Дисертації з теми "Effecteur de type TAL"

La bactériose vasculaire du riz, causée par la bactérie à Gram-négatif Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), est une des maladies les plus dévastatrices des cultures de riz en Afrique de l'Ouest et en Asie. Grâce à son système de sécrétion de type III, Xoo injecte ses effecteurs de type TAL ("Transcription Activator-Like") au sein de la cellule végétale hôte. Grâce à leurs signaux de localisation nucléaire (NLS), les TALE sont ensuite importés au noyau où ils ont la capacité de se fixer, par le biais de leur région centrale composée de répétitions en tandem, au promoteur d'un gène hôte au niveau d’une séquence appelée EBE (pour "Effector Binding Element"), et d’initier la transcription via leur domaine d'activation (AD). Xoo est ainsi capable de moduler l'expression des gènes de la plante en détournant sa machinerie transcriptionnelle et d'induire des gènes dits de sensibilité (S) qui favorisent le développement de la bactérie et donc de la maladie. Dans certains cas, les TALE peuvent activer des gènes dits exécuteur (E) dont l'expression entraîne des réactions de défenses de la plante et provoque la résistance. Des analyses de diversité génétique ont montré que Xoo comprend deux lignées correspondant aux souches Africaines et Asiatiques. Elles se distinguent notamment par le nombre de gènes tal qu'elles possèdent, mais aussi par le type de résistance qu’elles élicitent. De fait, aucune des races identifiées en Afrique n’a été retrouvée en Asie.L'objectif de cette thèse était d'identifier des sources de résistance chez le riz afin d’apporter de nouvelles stratégies de contrôle de la bactériose vasculaire du riz en Afrique. Des analyses préliminaires avaient permis de mettre en évidence par une approche de gain de fonction, plusieurs TALE de la souche Malienne MAI1 ayant une activité potentielle d'avirulence sur les variétés de riz IR64, CT13432 et FKR47N. Afin de confirmer ces résultats, une approche par perte de fonction a été entreprise, consistant à cribler une banque de mutants BAI3Δtal générés dans la souche Burkinabè BAI3, dont le TALome (répertoire de gènes tal) est très proche de celui de MAI1, sur chacune des trois variétés résistantes. Ces travaux ont permis de valider le rôle d’avirulence de TalD et TalI sur les variétés IR64 et CT13432, respectivement. Il a également été démontré que la résistance de CT13432 aux souches MAI1 et BAI3 résultait de la combinaison de deux mécanismes de résistance, l'un reposant sur l'induction, médiée par TalI, d'un gène exécuteur encore inconnu, et l'autre sur un allèle du gène de résistance Xa1. Dans un second temps, afin d'approfondir nos connaissances sur la résistance conférée par IR64 aux souches Africaines de Xoo, le criblage d'une population de lignées recombinantes de génération F11, provenant du croisement entre la variété résistante IR64 et la variété sensible Azucena, a été mené. Cette étude a permis de confirmer deux QTL, qABB-7 et qABB-11, préalablement rapportés dans une autre étude, et d'identifier quatre nouveaux QTL de résistance aux souches Africaines de Xoo. Pour finir, des analyses de type RNAseq ont été réalisées sur la variété résistante IR64 et la variété sensible Nipponbare, dont les génomes séquencés sont disponibles, afin de caractériser leur transcriptome en réponse à des souches Africaines de Xoo. L'activité d'avirulence de TalD chez IR64 ayant été démontrée, une comparaison de l'expression différentielle des gènes indu its par MAI1 et BAI3 avec le mutant BAI3ΔtalD a été effectuée, permettant d'identifier de potentiels gènes E candidats expliquant la résistance TalD-dépendante de IR64. Ces travaux représentent une première étape dans le développement de nouvelles stratégies basées sur le déploiement de sources de résistance durables afin de lutter contre la bactériose vasculaire du riz en Afrique
Bacterial Leaf Blight (BLB), caused by the Gram-negative bacterium Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), is one of the most devastating diseases of rice in West Africa and Asia. Xoo injects through its type-III secretion system a full cocktail of TAL ("Transcription Activator-Like") effectors into the host plant cell. By means of their nuclear localization signals (NLS) TALEs are next imported into the host nucleus where they bind through central tandem repeats to host promoter targets at a sequence called EBE ("Effector Binding Element"), with the final aim of initiating gene transcription thanks to their activation domain (AD). Xoo is thus able to modulate the expression of plant genes by hijacking the plant transcriptional machinery and induce so-called susceptibility (S) genes that favor the development of the bacterium and disease consequently. In some cases, TALEs can activate so-called executor (E) genes whose expression leads to plant defense reactions and results in resistance. Genetic diversity analyses have shown that Xoo is comprised of two lineages that corresponding to strains from Africa for one and Asian strains for the other. African and Asian Xoo differ in their number of tal genes, but also in the type of resistance they elicit. Noteworthy, none of the races identified in Africa have been found in Asia.The objective of this thesis was to identify sources of resistance in rice in order to provide new strategies for the control of BLB in Africa. In a gain-of-function approach, preliminary analyses identified several TALEs of the Malian strain MAI1 with potential avirulence activity on the rice varieties IR64, CT13432 and FKR47N. To further confirm these results, a loss-of-function approach was undertaken, consisting in the inoculation of a library of BAI3Δtal mutants deriving from the Xoo Burkinabe strain BAI3, whose TALome (tal genes repertoire) is very similar to that of MAI1, on each of the three resistant varieties. This work validated the avirulence role of TalD and TalI on the matching rice varieties IR64 and CT13432, respectively. We also showed that the resistance exhibited by CT13432 against MAI1 and BAI3 results of the combination of two resistance mechanisms, one based on the TalI-mediated induction of an as yet unknown executor gene, and the other on an allele of the Xa1 resistance gene. In a second step, in order to deepen our knowledge on the resistance conferred by IR64 to African Xoo strains, the screening of a population of recombinant inbred lines of F11 generation, resulting from the cross between the resistant variety IR64 and the susceptible variety Azucena, was conducted. This study confirmed two QTL, qABB-7 and qABB-11, previously reported in another study, and also identified four new QTL of resistance against African Xoo strains. Finally, RNAseq analyses were performed on the resistant variety IR64 and the susceptible variety Nipponbare, which genomes are sequenced, to characterize their transcriptome in response to African Xoo. The avirulence activity of TalD in IR64 being demonstrated, a comparison of the differential expression of genes induced by MAI1 and BAI3 with the BAI3ΔtalD mutant was performed, allowing the identification of potential candidate E-genes induced by TalD in IR64. This work represents a first step in the development of new strategies based on the deployment of sustainable sources of resistance to control BLB in Africa

La bactériose vasculaire du riz, causée par la bactérie à Gram-négatif Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), est une des maladies les plus dévastatrices des cultures de riz en Afrique de l'Ouest et en Asie. Grâce à son système de sécrétion de type III, Xoo injecte ses effecteurs de type TAL ("Transcription Activator-Like") au sein de la cellule végétale hôte. Grâce à leurs signaux de localisation nucléaire (NLS), les TALE sont ensuite importés au noyau où ils ont la capacité de se fixer, par le biais de leur région centrale composée de répétitions en tandem, au promoteur d'un gène hôte au niveau d’une séquence appelée EBE (pour "Effector Binding Element"), et d’initier la transcription via leur domaine d'activation (AD). Xoo est ainsi capable de moduler l'expression des gènes de la plante en détournant sa machinerie transcriptionnelle et d'induire des gènes dits de sensibilité (S) qui favorisent le développement de la bactérie et donc de la maladie. Dans certains cas, les TALE peuvent activer des gènes dits exécuteur (E) dont l'expression entraîne des réactions de défenses de la plante et provoque la résistance. Des analyses de diversité génétique ont montré que Xoo comprend deux lignées correspondant aux souches Africaines et Asiatiques. Elles se distinguent notamment par le nombre de gènes tal qu'elles possèdent, mais aussi par le type de résistance qu’elles élicitent. De fait, aucune des races identifiées en Afrique n’a été retrouvée en Asie.L'objectif de cette thèse était d'identifier des sources de résistance chez le riz afin d’apporter de nouvelles stratégies de contrôle de la bactériose vasculaire du riz en Afrique. Des analyses préliminaires avaient permis de mettre en évidence par une approche de gain de fonction, plusieurs TALE de la souche Malienne MAI1 ayant une activité potentielle d'avirulence sur les variétés de riz IR64, CT13432 et FKR47N. Afin de confirmer ces résultats, une approche par perte de fonction a été entreprise, consistant à cribler une banque de mutants BAI3Δtal générés dans la souche Burkinabè BAI3, dont le TALome (répertoire de gènes tal) est très proche de celui de MAI1, sur chacune des trois variétés résistantes. Ces travaux ont permis de valider le rôle d’avirulence de TalD et TalI sur les variétés IR64 et CT13432, respectivement. Il a également été démontré que la résistance de CT13432 aux souches MAI1 et BAI3 résultait de la combinaison de deux mécanismes de résistance, l'un reposant sur l'induction, médiée par TalI, d'un gène exécuteur encore inconnu, et l'autre sur un allèle du gène de résistance Xa1. Dans un second temps, afin d'approfondir nos connaissances sur la résistance conférée par IR64 aux souches Africaines de Xoo, le criblage d'une population de lignées recombinantes de génération F11, provenant du croisement entre la variété résistante IR64 et la variété sensible Azucena, a été mené. Cette étude a permis de confirmer deux QTL, qABB-7 et qABB-11, préalablement rapportés dans une autre étude, et d'identifier quatre nouveaux QTL de résistance aux souches Africaines de Xoo. Pour finir, des analyses de type RNAseq ont été réalisées sur la variété résistante IR64 et la variété sensible Nipponbare, dont les génomes séquencés sont disponibles, afin de caractériser leur transcriptome en réponse à des souches Africaines de Xoo. L'activité d'avirulence de TalD chez IR64 ayant été démontrée, une comparaison de l'expression différentielle des gènes indu its par MAI1 et BAI3 avec le mutant BAI3ΔtalD a été effectuée, permettant d'identifier de potentiels gènes E candidats expliquant la résistance TalD-dépendante de IR64. Ces travaux représentent une première étape dans le développement de nouvelles stratégies basées sur le déploiement de sources de résistance durables afin de lutter contre la bactériose vasculaire du riz en Afrique
Bacterial Leaf Blight (BLB), caused by the Gram-negative bacterium Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), is one of the most devastating diseases of rice in West Africa and Asia. Xoo injects through its type-III secretion system a full cocktail of TAL ("Transcription Activator-Like") effectors into the host plant cell. By means of their nuclear localization signals (NLS) TALEs are next imported into the host nucleus where they bind through central tandem repeats to host promoter targets at a sequence called EBE ("Effector Binding Element"), with the final aim of initiating gene transcription thanks to their activation domain (AD). Xoo is thus able to modulate the expression of plant genes by hijacking the plant transcriptional machinery and induce so-called susceptibility (S) genes that favor the development of the bacterium and disease consequently. In some cases, TALEs can activate so-called executor (E) genes whose expression leads to plant defense reactions and results in resistance. Genetic diversity analyses have shown that Xoo is comprised of two lineages that corresponding to strains from Africa for one and Asian strains for the other. African and Asian Xoo differ in their number of tal genes, but also in the type of resistance they elicit. Noteworthy, none of the races identified in Africa have been found in Asia.The objective of this thesis was to identify sources of resistance in rice in order to provide new strategies for the control of BLB in Africa. In a gain-of-function approach, preliminary analyses identified several TALEs of the Malian strain MAI1 with potential avirulence activity on the rice varieties IR64, CT13432 and FKR47N. To further confirm these results, a loss-of-function approach was undertaken, consisting in the inoculation of a library of BAI3Δtal mutants deriving from the Xoo Burkinabe strain BAI3, whose TALome (tal genes repertoire) is very similar to that of MAI1, on each of the three resistant varieties. This work validated the avirulence role of TalD and TalI on the matching rice varieties IR64 and CT13432, respectively. We also showed that the resistance exhibited by CT13432 against MAI1 and BAI3 results of the combination of two resistance mechanisms, one based on the TalI-mediated induction of an as yet unknown executor gene, and the other on an allele of the Xa1 resistance gene. In a second step, in order to deepen our knowledge on the resistance conferred by IR64 to African Xoo strains, the screening of a population of recombinant inbred lines of F11 generation, resulting from the cross between the resistant variety IR64 and the susceptible variety Azucena, was conducted. This study confirmed two QTL, qABB-7 and qABB-11, previously reported in another study, and also identified four new QTL of resistance against African Xoo strains. Finally, RNAseq analyses were performed on the resistant variety IR64 and the susceptible variety Nipponbare, which genomes are sequenced, to characterize their transcriptome in response to African Xoo. The avirulence activity of TalD in IR64 being demonstrated, a comparison of the differential expression of genes induced by MAI1 and BAI3 with the BAI3ΔtalD mutant was performed, allowing the identification of potential candidate E-genes induced by TalD in IR64. This work represents a first step in the development of new strategies based on the deployment of sustainable sources of resistance to control BLB in Africa

