Дисертації з теми "Facteur d'épissage"

Chez les organismes multicellulaires la diversité protéique dans chaque cellule et chaque tissu est obtenue initialement en régulant l’expression d’une partie des gènes d’un génome. Ces gènes sélectionnés peuvent ensuite être soumis à un épissage alternatif de sorte que certains exons sont retenus ou exclus dans l’ARNm final. Nous étudions les détails moléculaires de la protéine MEC-8, un facteur d’épissage tissu spécifique chez Caenorhabditis elegans. Les mutants MEC-8 sont responsables d’un phénotype insensible au touché chez Caenorhabditis elegans. Plus précisément, MEC-8 lie le pré-ARNm de mec-2 un composant des récepteurs mécanosensoriels afin de réguler la production d’un isoforme particulier nécessaire pour la transduction du signal mécanosensoriel. Des études portant sur le motif conservé de reconnaissance à l’ARN (RRM) chez des orthologues des vertébrés (RBPMS) et des insectes (couch potato, CPO) ont démontré la présence d’un motif d’homodimérisation dans le domaine RRM1 de MEC-8. Cependant MEC-8 contient aussi un second domaine RRM dans sa partie C-terminale, domaine qui n’est pas retrouvé dans les protéines RBPMS et CPO. Nous avons donc exprimé chaque domaine RRM de MEC-8 indépendamment ainsi que la protéine entière et ces constructions ont été utilisées pour diverses expériences biophysiques. Nous avons ainsi identifié la séquence de liaison optimale pour les deux domaines RRM1 et RRM2. Ces analyses ont aussi été menées sur les domaines homologues issus des protéines RBPMS et CPO qui présentent une forte affinité pour la même séquence d’ARN. Nous avons donc découvert que malgré des différences de fonction et de localisation les membres de la famille RBPMS lient tous le même motif d’ARN. Les détails atomiques des deux RRM en complexe avec leur motif de liaison ont été obtenus en utilisant de la spectroscopie RMN et de la cristallographique des rayons X. Les deux complexes RRM-ligand de MEC-8 présentent de surprenantes similarités dans leur architecture
In multicellular organisms, proteomic diversity in each cell and tissue is provided initially by selective expression of gene subsets from the total genome, which are further subjected to alternative splicing, such that a different pattern of exons can be retained or excluded in the final protein coding mRNA. We are investigating the molecular details of the tissue-specific splicing factor protein MEC-8 from the worm Caenorhabditis elegans. The MEC-8 mutant protein is responsible for a touch insensitive phenotype in Caenorhabditis elegans, relating to its role as an alternative splicing factor. More precisely, MEC-8 can bind to the mec-2 pre-mRNA, a component of mechanosensory receptor, to regulate the production of a certain isoform required for transducing the touch signal. Previous studies of the conserved RNA Recognition Motif (RRM) domain in orthologues from vertebrate (RBPMS) and insect (couch potato; CPO) have demonstrated a homodimerization motif in MEC-8 RRM1. However, MEC-8 also contains a second RRM domain in the C-terminus that is not found in the characterized RBPMS and CPO proteins. We have therefore expressed the independent RNA-binding domains of MEC-8 as well as the full-length protein and have used these constructs in a variety of biophysical assays. We identified the optimal RNA binding sequence for both the RRM1 and RRM2, and quantified the penalty of sequence variations. The investigation has also been extended to the homologous domains from human RBPMS and Drosophila CPO, which show a high affinity to the same RNA sequence. We therefore find that despite differences in function and localization, the members of the RBPMS protein family all bind to the same RNA motif. Atomic details of binding have also been obtained by using a combination of NMR spectroscopy and X-ray crystallography. The ligand-bound complexes reveal a surprising similarity in the architecture of the bound ligand for the first and second RRM domains from MEC-8

L'apoptose est un processus primordial pour le développement et le maintien des organismes eucaryotes. Elle est régulée à différents niveaux de l’expression génique. En fonction des stimuli intra- et extra-cellulaires, les facteurs de transcription régulent l'expression des protéines pro-survies et pro-apoptotiques. Ces facteurs de transcription facilitent la formation du complexe de pré-initiation (CPI) de la transcription pour activer la transcription. Le CPI est composé de l’ARN polymérase II et des facteurs généraux de transcription dont le facteur de reconnaissance du promoteur, TFIID. TFIID est un complexe multi-protéique composé de la protéine de liaison de la boîte TATA (TBP) et de 14 facteurs associés à TBP (TAFs) tel que TAF6 qui nous intéresse. TAF6 est exprimé sous 5 isoformes d'épissage alternatif (?, ?, ?, ð, ? ). TAF6? et TAF6ð sont deux entités antagonistes. Ils sont issus de l’épissage alternatif du deuxième exon de TAF6. Contrairement au variant majoritaire TAF6? qui a une activité oncogénique et antiapoptotique, le variant minoritaire TAF6ð est pro-apoptotique. À l’opposé de TAF6?, l’excision de la partie alternative du deuxième exon empêche la dimérisation de TAF6ð avec TAF9 dans TFIID (TFIID?). Les analyses de puce à ADN ont montré que l'impact sur le transcriptome de la perte de TAF6? est fortement distinct de l'impact causé par l'induction de l’isoforme pro-mort TAF6ð par des oligonucléotides antisens qui bascule l’épissage (SSO pour Splice site Switching Oligonucleotids). En outre, la déplétion du variant d'épissage majeur TAF6? aboutit à la perte de la viabilité des cellules. L'importance de l'induction de TAF6ð dans la mort cellulaire programmée et nos résultats précédents montrant que TAFð induit l’apoptose indépendamment de p53 dans de nombreux types de cellules cancéreuses, nous ont incités à entreprendre une dissection des éléments cis d'ARN qui contrôlent l'épissage du variant TAF6ð. Nous avons développé un système de minigène pour étudier les éléments cis d'ARN qui contrôlent l'expression de TAF6ð. Le minigène inclut la séquence génomique de TAF6 (exon 2 à exon 3) qui est dirigé par le promoteur CMV et il mime le patron d’épissage alternatif de TAF6? et TAF6ð endogène. Nous avons entrepris une analyse mutationnelle pour identifier les éléments cis de TARN pré-messager de TAF6. Nos données ont mis en évidence un site activateur d'épissage dans l’exon 2 constitutif. Dans l’intron, deux motifs polyC et polyG pourraient réguler l’épissage alternatif de TAF6ð. Ces motifs représentent des sites potentiels de liaison pour les protéines de liaison à l’ADN, hnRNP K et H respectivement. Nous avons donc testé l’effet de la surexpression de hnRNP K et H sur l’épissage alternatif de TAF6 et nous n'avons eu aucuns changement sur l’expression de TAF6ð endogène. De plus, nous avons constaté que la mutation d'un seul nucléotide qui semble perturber la structure secondaire d'ARN au site d’épissage proximal, renverse complètement le patron d’épissage. Cette mutation favorise le choix du site d’épissage distal (un site faible) à la place du site d’épissage proximal (TAF6?). Nos résultats suggèrent aussi qu’un élément régulateur d’épissage qui favorise TAF6? est présent dans l’exon 2 alternatif. Pour permettre l’identification des facteurs d’épissage influençant le choix du site d’épissage, nous avons créé un nouveau système d’épissage rapporteur. Notre nouveau vecteur contient la séquence génomique de TAF6 (exon 2 à exon 4) modifiée par l’introduction d’un codon stop prématuré (CSP) dans l’exon 2 alternatif et fusionné à la protéine EYFP. La combinaison des essais de transfections transitoires avec les SSOs ont été utilisés pour valider ce système contrôlé par cytométrie de flux. Dans le futur, ce système pourrait être utilisé pour produire une lignée stable afin d'identifier les facteurs d’épissage impliqués dans la régulation de l’épissage alternatif par un criblage d’inhibition (siRNA) ou de surexpression (ADNc). Donc, mon projet présente la première identification des éléments cis qui contrôlent l’épissage du facteur aussi bien que le développement d’un système d'épissage rapporteur créé pour permettre l’identification des protéines d'épissage qui régulent l’expression de TAF6ð. [symboles non conformes]

