Дисертації з теми "Déficience neurologique"

La prévalence de la déficience intellectuelle est estimée entre 1 à 3% de la population. En France, la déficience intellectuelle légère concerne entre 10 et 20 pour 1 000 personnes et la déficience intellectuelle sévère entre 3 à 4 pour 1 000 personnes. La déficience intellectuelle fait partie d’un groupe hétérogène de pathologies syndromiques et non syndromiques ayant en commun la limitation importante du fonctionnement intellectuel et du comportement adaptatif, apparaissant avant 18 ans et entrainant un handicap. Les causes de la déficience intellectuelle affectent la neurogénèse et/ou le fonctionnement neuronal. Environ 50% des déficiences intellectuelles sont encore à l’heure actuelle d’étiologie indéterminée. Les étiologies génétiques expliquent un grand nombre de déficiences intellectuelles et plus particulièrement les formes sévères. Les nouvellestechnologies, telles que les analyses chromosomiques sur puce à ADN et le séquençage à haut débit de l’ADN, ont permis d’augmenter le rendement diagnostique à 55-70% dans les déficiences intellectuelles modérées à sévères. C’est grâce à ces techniques que nous avons pu identifier puis caractériser deux nouveaux gènes impliqués dans des déficiences intellectuelles sévères syndromiques autosomiques récessives: le gène WDR73 responsable du syndrome de Galloway Mowat associant un déficience intellectuelle sévère et un syndrome néphrotique cortico-résistant et le gèneUBA5, impliqué dans le processus d’ufmylation, dans une encéphalopathie précoce
The prevalence of intellectual disability is estimated between 1% and 3% of the population. In France, mild intellectual disability affects between 10 and 20 per 1,000 people and severe intellectual disability between from 3 to 4 per 1,000 people. Intellectual disability is part of a heterogeneous group of syndromic and nonsyndromic pathologies with limitation in intellectual functioning and adaptive behavior appearing before the age of 18 and causing a disability. The causes of intellectual disability affect neurogenesis and / or neuronal functions. About 50% of intellectual disabilities are still undetermined. Genetic etiologies explain a large number of intellectual disabilities and more particularly the severe forms. New technologies, such as Array- Based Comparative Genomic Hybridization and next generation sequencing, have increased the diagnostic yield to 55-70% in moderate to severe intellectualdisability. Thanks to these techniques, we have been able to identify and characterize two new genes involved in severe autosomal recessive syndrome: the WDR73 gene responsible for Galloway Mowat syndrome which associates severe intellectual disability with corticosteroid-resistant nephrotic syndrome, and the UBA5 gene, involved in the ufmylation process in early encephalopathy

La déficience intellectuelle (DI) est une trouble du neuro développement caractérisée par une extrême hétérogénéité génétique, avec plus de 700 gènes impliqués dans des formes monogéniques de DI. Cependant un nombre important de gènes restent encore à identifier et les mécanismes physiopathologiques de ces maladies neuro développementales restent encore à comprendre. Mon travail de doctorat a consisté à identifier de nouvelles causes génétiques impliquées dans la DI. En utilisant différentes techniques de séquençage de nouvelle génération, j’ai pu augmenter le taux de diagnostic chez les patients avec DI et identifié plusieurs nouvelles mutations (dans AUTS2, THOC6, etc) et nouveaux gènes (BRPF1, NOVA2, etc) impliqués dans la DI. Pour les moins caractérisés, j'ai effectué des investigations fonctionnelles pour valider leur pathogénicité, caractériser les mécanismes moléculaires qu'ils affectent et identifier leur rôle dans cette maladie. Mes travaux de doctorat permettront d’améliorer et d’accélérer la possibilité d’obtenir un diagnostic moléculaire qui donnera accès à un meilleur suivi et à une meilleure prise en charge pour les patients. Cela permettra également de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces troubles neuro développementaux. Ces connaissances aideront éventuellement à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques
Intellectual disability (ID) is a group of neurodevelopmental disorders characterized by an extreme genetic heterogeneity, with more than 700 genes currently implicated in Mendelian forms of ID but still some are not yet identified. My PhD project investigates the genetic causes of these monogenic ID by using and combining different NGS techniques. By using this strategy, I reached a relative high diagnostic yield and identified several novel mutations (in AUTS2, THOC6) and genes (BRPF1, NOVA2, etc) involved in ID. For the less characterized ones, I performed functional investigations to prove their pathogenicity, delineate the molecular mechanisms altered and identify their role in this disease. Overall, this work improved and provided new strategies to increase the molecular diagnosis in patients with ID, which is important for their healthcare and better management. Furthermore, the identification and the characterization of novel mutations and genes implicated in ID better delineate the implicated pathophysiological mechanisms, opening the way to potential therapeutic targets

L’anomalie de développement du corps calleux (AnCC) est la malformation cérébrale congénitale la plus fréquente. Le spectre clinique lié à l’AnCC est large, d’un développement normal à un trouble du développement intellectuel (TDI) de gravité variable. Les causes connues sont majoritairement génétiques avec une grande hétérogénéité, majoritairement associées à un TDI. Les causes d’AnCC de bon pronostic (i.e. sans TDI) sont rares car peu étudiées. Actuellement l’AnCC est découverte le plus souvent en cours de grossesse, à l’échographie de dépistage du 2ème trimestre. Le principal enjeu est alors celui du pronostic fœtal, dépendant de l’étiologie sous-jacente. Une meilleure connaissance des facteurs génétiques en jeu dans l’AnCC joue un rôle important dans le diagnostic, le conseil génétique et l’information prénatale. Actuellement, la mise en lumière des facteurs diagnostiques et pronostiques est un défi majeur dans le domaine de la médecine fœtale. Les objectifs principaux de ma thèse étaient d’une part d’identifier de nouveaux gènes responsables d’AnCC, mais aussi d’établir des corrélations génotype-phénotype pour les gènes identifiés afin d’améliorer l’information pronostique en particulier en prénatal. Pour répondre à ces objectifs, le travail de thèse s’est axé sur trois axes complémentaires, menés en parallèle. Le premier axe portait sur la description d’un nouveau gène d’AnCC, issu de l’analyse des résultats du séquençage d’exome dans une cohorte de plus de 500 patients avec AnCC, recrutés sur plus de 10 ans dans les services de génétique de l’hôpital de La Pitié Salpêtrière et de neuropédiatrie de l’hôpital Armand Trousseau. Nous avons identifié un nouveau gène responsable d’AnCC, associé à un bon pronostic neurodéveloppemental, ZEB1, gène impliqué jusque-là dans la dystrophie cornéenne. Grâce à une collaboration, nous avons rapporté les données cliniques, génétiques et radiologiques de 14 patients porteurs d’un variant pathogène dans le gène ZEB1. La seconde partie du travail consistait en l’établissement de corrélations génotype-phénotype de syndromes génétiques déjà connus dans l’AnCC, avec un premier focus sur l’inversion duplication délétion du bras court du chromosome 8 (invdupdel8p), anomalie chromosomique la plus fréquente dans la cohorte de patients avec AnCC et TDI. Ce travail a permis de relimiter la région minimale critique dupliquée en 8p23 responsable d’AnCC. Nous avons également analysé les données d’une cohorte de patientes avec variant dans le gène ARX, localisé sur le chromosome X, bien connu dans l’AnCC avec TDI chez le garçon mais dont le phénotype féminin était moins établi. Grâce à une revue de la littérature et la description de 10 nouvelles patientes, nous avons montré que 40% des femmes porteuses d’un variant ARX présentaient un TDI ou une encéphalopathie épileptique et développementale. Parmi les femmes porteuses ayant eu une imagerie cérébrale, 66 % présentaient une AnCC, sans que celle-ci soit prédictive du phénotype neurodéveloppemental sous-jacent. Enfin, la troisième partie portait sur l’application de ces données dans le contexte du diagnostic prénatal avec une étude de faisabilité du séquençage d’exome en prénatal en cas