abbiamo posto l’attenzione principalmente sull’evoluzione del sistema endo-lisosomiale durante la crescita protratta in vitro; allo stesso tempo abbiamo analizzato la funzionalità mitocondriale e l’eventuale attivazione della via apoptotica. A tali scopi sono state impiegate sia metodiche morfologiche che biochimiche. L’indagine morfologica del compartimento endo-lisosomiale ha rivelato che l’invecchiamento cellulare delle colture CLN era associato ad un progressivo accumulo di elementi lisosomiali (corpi lisosomiali, autolisosomi e vacuoli otticamente vuoti), in misura diversa rispetto alle cellule di controllo. Inoltre si è potuto osservare che le colture CLN1 mostravano un diverso comportamento nel processo di accumulo citoplasmatico di corpi densi e di vacuoli a singola membrana rispetto alle altre colture CLN. In alcuni casi di specifiche forme, quali CLN3 e CLN6, l’indagine ultrastrutturale ha permesso di rilevare strutture a doppia membrana, gli autofagosomi, e questa evidenza ci ha condotti ad analizzare anche il processo dell’autofagia, che è risultata essere attivata in diverse linee cellulari, indipendentemente dalla specifica forma di CLN o dalla gravità della mutazione. Inoltre le alterazioni morfologiche del compartimento endo-lisosomiale, che avvengono nelle colture NCL, inducono una frammentazione del reticolo mitocondriale e una redistribuzione dei mitocondri polarizzati. Tuttavia, in condizioni basali non abbiamo mai osservato evidenze di attivazione della via apoptotica caspasi-dipendente in nessuna delle linee cellulari analizzate. Ciò nonostante, il trattamento con un agente chimico pro-apoptotico, la Staurosporina, ha rilevato una diversa attivazione della via apoptotica caspasi-3 mediata in almeno 2 linee CLN1 rispetto alle altre linee CLN e a quelle di controllo. I risultati emersi da questo studio suggeriscono che il processo autofagico è attivato nei fibroblasti CLN, probabilmente come meccanismo cellulare di recupero per far fronte allo ‘stress’ del compartimento endo-lisosomiale, accentuato dalla crescita prolungata in vitro. Allo stesso tempo i mitocondri, organelli essenziali per la sopravvivenza cellulare, sono secondariamente coinvolti in questo modello in vitro, mentre le evidenze indirette di un coinvolgimento della via apoptotica solo nelle linee di CLN1 sembrano essere in accordo con recenti lavori scientifici, che hanno sottolineato il ruolo dell’apoptosi nella patogenesi di questo gruppo di malattie.
Neuronal ceroid lipofuscinoses (NCL) are degenerative disorders of childhood, which affect the central nervous system (CNS). NCL belong to the wider group of lysosomal storage diseases and they are characterized by the accumulation of endo-lysosomal material with specific ultrastructural features, both in neuronal cells and other peripheral tissues. NCL arise from either primary or secondary involvement of the lysosomal compartment, since mutated NCL proteins reside not only in the lysosomes but also in other cellular structures, such as the endoplasmic reticulum. Over last 30 year ten NCL forms have been identified according to clinical, pathological and molecular criteria; moreover, eight NCL genes have been cloned, coding for proteins of specific and different functions. Therefore, today, NCL represents the acronym of a group of genetically different disorders of the CNS, leading to progressive shrinkage of the brain. The main issue in the NCL pathology is the comprehension of which cellular mechanisms are involved in neuronal cell death in these conditions. Recently the attention has been addressed mainly to the pathogenetic role that the abnormal storage may exert on the cellular homeostasis and survival, even through apoptotic cell death. Moreover, a role for autophagy is also under scrutiny, since morphological and molecular evidences suggest the activation of this cellular mechanism both in humans and animal models of disease. The aim of this doctorate project was to analyze in vitro the cellular behaviour of human genetically determined NCL fibroblasts derived from skin biopsies of patients affected with NCL forms, harbouring