Дисертації з теми "Expression à la surface de la levure"
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Pruvost, Tiphanie. "Ingénierie moléculaire de la réactivité croisée inter-espèces d’anticorps thérapeutiques par Yeast Surface Display." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2023. http://www.theses.fr/2023UPASQ074.
Анотація:
Le succès des anticorps monoclonaux comme outils thérapeutiques s'explique en partie par leur grande spécificité pour leur cible. Celle-ci implique souvent qu'un anticorps développé contre une cible humaine échoue à la reconnaître chez les espèces utilisées lors des essais précliniques. L'objectif de ces travaux est de développer une méthode d'ingénierie de protéine permettant à un anticorps de reconnaître un antigène provenant d'espèces différentes en utilisant comme modèles deux anticorps reconnaissant la protéine LAMP1 humaine mais pas ses versions murine et simienne. Durant ce projet le principe de mutagénèse exhaustive à l'acide aminé près (DMS) est couplé à l'expression de protéines à la surface des levures (YSD) ainsi qu'à la cytométrie en flux. Une première partie détaille l'utilisation de la combinaison de ces techniques pour l'identification des épitopes des deux anticorps sur LAMP1 humain. Les acides aminés situés dans les épitopes ont alors pu être comparés à ceux des protéines murine et simienne ce qui a permis d'expliquer l'absence de reconnaissance pour ces deux protéines. La seconde partie décrit la stratégie d'ingénierie protéique développée sur ces deux anticorps. L'expression des banques de DMS à la surface des levures a permis de sélectionner des mutations améliorant la reconnaissance croisée de LAMP1 sans affecter la fonctionnalité de l'anticorps. Ces mutations ont alors été combinées dans une nouvelle banque qui a été à nouveau criblée à plusieurs reprises pour en extraire les variants les plus promoteurs. L'affinité de ces variants pour différents orthologues de LAMP1 a pu être évaluée afin de confirmer l'efficacité de la stratégie grâce à laquelle plusieurs variants cross-réactifs ont pu être obtenus pour les deux anticorps étudiésSuccess of the monoclonal antibodies as therapeutic tools is partly due to their high specificity for their targets. Because of this high specificity antibodies developed against a human target often fail to recognize this target in animals used as models in preclinical trials. Thus, the goal of this study is to develop a protein engineering method aiming at conferring an antibody the ability to recognize a same antigen belonging to different species. To do so, two antibodies recognizing the human LAMP1 protein but not the murine and simian LAMP1 are used as models. In this project an exhaustive mutagenesis (DMS) monitored by Yeast Surface Display (YSD) and flow cytometry. The first part describes how these technics are combined in order to identify the epitopes of two antibodies on human LAMP1. The amino acids of epitopes are compared to those of murine and simian LAMP1 to explain the lack of recongnition of this two proteins. The second part focuses on the engineering strategy developped on the two antibodies. The expression of the DMS libraries in YSD allowed to select single mutations improving the cross-reactivity on LMAP1 without affecting the functionality of the antibodies. These mutations have been combined in a second library that has been screened for promissing variants. The affinities of these variants for differents human et simian LAMP1 orthologs has been measured to confirm the succes of the strategy. For each antibody many cross-reactive variants have been obtained
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Sivelle, Coline. "Conception et production d’anticorps anti-TNFa non immunogènes pour le traitement des maladies inflammatoires." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019SACLS603.
Анотація:
L’efficacité des anticorps anti-TNFα peut être particulièrement affectée par leur immunogénicité. Elle se traduit par la production d’anticorps dirigés contre la protéine thérapeutique (ADA) et induisant des effets indésirables. Pour l’adalimumab (Humira®), qui est l’anti-TNFα le plus utilisé, ce phénomène est observé chez plus de 30% des patients pour certaines pathologies. Les épitopes T responsables de cette immunogénicité sont principalement localisés dans les régions CDR impliquées dans l’interaction avec le TNFα. L’objectif de ce travail est de retirer les séquences épitopes T de l’anticorps sans altérer sa fonctionnalité. Afin de maitriser ce problème d’immunogénicité, ces travaux de thèse proposent d’utiliser le Yeast Surface Display (YSD) afin de contrôler la fonctionnalité de l’anticorps tout au long du processus de mutagénèse. Pour cela, une première étape de comparaison des différents formats d’expression d’anticorps en YSD a permis de définir le format d’affichage à utiliser pour la suite du projet. La stratégie de déimmunisation adoptée ensuite est basée sur la suppression des épitopes T. Dans un premier temps, elle réunit une approche de mutagénèse exhaustive (DMS) et l’utilisation d’algorithme afin d’identifier les substitutions délétères pour l’interaction HLA II/épitope T, mais neutre pour la fonction de l’anticorps. Dans un second temps, ces substitutions sont combinées dans des banques pré-enrichies en mutants fonctionnels. Des mutants ayant une immunogénicité potentielle réduite ont ensuite été sélectionnés à partir de ces banques. Plusieurs mutants de l’adalimumab à l’immunogénicité réduite selon l’algorithme de prédiction ont été identifiés et caractérisés. Ils possèdent tous une affinité augmentée pour le TNFα se traduisant par une activité au moins doublée par rapport à l’adalimumabEfficacy of anti-TNFα antibodies is well known to be affected by their immunogenicity. Some patients developp anti-drug antibodies (ADA) which can elicit adverse effects and neutralize the therapeutic protein. Adalimumab (Humira®), which is the most used anti-TNFα, is reported to be immunogenic for more than 30% of patients in some diseases. T-cell epitopes that account for its immunogenicity are mostly carried by regions implied in the interaction with TNFα. In the present work, we propose to remove T-cell epitopes from the antibody sequence while maintaining its functionality.To undertake this issue, this PhD project uses Yeast Surface Display (YSD) to monitor the affinity of the biologic during the mutagenesis process. To do so, a comparison of different expression formats of antibody in YSD has been performed in order to define the format that will be used for the deimmunization method. Then, the strategy chosen to reduce immunogenicity is based on T-cell epitopes removal. First, it merges deep mutational scanning and in silico HLA II binding prediction to identify substitutions deleterious for HLA II/T-cell epitopes interaction while neutral for the function of the biologic. Secondly, these substitutions were combined to obtain libraries pre-enriched with functional sequences. Mutants with reduced immunogenic potential were then selected from these libraries. Several mutants of adalimumab with reduced immunogenicity potential according to HLA II binding prediction were identified and caracterized. All of them show an increased affinity for TNFα associated with an improvement of activity of at least two fold in comparison to adalimumab
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Kudla, Bernard. "Construction d'un vecteur d'expression pour la levure Schizosaccharomyces pombe." Paris 11, 1987. http://www.theses.fr/1987PA112080.
Анотація:
Le vecteur d'expression pBK02 a été construit pour la levure Schizosaccharomyces pombe à partir d'un promoteur fort détecté chez cet organisme. Le plasmide navette E. Coli/S. Pombe pUZL contenant l'opéron bactérien lactose délété de ses séquences promotrices a été utilité. Il nous a permis de mesurer chez S. Pombe, l'activité promotrice de différente fragments génomiques de cette levure insérés devant l’opéron délété. L'insertion du plasmide appelé p 54/1 produit à l’état multicopies environ 5% des protéines sous la forme bêta-galactosidase active. Cette insertion a été choisie et le promoteur qu'elle contient, caractérisé. Les séquences chromosomiques homologues au promoteur ont été clonées et le transcrit TA correspondant a été mis en évidence. L'efficacité du promoteur 54/1 à diriger la synthèse d'un transcrit hétérologue (ARN LacZ) a été comparée à celle qu'il présente à diriger la synthèse d'un transcrit homologue (ARN TA). Le promoteur 54/1 ne semble pas affecté par la séquence dont il dirige la synthèse. Ce promoteur a été utilisé pour faire exprimer chez S. Pombe différents gènes hétérologues: lacZ de E. Coli, XylE de P. Putida, Phlr de E. Coli et amy de B. Licheniformis.
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Klonowska, Agnieszka. "Expression hétérologue de laccases du champignon Marasmius quercophilus chez la levure Saccharomyces cerevisiae." Aix-Marseille 3, 2000. http://www.theses.fr/2000AIX30085.
Анотація:
Marasmius quercophilus est un basidiomycète qui colonise la litière de chêne vert (Quercus ilex L. ). Ce champignon utilise plusieurs enzymes lui permettant de dégrader la lignine afin d'accéder à la cellulose. In vitro, il a une très forte activité d'oxydation des phénols consécutive à l'expression de plusieurs formes de laccases parmi lesquelles Lac1 est majoritaire. Ces enzymes à cuivre, utilisant l'oxygène moléculaire pour oxyder de très nombreux substrats, sont au centre de projets d'applications biotechnologiques. A partir de culture en conditions contrôlées nous avons purifié et partiellement caractérisé 3 formes de laccase autres que Lac1. Quatre membres de la famille multigénique qui code pour ces enzymes ont été clonés et séquencés. Parmi ceux-ci, lac1, le gène qui code pour la forme majoritaire, a été formellement identifié. Les ADN complémentaires correspondants à ces gènes ont été exprimés dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Deux d'entre eux, l'ADNc17 (lac1) et l'ADNc20, conduisent à la synthèse de laccases sécrétées et actives. .The basidiomycete Marasmius quercophilus colonizes the decaying litter of the evergreen oak (Quercus ilex L. ). This mushroom uses several enzymes to degrade lignin in order to have an access to cellulose. In vitro, it has a strong phenol oxidation activity related to the expression of several laccase isoforms among which Lac1 is predominant. Using molecular oxygen to oxidise numerous substrates, these copper enzymes are at the heart of many biotechnological projects. From controled culture conditions, we purified and partially characterized three laccase isoforms other than Lac1. Four members of the multigenic family which encodes laccases were cloned and sequenced. Among these genes, lac1, the structural gene encoding the major isoform, was formaly identified. The complementary DNA corresponding to these genes were expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Two of them, cDNA17 (lac1) and cDNA20, lead to the synthesis of secreted active laccases
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Lacour, Thierry. "Expression du cytochrome p45011 bovin dans la levure : identification d'un nouveau transporteur d'electrons." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 1997. http://www.theses.fr/1997STR13101.
