Дисертації з теми "Dosages chromatographiques"

Les proteines de reserve du ble ou prolamines (gliadines et glutenines) contribuent a la rheologie de la pate lorsque la farine est hydratee et petrie. L'objectif de ce travail est la mise au point de tests immunochimiques pour quantifier les differentes prolamines afin de predire les proprietes technologiques d'une farine. Des teneurs en prolamines ont ete etablies sur 45 echantillons (de differentes varietes de farine utilisees en biscuiterie et en panification) apres une extraction sequentielle par deux protocoles de dosage : azote et rp-hplc. Une methode d'extraction quasi-exhaustive des glutenines a permis de determiner les teneurs en sous-unites de faible poids moleculaire (sg-fpm) et de haut poids moleculaire (sg-hpm) par un dosage chromatographique (rp-hplc). Les teneurs obtenues par les protocoles azote et rp-hplc sont etroitement correlees (r#g#l#i#a#d#i#n#e#s = 0,93 ; r#g#l#u#t#e#n#i#n#e#s = 0,84, p<0,1%). Les teneurs en -gliadines et en gliadines totales sont fortement correlees (r = 0,97, p<0,1%). Nous avons utilise des anticorps polyclonaux diriges contre un peptide correspondant a la sequence c terminale la plus couramment trouvee dans les -gliadines pour doser les gliadines totales. Sur 22 varietes de farines testees, 16 varietes ont des teneurs en gliadines determinees par elisa competitif tres proches de celles obtenues par les dosages biochimiques azote et rp-hplc (moins de 16% de difference). Une reconnaissance incomplete des -gliadines par le serum utilise pourrait expliquer les ecarts entre le dosage elisa et les dosages biochimiques pour les 6 autres varietes. Pour le dosage des glutenines, l'utilisation d'agents reducteurs (2-mercaptoethanol) et dissociants (sds) perbute le dosage par elisa competitif. La solubilisation des glutenines a ete testee en utilisant des proteases. Les resultats indiquent que les proteases generent des peptides reconnus par les anticorps avant que la partie n-terminale des peptides ne soit hydrolysee.

Methode de concentration des pesticides organochlores dans les eaux par colonne pulsee a extraction liquide-liquide. L'utilisation de cette technique couplee avec la chromatographie en phase gazeuse permet d'ameliorer de facon significative les seuils de detection de ces polluants dans les eaux par rapport aux methodes traditionnelles. Description de l'optimisation du fonctionnement de cette colonne pour differents micropolluants de nature synthetique. Etude et suivi du fonctionnement d'un epurateur au charbon actif dans une station de traitement de l'eau

Le protocole propose pour doser la vitamine b#3 -extraction des differentes formes vitaminiques (nad, nadp, nicotinamide et acide nicotinique) en milieu chlorhydrique, transformation precolonne (en milieu alcalin) de ces formes en acide nicotinique, isolement sur phase stationnaire c18 de ce compose chimique et derivation postcolonne en compose fluorescent par irradiation uv en presence d'eau oxygenee- a presente une repetabilite, un taux de recouvrement et une specificite tres satisfaisantes ainsi qu'une excellente limite de detection (0,02 mg/100g d'aliment). La reaction de derivation postcolonne utilisee pour le dosage de la vitamine b#8 - formation d'un complexe fluorescent entre la vitamine b#8 (d-biotine et d-biocytine) et l'avidine-fitc (isothiocyanate de fluoresceine) apres hydrolyse enzymatique et separation des deux formes actives sur phase stationnaire c18- a ete tres specifique et a permis d'atteindre des teneurs aussi faibles que 0,5g/100g d'aliment, avec une repetabilite et un taux de recouvrement satisfaisants. Pour le dosage de la vitamine b#5, la detection de l'acide d-pantothenique par absorption uv, apres isolement sur phase stationnaire c18 a presente une sensibilite et une specificite insuffisantes. Le dosage des produits d'hydrolyse (acide) de l'acide d-pantothenique -d-pantoyl lactone (par cpg/fid) et -alanine (par clhp/fluorimetrie)- ne s'est pas non plus avere satisfaisant. La proposition originale faite pour resoudre le probleme pose par la multiplicite des formes sous lesquelles se trouve la vitamine b#9 (folates) -transformer, avant separation chromatographique, l'ensemble des folates en 5-ch#3-thf (compose stable possedant un rendement quantique de fluorescence eleve) par un enchainement de reactions simples, rapides et quantitatives (reductions par nabh#4, formylation et acidification)- a ete couronnee de succes et devrait permettre la mise au point prochaine d'une methode de dosage.

