Дисертації з теми "Espèces Réactives d'Oxygène (ROS)"

Le déséquilibre intracellulaire entre antioxydants et pro-oxydants est impliqué dans le développement de nombreuses pathologies, comme les maladies inflammatoires chroniques intestinales-MICI. Le fait que la superoxyde dismutase à manganèse (MnSOD) soit la première ligne de défense antioxydante nous a conduit à tester le rôle des mimes de SOD comme agents anti-inflammatoire dans le contexte des MICI. Mn1 est facilement synthétisé, stable, avec une bonne activité anti-superoxyde intrinsèque et anti-inflammatoire sur des cellules épithéliales intestinales (HT29-MD2) en situation de stress oxydant. La présence de Mn1 intact (ligand+Mn2+) à l'intérieur des HT29-MD2, créées pour étudier l'inflammation intestinale est démontrée avec une stratégie en spectrométrie de masse (IMS-MS). Après 6 h d'incubation avec 100 µM Mn1 et LPS 0.1 µg/mL, Mn1 a été détecté en forme intacte avec une concentration intracellulaire estimée à 10 µM. En utilisant la stratégie OcSILAC, qui permet de quantifier simultanément l’expression des protéines et le niveau d’oxydation de cystéines de l’ensemble du protéome, nous avons démontré qu’une oxydation est induite par le LPS dès 15min (dans la fraction organelles dont la mitochondrie) et qu’elle se résout après 6h-LPS, avec une surexpression de la MnSOD (dès 3h). Quand il est coincubé avec LPS, Mn1 est capable de limiter l’oxydation totale des protéines à 15 min (70% dans les membranes/organelles) et de remplacer l’action de la MnSOD à 6h. Mn1 également rétablit en leur niveau basal la majorité des protéines sous et surexprimées par l’activation au LPS. Nos résultats démontrent ainsi le potentiel du Mn1 comme nouvel agent thérapeutique contre les MICI
The intracellular imbalance between antioxidants and pro-oxidants is involved in the development of many pathologies (like chronic inflammatory bowel diseases-IBD). The fact that manganese superoxide dismutase (MnSOD) is the first line of antioxidant defense led us to study the role of MnSOD mimics as anti-inflammatory agents in the context of IBD. Mn1 is easily synthesized, stable, with good intrinsic anti-superoxide activity and anti-inflammatory activity on intestinal epithelial cells (HT29-MD2). The presence of intact Mn1 (ligand+Mn2+) inside HT29-MD2, created to study intestinal inflammation, was demonstrated using mass spectrometry (IMSMS). After 6h of incubation with 100 µM Mn1 and with LPS 0.1 µg/mL, Mn1 was detected intact with an estimated intracellular concentration of 10 µM. Using the OcSILAC strategy, making possible to simultaneously quantify protein expression and oxidation at the proteome-wide cysteine level, it has been demonstrated that an oxidation was induced by LPS from 15min (in the organelles fraction, including mitochondria) and was resolved after 6h-LPS, with an overexpression of MnSOD (after 3h). When coincubated with LPS, Mn1 limited the total protein oxidation at 15min (70% in the membranes/organelles) and compensate for MnSOD at 6h. Mn1 also restored to their basal levels most of the proteins that were under and overexpressed upon LPS activation. Our results thus demonstrate the potential of Mn1 as a new therapeutic agent against IBD

La radiothérapie est utilisée seule ou en association avec la chimiothérapie dans le traitement de plus de 50% des cancers. En dépit des nombreux progrès dans le but d'améliorer le rapport bénéfice/risque, l'irradiation est à l'origine de nombreux effets secondaires. Une des origines connues des cancers de la thyroïde est l'exposition pendant l'enfance aux radiations ionisantes, soit accidentelles, soit suite à un traitement par radiothérapie externe pour une autre pathologie. Les mécanismes par lesquels les radiations ionisantes provoquent l'apparition d'un cancer de la thyroïde sont nombreux et encore incomplètement connus. Les radiations ionisantes sont des agents génotoxiques qui induisent des dommages au niveau de l'ADN telles que des cassures et des aberrations chromosomiques. Bien que les mécanismes qui sous-tendent ces effets ne soient pas complètement compris, il est généralement admis que les radiations ionisantes induisent des dommages à l'ADN soit de manière directe soit de manière indirecte en générant des espèces réactives de l'oxygène (ROS). Durant ma thèse, nous avons étudié le rôle des ROS produit lors de l'irradiation dans la génération des dommages à l'ADN dans les cellules thyroïdiennes. Nos résultats montrent que les ROS produites après irradiation participent à la formation des réarrangements chromosomiques RET/PTC1 retrouvés dans 70% des cancers papillaires radioinduits. Les ROS engendrées par la radiolyse de l'eau ont une durée de vie extrêmement courte ce qui limite leur diffusion. Néanmoins, par des mécanismes redox, ils provoquent des modifications au niveau cellulaire qui conduisent à leur tour à l'activation de systèmes générateurs de ROS, parmi lesquels on trouve les NADPH oxydases. Nos résultats montrent que l'irradiation induit l'expression de la NADPH oxydase DUOX1 via la sécrétion d'IL-13, plusieurs jours après l'exposition aux radiations ionisantes. L'inactivation de DUOX1 par ARNs interférents diminue de manière significative les dommages de l'ADN observés plusieurs jours après irradiation. Ces résultats suggèrent un rôle de DUOX1 dans le stress oxydatif chronique qui contribue à l'instabilité génétique.

La radiothérapie est utilisée seule ou en association avec la chimiothérapie dans le traitement de plus de 50% des cancers. En dépit des nombreux progrès dans le but d’améliorer le rapport bénéfice/risque, l’irradiation est à l’origine de nombreux effets secondaires. Une des origines connues des cancers de la thyroïde est l’exposition pendant l’enfance aux radiations ionisantes, soit accidentelles, soit suite à un traitement par radiothérapie externe pour une autre pathologie. Les mécanismes par lesquels les radiations ionisantes provoquent l’apparition d’un cancer de la thyroïde sont nombreux et encore incomplètement connus. Les radiations ionisantes sont des agents génotoxiques qui induisent des dommages au niveau de l’ADN telles que des cassures et des aberrations chromosomiques. Bien que les mécanismes qui sous-tendent ces effets ne soient pas complètement compris, il est généralement admis que les radiations ionisantes induisent des dommages à l’ADN soit de manière directe soit de manière indirecte en générant des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Durant ma thèse, nous avons étudié le rôle des ROS produit lors de l’irradiation dans la génération des dommages à l’ADN dans les cellules thyroïdiennes. Nos résultats montrent que les ROS produites après irradiation participent à la formation des réarrangements chromosomiques RET/PTC1 retrouvés dans 70% des cancers papillaires radioinduits. Les ROS engendrées par la radiolyse de l’eau ont une durée de vie extrêmement courte ce qui limite leur diffusion. Néanmoins, par des mécanismes redox, ils provoquent des modifications au niveau cellulaire qui conduisent à leur tour à l’activation de systèmes générateurs de ROS, parmi lesquels on trouve les NADPH oxydases. Nos résultats montrent que l’irradiation induit l’expression de la NADPH oxydase DUOX1 via la sécrétion d’IL-13, plusieurs jours après l’exposition aux radiations ionisantes. L’inactivation de DUOX1 par ARNs interférents diminue de manière significative les dommages de l’ADN observés plusieurs jours après irradiation. Ces résultats suggèrent un rôle de DUOX1 dans le stress oxydatif chronique qui contribue à l’instabilité génétique
Radiotherapy is used alone or in combination with chemotherapy to treat over 50% of cancers. Despite much progress in order to improve the benefit / risk ratio, the radiation causes many side effects. One of the known origins of thyroid cancer is exposure during childhood to ionizing radiation, either accidentally or as a result of external radiation therapy for another disease. The mechanisms by which ionizing radiation causes the appearance of thyroid cancer are numerous and not yet fully known. Ionizing radiations are genotoxic agents that induce DNA damage such as breaks and chromosomal aberrations. Although the mechanisms underlying these effects are not completely understood, it is generally accepted that ionizing radiations induce DNA damage either directly or indirectly by generating reactive oxygen species (ROS). During my PhD, we studied the role of ROS produced during irradiation in the generation of DNA damage in thyroid cells. Our results show that ROS produced after irradiation participate in the formation of RET/PTC1 rearrangements found in 70% of radiation-induced papillary cancers. ROS generated by radiolysis of water have a very short lifetime that limits their diffusion. However, by redox mechanisms, they cause changes at the cellular level, which in turn lead to the activation of ROS generating systems, which include the NADPH oxidases. Our results show that irradiation induces the expression of NADPH oxidase DUOX1 via the secretion of IL-13, several days after exposure to ionizing radiation. Inactivation of DUOX1 by interfering RNAs significantly reduces the DNA damage observed several days after irradiation. These results suggest a role DUOX1 in chronic oxidative stress that contributes to genetic instability

Le pancréas est un organe hétérogène composé d’une partie exocrine, responsable de la synthèse d’enzymes pour la digestion, et d’une partie endocrine, essentielle pour l’homéostasie glucidique. Notamment la sécrétion d’insuline par les cellules β contrôle la glycémie. Les dysfonctionnements des cellules β sont une des causes du diabète, première épidémie non infectieuse au monde. Il est actuellement possible d’en traiter les symptômes mais pas de le guérir. De nombreux laboratoires recherchent un protocole idéal de production de cellules β afin de pouvoir greffer ces cellules aux patients. L’identification des facteurs qui gouvernent chaque étape du développement des cellules β devrait permettre de progresser dans ce sens. Le but de ma thèse a été d’étudier le rôle des Espèces Réactives de l’Oxygène (ROS) au cours du développement pancréatique. Cette question a été soulevée lorsque nous avons analysé l’expression des gènes codant pour les enzymes détoxifiantes des ROS: leur expression était extrêmement réduite dans les pancréas embryonnaires comparés aux pancréas adultes, suggérant que les précurseurs sont particulièrement sensibles aux variations des ROS. Nous avons ensuite montré que la réduction des ROS in vivo, obtenue par un traitement avec un antioxydant (NAC), diminue le développement des cellules β. Une analyse in vitro a permis de détailler les mécanismes de l’action des ROS. En effet, le peroxyde d’hydrogène favorise la différenciation des cellules β en augmentant l’expression du facteur pro-endocrine Ngn3 dans les progéniteurs. Ce processus implique l’activation la voie ERK1/2 par les ROS. Au contraire, la diminution des ROS induite par des méthodes génétiques ou pharmacologiques altère la différenciation des cellules β. Nos résultats indiquent également que la mitochondrie est impliquée dans ce processus. Nous avons donc montré que la présence des ROS est essentielle pour le bon développement du pancréas. Ces recherches devraient donc permettre de progresser vers une thérapie cellulaire du diabète
The pancreas is an heterogenous gland composed by exocrine tissue, responsible for digestive enzyme secretions, and endocrine tissue, essential for glucose homeostasis. In particular β cells secrete insulin which controls glycemia. Moreover, β cell failure is one of the primary causes of diabetes and this pathology is nowadays considered as the first non infectious worldwide outbreak. There is unfortunately no cure for this disease. Many laboratories are currently improving β cell generation protocols in order to inject those cells into patients. This is the reason why it appears mandatory to be able to identify factors that govern each step of β cell development. The aim of my work was to study the role of the Reactive Oxygen Species (ROS) during pancreatic development. First we found out that the expression of genes coding for antioxidant enzymes was extremely low in embryonic pancreas compared to adult pancreas. This suggested that progenitors could be sensitive to ROS variations. We then showed in vivo using an antioxidant component (NAC) that decreasing ROS level diminishes β cell development. Analysis in vitro allowed us to better describe the role of ROS. Indeed, hydrogen peroxyde favors β cell differentiation by increasing the pro-endocrine marker NGN3 expression in the progenitors. In this process, ROS activate the ERK1/2 signaling pathway. On the contrary, lowering ROS level using both pharmacologic and genetic approaches, decreases β cell differentiation. Our results also point out a role of the mitochondria in this process. Altogether, our data define the effects of ROS on β cell differentiation and open new perspectives to improve protocols of β cell generation