Анотація:
Dans le cadre d'un projet visant a reproduire la voie de biosynthese des hormones steroides dans la levure, nous avons etabli l'activite in vivo du cytochrome p45011 bovin dans les mitochondries de levure. Ces travaux mettent en evidence une nouvelle proteine de levure, yadr, capable de transferer les electrons indispensables a l'activite catalytique du cytochrome. Des analyses genetiques et biochimiques permettent de caracteriser cette proteine.
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Boutabout, Mansour. "La Rétrotranscriptase de l'élément Ty1 de la levure Saccharomyces cerevisiae : Clonage, expression, fidélité." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2002. http://www.theses.fr/2002STR13157.
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Kribii, Rachida. "La squalène synthase d'Arabidopsis thaliana - caractérisation moléculaire et expression chez la levure Saccharomyces cerevisiae." Poitiers, 1996. http://www.theses.fr/1996POIT2390.
Анотація:
La squalene synthase (sqs) est l'enzyme qui catalyse la premiere etape specifique de la voie de biosynthese des sterols en condensant deux molecules de farnesyl diphosphate en une molecule de squalene. Nous avons isole un adnc codant la sqs de la plante arabidopsis thaliana. L'adnc presente un cadre ouvert de lecture codant potentiellement une proteine de 410 acides amines qui presente des similarites significatives avec les sqs de levures et de mammiferes. Cet adnc a ete exprime, sous controle d'un promoteur fort de levure, dans une souche de saccharomyces cerevisiae depourvue de l'activite sqs et auxotrophe pour l'ergosterol. L'etude a revele que l'adnc, codant la qsq vegetale, ne permet pas la complementation de la mutation de la souche de levure. Nous avons pu observer, en revanche, que cet adnc conduit a la production d'une sqs fonctionnelle et dont l'activite est localisee au niveau des microsomes. Nous avons demontre que le squalene forme par l'action de l'enzyme vegetale, n'est cependant pas utilise comme substrat de la squalene epoxydase de levure, et explique ainsi l'absence de complementation. Un adnc codant une proteine chimerique, dont la region c-terminale de l'enzyme de plante a ete remplacee par la sequence correspondante chez la levure, permet a la levure deletee au niveau du gene de la sqs, d'acquerir une prototrophie vis a vis de l'ergosterol, suggerant ainsi que cette region de l'enzyme de levure est necessaire pour l'acheminement du squalene dans la voie de biosynthese de l'ergosterol. D'autre part, l'analyse du genome d'arabidopsis thaliana, par la technique de southern, revele la presence, chez cette plante, de deux genes codant la sqs organises en tandem. Le gene de sqs, correspondant a l'adnc que nous avons clone, est exprime dans les differents organes de la plante et principalement dans les racines
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CORREDOR, RODRIGUEZ MAURICIO. "Diversite genetique, constitution chromosomique et expression genetique chez la levure fromagere halotolerant debaryomyces hansenii." Paris 11, 2001. http://www.theses.fr/2001PA112044.
Анотація:
Dans ce travail nous avons construit des sondes specifiques a partir de fragments de rapd (amplification aleatoire d'adn polymorphe), qui nous a permis de developper une methode rapide et sensible pour l'identification de la levure d. Hansenii. La sonde f01pro a permis de typer les souches de d. Hansenii des ecosystemes fromageres. Les profils obtenus par rflp (polymorphisme de la longueur des fragments de restriction) avec la sonde f01pro discrimine les souches de d. Hansenii et releve un polymorphisme notable. L'analyse de ce polymorphisme par la methode upgma a mis en evidence une diversite genetique importante chez d. Hansenii, tout a fais, independante de l'origine geographique et de type de production fromagere. Cette heterogeneite significative au sein de d. Hansenii a ete correle avec les profils chromosomiques obtenus par pfge (electrophorese en champ pulse). L'analyse de caryotypes en southern blot a permis de confirmer le caractere repetitif des sondes specifiques telles que f01pro, le retrotransposon copia-like et une sequence telomerique hypothetique. De plus, les genes ribosomiques ont ete retrouves dans le chromosome le plus grand. Nous avons evalue les sondes specifiques en ecologie moleculaire afin d'etudier des micro-ecosystemes de populations de d. Hansenii. L'hybridation sur colonie avec la sonde f01pro a ete efficace pour identifier d. Hansenii au milieu des autres especes. La pcr in situ avec les amorces specifiques obtenues a partir de retrotransposon copia-like identifie specifiquement les cellules de d. Hansenii. Cependant, l'hybridation in situ d'une sonde specifique de ce retrotransposon n'a pas permis d'identifier d. Hansenii. Par ailleurs, nous n'avons pas trouve de sonde specifique capable d'identifier a la fois les deux varietes de d. Hansenii. Comme d'autres auteurs, nous avons conclu, en utilisant des outils moleculaires, que la variete fabriyii serait mieux classee comme l'espece d. Fabryii. Finalement, nous avons voulu etudier un des role biochimique de d. Hansenii dans les produits laitiers et le fromage. Nous avons etudie en particulier l'activite -galactosidase et les genes associes a cette activite lac4 et lac12. L'activite -galactosidase dans d. Hansenii a ete determine comme constitutive et le gene de lactose permease lac12 a ete identifie et partialement caracterise.
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Helies-Toussaint, Cécile. "Expression des genes dans le testicule." Paris 11, 1996. http://www.theses.fr/1996PA11T012.
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Verdiere, Jacqueline. "Régulation de la synthèse de l'iso 2-cytochrome c chez la levure Saccharomyces cerevisiae." Paris 11, 1987. http://www.theses.fr/1987PA112281.
Анотація:
Chez S. Cerevisiae deux iso cytochromes l'iso1 et l’iso2 cyt c sont synthétisés. Ils sont codés par deux gènes indépendants : CYC1 et CYP3 ; ils sont exprimés respectivement à des taux très différents, 95% et 5%. La possibilité de sélectionner des mutations surproductrices diso2 cyt c nous a permis de mettre en place un système génétique qui comprend d'une part, des mutations du gène de structure CYP1 de type "promotor up" agissant en cis et d'autre part, des mutations indépendantes des gènes de structure agissant en transe, tout particulièrement au locus CYP1. L'étude génétique des allèles mutés aux différents loci ainsi que les interactions entre mutations agissant en cis et celles agissant en trans, nous a permis d'élaborer un modèle de régulation de l'expression du gène de structure de l’iso2 : CYP3. L'analyse moléculaire a montré que les quatre mutations obtenues au locus CYP3 sont des macros lésions affectant la région située entre 140 et 500 paires de base en amont de la région codante. Deux d'entre elles sont des insertions à des positions différentes de transposons de type TYl, la troisième est une grande délétion affectant également l'expression d'un gène voisin, enfin la dernière est une petite délétion. CYP1 est un des loci agissant en trans. Nous avons montré que le produit de ce gène se comporte comme un activateur. La construction de souches double mutantes, associant à chaque mutation de type "promoter up" un des allèles mutés au locus CYP1 a montré que deux des mutations cis actives restent sous le contrôle du produit codé par CYP1, alors que les deux autres lui échappent en partie pour l'une et totalement pour l’autre. Un des allèles mutés au gène CYP1 a été cloné. LB séquence d'un fragment de 5,3 Kb a révélé que celui-ci code pour une protéine potentielle de 1. 483 acides aminés qui présente les caractéristiques d'une protéine ''DNA binding". L'analyse par "orthern blot" révèle la présence de deux transcrits de 4,8 et 2,2 Kb approximativement. La transcription du gène n'est sensible ni à l'oxygène, ni à l'hème, ni au substrat carboné. Nous avons montré que HAP1 identifié par Guarente comme nécessaire à l'activité de l'UAS (Upstream Activating Sequence) du gène CYC1 et CYP1 sont le même gène. Nous avons également montré que le produit " de CYPl est médiateur des effets de l'hème sur l'expression de gènes dépendants de l'oxygène.
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Daudonnet, Sylvie. "Transfert et expression du gène de la farnésyl diphosphate synthase de levure chez le tabac." Poitiers, 1996. http://www.theses.fr/1996POIT2264.
Анотація:
La sequence codante du gene de la farnesyl diphosphate synthase (fpp synthase) de la levure saccharomyces cerevisiae a ete inseree dans le vecteur pbin19 sous le controle du promoteur du 35s du virus de la mosaique du chou-fleur (camv) dans le but de permettre son expression dans le genome d'une plante superieure: le nicotiana tabacum. Nous avons obtenu des tabacs transgeniques chez lesquels l'expression du gene etranger conduit a la synthese d'une fpp synthase fonctionnelle. Cette expression heterologue est correlee a quelques modifications du developpement et de la morphogenese mais surtout mise en relation avec une augmentation a la fois de la synthese des sterols et de la resistance envers certains inhibiteurs de cette meme voie de biosynthese (ibs). Cependant, chez certaines plantes transgeniques, bien que la presence du gene ait ete verifiee par pcr, sa transcription n'a pu etre mise en evidence. Les differents resultats obtenus sont discutes et quelques hypotheses proposees
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FLEURY, CHRISTOPHE. "Etude fonctionnelle des proteines decouplantes mitochondriales (ucps) par expression heterologue dans la levure saccharomyces cerevisiae." Paris 11, 1998. http://www.theses.fr/1998PA112237.