Les déficits en pyruvate désydrogénase (PDH) constituent une des premières causes d'hyperlactatémie primaire chez les enfants atteints de maladies neurologiques mitochondriales. Un blocage de cette enzyme entraîne une élévation parallèle de la lactatémie et de la pyruvicémie (et du lactate et pyruvate dans le liquide céphalo-rachidien), avec un rapport lactate/pyruvate normal. Ces dosages simples sont le point de départ biologique de la recherche de déficit en PDH pour tous les patients et la majorité des patientes. Nous présentons dans la première partie de ce travail les résultats obtenus au laboratoire pour une cohorte de 30 patients. Dix-huit d'entre eux présentaient un anomalie au niveau du gène PDHA1(Xp22. 1-Xp22. 2), quatre au niveau du gène PDHX (11p13). Pour un patient, nous avons diagnostiqué un déficit en E3 (7p31. 1-7q32), sous-unité commune à trois déshydrogénases mitochondriales dont la PDH. Pour sept patients, nous n'avons pas identifié d'anomalie moléculaire malgré des signes clinico-biologiques trés évocateurs. Ces données sont discutées et comparées à celles de la littérature. Une proposition de conduite à tenir pour le diagnostic, en fonction des nouveaux outils d'analyse enzymatique et moléculaire que nous avons développés. Sera développée à la fin du document. Dans la seconde partie, nous détaillons les investigations moléculaires plus approfondies des déficits en PDH. Nous présentons la mise en place d'outils préliminaires qui permettront l'étude de la fonctionnalité des nouvelles mutations faux-sens chez S. Cerevisiae. Nous revenons en détail sur la détection de deux délétions intragéniques (sur les gènes PDHA1 et PDH X), sur l'étude d'un mosaïcisme somatique chez un garçon présentant une mutation au niveau du gène PDHA1 et sur deux mutations entraînant une dégradation de l'ARNm par le mécanisme de "Nonsense mRNA mediated Decay" (gènes PDHA1 et E3BP). Nous terminons par un récapitulatif des anomalies d'épissage. Dans la dernière partie, nous étudions le mécanisme moléculaire d'une mutation ponctuelle intronique sur la séquence du gène PGHA1, conduisant à une rétention partielle d'un intron au niveau de l'ARNm. Nous montrons par épissage in vitro que cette mutation intronique (IVS7+26G>A)entraîne l'utilisation d'un site cryptique d'épissage, "GT" en position 46 et 47 de l'intron 7. Ainsi que l'avait prédit le programme "ESE finder", nous montrons par UV-crosslinking que la protéine SC35, facteur d'épissage de la famille des protéines SR, se fixe avec une plus grande affinité sur la séquence intronique mutée G>A (ESE), entraînant ainsi une utilisation préférentielle du site donneur cryptique. Nous montrons enfin, qu'une déplétion en SC35 (obtenue par l'utilisation de SiRNA) sur les fibroblastes du patient entraîne une disparition de l'ARNm anormalement épissé. Ce travail démontre l'implication de l'interaction SC35/ESE et le rôle des séquences introniques en pathologie humaine. De plus, il ouvre de nombreuses voies de recherche au niveau de la thérapie des anomalies d'épissage.