Rheum ribes L. (la rhubarbe) est l'une des plantes médicinales méditerranéennes les plus importantes. La préparation des décoctions aqueuses des rhizomes de cette plante est devenue une pratique courante chez les patients souffrant de diverses maladies. La Détente Instantanée Contrôlée (DIC) est un traitement à haute température et à courte durée (HTST high-temperature/short-time) suivi d'une chute brutale de pression vers le vide (Pression absolue de 5 kPa environ). Le traitement DIC induit l’expansion et réduit la tortuosité de la matrice traitée, et assure ainsi une meilleure diffusivité des solvants d’extraction et par la suite une plus grande disponibilité des molécules actives. D’une part, nos travaux de recherche ont visé l’identification de l’impact du traitement par DIC des rhizomes d’une espèce libanaise de R. ribes L. Les évaluations ont été basées sur les teneurs en polyphénols totaux (TPC) et en flavonoïdes (TFC) ainsi que sur les pouvoirs antioxydants des extraits aqueux de rhizomes traités. Les résultats ont montré qu’une corrélation négative existe entre la pression de vapeur saturée appliquée et les valeurs de TPC, TFC et les activités antioxydantes des échantillons traités. Cependant, il n'y avait pas d'influence significative du temps de traitement par DIC sur les variables réponses. A ces deux facteurs opératoires de la DIC, pression et temps de traitement, s’ajoute la teneur en eau (W) des rhizomes. Les résultats ont montré qu’une augmentation ne provoque pas des meilleurs rendements en composés phénoliques. D’autre part, ce travail inclut également l’étude de l’impact du traitement par DIC sur les activités biologiques (effets antibactériens et antiprolifératifs) des extraits de rhizomes. Les résultats ont mis en évidence que les extraits aqueux de rhizomes traités par DIC présentent, aux concentrations testées, de très faibles pouvoirs antibactériens sur E. coli et S. aureus, avec des résultats légèrement supérieurs au niveau de l’inhibition de la croissance de S. aureus. En ce qui concerne le test de viabilité des cellules cancéreuses du mélanome, les résultats ont montré que le traitement par DIC a un impact positif sur le pouvoir antiprolifératif des échantillons traités en comparaison avec une matrice non-traitée par DIC et extraite par voie aqueuse. En particulier, deux échantillons parmi ceux testés, ont enregistré un pouvoir antiprolifératif de 60%. Les dosages par HPLC et UHPLC ont révélé la présence de trois anthraquinones (l’émodine, le chrysophanol et le physcion) dans les extraits de rhizomes ainsi qu’une vingtaine de composés de la famille des flavonoïdes. Cependant, les quantités d’anthraquinones détectés ne sont pas significativement plus élevées dans les extraits traités par DIC que dans ceux non-traités. Finalement, il a été constaté que la teneur phénolique totale d'un échantillon aqueux traité avec les paramètres optimaux de la DIC est égale à celle d'un point hydroalcoolique non traité. Des expérimentations supplémentaires seront nécessaires pour la validation de ce résultat
Rheum ribes L. (rhubarb) is one of the most important Mediterranean medicinal plants. Preparing its rhizomes’ aqueous decoctions has become common among patients suffering from various diseases. Instant Controlled Pressure Drop (DIC) is a High-Temperature Short-Time treatment (HTST) followed by an abrupt pressure drop towards the vacuum (approximately 5 kPa). This technology increases the expansion and reduces the tortuosity of the treated matrix to ensure better diffusivity of the extraction solvents and greater availability of the active molecules. On the one hand, our research aimed at the impact of DIC treatment on the rhizomes of a Lebanese species of R. ribes L. The evaluations were based on the contents of total phenolics (TPC) and flavonoids (TFC) as well as the antioxidant capacities of aqueous extracts of the treated rhizomes. The results showed a negative correlation between the saturated steam pressure applied and the values of TPC, TFC, and the antioxidant activities of the samples. However, DIC treatment time had no significant influence on the response variables. In addition to these two DIC operating factors (pressure and treatment time), the effect of the rhizomes water content (W) was also studied. The results showed that the increase of “W” does not lead to better yields of phenolic compounds. On the other hand, this study presents the impact of DIC treatment on the biological activities (antibacterial and antiproliferative effects) of rhizome extracts. The results revealed that the aqueous extracts of DIC-treated rhizomes show weak antibacterial powers on E. coli and S. aureus, with slightly superior results in inhibiting the growth of S. aureus. Regarding the viability test of melanoma cancer cells, the results showed that the DIC treatment positively impacts the antiproliferative power of the treated samples compared with the untreated point (aqueous MP). In particular, two samples among those tested recorded an antiproliferative power of 60%. The HPLC and UHPLC assays revealed the presence of three anthraquinones (emodin, chrysophanol, and physcion) in the rhizome extracts and about twenty compounds from the flavonoid family. However, the amounts of anthraquinones detected are not significantly higher in the extracts treated with DIC than in the untreated ones. Finally, it was found that the total phenolic content of an aqueous sample treated with the optimal DIC parameters is equal to that of an untreated hydroalcoholic sample. Further experiments will be necessary to validate this result