mutations on CLN1, CLN3, CLN5, CLN6 and CLN7 genes. Specifically, fibroblasts cell lines were analyzed in a ‘prolonged culture paradigm’ in order to assess which cellular responses could be activated by NCL cells, carrying a pre-existing endo-lysosomal dysfunction, to cope with the aging process in vitro. We focused our attention principally on the evolution of the endo-lysosomal system during the prolonged growth; at the same time, we checked the mitochondria functionality and the activation of the apoptotic pathway. Both morphological and biochemical tools were used. The morphological investigation of the endo-lysosomal system revealed that the aging of NCL cultures was associated with a progressive accumulation of lysosomal elements (lysosomal bodies, autolysosomes and empty vacuoles) in different manner as compared to controls. Furthermore, a different behaviour in the accumulation process of dense bodies and single membrane vacuoles was seen between CLN1 and the other forms. The detection of autophagosomes led to investigate the autophagic pathway, that was found to be activated in several cell lines, regardless the NCL forms and the severity of mutation. Moreover, the morphological alterations of the endo-lysosomal compartment occurring in all NCL cell lines affected the mitochondrial network and the distribution of polarized mitochondria as well. No evidences of apoptotic activation were seen under basal conditions during the prolonged growth in all the cell lines analyzed. However, the treatment with the apoptotic chemical inducer Staurosporine revealed a different activation of the caspase-3 dependent apoptosis in two CLN1 lines as compared to the other NCL forms and controls. These results suggested that autophagy is activated in NCL fibroblasts, probably as a rescue cellular program to cope with the endo-lysosomal stress, intensified by the prolonged growth in vitro. At the same time, mitochondria, a vital compartment for the cell survival, were secondary affected in this in vitro model, whereas the indirect evidence of involved apoptotic pathway in CLN1 only seems to be consistent with recent scientific reports.

Ruolo di composti fito-chimici ad azione antiossidante e antinfiammatoria in colture di fibroblasti del derma umano nella protezione dal foto-invecchiamento L’invecchiamento cutaneo è strettamente correlato allo stress ossidativo; le specie reattive dell’ossigeno (ROS) prodotti da vari stimoli esogeni e endogeni sono in grado di reagire e danneggiare le proteine, il DNA e i lipidi della componente cellulare (fibroblasti, cheratinociti) e della matrice extracellulare nella pelle. Tali danni radicalici sono alla base dei segni caratteristici dell’invecchiamento cutaneo come: rughe, cute lassa, e pelle sensibile. La radiazione UV rappresenta il principale fattori ambientali alla base della produzione di ROS, in particolare la radiazione UVA. Nel nostro lavoro testiamo materie prime innovative di natura fitochimica a potenziale attività antiossidante e anti-infiammatoria, contro il fotoinvecchiamento UVA-indotto nei fibroblasti. Lo studio ha previsto la realizzazione di un modello di fotoinvecchiamento dei fibroblasti irradiati con UVA (36 J/cm2) per valutare l’efficacia dei composti, singoli e in miscela, nel contrastare la formazione di ROS UVA-indotti impiegando sonde fluorescenti in associazione a metodologie citofluorimetriche. Inoltre è stato altresì valutato l’effetto anti-infiammatorio in seguito ad esposizione a LPS (10ng/ml per 3 h), tramite la valutazione dell’espressione di citochine proinfiammatorie (IL6, IL8, COX2 e MCP-1) in real time PCR. Lo studio ha consentito di identificare un sotto insieme di composti foto stabili, biocompatibili ed il loro range di concentrazione efficace nel prevenire il danno indotto da UVA ed in particolare le combinazioni più promettenti delle stesse per un futuro sviluppo di formulazioni di prodotti per l’industria cosmetica. Il progetto è stato supportato da ACRAF Angelini SpA e dalla Regione Marche nell’ambito del progetto EUREKA