Les éosinophiles sont des cellules à fonctionnalités multiples, impliquées dans de nombreux processus effecteurs et inflammatoires. Ils expriment à leur surface de nombreux récepteurs participant à l'immunité adaptative, mais aussi à l'immunité innée et libèrent, après activation, différents médiateurs, dont des protéines hautement cytotoxiques et des cytokines. Leur fonction exacte dans la réponse immunitaire innée reste encore inconnue. Outre leur présence au cours de certains processus granulomateux retrouvés lors de la schistosomiase ou dans la maladie de Crohn, une accumulation d'éosinophiles a été observée au sein de granulomes pulmonaires dans différents modèles d'infections mycobactériennes. L'objectif de notre travail a consisté à étudier les mécanismes impliqués dans les interactions entre les éosinophiles humains et Mycobacterium bovis BCG, choisi comme modèle de mycobactéries. Après avoir démontré l'activité chimiotactique du BCG vis-à-vis des éosinophiles nous avons ensuite montré que les éosinophiles pouvaient, après activation en présence de BCG, produire des espèces réactives de l'oxygène et libérer la peroxydase de l'éosinophile par dégranulation. La mise en évidence de l'expression membranaire des récepteurs Toll-like (TLR) 2 et 4 sur les éosinophiles nous a permis de démontrer l'implication majoritaire de TLR2 dans l'interaction éosinophiles/BCG ainsi que l'activation des voies MAP kinases et de la voie NF-κB. Enfin, nous démontrons que les éosinophiles sont capables d'exercer une fonction cytotoxique vis-à-vis du BCG, mécanisme faisant intervenir à la fois des défensines et la protéine cationique de l'éosinophile (ECP). Dans la continuité de la démonstration de l'expression par les éosinophiles de molécules partagées avec les lymphocytes T, nous nous sommes intéressés à d'autres molécules pouvant être impliquées dans les interactions éosinophiles/BCG, et plus particulièrement celles participant à l'immunité innée. C'est ainsi que, grâce à différentes approches de cytométrie en flux, de biochimie et de biologie moléculaire, nous avons mis en évidence l'expression du complexe CD3/TCRγδ à la surface d'une sous-population d'éosinophiles, puis nous avons montré la fonctionnalité de ce récepteur, après activation par des anticorps monoclonaux spécifiques ou des ligands physiologiques. Enfin, nous avons démontré, en utilisant des anticorps neutralisants ou un inhibiteur spécifique que CD3/TCRγδ participe à l'activation des éosinophiles induite par le BCG. Ce travail représente la première étude extensive des mécanismes intervenant dans les interactions entre éosinophiles humains et M. Bovis BCG. Il ouvre des perspectives nouvelles quant à la fonction des éosinophiles dans l'immunité innée, impliquant de manière originale deux récepteurs différents : TLR2 et CD3/TCRγδ. Nos résultats suggèrent également que les éosinophiles expriment des molécules de la famille des défensines, qui vient s'ajouter à leur arsenal cytotoxique et qui agirait en synergie avec l'ECP. En conclusion, ces résultats suggèrent que les éosinophiles puissent reconnaître directement des signaux de danger, incluant les mycobactéries, et, comme les lymphocytes Tγδ, représenter un nouveau lien entre immunité innée et immunité adaptative

Les éosinophiles sont des cellules à fonctionnalités multiples, impliquées dans de nombreux processus effecteurs et inflammatoires. Ils expriment à leur surface de nombreux récepteurs participant à l'immunité adaptative, mais aussi à l'immunité innée et libèrent, après activation, différents médiateurs, dont des protéines hautement cytotoxiques et des cytokines. Leur fonction exacte dans la réponse immunitaire innée reste encore inconnue. Outre leur présence au cours de certains processus granulomateux retrouvés lors de la schistosomiase ou dans la maladie de Crohn, une accumulation d'éosinophiles a été observée au sein de granulomes pulmonaires dans différents modèles d'infections mycobactériennes.
L'objectif de notre travail a consisté à étudier les mécanismes impliqués dans les interactions entre les éosinophiles humains et Mycobacterium bovis BCG, choisi comme modèle de mycobactéries.
Après avoir démontré l'activité chimiotactique du BCG vis-à-vis des éosinophiles nous avons ensuite montré que les éosinophiles pouvaient, après activation en présence de BCG, produire des espèces réactives de l'oxygène et libérer la peroxydase de l'éosinophile par dégranulation. La mise en évidence de l'expression membranaire des récepteurs Toll-like (TLR) 2 et 4 sur les éosinophiles nous a permis de démontrer l'implication majoritaire de TLR2 dans l'interaction éosinophiles/BCG ainsi que l'activation des voies MAP kinases et de la voie NF-κB. Enfin, nous démontrons que les éosinophiles sont capables d'exercer une fonction cytotoxique vis-à-vis du BCG, mécanisme faisant intervenir à la fois des défensines et la protéine cationique de l'éosinophile (ECP).
Dans la continuité de la démonstration de l'expression par les éosinophiles de molécules partagées avec les lymphocytes T, nous nous sommes intéressés à d'autres molécules pouvant être impliquées dans les interactions éosinophiles/BCG, et plus particulièrement celles participant à l'immunité innée. C'est ainsi que, grâce à différentes approches de cytométrie en flux, de biochimie et de biologie moléculaire, nous avons mis en évidence l'expression du complexe CD3/TCRγδ à la surface d'une sous-population d'éosinophiles, puis nous avons montré la fonctionnalité de ce récepteur, après activation par des anticorps monoclonaux spécifiques ou des ligands physiologiques. Enfin, nous avons démontré, en utilisant des anticorps neutralisants ou un inhibiteur spécifique que CD3/TCRγδ participe à l'activation des éosinophiles induite par le BCG.
Ce travail représente la première étude extensive des mécanismes intervenant dans les interactions entre éosinophiles humains et M. bovis BCG. Il ouvre des perspectives nouvelles quant à la fonction des éosinophiles dans l'immunité innée, impliquant de manière originale deux récepteurs différents : TLR2 et CD3/TCRγδ. Nos résultats suggèrent également que les éosinophiles expriment des molécules de la famille des défensines, qui vient s'ajouter à leur arsenal cytotoxique et qui agirait en synergie avec l'ECP. En conclusion, ces résultats suggèrent que les éosinophiles puissent reconnaître directement des signaux de danger, incluant les mycobactéries, et, comme les lymphocytes Tγδ, représenter un nouveau lien entre immunité innée et immunité adaptative.

Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) est l’agent causal de la bactériose vasculaire du riz (BLB), une maladie dévastatrice dans de nombreux pays rizicoles. Chez cette bactérie, les effecteurs de type TAL (Transcription Activator-Like) jouent un rôle majeur dans le pouvoir pathogène. En effet ces effecteurs qui sont secrétés à l’intérieur des cellules eucaryotes hôtes par le système de sécrétion de type III de Xanthomonas agissent comme de véritables facteurs de transcription capables de manipuler le transcriptome de l’hôte via l’induction de gènes spécifiques. L’interaction entre les TALs et le promoteur hôte ciblé est régi selon un code, tel que la région centrale des répétitions des TALs s’associe spécifiquement à sa séquence cible à raison d’une répétition pour un nucléotide. Un TAL peut agir comme une protéine de virulence via l’induction de gènes dits de sensibilité (S) dont l’activation est nécessaire au développement de la maladie, et comme protéine d’avirulence via l’induction d’un gène dit exécuteur (E), dont l’activation promeut les réponses de défense de la plante. L’objectif de cette thèse était d’identifier et de caractériser de nouvelles sources de résistance dépendants des effecteurs de type TAL pour contrôler la BLB. Chez le riz, les gènes de sensibilité à Xoo les mieux caractérisés sont ceux du clade III de la famille SWEET des transporteurs de sucres. L’un d’entre eux, OsSWEET14, est particulièrement important puisqu’il est ciblé par 4 effecteurs TALs différents et issus de souches de Xoo appartenant à des lignées génétiques distinctes et d’origines géographiques différentes. Partant du constat de la convergence pour l’induction de ce gène S majeur, un crible moléculaire du promoteur de OsSWEET14 a été réalisé dans le but d’identifier du polymorphisme pouvant affecter la liaison TAL-ADN et en conséquence entrainer une perte de sensibilité. Ces travaux ont permis l’identification du gène xa41(t) qui confère une forme de résistance récessive et à large spectre contre Xoo. Dans une seconde partie, le criblage phénotypique d’une centaine de variétés de riz résistantes à la souche africaine de Xoo MAI1 a permis d’identifier cinq TALs agissant comme des protéines d’avirulence. C’est le cas des effecteurs Tal2 et Tal9 qui provoquent spécifiquement une réaction de résistance sur la variété de riz IR64 dont le génome a été séquencé. Des analyses de type RNAseq ont été réalisées et ont permis d’identifier une dizaine de gènes exécuteurs E candidats expliquant potentiellement la résistance de IR64 à la souche de Xoo MAI1. Finalement, une troisième stratégie a été menée dans le cadre d’un projet collaboratif, visant à démontrer que PiCO39 conférant la résistance du riz au champignon pathogène Magnaporthe oryzae pouvait aussi contrôler les bactérioses vasculaire et à stries foliaires. Pour ce faire, des TAL artificiels (dTALE) ont été dessinés pour induire spécifiquement l’expression de la construction de M. oryzae AVR1-CO39 dans des riz transgéniques résistant (PiCO39) et sensible (pico39). Nos données montrent que l’induction de AVR1-CO39 par Xoo ou Xoc conduit de manière PiCO39-dépendante à une réduction spectaculaire des symptômes. Ceci démontre que les réactions de défense induites par un gène de résistance à M. oryzae sont également fonctionnelles contre X. oryzae, ouvrant de nouvelles perspectives originales quant aux stratégies de contrôle des bactérioses dues à Xanthomonas
Bacterial blight caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is the most destructive bacterial disease of rice. Xoo pathogenicity critically depends on the TAL (Transcription Activator-Like) effectors. TALs are type three effectors secreted through a type three secretion system into the eukaryotic cell where they act as transcription factors able to manipulate the host transcriptome via the induction of specific genes. DNA-binding specificity involves a unique central repeated region in the TAL effector whereby each repeat directly binds to one single nucleotide. TALs can act as major virulence effector thtough the induction of so-called susceptibility (S) genes that are essential for disease development, or act as avirulence effector by inducing so-called executor (E) resistance genes that promote host defense responses. The goal of this PhD project was to identify and characterize novel TAL-dependent resistance sources to control BLB. In rice, the best characterized S genes are those of the clade III of the sugar transporters SWEET family. The most important is OsSWEET14 as this gene is targeted at unrelated DNA boxes by four TAL effectors, which belong to strains of different lineages and geographic origins. The evolutionary convergence for the induction of SWEET14 reflects its crucial role as major determinant of rice susceptibility to Xoo. A molecular screening of the OsSWEET14 promoter was performed using the natural diversity of wild African rice in order to identify polymorphism that could affect the TAL/DNA binding and thus lead to loss of susceptibility. This work allowed the identification of xa41(t) that confers broad spectrum recessive resistance to Xoo. In a second part of my PhD project, a phenotypic screen for resistance against the Xoo African strain MAI1 of a hundred of rice accessions enabled to identify five TALs. Among them, Tal2 and Tal9 were shown to trigger resistance on the rice variety IR64 the genome of which is fully sequenced. RNAseq analysis identified a small set of resistance E gene candidates underlying potentially IR64 resistance against Xoo strain MAI1. Finally, as a third strategy we aimed within a collaborative project to investigate if PiCO39 that confers resistance of rice towards Magnaporthe oryzae could also control BLB and BLS (Bacterial leaf streak). To that end, Artificial TAL effectors (dTALe) were designed to induce specifically the M. oryzae AVR1-CO39 construct in resistant (PiCO39) and susceptible (piCO39) transgenic backgrounds. We show that the induction of AVR1-CO39 by Xoo or Xoc drastically impairs bacterial colonization in a PiCO39-dependent manner, highlighting the potential of exploiting rice blast or other resistance genes as novel strategies to control rice pathogenic Xanthomonas bacteria

Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), l'agent causal de bactériose vasculaire du riz (BLB), injecte des protéines de liaison à l'ADN, appelées Transcription Activator-Like Effectors (TALEs) dans les cellules hôtes afin de moduler l'expression de gènes cibles. Certains TALEs agissent comme des facteurs de virulence majeurs, indispensables à la mise en place du BLB et ciblent des gènes de sensibilité du riz. Les TALEs majeurs de Xoo ciblent universellement les gènes de sensibilité de la famille SWEET. Il existe dans la nature un polymorphisme des séquences ADN des gènes SWEET reconnues par les TALEs qui confère une résistance à la maladie. L’utilisation de la technologie TALEN a permis d'introduire artificiellement ce type de mutation dans le promoteur du gène de sensibilité SWEET14 le rendant insensible aux TALEs et conférant une résistance à certaines souches de Xoo asiatiques. La caractérisation des populations de Xoo africaines montrent qu'elles sont distinctes de celles d’Asie. L’objectif du projet de thèse était de créer à l'aide des technologies d'édition des génomes des sources de résistances efficaces contre un large panel de Xoo maliennes.Dans une première partie, l'édition des boites ADN de SWEET14 ciblées par des TALEs majeurs de souches africaines a effectivement permis d'obtenir des résistances contre les souches utilisant le TALE TalF (initialement appelé Tal5) mais pas contre celles utilisant TalC. La caractérisation du répertoire de TALEs des souches maliennes par des approches fonctionnelles (sensibilité des lignées éditées, expression de SWEET14 et autres gènes cibles de TALEs) et in silico (séquençage du génome de 8 souches) à révélé une diversité fonctionnelle de ces répertoires et la présence simultanée quasi systématique de versions actives et redondantes de TalF et TalC. La caractérisation de la sensibilité de variétés de riz locales aux souches de Xoo maliennes a montré que ces dernières possèdent un large spectre de virulence et qu'à une exception près, toutes les variétés testées sont sensibles au BLB. L'édition en multiplex par la technique CRISPR/Cas9 des boites TalF et TalC a aboli l'induction de SWEET14 en réponse à une souche malienne. Cependant, les lignées correspondantes sont restées sensibles à cette souche. Dans la dernière partie, pour expliquer ce résultat, nous avons postulé l'existence d'au moins un gène de sensibilité, cible de TalC et redondant avec SWEET14. Une approche bioinformatique a permis d'identifier un locus dont plusieurs caractéristiques en faisaient un candidat intéressant. Ce locus, nommé ATAC (pour Alternative TalC Target) est composé de deux gènes, ATAC1 et ATAC2 induits de façon bidirectionnelle par TalC. Nous avons montré qu'ATAC2, qui code pour un facteur de transcription bHLH atypique potentiellement impliqué dans l’élongation cellulaire et l'immunité chez le riz, se comporte comme un locus de sensibilité lorsqu'il est induit par des TALE artificiels dans un système gain de fonction. Nous avons édité simultanément le promoteur SWEET14 et le locus ATAC. Ces éditions devraient empêcher la reconnaissance du promoteur SWEET14 et du locus ATAC par TalC et TalF afin de conférer une résistance large au BLB au Mali
Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), the causal agent of bacterial leaf blight of rice (BLB), injects DNA binding proteins called Transcription Activator-Like Effectors (TALEs) into host cells to manipulate plant genes expression. Some TALEs behave as major virulence factors essential for BLB to occur by binding directly to target DNA boxes of rice susceptibility genes and inducing their expression. Xoo major TALEs universally target susceptibility genes of the SWEET family. In nature, polymorphism in the DNA sequence of SWEET genes recognized by TALEs confers resistance to BLB. Using the TALEN technology, this type of mutations has been artificially introduced in the promoter of the SWEET14 susceptibility gene to make it TALE-unresponsive and confer resistance to some Asian Xoo. The characterizations of Malian Xoo populations show that they are distinct from the Asian ones. The PhD project aimed to create broad tailored BLB resistance against Malian Xoo using genome editing technologies.First, editing SWEET14 DNA boxes targeted by major TALEs of African strains indeed yielded resistance against strains relying on TalF (initially named Tal5) but not against those relying on TalC. The characterization of Malian strains TALE repertoires using functional (edited lines susceptibility assays, SWEET14 and other TALE target expression studies) and in silico (genome sequencing of 8 strains) approaches uncovered functional diversity in these repertoires and, the almost systematic, simultaneous presence of active and redundant versions of TalF and TalC. In susceptibility assays of local rice varieties, Malian Xoo strains exhibited a broad virulence spectrum and, with one exception, all tested varieties were susceptible to BLB. Multiplex editing of TalF and TalC target boxes with the CRISPR/Cas9 technology abolished SWEET14 induction in response to a Malian strain. However the corresponding rice lines remained susceptible to this strain. Finally, to explain these results, we postulated the existence of, at least, a TalC target susceptibility gene redundant with SWEET14. Bioinformatics analysis identified a rice locus with several features electing it as a high priority candidate. This locus named ATAC (Alternative TalC Target) is composed of two genes, ATAC1 and ATAC2, bidirectionally upregulated by TalC. We further showed that ATAC2 which is predicted to code for an atypical bHLH transcription factor potentially involved in rice cell elongation and immunity, behaves as a susceptibility gene upon artificial TALEs-mediated induction in a gain of function assay. We used the CRISPR/Cas9 system to simultaneously edit the SWEET14 promoter and the ATAC locus. These mutations should prevent the recognition of the SWEET14 promoter and the ATAC locus by TalC and TalF, compromise their transcriptional induction and ultimately provide broad BLB resistance in Mali

Dans l’environnement les bactéries ne vivent pas seules. Elles coopèrent, mais se mènent également une guerre pour la survie. Le système de sécrétion de type VI (T6SS) est l’un des acteurs principaux dans cette guerre antimicrobienne. Il permet la sécrétion, directement dans les cellules compétitrices, d’effecteurs antibactériens. Le T6SS est une structure macromoléculaire comprenant un complexe membranaire (MC) ancré à la membrane qui recrute et assemble une structure tubulaire contractile. Le tube interne est enfermé dans un fourreau contractile. Au sommet de cette structure se trouve la pointe perforatrice du système formée par un trimère de la protéine VgrG. Au contact d’une bactérie cible, le fourreau se contracte, entrainant la propulsion du tube interne, de la pointe perforatrice et des toxines dans la cellule cible. L’objectif de ma thèse était d’identifier les toxines sécrétées par le T6SS d’Escherichia coli entéro-agrégatif (EAEC) et de comprendre leur mécanisme de sécrétion. Nous avons caractérisé Tle1, un effecteur de type phospholipase A1, responsable de l’activité antibactérienne du T6SS-1 d’EAEC. Les cellules productrices se protègent de l’activité toxique de cet effecteur en produisant une protéine d’immunité, Tli1, qui est une lipoprotéine de membrane externe. Nous avons ensuite montré que Tle1 interagit directement avec l’extension C-terminale de la protéine VgrG. Cette interaction permet de sécréter Tle1 directement dans les bactéries cibles. Enfin, nous avons purifié et caractérisé ce complexe, déterminé les régions nécessaires à cette interaction et résolu la structure du complexe à basse résolution par microscopie électronique
Bacteria do not live alone in their environment; they cooperate but also compete for niches and resources. The Type VI secretion system (T6SS) is one of the key players in the bacterial warfare by delivering anti-bacterial effectors directly into competitor cells. The T6SS is a macromolecular structure: A membrane complex (MC) anchored in the envelope recruits an assembly platform for a contractile tail structure. The tail is a tube wrapped by a sheath and topped by a needle spike called VgrG. The tail assembles in an elongated conformation. Upon contact with a target cell, the contraction of the sheath propels the inner tube, the spike and the toxins toward target cells. The goal of my PhD work was to identify T6SS toxins and to understand how they are selected by the EAEC T6SS. We have characterized Tle1, an antibacterial effector with phospholipase A1 (PLA1) activity, responsible for the antibacterial activity of EAEC T6SS. Self-protection of the producing cell is assured by an outer membrane lipoprotein, Tli1. We further showed that Tle1 interacts directly with the C-terminal extension domain of VgrG to allow subsequent delivery into target bacteria. We succeeded to purify the complex and obtain a 3D model at low resolution of the complex by electron microscopy after negative staining. The toxin interacts with the tip of the needle spike to be transported from the producing cell to the target cell

C. trachomatis est une bactérie Gram-négative intracellulaire obligatoire et un pathogène humain. Première cause de maladie sexuellement transmissible d'origine bactérienne, elle est également responsable, dans les pays en développement, d'infections oculaires pouvant conduire à la cécité (trachome). Son cycle de développement bi-phasique a lieu au sein d'un compartiment appelé inclusion. Grâce à un système de sécrétion de type 3 (SST3), Chlamydia sécrète des protéines dans le cytosol de la cellule afin de promouvoir sa survie et sa multiplication. Ces protéines sont désignées sous le terme d'effecteurs
C. trachomatis is an obligate intracellular Gram-negative bacteria and a human pathogen. It is the most prevalent cause of sexually transmitted diseases of bacterial origin and a leading cause of preventable blindness in the developing world. During their biphasic developmental cycle the bacteria remains in a membrane-bounded cellular compartment called an inclusion. Using a type 3 secretion system (T3SS) they translocate effector proteins inside the cytosol of the cell to promote its survival and multiplication.The aim of the PhD was to study the function of CT622, a hypothetic protein from C. trachomatis. We showed that CT622 is an effector protein from the T3SS and that it is secreted early during the infection. We identified a bacterial protein that binds to CT622, and we showed that it acts as a chaperone, stabilizing CT622 and enhancing its secretion. We obtained bacteria lacking CT622 expression, thus demonstrating that CT622 is not essential for bacterial growth in vitro. However, preliminary studies indicate that in the absence of CT622 bacterial development is delayed and T3SS is defective.We identified several molecules interacting with CT622: geranylgeranyl diphosphate, Rab39 and Atg16L1 proteins. Future work will aim at understanding how these identified interactions, or other bacterial or cellular partners still to be discovered, contribute to the establishment of a niche favorable to bacterial development

Un nombre croissant de protéines est localisé dans des régions spécifiques de la bactérie, cette localisation subcellaire étant la clé de leur fonction. Cependant en l'absence de compartiment intracellulaire membranaire, le mécanisme qui sous-tend la localisation des protéines de E. Coli au pôle par exemple de la cellule reste incompris. Nous montrons ici que la polarisation d'IpaC, composé du translocon du système de sécrétion de type III de Shigella flexneri est dépendante de son association avec la protéine chaperonne DnaK. Une construction d'IpaC fusionnée à la protéine fluorescente Venus (Civ) induit la formation de complexes de DnaK, exclus par le nucléoïde et accumulés au pôle bactérien, indépendamment de ses co-chaperons. Des expériences de FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) ont montré que la diffusion de Civ au pôle était limitée, probablement par son association avec Dnak. Dnak empêche l'accumulation létale de Civ agrégée à travers le corps bactérien, permettant sa séquestration réversible au pôle. Nous pensons que ces résultats mettent en évidence un nouveau moyen pour la bactérie de confiner certaines protéines à un pôle, par exclusion par le nucléoïde des complexes DnaK-substrats, pouvant ensuite servir de réservoir de protéines dépliées ou partiellement dépliées. Ces résultats sont le point de départ de nouvelles études visant à caractériser le lien entre ces complexes polaires DnaK-substrats et les processus fonctionnels impliquant le dépliement des protéines, comme par exemple la sécrétion bactérienne
An increasing number of proteins are localized in specific regions of the bacteria, this subcellular localization being key to their function. In the absence of intracellular membrane-bound compartment, however, the mechanism underlying the localization of E. Coli proteins to the cell pole has remained elusive. Here, we show that polarization of the Shigella type III secretion system translocon component IpaC is driven by its association with the DnaK chaperone. An IpaC construct fused to the Venus fluorescent protein (Civ) induced DnaK complexes that were excluded from the nucleoid and accumulated at the bacterial pole independent of its co-chaperones. Fluorescence alter photobleaching (FRAP) analysis indicated that Civ diffusion at the pole was restricted, likely by DnaK association. DnaK prevented the lethal accumulation of aggregated Civ through the bacterial body, to allow its reversible sequestration at the pole. We believe that these findings are shedding new lights a bacterial means to confine proteins at the pole through the nucleoid-mediated exclusion of DnaK-substrate complexes, that may then serve as a reservoir of , unfolded or partially unfolded proteins. It is anticipated that these findings will be the starting point of further studies aiming at characterizing the link between these polar DnaK-substrate complexes and functional processes involving protein unfolding, such as bacterial secretion