La protéine SC35 appartient à la famille des protéines SR (Ser/Arg-rich) connues pour être des régulateurs cruciaux de l'épissage alternatif et constitutif. L'activité de ces protéines est largement régulée par phosphorylation. Alors que plusieurs études ont mis en évidence une dérégulation de l'expression des protéines SR au cours du processus de carcinogenèse, peu de données existent à ce jour concernant les voies de signalisation cellulaire qui contrôlent l'expression et/ou l'activité de ces protéines dans les cellules cancéreuses. Pour la première fois, nous démontrons que SC35 est une protéine acétylée. Cette modification post-traductionnelle met en jeu l'acétyltransférase Tip60 et la déacétylase HDAC6. Nos données mettent aussi en évidence une connexion étroite entre la phosphorylation et l'acétylation de SC35 pour le contrôle de son niveau d'expression et de son activité. Nous démontrons enfin que ces modifications post-traductionnelles de SC35 sont critiques pour l'induction de l'apoptose en réponse aux agents génotoxiques et pour la mise en place d'un phénomène de sénescence en réponse au sodium butyrate, un inhibiteur d'histones déacétylases, dans différentes lignées cellulaires dérivées de carcinomes pulmonaires humains. La protéine E2F1 est un facteur de transcription qui participe au contrôle de la prolifération cellulaire en stimulant le passage des cellules en phase S du cycle cellulaire et est aussi capable d'induire l'apoptose. Au laboratoire, nous avons identifié la protéine SC35 comme une nouvelle cible transcriptionnelle directe de E2F1 et montré que les deux protéines coopèrent pour induire l'apoptose en réponse aux agents génotoxiques. Nous démontrons dans ce travail que SC35 gouverne aussi l'entrée et la progression en phase S en contrôlant certains gènes cibles de E2F1 impliqués dans ce contexte, tels que la cycline E. Nous mettons en évidence que la voie de signalisation cellulaire PI3K/AKT est impliquée dans le contrôle de l'expression de la cycline E médié par les deux protéines E2F1 et SC35, notamment via la phosphorylation de SC35. Finalement, nous décrivons une corrélation directe entre le niveau d'expression protéique de la cycline E et de P-SC35 dans une série de tumeurs pulmonaires neuroendocrines. L'ensemble de ces travaux identifie donc de nouvelles voies de signalisation contrôlant les fonctions cellulaires de SC35 et ouvre des perspectives quant aux conséquences biologiques découlant de la dérégulation de l'expression de SC35 dans les cancers bronchiques.

Plusieurs étapes successives sont essentielles àl'expression génique, parmi lesquelles l'élimination de séquencesinternes des transcrits primaires des gènes par lemécanisme d'épissage. Le complexe macromoléculaire quiréalise cette modification des ARN, le spliceosome, est assemblépar étapes par le biais d'interactions protéine-protéine,ARN-ARN et protéine-ARN. D'abord, la ribonucleoprotéineU1snRNP reconnaît le site d'épissage 5', SF1 (SplicingFactor 1) se lie au site de branchement et U2AF(U2snRNP auxilliary factor) au tract de polypyrimidine et ausite 3' (complexe E). U2AF favorise alors l'ancrage deU2snRNP au point de branchement, à la place de SF1, pourformer le complexe A. Ensuite, le recrutement du tri-snRNPU4/U6-U5 conduit au complexe B, et finalement, des réarrangementsstructuraux libèrent U1 et U4 snRNP conduisantau complexe catalytique C. U2AF est un hétérodimère,avec une sous-unité de 35 kDa (U2AF35) liée par son domaineUHM (U2AF Homology Motif) au domaine ULM(UHM Ligand Motif) de la sous-unité de 65 kDa (U2AF65).En outre, U2AF65 présente deux motifs de reconnaissancede l'ARN, un UHM C-terminal et un domaine N-terminal defaible complexité (LCD) riche en arginine-sérine (RS). Dansce modèle, le domaine RS de U2AF65 facilite l'hybridationde U2snRNA au point de branchement et son domaineUHM interagit successivement avec les domaines ULM deSF1 et d'une sous-unité de U2snRNP, SF3b155. In vitro, l'affinitéde U2AF65 pour SF1 est relativement plus élevée quepour SF3b155. Les domaines defaible complexité sont souvent impliqués dans la formationde condensats par séparation de phase liquide-liquide(LLPS), ce qui contribue en particulier à la compartimentalisationde complexes moléculaires dans des organites sansmembrane. Nous avions déjà montré que le domaine RS deU2AF65 favorise la formation de condensats via LLPS. Ici,nous avons recherché les déterminants de ce mécanismeet en particulier la force saline, la température, la longueurdu domaine RS et la composition en acides aminés. Laformation de condensats via LLPS est connue pour êtremodulée par des modifications post-traductionnelles.Nous avons montré que la phosphorylation du domaineRS module la formation de condensats. En utilisant desexpériences de pull-down et des immunoprécipitations,nous démontrons que la délétion du domaine RS empêchel'interaction de U2AF65 à la fois avec SF1 etSF3b155, ce qui indique fortement le rôle du domaine RSdans ces interactions in vivo.En parallèle, nous avons comparé, à l'aide de la spectroscopiepar résonance magnétique nucléaire (RMN), les interactionsdu domaine UHM avec les domaines ULM deSF1 et SF3b155. Les perturbations des spectres HSQC de15N-U2AF65-UHM indiquent que l'interaction de SF3b155avec U2AF65 implique au moins trois ULM distincts, enaccord avec la littérature. Inversement, un dosage de15N-SF3b155-ULM par U2AF65-UHM révèle des perturbationsdes déplacements chimiques d'au moins trois résidustryptophane de SF3b155. Ces spectres HSQC deSF3b155-ULM montrent que ce domaine reste désordonnéen présence de U2AF65, ce qui pourrait faciliter lareconnaissance de plusieurs ULMs et la formation decondensats de U2AF65 en présence de SF3b155.Finalement, nous avons entrepris une collaboration avecla société Synsight afin d'identifier, par criblage in silico,des molécules capables de perturber les interactionsUHM-ULM. Nous avons identifié une petite molécule(C13) interagissant avec le domaine UHM de U2AF65comme le montrent des analyses RMN. La combinaisonde données de RMN et des simulations de dynamiquemoléculaire (MD) a permis d’apporter des informationssur le mode de liaison du C13 dans la poche hydrophobedu UHM. Nous avons également montré que C13 peutmoduler la liaison de U2AF65 à SF3b155. Ces résultatsprometteurs suggèrent que les interactions UHM-ULMpourraient être ciblées pour lutter contre des maladiesspécifiques telles que les cancers
Gene expression requires many layers ofregulation among which splicing consists in the removalof sequences from primary transcripts. For thisprocess, a macromolecular machinery, the spliceosome,undergoes a dynamic assembly through protein-protein, RNA-RNA and protein-RNA interactionsin a stepwise manner. The simplified view of assemblyof the spliceosome is that first, the ribonucleoproteinU1 snRNP recognizes the 5’ splice site, Splicing Factor1 (SF1) binds the branchpoint sequence andU2snRNP auxiliary factor (U2AF) binds the polypyrimidinetract and 3' splice site (complex E). U2AF assiststhe recruitment of U2 snRNP to the branch point sequenceto form the A complex. Later, the recruitmentof U4/U6-U5 tri-snRNP forges the B complex, uponwhich, structural rearrangements release U1 and U4snRNPs leading to the catalytic C complex. U2AF is aheterodimer, with its 35kDa subunit (U2AF35) boundthrough its U2AF Homology Motif (UHM) domain tothe ULM (UHM Ligand Motif) of the 65kDa subunit(U2AF65). In addition, U2AF65 presents two RNArecognition motifs, a C-terminal UHM and a N-terminalarginine-serine (RS) rich low complexity domain(LCD). In this model, the RS domain of U2AF65 stabilizesthe U2snRNA-branchpoint sequence duplex andthe U2AF65-UHM domain recognizes successively theULM motif of SF1 and several ULMs in the U2snRNPsubunit SF3b155. In vitro, the affinity of U2AF65 forSF1 is relatively better than for SF3b155. LCD are often involved in the formation of condensatesthrough liquid-liquid phase separation (LLPS),which contribute for example to the compartmentalizationof biological molecules in membrane-less organelles.We have previously reported that U2AF65promotes the formation of such condensates viaLLPS. In line with this work, we have characterized theU2AF65 interactions supported by condensates formationrelatively to physicochemical parameters, includingsalt concentration and temperature, as wellas the length of the RS domain and its amino acidcomposition. Furthermore, LLPS can be modulatedby post-translational modifications. We havedemonstrated that the phosphorylation state of theRS domain modulates the formation of U2AF65condensates in vitro. Using pulldown experimentsand immunoprecipitations, we demonstrate thatthe deletion of the RS domain prevents the interactionof U2AF65 with both SF1 and SF3b155, whichstrongly indicates the actual contribution of the RSdomain in UHM-ULM interaction.In parallel, we compared, using nuclear magneticresonance (NMR) spectroscopy, the interactions ofthe hydrophobic core of the U2AF65-UHM domainwith the ULM domains of SF1 and SF3b155. Perturbationsof the 15N-U2AF65-UHM HSQC spectrumindicates that SF3b155 interaction with U2AF65-UHM is supported by at least three ULMs, which isconsistent with previous reports. In agreement, increasingthe stoichiometry of U2AF65-UHM against15N-SF3b155-ULM reveals stepwise changes inchemical shift perturbations of at least three tryptophanresidues, in the SF3b155-ULM spectrum. Interestingly,these HSQC spectra of SF3b155-ULMdid not reveal any structuration upon U2AF65-UHMbinding, suggesting a role of this dynamics to favourthe binding to several ULMs and the formationof U2AF65 condensates in the presence ofSF3b155.Lastly, we initiated a collaboration with the Synsightcompany in order to identify molecules ableto perturbate UHM-ULM interactions. Through insilico analyses, we obtained a small molecule (C13)displaying affinity for U2AF65-UHM as evidenced byNMR analyses. Through NMR and molecular dynamics(MD) simulations, we obtained insights intothe C13 binding mode in the U2AF65-UHM hydrophobicpocket. Using an in vitro binding assay, weshowed that C13 can modulate the binding ofU2AF65 to SF3b155. These promising results suggestthat UHM-ULM interactions could be targetedto fight specific diseases such as cancers