L'objectif principal du travail effectué au cours de cette thèse était de développer, caractériser et analyser des matériaux originaux pour des réactions d'oxydation photosensibilisée. Une attention particulière a été accordée à la détermination des propriétés photophysiques des sensibilisateurs (PSs) et à l'effet induit par l'immobilisation sur un support inerte (silice). Les espèces réactives formées lors de l'irradiation ont été identifiées et analysées. La production d'oxygène singulet a été suivie par deux méthodes complémentaires. Les sensibilisateurs supportés ont été employés, sous la forme de monolithes ou de poudres, pour la photo-oxydation du diméthyl sulfure à l'interface gaz-solide et de l’-terpinène à l'interface liquide-solide. L'oxygène singulet est la principale espèce réactive de l’oxygène formée par les PSs sélectionnés; néanmoins, les produits de réaction ont été analysés afin de mettre en évidence d’autres mécanismes
The main aim of the work carried out during this PhD project was to develop, characterize and analyze original materials for photosensitized oxidation reactions. Particular attention was paid to the determination of the photophysical properties of the selected photosensitizers (PSs) and the effect induced by the immobilization on an inert support (silica). The reactive species formed upon irradiation were identified and analyzed. Singlet oxygen production was monitored by two complementary methods. The solid-supported sensitizers were employed, in the form of either monoliths or powders, for the photooxidation of dimethyl sulfide at the gas-solid interface and of -terpinene at the liquid-solid interface. Singlet oxygen was the main reactive oxygen species formed by the selected PSs; nonetheless, the reaction products were analyzed and other possible mechanistic scenarios investigated

Les leucémies aiguë myéloïde (LAM) sont un groupe d’hémopathies malignes, dont le traitement est généralement composé de deux génotoxiques : la cytarabine (Ara-C) et la daunorubicine (DNR). Nous avons montré que l’Ara-C et la DNR induisent la déconjugaison rapide de SUMO (Small Ubiquitin-related Modifier) de ses protéines cibles. Cette deSUMOylation est dûe à l'inactivation des enzymes E1 et E2 de SUMOylation par les espèces réactives de l'oxygène (ROS) produites par l’Ara-C et la DNR et est impliquée dans l'activation de l'apoptose. En outre, cet axe ROS/SUMO est anergisé dans les LAM chimiorésistantes. Cependant, il peut être réactivé par des pro-oxydants ou par inhibition de la voie SUMO par l'acide anacardique. Pour identifier les protéines contrôlées par l’axe ROS/SUMO nous avons effectué une approche de spectrométrie de masse quantitative (SILAC). Parmi les 1000 protéines SUMOylées identifiées, la plupart des 114 protéines qui perdent leur SUMOylation lors du traitement sont impliquées dans la régulation de l'expression des gènes. De plus, un ChIP-Seq avec des anticorps anti SUMO-2 a permis de montrer que les génotoxiques, en particulier la DNR, induisent une diminution massive de la présence de protéines SUMOylées sur la chromatine. La recherche de motifs au sein des séquences fixant SUMO a permis d’identifier le motif de liaison de CTCF à l’ADN. De plus, CTCF a été trouvé dans la SILAC comme l’une des protéines déSUMOylées par les traitements. En utilisant des données publiques de Chip-Seq pour CTCF, nous avons identifié 55 gènes qui fixent à la fois CTCF et SUMO et dont l’expression est régulée par les traitements. Dans la dernière partie de ce travail, nous avons étudié le groupe de 19 protéines dont la SUMOylation augmente suite aux traitements génotoxiques. Parmi ces protéines, nous avons trouvé diverses protéines centromériques, y compris CENP-B et CENP-C. En utilisant le PLA (Proximity Ligation Assay) nous avons pu montrer que CENP-B et CENP-C colocalisent avec SUMO et yH2AX après traitement. Cela suggère que la SUMOylation des protéines centromériques se produit sur les sites de cassure et pourrait jouer un rôle dans la réparation des dommages de l'ADN
Acute Myeloid Leukemias (AML) are a group a severe hematological malignancies, which treatment is generally composed of two genotoxics: Cytarabine (Ara-C) and Daunorubicin (DNR). We have shown that these drugs induce the rapid deconjugation of the Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO) from its target protein. This is due to the inactivation of SUMO E1 and E2 enzymes by Reactive oxygen species (ROS). This deSUMOylation participated in the activation of specific genes and is involved the induction of apoptosis. In addition, this ROS/SUMO axis is anergized in chemoresistant AMLs. However, it can be reactivated by pro-oxidants or inhibition of the SUMO pathway with anacardic acid, an inhibitor of the SUMO E1. To identify which proteins are regulated by this ROS/SUMO axis, we performed a quantitative mass spectrometry approach. Among the 1000 identified SUMO targets, most of the 114 proteins, which SUMOylation decrease upon treatment, are involved in the regulation of gene expression. In addition, we showed by ChIP-Seq with SUMO-2 antibodies that genotoxics, in particular DNR, induce a massive decrease of the presence of SUMOylated proteins on the chromatin. Motif search analysis of the SUMO binding sequences in these genes identified CTCF binding motif. Interestingly, CTCF was found in the SILAC as deSUMOylated by the drugs. Using publicly available ChIP-Seq data for CTCF, we found 55 genes which are occupied by both SUMO-2 and CTCF and which expression is regulated by the drugs. In the last part of this work, we got interested in the 19 proteins that get up-SUMOylated upon treatment. Among them, we found centromeric proteins, including CENP-B and CENP-C. Using Proximity Ligation Assay, we could show that CENP-B and CENP-C colocalize with both SUMO and yH2AX upon DNR treatment. Altogether, this suggests that centromeric protein up-SUMOylation occurs at sites of DNA damage and might play a role in DNA damage repair

Plusieurs rapports ont suggéré que les formes réactives de l'oxygène (FRO) et d'azote sont impliquées dans la pathogénèse de la ScS. Les fibroblastes ScS de la peau et des organes internes surproduisent des FRO qui déclenchent la prolifération des fibroblastes et la synthèse de collagène de type I, conduisant à l'initiation et à la progression de la ScS. Le laboratoire a mis au point un modèle de souris ScS, induite par injections itératives de HOCl. Comme dans la ScS humaine, les fibroblastes de la peau de souris ScS produisent de manière constitutive de grandes quantités de FRO. Nous avons utilisé cette propriété pour induire sélectivement l'apoptose de fibroblastes de souris ScS. Le catalyseur organotelluride-(PHTE) 2NQ et le composé naturel Dipropyltertrasulfide (DPTTS) sont capables d'augmenter specifiquement la production de FRO par les fibroblastes et d’induire un stress oxydatif létal dans les fibroblastes sclérodermiques. Ce phénomène n'a aucun impact sur les fibroblastes normaux qui présentent des taux de FRO basaux faible et un statut oxydant / antioxydant normal. De nombreuses études ont également prouvé l’importance des espèces azotées dans la l’induction de la ScS. Chez les patients atteints de SSc, le taux sérique de l'oxyde nitrique est considérablement accru. De plus, le NO peut se combiner avec d'autres radicaux libres comme l'anion superoxyde (O•-2) pour former le peroxynitrite (ONOO-) qui est hautement cytotoxique et contribue à l'inflammation, la fibrose et l'apoptose des cellules endothéliales. La production de NO par les cellules endothéliales ou les fibroblastes peut être stimulée par l'angiotensine II, principal peptide de la voie rénine-angiotensine (RAS). Comme chez les patients atteints de sclérodermie, les souris HOCl/ScS présentent des taux sériques d'angiotensine II élevés, ce qui est favorable à la prolifération des fibroblastes, à la fibrose, et à l'inflammation. Ces observations nous ont conduites à tester les effets de l'Irbésartan, un antagoniste des récepteurs de l’angiotensine II de type I (AT1 RA) dans le ScS modèle murin. Un nouveau modèle animal basé sur l'exposition chronique à des ROS et présentant de nombreuses similitudes avec la maladie humaine, m'a permis d'étudier de nouveaux traitements de la ScS. Ces nouvelles approches sont basées sur l'action cytotoxique de composés pro-oxydants - (PHTE) 2NQ et DPTTS - et sur les effets anti-nitrosatifs de molécules comme l'Irbésartan. Ces stratégies thérapeutiques originales ouvrent des perspectives intéressantes dans le traitement de la ScS, où l'arsenal thérapeutique est actuellement encore limité
Several reports have suggested that reactive oxygen and nitrogen species are involved in SSc pathogenesis. SSc fibroblast from skin and internal organs overproduce ROS that trigger the proliferation of fibroblasts and the synthesis of type I collagen leading to the initiation and progresion of SSc. As in human SSc, skin fibroblasts from SSc mice constitutively produce large amounts of ROS. We have used this property to selectively induce apoptosis in the diseased fibroblast of SSc mice. Indeed, the organotelluride catalyst-(PHTE)2NQ and natural organosulfur compound – Dipropyltertrasulfide (DPTTS) are able of increasing ROS production by fibroblasts and inducing a lethal oxidative stress specificaly in SSc fibroblasts. This phenomenon has no impact on normal fibroblasts that present normal levels of ROS and a normal oxidant/antioxidant status. Many studies have also proved an importance of nitrogen species in the pathogenesis of SSc. In patients with SSc, the serum level of nitric oxide is significantly increased. Furthermore, NO can combine with other free radicals like superoxide anion (O•-2) to form the highly cytotoxic peroxynitrite (ONOO−) that contributes to inflammation, fibrosis and apoptosis of endothelial cells. Production of NO by endothelial cells or by fibroblasts can be stimulated by angiotensin II, the main peptide of the renin-angiotensin system (RAS). The level of angiotensin II is increased in SSc patients as well as in our HOCl mouse model and can promote proliferation of fibroblasts, fibrosis, and inflammation. These observations led us to test irbesartan, an angiotensin II type I receptor antagonist (AT1 RA) in the murine model of SSc. A new animal model based on chronic exposure to ROS and with many similarities to the human disease, allowed me to study new therapeutic approaches in SSc based on the cytotoxic action of pro-oxidative compounds - (PHTE)2NQ and DPTTS - and on the anti- nitrosative effect of irbesartan. These new therapeutic strategies open interesting perspectives in the treatment of SSc, where the therapeutic arsenal is currently still limited

La mitochondrie est le siège principal de la production d’énergie sous forme d’ATP en conditions aérobies, mais aussi d’espèces réactives dérivées de l’oxygène (ROS). La fonction mitochondriale est étroitement liée à la production de ROS puisque ces derniers, selon leur taux, peuvent altérer ou optimiser le rendement énergétique. La plasticité structurale et fonctionnelle de la mitochondrie est essentielle au maintien de l’homéostasie dans toute situation qui nécessite des ajustements métaboliques comme l’exercice physique. Les mécanismes adaptatifs de la fonction mitochondriale et des ROS lors de l’entrainement sont encore loin d’être élucidés ainsi que l’impact du genre sur ces réponses. Dans cette perspective, deux modèles animaux (rat Wistar et anguille européenne) ont été choisis. Les effets d’un entrainement en endurance de même intensité (70% de la vitesse maximale aérobie de course ou de nage) ont été étudiés chez le rat Wistar et l’anguille européenne argentée. Cette dernière est une espèce endurante capable d’effectuer une migration de reproduction de 6000 km et caractérisée par un dimorphisme sexuel de taille. Des mesures in vitro de la consommation d’oxygène, la production radicalaire et d’ATP ont été effectuées simultanément à partir de fibres perméabilisées de cœur et de muscle squelettique. La vulnérabilité ou résistance de la fonction mitochondriale à l’exposition à un système générateur de ROS (mimant un stress oxydant) a également été étudiée. Avant entrainement, chez le rat Wistar, la femelle présente une fonction mitochondriale plus efficiente énergétiquement et plus résistante aux ROS, alors que chez l’anguille, ce profil métabolique et radicalaire est plutôt observé chez le mâle. Après entrainement, quelle que soit l’espèce, la meilleure performance physique observée s’accompagne de modifications métaboliques et radicalaires différentes selon le genre et l’espèce. Chez le rat, l’amélioration de la fonction mitochondriale se traduit différemment selon le sexe. Chez le mâle, l’entrainement induit une amélioration du rendement énergétique via un meilleur couplage entre oxydation et phosphorylation et/ou une meilleure utilisation des électrons au niveau de la chaine respiratoire. Chez la femelle, l’augmentation de la production d’ATP serait liée à l’augmentation de la consommation d’oxygène mitochondriale. Comme chez le rat, l’entraînement induit globalement chez l’anguille une amélioration du rendement énergétique et de la résistance de la fonction mitochondriale aux ROS, mais uniquement chez le mâle. L’ensemble de ces résultats montre des réponses métaboliques et radicalaires dépendantes du genre. Quelle que soit l’espèce, l’entrainement semble être chez le mâle plus bénéfique que chez la femelle en termes d’efficacité énergétique mitochondriale et de résistance de la fonction mitochondriale à un stress oxydant. Dans le contexte de la migration de l’anguille, ces adaptations permettraient au mâle, largement plus petit que la femelle, une efficacité de nage supérieure, permettant leur synchronisation d’arrivée sur le lieu de reproduction. Les similitudes interspécifiques de réponse à l’entraînement selon le genre confortent l’intérêt d’utilisation du modèle poisson dans le champ de la physiologie de l’exercice
Mitochondrion is the main site of aerobic energy (ATP) and reactive oxygen species (ROS) productions. Mitochondrial function is closely linked to ROS, which, according their rate, can alter or optimize energy efficiency. Structural and functional plasticity of mitochondria is essential to maintain homeostasis in any situation that requires metabolic adjustments as physical exercise. The adaptive mechanisms of mitochondrial function and ROS during training and the impact of gender on these responses are still far from being solved. In this perspective, two animal models (Wistar rat and European eel) were chosen.The effects of endurance training of the same intensity (70% of maximal aerobic speed running or swimming) were studied in Wistar rat and silver European eel. The latter is an enduring species capable of performing a spawning migration of 6000 km and characterized by sexual dimorphism in size. In vitro measurements of oxygen consumption, free radical and ATP productions were carried out simultaneously from heart and skeletal muscle permeabilized fibers. The vulnerability or resistance of the mitochondrial function to a ROS generating system exposure (mimicking oxidative stress) was also studied.Before training, in rat, female has a mitochondrial function energetically more efficient and more resistant to ROS, whereas in eel, this metabolic and radical profile is observed rather in male. After training, whatever the species, the improved physical performance observed is associated with various metabolic and radical changes which depending on gender and species. In rats, the improving of mitochondrial function translates differently according to gender. In male, training induces improvement in energy efficiency through a better coupling between oxidation and phosphorylation and/or better use of electrons at the respiratory chain level. In female, increasing in ATP production may be related to the increase in mitochondrial oxygen consumption. As in rats, training induces globally in eel an improvement in energy efficiency and resistance of mitochondrial function to ROS, but only in male. All these results show metabolic and radical responses depending on gender. Whatever the species, training seems to be most beneficial in males than in females in terms of mitochondrial energy efficiency and resistance of mitochondrial function to oxidative stress. In the context of eel migration, these adaptations allow to male, largely smaller than female, a higher swim efficiency, allowing their synchronization on breeding site. Interspecific similarities in training response by gender confirm the interest of fish model’s using in the field of exercise physiology

