Дисертації з теми "Enzyme interaction"
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1
Bruce, Stephen James. "Drug-enzyme interaction through chromatographic profiling." Thesis, Imperial College London, 2004. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.408153.
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2
Riley, Jane. "The interaction of topoisomerase IV with potential DNA substrates." Thesis, University of Liverpool, 2002. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.272768.
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3
Campbell, Robert Stewart. "Trazine dye interaction with the isoenzymes of creatine kinase." Thesis, Open University, 1990. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.254865.
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4
Jones, G. R. D. "The interaction of the blood clotting factors with cellular components." Thesis, University of Oxford, 1987. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.376932.
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5
Mmutle, Tsietso Bernard. "Synthesis and interaction of secondary N-nitrosamines with acetylcholinesterase." Thesis, Rhodes University, 1991. http://hdl.handle.net/10962/d1004119.
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Secondary N-nitrosamines: diphenylnitrosamine (DPhNA), dimethylnitrosamine (DMNA), diethylnitrosamine (DENA), dipropylnitrosamine (DPNA), dibutylnitrosamine (DBNA), diethanolnitrosamine (DEtNA), methylnitrosoglycine (MNGly), nitrosopyrrolidine (NPyr), nitrosomorpholine (NMor) and nitrosopiperidine (NPip) were synthesised and their interaction with acetylcholinesterase (AChE) was investigated. Analyses of kinetic results show that DMNA (Ki=34.78 μM); DENA (Ki=54.24 μM); DPNA(Ki=60.36 μM); DBNA(Ki=95.54 μM); DEtNA(Ki=43.68 μM)MNGly (Ki=30.18 μM); NPip (Ki=123 μM); NPyr (Ki=66.07 μM), NMor (Ki=73.93 μM) and DPhNA (Ki=20.32 μM) are competitive and reversible inhibitors of acetylcholinesterase, with respect to the substrate, acetylthiocholine chloride, ATChCl. With time they act as irreversible covalent inhibitors with dipropy1nitrosamine producing 72% inactivation after 60 minutes. Scatchard analyses of f1uorometric titrations, (Kd=0.75mM-4.09mM); gel chromatography (Kd=O. 80mM-4. 60mM) and equilibrium dia1ysis (Kd=O. 71mM- 4.21mM) for MNG1y, DMNA, DEtNA, DENA, DPNA, NPyr, DSNA, NMor and NPip show that these compounds have weaker affinity for the enzyme, as compared to the much tightly binding aromatic DPhNA, Kd values (0.65mM, 0.68mM and 0.68mM) for fluorometric experiments, gel chromatography and equilibrium dialysis respectively. In all cases, the number of binding sites of acetylcholinesterase averaged to four.
6
Ngqwala, Nosiphiwe Patience. "Interaction of metallic nanoparticles with biomedical enzyme target: neuronal nitric oxide synthase." Thesis, Rhodes University, 2013. http://hdl.handle.net/10962/d1001536.
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Alzheimer's disease (AD) is the most common type of dementia characterized by intracellular appearance of neurofibrillary tangles, synaptic and neuronal loss; and extracellular accumulation of amyloid-β (Aβ) peptide in senile plaques. The initial causes leading to AD are unknown, and the available treatments are only effective at slowing the degeneration process. The accumulation of arginine in the brain of Alzheimer patients indicates a possible disruption of enzymes responsible for its metabolism. One such enzyme is neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and controlling its activity by interacting with nanoparticles may lead to a delay in the onset of the disease. Neuronal nitric oxide synthase was purified using DEAE-Sephacel ion exchange resulting in 10 % yield, 0.43 fold recovery and specific activity 0.09 U/mg. The enzyme was found to be a dimer with a molecular mass of 150 kDa. Characterisation of the nNOS showed an optimum temperature and pH of 50°C and 7.5 respectively, and it was relatively stable at the optimum conditions (t½ = 100 min). The purity was analysed by SDS-PAGE followed by Western blot. Purified nNOS was challenged with 3-7 nm silver and 4-15 nm gold nanoparticles of between synthesized chemical using AgNO3 and either sodium borohydride or sodium citrate. Results showed that gold nanoparticles are more effective at low concentration (5 μM) than silver nanoparticles due to their size difference. Incubation of different concentration of nanoparticles (5, 15, 25, 50 μM) with the purified nNOS showed an initial decrease of 5% in enzyme activity which over time was restored to 80%. This suggests that different nanoparticles are produced in different sizes and interaction over a given time may result in enzyme association–dissociation mechanism. Inhibition studies showed a strong binding of both nanoparticles with Ki values of 1.4 μM and 0.2 μM for silver and gold, respectively. Both nanoparticles inhibited the activity of nNOS extensively as they bound strongly to the inhibition site on the enzyme and were more in contact with fluorophores nanoparticles. This was confirmed by fluorimetry with binding constants of 0.0084 μM and 0.01092 μM for silver and gold, respectively. Results of this study suggest that silver and gold nanoparticles competitively inhibit nNOS.
7
Prieto, Luisa Perpetua Simenta Valente Estevez. "Studies of the interaction of selected organic solvents with human liver cytochrome P450." Thesis, University of Sheffield, 1999. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.310861.
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Peng, YI. "Pyruvate formate lyase and pyruvate formate lyase activating enzyme spectroscopic characteristics, interaction and mechanism /." Diss., Connect to online resource - MSU authorized users, 2008.
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Roland, Nathalie. "Interactions des fibres alimentaires avec les enzymes du métabolisme des xénobiotiques chez le rat : hétéroxenise avec une flore humaine." Paris 11, 1994. http://www.theses.fr/1994PA114830.
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Maharjan, Chandra Kumar. "Interaction of Na+/K+ ATPase with Bcl-2 Proteins: Isolated Enzyme vs Epithelial Cell Extracts." Wright State University / OhioLINK, 2016. http://rave.ohiolink.edu/etdc/view?acc_num=wright1464692938.
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Chen, Xin. "Structure/function analysis of the Drosophila fat facets deubiquitinating enzyme and analysis of the faf-dependent signaling pathway." Access restricted to users with UT Austin EID Full text (PDF) from UMI/Dissertation Abstracts International, 2001. http://wwwlib.umi.com/cr/utexas/fullcit?p3036169.
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Spenkuch, Felix Michael [Verfasser]. "Enzyme tRNA interaction and (t)RNA conformation probed via environmentally sensitive cyanine dyes / Felix Michael Spenkuch." Mainz : Universitätsbibliothek Mainz, 2014. http://d-nb.info/1060232200/34.
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Dhouib, Rabeb, Dk Seti Maimonah Pg Othman, Victor Lin, Xuanjie J. Lai, Hewa G. S. Wijesinghe, Ama-Tawiah Essilfie, Amanda Davis, et al. "A Novel, Molybdenum-Containing Methionine Sulfoxide Reductase Supports Survival of Haemophilus influenzae in an In vivo Model of Infection." FRONTIERS MEDIA SA, 2016. http://hdl.handle.net/10150/622464.
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Haemophilus influenzae is a host adapted human mucosal pathogen involved in a variety of acute and chronic respiratory tract infections, including chronic obstructive pulmonary disease and asthma, all of which rely on its ability to efficiently establish continuing interactions with the host. Here we report the characterization of a novel molybdenum enzyme, TorZ/MtsZ that supports interactions of H. influenzae with host cells during growth in oxygen-limited environments. Strains lacking TorZ/MtsZ showed a reduced ability to survive in contact with epithelial cells as shown by immunofluorescence microscopy and adherence/invasion assays. This included a reduction in the ability of the strain to invade human epithelial cells, a trait that could be linked to the persistence of H. influenzae. The observation that in a murine model of H. influenzae infection, strains lacking TorZ/MtsZ were almost undetectable after 72 h of infection, while similar to 3.6 x 10(3) CFU/mL of the wild type strain were measured under the same conditions is consistent with this view. To understand how TorZ/MtsZ mediates this effect we purified and characterized the enzyme, and were able to show that it is an S- and N-oxide reductase with a stereospecificity for S-sulfoxides. The enzyme converts two physiologically relevant sulfoxides, biotin sulfoxide and methionine sulfoxide (MetSO), with the kinetic parameters suggesting that MetSO is the natural substrate of this enzyme. TorZ/MtsZ was unable to repair sulfoxides in oxidized Calmodulin, suggesting that a role in cell metabolism/energy generation and not protein repair is the key function of this enzyme. Phylogenetic analyses showed that H. influenzae TorZ/MtsZ is only distantly related to the Escherichia colt TorZ TMAO reductase, but instead is a representative of a new, previously uncharacterized Glade of molybdenum enzyme that is widely distributed within the Pasteurellaceae family of pathogenic bacteria. It is likely that MtsZ/TorZ has a similar role in supporting host/pathogen interactions in other members of the Pasteurellaceae, which includes both human and animal pathogens.
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Elinder, Malin. "Towards a New Generation of Anti-HIV Drugs : Interaction Kinetic Analysis of Enzyme Inhibitors Using SPR-biosensors." Doctoral thesis, Uppsala universitet, Institutionen för biokemi och organisk kemi, 2011. http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:uu:diva-152172.
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As of today, there are 25 drugs approved for the treatment of HIV and AIDS. Nevertheless, HIV continues to infect and kill millions of people every year. Despite intensive research efforts, both a vaccine and a cure remain elusive and the long term efficacy of existing drugs is limited by the development of resistant HIV strains. New drugs and preventive strategies that are effective against resistant virus are therefore still needed. In this thesis an enzymological approach, primarily using SPR-based interaction kinetic analysis, has been used for identification and characterization of compounds of potential use in next generation anti-HIV drugs. By screening of a targeted non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor (NNRTI) library, one novel and highly potent NNRTI was identified. The inhibitor was selected with respect to resilience to drug resistance and for high affinity and slow dissociation – a kinetic profile assumed to be suitable for inhibitors used in topical microbicides. In order to confirm the hypothesis that such a kinetic profile would result in an effective preventive agent with long-lasting effect, the correlation between antiviral effect and kinetic profile was investigated for a panel of NNRTIs. The kinetic profiles revealed that NNRTI efficacy is dependent on slow dissociation from the target, although the induced fit interaction mechanism prevented quantification of the rate constants. To avoid cross-resistance, the next generation anti-HIV drugs should be based on chemical entities that do not resemble drugs in clinical use, either in structure or mode-of-action. Fragment-based drug discovery was used for identification of structurally new inhibitors of HIV-enzymes. One fragment that was effective also on variants of HIV RT with resistance mutations was identified. The study revealed the possibility of identifying structurally novel NNRTIs as well as fragments interacting with other sites of the protein. The two compounds identified in this thesis represent potential starting points for a new generation of NNRTIs. The applied methodologies also show how interaction kinetic analysis can be used as an effective and versatile tool throughout the lead discovery process, especially when integrated with functional enzymological assays.
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Patcharapinyopong, Chaiwut. "The phospholipase B response in rats infected with Fasciola hepatica and demonstration of the enzyme-parasitic interaction." Thesis, University of North Texas, 1999. https://digital.library.unt.edu/ark:/67531/metadc798055/.
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Fasciola hepatica was studied in outbred rats to determine of infection would cause an increase phospholipase B activity and the percentage of periperal blood eosinophilis. A second experiment was performed to investigate eosinophilis.
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Kamba, Keisuke. "Development of real-time NMR monitoring method and elucidation of the deamination mechanism of APOBEC3G." Kyoto University, 2016. http://hdl.handle.net/2433/215971.
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Gründel, Anne. "Funktion glykolytischer Enzyme von Mycoplasma pneumoniae in der Wirt-Erreger-Interaktion." Doctoral thesis, Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden, 2016. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa-213500.