d’AnCC fœtale. Menée dès 2018, cette étude a montré un rendement diagnostique de 25% avec un rendu médian en 21 jours. Ensuite, avec l’équipe de radiologie de l’hôpital Armand Trousseau, nous avons mené un travail de corrélation radio-génétique sur l’imagerie prénatale, en fonction des sous-catégories d’AnCC, montrant que l’identification d’un variant pathogène était plus fréquente dans dysplasies calleuses, et lorsque l’AnCC n’était pas isolée. Ce travail collectif et personnel a ainsi permis d’améliorer les connaissances dans les causes génétiques d’AnCC, augmentant l’efficacité diagnostique, l’information pronostique et a considérablement modifié la prise en charge des couples en prénatal
The Developmental Anomaly of the Corpus Callosum (DACC) is the most common congenital brain malformation. The clinical spectrum associated with DACC is broad, ranging from normal development to varying degrees of intellectual developmental disorder (IDD). The known causes are predominantly genetic with significant heterogeneity, mostly associated with IDD. Causes of DACC with a favorable prognosis (i.e., without IDD) are rare and less studied. Currently, DACC is most often discovered during pregnancy, through second-trimester screening ultrasound. The primary concern at this point is fetal prognosis, which depends on the underlying etiology. A better understanding of the genetic factors involved in DACC plays a crucial role in diagnosis, genetic counseling, and prenatal information. Currently, highlighting diagnostic and prognostic factors is a major challenge in the field of fetal medicine. The main objectives of my thesis were, on the one hand, to identify new genes responsible for DACC, and on the other hand, to establish genotype-phenotype correlations for the identified genes to improve prognostic information, particularly in prenatal care. To address these objectives, the thesis work focused on three complementary axes, conducted in parallel. The first axis involved the description of a new DACC gene, identified through exome sequencing analysis in a cohort of over 500 patients with DACC, recruited over more than 10 years from the genetics departments of La Pitié Salpêtrière Hospital and the neuropediatrics department of Armand Trousseau Hospital. We identified a new gene responsible for DACC, associated with a favorable neurodevelopmental prognosis, ZEB1, a gene previously known to be involved in corneal dystrophy. Through collaboration, we reported clinical, genetic, and radiological data for 14 patients carrying a pathogenic variant in the ZEB1 gene. The second part of the work involved establishing genotype-phenotype correlations of already known genetic syndromes in DCCA, with a primary focus on the inversion duplication deletion of the short arm of chromosome 8 (invdupdel8p), the most common chromosomal anomaly in the cohort of patients with DACC and IDD. This work helped to refine the critical duplicated region in 8p23 responsible for DACC. We also analyzed data from a cohort of patients with a variant in the ARX gene, located on the X chromosome, well known in DCCA with IDD in boys but with less established phenotypes in females. Through a literature review and the description of 10 new female patients, we showed that 40% of women carrying an ARX variant had IDD or a developmental and epileptic encephalopathy. Among the female carriers who had brain imaging, 66% had DACC, although it was not predictive of the underlying neurodevelopmental phenotype. Finally, the third part focused on the application of this data in the context of prenatal diagnosis, with a feasibility study of exome sequencing in prenatal cases of fetal DACC. Conducted since 2018, this study showed a diagnostic yield of 25% with a median turnaround time of 21 days. Then, with the radiology team at Armand Trousseau Hospital, we conducted a radio-genetic correlation study on prenatal imaging, based on subcategories of DACC, showing that the identification of a pathogenic variant was more common in callosal dysplasia and when DACC was not isolated. This collective and personal work has thus improved knowledge about the genetic causes of DACC, increasing diagnostic efficiency, prognostic information, and significantly altering the management of couples in prenatal care