Les microtubules sont une des cibles les plus établies dans le traitement contre le cancer. Les taxanes, paclitaxel et docetaxel, stabilisent les microtubules et ont montré une activité clinique significative mais des facteurs tels que le développement d’une résistance à ces agents limite leur utilisation clinique. Les épothilones sont des macrolides, et ont une activité in vitro et in vivo sur différents types cellulaires résistants aux taxanes. Plusieurs épothilones dont l'ixabepilone, le patupilone, BMS-310705, KOS-862, KOS-1584, et ZK-EPO sont en développement clinique. Le patupilone (épothilone B, EPO906) est un composé très actif et est actuellement en essais cliniques de phase III pour les cancers péritonéaux et ovariens. Le patupilone a la propriété de facilement passer la barrière hématoméningée et n'est pas substrat pour la P-glycoprotéine. Il a également montré des effets antitumoraux dans le système nerveux central (CNS) dans les modèles animaux. En raison de ces avantages, nous avons réalisé pour la première fois une étude in vitro de cette drogue sur les cellules de neuroblastome (SK-N-SH) afin d’en étudier le mécanisme d’action qui s’avère plus efficace que le paclitaxel (IC50 = 1. 8 nM comparé à 100 nM). La perméabilisation de la membrane mitochondriale, les changements morphologiques et la libération du cytochrome c après traitement au patupilone sont des phénomènes précoces aboutissant à l'apoptose. Le patupilone augmente la génération des espèces réactives de l'oxygène (ROS) de façon précoce et spécifique des mitochondries. Nous avons également pu montrer une accumulation des protéines pro-apoptotiques Bim et p53 au niveau des mitochondries à 6 heures et 12 heures de traitement respectivement. En revanche, les niveaux de Bax et de Bcl-2 mitochondriaux n'ont pas été changés pendant le traitement. Le balayage de ROS ou délétion partielle de l'ADN mitochondrial a protégé de manière significative les cellules reflétant l'importance cruciale des ROS mitochondriaux pour l'activité du patupilone. L'accumulation des protéines pro-apoptotiques aux mitochondries, des changements morphologiques des mitochondries et le relargage du cytochrome c ont été nettement diminués quand les ROS mitochondriales ont été empêchées. Nos résultats montrent donc l'importance cruciale des ROS produits par les mitochondries pendant le traitement au patupilone pour le déclenchement de la voie intrinsèque en induisant l'accumulation de Bim aux mitochondries. Ces résultats pourraient expliquer l'activité supérieure du patupilone sur des cellules tumorales comparé au paclitaxel. En outre, le rôle important des mitochondries pour le déclenchement et l'exécution des signaux apoptotiques, déclenchés par le patupilone, est démêlé par nos données. Ces résultats suggèrent fortement de poursuivre la recherche clinique sur le patupilone contre le neuroblastome.

La voie de signalisation mTORC1 hypothalamique (mammalian target of rapamycincomplexe 1) intègre les signaux hormonaux et nutritionnels. La disponibilité des nutrimentsmodule les espèces réactives derivées de l’oxygène (ROS) qui régulent l’activité des neuronesà propiomélanocortine (POMC). La modulation de la prise alimentaire induite par les ROSpourrait impliquer mTORC1.Des souris C57Bl6J et wild-type (WT) ou invalidées pour S6K1 (S6K1-KO), principaleprotéine cible de mTORC1, ou invalidées pour raptor, protéine clé de mTORC1,sélectivement au niveau des neurones anorexigènes POMC (POMC-raptor-KO) ont ététraitées par injections intracérébroventriculaires (ICV) d’H2O2 ou d’honokiol (piégeur deROS), uniques ou combinées avec un inhibiteur de mTOR (rapamycine) ou un activateur demTOR (leptine).L’H2O2 ICV induit une augmentation de l’activité hypothalamique mTORC1, de l’activationneuronale du noyau arqué, de l’expression des ROS dans les neurones POMC, associée à unediminution de la prise alimentaire et du poids. Cet effet anorexigène est diminué chez lessouris S6K1-KO, chez les C57Bl6J après administration de rapamycine, et chez les POMCraptor-KO.L’honokiol ICV bloque l’effet anorexigène de la leptine, suggérant que cet effet soitdépendant des ROS. La leptine ICV entraine une augmentation des ROS dans les neuronesPOMC des souris C57Bl6J et POMC-raptor-WT, mais pas chez les POMC-raptor-KO.Nos résultats montrent que la régulation de la prise alimentaire induite par les ROS nécessiteune voie mTORC1 fonctionnelle et que l’effet anorexigène de la leptine nécessite uneaugmentation de ROS, mTORC1 dépendante, au niveau des neurones POMC
The mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1) pathway is an importanthypothalamic integrator of nutrients and hormones. Nutrient availability also affects thereactive oxygen species (ROS) in propiomelanocortin (POMC) neurons and regulatesneuronal activity. We hypothesize that modulation of mTORC1 activity mediates ROS effectson food intake.To this purpose, C57Bl6J mice or WT mice and their KO littermates either deficient for themTORC1 downstream target S6K1 or for the mTORC1 component raptor specifically inPOMC neurons (POMC-raptor-KO) were treated with an intracerebroventricular (ICV)injection of the ROS producer H2O2 or the ROS scavenger honokiol, alone or in combinationwith the mTOR inhibitor rapamycin or the mTOR activator leptin.ICV H2O2 induced phosphorylation of S6K1 within the hypothalamus, increased expressionof c-fos, a marker of neuronal activity, in the arcuate nucleus and increased ROS in POMCneurons. These effects were associated with a significant decrease in food intake. Theanorexigenic effect of ICV H2O2 was not seen in S6K1-KO mice, in C57Bl6J mice cotreatedwith rapamycin (an mTOR inhibitor) and in POMC-raptor-KO mice.Similarly, ICV honokiol administration combined with a leptin injection blunted theanorexigenic effect of leptin, suggesting that leptin requires ROS formation to reduce FI. ICVadministration of leptin increased ROS in POMC neurons in C57Bl6J and POMC-raptor-WTmice, but not in POMC-raptor-KO mice.Our results demonstrate that ROS modulators require a functional mTORC1 pathway toregulate food intake and that leptin needs an mTORC1-dependent increase in ROS levels inPOMC neurons to decrease food intake

Dans le monde, 350 000 leucémies sont diagnostiquées chaque année. La rechute reste un problème majeur des leucémies aiguës myéloïdes (LAM) et le métabolisme oxydatif pourrait jouer un rôle essentiel dans la réponse au traitement. Un faible niveau des espèces réactives de l’oxygène (ROS) est associé à des propriétés des cellules souches leucémiques et la quiescence alors qu’un niveau plus élevé caractérise les leucoblastes proliférants. L’homéostasie des ROS repose sur un équilibre entre les systèmes oxydants et antioxydants. Les antioxydants sont bien documentés dans les LAM alors que les connaissances sur l’activité oxydante sont encore limitées. Dans ce travail nous avons choisi d’étudier les sept complexes NADPH oxydases (NOX) dans 25 lignées issues de LAM humaines et des LAM primaires. L’analyse des ARNm et des protéines montre des profils d’expression variables entre les lignées avec une expression plus forte des sous-unités du complexe NOX2 dans les lignées correspondant à des stades de différenciation myéloïde plus avancés. L’activité enzymatique des NOX est cependant équivalente entre les lignées. Deux inhibiteurs, DPI et VAS3947, ont été utilisés pour connaître la contribution des NOX à la production des ROS cellulaires. Alors qu’ils ont inhibé l’activité, ils ont aussi généré un stress oxydatif majeur conduisant à une diminution de la prolifération cellulaire et une forte apoptose, le DPI en augmentant les ROS mitochondriaux et VAS3047 les ROS cytoplasmiques. Afin de connaitre les sous-unités impliquées et de mieux comprendre les mécanismes, les sous-unités NOX2 et p22phox ont été inhibée par ARN interférence. Celle-ci n’ont pas affecté la prolifération mais ont montré des effets compensatoires. Nos data montrent qu’inhiber les NOX pourrait s’avérer une stratégie thérapeutique en augmentant le stress oxydatif dans les cellules leucémiques
350,000 leukaemia are diagnosed each year worldwide. In acute myeloid leukaemia (AML), relapse remains a major problem and the oxidative metabolism might play a crucial role in the therapeutic response. Low level of reactive oxygen species (ROS) is associated with properties of leukemic stem cells and quiescence whereas higher level promotes leukoblasts proliferation. ROS homeostasis relies on a tightly regulated balance between the oxidant and antioxidant systems. Although the antioxidant system is extensively studied in AML, the oxidant system remains poorly documented. In this work we aimed to study the seven NADPH oxidases (NOX) complexes in 25 AML human cell lines and primary samples. NOX transcriptional and protein profiles are variable with a higher expression of NOX2 in cell lines belonging to mature differentiation stages. An equivalent level of enzymatic activity was observed across all the cell lines. To reveal the contribution of NOX to global ROS production in the cells, two NOX inhibitors, DPI and VAS3947, were then used. Although both inhibitors efficiently blocked NOX activity they unexpectedly triggered strong oxidative stress leading to reduced cell proliferation and strong apoptosis, DPI by increasing mitochondrial ROS while VAS3947 by increasing cytoplasmic ROS production. To highlight which of the subunits were involved and to understand the mechanisms, NOX2 and p22phox subunits were inhibited using shRNA strategy. These did not affect cell proliferation but revealed a compensation effect. Our data suggest that NOX inhibition might be potential therapeutic strategy by increasing oxidative stress in leukemic cells

Les exosomes sont de petites vésicules membranaires secrétées dans le milieu extracellulaire principalement par les cellules hématopoïétiques. Le mécanisme menant à leur biogenèse commence à être élucidé, mettant en jeu la machinerie endosomale et la formation d'un endosome multivésiculaire (EMV). La fusion de cet EMV avec la membrane plasmique conduit à la libération des vésicules internes dans le milieu extracellulaire. Différentes études ont permis d'attribuer un rôle physiologique dans la présentation du peptide antigénique aux exosomes libérés par les cellules présentatrices d'antigène.
Ce travail montre que la sécrétion d'exosomes au cours de la maturation du réticulocyte est un processus issu d'un programme cellulaire permettant un remodelage membranaire en éliminant spécifiquement certaines protéines devenues inutiles voire dangereuses pour la cellule en fin de différenciation. Nos résultats suggèrent qu'une fois libérés dans la circulation sanguine, les exosomes de réticulocyte sont éliminés par un mécanisme similaire à celui impliqué dans la clairance des corps apoptotiques. L'action d'une iPLA2 d'origine endosomale et activable à la fois par les espèces réactives de l'oxygène libérées lors de la mitoptose et par la caspase-3 présente dans les vésicules permet la formation de lysophosphatidylcholine (LPC) à la surface des exosomes. Cette LPC est alors reconnue par les IgMs naturelles présentes dans la circulation, activant à leur tour la voie du complément. De la même façon, ApoH interagit avec les exosomes de réticulocyte et pourrait contribuer à leur élimination via la reconnaissance de phosphatidylsérine. La liaison de ces différentes opsonines en surface des exosomes pourrait en effet permettre leur ingestion par les phagocytes.