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Mycoplasma pneumoniae ist ein parasitär lebendes Bakterium, das eine atypische Pneumonie beim Menschen verursacht. Aufgrund seiner geringen Genomgröße besitzt dieser Organismus einen eingeschränkten Metabolismus sowie eine limitierte Zahl an Pathogenitätsfaktoren. Dennoch ist dieser Mikroorganismus perfekt an seinen Wirt angepasst und es war zu vermuten, dass neben dem komplexen Adhäsionsapparat von M. pneumoniae auch glykolytische Enzyme eine Rolle bei der Interaktion mit humanen Zellen spielen. Diese Enzyme sind maßgeblich bei intrazellulär ablaufenden Stoffwechselprozessen beteiligt. Es wurde jedoch bereits bei anderen Bakterien gezeigt, dass glykolytische Enzyme ebenfalls auf der Bakterienoberfläche zu finden sind und dort mit Komponenten der extrazellulären Matrix des Wirtes interagieren können. Dieser Vorgang trägt offensichtlich zur erfolgreichen Kolonisation des Wirtes bei. Ziel dieser Arbeit war es, alle glykolytischen Enzyme von M. pneumoniae hinsichtlich ihrer Lokalisierung zu beschreiben und Teilaspekte ihrer Funktion in der Interaktion mit Wirtskomponenten zu analysieren.
Die glykolytischen Enzyme wurden rekombinant produziert und für die Herstellung von monospezifischen polyklonalen Antikörpern verwendet. Die Lokalisation der Enzyme wurde durch Nachweis in der Membran- und Zytosolfraktion des M. pneumoniae Gesamtantigens untersucht. Mittels Immunfluoreszenz, Colony Blot und Protease-Verdau intakter Bakterienzellen wurde bestätigt, dass acht (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Lactatdehydrogenase, Transketolase, Pyruvatdehydrogenase, Phosphoglyceratmutase und Pyruvatdehydrogenase Untereinheiten A-C) der 19 glykolytischen Enzyme mit der Bakterienoberfläche assoziiert vorkommen.
Die Untersuchung von Mutanten ergab, dass die Lokalisation der Enzyme nicht an das Vorkommen der für die Anheftung der Bakterien an Zielstrukturen wesentlichen Adhäsine wie die Proteine P1, P40 und P90 sowie das Oberflächenprotein P01, gekoppelt ist. Jedoch sind sowohl intakte Zellen von M. pneumoniae als auch die oberflächenlokalisierten glykolytischen Enzyme in der Lage, an verschiedene humane Zellen zu binden. Eine Analyse der nachweisbaren Proteine auf der Oberfläche der Zellen führte zur Auswahl von sechs humanen Proteinen für weiterführende Studien: Plasminogen, Vitronektin, Fibronektin, Fibrinogen, Laminin und Laktoferrin. Mittels ELISA wurde eine konzentrationsabhängige Bindung der oberflächenassoziierten Enzyme von M. pneumoniae mit Wirtsproteinen festgestellt, die hinsichtlich der Intensität jedoch Unterschiede aufwies. So konnten ausgeprägte Interaktionen aller Enzyme mit humanem Plasminogen und Vitronektin nachgewiesen werden. Die Bindung von Fibronektin und Laktoferrin ist dagegen nur für einen Teil der glykolytischen Enzyme zu bestätigen. Die Untersuchung verschiedener Einflussfaktoren ergab, dass alle Bindungen zwischen glykolytischen Enzymen und humanen Proteinen spezifisch durch die entsprechenden Antiseren gehemmt werden und dass der Großteil der Interaktionen ionischen Wechselwirkungen unterliegt. Die Bindung zu Plasminogen basiert überwiegend auf Lysin-Resten. Untersuchungen, ob sich die glykolytischen Enzyme gegenseitig in der Bindung zu Wirtsfaktoren beeinflussen, ergab ein komplexes Muster, das hinsichtlich Plasminogen, Fibronektin und Laminin für eine Überlagerung der für die Interaktion maßgeblichen Proteinbereiche spricht.
Die Untersuchung einer möglichen Aktivierung von inaktivem Plasminogen zu proteolytisch aktivem Plasmin ergab, dass in Gegenwart aller oberflächenlokalisierten glykolytischen Enzyme von M. pneumoniae Plasmin gebildet wird. Es wurden jedoch Unterschiede im Aktivierungspotenzial nachgewiesen. Die Pyruvatdehydrogenase Untereinheit B zeigte die höchste, die Pyruvatdehydrogenase Untereinheit C die geringste Plasminproduktion. Die Verwendung des gewebespezifischen Plasminogenaktivators führte zu einer höheren Aktivierung als der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator. Die Variabilität der Plasminproduktion kann mit der unterschiedlichen Bindungsaffinität der glykolytischen Enzyme zu Plasminogen begründet werden. So besitzt die Pyruvatdehydrogenase Untereinheit B im Vergleich mit der Pyruvatdehydrogenase Untereinheit C ein höheres Bindepotenzial, das sich in der gemessenen Aktivierung widerspiegelt. Die Bildung von Plasmin kann zum Abbau verschiedener extrazellulärer Matrix-Proteine führen. Diese Prozesse sind physiologisch, z. B. in der Fibrinolyse, von Bedeutung. Während in Gegenwart der glykolytischen Enzyme die humanen Proteine Laktoferrin, Laminin und Fibronektin nicht abgebaut wurde, konnte Fibrinogen in Gegenwart der Pyruvatdehydrogenase Untereinheit B bzw. der Phosphoglyceratmutase und Vitronektin durch alle glykolytischen Enzyme (bis auf die Pyruvatdehydrogenase Untereinheit C) degradiert werden.
Mit der erstmals durchgeführten Analyse aller glykolytischen Enzyme eines Mikroorganismus hinsichtlich ihrer Lokalisation und der Bindung zu Komponenten der humanen extrazellulären Matrix wurde ein komplexes Netzwerk an Wirt-Erreger-Interaktionen nachgewiesen.
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Frenal, Karine. "Caractérisation structurale et fonctionnelle de TgDRE : une enzyme de réparation de l' ADN du parasite Toxoplasma gondii." Paris 6, 2006. http://www.theses.fr/2006PA066031.
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Pauthe, Emmanuel. "Approches cinétiques et moléculaires de la reconnaissance enzyme-substrat : application à l'étude de l'activité protéolytique de la thermolysine." Compiègne, 1998. http://www.theses.fr/1998COMP1139.
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L’accomplissement de tout acte protéolytique implique nécessairement la formation d'un complexe entre l'enzyme et son substrat. Par différentes approches cinétiques, spectroscopiques et moléculaires nous avons cherché à caractériser les phénomènes mis en jeu au cours de l'hydrolyse, par la thermolysine, de petits peptides en milieu biomimétiques. Cette étude a été conduite à l'interface entre la biochimie, la biophysique, la chimie et la physique. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés au comportement catalytique de la thermolysine sur des substrats modèles et en milieu modifié. Nous avons montré d'une part, que l'ajout d'additifs polyhydroxylés influence grandement l'activité de la thermolysine et d'autre part, affine les connaissances sur la spécificité et la sélectivité de cette enzyme (en particulier, mise en évidence de l'influence du résidu P'2 dans le mécanisme). Dans un deuxième temps, nous présentons des études structurales des peptides substrats en milieu modifié. Nous avons mis en évidence l'absence d'influence du micro-environnement contenant une forte proportion de glycérol sur la conformation des molécules de substrat et le rôle possible de leur structure tridimensionnelle quant à leur hydrolyse. Ces études ont été étendues à un autre modèle peptidique, de forme cyclique ou linéaire, et corrélées aux résultats cinétiques. Dans un troisième temps, par deux approches différentes, nous avons abordé l'étude des relations structure-fonction de la thermolysine. Expérimentalement, par des études cinétiques avec l'enzyme immobilisée et des déterminations de sa structure par spectroscopie laser Raman, nous montrons que l'enzyme est très peu sensible au micro-environnement. Théoriquement en analysant, par modélisation, l'interaction de la thermolysine avec un tripeptide substrat, nous avons mis en évidence des changements de conformation du substrat et/ou des mouvements du site actif enzymatique au cours de l'acte catalytique.
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El, Kirat-Chatel Karim. "Interaction de la phospholipase D avec des systèmes lipidiques biomimétiques : rôle de l'organisation membranaire sur l'activité de cette enzyme." Lyon 1, 2002. http://www.theses.fr/2002LYO10191.
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La phospholipase D (PLD) est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse des phospholipides, elle participe ainsi au remodelage des membranes biologiques. Deux protocoles de mesure de l'activité PLD de Streptomyces chromofuscus ont été mis au point. L'une est basé sur l'utilisation d'un substrat chromogène hydrosoluble : le bis(paranitrophényl)phosphate. Ce substrat a permis de distinguer les facteurs influençant l'activité enzymatique et ceux permettant la localisation de la PLD à la surface des membranes phospholipidiques. L'autre protocole de dosage de l'activité PLD que nous avons développé est basé sur l'utilisation des monocouches de Langmuir. Cette technique permet de déterminer les propriétés physique des membranes lipidiques. Ainsi, nous avons mis en évidence un lien entre l'activité PLD et la rhéologie de la membrane phospholipidique constituant son substrat naturel. Cette technique a aussi permis de définir les propriétés interfaciales de cette enzyme. Ces protocoles ont été mis au point afin de proposer des outils d'analyse de l'activité de PLD plus complexes comme celles de mammifère. Dans la deuxième partie de ce travail, nous nous sommes intéressés à une activité PLD PIP2- dépendante de cellule eucaryote. Les enzymes responsables de cette activité ne sont pas faciles à purifier et présentent des régulations très fines et complexes. De plus, la membrane plasmique des cellules eucaryotes possède des microdomaines lipidiques dont la composition et les propriétés physiques sont particulières. Nous avons alors recherché une activité PLD PIP2-dépendante au sein des microdomaines préparés à partir de cerveau de porc. Cette activité enzymatique est fortement impliquée dans la signalisation lipidique, sa localisation au sein de ces structures pourrait être liée à sa régulation. Les résultats obtenus ont soulevé plusieurs interrogations sur la signification d'un enrichissement en activité PLD PIP2-dépendante dans les microdomaines
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Castaing, Bertrand. "La formamidopyrimidine-ADN glycosylase, un enzyme de reparation de l'ADN chez E. Coli : étude de son interaction avec l'ADN." Aix-Marseille 2, 1993. http://www.theses.fr/1993AIX22035.
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La formamidopyrimidine-adn glycosylase (fpg ou mutm) tient une place originale parmi les systemes de reparation de l'adn par excision de base chez e. Coli et constitue un antimutateur puissant de la transversion spontanee g. C. T. A. Fpg est une metalloproteine a zinc multifonctionnelle qui assure l'elimination des purines a cycle imidazole ouvert (residus formamidopyrimidiques ou fapy) et de la 8-oxoguanine (8-oxog), lesions genotoxiques et promutagenes induites dans l'adn par les radiations ionisantes et par l'oxygene singulet. A cote de ses activites fapy- et 8-oxog-adn glycosylase, la proteine fpg est associee a une activite ap endonuclease de classe i. Nous avons applique la methode des gels retards pour l'etude de l'interaction entre fpg et l'adn et nous avons pu mettre en evidence que: 1) un oligonucleotide contenant un site abasique reduit ou un site 1,3-propanediol (analogues de site ap) n'est pas metabolisable par l'enzyme mais se comporte comme un inhibiteur fort des deux activites de l'enzyme. Il forme un complexe abortif stable avec fpg et constitue un ligand de haute affinite pour celle-ci (k#dapp=2,610#1#0m); 2) le site de coordination du zinc dans la proteine est associe au motif conserve -cys-x#2-cysx#1#6-cys-x#2-cys- et est replie sous la forme d'un doigt a zinc necessaire a la fixation de la proteine a l'adn; 3) l'excision de la 8-oxog par l'enzyme est fonction de la base qui est appariee a la lesion et les vitesses d'excision de la 8-oxog dans les paires 8-oxog. N (ou n=c,t,g, ou a) refletent une affinite differente de l'enzyme pour ces differents substrats, 4) fpg interagit avec un facteur cellulaire contenu dans un extrait brut de e. Coli. Il ne se fixe au complexe binaire (fpg/adn) que quand l'adn cible est porteur d'une lesion 8-oxog et n'interfere pas dans la reconnaissance d'un analogue de site ap. Nous proposons que ce facteur est implique, in vivo, dans la reconnaissance specifique de la paire de bases 8-oxog. C
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Sugimoto, Yu. "Development of Electrostatic and Three-Dimensional Random Orientation Models for Enzyme-Electrode Interfaces in Direct Electron Transfer-Type Bioelectrocatalysis." 京都大学 (Kyoto University), 2017. http://hdl.handle.net/2433/225651.