Role of phytochemicals with antioxidant and anti-inflammatory capacity in preventing photo-aging in human dermal fibroblasts Skin ageing is strictly connected to oxidative stress, reactive oxygen species (ROS) produced either from exogenous and endogenous sources are able to react and damage proteins, DNA and lipids of the cellular (fibroblast and keratinocyte) and extracellular matrix component of the skin underlying the typical sign of ageing in this tissue (wrinkles, sagging, hypersensitivity). UV radiation, among environmental factors, represent a major source of ROS, in particular UVA. In our study we tested innovative phytochemical substances with potential antioxidant and anti-inflammatory activities for their ability to prevent UV-mediated oxidative damage to fibroblasts . In particular we developed a model of UV photo-damaged fibroblast using a UVA source at 36 J/cm2 where isolated substances or mixes of those were used to evaluate through flow-cytometric techniques their ability in lowering ROS intracellular content triggered by UV irradiation. Moreover, antinflammatory effect of the same substances was also evaluated following LPS exposure (10 ng/ml for 3h) by quantifying the expression of pro-inflammatory cytokines (IL6, IL8, COX2 and MCP-1) in real time PCR. The study allowed the identification of a sub set of photostable compounds, biocompatible and their optimal range of concentrations in preventing UVA mediated damage. In particular the identification of most promising combinations represent a first step toward the development of novel formulation for the cosmetic industry. The project was supported by ACRAF Angelini SpA and Regione Marche within the EUREKA project.

L'invecchiamento è caratterizzato da un adattamento morfo-funzionale, che influenza variamente i principali sistemi fisiologici, a seconda di una complessa interazione tra fattori genetici, ambientali e stocastica. Una delle principali sfide della ricerca sull'invecchiamento è spiegare come i meccanismi cellulari possono influenzare i fenomeni complessi osservati durante l'invecchiamento dell'organismo. In questo quadro, una migliore comprensione dei meccanismi epigenetici coinvolti nell'acquisizione del fenotipo senescente, potrebbe contribuire a sostenere le caratteristiche chiave del processo di invecchiamento e dello sviluppo delle malattie legate all'età. In primo luogo, abbiamo analizzato lo stato di metilazione del DNA del genoma nelle cellule endoteliali giovani e senescenti (HUVEC). Questa analisi ha fatto luce sul fatto che gli HUCOV senescenti sono stati caratterizzati da maggiori livelli di sequenze demetilate, situate in regioni a bassa densità genica. Poiché le regioni genomiche a bassa densità genica potrebbero essere arricchite da elementi retrotrasportabili (E), sia elementi brevi (SINE) che lunghi intervallati (LINE), che possono contribuire all'instabilità genomica attraverso la retrotrasposizione e l'induzione di rotture a doppio filamento. L'attivazione delle TE potrebbe essere un meccanismi molecolare che promuovono o influenzano la senescenza cellulare. Sulla base di questo presupposto, abbiamo studiato l'attivazione delle UTE in due diversi tipi di cellule, come le cellule endoteliali (HUVEC) e i fibroblasti (NHDF). Abbiamo concentrato la nostra analisi su alcune sottofamiglia LINE, come L1PA2, e su alcune sottofamiglia SINE, come Alu, che richiedono proteine L1 ORF2 per la retrotrasposizione. L'analisi dell'espressione dell'RNA ha rivelato un significativo aumento sia di Alu che di ORF2 in HUVEC e NHDF senescenti. Poiché un aumento delle copie di TE nel nucleo potrebbe indicare un aumento delle sequenze integrate, mentre una maggiore quantità di DNA di TE nel citoplasma dovrebbe indicare un aumento del processo di retrotrascrizione, che procede attraverso un intermedio cDNA, abbiamo analizzato anche la localizzazione cellulare della ssDNA derivata dall'attività retrotrasponibile. Una significativa riduzione delle sequenze di DNA di L1PA2, Alu e ORF2 è stata osservata nelle frazioni nucleari degli HUVEC senescenti, mentre nella frazione nucler NHDF delle cellule senescenti è stata osservata solo una significativa riduzione