La bactérie Xanthomonas campestris pathovar campestris (Xcc) est responsable de la pourriture noire, une maladie vasculaire atteignant de nombreuses crucifères dont la plante modèle Arabidopsis thaliana. Les récepteurs TonB-dépendants (TBDRs) sont des protéines de la membrane externe des bactéries à Gram négatif, connues pour leur rôle dans le transport actif des complexes fer-sidérophore. Le génome de Xcc renferme 72 TBDRs ; cette sur-représentation est partagée par les autres espèces de Xanthomonas mais est limitée à un petit nombre de bactéries. Nos travaux ont permis de montrer que seulement 9 TBDRs de Xcc sont impliqués dans l'acquisition du fer. En revanche, l'analyse des gènes encadrant les autres TBDRs suggère que certains pourraient appartenir à des loci potentiellement impliqués dans l'utilisation de carbohydrates végétaux, appelés CUT loci (Carbohydrate Utilization containing TBDR loci). Le CUT locus du saccharose a été étudié de façon approfondie ; ce locus contribue au pouvoir pathogène de Xcc sur Arabidopsis, et contient un TBDR qui transporte du saccharose avec une très forte affinité. Nous avons également étudié un système de deux loci impliqués dans la dégradation du xylane et dans le transport de xylooligosaccharides ; nous avons identifié le régulateur transcriptionnel et défini les signaux végétaux inducteurs de ce CUT système. L'étude de deux autres CUT loci potentiellement impliqués dans l'utilisation de la pectine a été initiée. Enfin, nous avons observé que certains TBDRs/CUT loci sont conservés chez des bactéries ayant en commun la capacité de dégrader efficacement des polysaccharides complexes, et présentant également une sur-représentation des TBDRs. Nous proposons donc que la sur-représentation des TBDR et la présence de CUT loci traduisent la capacité d'une bactérie à exploiter activement des carbohydrates et contrôlent l'interaction avec la plante et/ou l'adaptation à divers environnements. .
The bacterium Xanthomonas campestris pathovar campestris (Xcc) causes black rot, a vascular disease on cruciferous plants including Arabidopsis thaliana. TonB-dependent receptors (TBDRs) are outer membrane proteins mainly known for the active transport of iron siderophore complexes in Gram-negative bacteria. Analysis of the Xcc genome predicts 72 TBDRs. Such an overrepresentation is common in Xanthomonas species but is limited to a small number of bacteria. Here, we show that only 9 Xcc TBDRs are likely to be involved in iron uptake. A genome context survey of the other TBDRs suggested that several Xcc TBDRs belong to loci potentially involved in the utilization of various plant carbohydrates, named CUT loci (Carbohydrate Utilization containing TBDR loci). We studied the sucrose CUT locus, which is required for full pathogenicity on Arabidopsis, and in which the TBDR transports sucrose with a very high affinity, suggesting that it might be a sucrose scavenger. We also focused on a CUT system constituted by two loci involved in xylan degradation and xylo-oligosacharide transport. We identified the transcriptional regulator of this system and characterized the plant inducing signals. The study of two other CUT loci, putatively involved in pectin utilization, was initiated. Finally, we noticed that several TBDRs/CUT loci are conserved in bacteria sharing the ability to degrade a wide variety of complex carbohydrates and displaying TBDR overrepresentation. .

Les mastocytes sont les sentinelles du système immunitaire , et jouent un rôle majeur dans les allergies ou réaction d’hyper-sensibilité de type I. Ces cellules expriment le RFceI constitué de 4 chaïnes : , b et 2 g comportant chacune un domaine ITAM. L’agrégation du RFceI par IgE+Ag induit la phosphorylation des domaines ITAM permettant l’initiation de 2 voies de signalisation dépendantes de Lyn et de Fyn. Ces voies sont régulées par des kinases et des phosphatases et mènent à la libération de médiateurs pro-inflammatoires et de cytokines. Dans ce contexte, il a été montré que la PLSCR1 est phosphorylée sur tyrosine suite à l’activation IgE-dépendante de la lignée mastocytaire RBL-2H3. Cette protéine a initialement été associée au scrambling lors de l’apoptose ou de l’activation cellulaire. Nous avons analysé le rôle et la régulation de la PLSCR1 dans ce contexte. La PLSCR1 existe sous la forme d’homo-complexes, est palmitoylée et présente dans les rafts. Elle interagit constitutivement avec le RFceI et avec Lyn. Lyn phosphoryle la PLSCR1 sur tyrosines et cela est en partie dépendante de la mobilisation calcique alors que Fyn régule négativement cette phosphorylation. Ainsi, la PLSCR1 se situe à un carrefour des 2 voies d’activation initiées par Lyn et Fyn après agrégation du RFceI. La PLSCR1 régule sélectivement certaines réponses mastocytaires IgE-dépendantes. Elle régule positivement la dégranulation, la sécrétion du VEGF et l’axe LAT-PLCg1/2 menant à la mobilisation calcique et ne modifie pas la voie menant à la synthèse de dérivés de l’acide arachidonique. D’autres études sont nécessaires pour la compréhension de ces mécanismes impliquant la PLSCR1.

Wolbachia est une bactérie Gram(-) intracellulaire modifiant la reproduction de nombreux arthropodes. Chez l'isopode Armadillidium vulgare, la souche wVulC entraîne la féminisation des mâles. Nous avons caractérisé deux opérons vir s'exprimant dans tous les tissus hôtes et codant un système de sécrétion de type IV (T4SS) pouvant permettre d'exporter des effecteurs bactériens vers le cytoplasme de l'hôte. La comparaison des séquences et de l'organisation des gènes de 37 souches de Wolbachia a révélé la forte conservation des deux opérons vir suggérant l'importance du T4SS dans la biologie de la bactérie. Nous avons également identifié, dans le génome en cours de séquençage de wVulC, 66 gènes codant des protéines à domaines ankyrines. Ces motifs forment des sites d'interactions protéine-protéine chez les eucaryotes et sont supposés être impliqués chez Wolbachia dans l'interaction avec des protéines de l'hôte. Nous avons montré qu'une des trois copies du gène pk2 de wVulC, n'est exprimée que chez des souches féminisantes mais chez aucune des 3 souches induisant l'incompatibilité cytoplasmique chez les isopodes terrestres. Ce produit du gène pk2 pourrait être impliqué dans la féminisation de l'hôte. Toutefois, nous avons réalisé des tests d'interaction par double-hybride en levures et par la méthode CRAfT (Cre-recombinase Reporter Assay for Translocation) entre les protéines du T4SS et cinq protéines à domaines ankyrines dont Pk2 afin de savoir si ces dernières étaient sécrétées par ce système. Les résultats montrent qu'aucun des cinq produits de gènes ank testés n'est sécrété par la bactérie mais se révèlent encourageants pour identifier les effecteurs de Wolbachia.

Shigella, l’agent de la dysenterie bacillaire, utilise un système de sécrétion de type III (T3SS) pour envahir et détruire les cellules de l’épithélium recto-colique. Le T3SS est activé par le contact cellulaire. Les protéines IpaC et IpaB sont sécrétées et s’insèrent dans la membrane de la cellule hôte pour former un translocateur, requis pour l’injection des effecteurs du T3SS. Nous avons montré qu’IpaC est stockée puis sécrétée à un pôle de la bactérie. Cette localisation polaire dirige l’injection des effecteurs lors de l’invasion. IpaC se juxtapose à IcsA, au nouveau ou au vieux pôle. La localisation d’IpaC est indépendante du T3SS. Les régions d’IpaC impliquées dans sa localisation ont été caractérisées. La polarisation d’IpaC conditionne l’efficacité de sa sécrétion. En utilisant une fusion IpaC-CFP qui bloque le T3SS, nous avons mis en évidence un contrôle commun de la sécrétion d’IpaC et IpaB. IpaC s’associe à la base du T3SS, probablement en complexe avec IpaB. In vitro, IpaC est reconnue par l’ATPase du T3SS. Le complexe formé par les composés du translocateur à la base du T3SS pourrait conditionner leur assemblage dans la membrane de la cellule hôte.

Le mildiou de la vigne est causé par l’oomycète Plasmopara viticola, qui s’attaque aux parties aériennes non-lignifiées affectant la production viticole. Une alternative à l’utilisation de pesticides est l’utilisation de variétés de vigne à la résistance durable, et un programme pour leur création par croisement entre espèces résistantes et la vigne cultivée, Vitis vinifera, est en cours. Ce programme nécessite l’identification de nouveaux gènes de résistance, ce que le projet vise à faire par (1) le criblage de vignes résistantes avec des effecteurs conservés chez P. viticola, (2) l’étude fonctionnelle d’effecteurs candidats. Le criblage de plantes résistantes n’a conduit à l’identification d’aucun nouveau facteur de résistance majeur. L’étude fonctionnelle d’effecteurs a permis la mise en évidence d’une nouvelle famille d’effecteurs chez P. viticola et a conduit à l’identification de deux effecteurs Pv33, nucléaire, et Pv47, associé au réticulum endoplasmique, qui induisent des défenses végétales
Grapevine downy mildew is caused by the oomycete Plasmopara viticola, which attacks the aerial non-lignified tissues affecting wine production. An alternative to the use of pesticides is the use of vine varieties with sustainable resistances. A programme aiming to create such varieties by crossing resistant species with the cultivated grapevine, Vitis vinifera, is ongoing. Within this program requiring the indentification of new resistance genes, which the project aims to do by (1) screening resistant vines with effectors stored in P. viticola, (2) performing a functional study of candidate effectors. The screening of resistant plants did not lead to the identification of any new major resistance factors. The functional study of effectors revealed a new family of effectors in P. viticola and led to the identification of two effectors Pv33, nuclear, and Pv47, associated with the endoplasmic reticulum, which induce plant defences

Pseudomonas aeruginosa a développé de nombreuses stratégies dans le but de désarmer l’hôte eucaryote et prendre l'avantage sur ce dernier. Le T6SS est un complexe dynamique, homologue à la queue contractile du bactériophage T4. Il fonctionne à la manière d’une arbalète en injectant une flèche chargée d’effecteurs dans la cellule cible. Nous avons découvert un nouvel effecteur du T6SS de P. aeruginosa, Tle3, et sa protéine d’immunité associée, Tli3. Tli3 permet de contrecarrer la toxicité périplasmique dépendante de Tle3 dans le but de se prémunir des attaques fratricides. La caractérisation du mécanisme de sécrétion de Tle3 nous a permis de mettre en évidence l’existence d’une protéine adaptatrice, Tla3. Tla3 permet l’adressage et l’interaction de Tle3 avec VgrG2b, conduisant ainsi à la sécrétion de l’effecteur par la machinerie H2-T6SS. Tla3 est différente des autres protéines adaptatrices caractérisées à ce jour, définissant de ce fait une nouvelle famille d’adaptateur. De manière intéressante, ces travaux nous ont amené à découvrir que VgrG2b, précédemment caractérisée comme un effecteur anti-eucaryote, possède de surplus une activité anti-procaryote. En effet, ce dernier est toxique envers Escherichia coli. De manière surprenante, Tli3 peut également contrecarrer la toxicité de VgrG2b. VgrG2b est donc un nouvel effecteur trans-règne permettant de cibler les communautés microbiennes et l’hôte eucaryote. VgrG2b représente donc une cible intéressante dans la lutte contre P. aeruginosa dans le contexte environnemental et dans le contexte infectieux
Pseudomonas aeruginosa has evolved multiple strategies to disarm and take advantage of its host. Among this, the type VI secretion system (T6SS) is utilized to deliver effectors into eukaryotic host as well as target bacteria. It assembles into a contractile bacteriophage tail-like structure that functions like a crossbow, injecting an arrow loaded with effectors into the target cell. Here, we report the discovery of a novel pair of antibacterial effector and immunity of P. aeruginosa, Tle3 and Tli3. Tli3 neutralizes the toxicity of Tle3 in the periplasm to protect from fratricide intoxication. The characterization of the secretion mechanism of Tle3 indicates that it requires a cytoplasmic adaptor, Tla3, to be targeted and loaded onto the VgrG2b spike and thus delivered by the H2-T6SS machinery. Tla3 is different from the other adaptors discovered so far and defines a novel family among T6SS with a DUF2875. Interestingly, this led us to discover that VgrG2b that we previously characterized as an anti-eukaryotic effector possesses an antibacterial activity as well, as it is toxic towards Escherichia coli. Excitingly Tli3 can counteract VgrG2b toxicity. VgrG2b is thus a novel trans-kingdom effector targeting both bacteria and eukaryotes. VgrG2b represents an interesting target for fighting against P. aeruginosa in the environment and in the context of host infection

Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria (Xcv) est l'agent causal de la gale bactérienne sur piment et tomate. L'interaction entre Xcv et ses plantes-hôtes dépend d'un système de sécrétion de type III (SSTT) spécialisé dans la sécrétion de facteurs de virulence. L'un d'entre eux est la protéine AvrBs3 qui appartient à une famille d'effecteurs largement conservée dans le genre Xanthomonas. Sur les plantes sensibles, les souches de Xcv exprimant avrBs3 provoquent la formation de pustules, tandis qu'elles induisent spécifiquement une réaction d'hypersensibilité (HR) sur les lignées de piment résistantes. Des expériences d'immunocytochimie ont permis de détecter AvrBs3 dans des cellules de piment infectées avec Xcv. L'immunodétection d'AvrBs3 s'est avérée dépendre d'un SSTT fonctionnel et du signal de sécrétion N-terminal, démontrant directement l'injection de cet effecteur dans la cellule végétale. En outre, AvrBs3 est détectée dans les noyaux et cette localisation est supprimée en l'absence des signaux de localisation nucléaires (NLS). La présence d'un domaine d'activation de la transcription fonctionnel et nécessaire à l'avirulence d'AvrBs3 suggère que cet effecteur interagit avec la machinerie de transcription eucaryote. Afin d'identifier les protéines de piment cibles d'AvrBs3, nous avons utilisé le système double hybride. Sur les huit classes d'ADNc de piment isolés, deux codent l'importine α qui est un composant du système de transport nucléaire. L'interaction entre AvrBs3 et l'importine α a été analysée en détail dans la levure et in vitro, mettant en évidence l'importance des NLS. Plusieurs modèles expliquant le mode d'interaction d'AvrBs3 avec les facteurs de l'hôte pour éliciter les réactions de défense et assurer sa fonction de virulence sont discutés.

La maladie de la pourriture noire des Brassicacées est causée par la colonisation du système vasculaire des plantes par Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). Cette bactérie, largement retrouvée sur les cinq continents, peut infecter de nombreuses espèces d'intérêts agronomiques et la plante modèle Arabidopsis. Malgré l'importance de cette maladie, la génétique et les bases moléculaires de la résistance à Xcc et de la résistance vasculaire en général restent méconnues et ont été le sujet de mes travaux de thèse. Des approches génétiques chez Arabidopsis ont permis d'identifier trois gènes (ZAR1, PBL2, RKS1) requis pour la résistance à Xcc et la reconnaissance de l'effecteur de type III XopAC de Xcc. Ces trois gènes codent respectivement une protéine de résistance canonique (famille des NLR) et deux kinases de la famille des RLCK. En collaboration avec l'équipe de J-M Zhou (Pékin), nous avons élucidé le mécanisme moléculaire de reconnaissance de XopAC: Un complexe de résistance préformé ZAR1-RKS1 reconnaît spécifiquement l'uridylylation de la kinase PBL2 par XopAC et induit la résistance à Xcc. Contrairement aux données existantes, la spécificité de reconnaissance du complexe de résistance n'est pas portée par la NLR mais par la kinase adaptateur RKS1. Ces résultats constituent la première description des mécanismes moléculaires sous tendant la résistance des brassicacées à Xcc et pourront servir de bases pour la mise en place de programmes rationnels d'amélioration variétale chez les Brassicacées cultivés
Black rot disease of Brassicaceae is caused by the colonization of plant vasculature by Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). This worldwide-distributed bacterium causes serious losses in brassica crops and also infects Arabidopsis. Despite of the economic importance of this disease, genetics and molecular bases of resistance to Xcc and vascular resistance in general is poorly understood. This topic was thus selected as my thesis project. Genetic approaches in Arabidopsis identified three genes (ZAR1, PBL2, RKS1) required for resistance to Xcc and the recognition of the Xcc type III effector XopAC. These three genes code for a canonical resistance protein of the NLR family and two kinases of the RLCK family, respectively. In collaboration with the group of J-M Zhou (Beijing), we uncovered the molecular mechanism of XopAC recognition: a preformed ZAR1-RKS1 resistance complex specifically recognizes PBL2 uridylylated by XopAC and triggers resistance to Xcc. In contrast to existing knowledge, the recognition specificity of the resistance complex is not conferred by the NLR but by the adaptor kinase RKS1. These results are the first description of the molecular mechanisms underlying Brassicaceae resistance to Xcc and pave the avenue for the rationale breeding of resistance in Brassica crops

Ralstonia solanacearum a dans son répertoire d’effecteurs de type III une famille de gènes codant pour des protéines nommées GALA. Ces protéines possèdent une structure caractéristique des protéines à F-box eucaryotes qui entrent dans la composition des complexes SCF impliqués dans l’ubiquitination des protéines. Nous avons démontré l’action collective des protéines GALA dans la virulence de la bactérie. Nous avons identifié au sein de cette famille le premier effecteur contrôlant la virulence de la bactérie sur une plante hôte. Il est apparu que les effecteurs GALA se comportent comme des protéines à F-box de plante et pourraient ainsi contrôler l’ubiquitination de protéines cibles dans la cellule végétale. Une cible candidate a été identifiée. Nous avons mis en évidence une protéine végétale susceptible d’être impliquée dans une voie de signalisation contrôlant la mise en place du Flétrissement bactérien. Nous proposons une hypothèse sur l’activité moléculaire des effecteurs GALA
Ralstonia solanacearum type III effector candidate repertory contains a gene family coding for proteins designated GALA. The GALA proteins possess a protein structure characteristic of eukaryotic F-box proteins. F-box proteins are subunits of SCF complexes involved in protein ubiquitination; a process controlling eukaryotic cellular homeostasis. In the course of this work, we demonstrated that GALA proteins are genuine effectors, and that they collectively play a role in R. Solanacearum virulence. Within the family, we identified the first effector from this bacteria controlling virulence on a specific host. Our studies revealed that GALA effectors behave as plant F-box proteins and that they could mediate ubiquitination of target proteins in the host cell. A target has been identified. We identified for the first time a plant protein potentially involved in a signaling pathway controlling Bacterial wilt establishment. We propose a model for the molecular activity of GALA effectors

Les Bradyrhizobium sont des bactéries du sol ayant la capacité d’établir une interaction symbiotique avec de nombreuses légumineuses. Cette symbiose conduit à la formation d’un nouvel organe, le nodule, au sein duquel la bactérie peut fixer le diazote atmosphérique au bénéfice de la plante. Cette interaction repose largement sur la reconnaissance par la plante de molécules signal,les facteurs Nods (FNs) produits par la bactérie qui contrôlent les processus d’infection et d’organogénèse nodulaire. Récemment, il a été démontré que certaines souches de Bradyrhizobiumnon-photosynthétiques, telles que les souches B. elkanii USDA61 et Bradyrhizobium sp. ORS3257,possèdent la capacité de noduler certaines légumineuses (Glycine max, Aeschynomene indica) enl'absence de facteurs Nods grâce à leur système de sécrétion de type III (T3SS). Cette découverte suggère que certains effecteurs secrétés par cette machinerie de sécrétion, initialement connus pour jouer un rôle dans la répression du système immunitaire de la plante hôte, peuvent directement activer la nodulation en court-circuitant les premières étapes de la voie de signalisation initiée parles FNS. Dans un premier temps, l’objectif principal de ce travail de thèse a consisté à avancer dans la compréhension des mécanismes mis en jeu lors de cette nouvelle interaction FN-indépendante T3SSdépendanteen utilisant la souche ORS3257 en interaction avec la légumineuse tropicale A. indica. Il a été démontré que ce processus symbiotique repose sur un cocktail d'au moins 5 effecteurs quijouent un rôle distinct et complémentaire dans les processus d'infection, d'organogenèse desnodules et de répression de la réponse immune. Plus particulièrement, un nouvel effecteur nucléaire appelé ErnA pour « Effector required for nodulation-A » et largement distribué chez les Bradyrhizobium, a été identifié comme étant le principal inducteur de l’organogenèse nodulaire.Dans un second temps, nous avons mené une analyse génomique comparative sur 146 génomes deBradyrhizobium afin de mieux comprendre la distribution du T3SS et des principaux effecteurs identifiés à ce jours. Il a été mis notamment en évidence que le T3SS est très répandu dans le genreBradyrhizobium et qu’il partage une histoire évolutive commune avec les gènes de nodulation nod. L’ensemble de ce travail de thèse constitue une première étape dans la compréhension des mécanismes moléculaire recrutés pour la mise en place d’un nouveau processus de nodulation indépendante d’une signalisation FNs et suggère, par ailleurs, que le T3SS des Bradyrhizobium pourrait jouer un rôle symbiotique bien plus important qu’estimé jusqu’alors
Bradyrhizobia are soil bacteria able to establish a symbiotic interaction with a wide range oflegume species. This symbiosis leads to the formation of a new organ, the nodule, in which thebacteria can fix atmospheric dinitrogen for the plant’s benefit. This interaction largely depends onthe plant recognition of bacterial signal molecules, the Nod factors (NFs), that control the infectionand nodule organogenesis processes. Recently, it has been demonstrated that some nonphotosyntheticBradyrhizobium strains, such as B. elkanii USDA61 and Bradyrhizobium sp. ORS3257,are capable to nodulate some legumes (Glycine max, Aeschynomene indica) in the absence of NFsand that this capacity is due to their type III secretion system (T3SS). This discovery suggests thatsome effectors secreted by this secretory machinery, initially believed to solely play a role in thesuppression of plant immunity, can directly activate the nodulation by bypassing the early stages ofthe symbiotic signaling pathway activated by the NFs. The main objective of this thesis was toprogress in the understanding of the mechanisms involved in this novel NF-independent T3SSdependentinteraction using as model the interaction of the strain ORS3257 with the tropical legumeA. indica. It has been shown that this symbiotic process relies on a cocktail of at least 5 effectors thatplay distinct and synergistic roles in the processes of infection, nodule organogenesis andsuppression of the plant immune response. In particular, a novel nuclear effector, that we namedErnA for "Effector required for nodulation-A", is widely distributed in the Bradyrhizobium genus andwas identified as the main inducer of nodule organogenesis. In addition, we have conducted acomparative genomic analysis of 146 Bradyrhizobium genomes in order to better understand thedistribution of T3SS and the main effectors identified to date. This showed that the T3SS iswidespread in the Bradyrhizobium genus and shares a common evolutionary history with the nodgenes. This thesis work constitutes a first step in the understanding of the molecular mechanismsinvolved in this NF-independent T3SS-dependent nodulation and suggests that the T3SS ofbradyrhizobia could play a much larger symbiotic role than originally thought