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Kyoto University (京都大学)0048
新制・課程博士
博士(農学)
甲第20426号
農博第2211号
新制||農||1048(附属図書館)
学位論文||H29||N5047(農学部図書室)
京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻
(主査)教授 加納 健司, 教授 植田 充美, 教授 三上 文三
学位規則第4条第1項該当
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Hermansson, Anders. "Calculating Ligand-Protein Binding Energies from Molecular Dynamics Simulations." Thesis, KTH, Skolan för kemivetenskap (CHE), 2015. http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-170722.
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Indications that existing parameter sets of extended Linear Interaction Energy (LIE) models are transferable between lipases from Rhizomucor Miehei and Thermomyces Lanigunosus in complex with a small set of vinyl esters are demonstrated. By calculat- ing energy terms that represents the cost of forming cavities filled by the ligand and the complex we can add them to a LIE model with en established parameter set. The levels of precision attained will be comparable to those of an optimal fit. It is also demonstrated that the Molecular Mechanics/Poisson Boltzmann Surface Area (MM/PBSA) and Molecular Mechanics/Generalized Born Surface Area (MM/GBSA) methods are in- applicable to the problem of calculating absolute binding energies, even when the largest source of variance has been reduced.
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Artigas, Alejo Joan. "The role of fungi and bacteria on the organic matter decomposition process in streams: interaction and relevance in biofilms." Doctoral thesis, Universitat de Girona, 2008. http://hdl.handle.net/10803/7874.
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L'objectiu d'aquest estudi és el d'investigar sobre l'ús de matèria orgànica per part dels fongs i bacteris que colonitzen diferents substrats bentònics en rius Mediterranis i analitzar l'efecte dels factors ambientals i antròpics sobre l'estabilitat estructural i funcional de les comunitats del biofilm. La metodologia emprada en aquest estudi consisteix en: i) anàlisi de la biomassa bacteriana i fúngica, ii) anàlisi de la composició de les comunitats bentòniques (identificació d'hifomicets aquàtics i anàlisi del 16S rDNA bacterià), i iii) anàlisi de l'activitat enzimàtica extracel·lular relacionada amb el reciclatge de matèria orgànica en rius.This study aimed to investigate on the use of organic matter by fungi and bacteria inhabiting different benthic substrata and to analyze the effect of environmental and anthropogenic perturbations on the structural and functional stability of biofilms. The following methodologies has been used in this study: i) analysis of fungal and bacterial biomass, ii) analysis of benthic community composition (identification of hyphomycete taxa, analysis of the bacterial 16S rDNA), and iii) analysis of extracellular enzyme activities involved in organic matter recycling in rivers.
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Dive, Vincent. "Mise au point d'inhibiteurs peptidiques puissants des collagénases bactériennes : étude des interactions collagénase-inhibiteur." Paris 6, 1986. http://www.theses.fr/1986PA066395.
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De puissants inhibiteurs peptidiques de collagénases d'origine bactérienne (Empedobacter collagenolyticum, Clostridium histolyticum, Achromobacter iophagus) ont été mis au point et les interactions inhibiteur-enzyme ont été étudiées: relation structure-activité; méthodes de calculs semi-empirique, résonance magnétique nucléaire du proton.
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Mahé-Gouhier, Nicole. "Etude des interactions lipase/colipase par chromatographie d'affinite conventionnelle (cac) et haute performance (cahp)." Paris 7, 1987. http://www.theses.fr/1987PA077062.
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Cette these repose sur l'application de la chromatographie d'affinite (zonale) conventionnelle (cac) et haute performance (cahp) a l'etude des interactions de la lipase (ou ses isolipases, ou sa sequence c terminale) d'une part, et la colipase, d'autre part. Les constantes de dissociations k::(d) du complexe calculees en cac et cahp sont voisines des valeurs mesurees par d'autres techniques non chromatographiques dans des conditions operatoires similaires. La cahp est une technique qui permet de determiner rapidement la stabilite du complexe lipase/colipase. L'influence de parametres physiques et physico-chimiques montre que la nature des interactions lipase/colipase est mixte, de type hydrophobe et ionique. En cahp les isolipases a et c presentent une affinite plus faible que l'isolipase b pour le cofacteur immobilise. Le peptide b, region c terminale de l'enzyme, engage des interactions specifiques avec la colipase, ce qui laisse supposer que le site d'association de la lipase avec son cofacteur se situe dans la region 336-449
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Lacapère, Jean-Jacques. "Mecanisme reactionnel de l'atpase calcium du reticulum sarcoplasmique : interaction avec les nucleotides, role des cations divalents." Paris 6, 1987. http://www.theses.fr/1987PA066465.
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L'atpase calcique du reticulum sarcoplasmique hydrolyse une molecule d'atp pour transporter du calcium contre son gradient de concentration. Plusieurs hypotheses existantes pour expliquer ce phenomene: 1) deux sites topologiquement differents (un site catalytique de haute affinite et un site activateur de basse affinite) 2) un seul site ayant des affinites differentes pour les deux conformations principales de l'enzyme, la saturation sur site basse affinite entrainant une acceleration du changement de conformation 3) un seul site, la liaison d'atp sur le site catalytique phosphoryle de l'enzyme, apres depart de l'adp, induisant l'activation. Par une approche cinetique, la derniere hypothese est la plus solidement etayee. Les auteurs proposent un schema de fonctionnement de cette enzyme ou, a fortes concentrations de substrat, le site catalytique serait toujours occupe par l'atp. L'activation serait le fruit de modifications de differentes etapes du cycle
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Bruch, Marcel. "Regulation de l'elastolyse par interaction de macromolecules avec l'elastine ou l'elastase." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 1987. http://www.theses.fr/1987STR13001.
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Rodrigues, Fábio Henrique dos Santos 1986. "Derivados de quinazolinas na inibição da adenosina quinase." [s.n.], 2011. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/248424.
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Orientador: Ljubica TasicDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química
Made available in DSpace on 2018-08-19T12:26:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_FabioHenriquedosSantos_M.pdf: 24628982 bytes, checksum: f6b1490bc6bf2bf5497e5cad40a40daa (MD5) Previous issue date: 2011
Resumo: A Adenosina Quinase (ADK) é uma enzima importante (EC 2.7.1.20), cuja ação pode estar relacionada a diversas doenças, tais como inflamações, derrame, infarto, entre outras. Desse modo, a inibição de sua atividade é de grande importância, e desperta interesse científico. Na tentativa de inibir a ação da ADK, houve busca por compostos orgânicos cuja capacidade inibitória seja superior comparando-se com inibidores da ADK existentes. Desse modo, derivados de 4-anilinoquinazolinas mostraram-se alvos interessantes. Foi sintetizada uma série de 22 derivados de 8-metóxi-4-anilinoquinazolinas, substituídas nas posições 3'e 4'do anel anilínico. Os compostos sintetizados foram caracterizados e testados frente à ADK, de forma a verificar seu potencial inibitório, principalmente através da técnica de fluorescência de emissão. Da série de compostos, seis apresentaram-se promissores na inibição da ADK. Ensaios in silico também foram realizados, buscando-se uma melhor compreensão do mecanismo de inibição do sistema compostos/ADK
Abstract: The Adenosine Kinase (ADK) is an important enzyme (EC 2.7.1.20) that might be related to several diseases, such as inflammation, stroke and infarct, and many others. Therefore, its activity inhibition is of great importance, arising significant scientific interest. Aiming ADKs inhibition, a search for suitable organic species was realized, in such way that 4-anilinoquinazoline derivatives showed themselves interesting targets. A serie of 22 8-methoxy-4-anilinequinazoline derivatives, substituted on the aniline ring at 3'and 4'positions, was synthesized. The compounds were characterized and tested in in vitro ADKs inhibition, in order to verify their inhibitory potentials, mainly applying emission fluorescence technique. Six compounds of this serie presented promising properties in ADKs inhibition. In silico assays were also conducted, in order to better explain the inhibitory mechanism of the system compounds/ADK
Mestrado
Quimica Organica
Mestre em Química
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Lundmark, Kristoffer. "Characterisation of free and conjugated protease inhibitors from Solanum tuberosum." Thesis, Uppsala universitet, Institutionen för kemi - BMC, 2017. http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:uu:diva-313835.
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The main purpose of the master thesis project is to investigate the influence of selected serine protease inhibitors (SPI) on the catalytic action of the serine proteases chymotrypsin and trypsin, in a conjugated and non-conjugated state. The inhibitors included for this study were extracted from Solanum tuberosum, i.e.common potato. The purification method included in this study consist of crude extraction by mixer, followed by a salt-out procedure with ammonium sulphate. Further purification steps were cation exchange chromatography and, finally, gel filtration to obtain SPI of high purity. The purified sample was then characterized by SDS-page and kinetic activity measurement of trypsin and chymotrypsin action on synthetic substrate derivate, N-Benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide hydrochloride (BAPA) and N-Succinyl-L-phenylalanine-p-nitroaniline (SFpNA) respectively. The characterization showed inhibitory inactivation of both pancreatic proteases. This would indicate successful extraction of SPI. To investigate inhibitory action in a conjugated state, either enzyme or inhibitor was immobilized onto aluminium oxide membranes. Then two different experimental setups were tested, called experiment 1 and 2. In experiment 1, the inhibitor was immobilized and the interaction was monitored from a retention shift of enzyme flow-through compared to a blank column, using detection at 280 nm of the enzyme. In experiment 2 the enzyme was instead immobilized and a mixture of inhibitor and substrate was circulated with monitoring of the catalytic activity. The main goal was thus to measure the effects on the kinetics in the conjugated state compared to enzyme and inhibitor in the free state. The result from both experiment 1 and 2 did not yield consistent and reliable result so the discussed method should be regarded as preliminary results. The study also includes investigation of inhibitor-enzyme interaction as revealed by molecular mass data to determine complex formation. This part was conducted with static light scattering analysis to determine the stoichiometry for the interaction between pancreas proteases and the inhibitor. Results from light scattering showed promising indication of many-to-one interaction between enzyme and inhibitor, which have been seen by previous studies. It should be considered a preliminary result as complex formation does not exclude aggregation of enzymes or inhibitor in the solution.
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Michel, Valérie. "Effets indésirables et interactions médicamenteuses des inhibiteurs de l'enzyme de conversion : a propos de 7 cas dans le service de cardiologie de l'hôpital Beaujon à Clichy." Paris 5, 1992. http://www.theses.fr/1992PA05P104.
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Negrerie, Michel. "Etude par spectroscopie raman des conformations et interactions moleculaires dans la membrane postsynaptique." Paris 6, 1987. http://www.theses.fr/1987PA066551.