Les amplifications de répétitions de triplets CTG dans le gène DMPK humain sont à l'origine de la dystrophie myotonique de type 1 ou DM1. Les répétitions CUG présentes dans les ARNm DMPK séquestrent le facteur d'épissage MBNL1 au sein de foci nucléaires et dérégulent l'épissage des pré-ARNm cibles de MBNL1. Par ailleurs, 9 isoformes de MBNL1, produites par épissage alternative, coexistent dans les cellules. Dans un premier temps nous avons recherché quels exons constitutifs ou alternatifs étaient requis pour la reconnaissance des ARN, la régulation de l'épissage et la localisation cellulaire de MBNL1. Nous avons ensuite entrepris de rechercher par l'approche SELEX les séquences de haute affinité pour MBNL1. Nous avons ainsi identifié une séquence conservée de 12 nucléotides de long, contenant un seul motif de fixation pour MBNL1 et adoptant une structuration tige-boucle particulière. L'importance de cette structuration a été confirmée par l'existence de mutants compensatoires au sein des ARN sélectionnés. Finalement nous avons étudié les mécanismes de régulation de l'inclusion de l'exon 5 du pré-ARNm de la troponine T cardiaque humaine (hcTNT). Une approche in cellulo nous a permis d'identifier les séquences minimales requises pour la régulation de l'épissage en conditions normales et en présence des répétitions CUG. Au sein de ces séquences nous avons identifié 6 nouveaux sites MBNL1 dont nous avons montré l'importance fonctionnelle in cellulo et in vitro. Nous avons également mis en évidence l'implication d'autres séquences régulatrices dans la régulation de l'inclusion de l'exon 5 du pré-ARNm hcTNT et un rôle de la protéine hnRNP H dans ces régulations. L'ensemble de ces données apportent de nouveaux éléments d'information importants pour la compréhension de la DM1
Amplifications of CTG motifs in the human DMPK gene are responsible for Myotonic Dystrophy of type 1. The resulting CUG repeats in pre-mRNAs capture the MBNL1 splicing factor, leading to mis-regulation of MBNL1 pre-mRNA targets. Due to the recent discovery of MBNL1 and its numerous isoforms (9) resulting from alternative splicing, little is known on how MBNL1 regulates splicing and how a decreased level of available MBNL1 generates splicing miss-regulations. First, we defined which of the MBNL1 alternative and constitutive exons are required for: i) RNA binding, ii) splicing activity and, iii) MBNL1 sub-cellular localization. Second, for a more precise definition of the MBNL1 RNA binding properties, we performed SELEX experiments using a library of RNA stem-loop structures containing a 18-nt long randomized sequence. Its leads to the identification of 12-nt long sequence adopting a peculiar stem-loop structure, whose importance for MBNL1 binding was revealed by its preservation by compensatory base-pair mutations. Finally, based on the above data, we studied the mechanisms involved in regulation of hcTNT exon 5 splicing. By in cellulo assays, we defined the hcTNT pre-mRNA region required for both normal inclusion and for the trans-dominant effect of CUG repeats. Within this region, we identified six new potential MBNL1 sites and demonstrated their functional role by in vitro and in cellulo assays. We also identified several additional splicing regulatory elements involved in normal and CUG-deregulated exon 5 inclusion and already showed a role of hnRNP H in splicing regulation. Altogether, our data bring new information important for understanding the pathology