Chez Medicago truncatula, le nitrate, perçu comme un signal par MtNPF6.8, inhibe la croissance de la racine primaire en réduisant l’élongation des cellules. Comme les espèces réactives de l’oxygène (ROS) produites et converties (O2•−→ H2O2→ •OH) dans l’apex des racines contrôlent l'élongation cellulaire, nous avons évalué si les ROS pouvaient médier ce signal. Nous avons constaté que le nitrate réduit la teneur en ROS de l’apex de la racine primaire chez trois génotypes sauvages sensibles au nitrate (dont R108), mais pas chez des mutants npf6.8 (fond génétique R108) insensibles au nitrate. La diminution de la teneur en ROS observée chez R108 en réponse au nitrate est orchestrée par les peroxydases (POD) de paroi cellulaire qui éliminent H2O2 et empêchent sa conversion en •OH, espèce responsable du relâchement de la paroi et de l'allongement des cellules. Ces résultats démontrent que les ROS et les POD sont des médiateurs du signal nitrate. Nous avons également identifié une NADPH oxydase (MtRBOHF), comme autre médiateur du signal nitrate, la croissance de la racine primaire de mutants rbohF étant insensible au nitrate. En parallèle, une analyse couplée du transcriptome et du protéome de l’apex de la racine primaire de R108 et npf6.8, cultivés en absence ou en présence de nitrate, a été réalisée. Les résultats montrent que la sensibilité de la racine primaire au nitrate est fortement liée à la fonctionnalité de MtNPF6.8 et que de nombreux gènes qui répondent au nitrate sont impliqués dans l'homéostasie des ROS et l'organisation de la paroi cellulaire ou codent des facteurs de transcription
In Medicago truncatula, nitrate, acting as a signal perceived by MtNPF6.8, inhibits primary root growth through a reduction of root cell elongation. We evaluated here whether reactive oxygen species (ROS) could mediate the nitrate signal since ROS produced and converted (O2•−→ H2O2 → •OH) in the root tip have been reported to control cell elongation. We found that nitrate reduces the content in ROS of the primary root tip in three wild type genotypes (including R108) sensitive to nitrate, but not in the npf6.8 mutants (in the R108 genetic background), insensitive to nitrate. The decrease in ROS content observed in R108 in response to nitrate is orchestrated by cell wall peroxidases (PODs) that eliminate H2O2 and impair its conversion in •OH, the species responsible for cell wall loosening and cell elongation. These results demonstrate that ROS and PODs are downstream mediators of the nitrate signal. We further identified a NADPH oxidase (MtRBOHF), as another mediator in the nitrate signaling pathway, the primary root growth of rbohF mutants being insensitive to nitrate. We finally performed a coupled transcriptomic and proteomic analysis with R108 and npf6.8 grown in absence or presence of nitrate to uncover novel aspects of legume primary root tip response to nitrate. We found that the sensitivity of the primary root is strongly linked to the functionality of MtNPF6.8 and many nitrate responsive genes encompass genes involved in ROS homeostasis and cell wall organization, or encode transcription factors

Saccharothrix algeriensis est une Actinobactérie rare capable de synthétiser divers dérivés de dithiolopyrrolones (DTPs) aux propriétés phytosanitaires intéressantes. L'objectif de la thèse vise à développer différentes méthodes, alternatives à la synthèse organique, pour optimiser la production de DTPs par la régulation du métabolisme de la bactérie. Deux approches ont été envisagées : * la première fait appel à des éliciteurs chimiques tels que l'éthanol, le butan-1-ol, le diméthylsulfoxyde et des homosérines lactones (C4-HSL, 3-oxo-C12-HSL et 3-OH-C12-HSL). Les effets de la concentration de ces composés et du temps d'addition dans le milieu de culture ont été étudiés et une investigation sur le mécanisme d'action de l'éthanol a été initiée * la deuxième utilise une approche physico-chimique innovante modifiant le métabolisme microbien à l'aide d'une électrode polarisée. Des électrodes en carbone, en acier et en platine de topographies variées ont servi pour l'étude de l'effet du potentiel, par rapport à une électrode au calomel saturée (ECS), sur la croissance de S. algeriensis et la production de dithiolopyrrolones. Les résultats obtenus montrent que l'ajout de l'éthanol à une concentration de 1,74 % v/v ou du diméthysulfoxyde à 3 % v/v au début de la culture, induit une augmentation significative de la production spécifique des DTPs. Celle-ci est multipliée par un facteur 19 avec l'éthanol et par 6 avec le diméthylsulfoxyde. Dans le cas de l'éthanol, cette induction serait médiée par des espèces réactives de l'oxygène. Par ailleurs, l'ajout simultané de la C4-HSL et de la 3-oxo-C12-HSL à des doses successives de 500 µM permet de multiplier la production spécifique des DTPs par un facteur 2,5. L'utilisation d'une électrode polarisée, en platine ou en carbone, permet un bon développement mycélien de S. algeriensis contrairement à une électrode en acier. Sous le potentiel -0.3 V/ECS, des concentrations élevées en dithiolopyrrolones ont été quantifiées
Saccharothrix algeriensis is a rare Actinobacterium that produces a variety of dithiolopyrrolone derivatives (DTPs). These biocidal compounds are used as plant and crop- protection products. The aim of this thesis is to develop new strategies for DTPs production by regulating bacterial metabolism as an alternative to the chemical synthesis of these compounds. Two strategies were used : * the first strategy consist of using chemical elicitors such as ethanol, butan-1-ol, dimethylsulfoxide and homoserine lactones (C4-HSL, 3-oxo-C12-HSL and 3-OH-C12-HSL). The effects of concentration and time addition of these compounds were studied and ethanol mode of action was investigated. * the second strategy is a physico-chemical innovative approach that modifies bacterial metabolism using a polarized electrod. Platinum, carbon and stainless steel electrodes with varied topographies were used to study the effect of the potential, versus a saturated calomel electrode (SCE), on the growth of S. algeriensis and DTPs production. Our results show that the addition of pure ethanol and dimethylsulfoxide, at the beginning of the culture (t0), in respective concentrations of 1,74 % v/v and 3 % v/v increases DTPs specific production. This one was multiplied by nineteen-fold in presence of ethanol and by six-fold in presence of dimethylsulfoxide. In the case of ethanol, the induction of DTPs biosynthesis is mediated by reactive oxygen species (ROS). Furthermore, simultaneous addition of C4-HSL and 3-oxo-C12-HSL in multiple doses of 500 µM increases DTPs specific production by 2,5 fold. In presence of polarized platinum and carbon electrodes mycelium development of S. algeriensis is thicker than that grown on stainless steel electrode. Although, under - 0,3 V/SCE, high DTPs concentrations were quantified in comparison to other conditions tested

Le développement de la phase SIDA (Syndrome de l'ImmunoDéficience Acquise) chez les patients infectés par le virus VIH-1 (Virus de l'Immunodéficience Humaine) se caractérise par une diminution progressive du nombre de cellules T CD4. Orla majorité des cellules constituant cette déplétion sont non-infectées et appelées "bystander". En 2006, notre équipe a montré que le contact entre les cellules infectées exprimant les glycoprotéines de l’enveloppe (Env) et les cellules noninfectées exprimant les récepteurs CD4 et CXCR4 déclenche au sein de ces dernières la voie d’autophagie, ce qui mène à une mort cellulaire par apoptose. L'autophagie est un processus impliqué dans la dégradation de matériel cytoplasmiqueaprès sa séquestration au sein de vacuoles dans lesquelles il sera dégradé puis recyclé. Ce processus peut être hautement sélectif par l'action de protéines réceptrices tels que p62 ou NBR1.L’objectif de mon projet de thèse vise à comprendre comment l'autophagie induite par Env mène les cellules T CD4 bystander à leur mort par apoptose. Une précédente étude menée par notre équipe a démontré que les changements induits par Env au sein de ces cellules T CD4 non infectées comprenaient la production d’espèces oxygénées réactives (ROS) menant à un état de stress oxydatif. Nous montré que le stress oxydatif induit par Env est impliqué dans la mort des cellules T CD4 bystander par apoptose. Nous avons également observé que l’autophagie doit être dégradative pourmener ces cellules T CD4 à leur mort par apoptose. De plus, nous avons observé une dégradation des protéines peroxysomales par l’autophagie induite par Env dans le même modèle. Les peroxysomes sont des organelles essentielles de la cellule qui sont en partie responsables de la détoxification des ROS dans la cellule. Leur nombre est régulé par une dégradation sélective autophagique que l’on appelle la pexophagie.Dès lors, nous étudions l’hypothèse de l'induction par Env d’une dégradation sélective des systèmes antioxydants de la cellule par autophagie dans les cellules T CD4 bystander. Les peroxysomes étant des organites responsables de la réponse au stress oxydatif, leur dégradation sélective pourrait empêcher la cellule de faire face au stress oxydatif qu’elle subit et la mener vers une mort cellulaire par apoptose. En conclusion, nous montrons que l’autophagie induite par Env dégrade un système antioxydant important qui est un facteur clé nécessaire à la survie des cellules T CD4 bystander pour réduire le stress oxydatif induit par Env
The development of AIDS (Acquired ImmunoDeficiency Syndrome) in HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus)-infected patients is characterized by a progressive decrease in the number of CD4 T cells. The majority of dying cells are noninfected and called bystander CD4 T cells. In 2006, our team demonstrated that the contact between infected cells (expressing the envelope glycoproteins (Env)) and non-infected cells (expressing the CD4 and CXCR4 receptors) was responsible for enhancing the autophagic pathway which lead to their cellular death by apoptosis. The autophagicpathway is involved in the degradation of cytoplasmic material after its sequestration into vacuoles wherein it will be degraded and then recycled. This process can be highly selective through the involvement of receptor proteins such asp62 or NBR1.We aim at understanding how Env-mediated autophagy can lead to apoptosis in bystander CD4 T cells. A precedent workof our team showed that the changes induced by Env in bystander CD4 T cells included the production of reactive oxygen species (ROS) leading to an oxidative stress state. We showed that the oxidative stress induced by Env is involved in thecellular death by apoptosis of bystander CD4 T cells. We also show that the autophagic process involved has to be a degradative process to lead these CD4 T cells to their death by apoptosis. Moreover, we have observed that Env-mediatedautophagy was degrading peroxisomal proteins. Peroxisomes are essential organelles in the cell responsible partly for the detoxification of ROS in the cell. Their number is regulated through a selective autophagic degradation known aspexophagy.Therefore, we hypothesized that Env induced a selective degradation by autophagy of the cell antioxidant system in bystander CD4 T cells. Since peroxisomes are responsible for regulating the cellular response to an oxidative stress state, their selective degradation could prevent the cell from overcoming this event and eventually lead to its death by apoptosis. In conclusion, we are showing that Env-mediated autophagy degrades important antioxidant systems which are a key survival factor necessary to the bystander CD4 T cells to reduce the oxidative stress induced by Env