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La conformation moleculaire des lipides et des proteines est etudiee par spectroscopie de diffusion raman. La spectroscopie raman permet de decrire la structure secondaire du recepteur cholinergique et la position de certains acides amines aromatiques. Etude de la structure d'une neurotoxine. L'influence de deux modifications chimiques portant sur les acides amines conserves dans la sequence des neurotoxines. La conformation structurale de l'acetylcholine esterase est egalement abordee
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Smith, Dustin M. "Uncovering mechanisms to improve predictions : the alteration in CYP2C9 kinetics by albumin and identifying the cause of the drug-drug interaction between enoxacin and CYP1A2 /." Thesis, Connect to this title online; UW restricted, 2007. http://hdl.handle.net/1773/8181.
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Bonaventure, Audrey. "Facteurs de risque des leucémies aiguës de l’enfant et interactions gènes-environnement." Thesis, Paris 11, 2014. http://www.theses.fr/2014PA11T008.
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Le but de cette thèse était d’analyser les associations entre plusieurs facteurs environnementaux (consommations maternelles de tabac, d’alcool et de boissons caféinées pendant la grossesse) et médicaux (antécédents d’asthme ou d’eczéma) et les leucémies aiguës de l’enfant, et d’étudier des polymorphismes génétiques susceptibles de modifier ces associations. Les analyses ont été réalisées à partir de l’étude cas-témoins nationale ESCALE réalisée en population générale en 2003 et 2004. Les données sur les antécédents médicaux et les consommations maternelles pendant la grossesse ont été recueillies au cours d’un entretien téléphonique standardisé des mères. Les polymorphismes génétiques d’intérêt ont été sélectionnés suivant une approche candidate sur leur fonctionnalité, dans des gènes impliqués dans le métabolisme du tabac (CYP1A1*2, CYP2E1*5, NQO1*2, EPHX1 et NAT2*5), de l’alcool (CYP2E1*5, ADH1C*2) et de la caféine (NAT2*5), et dans l’allergie (IL4, IL4R, IL10 et IL13). Les données génétiques ont été obtenues à partir de prélèvements de sang chez les cas et de salive chez les témoins, par génotypage de 370 000 SNPs chez les cas et sur puce à façon de 4 500 SNPs chez les témoins, complété par des imputations génotypiques lorsque les polymorphismes candidats n’étaient pas disponibles au génotypage. Au total, les données étaient disponibles pour 493 cas de leucémie aiguë et 442 témoins d’origine européenne.La consommation maternelle de café pendant la grossesse était positivement associée aux leucémies aiguës de l’enfant dans cette étude. Aucune association significative n’était observée avec le tabagisme maternel ou la consommation d’alcool pendant la grossesse. La présence de deux allèles NAT2*5 était associée aux leucémies aiguës lymphoblastiques (Odds Ratio OR=1.9 [1.3-2.7]), mais les analyses ne montraient pas d’association avec les autres polymorphismes des enzymes du métabolisme. Aucune interaction significative n’a été observée entre les polymorphismes candidats et le tabagisme maternel ou les consommations d’alcool ou de boissons caféinées pendant la grossesse. Cependant, les allèles candidats de CYP2E1, NQO1 et EPHX1, trois enzymes impliquées dans le métabolisme du benzène, semblaient interagir entre eux.Les allèles variants dans les gènes IL13, IL4, IL10 et IL4R n’étaient pas associés au risque de leucémie de l’enfant. Les antécédents d’asthme ou d’eczéma étaient plus fréquemment retrouvés chez les témoins que chez les cas (OR=0.7 [0.6-0.9]). Cette association inverse était essentiellement retrouvée chez les enfants porteurs d’un haplotype variant régulant l’expression de l’IL10 (p interaction=0.08) et porteurs de deux allèles de référence pour IL13-rs20541 (p interaction=0.06).En conclusion, ces résultats suggèrent un rôle de la consommation de café dans le risque de leucémie, déjà observé dans la précédente étude de l’équipe, qui devra être répliqué et approfondi. En revanche, aucune association n’a été observée avec la consommation maternelle de tabac ou d’alcool, même en tenant compte des polymorphismes génétiques candidats. L’interaction gène-gène des trois enzymes impliquées dans le métabolisme du benzène est intéressante et devra être explorée dans d’autres études. Enfin, l’association inverse entre le risque de leucémie aiguë et les antécédents d’asthme ou d’eczéma semble limitée aux enfants porteurs de certains polymorphismes des interleukines IL10 et IL13, ce qui pourrait refléter des mécanismes biologiques sous-jacents. Ces hypothèses pourront être testées d’autres études, et en particulier dans l’étude ESTELLE, récemment réalisée par l’équipeThe aim of this thesis was to analyze the associations between several environmental (maternal consumption of tobacco, alcohol or caffeinated drinks during pregnancy) and medical (history of asthma or eczema) factors and childhood acute leukemia, and to study genetic polymorphisms suspected to modify those associations.The analyses were performed using data from the national population-based case-control ESCALE study conducted in 2003 and 2004. Information about medical history and maternal consumptions during pregnancy was obtained through a standardized telephone interview with the mothers. The genetic polymorphisms were selected using a candidate approach based on their functionality, in genes involved in the metabolism of tobacco (CYP1A1*2, CYP2E1*5, NQO1*2, EPHX1 and NAT2*5), alcohol (CYP2E1*5, ADH1C*2) or caffeine (NAT2*5), and in allergy (IL4, IL4R, IL10 and IL13). Biological samples consisting of blood for cases and saliva for controls allowed for the genotyping of 370,000 SNPs in the cases and 4,500 SNPs in the controls. Where the candidate polymorphisms were not available from the genotyping, genotypic imputation was used to infer those. In total, data was available for 493 acute leukemia cases and 442 controls of European origin. Maternal coffee drinking during pregnancy and, to a lesser extent, cola soda drinking, was positively associated with childhood leukemia in the ESCALE study. No significant association was observed with maternal smoking or alcohol consumption during pregnancy. Carrying two NAT2*5 alleles was associated with acute lymphoblastic leukemia (Odds Ratio OR=1.9 [1.3-2.7]), although the analyses showed no association with the other candidate alleles involved in metabolism. There was no significant interaction between the candidate genetic polymorphisms and maternal consumptions of tobacco, alcohol or caffeinated drinks during pregnancy. However, the candidate alleles of CYP2E1, NQO1 and EPHX1, three enzymes involved in benzene metabolism, seemed to interact together.The variant alleles in IL13, IL4, IL10 and IL4R genes were not associated with childhood leukemia. A history of asthma or eczema was more frequently reported in controls than in cases (OR=0.7 [0.6-0.9]). This inverse association was mostly observed in children carrying a variant haplotype regulating the expression of IL10 (p for interaction=0.08), and carrying two reference alleles for IL13-rs20541 (p for interaction=0.06).As a conclusion, these results suggest a role of maternal coffee drinking during pregnancy in childhood leukemia that had already been reported in a previous French study of the same research team, and needing in-depth study and replication. However, no association was observed with maternal smoking or alcohol drinking, even after taking into account the candidate genetic polymorphisms. The gene-gene interaction of the three enzymes involved in benzene metabolism is interesting and needs to be investigated in other studies. Finally, the inverse association between childhood acute leukemia risk and medical history of asthma or eczema seems to be limited to the children with specific polymorphisms of interleukins IL10 and IL13, which could reflect underlying biological mechanisms. Those hypotheses should be further tested in other studies, such as the ESTELLE study, that has been recently conducted by the team
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Margelin, Dominique. "Lipoproteines lipases : interaction avec les proteoglycannes aortiques et regulation de la secretion par le macrophage." Paris 6, 1988. http://www.theses.fr/1988PA066393.
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Les proteoglycanes composes de chaines de chondroitine sulfate isoles de la media-intima d'aorte de porc possedent une affinite pour la lipoproteine lipase purifiee a partir du lait de vache. Etude du complexe enzyme-proteoglycanes marque a l'iode 125
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Fournier, Bertrand. "Modélisation des propriétés électrostatiques des complexes macromoléculaires à partir des données de diffraction des rayons X à très haute résolution." Thesis, Nancy 1, 2010. http://www.theses.fr/2010NAN10074/document.
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La diffraction des rayons X permet d’obtenir des informations sur la structure atomique et même sur la distribution de charges de composés sous forme cristalline, ce qui est d’une importance fondamentale pour la compréhension de leurs propriétés. Accéder expérimentalement à une description de la distribution de charges de systèmes macromoléculaires reste rarement possible malgré les améliorations techniques. Pour pallier cette limite, la transférabilité des paramètres de distributions de charges est un moyen fiable d’obtenir pour ces systèmes un modèle estimé et d’en déduire leurs propriétés électrostatiques. Les résultats présentés dans ce travail de thèse s’intègrent dans une dynamique visant à étendre les méthodes initialement réservées pour l’étude des petites molécules aux systèmes macromoléculaires. Il s’articule autour du développement de la suite de logiciels MoPro et de la banque de données ELMAM (Experimental Library of Multipolar Atom Model) pour l’étude des énergies des interactions électrostatiques au sein du site actif de complexes enzyme-inhibiteur. L’étude du fidarestat, un inhibiteur de l’holoenzyme aldose réductase, réalisée à partir de données obtenues à très haute résolution, est exposée dans ce manuscrit et a servi notamment à l’amélioration de la banque ELMAM en vue de l’étude des complexes holoenzymes aldo-keto réductase. A cette occasion, la légitimité du recours aux modèles transférés de distribution de charges a été discutée pour la première fois par une estimation statistique des incertitudes sur les énergies d’interaction électrostatique entre enzyme et inhibiteurX-ray diffraction allows to obtain information about atomic structure and charge density distribution of crystal-state compounds, which is of main interest for the understanding of their properties. Reaching experimentally charge density distribution description of macromolecular systems is rarely possible despite technical improvements. To get around this limit, the transferability of charge density distribution parameters is a reliable way to obtain for these systems estimated model and to deduce their electrostatic properties. Works introduced in this PhD thesis manuscript take part in the will of extending methods initially for study of small molecules to macromolecular systems. It is centered on the development of the MoPro software suite and of ELMAM database (Experimental Library of Multipolar Atom Model) for the study of electrostatic interaction energies in enzyme-inhibitor complexes’ active site. The study of fidarestat, an inhibitor of aldose reductase holoenzyme, performed using ultra-high resolution data, is exposed in this manuscript and allowed to improve ELMAM database for the study of electrostatic interaction in aldo-keto reductase holoenzyme complexes. Moreover, the legitimacy of using transferred charge density distribution models was discussed for the first time, thanks to statistical estimation of uncertainties on electrostatic interaction energies between enzyme and inhibitor
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Esnault, Charles. "Modification électrochimique de surface pour la mesure des interactions ADN/Protéines (HsRad51 - Transposase)." Phd thesis, Université du Maine, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00752894.
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Depuis l'apparition du terme "biosensor" à travers un article de Lyons et Clark en 1962, les biocapteurs ont connu un véritable essor tant au niveau académique qu'industriel. Le principal objectif de ce travail de thèse était de créer une surface permettant l'immobilisation spécifique par liaison covalente de simple ou double brin d'ADN puis d'étudier les interactions pouvant exister entre une protéine donnée et l'ADN. Pour préparer la surface à cette immobilisation, nous avons opéré une réduction électrochimique de sel d'aryldiazoniums. Ce type de modification nous a permis de fixer de manière covalente sur la surface conductrice des fonctions de type Ar-SO2Cl. Par l'utilisation de la QCM et de l'AFM, nous avons pu par la suite détailler les mécanismes de fonctionnement de protéines (HsRad51 et Transposase) en interaction avec l'ADN simple ou double brin fixé, que ce soit d'un point de vue cinétique ou bien structural.