La bactériose vasculaire du riz (BLB) et bactériose non-vasculaire du riz (BLS), causées respectivement par Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) et X. oryzae pv. oryzicola (Xoc), sont les deux plus importantes maladies bactériennes du riz. Ces maladies limitent le rendement de la production de riz dans les zones rizicoles en Asie et dans certaines régions d'Afrique. L'infection et la multiplication bactérienne dans les tissus de l'hôte dépendent souvent des facteurs de virulence de ces bactéries dont le type le système de sécrétion de type III (T3SS) et ses substrats. Dans cette thèse, nous avons identifié neuf effecteurs non-TAL (transcription Transcription activator-like) sécrétés par des effecteurs de type III de la souche chinoise 13751 de Xoo en utilisant le domaine d'induction HR de la protéine avirulente AvrBs1 comme gène reporter. Parmi eux, XopAE13751 a été expérimentalement confirmé pour la première fois comme étant un effecteur non-TAL. Ensuite, par l'analyse mutationnelle de ces gènes effecteurs identifiés dans Xoo, nous avons constaté que l'effecteur non-TAL XopR13751 était nécessaire pour la virulence de la souche chinoise de Xoo sur le riz hybride Teyou63. En parallèle, nous avons démontré que le gène rsmA (repressor of secondary metabolism) - comme le gène rsmAXoo de l'espèce chinoise Xoo 13751- régule positivement l'expression des gènes associés aux facteurs de virulence, tels que le système de sécrétion de type III, les enzymes extracellulaires et le DSF (diffusible signal factor). De plus, le gène effecteur non-TAL xopO s'est avéré être peu répandu chez les Xanthomonas puisqu'il est présent uniquement chez X. euvesicatoria (Xe) et Xoc mais est absent chez Xoo. En considérant les deux pathovars de X. oryzae, avec deux modes d'infection différents, xopO a été examiné comme un facteur de la spécificité du tissu par l'inactivation mutationnelle du gène dans Xoc et par l'expression du gène dans Xoo. Les résultats ont montré que xopO n'est pas la cause déterminante de la spécificité de tissu chez Xoc. Enfin, nous avons étudié les VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats) comme outil de typage moléculaire rapide, fiable et rentable, pour améliorer le contrôle des épidémies et pour évaluer la structure de population des souches de Xoc. 28 loci candidats VNTR ont été prédits par le criblage de trois génomes de Xoc (souche philippine BLS256, souche chinoise GX01 et souche malienne MAI10). Des paires d'amorces pour l'amplification de PCR de chacun des 28 loci ont été conçues et testées à un pannel de 20 souches de Xoc provenant de l'Asie et de l'Afrique. Le séquençage des amplicons de PCR a confirmé 25 loci VNTR robustes et polymorphes communs entre les souches Xoc asiatiques et africaines. Un dendrogramme, construit à partir de la combinaison des 25 loci de VNTR (MLVA-25), a montré que la plupart des souches asiatiques sont clairement distinguables des souches africaines. Cependant, en accord avec de précédents rapports, une souche Malienne se distingue et semble être liée aux souches asiatiques, suggérant une introduction possible de souches sur le continent africain. Ce nouvel outil de typage basé sur les VNTR sera utile pour l'étude de structures de populations et pour la surveillance épidémiologique de Xoc
Bacterial leaf blight (BLB) and Bacterial leaf streak (BLS), caused respectively by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) and X. oryzae pv. oryzicola (Xoc), are two most important bacterial diseases on rice, constraining severely the rice yield in the rice-growing areas in Asia and in parts of Africa. Successful infection and bacterial multiplication in host tissue often depend on virulence factors from these bacteria including type Ⅲ secretion system (T3SS) and its substrates. In this thesis, we identified nine type Ⅲ secreted non-TAL (Transcription activator-like) effectors of Xoo Chinese strain 13751 using HR-inducing domain of avirulence protein AvrBs1 as the reporter, among them, XopAE13751 was first found experimentally to be non-TAL effector. Subsequently, through mutational analysis of these identified effector genes in Xoo, we showed non-TAL effector XopR13751 was found to be required for full virulence of Xoo Chinese strain in hybrid rice Teyou63. In parallel, we demonstrated that rsmA (repressor of secondary metabolism)-like gene rsmAXoo of Xoo Chinese strain 13751 positively regulated the expression of genes associated with virulence factors such as type Ⅲ secretion system, extracellular enzymes and diffusible signal factor (DSF). Furthermore, non-TAL effector gene xopO was found to be narrowly distributed in Xanthomonas, which was only present in X. euvesicatoria (Xe) and Xoc, but not in Xoo. Based on the consideration of two X. oryzae pathovars carrying two different infection ways, xopO was tested in host and tissue specificity by analysis of mutational analysis of the gene in Xoc and expression of the gene in Xoo. The results showed that xopO of Xoc did not function as a determinant in host and tissue specificity. Finally, we explored Variable Number of Tandem Repeats (VNTRs) as a fast, reliable and cost-effective molecular typing tool, to better monitoring epidemics and assess the population structure of Xoc strains. 28 candidate VNTR loci were predicted by screening of three Xoc genome sequences (Philippine strain BLS256, Chinese strain GX01 and Malian strain MAI10). Primer pairs for PCR amplification of all 28 loci were designed and applied to a panel of 20 Xoc strains originating from Asia and Africa. Sequencing of PCR amplicons revealed 25 robust and polymorphic VNTR loci which are shared among Asian and African strains of Xoc. A dendrogram was constructed from 25 VNTR loci-combinating data (MLVA-25), indicating that most Asian strains were clearly discriminated from African strains. However, in agreement with previous reports, one strain from Mali appeared to be related to Asian strains, pointing to a possible introduction of strains to the African continent. A detailed analysis of the evolutionary relationships among a larger set of Xoc strains from China will be presented, considering different spatial scales. In conclusion, a new VNTR-based tool useful for studies of population structures and epidemiological monitoring of Xoc was successfully established

La bactérie phytopathogène R. Solanacearum est l'agent causal du flétrissement bactérien. Les effecteurs de type III sont des protéines injectées par la bactérie dans le cytoplasme végétal et essentielles au pouvoir pathogène mais certains peuvent être reconnus par les plantes ce qui conduit à la résistance végétale. Nous avons identifié deux effecteurs, AvrA et PopP1 qui limitent le spectre d'hôte de R. Solanacearum GMI1000 sur trois espèces de tabac. Nous avons aussi pu démontrer l'activité enzymatique tréhalose-6-phosphate synthase (TPS) de l'effecteur RipTPS (pour Ralstonia injected protein TPS). Le tréhalose-6-phosphate étant une molécule signal qui régule notamment le métabolisme des sucres chez les plantes, il est possible que RipTPS altère le métabolisme végétal au cours de l'infection
The plant pathogenic bacterium R. Solanacearum is the causal agent of bacterial wilt. The type III effector proteins that are delivered by the bacteria into plant cells manipulate the host cell physiology in a way that favors bacterial multiplication, but recognition of these effectors by the plant immune system can also lead to resistance against the pathogen. We have identified two effectors, AvrA and PopP1, which determine host specificity of strain GMI1000 on three tobacco species. We have also demonstrated that an effector, called RipTPS (Ralstonia injected protein TPS), possesses a trehalose-6-phosphate synthase (TPS) activity. Since trehalose-6-phosphate is a key signal molecule controlling sugar metabolism in plants, it is hypothesized that RipTPS specifically alters the plant cell metabolism during infection

L'activation des mécanismes de défense végétale est un processus énergétiquement coûteux pour la plante qui se doit d'être finement régulé. Dans ce contexte, un contrôle précis de la régulation transcriptionnelle se révèle être essentiel lors de l'attaque par un agent pathogène. AtMYB30, un facteur de transcription de type MYB d'Arabidopsis thaliana, est un régulateur positif de la mort cellulaire hypersensible, forme de résistance mise en place par la plante en réponse à l'attaque par un microorganisme pathogène. Nos résultats montrent que l'activité d'AtMYB30 est soumise à de nombreux phénomènes de régulation qui proviennent d'une part de la cellule végétale, mais aussi de l'environnement extracellulaire, par l'intermédiaire d'un effecteur microbien. En particulier, nous avons montré qu'une phospholipase A2 sécrétée de la plante, AtsPLA2-?, est relocalisée dans le noyau de la cellule végétale dans lequel elle interagit avec AtMYB30. AtsPLA2-? exerce un contrôle spatio-temporel sur l'activité d'AtMYB30, contribuant ainsi à limiter l'étendue de la mort cellulaire. MIP1, une potentielle ubiquitine-ligase végétale, est un régulateur négatif de l'activité d'AtMYB30. MIP1 serait en effet capable d'ubiquitiner AtMYB30 pour le conduire à sa dégradation. Enfin, XopD, un effecteur de type III de la bactérie phytopathogène Xanthomonas campestris, cible directement AtMYB30 pour inhiber son activité. L'originalité de ces résultats réside dans l'identification d'une nouvelle stratégie élaborée par Xanthomonas pour moduler le transcriptome de l'hôte, à travers la répression de l'activité d'un facteur de transcription impliqué dans la défense de la plante. Nos données soulignent donc l'importance du contrôle de l'activité d'AtMYB30 pour la nécessaire atténuation de la mort cellulaire associée à la résistance des plantes, caractéristique qui peut être exploitée par les microorganismes pathogènes. L'identification future d'autres partenaires d'AtMYB30, qu'ils soient végétaux ou microbiens, permettra sans doute de découvrir l'existence de mécanismes additionnels pour la régulation d'AtMYB30. Les données obtenues au cours de ma thèse établissent ainsi une des premières étapes pour l'identification future de mécanismes moléculaires et biochimiques permettant aux plantes de contrôler l'invasion microbienne et les réponses de mort cellulaire afin de conduire à leur résistance
The activation of plant defence mechanisms is a costly process for the plant that needs to be tightly regulated. In this context, a precise control of transcriptional regulation appears to be essential during pathogen attack. AtMYB30, an Arabidopsis thaliana MYB transcription factor, acts as a positive regulator of hypersensitive cell death, a form of resistance set up by the plant in response to pathogens. Our results show that AtMYB30 activity is subject to many regulatory processes coming from both the plant cell and the extracellular environment, through microbial effectors. Particularly, our data showed that a secreted phospholipase A2, AtsPLA2-a, is relocalized to the plant cell nucleus where it interacts with AtMYB30. AtsPLA2-a exerts a spatio-temporal control on AtMYB30 activity, thus limiting the extent of cell death. MIP1, an Arabidopsis putative ubiquitin ligase, is a negative regulator of AtMYB30 activity. MIP1 is thought to ubiquitinate AtMYB30, leading to its degradation. Finally, XopD, a type III effector from the phytopathogenic bacterium Xanthomonas campestris, directly targets AtMYB30 to inhibit its activity. These results illustrate an original strategy developed by Xanthomonas to modulate the host transcriptome through direct suppression of the activity of a transcription factor essential for plant defence. Together, our data highlight the fine tuning of AtMYB30 activity for a necessary attenuation of plant cell death responses associated with resistance, a feature that may be exploited by pathogenic microorganisms. The future characterization of other AtMYB30 partners, both plant and microbial, should uncover additional mechanisms for AtMYB30 regulation. The results obtained during my PhD provide a first step for the future identification of molecular and biochemical mechanisms enabling plants to control microbial invasion and cell death responses leading to resistance

La bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum possède, parmi son répertoire d'effecteurs de type III, une famille de sept protéines nommées GALA. Les GALA sont collectivement requises pour le pouvoir pathogène de R. Solanacearum sur différentes plantes hôtes. De plus, les GALA sont homologues à des protéines à domaine F-box, impliquées dans le système ubiquitine-protéasome des eucaryotes. Les GALA pourraient donc permettre à la bactérie de manipuler la stabilité de certaines protéines végétales lors de l'infection. Au cours de ce travail, nous avons montré que les membres de la famille GALA ont subi une divergence fonctionnelle au cours de l'évolution. En intégrant des analyses bioinformatiques avec des données expérimentales, nous avons montré que les GALA possédaient des spécificités fonctionnelles, notamment dans leur contribution au pouvoir pathogène sur différents hôtes. Cette divergence fonctionnelle a sans doute permis la conservation de cette famille d'effecteurs dans les différentes souches de R. Solanacearum. Nous avons ensuite analysé la fonction de virulence de GALA7 qui est un facteur de spécificité d'hôte sur Medicago truncatula. Une analyse structure-fonction a été initiée dans le but d'identifier les acides aminés nécessaires à la fonction de cet effecteur au cours de l'infection. En parallèle, l'étude de plantes transgéniques exprimant GALA7 indique que cet effecteur semble posséder une activité E3-ubiquitine ligase dans les cellules végétales. Enfin, des interacteurs potentiels des GALA ont été identifiés lors d'un crible double-hybride chez la levure. Notre travail fournit ainsi de nouvelles perspectives sur les forces sélectives agissant au cours de l'évolution des effecteurs de type III et contribue à une meilleure compréhension de la fonction des GALA lors de l'infection
The plant pathogenic bacterium Ralstonia solanacearum possesses a large repertoire of type III effectors, among which a family of seven proteins called GALAs. GALAs are collectively required for the virulence of R. Solanacearum on different host plants. Interestingly, GALAs are homologous to plant F-box proteins which are involved in the eukaryotic ubiquitine-proteasome system. Thus GALAs could enable R. Solanacearum to manipulate the stability of some plant proteins during infection. Through this work, we demonstrated that the GALA family members underwent functional divergence during evolution. Integrating bioinformatics studies along with experimental data, we showed that GALA proteins display functional specificities and show differential requirement for pathogenicity on different hosts. This functional divergence likely contributed to the remarkable conservation of the GALA family among R. Solanacearum strains. We then analyzed more specifically the virulence function of GALA7 which had been shown to be a host specificity factor on Medicago truncatula. A structure-function analysis was initiated in order to identify the amino-acids which are required for GALA7 function during infection. Using transgenic plants expressing GALA7, we showed that this effector is probably an active E3-ubiquitine ligase enzyme within plant cells. Finally, using a yeast two-hybrid screen, we identified several putative GALA interactors. Our work thus provides new insights into the selective forces driving the evolution of type III effectors and contributes to a better understanding of GALA functions during infection