L'autisme et la déficience mentale (DM) sont des pathologies neurodéveloppementales fréquentes qui partagent des facteurs génétiques communs. Afin de mieux comprendre leur étiologie, nous avons étudié les mécanismes moléculaires de la neurofibromatose de type 1 (NF1), qui est souvent associée à l'autisme et à la DM. La neurofibromine, dont le gène est muté dans la NF1 interagit avec LIMK2. Cette protéine fait partie de la voie des Rho-GTPases dont des mutations de plusieurs membres ont été trouvés mutés dans des cas d'autisme et de DM. Chez le rat, nous avons montré que l’expression de Limk2d, une isoforme sans domaine kinase, augmente la croissance des neurites des cellules neuronales NSC-34. Chez l'homme, LIMK2-1 est la seule isoforme qui comporte un domaine inhibiteur de la phosphatase 1 (PP1i). Nous avons montré que l’expression de cette protéine diminue la longueur des neurites des cellules NSC-34 in vitro. Nous avons observé l'association de la variation située dans le domaine PP1i à la DM (p.S668P, rs151191437) (p=0,04, test de Fisher, OR = 3,29). Elle abolit l’effet inhibiteur de croissance des neurites de l'isoforme LIMK2-1 diminue l'interaction de LIMK2-1 avec la neurofibromine. La fréquence de l'autisme est plus élevée chez les patients atteints ayant des délétions de 14 gènes du locus NF1. Nous avons observé une association entre la variation R115K (rs111902263) du gène RNF135 de ce locus et l'autisme (p=0,00014, test de Fisher) ainsi qu’une anomalie du nombre de copies située dans l'intron 2 de ce gène chez un d’entre eux. Ce travail souligne la spécificité de deux isoformes de LIMK2 sur la croissance des neurites. Il renforce l’intérêt d’étudier l’implication du gène RNF135 dans l’autisme. Des études fonctionnelles seront entreprises afin de confirmer le rôle de LIMK2 et de RNF135 dans l'étiologie de l'autisme et de la DM
Autism and mental deficiency (MD) are two neurodevelopemental diseases which share genetic factors in common. To better understand their etiologies, we studied the molecular mechanisms of neurofibromatosis type 1, a pathology frequently associated with autism and MD. Neurofibromatosis type 1 is due to deletions or mutations of the NF1 gene which encodes neurofibromin. This protein interacts with several proteins such as LIMK2. This protein belongs to the Rho-GTPases pathway in wich mutations of numerous members have been associated with autism and MD. In our study, we showed that LIMK2 isoforms do not only have important structural differencies but have also functional specificities. Limk2d, which lacks the kinase domain, promotes neurite outgrowth of NSC-34 cells. On the contrary, LIMK2-1, which is primate specific and has a C-terminal PP1i domain, inhibits neurite outgrowth. Analysis of the LIMK2-1 coding sequence, revealed the association between MD and a variation located in the PP1i domain, S668P (rs151191437) (p=0.04, Fisher test, OR = 3.29). This variation abrogated the LIMK2-1 effect on neurite outgrowth and inhibited LIMK2-1 interaction with neurofibromin. Deletions occuring in neurofibromatosis type 1 which include the NF1 gene and 13 others are associated with a higher frequency of autism. Mutations of one of them, RNF135, have been identified in patients with MD and overgrowth syndrome. Two of these patients also presented autistic features. By analysing RNF135 gene in autistic patients, we showed the association of the variation R115K (rs111902263) with autism. We also identified a duplication of a region located in RNF135 gene intron 2 in one patient presenting autism and MD. Our results highlight the importance and specificity of LIMK2 isoforms on neurite outgrowth and strengthen the importance to analyze both the sequence and copy-number of RNF135 gene. Further functional experiments will be undertaken to confirm the implication of LIMK2 and RNF135 in autism and MD etiology