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Lautrette, Alexandre. "Interaction entre la voie de l'épidermal growth factor et la voie de l'angiotensine : rôle dans la progression des lésions rénales." Paris 6, 2006. http://www.theses.fr/2006PA066376.
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Deux facteurs de croissance jouent un rôle prépondérant dans le processus lésionnel rénal : l’EGF et l’angiotensine II (AngII). Le but de mon travail de thèse a été d’évaluer si la transactivation du récepteur de l’EGF (R-EGF) était responsable de l’effet délétère de l’AngII lors du développement des lésions rénales, et, si c’était le cas, d’identifier les mécanismes moléculaires à l’origine de ce phénomène. Nous avons montré par des modèles expérimentaux de néphropathie chronique, des lignées de souris génétiquement modifiées et des inhibiteurs pharmacologiques, que les lésions rénales induites par l’AngII passent par l’activation du R-EGF, via la surexpression d’un de ces ligands, le TGF-, elle-même provoquée par l’activation de sa métalloprotéase de clivage, TACE. Puis nous avons débuté l’étude du rôle du TGF- et de sa modulation par la voie de l’AngII dans la pathologie rénale humaine et plus particulièrement dans la polykystose. Nous avons observé une surexpression de TGF- et de TACE dans l’épithélium kystique. L’excrétion urinaire de TGF- est associée à la sévérité de l’insuffisance rénale dans la polykystose et dans différentes néphropathies. Cette excrétion semble dépendre de la prise d’inhibiteur de la voie de l’AngII et être corrélée à une détérioration plus rapide de la fonction rénale. Ceci suggère que le TGF- est impliqué dans le processus lésionnel de diverses néphropathies chroniques humaines et que sa production pourrait être régulée par l’AngII. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives dans la recherche de molécules susceptibles de modifier l’évolution des maladies rénales et de traitements capables de ralentir la progression des lésions rénales.
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Pichard, Lydiane. "Modèles "in vitro" humains pour l'étude du métabolisme et des effets secondaires des médicaments." Montpellier 1, 1996. http://www.theses.fr/1996MON1T023.
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Rezgui, Rachid. "Etude de l'activité de l'enzyme de réparation NucS à l'échelle de la molécule unique." Phd thesis, Ecole Polytechnique X, 2013. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00842766.
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Les enzymes de réparation de l'ADN sont des facteurs essentiels pour assurer l'intégrité du génome. Ainsi, la compréhension de la dynamique de leurs mécanismes d'interaction est capitale. NucS est une nucléase récemment découverte chez l'archée Pyrococcus abyssi, qui interagit avec des structures branchées de l'ADN à simple brin libre, appelées flaps. Sa caractérisation biochimique a mis en évidence une affinité nanomolaire pour l'ADN simple brin, avec l'existence de deux sites de liaison (site I et II) ainsi qu'une activité bidirectionnelle caractérisée par la capacité à cliver les flaps 5' et 3'. Les mécanismes qui sont à l'origine de cette activité, notamment ses modalités de chargement, de localisation et de dissociation, restent toutefois peu connus. Afin de sonder la dynamique des interactions de NucS avec son substrat, nous avons mis en place un microscope à illumination en onde évanescente permettant la détection et le suivi des événements d'interaction individuels entre la protéine marquée avec un fluorophore et un substrat d'ADN attaché à la surface. Nous avons ensuite développé une nouvelle technique de colocalisation qui permet de positionner une protéine individuelle par rapport à son substrat avec une précision de 50 nm pour des durées arbitraires. Nous avons alors étudié la cinétique d'association et de dissociation des complexes NucS-ADN individuels afin de résoudre les mécanismes qui régulent l'activité de l'enzyme dans différentes conditions. Dans des conditions où le clivage est inhibé, nous avons montré que l'association était dépendante du site I, bidirectionnelle et symétrique pour les flaps 3' et 5' et que la dissociation était orientée avec une affinité supérieure pour les flap 5'. Nous avons également montré que la dissociation suivait une cinétique du premier ordre indépendante de la diffusion de NucS sur le flap. Ceci indique que, dans ces conditions non clivantes, NucS s'associe et/ou se dissocie à des positions arbitraires sur le flap. Par la suite, nous avons étudié la cinétique d'association et de dissociation du complexe NucS-ADN à 45 ◦ C en présence du cofacteur de la réparation PCNA. Nous avons démontré que PCNA augmente la vitesse d'association de NucS avec les substrats 3' et 5'. Ceci indique que PCNA agit comme une plateforme qui facilite la reconnaissance de la lésion, avec un chargement ciblé de NucS à la jonction. De plus, nous avons montré que PCNA déstabilise le complexe NucS-ADN, vraisemblablement en exerçant une force pour plier l'ADN afin d'amener l'extrémité du flap vers le site II. Dans le cas de flaps 5', nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme en deux étapes, qui est indépendant de la longueur du flap. Ceci nous a permis de proposer un modèle où NucS se charge par son site I directement à la jonction, courbe le substrat pour capturer l'extrémité simple brin par le site II pour le cliver. Dans le cas d'un flap 3', nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme du premier ordre ce qui est probablement dû à la rapidité de la seconde étape dans le mécanisme proposé pour les flaps 5'. Nos résultats constituent ainsi une nouvelle contribution à la caractérisation intramoléculaire des interactions NucS-ADN. Les méthodes que nous avons développées constituent en outre un moyen original pour sonder la cinétique des interactions entre biomolécules et pourront être appliquées à de multiples systèmes.
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Le, Thao Nhi. "Le frelon asiatique (Vespa velutina nigrithorax) : Stratégies d’études sur l’identification de nouvelles molécules actives pour la dermacosmétique." Thesis, Orléans, 2020. http://www.theses.fr/2020ORLE3143.
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La recherche de nouveaux composés pour prévenir ou atténuer le vieillissement de la peau est une priorité des recherches actuelles dans les cosmétiques. Dans ce contexte, le venin de frelon asiatique (Vespa velutina nigrithorax) a été étudié comme une source particulière de molécules potentiellement bioactives d’intérêt dermacosmétique. La première étude a tout d’abord porté sur la mise en œuvre d’un protocole fiable d’extraction et récupération du venin. Puis, la fraction peptidique et petites molécules a été sélectionnée afin d’évaluer, en comparaison avec le venin brut, la présence de molécules actives vis-à-vis d’une activité antioxydante, anti-microbienne (C. acnes) et inhibitrice enzymatique (tyrosinase, élastase, collagénase) in-tubo et in-cellulo. Ces études ont conduit à identifier par UHPLC-ESI-QTOF-HRMS/MS, dans le venin brut, une molécule responsable de l’activité anti-oxydante sur kératinocytes HaCaT. Dans une seconde étude, une approche peptidomique basée sur une méthode UHPLC-QTOF-HRMS et MS/MS suivie par un traitement statistique (PCA, PLS-DA) a été appliquée sur l’étude différentielle de profil peptidique du venin, en fonction de la période de collecte, des castes et du comportement. Ces derniers ont pour but d’évaluer l’influence de différents facteurs sur le patrimoine moléculaire de ces venins. Parallèlement, en troisième étude, une approche de criblage d’interaction Ligand/enzyme par spectrométrie de masse sur les enzymes élastase et tyrosinase immobilisées a été développée. Cette méthode a pour objectif de mettre en évidence la présence d’inhibiteurs ou de substrats dans des fractions plus ou moins complexes. On a montré que deux peptides présents dans le venin de frelon étaient capables d’interagir avec l’enzyme élastase en tant que substrat. La séquence peptidique de ces peptides a été partiellement obtenue par séquençage de novoThe search for new compounds to prevent or attenuate skin aging is a priority in current research in cosmetics. In this context, Asian Hornet venom (Vespa velutina nigrithorax) has been studied as a particular source of potentially bioactive molecules for dermacosmetic interest.The first study focused on the implementation of a reliable venom extraction and sampling protocol. Then, the peptide - small molecules fraction was selected to evaluate, in comparison with crude venom, the presence of active molecules with respect to antioxidant, anti-microbial (C. acnes) and enzyme inhibition (tyrosinase, elastase, collagenase) activity in-tubo and in-cellulo. These studies led to the identification in crude venom, by UHPLC-ESI-QTOF-HRMS/MS, of one molecule responsible for antioxidant activity on HaCaT keratinocytes.In a second study, a peptidomic approach based on UHPLC-ESI-QTOF-HRMS/MS followed by statistical processing (PCA, PLS-DA) was applied to the differential study of venom, according to the collection period, castes and behavior. The latter aims at evaluating the influence of these different factors on the venom molecular heritage. At the same time, in a third study, a ligand/enzyme interaction screening approach by mass spectrometry on solid-supported elastase enzymes was developed. The aim of this method is to detect the presence of inhibitors or substrates in more or less complex fractions. Two hornet venom peptides presenting in the hornet venom were identified to be capable of interacting with the enzyme elastase. Their peptide sequences were then partially obtained by de novo sequencing
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VASSEUR, CORINNE. "La proteine bande 3 erythrocytaire humaine : purification de la proteine et effet de la phosphorylation sur sa fonction de transport des anions et sur son interaction avec une enzyme cytosolique." Paris 6, 1989. http://www.theses.fr/1989PA066500.
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La proteine bande 3 (b3) est formee d'un domaine transmembranaire qui permet l'echange des anions et d'un domaine cytoplasmique qui concourt a la stabilite de la membrane par ses interactions avec les proteines du squelette et avec les proteines cytosoliques. Nous avons etudie le role de la phosphorylation de la b3 sur les proprietes fonctionnelles de ces deux domaines. Plusieurs proteine-kinase membranaires phosphorylent la b3 sur des sites distincts. Leur activation preferentielle par mg#+#+ ou mn#+#+ a permis de phosphoryler la b3 avec une proportion differente de phosphoaminoacides avant de l'isoler. L'etude du transport du sulfate, realisee dans les vesicules lipidiques reconstituees en presence de b3 issue de membranes phosphorylees en presence de mg#+#+ ou mn#+#+, met en evidence un role regulateur de la phosphorylation sur la fonction de transport des anions que nous attribuons a la presence de p-ser sur la proteine. L'etat de phosphorylation de la b3 ne regule pas la fixation de la g3pdh aux membranes d'erythrocytes dans des conditions de phosphorylation physiologiques. Une alteration de cette fixation aux membranes de globules rouges drepanocytaires a ete observee, que nous n'avons pu rapporter ni a une anomalie de la phosphorylation ni a un phenomene oxydatif aigu
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Soares, Rosemberg de Oliveira. "Analyse the Impact of Genetic Polymorphism of subtype C of HIV-1 Protease Inhibitors in the Interaction Viral With the Inhibitor Nelfinavir by Modeling and Molecular Dynamics." Laboratório Nacional de Computação Científica, 2008. http://www.lncc.br/tdmc/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=166.
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The human immunodeficiency virus (HIV) can be divided into HIV-1 and HIV-2. The former can be divided into groups: M, N and O. Group M, which represents 90% of infections, is divided into several subtypes (A, B, C, D, F, G, H, J and K). It is known today that the most prevalent subtype in the world (and in Africa) is the subtype C, although the most studied is B (prevalent in the U.S. and Western Europe).