Les protéines U2AF65, CAPERα, PUF60 et SPF45 sont des facteurs d'épissage qui possèdent des domaines similaires appelés UHM et qui interagissent pendant les étapes précoces de l'épissage avec des protéines qui possèdent des domaines ULM, comme SF3b155. Par des approches biochimiques, nous avons mis en évidence la formation d'assemblages macromoléculaires par U2AF65 et CAPERα au contact du domaine multi-ULM de SF3b155. En diminuant les taux d'expression des facteurs d'épissage à domaines UHM avec des shRNA et en analysant par qPCR l'épissage de 65 exons cassette, nous avons identifié un rôle activateur de CAPERα, U2AF65 et PUF60 et un rôle répresseur de SPF45 dans l'épissage. Plus particulièrement, CAPERα et U2AF65 activent l'épissage des exons cassette présentant des séquences flanquantes en 5' riches en motifs polypyrimidine. De plus, ces séquences favorisent la formation des assemblages macromoléculaires de U2AF65 et CAPERα. Appuyés par ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel des interactions multivalentes conduisent à la formation d'assemblages macromoléculaires par CAPERα et U2AF65 ; ces complexes ont une affinité particulière d'une part pour les séquences introniques riches en motifs polypyrimidine et d'autre part avec le domaine multi-ULM de SF3b155. L'ensemble de ces interactions favorise la reconnaissance des sites 3' d'épissage
U2AF65, CAPERα, PUF60 and SPF45 are splicing factors that hold similar domains called UHM that interact during the early splicing steps with ULM domains proteins, such as SF3b155. Using biochemical approaches, we highlighted the formation of macromolecular assemblies by U2AF65 and CAPERα in contact with the multi-ULM domain of SF3b155. The inhibition of the expression of the UHM splicing factors by shRNA, followed by a qPCR analysis of 65 cassette exons led us to identify an activating role of CAPERα, U2AF65 and PUF60 and a repressing role of SPF45 in splicing. Particularly, CAPERα and U2AF65 activate splicing of cassette exons presenting long pyrimidine-rich 5' flanking regions. Moreover, these regions favor the formation of macromolecular assemblies of U2AF65 and CAPERα. On the basis of these results, we propose a model in which multivalent interactions lead to CAPERα and U2AF65 macromolecular assemblies; these assemblies present a particular affinity on one hand for long pyrimidine-rich introns and on the other one for the multi-ULM domain of SF3b155. All these interactions promote 3' splice sites recognition

Notre projet consiste à modéliser une forme spécifique de rétinite pigmentaire (RP) en utilisant des cellules iPS de patients. Nous avons d'abord optimisé un protocole de différenciation pour obtenir à partir de cellules iPS des organoïdes rétiniens avec une organisation structurelle plus proche de la rétine in vivo, permettant une maturation avancée des photorécepteurs. Cet outil nous a permis de récapituler entièrement le phénotype RP (dégénérescence des bâtonnets et des cônes), observé chez les patients présentant une mutation du gène RHODOPSINE, codant pour le pigment visuel. Nous avons ensuite utilisé la même approche pour comprendre la pathogénicité des RP liées à des mutations du gène PRPF31, codant pour un facteur d'épissage. Les organoïdes rétiniens ont résumé la dégénérescence des bâtonnets et la perte secondaire des cônes, observées chez les patients. Les cellules de l'épithélium pigmenté de la rétine présentaient également des défauts organisationnels et fonctionnels. Ces phénotypes dégénératifs rétiniens sont corrélés à un niveau d'expression plus faible de la protéine PRPF31, liant la pathogénicité à un mécanisme d'haploinsuffisance. Nous avons donc développé une stratégie d'augmentation du gène, en apportant une copie fonctionnelle de PRPF31 par CRISPR/Cas9 ou en utilisant un vecteur AAV, qui ont permis le sauvetage de la dégénérescence des cellules rétiniennes
Generation of retinal cells from human iPS cells offers the opportunity to study the effects of specific disease-causing mutations in an in vitro human system. Our project consisted of modeling specific form of Retinits Pigmentosa (RP) using patient iPS cells. We first optimized a differentiation protocol to obtain retinal organoids with a structural organization closer to the retina in vivo, allowing advanced photoreceptor maturation. Using this tool, we were able to fully recapitulate the RP phenotype (degeneration of rods and cones), observed in patients with mutation in RHODOPSINE gene, coding for the visual pigment. Then, we used the same approach to understand the pathogenicity of RP related to mutations in PRPF31 gene, coding for a splicing factor. Retinal organoids summarized the degeneration of mature rods and secondary loss of cones, as observed in patients. Furthermore, PRPF31-mutated retinal pigmented epithelial cells exhibited also structural and functional defective phenotype. These retinal degenerative phenotypes are correlated with a lower level expression of PRPF31 protein, linking causal mutations to an haploinsufficiency mechanism. We thus have developed a gene augmentation strategy, bringing an additional wild type copy of PRPF31 through CRISPR/Cas9 or using an AAV vector, that both allowed the rescue of retinal cell degeneration