Ralstonia solanacearum, une béta-proteobactérie d'origine tellurique, est l'une des phytobactérioses les plus nuisibles au niveau mondial. Cette bactérie est capable d'infecter plus de 250 espèces différentes dont certaines présentent un intérêt économique majeur (tomate, pomme de terre, tabac). R. solanacearum est divisée en 4 phylotypes distincts présentant des origines géographiques différentes : I (asiatique), IIA et IIB (américain), III (africain), IV (indonésien). Parmi ces phylotypes, le phylotype I est en expansion démographique, hautement recombinogène, réparti mondialement et possède une large gamme d'hôtes. Il possède donc un fort potentiel évolutif (sensu McDonald et Linde, 2002). Afin de contrôler cette bactérie, la lutte génétique reste la méthode la plus prometteuse : elle consiste à déployer des cultivars possédant différents sources de résistance (i.e., des gènes de résistance). La variété d'aubergine AG91-25 (E6) possède un gène majeur de résistance (ERs1) lui permettant de contrôler certaines souches de R. solanacearum de phylotype I. Cependant, la gestion de cette résistance requiert d'étudier au préalable sa durabilité afin d'en éviter le contournement. Cette durabilité peut être estimée en étudiant le potentiel évolutif d'un agent pathogène face à cette source de résistance, ainsi qu'en décryptant les mécanismes moléculaires de l'interaction entre l'hôte (gène R) et le pathogène (effecteur de types trois). Afin d'étudier la dynamique évolutive de R. solanacearum sous une pression de sélection exercée par la variété résistante E6, nous avons mis en place un essai d'évolution expérimentale au champ. Cet essai est composé de trois couples de microparcelles d'aubergines résistantes E6 et d'aubergines sensibles E8, implantées deux fois par an, pendant trois ans (soit 5 cycles). Un schéma MLVA (« Multi-Locus VNTR Analysis ») composé de 8 loci minisatellites a été développé afin de caractériser les souches extraites de ces cycles de cultures. Ces VNTR sont spécifiques aux souches de R. solanacearum de phylotype I, hautement polymorphes et discriminants à toutes les échelles : mondiale, régionale et locale. Nos résultats démontrent une absence de contournement de la résistance d'E6 par les populations parcellaires de R. solanacearum, confirmant le caractère durable de cette résistance. Cette variété aurait fortement réduit les populations bactériennes du sol, ne leur permettant plus d'infecter l'hôte résistant. Parallèlement, 100% des plants d'E8 sont morts à partir du cycle 2. La maladie au sein des microparcelles semble progresser selon une dynamique de « plante-à-plante ». Une baisse de la diversité génétique a aussi été observée au cours des cycles de culture répétés d'E8, associée à l'augmentation en fréquence de deux haplotypes. Cependant, aucune structuration génétique claire n'a été observée à l'échelle de la parcelle entière ou de la microparcelle. En revanche, les données d'isolement par la distance semblent indiquer qu'une structure spatiale semble être en cours d'établissement. L'ensemble de nos résultats suggère une structure épidémique clonale de nos populations parcellaires. Nous nous sommes aussi intéressés à l'implication de 10 ET3 dans l'interaction R. solanacearum vs aubergine résistante (E6). La distribution des 10 ET3 candidats est variable au sein d'une collection de souches phylogénétiquement diverses (91 souches) : ripAJ et ripE1 sont les ET3 les plus partagés alors que ripP1 et ripP2 sont les moins fréquemment. Certains ET3 présentent peu (ripAJ) voire pas (ripE1 et ripP2) de polymorphisme de taille, alors que d'autres (ripAU) sont extrêmement polymorphes. Cependant la composition en effecteurs d'une souche ne semble pas être corrélée à un phénotype sur aubergine E6. Nous avons identifié le gène d'effecteur ripAX2 comme ayant une fonction d'avirulence sur aubergine résistante E6. Sa reconnaissance par E6 semble s'opérer au niveau de la zone hypocotylaire
Ralstonia Solanacearum is a soilborn beta-proteobacterium responsible of bacterial wilt on Solanaceaous crops. This bacterium is considered as one of the most harmful plant disease worldwide. This bacterium possesses the ability to infect more than 250 different species, including crops with major economic importance (tomato, potato, tobacco, eucalyptus…). R. solanacearum is divided into four phylotypes originated from different areas: I (Asian), IIA and IIB (American), III (African), IV (Indonesian). Among these phylotype, phylotype I is currently in demographic expansion, is highly recombinogenic and has a wide hosts range. Thus, altogether, these characteristics demonstrated that this phylotype has a high evolutionary potential (sensu McDonald and Linde, 2002). In order to control this bacterium, genetic plant resistance seems to be the most promising method. This method consists in using cultivars with different source of resistance such as resistance genes and/or resistant QTLs. The AG91-25 (E6), an eggplant cultivar possessing a major resistance gene (ERs1), is capable to control some of phylotype I strains of R. solanacearum. However, in order to optimize the management of this resistance and to avoid its fast breakdown, we need to deeply investigate the durability of this resistant gene. Durability can be estimated by studying the evolutionary potential of our pathogen faced to E6 source of resistance and by understanding the molecular mechanisms underlying the interaction between the host (R gene) and its pathogene (Type III Effector – T3E). In order to study R. solanacearum evolutionary dynamics under selective pressure from E6 resistant cultivar, we set up an experimental evolution trial in the field. This trial consisted of three couples of resistant (E6) and susceptible eggplants (E8) microplots, implanted twice a year during three years, hence consisting of 5 cycles. A Multi-Locus VNTR Analysis (MLVA) scheme, consisting of 8 minisatellite loci, was developed in order to characterize the strains extracted from these crop cycles. These VNTRs were specific to R. solanacearum phylotype I strains, they were highly polymorphic and discriminatory at different scale: globally, regionally and locally.Our results showed no breakdown of E6 resistance by R. solanacearum populations, which confirms that this resistance is durable. It seemed that this cultivar reduced the soil bacterial population, preventing bacterial population to infest the resistant host. At the same time, 100% of the E8 plants have died, starting at cycle 2. Bacterial wilt seemed to spread with a “plant-to-plant” dynamics within each microplot. Genetic diversity reduction was also observed during the successive cycle of susceptible eggplant, associated with the increase of frequency of two main haplotypes. However, we failed to identify a clear genetic structuration, neither at the plot scale nor at the microplot scale. Nevertheless, isolation-by-distance data seemed to show that a spatial structure is currently establishing. Altogether, our results suggested that our plot populations appeared to have a clonal epidemic structure.We also looked into 10 T3Es' involvement in the interaction between R. solanacearum and the resistant eggplant (E6). Their distribution was completely different within a collection of phylogenetically diverse strains (91 strains): ripAJ and ripE1 are the most shared T3Es whereas ripP1 and ripP2 were the less common T3E whithin our collection of strains. Some T3Es showed few (ripAJ) or no length polymorphism at all (ripE1 and ripP2) whereas some other (ripAU) are extremely polymorphic. Nevertheless, the T3E effector repertoire did not seemed to be correlated to a specific phenotype on E6 eggplant. Its recognition by E6 seemed to occur in the hypocotyle region rather than in the mesophyll, highlighting a possible organ-specificity of the interaction between ERs1 and ripAX2

L'objectif de cette recherche est la construction manuelle de ressources lexicales pour les noms composés grecs qui sont définis par la structure morphosyntaxique : Nom (E+Déterminant au génitif) Nom au génitif, notés N (E+DET:G) N:G (e.g. ζώνη ασφαλείας/ceinture de sécurité). Les ressources élaborées peuvent être utilisées pour leur reconnaissance lexicale automatique dans les textes écrits et dans d'autres applications du TAL. Notre travail s'inscrit dans la perspective de l'élaboration du lexique-grammaire général du grec moderne en vue de l'analyse automatique des textes écrits. Le cadre théorique et méthodologique de cette étude est celui du lexique-grammaire (M. Gross 1975, 1977), qui s'appuie sur la grammaire transformationnelle harisienne.Notre travail s'organise en cinq parties. Dans la première partie, nous délimitons l'objet de notre travail tout en essayant de définir la notion fondamentale qui régit notre étude, à savoir celle de figement. Dans la deuxième partie, nous présentons la méthodologie utilisée pour le recensement de nos données lexicales et nous étudions les phénomènes de variation observés au sein des noms composés de type N (E+DET:G) N:G. La troisième partie est consacrée à la présentation des différentes sous-catégories des N (E+DET:G) N:G identifiées lors de l'étape du recensement et à l'étude de leur structure lexicale interne. La quatrième partie porte sur l'étude syntaxico-sémantique des N (E+DET:G) N:G. Enfin, dans la cinquième partie, nous présentons les différentes méthodes de représentation formalisée que nous proposons pour nos données lexicales en vue de leur reconnaissance lexicale automatique dans les textes écrits. Des échantillons représentatifs des ressources élaborées sont présentés en Annexe

Le domaine TIR (Toll/interleukin (IL)-1 receptor) est une composante essentielle du système immunitaire inné, celui-ci est présent dans les récepteurs TLR (Toll-like receptor) et les protéines adaptatrices associées comme MyD88 et TIRAP. La détection de pathogènes déclenche l'interaction entre les domaines TIR permettant ainsi l'initiation et la propagation de la signalisation par les TLRs. Aussi, de nombreux pathogènes produisent des effecteurs contenant un domaine TIR tels que BtpA et BtpB chez Brucella abortus, TirS chez Staphylococcus aureus ou TcpC chez l'uropathogènique Escherichia coli. Tous ces effecteurs bloquent la signalisation des TLRs et sont capables de perturber les voies de signalisation de l'immunité innée pendant l'infection. Cependant les mécanismes moléculaires impliqués restent la plupart du temps non caractérisés et dans certains cas controversés. Dans le but de mieux comprendre le fonctionnement de ce type d'effecteurs bactériens, j'ai caractérisé chez Pseudomonas aeruginosa PA7 un nouvel effecteur contenant un domaine TIR que nous avons renommé PumA pour Pseudomonas UBAP1 Modulator A. En parallele, j'ai aussi participé à des projets de caractérisation de deux autres effecteurs avec un TIR domain : BtpB et TirS. Ainsi, PumA est un facteur essentiel pour la virulence de P. aeruginosa PA7 et son domaine TIR est essentiel pour interaction avec deux protéines adaptatrice, TIRAP et MyD88. Durant l'infection de cellules épithéliales pulmonaires par P. aeruginosa PA7, PumA est responsable du contrôle de la translocation du facteur de transcription NF-κB dans le noyau. De plus, la production de PumA dans une souche de P. aeruginosa non-TIR confère à cette bactérie de nouvelles propriétés d'immuno-modulation. PumA cible aussi UBAP1, une protéine du complexe de tri endosomal requis pour le transport, ESCRT-I (endosomal sorting complex require for transport I) qui a été récemment montré pour moduler l'activation de récepteur de cytokine. Nos résultats montrent que UBAP1 peut s'associer avec TIRAP et MyD88, provoquant le mouvement de MyD88 à la membrane cytoplasmique, suggérant une nouvelle voie cellulaire commune entre UBAP1 et les TLRs, et révélant UBAP1 comme nouvelle cible pour des effecteurs bactériens dans le cadre du contrôle des réponses immunitaires de l'hôte
In higher eukaryotes, the innate immune system provides the first line of defense against invading pathogens. The Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain is an essential component of the innate immune system. This domain is present in Toll-like receptors (TLRs) and associated adaptor proteins such as MyD88 and TIRAP. Pathogen detection requires interaction between the TIR domains, which initiates and triggers propagation of TLR signaling. However, many pathogens produce a TIR domain-containing protein such as BtpA and BtpB in Brucella abortus, TirS in Staphylococcus aureus or TcpC in the uropathogenic strain Escherichia coli. These effectors block TLR signaling and are able to disrupt innate immune response during infection. However, the molecular mechanisms involved remain mostly uncharacterized and in some cases controversial. The objective of this thesis was to study bacterial effectors containing a TIR domain particularly at the molecular level. For this, we focused on Pseudomonas aeruginosa PA7, an atypical multi-drug resistant strain that contains an effector with a TIR domain that we named PumA, for Pseudomonas UBAP1 Modulator A. In addition, during these four years of thesis work I also participated in the characterization of two other effectors with a TIR domain: BtpB in B. abortus and TirS in S. aureus.We found that PumA is essential for virulence of P. aeruginosa PA7 and its TIR domain is the key element for interaction with two adaptor proteins MyD88 and TIRAP. During infection of lung epithelial cells by P. aeruginosa PA7, PumA is responsible for controlling the translocation of NF-?B into the nucleus indicative of activation of this transcription factor. In addition, production of PumA by a TIR-deficient strain of P. aeruginosa confers to this bacterium a new immuno-modulation property. Furthermore, PumA targets ubiquitin-associated protein 1 (UBAP1), a protein of the endosomal sorting complex required for transport I (ESCRT-I) which has recently been shown to modulate cytokine receptor activation. Our results also show that UBAP1 can associated with TIRAP and MyD88, causing movement of MyD88 to the cytoplasmic membrane and suggesting a new cellular pathway between UBAP1 and TLRs. In summary, our data reveal UBAP1 as a novel target for bacterial effectors implicated in control of host immune responses

La bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum est l'agent causal du flétrissement bactérien des solanées. Les gènes hrp codent pour un appareil de sécrétion de protéines, dit de type III, qui permet l'injection d'effecteurs du pouvoir pathogène à l'intérieur des cellules végétales hôtes. Le gène régulateur hrpB contrôle l'expression des composants de la machinerie Hrp et des substrats qui l'empruntent. La caractérisation du mécanisme d'action de HrpB a permis de définir un motif cis-opérateur conservé, la boite hrpII, indispensable à l'activité des promoteurs du régulon. Une liste de 114 gènes candidats a été constituée suite à la recherche de ce motif sur la séquence du génome de R. Solanacearum GMI1000. Dans un deuxième temps, l'analyse fonctionnelle des candidats identifiés par les approches in silico a été entreprise : 48 de ces gènes font partie du régulon hrpB. Neuf brg (gènes hrpB-régulés) sont homologues à des effecteurs de type III précédemment décrits chez d'autres bactéries phytopathogènes. Les 31 brg restants codent pour des protéines originales qui arborent un signal d'injection potentiel. La translocation hrp-dépendante de cinq protéines candidates dans des cellules végétales a été confirmée. L'étude du pouvoir pathogène des mutants d'insertion générés vis-à-vis de deux espèces hôtes indique que l'interaction n'est modifiée que pour un petit nombre d'entre eux. Finalement, nous avons caractérisé le gène avrA, qui conditionne l'aptitude de la bactérie à déclencher une réponse hypersensible sur différentes espèces de Nicotiana. L'ensemble de ces travaux suggère que le génome de R. Solanacearum héberge un répertoire d'effecteurs de type III considérable (50 à 70). La compréhension de leur contribution respective au pouvoir pathogène de R. Solanaceraum nécessitera l'élucidation de leur activité moléculaire sur le métabolisme de la cellule végétale
Ralstonia solanacearum is the causal agent of bacterial wilt disease. Hrp genes encode a type III protein secretion apparatus that allows virulence effectors injection into the host plant cell. The regulatory gene hrpB controls expression of the structural components of the secretion machinery as well as its substrates. Characterization of the mode of action of HrpB allowed the definition of the hrpII box, a conserved cis-operator motif required for activity of the promoters belonging to this regulon. A search for this motif on R. Solanacearum GMI1000 genome sequence produced a list of 114 candidate genes. The next step involved the functional analysis of a group of these candidate genes : 48 of them were shown to belong to the hrpB regulon. Nine brg (hrpB-regulated genes) are homologous to known type III effectors from other plant pathogenic bacteria. The remaining 31 brg encode unknown or hypothetical proteins harbouring a putative type III-translocation signal. Hrp-dependent translocation into plant cells was confirmed for five candidate proteins. Only a few of the insertion mutants generated displayed an altered virulence when tested onto two host species. Finally, we identified and characterized the avrA gene which is necessary for elicitation of the hypersensitive response on some Nicotiana species. Altogether, these data suggest that R. Solanacearum genome contains a large type III effector repertory (50 to 70). Understanding their relative contribution to R. Solanacearum pathogenicity will await future elucidation of their molecular activity on the plant cell metabolism

L'agent causal du flétrissement bactérien, Ralstonia solanacearum est l'une des bactéries pathogènes qui cause le plus de ravages sur les cultures d'intérêt économique. Le gène de Résistance à Ralstonia solanacearum (RRS1-R) isolé à partir de l'écotype résistant Nd-1 d'A. Thaliana, code une protéine à structure modulaire atypique. Elle combine en effet, un domaine TIR-NBS-LRR, commun à de nombreuses protéines de résistance, et un domaine d'activation transcriptionnelle WRKY, caractéristique d'une famille de facteurs de transcription végétaux. PopP2, le gène d'avirulence correspondant à RRS1-R, code une protéine appartenant à la famille d'effecteurs YopJ/AvrRxv. Les deux partenaires R/Avr interagissent physiquement dans le noyau de la cellule végétale. Cependant, cette interaction physique n'exclue pas l'intervention d'autres composantes végétales impliquées dans l'activation de la résistance. Selon le modèle de garde, les protéines d'avirulence sont des facteurs de virulence capables de modifier des protéines végétales cibles dans le but de détourner la physiologie de la plante en faveur de la bactérie. Les protéines de résistance joueraient alors un rôle de gardien en détectant les modifications des protéines ciblées, et activer les mécanismes de résistance en aval. Dans ce contexte, la recherche d'interacteurs de PopP2 a été entreprise par le criblage double hybride d'une banque d'ADNc d'A. Thaliana. Parmi plusieurs candidats, nous avons identifié et caractérisé RD19, une protéase à cystéine de la famille de la papaïne. Par une approche de génétique inverse, nous avons montré que cette protéase à cystéine est impliquée dans l'établissement de la résistance d'A. Thaliana à R. Solanacearum. Exprimée transitoirement chez N. Benthamiana, RD19 fusionnée à la protéine fluorescente YFP (Yellow Fluorescent Protein) est détectée dans des petits compartiments mobiles adressés à la vacuole. De manière surprenante, lorsque RD19 est coexprimée avec PopP2, elle est également détectée au niveau du noyau. .
Bacterial wilt caused by the phytopathogenic bacterium Ralstonia solanacearum is one of the most important plant diseases worldwide. The RRS1-R gene (Résistance to Ralstonia solanacearum) confers broad spectrum resistance to several strains of this pathogen. It encodes an atypical resistance protein which combines the TIR-NBS-LRR domains found in several R proteins and a WRKY motif characteristic of some plant transcriptional factors. PopP2, a Ralstonia solanacearum type III effector which belongs to the YopJ/AvrRxv protein family, is the avirulence protein recognized by RRS1-R. Both partners can physically interact in the plant nucleus. Nevertheless, this physical interaction doesn't exclude the role of other plant components in the activation of resistance. According to the "guard model", avirulence proteins are virulence factors which manipulate plant proteins to favour microbial development. Resistance proteins would then act as guards of modified plant targets and activate resistance. In this context, search for PopP2 interactors has been initiated by a Yeast-2-Hybrid screening of an Arabidopsis cDNA library. Among several candidates, we identified and characterized RD19, a papain-like Cysteine protease. Using a reverse genetic approach, we showed that RD19 is involved in the establishment of resistance of A. Thaliana to R. Solanacearum. Transient expression in N. Benthamiana showed that, when fused to the fluorescent protein YFP (Yellow Fluorescent Protein), RD19 is detected in small mobile compartments targeted to the vacuole. Interestingly, when coexpressed with PopP2, RD19 is also detected in plant nuclei. .

La bactérie phytopathogène E. amylovora, est l'agent responsable du Feu bactérien des Spiraeoideae (pommier, poirier, pyracantha), une maladie caractérisée par l'apparition de symptômes nécrotiques des tissus infectés. Le pouvoir pathogène d’E. amylovora repose entre autre sur un système de sécrétion de type III (SSTT) qui permet la sécrétion et l'injection d'effecteurs dans la cellule hôte végétale. Parmi les protéines injectées par le T3SS d'E. amylovora, DspA est essentielle au pouvoir pathogène de la bactérie puisqu’un mutant dspA est non pathogène sur plante (Gaudriault et al., 1997). Le rôle de DspA est dual, d’une part, l’expression de dspA est suffisante pour provoquer des symptômes nécrotiques sur plante et une toxicité chez la levure, d’autre part, DspA est impliquée dans la suppression des réactions de défense telles que la déposition de callose (Degrave et al., 2008; Boureau et al., 2006; Oh et al., 2007; DebRoy et al., 2004). DspA appartient à la famille des effecteurs AvrE qui sont répandus chez les bactéries phytopathogènes et semblent posséder une fonction similaire. Cependant, peu de connaissance existe sur la structure ainsi que la fonction de DspA. L'objectif de ce travail de thèse était de déterminer les domaines ou motifs importants pour la fonction de DspA. Pour cela nous avons choisi d'effectuer une analyse in silico et fonctionnelle de la protéine DspA. L'analyse in silico révèle la présence d'un domaine bêta-propeller au sein de la protéine DspA ainsi que de tous les homologues analysés. De plus, l'analyse fonctionnelle indique que ce domaine est important pour la structure et la fonction de DspA. Dans un second temps, j'ai étudié le mécanisme d'action de DspA dans la levure Saccharomyces cerevisiae. J'ai pu mettre en évidence que l'expression de dspA chez la levure induit un arrêt de croissance et une forte altération du trafic cellulaire. L'étude de mutants de levure suppresseurs de la toxicité de DspA, effectuée avant mon arrivée au laboratoire, montre que les suppresseurs les plus forts sont affectés dans la voie de biosynthèse des sphingolipides, je me suis donc plus particulièrement intéressée au rôle des sphingolipides dans la toxicité générée par DspA. Nos résultats montrent que DspA inhibe la biosynthèse des sphingolipides indirectement via les régulateurs négatifs de la voie, les protéines Orms
Erwinia amylovora is the causative agent of fire blight of Spiraeoideae (apple, pear, pyracantha), a disease characterized by the apparition of necrotic symptoms on infected tissues. The pathogenicity of E. amylovora relies on a functional type III secretion system (T3SS) that allows secretion and injection of effector proteins into the host plant cell. Among these effector proteins injected by the T3SS of E. amylovora, DspA is essential to the bacteria disease process since a dspA mutant is nonpathogenic on plants (Gaudriault et al., 1997). DspA has a dual role; on the one hand dspA expression is sufficient to induce cell death on plants and toxicity on yeast, on the other hand, DspA is involved on suppression of defense reactions like callose deposition (Degrave et al., 2008; Boureau et al., 2006; Oh et al., 2007; DebRoy et al., 2004). DspA belongs to the AvrE familly of type III effectors which are widespread on phytopathogenic bacteria and likely possess a similar function. However, the structure and function of DspA remain unknown. In the first part of my thesis, I attempted to characterize domains or motifs important for the function of DspA. We performed an in silico and a functional analysis of the DspA protein. In silico analysis predicted a bêta-propeller domain in DspA and all the analysed effectors. In the second part of my thesis, I analysed the mechanism of function of DspA in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Results showed that expression of dspA in yeast inhibits cell growth and alters the actin cytoskeleton and endocytosis. Screening of the Euroscarf library for mutants resistant to DspA induced toxicity revealed that mutants impaired in the sphingolipid biosynthetic pathway are the best suppressors. Based on this results, I attempted to determine the role of sphingolipids in the toxicity induced by DspA. Results showed that DspA inhibits indirectly the sphingolipid biosynthetic pathway via the negative regulators, Orm proteins