Several stages the HIV-1 replicating cycle have been identified as a target for pharmacologic intervention. One of the main targets is the enzyme aspartyl protease (PR), which processes the viral polyproteins Gag and Gag-Pol. Its inhibition results in the formation of non-infectious virus particles. Currently 10 PR inhibitors are used in clinic. However, the emergence of resistance to these inhibitors leads to a therapeutic failure. Several mutated amino acid residues that are present in resistant isolates have been identified. One of such resistance mutations is the D30N, which confers primary resistance exclusively to nelfinavir, has been described in patients infected with subtype B. However, clinical and laboratory studies showed that virus of subtype C with the mutation D30N (CD30N) has low incidence in clinical and reduced adaptability in vitro.
To try to understand these differences caused by mutation D30N in subtypes B and C, we studied the interaction of these PRs with the peptide KARVLAEAM (analogous to the natural substrate of cleavage between the protein the capsid (CA) and p2 of HIV-1) and with the inhibitor nelfinavir. We have also studied the PR CD30N with the compensatory mutations N83T or N88D, found in vitro and in vivo, respectively, which occur when the subtype C acquires the mutation D30N. This work aimed to study the molecular and atomic mechanisms of mutation D30N in the PR of subtypes B and C.
The results showed that the inhibitor and backbone of models BD30N and CD30N/N83T possessed the greatest variation, with respect to the initial structure. Although the mutants CD30N and CD30N/N88T have not suffered similar variations, they showed, as well as the other two mutants, a reduction in the intensity of the h-bonds that occur between PR and inhibitor which are located near the catalytic and the flaps regions. Also, all mutants had reduced hydrophobic contacts between the receptor and the ligand. Some data indicated that the flap of one of the chains is highly immobile in a model CD30N suggesting the mutation
D30N impairs the contact of flap with the substrate in subtype C. Also, the analysis of the PR structure interacting with the substrate, indicated that the CD30N mutant has one of its α-helix regions unstructured, which can be directly associated with substrate cleavage.
Our work provides important insights in to the effect of D30N mutation in the PR structure of the subtype C, and on its interaction with the substrate and the inhibitor. These data confirm and explain, at least in part, the smaller incidence of the studied mutation in that genetic subtype of HIV-1.O HIV pode ser dividido em HIV-1 e HIV-2. Aquele, por sua vez, pode ser divido nos grupos: M, N e O. O grupo M, que representa 90% das infecções, foi dividido em vários subtipos (A, B, C, D, F, G, H, J e K). Sabe-se hoje que o subtipo mais circulante no mundo (a maior parte na África) é o C, entretanto o mais estudado é o B (prevalente nos EUA e Europa). Diversas etapas do ciclo replicativo do HIV-1 têm sido identificadas como alvos para intervenção farmacológica. Um dos principais alvos é a enzima aspartil protease (PR); é ela que processa as poliproteínas virais Gag e Gag-Pol e sua inibição resulta na formação de partículas virais não infecciosas, sendo atualmente 10 inibidores utilizados em clínica. No entanto, o aparecimento de resistência a esses inibidores leva à falha terapêutica, tendo sido identificados e estudados vários resíduos que se apresentam mutados em isolados resistentes. Uma dessas mutações de resistência é a D30N, que consiste numa mutação primária de resistência exclusiva ao nelfinavir descrita em pacientes soropositivos infectados pelo subtipo B. Entretanto, observações clínicas e laboratoriais mostraram que vírus do subtipo C com a mutação D30N (CD30N) têm baixíssima ocorrência clínica e adaptabilidade reduzida in vitro. Para tentar entender as diferenças causadas pela mutação D30N nos subtipos B e C, foi estudada a interação da PR destes vírus com o peptídeo KARVLAEAM (análogo ao substrato natural de clivagem entre a proteína do capsídeo (CA) e a proteína p2 do HIV-1) e com o inibidor nelfinavir. Também foi estudada a PR CD30N com as mutações compensatórias N83T e N88D, encontradas in vitro e in vivo respectivamente, que se manifestam quando o subtipo C sofre a mutação D30N. Este trabalho teve como objetivo estudar os mecanismos moleculares e atômicos dos efeitos da mutação D30N na PR dos subtipos B e C. Os resultados mostram que o inibidor e o esqueleto peptídico dos modelos BD30N e CD30N/N83T sofreram as maiores variações, em relação à estrutura inicial. Embora os mutantes CD30N e CD30N/N88D não tenham sofrido variação semelhante, eles apresentaram, assim como os outros dois mutantes, uma redução na intensidade das ligações de hidrogênio que ocorrem entre a PR e o inibidor que estão localizadas próximas à região catalítica e aos flaps. Além disso, todos os mutantes apresentaram redução em seus contatos hidrofóbicos ocorridos na interação receptor/ligante. Alguns dados obtidos indicam que a alça de uma das cadeias é altamente imóvel no modelo CD30N sugerindo que a mutação D30N prejudica o contato do flap com o substrato no subtipo C. Além disso, a análise da estrutura das PRs, interagindo com o substrato, indicou que o mutante CD30N tem uma de suas regiões de α-hélice desestruturada, o que pode estar diretamente associado a não clivagem do substrato. O nosso trabalho provê importantes insights sobre o efeito da mutação D30N na estrutura da PR do subtipo C, bem como na sua interação com o substrato e com o inibidor. Tais dados corroboram e explicam, ao menos em parte, a menor ocorrência da mutação estudada naquele variante genético do HIV-1.
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Anissimova, Marya. "Application du ligand pseudo-biospécifique (IDA-ME (II)) à l'étude de la relation structure/fonction des protéines natives et modifiées." Compiègne, 1999. http://www.theses.fr/1999COMP1228.
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L’étude de la structure des protéines présente un intérêt majeur en biochimie pour permettre de comprendre et d'interpréter leur fonctionnement. Dans ce travail, les relations structure/fonction d'enzymes natives et modifiées ont été étudiées par le biais de leurs interactions avec les ions métalliques immobilisés. Notre première exploitation des interactions métaux chélatés - protéines a été l'application de l'électrophorèse d'affinité sur gel avec les ions métalliques immobilisés (IMAGE) comme outil d'étude des changements dans la topographie des résidus histidine dans les ribonucléases microbiennes induits par mutagenèse dirigé, photo oxydation et interaction avec un inhibiteur. L'importance de His 102 dans la barnase et His 101 dans la binase pour l'activité catalytique et la reconnaissance de Cu (II) chélaté a été démontré par l'utilisation de ligand IDA-Cu(II). Dans la deuxième partie, la chromatographie et l'électrophorèse capillaire d'affinité avec les ions métalliques immobilisés (IMAC et IMACE) ont été utilisées afin d'identifier les changements dans la conformation active de l'α-chymotrypsine bovine pancréatique chimiquement glycosylée. Deux populations distinctes ont été obtenues après la glycosylation. Pour la partie majeure de protéine glycosylée, la diminution d'affinité pour IDA-Cu(II) correspondant à une perte d'activité enzymatique a été détectée en conditions d'IMAC et d'IMACE. En même temps, la glycosylation chimique a généré une autre forme active de chymotrypsine avec une plus forte affinité pour les ions Cu (II) immobilisés. Finalement, les systèmes IMA ont été appliqués à l'étude de différentes structures quaternaires de dimères natifs de BS-RNase et des oligomères artificiels de RNase A. L'augmentation de l'affinité pour les ions métalliques immobilisés après l'agrégation in vitro aussi bien qu'in vivo a été démontrée pour ces deux ribonucléases. Cette affinité provenant des résidus histidine de chaque sous-unité permet de supposer que les sites actifs (His 12, His 119, Lys 41) restent disponibles après l'agrégation et que leur action coopérative est un des facteurs déterminant les nouvelles propriétés enzymatiques de ces oligomères.
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Neiverth, Adeline. "Desempenho de genótipos de trigo associados com Herbaspirillum seropedicae em relação à fixação biológica de nitrogênio e promoção do crescimento vegetal." Universidade Estadual do Oeste do Paraná, 2011. http://tede.unioeste.br:8080/tede/handle/tede/1412.
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Previous issue date: 2011-07-11Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Wheat is the most important staple food of the world. The increase in grains productivity and protein content is correlated to increase inorganic nitrogen absorption. Usually, urea is the most convenient source of N2, but, it causes the increase in crops costs beyond injuries to the environment. The BNF realized by diazotrophics bacteria is an alternative to supplement or replace the nitrogen fertilizers and promote plant growth. The objective of this study was to evaluate the performance of Brazilian wheat genotypes for PCV( plant promoter growth) and BNF by association between diazotrophic bacteria (H. seropedicae SmR1) and wheat cultivars under in vitro and greenhouse conditions. In in vitro experiment, eight wheat plantlets of 8 genotypes were tested in tubes with liquid culture medium and these were co-cultured for 7 days with 107 cells.mL-1. As control plantlets without inoculum under the same conditions were used. The experimental design was completely randomized in a 2 x 8 factorial with 3 repetitions. We analyzed the fresh mass of roots, fresh and dry weight of shoots, total nitrogen (TN) content of NH4 +, microbial counting (CFU), glutamine synthetase activity (GS), the morphology of the roots by microscopy and molecular analysis of epiphytic and endophytic bacteria recovered after co-cultivation. In the greenhouse, it was planted five wheat genotypes. The seeds were placed in pots with 4.5 kg of soil under four treatments: 1 - Control 2 - Addition of N as urea (142 kg ha-1 of N) 3 - Addition of inoculum containing H. seropedicae (106 cells.mL-1) (Hs) and 4 - Addition of inoculum containing urea + H. seropedicae (N + Hs). The experimental design was completely randomized in a factorial 5 x 4 with 5 repetitions. The fresh mass of roots, fresh and dry weight of shoots, NT, NH4 + content and GS activity were evaluated. As agronomic parameters were evaluated the whole plant mass at the end of the phenological cycle, yield per plant and weight of 100 seeds.As results in vitro, it was observed the presence of epiphytic bacteria on the roots of all genotypes and the presence of endophytic bacteria in genotypes CD 105, CD 108, CD 111, CD 117, CD 120. There was a sharp increase of root hairs in the genotypes CD 105, CD 117, CD 119 and CD120. The cultivars CD 105 and CD 120 by the presence of endophytic bacteria showed an increase of root hairs, probably it may be the most promising for a response of BNF. The levels of NH4 +, NT and GS in the roots were not decisive for in vitro plant growth promotion. The results obtained in the greenhouse showed significant interactions among parameters, although there were were not crucial for the definition of a specific genotype which answers to the interaction. However, there was a contribution to be further studied, where the CD 120 cultivar showed evidence of association with response to the bacterium and possible occurrence of the BNF. There was no negative effect of inoculation to plants. Additional studies are needed to get answers about the interactions of these genotypes with diazotrophic bacteria related to BNF and plant growth promotion
Os fertilizantes nitrogenados são fontes convenientes de nitrogênio para a cultura de trigo, porém geram altos custos e podem ser poluentes. A fixação biológica de nitrogênio (FBN) é uma fonte alternativa de nitrogênio por meio das bactérias diazotráficas. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho de genótipos de trigo brasileiros para a FBN e promoção do crescimento vegetal (PCV) associados com a bactéria diazotrófica H. seropedicae SmR1, sob condições in vitro e em casa de vegetação. Nas condições in vitro, colocou-se plântulas de 8 genótipos de trigo em tubos de ensaio com meio de cultura líquido, co-cultivadas durante 7 dias com 107células de bactéria.mL-1. O mesmo número de plântulas foi mantido nas mesmas condições, porém sem inóculo. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, num esquema fatorial 8 x 2 com 3 repetições. Analisou-se a massa fresca de raízes, massa fresca e seca de parte aérea, o nitrogênio total (NT), conteúdo de amônio (NH4+), contagem microbiana (UFC), Glutamina sintetase (GS), a morfologia das raízes por microscopia e análise molecular das bactérias endofíticas e epifíticas recuperadas após co-cultivo. Em casa de vegetação, foram avaliados 5 genótipos de trigo, onde o delineamento experimental foi inteiramente casualizado num esquema fatorial 5 x 4 com 5 repetições, onde: 1 Testemunha; 2 Adição de N na forma de ureia, 142 kg ha-1 de N; 3 Adição de inóculo contendo H. seropedicae, 106 celulas por semente (Hs) e 4 Adição de ureia + inóculo (N+Hs). Avaliaram-se a massa fresca de raízes, massa fresca e seca de parte aérea, o NT, conteúdo de NH4+ e a atividade da GS. Como parâmetros agronômicos avaliaram-se a massa da planta inteira no final do ciclo fenológico, produção por planta e massa de 100 grãos. Como resultados, observou-se in vitro a presença de bactérias epifíticas nas raízes de todos os genótipos e presença de bactérias endofíticas não foi verificada nos genótipos CD 104, CD 119 e CD 150. Verificou-se um aumento acentuado de pêlos radiculares nos genótipos CD 105, CD 117, CD 119 e CD120. As cultivares CD 105 e CD 120 pela presença da bactéria endofiticamente associado com o aumento de pêlos radiculares, podem ser as mais promissoras para uma resposta da FBN. As plântulas inoculadas apresentaram senescência precoce. Os níveis de NH4+, GS e NT nas raízes não foram determinantes para a promoção do crescimento vegetal. Os resultados obtidos em casa de vegetação demonstram que, apesar de ter havido interações significativas, os parâmetros não foram determinantes para a definição de um genótipo que apresentasse uma resposta conclusiva a respeito da interação benéfica entre genótipo COODETEC e H. seropedicae. No entanto, observou-se uma contribuição a ser mais bem estudada, onde a cultivar CD 120 mostrou indícios de resposta à associação com a bactéria e possível ocorrência da FBN. Não foi observado nenhum efeito negativo da inoculação às plantas. Estudos complementares são necessários para obter respostas quanto às interações destes genótipos com estas bactérias diazotróficas, no processo de colonização, da FBN e da PCV
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Castro, Marin Inmaculada. "Nitrate: metabolism and development : characterization of the glutamate dehydrogenase (GDH) family, an enzyme at the cross-roads of carbon-nitrogen interaction metabolites and study of the regulation of flowering by nitrogen." Phd thesis, Universität Potsdam, 2007. http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2008/1882/.