Анотація:
La proteine ucp1 (uncoupling protein-1) est un transporteur dans la membrane interne mitochondriale, specifique des adipocytes bruns thermogeniques. Ucp1 permet la rentree des protons dans la matrice mitochondriale et dissipe le gradient de protons genere par la chaine respiratoire. L'energie liberee par ce decouplage entre la respiration cellulaire et la phosphorylation de l'atp est dissipee sous forme de chaleur. Cette activite decouplante est inhibee par les nucleotides et activee par les acides gras libres. L'etude fonctionnelle d'ucp1 par expression heterologue dans la levure saccharomyces cerevisi a necessite la mise au point de techniques et protocoles, notamment de nouveaux outils (mutagenese, banque d'expression, cytometrie de flux). L'analyse de nombreux mutants a permis de mieux comprendre les relations entre la structure, la fonction d'ucp1 et les regulations de son activite. Nous avons ete conduits a postuler l'existence de nouveaux genes codant des proteines tres semblables a l'ucp1 de tissu adipeux brun. De nouveaux genes ont ete mis en evidence chez les mammiferes : - le gene ucp2, exprime dans de nombreux types cellulaires. - le gene ucp3, exprime principalement dans les muscles. - le gene ucp4, exprime preferentiellement dans le cerveau. Un gene homologue aux ucps de mammiferes a egalement ete identifie chez la pomme de terre (stucp) et arabidopsis thaliana (atucp). La constitution d'une famille de proteines decouplantes au sein de la superfamille des transporteurs mitochondriaux suggere que le decouplage des mitochondries doit revetir une importance physiologique et incite a reexaminer les mecanismes moleculaires de la thermogenese. La production de chaleur par tous les types de cellules est liee a un couplage imparfait de la respiration a la synthese d'atp. Les ucps sont donc de bon candidats pour expliquer les fuites de protons dans la membrane interne des mitochondries.
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Worapamorn, Wilairat. "Cell-surface proteoglycan expression by periodontal cells /." St. Lucia, Qld, 2001. http://www.library.uq.edu.au/pdfserve.php?image=thesisabs/absthe16097.pdf.
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Cool, Marc. "Etude des gènes codant pour le facteur d'élongation EF-1 alpha de levure : isolement et analyse du gène TEF2, contribution à la construction de vecteur d'expression de gène hétérologue à la levure." Paris 6, 1986. http://www.theses.fr/1986PA066363.
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Morris, L. "Expression of surface molecules on mouse foetal macrophages." Thesis, University of Oxford, 1988. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.235069.
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Lutton, Deborah A. "Variability of surface structure expression in Bacteroides fragilis." Thesis, Queen's University Belfast, 1991. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.334571.
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Al-Subaie, Abeer. "Genetic studies on surface expression of platelet glycoproteins." Thesis, University of Cambridge, 2014. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.648804.
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Bretes, Rodrigues Hugo. "Etude de la régulation du métabolisme des ARN messagers chez la levure Saccharomyces cerevisiae." Thesis, Paris 11, 2012. http://www.theses.fr/2012PA112209.
Анотація:
Au cours de la transcription, plusieurs facteurs sont assemblés sur les ARN messagers pour former des Ribonucléoparticules de messagers (mRNPs), et contrôler leur maturation, leur stabilité et leur devenir dans le cytoplasme. Afin d’assurer la production de protéines fonctionnelles, la cellule dispose de plusieurs mécanismes de régulation et de contrôle de qualité assurant la fidélité de l’information génétique transmise au niveau ARN messager et protéine.Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, un ensemble de protéines associées au pore nucléaire, incluant la SUMO protéase Ulp1, a été impliqué dans un contrôle de qualité des mRNPs régulant leur export vers le cytoplasme. Ces données suggéraient que l’export des ARN messagers pourrait être contrôlé par la modification post-traductionnelle par le polypeptide SUMO d’un ou de plusieurs effecteurs au sein des mRNPs. Afin de mieux comprendre ces processus, nous avons combiné plusieurs approches visant à identifier ces protéines SUMOylées. En particulier, nous avons mis en place un crible protéomique visant à identifier les protéines dont l’association sur les mRNPs dépend d’Ulp1. Ce crible nous a permis de mettre en évidence une régulation par Ulp1 de l’assemblage du complexe THO sur les ARN messagers. Ce complexe, recruté sur les gènes et les mRNPs, est connu pour contribuer à l’efficacité de la transcription, prévenir l’instabilité génétique liée à la formation d’hybrides ADN matrice – ARN messager (dénommés R-loops) et permettre l’export des mRNPs. En combinant l’analyse biochimique de différentes catégories de mRNPs à des expériences d’immunoprécipitation de l’ARN, nous avons montré que l’activité de la SUMO-protéase Ulp1 est nécessaire à l’association du complexe THO sur différents ARN messagers. De plus, nous avons montré que le complexe THO est SUMOylé sur le domaine C-terminal de sa sous-unité Hpr1, et que Ulp1 régule cette modification. Enfin, cet événement de SUMOylation du complexe THO régule son association avec les mRNPs. L’analyse fonctionnelle de mutants affectant la SUMOylation du complexe THO révèle que des défauts de SUMOylation de ce complexe compromettent ses fonctions dans la transcription sans affecter l’export. De manière intéressante, nous avons observé que la présence d’un intron sur des rapporteurs LacZ diminue la sensibilité de leur expression à des inactivations ou des défauts de SUMOylation du complexe THO. Ce phénotype entraine une augmentation relative des niveaux d’ARN pré-messagers dans ces mutants, un phénomène rendant compte de la fuite cytoplasmique apparente d’ARN non épissés précédemment observée dans le mutant ulp1. L’ensemble de ces données caractérise pour la première fois un rôle de la SUMOylation dans le contrôle de l’assemblage et du devenir cellulaire des mRNPsDuring transcription, several factors associate with mRNA to form messenger Ribonucleoparticles (mRNPs), thereby controlling their processing, their stability, and their cytoplasmic fate. To ensure the production of functional proteins from these mRNAs, eukaryotic cells contain numerous regulatory and quality control systems in order to prevent aberrant mRNP accumulation and export.In the yeast Saccharomyces cerevisiae, several nuclear pore associated proteins, including the SUMO isopeptidase Ulp1, have been involved in a mRNP quality control regulating their nuclear export. These data suggested that post-translational modification by SUMO of one or several mRNP components could regulate mRNA export. In order to understand the molecular mechanisms underlying this process, we undertook several approaches to identify these SUMOylated factors. In particular, we have set up a proteomic screen to identify mRNP components whose assembly onto mRNPs depends on Ulp1 activity.This proteomic survey revealed an Ulp1-dependent regulation of THO complex assembly to mRNPs. This complex, recruited to transcribed genes and mRNPs, is known to regulate transcription elongation by preventing DNA-RNA hybrids formation (termed R-loops), and mRNP export. Through a combination of proteomic analysis of mRNPs assembled in Ulp1 mutant cells, with RNA / chromatin immunoprecipitation experiments, we demonstrate that Ulp1 controls specifically the recruitment of the THO complex within mRNPs. SUMOylation analysis further reveals that Ulp1 targets the THO complex subunit Hpr1 on its C-terminal domain for deSUMOylation. We further show that this SUMOylation event regulates THO complex association within mRNPs. Finally, functional analysis reveal that impaired deSUMOylation of the THO complex do not affect mRNP export, but disturbs expression of LacZ reporter genes, a phenotype classically associated with THO complex dysfunction. Intriguingly, the transcriptional effect of inactivation or impaired deSUMOylation of the THO complex on LacZ expression is alleviated by the presence of an intron, providing a molecular basis for previously reported pre-mRNA leakage phenotypes. Our data therefore unravels for the first time a function of SUMO in the control of mRNP assembly contributing to proper mRNP homeostasis
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Sarramegna, Valérie. "Solubilisation et purification du récepteur u-opoi͏̈de humain surexprimé dans la levure méthylotrophe pichia pastoris." Toulouse 3, 2002. http://www.theses.fr/2002TOU30034.
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Enjalbert, Brice. "Régulation transcriptionnelle de Gsy2p, glycogène synthase majeure de la levure Saccharomyces cerevisiae." Toulouse, INSA, 2001. http://www.theses.fr/2001ISAT0003.