Dans cette étude, nous avons développé un composé dérivé du NADPH, nommé Nanoshutter (NS). NS a été conçu pour inhiber l'activité catalytique de la NOS, c'est à dire la synthèse de NO, en occupant la place du NADPH dans le domaine réductase du NOS. La voie de synthèse de NO chez les mammifère correspond à l'oxydation de la L-arginine catalysée par la NOS, qui se produit dans son domaine oxygénase. Basée sur des données de modélisation moléculaire, la structure de NS est composée deux sous-unités: (i) le motif nucléotidique de reconnaissance du NADPH a été retenu, permettant au composé NS un ciblage approprié du site de liaison au NADPH de la NOS, (ii) le motif nicotinamide de NADPH a été remplacé par un groupe stilbène lié à un groupement terminal accepteur d'électrons. De plus, ce fragment est caractérisé par une très bonne section efficace d'absorption à deux photons (130 GM à 840 nm). NS1, le composé prototype de la famille NS, contient un groupe terminal NO2 en tant que groupe accepteur d'électrons. La valeur de Kd (~ 4,2 µM) a été estimée dans des expériences de titrage sous excitation un- ou deux-photons, et suggère une bonne affinité de liaison de NS1 à la NOS. De façon inattendue, NS1 présente une bonne sélectivité, en terme de rendement quantique de fluorescence, pour les isoformes de NOS par rapport à d'autres protéines qui contiennent ou non un site de liaison NADPH. En outre, il a été montré que NS1 inhibait de façon compétitive NOS par rapport au NADPH. Dans les expériences d'imagerie de fluorescence réalisées sur des cellules endothéliales (HUVEC), NS1 a démontré une internalisation rapide et efficace, avec un signal de fluorescence mis en évidence principalement dans la région périnucléaire, accompagné d'un signal plus sporadique à la membrane plasmique. Cette observation est en parfait accord avec la colocalisation de NS1 et eNOS mesurée par immunomarquage, démontrant ainsi que NS1 cible eNOS dans les cellules endothéliales. La vasoconstriction NO-dépendante attendue dans les anneaux aortiques isolés de souris a été montrée, mais uniquement en présence de catalase qui convertit H2O2 en H2O et O2. En revanche, en l'absence de catalase, la vasorelaxation a plutôt été observée. Ce résultat indique que la NOS n'est très certainement pas l'unique cible de NS1 dans le système endothélial, et que d'autres cibles en rapport avec la modulation de ROS (Reactive Oxygen Species) sont impliquées. En accord avec ce résultat, NS1 provoque une réponse biphasique de la production de ROS dans les cellules HUVEC : Une phase d'augmentation est observée aux faibles concentrations de NS1 (en dessous de 2 µM), suivie d'une diminution (inhibition de ROS) pour des concentrations de NS1 plus élevées. En outre, NS1 inhibe la production de O2- dans les macrophages de souris et les productions de H2O2 et de O2- survenant dans des conditions de découplage de nNOS in vitro. Des explications possibles pour interpréter ces données sont: NS1 probablement inhibe la production de ROS, soit produites au niveau de la NADPH oxydase ou (et) au cours du découplage de la NOS. L'origine de la phase d'augmentation reste plus difficile à interpréter, mais pourrait correspondre au ciblage de la glucose-6-phosphate deshydrogénase. Enfin, NS1 exerce un effet anti -angiogénique sur les cellules endothéliales et empêche la prolifération de cellules du mélanome. En conclusion, NS1 rempli l'objectif principal de cibler et inhiber la NOS en ciblant plus particulièrement le domaine réductase - il est aussi caractérisé par des propriétés d'absorption et de fluorescence à deux photons intéressantes permettant des applications in vitro et in vivo. L'ensemble de ces caractéristiques présentent un profil intéressant pour de futures applications d'imagerie en temps réel et non-invasive, avec également un fort potentiel pour des applications cliniques liées aux maladies NO-dépendantes.

La bactérie hyperthermophile Thermotoga maritima a été cultivée dans un fermenteur dans lequel la concentration en O2 a été rigoureusement contrôlée. A 80°C et pH 7, il a été démontré que T. maritima pouvait survivre à des expositons de durées variables à l’O2 et qu’elle était capable de le consommer. La vitesse spécifique de consommation de l’O2 a été estimée à 73.6 µmoles O2.min-1.g protéines-1 lors d’une courte exposition à l’O2 (30 min). De longues expositions à l’O2 (20 h) nous ont permis de démontrer que la présence d’O2 ralentissait la croissance de T. maritima et conduisait à un shift du métabolisme vers la production de lactate aux dépens de l’acétate et à un arrêt de production d’H2. Dans ces conditions, il a été constaté que 73% du glucose était consommé selon un métabolisme partiellement oxydatif faisant intervenir simultanément les deux voies Embden-Meyerhof et Entner-Doudoroff de la glycolyse. En l’occurrence, l’oxydation incomplète du glucose est corrélée à la réduction de l’O2 en eau. Les études transcriptomiques ont montré que cette réduction de l’O2 résultait d’une cascade de réactions intermédiaires faisant intervenir des enzymes de type peroxydases [activation de l’expression des enzymes Ahp (alkyl hydroperoxyde réductase), Bcp1 et Bcp2 (thiol peroxydase thioredoxin-dépendante)] qui acheminent les électrons libérés via les radicaux libres. D’autres enzymes comme la rubréryhtrine et la neelarédoxine interviendraient pour détoxiquer les espèces réactives d’O2. Les électrons libérés seraient au final utilisés pour réduire l’O2 en H2O par l’enzyme FprA, dont l’expression varie en fonction du potentiel redox du milieu de culture. Ce schéma est proposé comme un des éléments essentiels du dispositif enzymatique permettant la consommation de l’O2 et la protection des cellules contre les effets des espèces réactives de l’oxygène chez T. maritima
Batch cultures of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima were performed in a bioreactor where O2 concentrations in the gas phase were strictly controlled. At 80°C and pH 7, we demonstrated that T. maritima survived despite being exposed to oxygen at different times and that it consumed it. O2 uptake rate was estimated at 73.6 µmoles O2 min-1g proteins-1 during a short exposure to O2 (30 minutes). A long time exposure of T. maritima cultures to oxygen (20h) led to a drastic reduction in growth, together with a shift in glucose metabolism towards lactate instead of acetate production and a stop in H2 production. Under these conditions, it has been observed that 73% of glucose was partially oxidised by using both Embden-Meyerhof and Entner-Doudoroff glycolytic payhways. Uncomplete oxidation of glucose is correlated to a reduction of O2 to H2O. Transcription analyses revealed that this reductive process of O2 involved enzymes like peroxidases [activation of alkyl hydroperoxide reductase (ahp), bcp1 and thioredoxin-dependent thiol peroxidase (bcp 2)]. Moreover, genes encoding reactive oxygen species (ROS)-scavenging systems (neelaredoxin and rubrerythrin), were found to be upregulated during oxygen exposure. The oxygen reductase FprA, which expression was shown to depend on the redox level of the culture medium, is proposed as a primary consumer of O2. All these enzymes are essential for T. maritima to consume O2 consumption and to fight against the toxic effects of ROS in cells

Les neutrophiles participent à la défense de l'hôte en phagocytant les agents pathogènes et en les détruisant via notamment la production de formes réactives de l'oxygène (FRO). Les FRO sont produites par un complexe multi- protéique :la NADPH oxydase (NOX2). Celle-ci peut s’assembler à la membrane du phagosome lors de la phagocytose mais aussi à la membrane plasmique lors de la stimulation des neutrophiles par des agents bactériens ou des médiateurs de l’inflammation. La NADPH oxydase est une arme à double tranchant; une activation excessive ou inappropriée de la NADPH oxydase génère un stress oxydant, facteur aggravant des nombreuses pathologies. Cette enzyme doit donc être finement régulée. La NADPH oxydase est activée lorsque les sous-unités cytosoliques de NOX2 (p67phox, p47phox, p40phox) et la petite GTPase Rac s’assemblent avec les sous-unités membranaires (p22phox et gp91phox) à la membrane phagosomale ou plasmique. P67phox régule le flux d'électrons qui transite via gp91phox du NADPH à O2.-. Des travaux récents indiquent que les phospholipides anioniques contribueraient à la régulation de la NADPH oxydase. De plus, Les protéines organisatrices p40phox et p47phox possèdent des domaines de liaison à ces phosphoinositides : p40phox peut se lier au phosphatidylinositol 3-phosphate (PI(3)P) et p47phox au phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate (PI(3,4)P2). Nous avons donc voulu comprendre le rôle des ces phospholipides dans la régulation de la NADPH oxydase. Dans un premier temps nous nous sommes intéressés au rôle du PI(3)P, présent au phagosome après la fermeture de celui-ci, dans l’activation de la NADPH oxydase. Nos données indiquent que p40phox fonctionne comme un adaptateur, PI(3)P dépendant, permettant de maintenir p67phox dans le complexe de la NADPH oxydase. Le PI(3)P agit comme un « timer » pour l'activation de la NADPH oxydase au phagosome. Nous avons ensuite voulu examiner le rôle du PI(3,4)P2 dans la régulation de la NADPH oxydase à la membrane plasmique. Ce lipide est formé à la membrane plasmique par phosphorylation du PI(4)P par la PI3K de classe I lors de l’activation des neutrophiles. Nous avons montré que, l'activité PI3K de classe I est nécessaire pour maintenir l’activation, intégrine-dépendante, de la NADPH oxydase à la membrane plasmique
The NADPH oxidase of the professional phagocyte is essential for the immune system. The phagocyte NADPH oxidase, NOX2, catalyze the reduction of molecular oxygen to superoxide. Superoxide is transformed rapidly into other reactive oxygen species (ROS) which play a critical role in the killing of pathogens in host defense. Indeed neutrophils, the first cells that arrive at the site of infections, engulf pathogens in a process called phagocytosis. The production of reactive oxygen species is then triggered by the NADPH oxidase in the phagosome. The importance of ROS production is demonstrated by the recurrent bacterial and fungal infections that face patients who lack functional NADPH oxidase as in the rare genetic disorder known as the chronic granulomatous disease (CGD). Upon stimulation by bacterial peptide or in some pathological conditions, NADPH oxidase can also be activated at the phagocyte plasma membrane producing ROS in the extracellular medium. So, an excessive or inappropriate NADPH oxidase activation generates oxidative stress involve in chronic inflammation, cardiovascular disease and neurodegenerative disease. The NADPH oxidase activity should be tightly regulated. The activity of the enzyme is the result of the assembly of cytosolic subunits (p47phox, p67phox, p40phox and Rac2) with membranous subunits (gp91phox and p22phox). P67phox regulates the electron flow through gp91phox from NADPH to oxygen leading to the formation of superoxide. Recent data indicate that the anionic phospholipids are important for the NADPH oxidase regulation. Moreover, p40phox and p47phox bear a PX domain that binds respectively phosphatidylinositol3-phosphate (PI3P) and phosphatidylinositol (3,4)-bisphosphate(PI(3,4)P2). Our objective was to decipher the importance of these phosphoinositides on the NADPH oxidase activity. We first examined the role of PI3P, which is present on the cytosolic leaflet of phagosome after its sealing, in NADPH oxidase activation. Our data indicate that p40phox works as a late adaptor controlled by PI3P to maintain p67phox in the NADPH oxidase complex. Thus, PI3P acts as a timer for NADPH oxidase assembly. We then examined the role of PI(3,4)P2 in the activation of the NADPH oxidase assembled at the plasma membrane. PI(3,4)P2 and PI(3,4,5)P3 are formed at the plasma membrane, upon neutrophil activation, by phosphorylation by Class I PI3K of respectively PI4P and PI(4,5)P2. We found that class I PI3K activity is required to maintain the integrin-dependent activation of NADPH oxidase at the plasma membrane