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The major aim of this thesis was to study the effect of nitrate on primary metabolism and in development of the model plant Arabidopsis thaliana.
The present work has two separate topics. First, to investigate the GDH family, a small gene family at the interface between nitrogen and carbon metabolisms. Second, to investigate the mechanisms whereby nitrogen is regulating the transition to flowering time in Arabidopsis thaliana.
To gain more insights into the regulation of primary metabolism by the functional characterization of the glutamate dehydrogenase (GDH) family, an enzyme putatively involved in the metabolism of amino acids and thus suggested to play different and essential roles in carbon and nitrogen metabolism in plants, knock out mutants and transgenic plants carrying RNA interference construct were generated and characterized. The effect of silencing GDH on carbon and nitrogen metabolisms was investigated, especially the level of carbohydrates and the amino acid pool were further analysed. It has been shown that GDH expression is regulated by light and/or sugar status therefore, phenotypic and metabolic analysis were developed in plants grown at different points of the diurnal rhythm and in response to an extended night period.
In addition, we are interested in the effect of nutrient availability in the transition from vegetative growth to flowering and especially in nitrate as a metabolite that triggers widespread and coordinated changes in metabolism and development. Nutrient availability has a dramatic effect on flowering time, with a marked delay of flowering when nitrate is supplied (Stitt, 1999).
The use of different mutants and transgenic plants impaired in flowering signalling pathways was crucial to evaluate the impact of different nitrate concentrations on flowering time and to better understand the interaction of nitrate-dependent signals with other main flowering signalling pathways. Plants were grown on glutamine as a constitutive source of nitrogen, and the nitrate supply varied. Low nitrate led to earlier flowering. The response to nitrate is accentuated in short days and in the CONSTANS deficient co2 mutant, whereas long days or overexpression of CONSTANS overrides the nitrate response. These results indicate that nitrates acts downstream of the known flowering signalling pathways for photoperiod, autonomy, vernalization and gibberellic acid.
Global analyses of gene expression of two independent flowering systems, a light impaired mutant (co2tt4) and a constitutive over-expresser of the potent repressor of flowering (35S::FLC), were to be investigated under two different concentrations of nitrate in order to identify candidate genes that may be involved in the regulation of flowering time by nitrate.Das Hauptziel dieser Doktorarbeit war die Untersuchung des Effekts von Stickstoff auf den Primärmetabolisms und auf die Entwicklung der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Die vorliegende Arbeit hat zwei Unterthemen: Auf der einen Seite wurde die GDH Familie untersucht, eine kleine Genfamilie an der Schnittstelle zwischen Stick –und Kohlenstoffmetabolismus. Auf der anderen Seite wurde der Mechanismus, bei dem Stickstoff die Blütezeit in Arabidopsis thaliana kontrolliert, untersucht. Um einen tieferen Einblick in die Regulierung des Primärmetabolismus zu erhalten, wurde eine funktionelle Charakterisierung der Glutamatdehydrogenase-Familie (GDH) mit Hilfe von knock-out Mutanten und transgenen Pflanzen, die ein RNA Interferenzkonstrukt tragen, durchgeführt. GDH ist höchstwahrscheinlich am Aminosäuremetabolismus beteiligt, wobei vermutet wird, dass es verschiedene wichtige Aufgaben im Pflanzenkohlen –und stickstoffmetabolismus übernimmt. Dabei wurde der Effekt des GDH Silencing auf den Kohlen- sowie Stickstoffmetabolismus untersucht und insbesondere die Anteile von Kohlenhydraten und Aminosäuren eingehend analysiert. In vorhergehenden Studien zeigte sich, dass die GDH-Expression durch Licht und/oder die Zuckerverfügbarkeit reguliert wird. Deshalb wurden phenotypische und metabolische Analysen an Pflanzen entwickelt, die zu verschiedenen Zeitpunkten des diurnalen Rhythmus und nach einer längeren Nachtperiode gezüchtet wurden. Ausserdem interesssiert uns der Effekt der Nährstoffverfügbarkeit im Übergang vom vegetativen Wachstum zur Blüte, und vor allen Dingen Nitrat als Metabolit, welches weitreichende und koordinierte Veränderungen im Metabolismus und in der Entwicklung hervorruft. Die Nährstoffverfügbarkeit hat einen dramatischen Effekt auf die Blütezeit, insbesondere führt eine Nitratzugabe zu einer deutlichen Verzögerung der Blüte (Stitt, 1999). Der Einsatz von verschiedenen Mutanten und transgenen Pflanzen, die eine Blockade im Blüte-Signalweg aufwiesen, war ausschlaggebend, um den Einfluss von unterschiedlichen Nitratkonzentrationen auf die Blütezeit zu beurteilen, und um zu einem besserem Verständnis des Zusammenspiels von nitratabhängigen Signalen und anderen Blüte-Signalwegen zu gelangen. Die Pflanzen wuchsen auf Glutamin, das als konstitutive Stickstoffquelle diente, wobei die Nitratversorgung variierte. Niedriger Nitratanteil führte zu einer früheren Blüte. Bei kurzer Tageslänge und bei CONSTANS defizienten Mutanten (co2) ist die Reaktion auf Nitratzugabe erhöht, wohingegen bei fortgeschrittener Tageslänge oder bei Überexpression von CONSTANS die Reaktion auf Nitrat unterbleibt. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Nitrat unterhalb der bekannten Blüte-Signalwege für Photoperiode, Autonomie, Vernalisierung und Gibberelinsäure fungiert. Globale Expressionsanalysen von zwei unterschiedlichen Blütensystemen, eine licht-unempfindliche Mutante (co2tt4) und eine Mutante mit konstitutiver Expression eines potentiellen Blüte-Repressors (35S::FLC), wurden bei zwei verschiedenen Nitratkonzentrationen durchgeführt, um Kandidatengene zu identifizieren, die eine wichtige Rolle in der Regulation der Blütezeit durch Nitrat spielen könnten.
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Brière, Jean-François. "Elaboration d'une enzyme artificielle se liant à des fonctions amines et des fonctions acides dans le but de catalyser la formation de liaisons amides." Rouen, 1998. http://www.theses.fr/1998ROUES097.
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Ce travail décrit l'élaboration d'un catalyseur supramoléculaire de structure hétérocyclique devant accélérer la formation de liaisons amides, en mimant les mécanismes enzymatiques. Une première synthèse à partir de la 4-amino-3-bromoisoquinoléine a ouvert deux nouvelles voies d'accès aux 2-méthyloxazolo[5,4-c]isoquinoléine et 1H-pyrrolo[3,2-c]isoquinoléine. Cette dernière structure a été fonctionnalisée en position 2 à l'aide d'une réaction de métallation. Au cours de la deuxième voie de synthèse nous avons établi l'influence de la substitution de la fonction amine d'aminopyrrolidine-2,5-diones sur la régiosélectivité de la réduction en -hydroxylactames par le borohydrure de sodium. La synthèse diastéréosélective d'un nouvel hétérocycle tricyclique de type 1a,3a,4,5-tétrahydro-1H,3Hpyrrolo[3,2-c]isoquinoléin-2-one a été alors réalisée. La fonctionnalisation de ce dernier a permis la synthèse de l'enzyme artificielle. Nous avons établi que ce récepteur se liait avec des amines et des acides avec des constantes d'association de l'ordre de 100 à 400 M-1, au sein de complexes de stoechiométrie 1:1. La structure de deux complexes, récepteur-benzylamine et récepteur-acide benzoïque, a été approchée à l'aide d'une étude par RMN 1H NOESY, suivie d'une modélisation par mécanique moléculaire. Enfin l'enzyme artificielle a permis d'accélérer de 34% la réaction d'aminolyse entre la n-propylamine et le benzoate de pentafluorophényle.
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Denuc, Isern Amanda. "Dominis estructurals i noves interaccions proteiques de l'enzim deubiquitinant USP25." Doctoral thesis, Universitat de Barcelona, 2011. http://hdl.handle.net/10803/83587.
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La present Tesi Doctoral es presenta com una agrupació de quatre publicacions que resumeixen el treball realitzat al Departament de Genètica de la Facultat de Biologia de la Universitat de Barcelona. El principal objectiu és la
caracterització funcional de les regions estructurals de la isoforma muscular de l’enzim deubiquitinat USP25, inicialment definides amb eines bioinformàtiques. A més a més, es pretén fer un estudi de noves interaccions moleculars tipus proteïna-proteïna per la cerca de nous substrats o reguladors enzimàtics.
La cèl•lula eucariota posseeix, entre altres, un sistema senyalitzador intracel•lular basat en una família de pèptids, el representant dels quals és la ubiquitina. Aquest sistema presenta diferents categories funcionals, entre elles, els enzims deubiquitinants, un centenar a l’espècie humana. Aquests enzims hidrolitzen l’enllaç que uneix la ubiquitina als seus precursors o substrats, mantenint així l’homeostasi d’aquest pèptid dins la cèl•lula. Una alteració de la seva funció pot portar diferents conseqüències depenent de la via metabòlica que es vegi afectada, doncs suposa una desregulació estequiomètrica dels substrats ubiquitinants respecte els no ubiquitinats. L’enzim deubiquitinant USP25 es va descriure en el grup d’investigació d’aquesta tesi durant la cerca de nous gens relacionats amb la síndrome de Down. Un cop caracteritzat funcionalment com una proteasa específica d’ubiquitina, els estudis d’expressió van mostrar l’existència de tres isoformes proteiques, una d’elles, USP25m, restringida al teixit muscular i cardíac.