Les p21-activated kinases (PAK) du sous-groupe I sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires tels la prolifération, les mouvements cellulaires, l’adhérence et l’apoptose. Ces kinases sont des effecteurs des Rho-GTPases Rac1 et Cdc42 et participent à la régulation du cytosquelette d’actine. Les deux kinases neuronales PAK1 et PAK3, qui présentent de fortes identités de séquence, régulent le cytosquelette d’actine, contrôlant ainsi la dynamique des épines dendritiques, et la plasticité synaptique.Les mutations du gène pak3, localisé sur le chromosome X, sont responsables de déficience intellectuelle chez l’homme, et les mécanismes moléculaires et cellulaires associés aux défauts cognitifs sont mal connus. Il a été montré que PAK3 participe à la voie proneurale au cours de l’embryogénèse précoce du xénope en favorisant la sortie du cycle cellulaire et la différenciation neuronale. Cependant, le rôle de PAK3 dans la neurogenèse adulte n’a pas été étudié. Or depuis maintenant une quinzaine d’années, il est admis que la neurogenèse perdure à l’âge adulte et participe aux processus de mémorisation et d’apprentissage. Nous nous sommes donc intéressés à l’implication de PAK3 dans la régulation de la neurogenèse adulte, posant l’hypothèse qu’un défaut de neurogenèse serait responsable, au moins en partie, des défauts cognitifs chez les patients. Nous avons montré que PAK3 n’est pas exprimée dans les cellules souches neurales/progéniteurs prolifératifs mais son expression augmente fortement dès le retrait des facteurs de croissance, ex vivo, suggérant un rôle dans la neurogenèse adulte. Nous avons montré que l’invalidation de pak3 provoque une augmentation de la fréquence de neurosphères primaires formées ainsi qu’un accroissement de leur taille, ceci sans affecter la taille du réservoir de cellules souches ni les propriétés cardinales de celles-ci (multipotence, auto-renouvellement et prolifération). Toutefois, les cellules progénitrices pak3- poursuivent leur prolifération dans des conditions de culture induisant normalement la différenciation, suggérant un défaut de sortie du cycle cellulaire.Nous nous sommes ensuite demandé si les mutations de déficience intellectuelle du gène pak3 altèrent la neurogenèse adulte. Nous avons créé pour cela un modèle murin portant la mutation R67C, responsable chez l’homme de la forme la plus sévère de déficience intellectuelle associée aux mutations de ce gène. Nous mettons en évidence, dans cette souris knock-in, une forte diminution du nombre de cellules nouveau-nées dans les deux zones neurogéniques du cerveau (la zone sous-ventriculaire et le gyrus denté de l’hippocampe) et une augmentation de la proportion de neurones nouveau-nés immatures. Ces données suggèrent que la mutation R67C n’induit pas une perte de fonction de la kinase mais un changement de fonction dépendante d’une activation préférentielle par la GTPase Rac1.En conclusion, ce travail de thèse montre que PAK3 participe à la régulation de la neurogenèse adulte chez les mammifères, contrôle la sortie du cycle cellulaire des progéniteurs neuraux et que la mutation R67C impacte la maturation des neurones nouveau-nés. L’ensemble de ces données suggère que les défauts de neurogenèse adulte dus aux mutations de déficience intellectuelle du gène pak3 sont à l’origine de certains dysfonctionnements cognitifs
The group I p21-activated kinases (PAK) are involved in many cellular processes such as proliferation, cell movement, adhesion and apoptosis. These kinases are effectors of Rho GTPases Rac1 and Cdc42, and participate in the regulation of the actin cytoskeleton. Both neuronal kinase PAK1 and PAK3, which exhibit high sequence identities, regulate the actin cytoskeleton, thereby controlling the dynamics of dendritic spines and synaptic plasticity. Mutations of the X-linked pak3 are responsible for intellectual disability (ID) in humans, and the molecular and cellular mechanisms associated with cognitive defects are poorly described. It was shown that PAK3 participates in the proneural pathway during early Xenopus embryogenic development, by promoting cell cycle exit and neuronal differentiation of neural precursors. However, the role of PAK3 in the adult neurogenesis has not been studied in mammals. It is now generally accepted that neurogenesis persists during human adulthood and is involved in learning and memory. We are therefore interested in the involvement of PAK3 in the regulation of adult neurogenesis, on the assumption that defects in neurogenesis may be responsible, at least in part, for cognitive defects in ID patients.We