dell'L1PA2. È interessante notare che nelle frazioni cimalasmatiche, sia nelle cellule HUVEC che NHDF, è stato osservato un aumento significativo delle sequenze di DNA derivate da Alu, ORF2 e persino L1PA2. L'aumento della quantità di sequenze di cDNA L1PA2 non associate all'aumento dell'mRNA, suggerisce un meccanismo complesso nella retrotrascrizione delle TE nelle cellule senescenti. Infine, l'aumento della quantità di acidi nucleici cimalasmatici derivati dalle TE nelle cellule senescenti dovrebbe contribuire ad attivare i sensori citoplasmatici che inducono risposta antivilare e sintesi INF1. Sorprendentemente, l'NHDF senescente ha mostrato un aumento dell'espressione INF1, come previsto, mentre negli HUVEC senescenti l'espressione INF1 non è stata significativamente modulata. Questo risultato, suggeriscono che alcuni tipi di cellule, cioè le cellule endoteliali, potrebbero essere "tolleranti" durante la senescenza all'aumento della quantità di acidi nucleici citosolici fuori luogo, diventando più suscettibili alle infezioni virali.
Aging is characterized by a morpho-functional adaptation, variably affecting major physiological systems, depending on a complex interaction between genetic, environmental and stochastic factors. One of the main challenge of the research on aging is to explain how cellular mechanisms can affect the complex phenomena observed during organismal aging. In this framework, a better understanding of the epigenetic mechanisms involved in the acquisition of the senescent phenotype, could help to underpinn the key features of aging process and age-related diseases development. We firstly analysed DNA methylation status of genome in young and senescent endothelial cells (HUVECs). This analysis hightlighted that senescent HUVECs were characterizated by increased levels od demethylated sequences, located in regions with low gene density. Since genomic regions with mild-low gene density could be enriched of retrotransportable elements (TEs), both short (SINE) and long interspersed elements (LINE), that can contribute to genomic instability via retrotransposition and induction of double strand breaks. TEs activation could be a molecular mechanisms promoting or affecting cellular senescence. Based on this assumption, we studied TEs activation in two different cell types, such as endothelial cells (HUVECs) and fibroblasts (NHDF). We focused our analysis on some LINE subfamily, such as L1PA2, and on some SINE subfamily, like Alu, that require L1 ORF2 protein for the retrotrasposition. The analysis of the RNA expression revealed a significant increase of both Alu and ORF2 in senescent HUVEC and NHDF. Since an increase in TEs copies in the nucleus could indicate an increase of the integrated sequences, while an increased amount of TEs DNA in the cytoplasm should indicate an increase in the retrotransscription process, which proceeds through a cDNA intermediate, we analysed also the cellular localization of the ssDNA derived from retrotrasposable activity. Significant reduction of DNA sequences of L1PA2, Alu and ORF2 was observed in the nuclear fractions of senescent HUVECs, whereas in NHDF nucler fraction of senescent cells only a significant reduction of L1PA2 was observed. Interestingly, a significant increased of DNA sequences derived from Alu, ORF2 and even L1PA2 was observed in the cytoplasmatic fractions, both in HUVEC and NHDF cells. The increased amount of L1PA2 cDNA sequences not associated with increased mRNA, suggests a complex mechanism in the retrotrascription of TEs in senescent cells. Finally, the increased amount of cytoplasmatic nucleic acids derived from TEs in senescent cells should contribute to activate the cytoplasmic sensors inducing antivilar response and INF1 synthesis. Surprisingly, senescent NHDF showed increased INF1 expression, as predicted, whereas in senescent HUVECs INF1 expression was not significantly modulated. This result, suggest that some cell types, i.e. endothelial cells, could be “tolerant” during senescence to the increased amount of misplaced cytosolic nucleic acids, becoming more susceptible to viral infections.