La méthode mise au point pour le dosage de l'acide pantothénique libre consiste en une purification des échantillons par passages successifs sur des cartouches échangeuses d'anions et de cations, puis en un isolement chromatographique en phase inverse suivi d'une dérivation post-colonne de l'acide pantothénique en isoindole fluorescent (réaction de la -alanine, obtenue par hydrolyse alcaline à chaud de l'acide pantothénique, avec l'ortho-phthaldialdéhyde en présence d'acide mercaptopropionique). Une hydrolyse enzymatique (pepsine, puis pantéthéinase et phosphatase alcaline), effectuée avant l'étape de purification, permet de libérer l'acide pantothénique lié et ainsi d'obtenir la teneur en vitamine B5 totale dans les aliments. En ce qui concerne la vitamine B12 libre, le protocole proposé comporte une purification très spécifique par passage sur colonne d'immunoaffinité, avec concentration de l'échantillon, puis une transformation de la vitamine en ribazole (hydrolyse alcaline à chaud, puis traitement par une phosphatase alcaline). Le ribazole obtenu est par la suite dosé par fluorimétrie après un isolement chromatographique en phase inverse. Un traitement par la pepsine permet de libérer les différentes formes de la vitamine B12 liées à des protéines et ainsi de pouvoir estimer la teneur en vitamine B12 totale dans les aliments. Ces méthodes, sensibles et répétables, donnent de bons taux de recouvrement. Etant données leur faible limite de détection (0,65 µg. G-1 pour la vitamine B5 et 1 ng. G-1 pour la vitamine B12) et la bonne résolution des pics chromatographiques (respectivement d'acide pantothénique et de ribazole), elles devraient pouvoir très vraisemblablement être utilisées pour la détermination de ces vitamines dans n'importe quel échantillon alimentaire
The developped method for the free pantothenic acid consists of a purification of the samples by successive passages through anion and cation exchange cartridges, then an isolation by reversed-phase chromatography followed by a post-column derivatization of pantothenic acid as a fluorescent isoindole (reaction of -alanin, formed by hot alkaline hydrolysis of pantothenic acid, with ortho-phthaldialdehyde in the presence of mercaptopropionic acid). An extraction procedure in two steps, first treatment by pepsin (hydrolysis of forms bound to proteins), then treatment by alkaline phosphatase and pantetheinase (hydrolysis of coenzyme A), allows to release the total vitamin B5 in the pantothenic acid form. As for free vitamin B12, the proposed protocol contains a very specific purification by passage through an immunoaffinity column, with concentration of the extract, then a transformation of the vitamin into ribazole (obtained by hot alkaline hydrolysis followed by a treatment by alkaline phosphatase). The fluorescent compound is then analysed by fluorimetry after a separation by reversed-phase chromatography. An enzymatic hydrolysis by pepsin allows to release the different forms of vitamin B12 bound to proteins and thus to obtain an estimation of the total vitamin B12 amount. These sensitive and repetable methods give good recovery rates. Owing to their low detection limit (0,65 µg. G-1 for the vitamin B5 and 1 ng. G-1 for the vitamine B12) and the good resolution of the peaks (respectively of pantothenic acid and of ribazole), they could most probably be applied to the determination of these vitamins in any foodstuff