Dans ce travail, nous avons étudié la dégradation de la sulfaclozine, un antibiotique, dans des solutions aqueuses par photocatalyse (TiO2 en suspensions) ainsi que par oxydation par les ions persulfate. L'utilisation d'inhibiteurs spécifiques (KI et alcools) nous a permis de comprendre l'intervention de chacune des espèces réactives (électrons, trous, radicaux •OH) dans la dégradation de la sulfaclozine. En outre, l'identifications des produits de dégradation par LC-MS/MS et le suivi de leur cinétique d'apparition et de disparition avec et sans alcool nous a permis de proposer un mécanisme de dégradation photocatalytique faisant intervenir les trous, les radicaux •OH, les électrons, et les radicaux O2•–. Nous avons également évalués plusieurs méthodes d'activation du persulfate (UV, irradiation solaire, UV/TiO2 et Fe(II)) afin de générer des radicaux SO4•– pour dégrader la sulfaclozine. Nous avons montré qu'à pH 7, le système présentant la plus grande efficacité quelque soit la concentration de persulfate, était le système UV/TiO2/K2S2O8. L'utilisation des inhibiteurs spécifiques des radicaux •OH et SO4•– a permis de constater que le pH a un effet important sur le rôle de chacun de ces radicaux dans la dégradation de la sulfaclozine. Les constantes de vitesse de la réaction de la sulfaclozine avec les radicaux •OH et SO4•– ont été déterminées et des valeurs proches ont été trouvées (?109 M-1s-1). Nous avons également étudié l'effet des principaux ions constituants de l'eau sur la dégradation de la sulfaclozine dans les trois systèmes suivants: UV/TiO2, UV/TiO2/K2S2O8 et UV/K2S2O8. Cette étude a montré que les bicarbonates et les phosphates accélèrent la dégradation photocatalytique alors qu'aucun effet n'a été observé dans le système UV/K2S2O8. En ce qui concerne les ions chlorures et nitrates nous avons montré qu'ils augmentaient l'adsorption de la sulfaclozine à la surface de TiO2 mais n'accéléraient pas significativement la réaction de dégradation
In this work, we studied the degradation of the antibiotic sulfaclozine in aqueous solutions by photocatalysis (on TiO2 suspensions) as well as by persulfate ions. The use of specific inhibitors (KI and alcohols) allowed us to understand the intervention of each of the reactive species (electrons, holes, radicals •OH) in the degradation of sulfaclozine. In addition, the identification of the by-products by LC-MS / MS and the monitoring of their appearance and disappearance kinetics, allowed us to propose a photocatalytic degradation mechanism involving TiO2 holes, •OH radicals, electrons, and O2•– radicals. We also evaluated several methods for persulfate activation (UV, sunlight, UV / TiO2 and Fe (II)) to generate SO4•–. We have shown that at pH 7, the system having the highest efficiency, regardless of persulfate concentration, was the UV/TiO2/K2S2O8 system. The use of specific inhibitors of •OH and SO4•– radicals showed that pH has a significant effect on the role of each of these radicals in the sulfaclozine degradation. Moreover, the reaction rate constants of sulfaclozine with •OH radicals and with SO4•– radicals were determined and close values were found (?109 M-1s-1). We also studied the effect of the main water constituents on the degradation of sulfaclozine in the following three systems: UV/TiO2, UV/TiO2/K2S2O8 and UV/K2S2O8. This study showed that bicarbonate and phosphate accelerated the photocatalytic degradation of sulfaclozine while no effect was observed in the UV/K2S2O8 system. Regarding chloride and nitrate ions, we obtained an enhancement in sulfaclozine adsorption on the surface of TiO2 but no significant enhancement of the degradation rate was observed

En cellules vivantes, les interactions dynamiques entre les protéines jouent un rôle clé dans la régulation de nombreuses voies de signalisation et événements biochimiques. C’est également le cas de la NADPH oxydase (NOX) des phagocytes, qui est une enzyme majeure du système immunitaire inné. Elle génère des anions superoxyde (O₂•⁻), précurseurs d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), qui sont essentielles dans la lutte contre les infections microbiennes. La NADPH oxydase est un complexe protéique composé de six sous-unités ; deux protéines membranaires (NOX2 et p22phox) formant le centre catalytique, trois protéines cytosoliques (p67phox, p47phox et p40phox) et une petite GTPase Rac. Le mécanisme d’activation de la NADPH oxydase est basé sur l’assemblage de toutes les sous-unités cytosoliques avec les sousunités membranaire, où les interactions protéineprotéine jouent un rôle important. Un défaut d’activité de la NADPH oxydase cause une maladie granulomateuse septique chronique (CGD) caractérisée par des infections sévères et récurrentes. En revanche, des niveaux élevés de ROS contribuent aux maladies cardiovasculaires et neurodégénératives. Ainsi, l’activité de la NADPH oxydase doit être strictement régulée. Une meilleure compréhension de la machinerie de la NADPH oxydase au niveau moléculaire aidera à identifier les aspects clés de l’activité enzymatique et donc les potentielles cibles thérapeutiques. Le but de ma thèse était d’étudier l’état actif de la NADPH oxydase en utilisant des stratégies de microscopie à fluorescence en cellules vivantes. Pour détecter les interactions protéine-protéine, nous avons exploité le phénomène de transfert résonant d’énergie de type Förster (FRET) mesuré par imagerie de durée de fluorescence (FLIM). Étant donné que le phénomène de FRET a lieu uniquement entre des fluorophores proches spatialement (< 10 nm), il est approprié pour révéler les interactions à l’échelle nanométrique entre les sous-unités de la NOX étiquetées par des protéines fluorescentes (PFs) et il fournit également des informations sur la topologie du complexe enzymatique. Les approches de FRET-FLIM ont été réalisées soit avec des sous-unités séparées, soit avec une protéine de fusion chimérique appelée "Trimère". Le Trimère est composé des domaines essentiels des protéines cytosoliques p47phox, p67phox et Rac1, permettant une activité constitutive de la NADPH oxydase dans les cellules, sans avoir besoin d’un stimulant. Dans une première étape, nous avons travaillé avec les sous-unités individuelles étiquetés par les PFs dans les cellules de type fibroblastes ou dans des modèles de phagocytes. Nous avons comparé le PMA et l’acide arachidonique en tant qu’activateurs de la NADPH oxydase en termes de cinétique d’activation et de production de ROS. Les conditions expérimentales les plus convenables ont été explorées par la microscopie TIRF, qui permet d’exciter sélectivement des fluorophores situés près de la membrane plasmique et ainsi rend possible de suivre la formation du complexe actif de la NADPH oxydase en temps réel. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons utilisé majoritairement le Trimère. Les expériences FRET-FLIM ont révélé que le Trimère forme des clusters dans la membrane plasmique. L’activité continue de la NADPH oxydase incité par le Trimère a été également examinée en termes de conséquences sur la physiologie des cellules vivantes. Nous avons montré que la production continue de ROS à long terme conduit à l’acidification du pH intracellulaire et déclenche l’apoptose
In living cells, dynamic interactions between proteins play a key role in regulating many signaling pathways and biochemical events. It is also the case of the phagocyte NADPH oxidase (NOX), a key enzyme of the innate immune system. It generates superoxide anions (O₂•⁻), precursors of reactive oxygen species (ROS), such as hydrogen peroxide or hydroxyl radical that are critical for host responses to microbial infections. The NADPH oxidase is a protein complex composed of six subunits; two membrane proteins (NOX2 and p22phox) forming the catalytic core, three cytosolic proteins (p67phox, p47phox and p40phox) and a small GTPase Rac. The sophisticated activation mechanism of the NADPH oxidase relies on the assembly of all cytosolic subunits with the membrane-bound components, whereby proteinprotein interactions play an important role. Lack of the NADPH oxidase activity leads to chronic granulomatous disease (CGD) characterized by severe and recurrent infections. On the other hand, enhanced levels of ROS contribute to cardiovascular and neurodegenerative diseases. Thus, the NADPH oxidase activity needs to be tightly regulated in order to maintain physiological levels of ROS. Understanding the NADPH oxidase machinery at the molecular level will help to identify the key aspects of its enzyme activity and thereby potential therapeutic targets. The aim of my PhD project was to investigate the active state of the NADPH oxidase in living cells using state of the art fluorescence microscopy strategies. To detect the protein-protein interactions Förster Resonance Energy Transfer (FRET) measured by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) was a method of choice. As the FRET phenomenon occurs only between fluorophores in close proximity (< 10 nm), it is well-suited to reveal interactions of the NADPH oxidase subunits labeled by fluorescent proteins at nanoscale level, but also it provides information about the topology of the enzyme complex. FRET-FLIM was performed either with separated NOX subunits or with a chimeric fusion protein called “Trimera”. The Trimera is composed of the essential domains of the cytosolic proteins p47phox, p67phox and Rac1, enabling constitutive, robust NADPH oxidase activity in cells without the need of a stimulant. First, we worked with the individual FP-labeled cytosolic subunits in COSNOX cells (stably expressing NOX2/p22phox subunits) or macrophages and compared PMA and arachidonic acid as activators of the NADPH oxidase in terms of the activation kinetics and the total ROS production. By introducing mutations into the p47phox and p67phox subunits we were able to modulate the oxidase activity. The final validated working conditions were explored by TIRF microscopy, an imaging method allowing selective excitation of the fluorophores situated in the vicinity of the plasma membrane, and thus enabling to monitor the realtime formation of the active NADPH oxidase complex. We also focused on NOX2, the catalytic center of the NADPH oxidase that we labeled by FPs and prepared for further FRET-FLIM experiments aiming the investigation of NOX2/cytosolic subunits interactions. Second, we employed the Trimera that acts as a single activating protein of the NADPH oxidase. FRET-FLIM experiments revealed that theFP-Trimera forms clusters in the plasma membrane. The continuous long-term NOX activity elicited by the Trimera was also examined in terms of consequences on the physiology of living cells. We showed that the sustained ROS production leads to acidification of the intracellular pH and triggers apoptosis

Les peroxyrédoxines sont des enzymes essentielles de la cellule. Outre leur rôle d’antioxydant, elles sont aussi des régulateurs de la signalisation cellulaire et des suppresseurs de tumeurs. La péroxiredoxine 1 (Prx1) est la plus abondante parmi les six isoformes de peroxyrédoxines humaines. Elle est fréquemment surexprimée dans plusieurs types de cellules cancéreuses, et on a pu associer Prx1 aux processus de carcinogenèse et de métastase, ainsi qu’à la résistance à la radiothérapie ou la chimiothérapie. Ainsi, Prx1 pourrait donc être une cible anticancéreuse intéressante. Au cours de ce travail de thèse, nous avons d’abord évalué l'impact d’une diminution de Prx1 (Prx1 knockdown (Prx1–)) sur la sensibilité cellulaire à des dizaines de médicaments anticancéreux dont la vinblastine, le taxol, la doxorubicine, la daunorubicine, l’actinomycine D, et le 5-fluorouracile, et d’agents connus pour provoquer la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), dont le peroxyde d'hydrogène, le 2-phényléthyle isothiocyanate, le β-lapachone (β-lap) et la ménadione. Nous avons mis en évidence qu’une diminution de Prx1 augmente significativement la sensibilité des cellules à l'effet cytotoxique de la β-lap et de la ménadione, deux naphtoquinones possédant une activité anti-tumorale.Nous avons étudié les mécanismes responsables de l'augmentation de la cytotoxicité de la β-lap dans un contexte Prx1–. Nous montrons que la toxicité accrue de la β-lap dans des cellules Prx1– est due à une accumulation intracellulaire de ROS. Cet effet est dépendant de l’activité NADPH quinone oxydoréductase (NQO1) et s’accompagne d’une phosphorylation de c-Jun N-terminal kinases (JNK), protein 38 (p38), extracellular signal-regulated kinases (Erk) et des mitogen-activated protein kinases (MAPK), mais aussi d’une diminution des niveaux protéiques de la thiorédoxine 1. En se basant sur le fait que Prx1 est une enzyme antioxydante et un partenaire d'au moins ASK1 et JNK, deux éléments clés de la voie MAPK, nous proposons que la sensibilisation à la β-lap, observée après diminution de Prx1, est provoquée par une action synergique entre l'accumulation de ROS et l'induction de la voie MAPK, conduisant ainsi à l'apoptose.Nous avons ensuite étudié les mécanismes responsables de l'augmentation de la cytotoxicité de la ménadione dans le contexte Prx1–. La sensibilité accrue des cellules à l'effet cytotoxique de la ménadione et également associée à l'accumulation rapide et massive des ROS intracellulaire et à une mort cellulaire ressemblant à la nécrose programmée (necroptosis). L’accumulation de ROS induite par la ménadione et très rapidement détectée dans le cytosol, le noyau, et de façon encore plus importante, dans la matrice mitochondriale. Ce phénomène est en corrélation avec l'oxydation importante des thiorédoxine 2 et peroxiredoxine 3, deux protéines antioxydantes localisées dans la mitochondrie. La diminution de l’expression de Prx1 s’accompagne d’une augmentation des quantités tant de l’ARNm que de la protéine NRH: quinone oxydoréductase 2 (NQO2). Cette augmentation de l'activité de NQO2 est en grande partie responsable de l'accumulation intracellulaire de ROS et de la mort cellulaire après le traitement à la ménadione. Nos données révèlent que l’accumulation de ROS dans les cellules Prx1– provient de la résultante entre l’augmentation de leur production par NQO2 au cours du métabolisme de la ménadione et la diminution de leur élimination par Prx1. Enfin et de façon surprenante, selon la nature des naptoquinones (β-lap ou ménadione), les voies métaboliques qui conduisent à l'accumulation des ROS, ou les voies de signalisation et les mécanismes de mort cellulaire impliqués semblent être distincts
Peroxiredoxins have multiple cellular functions as major antioxidants, signaling regulators, molecular chaperones and tumor suppressors. Peroxiredoxin 1 (Prx1) is the most abundant among the six isoforms of human peroxiredoxins. It is frequently over-expressed in various cancer cells, which is known associated with carcinogenesis, metastasis and resistance to radiotherapy or chemotherapy. Prx1 could thus be an interesting anticancer target. In this study, we first evaluated the impact of Prx1 knockdown (Prx1–) on cellular sensitivity to dozens of anticancer drugs including vinblastine, taxol, doxorubicin, daunorubicin, actinomycin D, and 5-fluorouracil, and of reactive oxygen species (ROS)-generating agents, including hydrogen peroxide, 2-phenylethyl isothiocyanate, β-lapachone (β-lap) and menadione. We observed that Prx1 knockdown significantly enhanced cancer cell sensitivity to β-lap and menadione, two naphthoquinones with anti-cancer activity.We first investigated the underlying mechanisms responsible for the specifically enhanced cytotoxicity to β-lap in a Prx1 knockdown context. Prx1 knockdown markedly potentiated β-lap-induced cytotoxicity through ROS accumulation. This effect was largely NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1)-dependent and associated with the phosphorylation of c-Jun N-terminal kinases (JNK), protein 38 (p38) and extracellular signal-regulated kinases (Erk) proteins in mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways, and a decrease in thioredoxin 1 protein levels. Based on the fact that Prx1 is a major ROS scavenger and a partner of apoptosis signaling kinase 1 (ASK1) and JNK, two key components of MAPK pathways, we propose that Prx1 knockdown-induced sensitization to β-lap is achieved through the combined action of ROS accumulation and MAPK pathway activation, leading to cell apoptosis.We then investigated the underlying mechanisms responsible for the specifically enhanced cytotoxicity to menadione in Prx1– cells. Enhanced sensitivity to menadione was associated with a rapid and significant intracellular ROS accumulation and necroptotic-like cell death. Menadione-induced ROS accumulation occurred immediately in the cytosol, the nucleus, and even more noticeably in the mitochondrial matrix, correlated with significant oxidation of both mitochondria-localized thioredoxin 2 and peroxiredoxin 3. Prx1 knockdown significantly up-regulated mRNA and protein levels of NRH: quinone oxidoreductase 2 (NQO2). Increased activity of NQO2 was largely responsible for menadione-induced ROS accumulation and consequent cell death. Our data indicate that massive ROS accumulation results from the combined effect of increased ROS generation by higher NQO2 activity during menadione metabolism, and diminished Prx1 scavenging activity. Finally and noteworthy, the metabolic pathways that lead to ROS accumulation, downstream signaling pathways and cell death mechanisms appear to be distinct for β-lap and menadione