Анотація:
La levure Saccharomyces cerevisiae se doit de répondre aux stress et contraintes environnementales pour assurer sa survie et sa prolifération. Un de ces mécanismes de réponse adaptative est l'accumulation de sucres de réserve comme le glycogène lors d'une limitation nutritionnelle. Nous avons démontré que l'ensemble des protagonistes impliqués dans le métabolisme du glycogène est induit en un même stimulon par un phénomène d'induction transcriptionnelle à la sortie de la phase exponentielle de croissance sur glucose. La majorité de ces gènes possède des éléments STREs (STress Response Elements) dans leur promoteur qui permettent l'induction en réponse aux stress. Toutefois, les STREs ne sont pas nécessaires à l'augmentation d'expression des gènes du stimulon, en fin de phase exponentielle sur glucose. Cette induction nécessite au moins deux éléments de régulation dans le promoteur du gène GSY2, codant pour la glycogène synthase majeure de S. Cerevisiae. L'étude de diverses mutations affectant l'expression de GSY2 a abouti à la détermination d'un schéma de régulation complexe, impliquant trois systèmes de transduction du signal requis pour indiquer la présence ou le changement de substrat nutritionnel dans le milieu. Nous avons localisé les éléments du promoteur de GSY2 nécessaires au contrôle de la transcription du gène par ces voies de signalisation. La voie AMPc/PKA a démontré son rôle majeur sur l'établissement du phénomène d'induction et sur le niveau d'expression du gène. Enfin, les interférences sur la biosynthèse du glycogène liées à l'absence de régime respiratoire ont été étudiées. Ces travaux ont aboutis à la clarification du rôle de sucre de réserve et de la cinétique d'accumulation et de dégradation du glycogèneThe Yeast Saccharomyces cerevisiae, like most of the living organisms, has to cope with stress and environmental constraints to ensure its survival and proliferation. One of this adaptive response is the synthesis of glycogen during a nutritional limitation. We have demonstrated that the whole group of genes allowing the glycogen synthesis or degradation is induced at the same time, before the end of the exponential phase of growth on glucose. Most of these genes possess STREs (STress Response Elements) in their promoter which are responsible for their increase in expression due to a stress but not to the disappearance of glucose. This induction requires at least two elements in the promoter of the GSY2 gene, encoding the major glycogen synthase. Study of the main mutations affecting GSY2 expression has led to the unraveling of a fine regulation system implicating three nutritional signaling pathways. The elements regulating the GSY2 transcription have been localized and the cAMP/PKA has been demonstrated to be the main pathway controlling the gene expression and induction. Moreover, our work on the linkage between glycogen biosynthesis and respiratory requirement have allowed to precise the production and consumption kinetics of glycogen and its function as a sugar storage
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PEYRONNEAU, MARIE-ANNE. "Expression et caracterisation biochimique et spectroscopique de p450s humains de la famille 3a dans la levure saccharomyces cerevisiae." Paris 7, 1994. http://www.theses.fr/1994PA077076.
Анотація:
Les p450s constituent une superfamille de proteines a heme-thiolate impliquees dans l'oxydation primaire de substances endogenes importantes et d'un grand nombre de medicaments ou de procancerogenes. Afin d'etudier les proprietes specifiques de p450s humains de la famille 3a, une des famille majoritaire au niveau du foie, nous avons choisi de produire ces proteines dans la levure saccharomyces cerevisiae. Quatre variants du p450 3a4 humain (nf25, hpcn1, nf10 et nf25-t309a) et le p450 3a5 (hpcn3) ont ete exprimes dans la levure. Nous avons compare leurs capacites a reconnaitre et a metaboliser divers medicaments couramment utilises en clinique comme la nifedipine, la quinidine, la lidocaine ou la testosterone. Nous avons exprime l'adnc du p450 nf25 dans de nouvelles souches de levures genetiquement modifiees capables de surproduire les enzymes de transfert d'electrons associes au p450: nadph-p450 reductase de levure et cytochrome b#5 humain. Nous avons pu augmenter considerablement le niveau d'activite du p450 nf25 dans les microsomes de levure, d'un facteur 15 a 50 selon les substrats. Dans une troisieme partie, nous avons montre que differents alcaloides peptidiques de l'ergot de seigle constituaient une nouvelle classe de substrats ayant une affinite tres elevee pour le p450 3a4 humain (p450snf25 et hpcn1). Nous avons egalement montre que les p450s 3a4 et 3a5 humains catalysent l'hydroxylation regioselective d'un de ces ergopeptides, la bromocriptine, au niveau de la partie peptidique de la molecule. La derniere partie de ce travail consistait a proposer des conditions experimentales plus appropriees pour l'utilisation de microsomes de levure contenant une forme donnee de p450 humain. Ce travail illustre l'interet d'un tel systeme d'expression heterologue pour caracteriser des formes individuelles de p450s humains. Il permet d'etudier et de prevoir les premieres etapes du metabolisme hepatique de nouvelles molecules therapeutiques, les effets toxiques potentiels par activation metabolique et d'eventuelles interactions medicamenteuses
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Lemieux, Caroline. "Caractérisation de l'homologue de PABPN1 (Poly(A)-Binding Protein Nuclear 1) chez la levure à fission Schizosaccharomyces pombe." Thèse, Université de Sherbrooke, 2012. http://hdl.handle.net/11143/6241.
Анотація:
Deux classes de poly(A)-binding protein (PABP) lient la queue poly(A) des ARNm chez la plupart des mammifères: PABPC1 au cytosol et PABPN1 au noyau. PABPC1 stimule la traduction des ARNm tandis que PABPN1 stimule la processivité de la poly(A) polymérase tout en contrôlant la taille des queues poly(A). Il est à noter que les orthologues de PABPC1 sont bien caractérisés chez la levure, toutefois un homologue de PABPN1 n'avait jamais été identifié. Précédemment, le Dr. Bachand avait réalisé une purification par affinité avec la protéine d’arginine méthyltransférase I (Rmt1) couplée à la spectrométrie de masse, ce qui a permis d'identifier l’homologue de PABPN1 (Pab2) chez la levure à fission. Différentes expériences ont démontré que Pab2 est une protéine nucléaire non-essentielle qui lie spécifiquement des séquences poly(A) in vitro. Pab2 a été identifiée par son interaction avec Rmt1 et cette enzyme méthyle les arginines présentes dans le domaine riche en arginine de la protéine Pab2. Cette modification post-traductionnelle n'affecte pas la localisation nucléaire et l’affinité aux séquences poly(A) de Pab2. Par contre, les niveaux d’oligomérisation de Pab2 sont nettement augmentés lorsque Pab2 n’est plus méthylée. De plus, les ARNs provenant de cellules [Delta]pab2 sont hyperadénylés, ce qui corrobore avec la fonction de PABPN1 à contrôler la taille des queues poly(A) in vitro. Par la suite, j'ai caractérisé l’implication de Pab2 durant la maturation du pré-ARNm. Des essais d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) ont établi que Pab2 est recrutée co-transcriptionnellement aux gènes activement transcrits. De façon surprenante, mes études ont démontré que le recrutement de Pab2 précède celui d'un facteur impliqué dans le clivage et la polyadénylation. De plus, le recrutement de Pab2 dépend de l’ARNm naissant. Conséquemment, j'ai voulu identifier les protéines associées à Pab2. Ainsi, une purification d’affinité par tandem couplée à la spectrométrie de masse a révélé que Pab2 est associée à plusieurs protéines ribosomales ainsi que des facteurs de traduction générale. Ces données étaient étonnantes puisque la traduction des ARNm implique la protéine Pab1. Par conséquent, il était pertinent de vérifier le rôle possible de Pab2 sur la traduction. À priori, j ’ai confirmé que Pab2 fait la navette entre le noyau et le cytosol, ce qui concorde avec l’orthologue PABPN1. Par la suite, j'ai démontré qu’une fraction de la protéine Pab2 demeure associée aux ARNm activement traduits. Il devenait alors intéressant de connaître les cibles de Pab2. L’analyse génomique a établi que Pab2 régule l’expression de certains transcrits, tels que les gènes méïotiques, les snoRNAs et les rétrotransposons. Pour la suite de mes recherches, je me suis concentrée sur le gène codant pour la protéine ribosomale de la large sous-unité Rpl30-2, dont l’expression augmente de 4 fois en absence de Pab2. Il est intéressant de noter que le changement d ’expression de Rpl30-2 dans une souche [Delta]pab2 dépend de la présence de l’intron Rpl30-2. Mes travaux démontrent que l’expression de Rpl30-2 est régulée au niveau du pré-ARNm par Pab2 et Rrp6, une composante de l’exosome nucléaire. De plus, l’analyse du transcriptome par RNA-seq a établi que ce mécanisme permet de réguler l’expression d'une soixantaine de gènes qui sont inefficacement épissés. En ce qui concerne Rpl30-2, l’épissage de ce transcrit est ralenti par Rpl30-1, le paralogue de Rpl30-2. L’ensemble de mes travaux ont pu caractériser l’homologue de PABPN1 (Pab2) chez la levure à fission tout en établissant une fonction spécifique pour cette poly(A)-binding protein.
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Tavares, Rafaela. "Surface expression of Chromobacterium violaceum transaminase in Escherichia coli." Thesis, KTH, Skolan för bioteknologi (BIO), 2011. http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-49131.
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Brousse, Michel. "Analyse qualitative et quantitative du potentiel fermentaire de quelques souches industrielles de Levure et de son expression au cours de la fermentation alcoolique du moût de raisin." Bordeaux 2, 1985. http://www.theses.fr/1985BOR22013.
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LOULERGUE, CLARISSE. "Caracterisation d'adnc de racines de mais par expression dans des mutants de levure alteres dans le transport du fer." Paris 7, 1998. http://www.theses.fr/1998PA077252.