Les protéines SR jouent un rôle crucial dans les processus de maturation des précurseurs d'ARNm, et plus particulièrement dans la régulation de l'épissage alternatif. Ce mécanisme permet la synthèse de multiples ARNm à partir d'un unique précurseur, et constitue un moteur essentiel de la diversité protéique chez les eucaryotes supérieurs. L'activité des protéines SR est régulée par la phosphorylation de leur domaine RS, riche en résidus arginines et sérines, par plusieurs familles de protéines kinases et dont l'ADN topoisomérase I (Topo I). En utilisant des cellules résistantes à un inhibiteur de la Topo I, nous avons observé que la résistance à la camptothécine est étroitement liée à l'extinction de l'expression de cette enzyme. L'absence de Topo I est corrélée à une hypophosphorylation des protéines SR et à des défauts d'épissage alternatif, ce qui suggère que l'activité kinase de la Topo I n'est pas redondante avec celle d'autres protéines et est nécessaire pour les processus d'épissage alternatif in vivo. Les protéines SR jouent un rôle essentiel au cours du développement, mais paradoxalement, leur fonction dans ce processus reste élusive. Chez la drosophile, la surexpression de diverses protéines SR, dans les disques imaginaux d'œil et dans le cerveau de larves, induit des défauts de développement de ces tissus. Nous avons identifié les ARNm associés à dASF/SF2 et à B52, et nous avons montré que la surexpression de ces deux protéines entraîne des altérations du profil d'épissage de certains d'entre eux impliqués, en particulier, dans le développement de l'œil et du cerveau. L'analyse du développement de ces deux tissus, au stade larvaire, a révélé que la surexpression de dASF/SF2 perturbe la différentiation de cellules de l'ommatidie, et que l'expression de B52-GFP interfère également avec le développement du cerveau. Les protéines SR régulent l'épissage des précurseurs d'ARNm en interagissant avec des séquences activatrices introniques ou exoniques, dont la fonction peut être altérée par des mutations, dans le cas de maladies génétiques. Nous avons étudié une mutation qui localisée dans l'intron 7 du gène E1α du complexe PDH, chez un patient atteint du syndrome de Leigh. Cette mutation créée une séquence spécifiquement reconnue par la protéine SC35 qui est responsable d'un épissage aberrant de l'ARNm E1αPDH à l'origine de la maladie. Nous avons montré que la réduction de l'expression de SC35 par ARN interférence permet de restaurer un épissage normal du gène E1αPDH dans des fibroblastes primaires de patients. Enfin, nous avons identifié des composés chimiques qui inhibent spécifiquement des évènements d'épissage alternatif dépendants d'une ou plusieurs protéines SR, in vitro et in vivo. De telles molécules pourraient ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter des pathologies humaines résultant de mutations génétiques qui affectent les processus d'épissage
SR proteins play a crucial role in messenger RNA maturation processes, and more precisely in the regulation of alternative splicing. This mechanism allows the synthesis of multiple mRNAs from a single precursor and is a major source of proteomic diversity. The activities of SR proteins are regulated by phosphorylation of the RS domain, rich in arginine and serine residues, by several protein kinases, including the DNA topoisomerase I (Topo I). Using cells resistant to a Topo I inhibitor, we have shown that resistance to camptothecin is correlated to the downregulation of the expression of this enzyme. Topo I depletion induces the hypophosphorylation of SR proteins as well as alternative splicing alterations, suggesting thereby that the kinase activity of Topo I is not redundant and is necessary for alternative splicing processes in vivo. As key splicing regulators, SR proteins also play an essential role during development, even if this function remains elusive. In drosophila, the overexpression of several SR proteins, in larval eye imaginal discs and brain, is responsible for developmental alterations of both tissues. We have identified candidate target mRNAs associated to dASF/SF2 and B52, and we have shown that overexpression of both SR proteins induces splicing patterns alterations for some of these mRNAs that are involved in eye and brain development. The analysis of both tissues, at the larval stage, revealed that overexpression of dASF/SF2 impairs cell differentiation within the ommatidia, when the overexpression of B52 also alters brain development. SR proteins regulate the splicing of mRNA precursors through binding of intronic or exonic enhancer sequences, which can be altered by mutations in genetic diseases. We have investigated the consequences of a mutation, located in the intron 7 of the PDH complex E1α subunit encoding gene, in a case of Leigh syndrome. This mutation creates an enhancer sequence specific for SC35, and is responsible for an aberrant splicing pattern of the E1αPDH mRNA causing the disease. Using RNA interference, we were able to restore the normal splicing pattern of the E1αPDH gene by reducing the expression level of SC35. At last, we have characterized small chemical molecules that specifically inhibit, both in vitro and in vivo, alternative splicing events regulated by one or more SR protein. Such molecules open exciting perspectives concerning therapeutical approaches to treat human diseases resulting from genetic mutations that impair splicing processes

La selection des sites 5' et 3' est une etape decisive dans l'epissage des arn pre-messagers. Bon nombre de facteurs impliques dans cette selection sont des proteines constituees d'un domaine de liaison a l'arn (domaine rrm) et d'un domaine riche en residu arginine et serine (domaine rs). Ce sont des proteines phosphorylees sur les residus serine. Apres avoir note qu'au moins un de ces facteurs subit un cycle de phosphorylation-dephosphorylation au cours de l'assemblage du spliceosome et de l'epissage, nous avons etudie le role de certains d'entre eux et des proteines de la snrnp u1 dans la selection du site d'epissage 5'. Nous concluons que la phosphorylation de la proteine u1-70k est critique pour la participation de la snrnp u1 a une etape pre-catalytique de la reaction d'epissage. Cette phosphorylation diminue aussi l'interaction de la snrnp u1 pour le site d'epissage 5'. La proteine u1-c interagit directement sur le site d'epissage 5'. L'extremite 5' du snrna u1 n'est pas requise dans la reconnaissance du site d'epissage mais est necessaire pour stabiliser l'interaction par appariement de bases. Nous avons cherche une kinase capable de phosphoryler de facon specifique le domaine rs des proteines sr. Nous avons decouvert que la dna topoisomerase i, en plus de son activite de relaxation des surtentions de l'adn, possede cette activite proteine kinase