Les plantes n'échappent pas à leur lieu de vie, elles doivent en permanence adapter leurs processus physiologiques pour répondre aux variations de leurs conditions environnementales. Durant ma thèse, j'ai étudié deux stress affectant le développement des plantes, les stress thermique (HS) et oxydant (OS), en ciblant des éléments clé de ces phénomènes (les protéines de choc thermique Hsp et Thiorédoxines TRX) afin d'apporter des éléments de réponse quant à l'interconnexion de ces stress et leur importance pour la plante.En utilisant le riz et le soja comme modèles, je montre que le HS suit une « signature Ca2+ » en provoquant une entrée de calcium de l'apoplaste vers le cytosol, assurant ainsi une rigidité à la paroi cellulaire et une cascade de signaux. J'identifie aussi une Pectine Methylesterase nécessaire au remodelage de la paroi cellulaire et à l'intégrité de la membrane. J'ai aussi recherché comment la plante perçoit les changements de température et transmet ce signal vers des effecteurs. Par des analyses d'expression de gènes, je montre qu'une CaM bien spécifique coordonne la réponse au HS, qui se traduit par l'expression spécifique de certaines petites Hsp nucléaires et cytosoliques.Je réalise enfin une étude moléculaire de TDX, une TRX suspectée d'agir dans la réponse au HS. Je montre que TDX interagit avec des Hsp70 de type cytosoliques/nucléaires de façon redox dépendante, que les stress HS et OS induisent une relocalisation nucléaire de TDX. Je montre enfin que TDX est essentielle pour la thermotolérance acquise et la transduction du signal oxydant. Ces résultats sont discutés et des modèles de transduction des signaux entre HS et OS sont proposés
While being unable to escape their lands, plants are continuously submitted to the modifications of their environment, and need to adjust proper physiological processes in response to various stimuli. During this work, I devoted my studies on two major stresses affecting plant development, heat shock (HS) and oxidative stresses (OS), focusing on key elements in these pathways (HS chaperons and HS-related thioredoxins) in order to bring news elements of knowledge and interconnexion of these pathways.Using rice and soybean as mono- and dicotyledonous plant systems, I show how HS leads to calcium release from plant cell apoplast to the cytosol in a typical calcium signature, conferring cell wall rigidity and enhancing HS signaling pathway. I also identify Pectin Methylesterase as required in this pathway for cell wall remodeling and plasma membrane integrity. I further investigate how plant sense temperature increases and how they transmit the HS signal to downstream elements. Using systematic analyses of Calmodulin (CaM) and small heat shock protein (sHsp) gene expression, I identify one CaM as a coordinator of HS response, which I characterize as involving specific cytosolic/nuclear isoforms of the sHsp family.I latter perform the molecular analysis of TDX, a Thioredoxin suspected to be involved in heat shock response. I show that TDX interacts with cytosolic/nuclear members of the Hsp70 family in a redox dependent manner, both HS and OS inducing its nuclear relocation, and that TDX is required for both acquired thermotolerance and OS signaling.I finally discuss the data brought by this work and propose models with cross-talks between HS and oxidative stress signaling

La dynamique co-évolutive qui joue dans les systèmes hôte-parasite conduit à une véritable course aux armements entre les deux protagonistes qui se traduit, dans certaines interactions comme celle qui est traitée dans cette thèse, par un polymorphisme de compatibilité dont les bases moléculaires sont méconnues. L'objectif de cette thèse était de progresser dans la connaissance des mécanismes moléculaires sous-jacents à ce polymorphisme de compatibilité dans l'interaction Biomphalaria glabrata/Schistosoma mansoni. Une approche protéomique comparative entre des souches de parasites compatibles et incompatibles nous a permis d'identifier des déterminants moléculaires clés de l'interaction exprimés par le parasite. Il s'agit d'une part de mucines hautement polymorphes potentiellement antigéniques, les "Schistosoma mansoni Polymorphic Mucin" (SmPoMucs), et d'autre part de molécules anti-oxydantes ("ROS scavengers"). Afin d'aborder la question de la course aux armements de manière complète, nous avons également recherché la "contre-partie moléculaire" exprimée par le mollusque et susceptible d'exprimer ce polymorphisme de compatibilité. Dans ce but, des approches de co-précipitation ont été menées. Elles ont permis de montrer que les SmPoMucs interagissaient avec des récepteurs immunitaires diversifiés du mollusque, les Fibrinogen-related Proteins (FREPs). Nous montrons ainsi pour la première fois dans une interaction parasite/hôte invertébré l'intervention d'un "système de type antigène-anticorps" impliquant un répertoire individuel polymorphe d'antigènes potentiels du parasite (les SmPoMucs) et un répertoire individuel diversifié de récepteurs immunitaires de son hôte (les FREPs). Nous avons également montré que le complexe immun formé par les deux dernières molécules citées incluait un troisième partenaire, une thioester-containing protein (TEP) qui appartient à une classe de molécules connue pour son rôle dans la fagocytose ou l'encapsulation. La présence de ce troisième partenaire au sein d'un même complexe renforce le rôle potentiellement immunitaire de ce complexe dans la reconnaissance et l'élimination du parasite. Au travers de cette thèse, nous nous sommes également intéressés à la course aux armements jouant sur les mécanismes effecteurs de l'immunité du mollusque. Dans notre modèle, les effecteurs responsables de la destruction du parasite sont principalement des espèces réactives de l'oxygène (ROS). Dans ce cas aussi, nous avons montré qu'il existe une concordance phénotypique entre la production de ROS par l'hôte et le niveau de "ROS scavengers" produits par le parasite pour contrecarrer la réaction de l'hôte. Ainsi, les mécanismes moléculaires responsables du polymorphisme de compatibilité dans l'interaction B. glabrata/S. mansoni s'appuieraient au moins sur deux facteurs d'une part sur la confrontation de répertoires de molécules polymorphes et/ou diversifiées en ce qui concerne les mécanismes de reconnaissance immunitaire, et d'autre part sur une adaptation réciproque quantitative en ce qui concerne certains mécanismes effecteurs de l'immunité.

L’infarctus du myocarde constitue la première cause de mortalité cardiovasculaire. A ce jour, la seule stratégie permettant de limiter la mort cellulaire au cours de l’ischémie cardiaque est la reperfusion. Néanmoins, elle est à l’origine de lésions qui lui sont propres. L’établissement d’un cercle vicieux entre la surproduction d’espèces réactives oxygénées mitochondriales (EROmt) et la surcharge calcique (Ca2+) matricielle semble être un acteur clé de l’exacerbation de la mort cellulaire dans les premiers instants de la reperfusion. Dans ce contexte, l’objectif de ce travail de thèse a été de développer et/ou de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de stratégies naturelles permettant de limiter l’établissement de ce cercle vicieux pour permettre une protection des mitochondries au cours de l’ischémie-reperfusion. Notre première stratégie a été d’identifier dans la nature des molécules antioxydantes dont les propriétés physico-chimiques permettent de cibler le stress oxydant mitochondrial. Nous avons pu identifier un antioxydant naturel, la sinapine dont les propriétés chimiques pourraient lui conférer un tropisme mitochondrial. On a ainsi pu démontrer in vitro, in cellulo, ex vivo et in vivo que la sinapine était capable de cibler le stress oxydant mitochondrial et ainsi diminuer la sensibilité du cœur à l’IR. La deuxième étude de ce travail de thèse consistait à mieux identifier les mécanismes cellulaires sous-jacents à la cardioprotection par l’exercice physique. Une attention toute particulière a été portée sur le rôle clé joué par la signalisation du monoxyde d’azote (NO) au niveau mitochondrial. En effet, le NO est bien décrit comme pouvant moduler la production d’EROmt et comme permettant de protéger le cœur au cours de l’IR. Néanmoins, à ce jour, l’impact de l’exercice sur la signalisation eNOS-NO au niveau mitochondrial est mal connu. Nous avons pu observer qu’un entraînement modéré de 5 semaines était à l’origine d’une translocation de la eNOS au niveau des mitochondries et que celle-ci était associée à une augmentation de la biodisponibilité du NO au niveau mitochondrial et à une modification du s-nitrosoprotéome. Enfin, nous avons pu montrer que la S-nitrosylation joue un rôle clé dans la protection des mitochondries en situation de stress permettant de mimer l’ischémie-reperfusion. Mots
Cardiovascular ischemic heart disease remains one of the main cause of morbidity and mortality worldwide. Reperfusion is essential to blunt cell death during ischemia. However, post-ischemic reperfusion exacerbates cell death during the first minute of reperfusion. This is mainly explained by the activation of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP). A vicious circle between overproduction of mitochondrial ROS (mtROS) and matrix mitochondrial calcium overload (Ca2+) is proposed today as a main trigger of mPTP activation during IR. Thus, the aim of this work, was to i) proposed new strategy to blunt this vicious circle and protect mitochondria during IR or ii) better understand the underlying mechanisms of natural cardioprotective strategy. Targeting mitochondria with antioxidant is a promising strategy. In this work, we identified a natural antioxidant, sinapine, able to target mitochondrial oxidative stress. We reported that sinapine but not sinapic acid limit mitochondrial oxidative stress and ROS production during cardiac IR. In our second study, we decipher the role of nitric oxide in exercise-induced cardioprotection. We reported that exercise training resulted in eNOS translocation to mitochondria which impact the bioavailability of NO and the S-nitrosylation of mitochondrial key proteins involved in cardioprotection. Finally, we reported that S-nitrosylation played a key role in the protection of mitochondria during stress situations mimicking cardiac ischemia-reperfusion. Keywords