Анотація:
Le fer est un composant essentiel des systemes catalytiques de tres nombreuses proteines. Cependant, en depit de l'abondance du fer, sa disponibilite est tres reduite pour les plantes, notamment en milieu aerobie. Cette disponibilite restreinte est responsable d'un probleme nutritionnel majeur : la chlorose ferrique. Or les donnees moleculaires concernant le transport du fer racinaire chez le mais sont encore tres fragmentaires. Nous avons donc entrepris une recherche des adnc de racines de mais impliques dans le transport du fer. Une banque d'expression d'adnc de racines de mais carencees en fer pendant 10 jours a ete construite afin de complementer deux mutants de levure w103 et dey1453, deficients dans le transport du fer. La recherche d'adnc impliques dans le transport du fer a conduit a l'isolement de 3 adnc de mais. Deux d'entre eux, les adnc a (1,2 kpb) et b (1,1 kpb), ont ete isoles chez le mutant w103 conferant un avantage de croissance sur un milieu contenant 20m fe(iii)-dma. Des mesures d'accumulation de 5 5fe-dma dans le mutant w103-a et w103-b revelent une absence de transport du 5 5fe-dma. De plus, leurs fonctions restent inconnues. Cependant, la proteine a possede un motif conserve, re(g/l)e, retrouvee dans la permease ftr1 de s. Cereviciae (impliquee transport haute affinite du fer ferreux) et dans les ferritines animales et vegetales. Le troisieme adnc, 7e (2,5 kpb), a ete isole chez le mutant fet3fet4. Il code une proteine de 74. 2 kda qui possede des caracteristiques communes aux proteines de la famille myc. Il presente une homologie de 44% avec la proteine rap-1 d'arabidopsis thaliana, et une homologie de 25% avec la famille des proteines r de mais. L'expression de l'adnc 7e confere un avantage de croissance uniquement dans le mutant fet3fet4. Cette expression n'active toutefois pas l'entree de fer. Cependant, une accumulation de 30% de plus de 5 5fer en 24 heures n'est observee que chez le mutant. Des experiences d'hybridations moleculaires ont montre que 7e etait code par une petite famille de genes, et qu'il etait induit en condition de carence en fer, a la fois dans les racines et les feuilles de mais agees de 10 jours, de 20% et de 40% respectivement. Ces resultats ont permis de caracteriser une nouvelle sous-famille de facteur de transcription de mais de type myc.
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Hocquet, Clémence. "Etude du rôle de Condensine dans le contrôle de l'expression génique chez la levure Schizosaccharomyces pombe." Thesis, Lyon, 2018. http://www.theses.fr/2018LYSEN037.
Анотація:
Condensine est un complexe protéique organisateur du génome qui conduit l’assemblage des chromosomes et promeut leur transmission fidèle en anaphase. De nombreuses études ont rapporté des changements dans les niveaux des ARNs cellulaires quand Condensine est défaillante, suggérant un rôle pour Condensine dans la régulation de l’expression génique. Cependant, les mécanismes sous-jacents sont demeurés énigmatiques, et l’on ignore dans quelle mesure le rôle joué par Condensine dans l’expression génique est lié ou non à sa fonction dans l’organisation des chromosomes. Lors de ma thèse, j’ai étudié l’activité de Condensine dans la régulation de l’expression génique en utilisant la levure S. pombe comme organisme modèle. Contrairement à l’idée communément admise, mes résultats montrent que Condensine ne joue aucun rôle direct dans le maintien du transcriptome, ni en interphase, ni en mitose chez cette levure. En accord avec les études précédentes, j’observe des changements de niveau et de qualité des ARNs dans les cellules mutantes pour Condensine au sortir de la mitose ; des ARNs non codants et des ARNs aberrants, étendus en 3’, s’accumulent. En revanche, je démontre que ces changements sont la conséquence de défauts de transmission des chromosomes en anaphase. L’inactivation de Condensine cause la non-disjonction de l’ADN ribosomique et du nucléole, entrainant une déplétion de l’ARN-exosome des cellules filles, lesquelles accumulent alors des ARNs normalement dégradés par l’ARN-exosome. De façon cruciale, je montre qu’empêcher les anomalies de migration des chromosomes restaure une expression normale des gènes malgré l’inactivation de Condensine, démontrant que c’est l’instabilité chromosomique qui est source des changements d’expression génique observés quand Condensine est défaillante, et non le complexe Condensine en tant que tel. Ce travail remet en question le concept de régulation de l’expression génique par les complexes Condensine et appelle à la prudence lorsque l’on cherche à étudier les fonctions de ces complexes en dehors de la condensation de la chromatine en mitoseCondensin is a genome organiser that shape chromosomes and promote their accurate transmission in anaphase. Several studies have related changes in RNA level when Condensin is defective, suggesting that the complex has also a role in gene expression. However, the mechanisms have remained enigmatic and we still don’t know to what extent it is related to its role in chromosome organization. During my thesis, I studied the role played by Condensin in the regulation of gene expression using S. pombe as a model system. In contrast to previous studies, my results provide compelling evidence that Condensin plays no direct role in the maintenance of the transcriptome, neither during interphase nor during mitosis in this yeast. Accordingly to previous studies, I observed changes in RNA level in cells mutated for Condensin; non coding and 3’ extended RNA accumulate. However, I showed that the changes in gene expression in post-mitotic fission yeast cells that result from Condensin inactivation are largely a consequence of chromosome missegregation during anaphase, which notably depletes the RNA-exosome from daughter cells. Crucially, preventing karyotype abnormalities in daughter cells restores a normal transcriptome despite Condensin inactivation. Thus, chromosome instability, rather than a direct role of Condensin in the transcription process, changes gene expression. This work challenges the concept of gene regulation by canonical Condensin complexes and ask for caution when studying Condensin role outside chromosome condensation in mitosis
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Wong, Angela Ting Ting. "The effect of surface topography on gene expression of macrophages." Thesis, University of British Columbia, 2013. http://hdl.handle.net/2429/45058.
Анотація:
Osseointegration, the direct attachment of living bone to an implant surface, is necessary for the success of dental implant therapy. The surface topography of an implant influences cellular behaviour and osseointegration. In-vivo studies have shown that rough surface topographies are associated with accumulation of macrophages and subsequent bone formation (Chehroudi et al., 2009). Macrophages can exhibit classic inflammatory (M1) or alternative (M2) phenotypes that secrete different patterns of cytokines, chemokines and growth factors that affect wound healing. These experiments aim to characterize the phenotypes of unstimulated RAW264.7 macrophages grown on polished and SLA (sandblasted and acid-etched) surfaces using gene expression microarray technology. Whole genome microarray analysis showed differential expression of 199 genes on day 1 and 4943 genes on day 5 on SLA compared to polished surfaces. These genes were assigned to network categories related to cellular movement, immune cell trafficking, inflammation, cell-to-cell signalling and tissue development. Gene profiles were also compared to M1 and M2 macrophages obtained by stimulation with LPS and IL-4 respectively. Stimulated macrophages exhibited gene expression profiles consistent with their predicted phenotypes. Confirmation of upregulated expression of CCL4 and CCL7, macrophage chemoattractants associated with early inflammatory responses, was performed with quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR). CCL4 was significantly upregulated on SLA surfaces by a factor of 2.18 after 1 day, and CCL7 was significantly upregulated on SLA surfaces by a factor of 4.01 after 5 days. Both CCL4 and CCL7 were also significantly upregulated after 1 day by M1 and M2 stimulated macrophages on the microarray. These experiments show that unstimulated macrophages grown on SLA surfaces increase gene expression of macrophage chemoattractants, and exhibit an intermediate phenotype with a mixture of M1 and M2 characteristics.
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Cresswell, Joanne. "HIV modulation of MHC class II biosynthesis and surface expression." Thesis, University of Edinburgh, 1999. http://hdl.handle.net/1842/14742.
Анотація:
The aim of this project was to investigate the effects of HIV infection on class II biosynthesis and surface expression on professional and non-professional APC. To investigate the mechanism by which HIV controls class II expression in non-professional APC, a transfection model was designed for the expression of the HIV env gene, either singly, or co-transfected with an HIVΔenv plasmid, in HLA-DR4+ Chinese hamster ovary (CHO-DR) cells. It was shown that the env glycoproteins produced in this model were processed correctly in both single and double transfectants, and could be incorporated into virus particles released from env/HIVΔenv transfected cells. Env production in CHO-DR cells led to an increase in the surface expression of conformationally immature class II. This increase was not due to higher levels of class II biosynthesis, or more rapid intracellular processing. This shows that, in the presence of the HIV env glycoprotein, a greater proportion of cell-associated class II reaches the cell surface, and that env may act as a chaperone, stabilising immature class II molecules. Using Western blotting, it was also shown that class II, in the form of αβ dimers, could be incorporated into virus particles released from env/HIVΔenv-transfected CHO-DR cells. It is possible that this is dependent on association with env glycoproteins, suggested by the effect of env expression on surface class II expression. The results indicate that HIV has different effects, depending on the cell type under investigation. In professional APC, class II surface expression remains unchanged despite increased biosynthesis, whilst in non-professional APC there is increased surface class II on infected cells. Data from the single, and double transfection models indicate that these effects may be mediated by the HIV env glycoprotein.
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Boron, Mallorie Lynn. "Expression and Cell Surface Re-Engineering of Thrombomodulin on Macrophages." Cleveland State University / OhioLINK, 2020. http://rave.ohiolink.edu/etdc/view?acc_num=csu1588167014316672.
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Storlie, Patricia Ann. "Expression of the major surface protease (MSP) of leishmania chagasi." Diss., University of Iowa, 2009. https://ir.uiowa.edu/etd/891.