Afin d'ameliorer la qualite des preparations d'immunoglobulines qu'il propose, le cnts s'interesse a la purification des immunoglobulines par des techniques chromatographiques. Nous avons donc entrepris l'etude du comportement des 4 sous-classes d'igg humaines sur 4 supports chromatographiques differents, compatibles avec une utilisation industrielle: hydrophobe, thiophile, echange d'ions et hydroxyapatite. Pour cela, il nous a fallu mettre au point une methode de dosage des sous-classes d'igg, adaptee a notre produit de depart (solution d'immunoglobulines obtenues par precipitation a l'alcool et a l'acide caprylique: allergamma). Ce dosage repose sur une technique elisa simple couche. Pour chaque type de gel, nous avons fait varier differents parametres pouvant intervenir sur les performances des colonnes (ph, force ionique, nature du sel, temperature. . . ). Les gels peuvent etre regroupes en 2 categories. Sur les gels d'interactions hydrophobes et d'adsorption thiophile, en presence de sulfate d'ammonium 1m, la plupart des immunoglobulines s'adsorbent sur le gel. Elles sont eluees tout le long d'un gradient de force ionique decroissante. Il y a donc un comportement heterogene des immunoglobulines, mais il n'y a pas d'elution selective en fonction de la sous-classe d'igg. Sur les gels echangeurs d'anions et sur hydroxyapatite, on peut, a faible molarite et a ph basique, obtenir une fraction enrichie en igg2 (72%) et en igg4 (7%), peu adsorbee sur la colonne. En revanche, sur un gel echangeur de cations, a faible molarite et a ph acide, une fraction tres enrichie en igg4 (20%) est eluee en fin de gradient de force ionique croissante

L'objet de cette thèse est le développement de méthodes de dosage de l'oxytetracycline et de l'acide oxolinique dans l'eau de mer, les sédiments et la chair de bivalves marins, puis de protocoles expérimentaux destines a une meilleure connaissance du devenir de ces antibiotiques dans ces trois compartiments de l'environnement marin. La première partie est une mise au point sur les propriétés, les méthodes de dosage, la pharmacocinétique et l'utilisation de ces antibiotiques en aquaculture. Dans la deuxième partie, des méthodes d'extraction, en phases liquide ou solide, et de dosage, par chromatographie liquide haute performance, de l'oxytetracycline et de l'acide oxolinique dans l'eau de mer et différents types de sédiments et d'espèces de bivalves marins ont été développées et validées. Les critères de validation de ces méthodes analytiques sont définis et considérés comme acceptables. Dans la troisième partie, cinq expérimentations sont conduites dans le but d'étudier la contamination et la décontamination du sédiment et de la chair de bivalves par ces antibiotiques. Dans le sédiment, le devenir de l'oxytetracycline et de l'acide oxolinique est fonction des propriétés physico-chimiques du sédiment et de l'antibiotique. Dans la chair de bivalves, leur devenir est fonction des propriétés de la molécule, des caractéristiques eco-physiologiques de l'espèce de bivalves et de la présence ou non de sédiment. L'huitre creuse (crassostrea gigas) et le sédiment apparaissent comme étant des révélateurs efficaces de la contamination réelle de l'environnement marin par ces deux antibiotiques.