Le système nerveux consiste en plusieurs types cellulaires quels interagissent avec eux-mêmes pour conduire des potentiels d’action du soma au travers l’axone vers la synapse. Dans les nerfs périphériques, les cellules de Schwann interagissent avec les neurones par enrouler autour l’axone et créer une gaine de myéline. Cette gaine de myéline permit une conduction rapide des potentiels d’action de nœud de Ranvier vers nœud de Ranvier, quels sont petits régions non-myélinisés de l’axone. En plus, les cellules de Schwann transportent du lactate vers le neurone et le neurone utilise ce lactate pour la production d’énergie sous la forme d’ATP. Cette production est nécessaire, parce que beaucoup de processus dans des cellules, comme la conduction des potentiels d’action, ont besoin d’ATP. Trois mécanismes sont impliqués à la production d’ATP : la glycolyse dans le cytosol et le cycle de Krebs et la chaîne de transport d'électrons dans les mitochondries. Par contre, la production d’ATP par des mitochondries résulte en la production du dérivés réactifs de l'oxygène (DRO), quels provoquent du stress oxydative. DRO peuvent être présent en plusieurs formes et ces formes différentes ont des traits spécifiques, mais tous les formes peuvent endommager la cellule. Par exemple, l’ion superoxyde est très réactif donc ils agissent extrêmement vite avec les molécules dans son environnement. Par contre, peroxyde d'hydrogène est un type de DRO quel est moins réactif, mais peut diffuser à plus longue distances et peut oxyder des cibles plus distales. Heureusement, les cellules sont équipées avec un système antioxydant compétant en consistent une groupe d’enzymes antioxydant, quels réduisent du DRO à l’eau. Si les mitochondries dysfonctionnent ou si l’équilibre entre DRO et antioxydants devient en disbalance, des neuropathies pourraient se développer, comme sclérose latérale amyotrophique (SLA), sclérose en plaques (SEP), maladie d'Alzheimer et maladie de Parkinson. Au SNP, des neuropathies périphériques comme la maladie Charcot-Marie-Tooth (CMT) peuvent se développer en raison d’excès du DRODans cette thèse, je présente un modèle élaboré pour la production d’ATP et DRO par les mitochondries in vivo. Je montrerai comment les cellules de Schwann utilisent l’effet Warburg, la transition de métabolisme de phosphorylation oxydative à glycolyse, pour la production de lactate, quel est transporté vers le neurone pour la production d’énergie. Je montrerai aussi que sans l’effet Warburg dans des cellules de Schwann, le métabolisme neuronal est détérioré menant à la production d’ATP diminué, déficits neuronales et des problèmes moteurs. Suite à l’activité nerveuse, la production d’ATP par des mitochondries augmente, mais aussi la production de DRO. Pourtant les deux productions ne sont pas en parallèle. En plus, je montre que la physiologie mitochondriale est affectée par des neuropathies. Aux souris avec défectueux mitofusin2, un modèle pour CMT2A, le contact entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries est diminué, à côté d’un changement de morphologie et fonction mitochondriale. En plus, démyélinisation résulte dans des déficits de la production ATP et DRO, montrent une dissociation pathologique entre la production d’ATP et DRO.Pour obtenir ces résultats, des techniques d'imagerie avancées étaient utilisé pour imager les nerfs périphériques des souris transgéniques. Ces transgènes sont introduit dans les souris par injection des vecteurs virales, quels induisent l’expression des sondes fluorescents dans les cellules neuronales. Ces sondes fluorescentes étaient détectées par microscopie multiphotonique. En plus du modèle de la production d’ATP et DRO dans des nerfs périphériques, je présente un protocole pour introduire des vecteurs viraux dans le nerf sciatique
The nervous system consists of several cell types that interact with each other in order to conduct action potentials from the neuronal soma through axons to the synapse. In peripheral nerves, Schwann cells interact with neurons by wrapping around the axon and creating a myelin sheath. This myelin sheath allows for fast conduction of action potentials from node of Ranvier to node of Ranvier, which are small unmyelinated areas of the axon. In addition, Schwann cells transfer lactate to the neuron, which the axonal mitochondria use to produce energy in the form of ATP. This is necessary, because many cellular processes, such as the conduction of action potentials use ATP. The production of ATP involves three mechanisms: anaerobic glycolysis in the cytosol and the Kreb’s cycle and electron transport chain within mitochondria. However, the production of ATP by mitochondria also results in the production of reactive oxygen species (ROS), which cause cell damage. ROS can be present in several different forms and these different forms have specific properties. For example, superoxide anions are highly reactive and subsequently react rapidly with the molecules in their environment. Hydrogen peroxide on the other hand is less reactive but hence can diffuse over longer distances and react with their targets more distally. Fortunately, the cell contains a competent antioxidant system, which can reduce ROS to water. When mitochondria malfunction or when the equilibrium between ROS and antioxidants becomes in disbalance, neuropathies can develop, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), multiple sclerosis (MS), Alzheimer’s disease or Parkinson’s disease. In the PNS, peripheral neuropathies can develop such as Charcot-Marie-Tooth disease as a result from an excess of ROS.In this thesis, I will provide an elaborate model for ATP and ROS production by axonal mitochondria in vivo. I will show how Schwann cells use the Warburg effect, the shift in metabolism from oxidative phosphorylation to anaerobic glycolysis, to produce lactate, which is then transported to the neuron for energy production. I also demonstrate that without the Warburg effect in Schwann cells neuronal metabolism would be impaired, leading to impaired ATP production, neuronal deficits and motor problems. Following action potential firing, not only ATP is produced by mitochondria, but also ROS, although with independent dynamics. In addition, I show that mitochondrial physiology is affected by several neuropathologies. In mitofusin2 deficient mice, a model for CMT2A, contact between the endoplasmic reticulum and mitochondria is impaired next to affected mitochondrial morphology and function. Also demyelination causes deficits in mitochondrial ATP and ROS production, showing a pathologic decoupling between ATP and ROS.To obtain these results, advanced imaging techniques were used to image peripheral nerves of transgenic mice. These transgenes were introduced in mice via injection of viral vectors which induce expression of fluorescent probes in neuronal cells. These fluorescent probes were detected via multiphoton microscopy. Next to the model for ATP and ROS production in peripheral nerves, I provide a protocol for introducing viral vectors into mouse sciatic nerves

Le métabolisme de la cellule cancéreuse s'adapte aux besoins en macromolécules de cette cellule en prolifération et en réponse aux signaux du microenvironnement tumoral. Ainsi, la biosynthèse des acides gras monoinsaturés (AGMI), est augmentée dans les cellules cancéreuses coliques et associée à une augmentation de l'activité de la stéaroyl-CoA désaturase (SCD), enzyme limitante de cette synthèse. Les acides gras polyinsaturés (AGPI) comme les isomères conjugués de l'acide linoléique (CLA), c9,t11 CLA et t10,c12 CLA possèdent à la fois un effet inhibiteur sur l'activité SCD et un effet anti-tumoral dont les mécanismes moléculaires restent à préciser. Dans ce contexte, les objectifs de ce travail furent d'évaluer le rôle de SCD-1 dans la survie de la cellule cancéreuse colique (CCC) et les mécanismes de régulation sous-jacents mais également d'apporter des éléments nouveaux sur les régulations à l'origine de l'effet anti-prolifératif des CLA. Nous avons tout d'abord montré que l'extinction de l'expression de SCD-1 conduit à l'apoptose des CCC dépendante de CHOP. En revanche l'extinction de SCD 1 n'affecte en rien les cellules non cancéreuses. Par ailleurs, nous avons étudié les effets sur la viabilité des CCC de deux isomères de l'acide linoléique le c9,t11-CLA et le t10,c12-CLA in vitro. Nos résultats montrent que seul le t10,c12-CLA induit une mort cellulaire par apoptose des CCC sans affecter la survie de cellules coliques non transformées. Il apparait aussi être le seul isomère à réduire la biosynthèse des AGMI dans les CCC. La mort induite par le t10,c12 CLA dans les CCC est dépendante de l'activation d'un stress du RE via la production d'espèces réactives de l'oxygène.Nos travaux apportent des éléments nouveaux dans la compréhension du rôle de SCD 1 dans la survie des cellules cancéreuses coliques et les mécanismes d'action du t10,c12 CLA. Notre étude soutient l'hypothèse de faire de la biosynthèse des AGMI une cible thérapeutique possible dans le traitement des cancers colorectaux

Objectif : Étudier les mécanismes apoptotiques impliqués dans la néphropathie diabétique en identifiant les gènes responsables de l’apoptose et activés par les espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules de tubules proximaux rénaux (RPTC) de différents modèles diabétiques. Méthodes : Une hybridation par puce à AND a été réalisée sur les ARN extraits à partir de RPTC de souris heterozygotes db/m+, db/db and db/db catalase (CAT)-transgénique (Tg) de 20 semaines. Des expériences de PCR en temps réel et d’immunohistochimie réalisées sur ces modèles et sur le modèle ou le diabète avait été induit par traitement au streptozotocin (STZ) ont permis de valider les gènes apoptotiques identifiés par puce à ADN. Des RPTC immortalisées de rat ont été utilisées pour montrer l’activité de ces gènes apoptotique et la régulation de leur expression. De plus, une étude additionnelle réalisée sur des sections rénales provenant de patients diabétiques et non diabétiques a démontré également une surexpression de ces gènes apoptotiques dans les IRPTC. Résultats: L’expression de Bcl-2-modifying factor (Bmf), une protéine apoptotique, semble augmentée dans les RPTC de souris db/db comparé aux souris contrôles db/m+, ou aux souris db/db CAT-tg. La surexpression de Bmf a également été identifiée dans les RPTC du modèle diabétique STZ. La normalisation de l’hyperglycémie chez ces souris par traitement à l’insuline semble normaliser également l’expression de Bmf. In vitro, la surexpression du cDNA de Bmf dans les RPTC promouvoit l’apoptose et augmente l’activité de caspase 3. La stimulation de RPTC de Rat avec le glucose élevé (25mM de D-glucose) semble augmenter l’expression de Bmf et le traitement de ces cellules avec la roténone, les Diphénylène iodonium, la catalase et l’apocynine semble renverser cette stimulation. L’inhibition de Bmf avec un siRNA semble réduire l’apoptose induite par le glucose élevé. L’expression de Bmf a également été démontrée dans les RPTC de patients diabétiques. Conclusion: Ces résultats ont démontré une surexpression de Bmf dans les RPTC de différents modèles diabétiques et suggèrent son potentiel rôle dans la régulation de l’apoptose et de l’atrophie tubulaire chez les diabétiques.
Objective: To investigate the mechanisms underlying tubular apoptosis in diabetes by identifying pro-apoptotic genes that are differentially upregulated by reactive oxygen species in renal proximal tubular cells (RPTCs) in models of diabetes. Research Design and Methods: Total RNAs isolated from renal proximal tubules (RPTs) of 20 week-old heterozygous db/m+, db/db and db/db catalase (CAT)-transgenic (Tg) mice were used for DNA chip microarray analysis. Real time-quantitative polymerase chain reaction assays, immunohistochemistry and mice rendered diabetic with streptozotocin were used to validate the pro-apoptotic gene expression in RPTs. Cultured rat RPTCs were used to confirm the apoptotic activity and regulation of pro-apoptotic gene expression. Additionally, studies in kidney tissues from patients with and without diabetes were employed to confirm enhanced pro-apoptotic gene expression in RPTs. Results: Bcl-2-modifying factor (Bmf) was differentially upregulated (p<0.01) in RPTs of db/db mice as compared to db/m+ and db/db CAT-Tg mice and in RPTs of streptozotocin-induced diabetic mice in which insulin reversed this finding. In vitro, Bmf cDNA overexpression in rat RPTCs co-immunoprecipated with Bcl-2, enhanced caspase-3 activity and promoted apoptosis. High glucose (HG, 25 mM) induced Bmf mRNA expression in RPTCs, while rotenone, catalase, diphénylèneiodonium and apocynin decreased it. Knockdown of Bmf with small interference RNA reduced HG-induced apoptosis in RPTCs. Importantly, enhanced Bmf expression was detected in RPTs of kidneys from patients with diabetes. Conclusion: These data demonstrate differential up-regulation of Bmf in diabetic RPTs and suggest a potential role for Bmf in regulating RPTC apoptosis and tubular atrophy in diabetes.