L'inclusion de l'exon 16 permet la production d’une protéine 4. 1R fonctionnelle, essentielle à l’intégrité des membranes cytoplasmiques dans les érythroblastes mature. Dans notre étude, nous avons identifié KSRP comme protéine majoritairement fixée sur l’ESS de l’exon 16. Sa fixation requiert hnRNP A1 in vitro mais n’influe pas sur l’épissage de l’exon 16 de manière directe et indirecte. De plus, nous avons observé que dans les protéines hnRNP A/B uniquement hnRNP A2 régule in vivo l’inclusion de l’exon 16 dans le système érythroïde. Ces données ont permis de créer un modèle de régulation de l’épissage de l’exon 16 permettant de mieux apréhender les mécanismes d’épissage essentiels contribuant à la formation des cellules érythroïdes différenciées. Ce modèle montre que les protéines hnRNP A1, hnRNP A2 et KSRP font partie du complexe ribonucléoprotéique fixé sur l’ESS in vitro mais que seul hnRNP A2 inhibe l’inclusion de l’exon 16 in vivo
The inclusion of exon 16 in the mature protein 4. 1R messenger RNA (mRNA) is a critical event in red blood cell membrane biogenesis. It occurs during late erythroid development and results in inclusion of the 10kDa domain needed for stabilization of the spectrin/actin lattice. We here identified KSRP as a predominant splicing factor that binds to ESS16, a splicing silencer within exon 16. Its binding requires hnRNP A1 protein in vitro but does not affect exon 16 splicing in intact cells. In addition, we observed that the regulation of the exon 16 inclusion in the erythroid system is not affected by hnRNP A1 in vivo, but rather is modulated by hnRNP A2 in an isoform specific manner

Les ARNs ribosomiques (ARNr) et les ARNs du spliceosome contiennent de nombreux nucléotides modifiés. Chez les ARNr, les pseudouridines et les nucléotides 2'-O-méthylés sont synthétisés par les snoRNPs (small nucleolar RNPs). Chaque snoRNP est composée d'un ARN guide qui sélectionne les nucléotides cibles par formation d'un appariement. La construction et la caractérisation de banques humaines d'ADNc nous ont permis d'identifier 70 nouveaux ARNs guides putatifs. La majorité des nouveaux ARNs est nucléolaire et guide les modifications des ARNr. Certains ARNs s'accumulent dans les Cajal bodies et sont prédits pour guider les modifications des ARNs du spliceosome. Nos résultats suggèrent que les Cajal bodies soient le lieu de modifications des ARNs du spliceosome. Nous avons également identifié des ARNs guides qui ne possèdent pas de séquences complémentaires aux ARNr ou aux ARNs du spliceosome. Ainsi, ces ARNs peuvent également guider des modifications d'autres types d'ARNs cellulaires
Ribosomal RNAs (rRNAs) and spliceosomal RNAs contain many post-transcriptionally modified nucleotides. In rRNAs, pseudouridines and 2'-O-methylated nucleotides are synthesised by small nucleolar RNPs (snoRNPs). Each snoRNP contains a guide RNA carrying sequences that select the target nucleotides by formation of base-pairing interactions. By construction and characterization of human cDNA libraries, we have identified 70 novel putative guide RNAs. The great majority of the new RNAs accumulates in the nucleolus and is predicted to function in rRNA modification. Another group of the new guide RNAs accumulates in Cajal bodies and is predicted to direct modification of spliceosomal RNAs. Our results raised the possibility that Cajal body may provide the nuclear locale for modification of spliceosomal RNAs. We have also identified guide RNAs that lack complementarities to rRNAs and spliceosomal RNAs, indicating that guide RNAs also function in modification of other type of cellular RNAs

SOX9 est un facteur de transcription, appartenant à la famille des protéines à domaine HMG, et connu pour réguler la transcription grâce à la liaison de ce domaine à l'ADN. Au laboratoire, il a été montré que SOX9 possédait des propriétés anti-oncogéniques, cependant, de façon paradoxale, SOX9 est surexprimé dans les tumeurs colorectales. Nous avons mis en évidence l'existence d'un nouveau variant d'épissage de SOX9, MiniSOX9, qui possède un effet dominant négatif vis-à-vis de l'activité transcriptionnelle de SOX9. MiniSOX9 est fortement exprimé dans les tumeurs en comparaison avec le tissu sain adjacent à la tumeur. Nous avons émis l'hypothèse que MiniSOX9 pourrait donc avoir, dans les tumeurs, un effet antagoniste à SOX9 et s'opposer à ses propriétés anti-oncogéniques. Grâce à la mise en place de modèles cellulaires tumoraux de surexpression de SOX9 et MiniSOX9, inductibles à la doxycycline, nous avons mis en évidence que SOX9 réduit la prolifération, la migration et l'invasion cellulaire. De manière surprenante, MiniSOX9 ne possède aucun effet sur la prolifération cellulaire, suggérant que les effets de SOX9 pourraient être dus à son activité transcriptionnelle. En revanche, SOX9 ainsi que MiniSOX9 réduisent la capacité clonale des cellules et leur capacité à former des tumorosphères. Dans ce cas, il serait probable que SOX9 et MiniSOX9 modulent l'activité de protéines partenaires
SOX9 is an HMG transcription factor known to regulate transcription by binding of its HMG domain to DNA. We previously demonstrated that SOX9 has anti-oncogenic-properties but SOX9 is overexpressed in colon tumors when compared to adjacent healthy tissu. This overexpression appears paradoxical, unless its anti-oncogenic activity cannot be exert. In this study, we report the discovery of MiniSOX9, a new SOX9 splice variant, which is highly expressed in colon tumors. MiniSOX9 acts as a SOX9 dominant negative isoform. Our hypothesis was that MiniSOX9 antagonizes the SOX9 anti-oncogenic activity in tumors.Using tumors cells lines inducible for SOX9 and MiniSOX9 overexpression, we showed that SOX9 reduces cell proliferation, migration and invasion. Surprisingly, MiniSOX9 has no effect on cell proliferation, suggesting that SOX9 effects could be du to his transcriptionnal activity. However, SOX9 and MiniSOX9 decrease cell clonal ability and tumorosphere formation. In this case, it is likely that SOX9 and MiniSOX9 modulate the activity of proteins partners