Анотація:
Leishmania chagasi is the causative agent of visceral leishmaniasis in South America. The most abundant glycoprotein on the surface of L. chagasi promastigotes is the glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored protease MSP (major surface protease), also called GP63. MSP is encoded by more than 18 tandem MSP genes on a single chromosome. MSP genes are classified according to unique sequences at their 3' ends and distinct expression patterns. The five MSPS genes (MSPS1, MSPS2, etc.) express 3.0 kb RNAs in stationary phase of promastigote growth in vitro in culture. The > twelve MSPL genes express 2.7 kb RNAs in logarithmic phase of promastigote growth, and the single MSPC RNA is constitutively expressed as two RNA species (2.6 and 3.1 kb) throughout promastigote growth. The progression from logarithmic to stationary phase is accompanied by an increase in parasite virulence for a mammalian host, and a 16-fold increase in the total MSP protein associated with the cell. As such, MSP has been called a virulence factor of leishmania. Little is known about the differences between isoforms of MSP proteins encoded by the three MSP gene classes, because they have a very similar amino acid sequences. The purpose of this thesis was to study the protein expression and localization of MSPS, MSPL, and MSPC in the promastigote and amastigote stages of the L. chagasi. We took three approaches to this problem. First, we produced constructs in which the fluorescent marker GFP was flanked by putative targeting sequences of the MSPs. Second, we generated Leishmania transfectants expressing Myc-tagged full-length MSPs and studied their localization in promastigote cells. Third, we generated antibodies to immunogenic peptides in the few regions with unique sequences that allowed us to distinguish between some of the MSP classes. One monoclonal anti-peptide antibody, named C51, recognized only MSPS1 and MSPL1. Data indicated that the product of the MSPC gene runs at a higher molecular size than products of the MSPL and MSPS genes, both of which localize to the promastigote surface. Overall the data set the stage for future studies of the properties and functions of specific MSP gene products.
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Lagorce, Arnaud. "Etude du mécanisme de compensation induit en réponse à des mutations pariétales chez la levure Saccharomyces cerevisiae." Toulouse, INSA, 2002. http://www.theses.fr/2002ISAT0021.
Анотація:
La paroi de Saccharomyces cerevisiae est une structure complexe composée de polymères de résidus de glucose (b-glucanes), de mannose (mannanes) et de N-acétylglucosamine (chitine). Pour étudier le mécanisme de compensation induit en réponse à une mutation pariétale, nous avons analysé cinq mutants affectés différemment dans la structure pariétale. Ce travail a dans un premier temps mis en évidence le rôle majeur du gène GFA1, codant pour une glutamine fructose-6P-amidotransférase, dans l'activation de la synthèse de la chitine induite en réponse aux mutations pariétales. Dans un second temps, nous avons analysé le mécanisme de compensation pariétale grâce à l'utilisation de filtres à haute densité. Cette approche a permis la caractérisation de la signature transcriptionnelle du mécanisme de compensation et l'identification d'un nouveau motif de régulation potentiellement fonctionnel : WCE (pour Wall Consensus Element). Enfin, l'analyse des promoteurs des gènes impliqués dans le mécanisme de compensation pariétale suggère que ce mécanisme soit gouverné par deux systèmes de régulation : la voie de maintien de l'intégrité cellulaire et la voie de réponse générale aux stressSaccharomyces cerevisiae cells are surrounded by a cell wall, which consists of a complex structure essentially composed of polymers of glucose units (b-glucans), of mannose units (mannans) and of N-acetylglucosamine units (chitin). In order to investigate on the cell wall rescue mechanism induced in response to cell wall mutations, we studied five mutants affected in different pathways of the cell wall metabolism. First, this work demonstrated the key role played by the gene GFA1, which encodes a glutamine fructose-6P-amidotransferase, in the activation of the chitin biosynthesis pathway in response to cell wall mutation. Secondly, we investigated the cell wall rescue mechanism using high density filters arrays. This approach led to the characterisation of the cell wall compensatory transcriptional signature and to the identification of a novel regulatory motif named WCE (for Wall Consensus Element). Moreover, promoter analysis of the genes implicated in the cell wall compensatory mechanism clarified the two regulatory pathways underlying this mechanism : the cell wall integrity pathway and the general stress response pathway
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PIGNEDE, GEORGES, and Giuseppe Baldacci. "Structure, fonction et expression du gene de la sous-unite catalytique de l'adn polymerase delta de la levure schizosaccharomyces pompbe." Paris 6, 1993. http://www.theses.fr/1993PA066205.
Анотація:
Pour etudier la replication de l'adn eucaryote, nous avons choisi comme systeme modele la levure s. Pombe. Dans un premier temps, nous nous sommes interesses a la structure du gene codant pour une enzyme cle de ce processus: la sous-unite catalytique de l'adn polymerase delta. Nous avons caracterise ce gene au niveau de sa sequence nucleotidique et nous avons realise des anticorps specifiques diriges contre une partie du produit de ce gene. L'utilisation du gene et des anticorps nous a permis, dans un deuxieme temps, de nous interesser a sa fonction et a son expression. Disposant du gene de la sous-unite catalytique de l'adn polymerase alpha de s. Pombe caracterise par ailleurs au laboratoire et d'anticorps diriges specifiquement contre cette proteine, nous nous sommes egalement interesses a la fonction et a l'expression de ce gene. Les resultats obtenus montrent: 1) les deux anticorps inhibent de maniere additive l'activite polymerase dans un extrait de s. Pombe. 2) la comparaison des sequences proteiques et les reactions des anticorps font apparaitre une tres forte conservation des levures aux mammiferes. 3) l'expression des pol alpha et delta de s. Pombe a montre: a) la pol delta exprimee chez e. Coli est toxique pour la bacterie. B) l'expression des pol alpha et delta dans des cellules d'insecte a l'aide de baculovirus recombinants permet d'obtenir des enzymes actives. C) l'etude de la surexpression des pol alpha et delta chez s. Pombe suggere des mecanismes de regulation de l'expression differents
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Li, Tong-Tong. "Molecular biology of cell reactions to surface topography." Thesis, University of Glasgow, 1998. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.312506.
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Montigny, Jacky de. "URA5 et URA10, deux gènes codant pour deux isoenzymes à activité OMP pyrophosphorylase chez la levure Saccharomyces cervisiae structure, expression, régulation /." Grenoble 2 : ANRT, 1988. http://catalogue.bnf.fr/ark:/12148/cb376166778.
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Sheader, Karen. "The architecture and control of variant surface glycoprotein gene expression sites." Thesis, University of Oxford, 2004. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.403985.
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Miller, Erin Suzanne. "Increasing Expression of Hepatitis B Surface Antigen in Maize through Breeding." DigitalCommons@CalPoly, 2015. https://digitalcommons.calpoly.edu/theses/1359.
Анотація:
The hepatitis B virus (HBV) is a common virus, with two billion people infected worldwide. It causes approximately 600,000 deaths each year, despite the availability of an effective vaccine since 1982. Maize as a platform for oral vaccination can supply a heat stable vaccine, which does not require syringes or trained personnel to administer. The Hepatitis B Surface antigen was transformed into maize and this seed was used to evaluate expression levels through the breeding process. The transgene was transferred into two elite maize inbreds by backcrossing. Highest expressing ears were selected each generation until approximately 99% commercial parent was obtained with a single gene coding for the vaccine present. Selected individuals were crossed to create hybrid plants. This work was done to create high expressing high yielding lines that could be used as a plant-based oral vaccine for Hepatitis B.
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Prudent, Sébastien. "Expression de l'aquaporine tonoplastique Bob TIP1 ;1 de chou-fleur chez la levure Saccharomyces cerevisiae : rôle dans la réponse cellulaire au stress hypo-osmotique." Dijon, 2005. http://www.theses.fr/2005DIJOS026.
Анотація:
L'osmorégulation joue un rôle important dans les réponses cellulaires aux stress osmotiques chez les plantes et les levures. Les aquaporines contribuent à l'ajustement osmotique en facilitant le transport d'eau ou de solutés à travers les membranes. Les gènes codant le canal à eau tonoplastique BobTIP1;1 sont régulés positivement durant le stress de dessiccation dans les tissus méristématiques de chou-fleur. Pour déterminer l'importance physiologique de BobTIP1;1, nous l'avons exprimé dans un mutant de la levure Saccharomyces cerevisiae osmosensible fps1. Nous avons montré que le défaut du transporteur de glycérol plasmalemmique de levure est complémenté par un ADNc de plante codant l'aquaporine BobTIP1;1 qui est localisée dans la membrane vacuolaire des cellules de levure complémentées. A notre connaissance, c'est la première fois qu'une aquaporine de plante localisée dans la membrane vacuolaire des cellules de levure est reliée à un phénotype d'osmorésistance à un choc hypo-osmotiqueOsmoregulation plays an important role in cellular responses to osmotic stress in plants and in yeast. Aquaporins contribute to osmotic adjustment by facilitating transport of water or solutes across membranes. The tonoplastic water channel BobTIP1;1 genes are upregulated during dessication stress in cauliflower meristematic tissue. To investigate the physiological importance of BobTIP1;1, we expressed it in a Saccharomyces cerevisiae osmosensitive mutant fps1. We showed that the defect in the yeast glycerol plasma membrane transporter transporter is complemented by a plant cDNA encoding the aquaporin BobTIP1;1 which is localized in the vacuolar membrane of the complemented yeast cells. To our knowledge, this is the first example of a plant aquaporin for which localization in the vacuolar membrane of yeast cells is related to an osmoresistant phenotype under hypo-osmotic shock
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Fégueur, Marc. "Régulation de l'activité squalène synthétase chez la levure saccharomyces cerevisiae : isolement du gene et détermination des modalités de régulation de son expression." Poitiers, 1991. http://www.theses.fr/1991POIT2317.