Tenint en compte que en el fenotip dels pacients amb síndrome de Down, entre altres trets, hi ha deficiència cardiovascular i atonia muscular, els esforços del grup es van centrar en la descripció i anàlisi d’aquesta isoforma. Els primers estudis van mostrar la seva situació citosòlica, l’expressió correlativa amb la diferenciació de cèl•lules musculars i la relació específica amb diverses proteines del sarcòmer. En el treball realitzat per la present Tesi Doctoral, s’han caracteritzat funcionalment diferents regions reguladores descrites a nivell bioinformàtic, així com també s’ha analitzat la seva implicació fisiológica a la funció d’USP25m. A més a més, mitjançant un estudi de cerca de nous interactors proteics, s’ha trobat una nova molècula que pertany a la mateixa via senyalitzadora i que es relaciona de manera específica amb USP25m, la lligasa d’ubiquititna MKRN1 (makorin 1)
Mitjançant l’ús de diferents construccions amb delecions i mutacions puntuals de la proteïna que afecten a les regions d’interès, s’ha arribat a diferents conclusions, entre elles, que USP25m és monoubiquitinat i té la capacitat d’autodeubiquitinar-se. La monoubiquitinació en regula la seva activitat enzimàtica i es proposa un mecanisme de regulació basat en la conjugació alternativa de SUMO (una altra molècula de la família de la ubiquitina) i ubiquitina, en el mateix residu aminoacídic, la lisina 99 (Lys99). Els dominis d’unió a ubiquitina regulen el reconeixement de substrat i afavoreixen la monoubiquitinació. USP25m oligomeritza dins la cèl•lula i es troba present en diferents formacions proteiques d’elevat pes molecular. S’ha comprovat la relació específica amb la nova lligasa MKRN1 i es suggereixen diferents escenaris moleculars on poden trobar-se inclosos els dos pèptidsThe main aim of the present PhD work, titled “Structural domains and new protein interactions of the deubiquitinating enzyme USP25”, is the functional characterisation of the structural domains of the muscle isoform of USP25, USP25m, as well as the analysis of new protein‐protein interactions. The ubiquitin‐proteasome pathway is widely known as the preferential system to get ride of old or non‐functional proteins. Recently, it has become more apparent that this is not the only function. Ubiquitin (Ub) and all ubiquitin–like (UbLs) molecules acted as regulatory tags involved in different cellular events as subcellular localization, enzyme activation, DNA repair, etc. The intricate Ub‐signalling networks require a tight regulation of both conjugation and deconjugationprocesses, which are controlled by ubiquitin ligases and deubiquitinating enzymes (DUBs), respectively. USP25 is a DUB described while looking for novel genes involved in Down syndrome phenotype. First studies showed that it encoded three alternative protein isoforms, one of them, muscle specific. This muscle isoform, USP25m, is a cytosolic protein, upregulated during myogenesis that interacts in a specific manner with different sarcomeric proteins. Using an “in silico” approach, we were able to identify different structural domains, among them three ubiquitin binding domains (UBDs), and we aimed to characterise its role on USP25m function. By generating a collection of deletion and punctual mutants of the regions of interest, we conclude that USP25m is monoubiquitinated and that the UBDs modulate this modification. The preferential site for monoubiquitination is lysine 99 (K99), a residue that has been reported to undergo sumoylation (SUMO conjugation, being SUMO an UbL). According to our results, mutation of the K99 residue diminishes the deubiquitinating function, proposing a mechanistic model for USP25m regulation based on alternative conjugation of Ub and SUMO on the same residue, K99. Futhermore, while seeking new protein interactions of USP25m we identified Makorin Ring finger protein 1 (MKRN1), which belongs to an ubiquitin ligase family, as a putative interactor. We were capable of characterise its interaction and propose different cellular scenarios were they could interact.
The main aim of the present PhD work, titled “Structural domains and new protein interactions of the deubiquitinating enzyme USP25”, is the functional characterisation of the structural domains of the muscle isoform of USP25, USP25m, as well as the analysis of new protein‐protein interactions. The ubiquitin‐proteasome pathway is widely known as the preferential system to get ride of old or non‐functional proteins. Recently, it has become more apparent that this is not the only function. Ubiquitin (Ub) and all ubiquitin–like (UbLs) molecules acted as regulatory tags involved in different cellular events as subcellular localization, enzyme activation, DNA repair, etc. The intricate Ub‐signalling networks require a tight regulation of both conjugation and deconjugationprocesses, which are controlled by ubiquitin ligases and deubiquitinating enzymes (DUBs), respectively. USP25 is a DUB described while looking for novel genes involved in Down syndrome phenotype. First studies showed that it encoded three alternative protein isoforms, one of them, muscle specific. This muscle isoform, USP25m, is a cytosolic protein, upregulated during myogenesis that interacts in a specific manner with different sarcomeric proteins. Using an “in silico” approach, we were able to identify different structural domains, among them three ubiquitin binding domains (UBDs), and we aimed to characterise its role on USP25m function. By generating a collection of deletion and punctual mutants of the regions of interest, we conclude that USP25m is monoubiquitinated and that the UBDs modulate this modification. The preferential site for monoubiquitination is lysine 99 (K99), a residue that has been reported to undergo sumoylation (SUMO conjugation, being SUMO an UbL). According to our results, mutation of the K99 residue diminishes the deubiquitinating function, proposing a mechanistic model for USP25m regulation based on alternative conjugation of Ub and SUMO on the same residue, K99. Futhermore, while seeking new protein interactions of USP25m we identified Makorin Ring finger protein 1 (MKRN1), which belongs to an ubiquitin ligase family, as a putative interactor. We were capable of characterise its interaction and propose different cellular scenarios were they could interact.
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Rabeharindranto, Mamy Hery Ny Aina. "Conception de nouveaux biocatalyseurs par fusion de domaines catalytiques." Thesis, Toulouse, INSA, 2019. http://www.theses.fr/2019ISAT0015/document.
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La production microbienne de molécules d'intérêt pourrait être améliorée par des stratégies d'ingénierie du vivant. L'ingénierie enzymatique joue un rôle central dàns la conception d'organismes hôtes efficaces car l'efficacité de la voie dépend en premier lieu de l'efficacité des enzymes. Aujourd'hui, il est utile de savoir quelles conceptions d'enzymes synthétiques sont efficaces et quels paramètres doivent être testés pour les caractériser. La colocalisation spatiale d'enzymes à l'intérieur de la voie métabolique pourrait améliorer la production de la molécule d'intérêt finale en permettant une biotransformation rapide des intermédiaires de la voie de biosynthèse. Des protéines multidomaines regroupant plusieurs activités enzymatiques sont décrites dans la littérature. Ces travaux ont permis la création de fusions synthétiques d'enzymes caroténogéniques pour la production de bêta-carotène chez Saccharomyces cerevisiae. Différents types de fusions et de configurations enzymatiques ont été testés. L'étude a permis ia création d'une fusion enzymatique tripartite efficace produisant deux fois moins d'intermédiaires et deux fois plus de bêta-carotène. Les mesures précises de la concentration de chaque caroténoïde, associées à la quantification des enzymes, ont permis de caractériser l'efficacité de chaque enzyme synthétique. D'autres stratégies de colocalisation spatiale d'enzymes ont également été testées en utilisant des domaines d'interaction tels que la cohesinedockérine ou la protéine oligomériques CcmK2. Certaines enzymes caroténogéniques préservent leur fonctionnalité au sein de ces configurations. Des systèmes enzymatiques construites modifient le flux métabolique des caroténoïdes et produisent des caroténoïdes différents de ceux des enzymes naturelles. Un contrôle plus affiné des activités enzymatiques pourrait permettre un contrôle précis de la nature du caroténoïde final produitMicrobial production of molecules of interest can be improved by severa! engineering strategies. Enzymatic engineering has a central role in the conception of efficient host because pathway's efficiency depends in first place on the efficiency of the enzymes. Knowing which synthetic enzymes conceptions are efficient and knowing to characterize the best candidates are essential. Enzyme colocalisation inside metabolic pathway might improve the production of final molecule of interest by allowing rapid biotransformation of intermediates of the pathway. Multidomain proteins regrouping severa! enzymatic activities are described in the literature. This work has focused in part on the creation of synthetic fusion of sorne carotenogenic enzymes for the production of beta carotene in Saccharomyces cerevisiae. Different types of enzymatic fusions and configurations have been tested and. characterized. The study allowed the creation of an efficient tripartite enzyme. fusion which produces two times Jess intermediates and two times more beta carotene. Precise measurement of each caro teno id' s concentration coupled with quantification of enzymes allows the characterization of the efficiency of each synthetic enzyme. Other strategies for enzyme spatial co localisation have also been tested using domains of interaction like cohesin-dockerin or the oligomeric protein CcmK2. Sorne carotenogenic enzymes are still functional using those configurations. Sorne of the enzymatic systems modify the metabolic flow ofcarotenoids and produce carotenoids different from the natural systems. Sorne strategies have changed the metabolic flux of carotenoids inside the pathway. Interestingly, a fine control of activity of enzyme might allow a fine control of the nature of the final carotenoid
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Zaoui, Philippe. "Sécrétion et expression de la gélatinase - B de 92 kDa et de son inhibiteur tissulaire (TIMP-1) dans un modèle d'interaction des polynucléaires neutrophiles humains avec l'endothélium : application aux interactions cellulaires dans le glomérule rénal." Université Joseph Fourier (Grenoble), 1996. http://www.theses.fr/1996GRE10139.
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La proteolyse matricielle par les neutrophiles fait intervenir une gelatinase de 92 kda (mmp-9) qui degrade le collagene iv des membranes basales, une collagenase i (mmp-8) qui clive les collagenes fibrillaires et un inhibiteur tissulaire des metalloproteases de 28 kda, le timp-1. Dans un modele d'adhesion des neutrophiles humains en puits de plastique, nous avons mesure l'activite de degradation de gelatine-#1#4c dans les surnageants d'exocytose. Les enzymes et les inhibiteurs secretes ont ete identifies dans les surnageants par zymographie et immunotransfert. Les arn messagers de la gelatinase et du timp-1 ont ete mis en evidence par transcription reverse et reaction en chaine d'adn polymerase (rt-pcr). L'adhesion des neutrophiles au plastique induit une importante secretion basale de gelatinase avec une liberation beaucoup plus faible de timp-1 alors que les autres marqueurs compartimentaux du neutrophile sont peu mobilises. La secretion de gelatinase est augmentee par des agents stimulants solubles (peptides formyles, cytokines, ester de phorbol) utilises seuls ou en association deux a deux. A l'inverse, la gelatinase secretee est partiellement inhibee par l'interaction, directe ou en puits separes, avec une monocouche de cellules endotheliales ou au contact de glomerules en culture. Les arnm du timp-1 sont abondants et stables dans le neutrophile tandis que les arnm de la gelatinase sont faiblement transcrits et disparaissent au cours de la stimulation ou lors du contact avec une autre cellule (endothelium, glomerule). Un desequilibre entre transcription et secretion est aussi retrouve dans les cellules endotheliales et les glomerules qui expriment plus d'arnm codant pour le timp-1 que pour la mmp-9, mais qui secretent plus de mmp-9 et de mmp-2 que d'inhibiteur. En conclusion, la balance entre la gelatinase de 92 kda et son inhibiteur tissulaire est en faveur de la secretion d'une enzyme preformee faiblement transcrite et de la transcription continue d'un inhibiteur faiblement secrete. Ces phenomenes interviendraient dans les consequences tissulaires de l'extravasation des leucocytes et dans l'atteinte vasculaire et glomerulaire des processus inflammatoires.