TDP-43 est une protéine de liaison aux acides nucléiques qui joue un rôle essentiel dans le métabolisme de l'ARN. À l'état physiologique, un contrôle strict des niveaux d’expression de cette protéine est critique pour la fonction et la survie cellulaire. Une boucle d'autorégulation négative est à la base de ce contrôle du taux intracellulaire de TDP-43. Laquelle a été identifiée comme le constituant principal des inclusions observées chez une majorité des patients atteints de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) ou de Dégénérescence Lobaire Fronto-Temporale (DLFT). A ce jour, plus de 50 mutations faux-sensdu gène TARDBP/TDP-43 ont été décrites chez des patients DLFT/SLA, démontrant le rôle clé de TDP-43 dans ces pathologies neurodégénératives. Notons cependant que les conséquences fonctionnelles de ces mutations ne sont pas complètement déterminées. Plusieurs études suggèrent qu’une élévation des niveaux d’accumulation de TDP-43 pourraitparticiper aux mécanismes physiopathologiques. La modulation du cycle de production de TDP-43 pourrait donc constituer une nouvelle stratégie thérapeutique. Ce travail de recherche avait donc pour principal objectif d’identifier des modulateurs génétiques de la production de TDP-43 en utilisant un nouveau modèle de drosophile transgénique mimant les principales étapes d’autorégulation de TDP-43. Nous avons ainsi pu montrer que la modulation des niveaux d’expression de la protéine TCERG1 et de plusieurs facteurs d'épissage, parmi lesquels SRSF1, SRSF3 et SF3B1, influe sur les niveaux de production deTDP-43. Nous avons également montré que la présence des mutations DLFT/SLA n’altère pas la capacité de la protéine à s’autoréguler
TDP-43 is a DNA/RNA binding protein that plays an important role in RNA metabolism. In the physiological state, strict control of its expression levels is critical for cell function and survival. TDP-43 expression is tightly regulated through an autoregulatory negative feedback loop. This protein has been identified as the principal component of the inclusions observed in a majority of patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) or FrontoTemporal Lobar Degeneration (FTLD). To date, more than 50 missense mutations of the TARDBP / TDP-43 gene have been described in FTLD / ALS patients, demonstrating the key role of TDP-43 in these neurodegenerative pathologies. However, the functional consequences of TDP-43 mutations are not completely determined. Several studies suggest that high accumulation levels of TDP-43 may participate in pathophysiological mechanisms. The modulation of the production cycle of TDP-43 may therefore provide a new therapeutic strategy. The main goal of this research project was to identify genetic modulators of TDP-43 production by using a novel transgenic Drosophila model mimicking main steps of TDP-43 the autoregulatory mechanism. We identified several splicing factors, including SF2, Rbp1 and Sf3b1, as genetic modulators of TDP-43 production. We have also shown that modulation of TCERG1 expression levels affect TDP-43 production levels in flies. Finally, we found that FTLD/ALSlinked TDP-43 mutations do not alter TDP-43’s ability to self-regulate its expression and consequently of the homeostasis of TDP-43 protein levels

L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) reste un problème majeur de santé publique. L’infection chronique par le VHB peut conduire au développement d’une cirrhose et d’un carcinome hépatocellulaire (CHC). L’ARN pré-génomique du VHB (ARNpg), matrice de la réplication virale, peut aussi subir un épissage alternatif dans les hépatocytes. L’ARN simple-épissé SP1 (ARNSP1) est le variant majeur détecté. L’ARNSP1 génère des particules virales défectives (VHBd) et code la protéine HBSP (HBV splicing-generated protein). Des études récentes ont démontré que la proportion de VHBd dans le sérum augmente lors de la progression de maladies hépatiques et précède le développement de CHC. Notre équipe ainsi que d’autres ont décrit qu’HBSP pouvait pirater les voies de signalisation intervenant dans l’immunité innée et limiter l’étendue de l’inflammation du foie. Le but de notre étude est de comprendre la régulation de l’épissage alternatif viral et cellulaire au cours de la pathogenèse hépatique. Nous avons montré:1) une diminution du recrutement immunitaire et une réduction de la fibrose hépatique les souris exprimant HBSP régulée par épissage alternatif. 2) dans 6 modèles murins différents une régulation de l’expression des facteurs épissage variable selon la maladie du foie et définissant une signature spécifique. Cette régulation de facteurs d’épissage et de l’épissage alternatif a été observée dans les CHC de patients. En conclusion, nos résultats soulignent l’impact de l’atteinte hépatique sur l’expression des facteurs d’épissage, lesquels pourraient contribuer à réguler à la fois l’épissage viral et cellulaire et par conséquent, la progression de la pathogenèse hépatique
Hepatitis B virus (HBV) infection remains a major public health problem with 250 million chronic carriers worldwide. Chronic HBV infection may lead to the development of cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). HBV pregenomic RNA (pgRNA), matrix of viral replication, could also undergo alternative splicing (AS) in hepatocytes. The singly spliced SP1RNA is the major HBV spliced variant detected. SP1RNA generates defective viral particles (dHBV) and encodes for HBV splicing-generated protein (HBSP). Recent studies found the proportion of serum dHBV increased during the progression of liver disease and prior to development of HCC. In addition, our group and others revealed that HBSP hacked signaling pathways involved in innate immunity and limit the extent of liver inflammation. The aim of our study was to investigate the regulation of viral and cellular alternative splicing in the pathogenesis of liver diseases. Our data showed that 1) the modulated expression of splicing factors in HBV transgenic mice contributed to an increase of SP1RNA encoding for HBSP. In HBSP transgenic mice, HBSP expression led to the decrease of inflammatory mono/macrophages recruitment and consequently impaired liver fibrogenesis. 2) the pattern of selected splicing factors expression varied according to liver disease in mouse models, and overexpression of splicing factors and enhanced alternative splicing of target genes were observed in HCC tumors. In conclusion, our data highlighted the impact of liver diseases on the expression of splicing factors which may contribute to regulate both viral and cellular splicing events and consequently the progression of liver pathogenesis