Анотація:
La squalene synthetase (ec. 2. 5. 1. 21) enzyme membranaire de la biosynthese, catalyse la transformation du farnesyl diphosphate en squalene, premier precurseur specifique des sterols. Le gene erg9 a ete isole chez le mutant fkerg9 de saccharomyces cerevisiae, affecte au niveau de la squalene synthetase, par complementation de la mutation erg9-1, a l'aide d'une banque d'adn genomique de levure. L'etude de l'activite squalene synthetase chez la levure et la synthese de squalene observee chez e. Coli porteuse du gene erg9 isole, nous a permis de conclure que le gene structural etait isole. L'analyse de la sequence nucleotidique du gene erg9 a mis en evidence un seul cadre de lecture de 1332 paires de base codant pour une proteine de 444 acides amines et de mr: 51. 600d. La sequence en acides amines deduite, presente des homologies avec la prephytoene synthase de rhodobacter capsulatus et l'analyse de la structure primaire de l'enzyme nous a permis de definir une partie c terminale hydrophobe et une partie n terminale semblable a l'invertase de levure. Le gene erg9 a ete localise sur le chromosome viii a 30 cm du cup1 et son expression est soumise a un controle de type transcriptionnel. La squalene synthetase n'est pas limitante dans la voie de biosynthese chez la levure par contre son integration au sein du reticulum est determinante sur l'activite enzymatique
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Bordonné, Rémy. "Structure et expression de genes mitochondriaux de la levure saccharomyces cerevisiae : etude de la maturation des produits de transcription du dna mitochondrial." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 1987. http://www.theses.fr/1987STR13187.
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Montigny, Jacky de. "Ura5 et ura10, deux genes codant pour deux isoenzymes a activite omp pyrophosphorylase chez la levure saccharomyces cerevisiae : structure, expression et regulation." Strasbourg 1, 1988. http://www.theses.fr/1988STR13198.
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Bordonné, Rémy. "Structure et expression de gènes mitochondriaux de la levure Saccharomyces cerevisiae étude de la maturation des produits de transcription du DNA mitochondrial /." Grenoble 2 : ANRT, 1987. http://catalogue.bnf.fr/ark:/12148/cb376031669.
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Li, Zhongyan. "Characteristics of platelet surface expression of glycoprotein VI in type 2 diabetes." [S.l.] : [s.n.], 2004. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=972317430.
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Chou, Laisheng. "Effects of substratum surface chemistry and topography on extracellular matrix gene expression." Thesis, National Library of Canada = Bibliothèque nationale du Canada, 1997. http://www.collectionscanada.ca/obj/s4/f2/dsk3/ftp04/nq25033.pdf.
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Nazzari, Hamed. "Structural determinants regulating surface expression and function of Kv-related ion channels." Thesis, University of British Columbia, 2010. http://hdl.handle.net/2429/28410.
Анотація:
To date, the mechanisms and structural determinants which contribute to the regulation of ion channel trafficking, surface expression and function have only been limitedly explored. Through biophysical and molecular characterization of the hyperpolarization-activated cyclic-nucleotide gated channel 2 (HCN2), we have identified a four-amino acid motif (EEYP) in the B-helix of the cyclic-nucleotide binding domain (CNBD) that strongly promotes channel export from the endoplasmic reticulum (ER) and cell surface expression but does not contribute to the inhibition of channel opening. We further demonstrate that this motif augments a step in the trafficking pathway and/or the efficiency of correct folding and assembly. The role of post-translational modifications, specifically N-linked glycosylation, has also been investigated in two different HCN isoforms. All four mammalian HCN channel isoforms have been shown to undergo N-linked glycosylation in the brain. HCN channels have further been suggested to require N-glycosylation for function, a provocative finding that would make them unique in the voltage-gated potassium channel superfamily. Here, we show that both the HCN1 and HCN2 isoforms are also predominantly N-glycosylated in the embryonic heart, where they are found in significant amounts and where HCN-mediated currents are known to regulate beating frequency. Surprisingly, we find that N-glycosylation is not required for HCN2 function, although its cell surface expression is highly dependent on the presence of N-glycans. Comparatively, disruption of N-glycosylation only modestly impacts cell surface expression of HCN1 and leaves permeation and gating functions almost unchanged. The evolutionary significance of this isoforms specific regulation is also examined. Finally, the role of palmitoylation in the regulation of Kv4 channels is examined. Using acylbiotin exchange (ABE) chemistry we are able demonstrate that Kv4.2 is present as a palmitoylated protein in both rat cortical neurons and COS-7 cells. Through mutational analysis of the twelve intracellular cysteine residues within Kv4.2, we were able to localize the site of palmitoylation to the intracellular COOH-terminus. Palmitoylation of Kv4.2 does not contribute to the regulation of activation and inactivation gating parameters. Rather, inhibition of palmitoylation through either mutation of COOH-terminal cysteine residues or the pharmacological agent 2-bromopalmitate results in significant reductions in overall current density measurements.
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So, Ling-yue Daphne, and 蘇令如. "Inclined [expression], [impression]: an urbanconnector/collector on the inclined surface at foothill." Thesis, The University of Hong Kong (Pokfulam, Hong Kong), 2001. http://hub.hku.hk/bib/B31986031.
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Jarmander, Johan. "Improved detection and performance of surface expression from the AIDA-I autotransporter." Licentiate thesis, KTH, Bioprocessteknik (stängd 20130101), 2013. http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-121561.
Анотація:
Surface expression of recombinant proteins has attracted a lot of attention due to its potential in applications such as enzyme production, vaccine delivery and bioremediation. Autotransporters have been used for surface expression of a variety of proteins, but the expression systems reported in literature have typically been inflexible and incapable of detecting proteolysis, thereby limiting surface expression yield. In this thesis, a modular surface expression system, utilizing dual tag detection, was therefore created. It was based on the adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I) autotransporter, and was here used to express the model proteins SefA and H:gm on the cell surface of Escherichia coli. Due to the dual tag detection system, proteolysed H:gm could be successfully verified on the cell surface. By optimizing cultivation conditions, surface expression yield of SefA was increased by 300 %, and proteolysis reduced by 33 %. While proteolysis could not be eliminated completely, the work presented in this thesis is a major step towards a general system for surface expression of a wide range of proteins in varied applications.QC 20130506
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Crummie, Darragh Kevin. "Modulation of NMDA receptor surface expression by DISC1 and its pathway partners." Thesis, University of Edinburgh, 2015. http://hdl.handle.net/1842/21047.
Анотація:
Disrupted in Schizophrenia 1 (DISC1) is a well supported risk factor for schizophrenia, bipolar disorder and major recurrent depression. DISC1 is a multifunctional multicompartmentalised scaffold protein with essential roles in neuronal proliferation, differentiation, migration and integration. DISC1 also modulates pathways of vital importance for neuronal signalling and plasticity. One of the major hypotheses for the cause of psychiatric illness is N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor hypofunction. It was observed that NMDA receptor antagonists can induce symptoms of schizophrenia in unaffected individuals, and exacerbate symptoms in patients with schizophrenia. Recent work in our laboratory showed that DISC1 complexes with NMDA receptors within the cell body and at synapse of neurons. Here I studied whether DISC1, or DISC1 missense variants, affect the trafficking of NMDA receptors. This was done by quantifying surface NMDA receptor expression in the presence of DISC1 or variant DISC1. I found that one common variant, 607F, causes a significant reduction in surface expressed NMDA receptors. I went on to show that DISC1 reduces the number of internalised receptors associating with early RAB5-containing endosomes. This indicates that DISC1 may be involved in the trafficking and recycling of NMDA receptors, a process that may be affected by the missense DISC1 variant 607F. Further to this I studied the effects on NMDA receptor trafficking of DISC1 pathway partners Nuclear Distribution Element 1 (NDE1) and Trafficking-protein kinesin binding 1 (TRAK1), both regulators of neuronal intracellular trafficking. Phosphorylation of NDE1 at T131 has been shown to be modulated by DISC1. Using phospho-mimic and phospho-dead NDE1 expression constructs I observed a significant reduction in the surface-expressed NMDA receptors in cells expressing the phospho-mimic form of NDE1. NDE1 may therefore be involved in the trafficking of NMDA receptors, and this role may be modulated by phosphorylation of NDE1. Finally, TRAK1 was shown to associate robustly with the GluN2B subunit, and to decrease the surface expression of NMDA receptors, most likely by sequestering them. The TRAK1-induced GluN2B sequestration may be an artefact, but the association of the trafficking molecule TRAK1 with this subunit may point towards a role in NMDA receptor trafficking. These proteins have been shown to associate with each other and may form a complex in order to traffic NMDA receptors. Disruption of this complex by defective DISC1 expression may affect NMDA receptor trafficking. In the brain this could conceivably contribute to NMDA receptor hypofunction and the development of psychiatric illness.
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Trimnell, Adama R. "Assessment of cell surface expression vectors for heterologous expression of peptides/antigens through the A-layer of Aeromonas salmonicida." Thesis, University of Reading, 1996. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.339514.
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Vincenti, Sophie. "Expression de l’hydroperoxyde lyase recombinante d’olive chez la bactérie Escherichia coli et chez la levure Pichia pastoris Etude des relations structure-fonction de l’enzyme." Thesis, Corte, 2016. http://www.theses.fr/2016CORT0010.
Анотація:
L’hydroperoxyde lyase (HPL) est une enzyme présente chez les végétaux supérieurs et impliquée dans la voie de la lipoxygénase. Elle agit sur les 9- et/ou les 13-hydroperoxydes d’acide gras pour produire des aldéhydes à 6 ou 9 carbones, responsables de l’odeur fraîche de l’herbe coupée dite « note verte », et très utilisés par les industries cosmétiques et agroalimentaires. Afin de répondre à la demande croissante en molécules à note verte naturelles, des systèmes de production utilisant des enzymes recombinantes sont développés. Ainsi, l’HPL d’olive (HPLwt) et l’enzyme dépourvue de son peptide de transit chloroplastique (HPLdel), ont été clonées au laboratoire et exprimées chez Escherichia coli. Les deux enzymes recombinantes ont été purifiées puis caractérisées biochimiquement. Elles sont spécifiques des 13-hydroperoxydes, présentent une activité maximale à pH 7,5 et à 25°C, et agissent plus efficacement sur le 13-hydroperoxyde d’acide linolénique. L’étude de la stabilité de l’HPLwt et de l’HPLdel au cours du temps a montré que la totalité de l’activité enzymatique est conservée durant cinq semaines de stockage à -80°C en présence de glycérol 10%. De plus, l’ajout de composés chimiques tels que le NaCl, le Na2SO4 et la glycine ont permis d’augmenter l’activité des deux enzymes. Parallèlement, les HPL recombinantes ont été exprimées dans un système eucaryote, la levure Pichia pastoris. Les enzymes ne sont pas sécrétées dans le milieu de culture, mais exprimées au niveau intracellulaire, avec une activité maximale obtenue après 24h d’induction. Par ailleurs, les relations structure-fonction de l’HPL ont été étudiées. La structure tridimensionnelle de la 13-HPL d’olive a été modélisée grâce à des méthodes computationnelles. Des acides aminés potentiellement impliqués dans la régiospécificité de l’enzyme ont été ciblés, puis modifiés par mutagénèse dirigée. Ainsi, le mutant T302K présente une efficacité catalytique sur les 13-hydroperoxydes similaire à celle de l’HPLwt, mais il est également actif sur le 9-hydroperoxyde d’acide linoléniqueHydroperoxide lyase (HPL) is an enzyme found in higher plants and involved in the lipoxygenase pathway. HPL acts on the 9- and/or 13-hydroperoxy fatty acids to produce C6 or C9 aldehydes, responsible for the fresh odor of cut grass known as "green note" and widely used by cosmetic and food industries. Production systems using recombinant enzymes are developed to meet the growing demand for natural green leaf volatiles. Thus, HPL from olive fruit (HPLwt) and the enzyme with its chloroplast transit peptide deleted (HPLdel), were cloned in the laboratory and expressed in Escherichia coli. Both recombinant enzymes were purified and biochemically characterized. They act only on 13-hydroperoxides, exhibit maximum activity at pH 7.5 and 25°C, and are more effective on the 13-hydroperoxy linoleic acid. The study of HPLwt and HPLdel stability over time has shown that all of the enzymatic activity is retained during a five weeks storage at -80°C in the presence of 10% glycerol. Furthermore, the addition of chemical compounds such as NaCl, Na2SO4 and glycine have increased the activity of both enzymes. Meanwhile, recombinant HPLs have been expressed in the eukaryotic system Pichia pastoris yeast. The HPLs are not secreted into the culture medium, but are expressed intracellularly, with a maximum after 24h of induction. Moreover, HPL structure-function relations were studied. The olive 13-HPL three dimensional structure has been built by computational modelling. Amino acids potentially involved in regiospecificity of the enzyme have been identified and modified by site-directed mutagenesis. Thus, T302K mutant has a catalytic efficiency on 13-hydroperoxides similar to the HPLwt, but it is also active on the 9-hydroperoxide of linoleic acid
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Bednarska, Aleksandra. "Artificial systems for in vitro gene expression." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015SACLN016/document.
Анотація:
L’ARN polymérase dépendante d’ADN (RNAP) est une enzyme responsable de la polymérisation de ribonucleotides dans une séquence d'ARN complémentaire de l'ADN de matrice. La famille de RNAP a plusieurs membres, comme de protéines sous-unité unique (par exemple du bactériophage T7) ou multiple sous-unité (bactériennes et eucaryotes). Transcription de l'ARN - un événement crucial dans l'expression des gènes - varie en fonction de l'origine de RNAP. Bien que le processus de transcription est relativement bien caractérisée, de nombreux éléments restent mal compris, surtout par rapport à la dynamique de la reconnaissance de promoteur, d'évasion et de l'allongement dans une contexte de cellule où la densité moléculaire, les concentrations et les effets plus proches environs sont importants. L'objectif de cette thèse était la développement d’une méthode qui permettrait suivre la réaction RNAP in vitro en temps réel dans des conditions très contrôlées. Un axe majeur a été mis pour développer un biocapteur basé surface qui permettrait à la caractérisation des principales étapes de la réaction de transcription. Par conséquent, les interactions entre des molécules d'ADN immobilisés sur une surface du capteur et RNAP libre délivré par un système microfluidique de la surface ont été examinées. Changements de l'indice de réfraction, corrélés avec les changements de masse sur la surface ont été suivis en utilisant l'imagerie par résonance de plasmon de surface (SPRi). SPRi est une technique sensible dédiée à l'analyse des interactions entre deux ligands en temps réel. Les bases du mécanisme sont la détection de légères différences dans la réflexion de la lumière polarisée à un angle fixe qui est associé avec une variation de masse à l'interface. Les données obtenues à partir SPRi sont utilisées pour déterminer la cinétique des interactions. Géométrie d’ADN puces permet de suivre plusieurs échantillons simultanément, qui raccourcit considérablement le temps que de manipulation et améliore la qualité et la reproductibilité des résultats obtenus. Autres biocapteurs optofluidique: résonateur de microring et microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF) ont été développés en parallèle. Nous avons biofunctionalisé et caractérisé des surfaces de capteur (de verre couvert de polymère pour un résonateur de microring et la microscopie TIRF et 50 nm couche mince d’or sur des prismes de SPRi) afin d'immobiliser ADN d'une manière contrôlée, par création d’une monocouche auto-assemblée (SAM). Fonctionnalisation de polymères SU-8 concernées deux méthodes: covalent immobilisation de (bio) molécules et la conjugaison non covalente sur la base de couplage hydrophobe. Pour la fonctionnalisation de surface d’or, quatre stratégies différentes d'immobilisation des molécules ont été comparés: formation de la liaison de thiol - or, la formation des liaisons amide, interactions extrAvidin - biotine et le couplage hydrophobe. Les études de la conjugaison de l'ADN à la surface d'or fonctionnalisé ont été effectuées en ce qui concerne la spécificité et la densité d'ADN immobilisées de longueurs différentes: 50, 500 et 1000 pb. Enfin, les surfaces biofunctionalized ont été utilisées pour suivre en temps réel des réactions de transcription de deux RNAP: bactériophage T7 RNAP monomère et l'holoenzyme d'Escherichia coli RNAP. Les analyses cinétiques de la formation d’un complexe nucléoprotéine et la transcription d'ARN ont été fait par report de la densité et la longueur de l'ADN immobilisé, la position de la séquence du promoteur spécifique. Transcription de l'ARN dans l'appareil SPRi a été confirmée par la collection, la détection et l'analyse des produits ARN.L'objectif final comprends une synthèse de l'ARN contrôlée qui serait une étape intermédiaire d'enquêter en temps réel la production de protéines in vitroDNA-dependent RNA polymerase (RNAP) is an enzyme responsible for the polymerization of ribonucleotides into an RNA sequence complementary to the template DNA. RNAP family has several members being single subunit (e.g. T7 bacteriophage) or multi subunit (bacterial and eukaryote) proteins. RNA transcription – a crucial event in gene expression – differs depending on the RNAP origin. Although the transcription process is relatively well characterized, many elements remain poorly understood, especially with respect to the dynamics of promoter recognition, escape and elongation in a cell like context where molecular density, concentrations and nearest neighbour effects are prevalent.The goal of this thesis was to develop a robust method that would allow real time monitoring of RNAP reaction in vitro in thoroughly controlled conditions. A major axis was to develop a surface-based biosensor that would allow the characterization of the main steps of the transcription reaction. Consequently, interactions between DNA molecules immobilized on a sensor surface and free RNAP delivered through a microfluidic flow system to the surface were examined. Changes in refractive index, correlated with changes in mass at a surface were followed using surface plasmon resonance imaging (SPRi). SPRi is a sensitive technique dedicated to analysis of interactions between two ligands in real time. The mechanism bases on the detection of slight differences in the reflectivity of polarized light at a fixed angle that are associated with a mass variation at the interface. Data obtained from SPRi are used to determine the kinetics of the interactions. Microarray geometry of SPRi allows monitoring several samples simultaneously that significantly shortens manipulation time and improves a quality and reproducibility of obtained results. Other label-free optofluidic biosensors: microring resonator and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy were developed in parallel.We firstly biofunctionalized and characterized sensor surfaces (polymer coated glass for microring resonator and TIRF microscopy and 50-nm thin layer gold coatings on glass prisms for SPRi) in order to immobilize DNA strands in a controlled manner, using a self-assembled monolayer (SAM). Functionalization of photoresist polymer SU-8 concerned two methods: covalent (bio)molecule grafting and non-covalent conjugation based on hydrophobic coupling. Regarding gold surface functionalization, four different strategies of antifouling (bio)molecule immobilization were compared: thiol – gold bond formation, amide bond formation, extrAvidin – biotin interactions and hydrophobic coupling. Studies of DNA conjugation to the functionalized gold surface were performed with respect to specificity and density of immobilized DNA molecules of different lengths: 50, 500 and 1000 bp.Finally, biofunctionalized surfaces were used for real time monitoring of transcription reactions using two RNAPs: monomeric bacteriophage T7 RNAP and the holoenzyme of Escherichia coli RNAP. Kinetic analyses of nucleoprotein complex formation and RNA transcription were performed as a function of immobilized DNA density, the length of the immobilized DNA, the position of the specific promoter sequence with respect to the point of immobilization and the direction of subsequent transcription. RNA transcription in the SPRi apparatus was confirmed by collection, detection and analysis of relevant products.The future development of biosensors dedicated to in vitro gene expression will include the adaptation of the methods presented above to other optofluidic systems and further development of the technique. The final goal comprises a controlled RNA synthesis that would be an intermediate step to investigate real time in vitro protein production