showed that PAK3 is not expressed in proliferative neural stem/progenitor cells but its expression increased significantly upon growth factor removal, suggesting a role in adult neurogenesis. We showed that the invalidation of pak3 gene causes an increase in the frequency and in size of primary neurospheres. However Pak3 invalidation does not affect the size of the stem cell reservoir nor the NCS cardinal properties (pluripotency, self-renewal and proliferation). However, the pak3- progenitor cells continue their proliferation in culture conditions normally inducing differentiation, suggesting a defect in cell cycle exit. We then asked whether pak3 ID mutations affect adult neurogenesis. We created a knock-in model expressing the pak3-R67C mutation responsible in humans for a severe form of intellectual impairment. We observed in the knock-in mice, a significant decrease in the number of newborn cells in both neurogenic areas of the brain (the subventricular zone inforebrain, and the dentate gyrus of the hippocampus) and an increase in the proportion of immature newborn neurons. These data suggest that the R67C mutation does not induce a loss of function of the kinase but a change of a function dependent on preferential activation by the Rac1 GTPase.In conclusion, we show that PAK3 play an important role in the regulation of adult neurogenesis in mammals by controlling the cell cycle exit of neural progenitors. The R67C ID mutation impacts both newborn cell proliferation and their maturation. Taken together, these data suggest that defects in adult neurogenesis caused by ID mutations in the pak3 gene may be involved in some cognitive dysfunctions

Il a été établi que les troubles de la perception visuo-spatiale étaient fréquents dans la population d’enfants présentant des troubles des apprentissages et que 60% des enfants avec un trouble du neuro-développement ont un déficit de perception visuo-spatiale élémentaire (PVSE). Notre objectif en réalisant ce travail était double. D’une part un objectif de recherche fondamentale : mieux comprendre le rôle que joue la vision dans la cognition spatiale. Et d’autre part, un objectif clinique : mieux comprendre les déficits du développement de la PVSE et leurs conséquences fonctionnelles dans des contextes dans lesquels ils ne sont pas suffisamment pris en considération. Ainsi, nous avons évalué la prévalence des troubles de la PVSE chez des enfants présentant un déficit moteur dans le contexte d’une Paralysie cérébrale. Nous avons constaté que le développement de la PVSE était plus déficitaire avec une lésion cérébrale dans le contexte de la prématurité que dans le cas d’une lésion néonatale. Pour une meilleure compréhension de ce phénomène, nous nous sommes intéressés aux enfants nés prématurés sans lésion cérébrale qui consultent pour des troubles des apprentissages. Nous avons constaté que même en l’absence de trouble du neuro-développement, la prématurité était un facteur de risque supplémentaire de développer des troubles de la PVSE et notamment de la perception des grandeurs. Ces deux études laissent penser qu’un déficit de la PVSE serait lié au développement cérébral intra-utérin et serait indépendant de l’environnement dans lequel se réalise la maturation post-natale du cortex. Mais quel est le rôle que jouent les entrées sensorielles dans la perception et la cognition spatiale ? La littérature s’est principalement intéressée aux cécités congénitales et leur impact sur la cognition spatiale soulignant que la vision ne serait pas juste une modalité d’entrée comme une autre mais qu’elle interviendrait de façon cruciale dans le développement de la cognition spatiale. Peu de travaux ont évalué l’impact d’un déficit visuel partiel et progressif sur la perception spatiale, sur entrée visuelle ou non-visuelle, et sur la cognition spatiale et numérique. Nous avons montré une prévalence importante des troubles de la PVSE chez les personnes déficientes visuelles mais pas aveugles, et davantage en l’absence de champ visuel périphérique qu’en situation de baisse d’acuité visuelle. Ce constat est d’autant plus surprenant que nous avons démontré une absence de déficit de PVSE lors d’une étude évaluant le rôle de la vision périphérique chez des sujets sains. Ce déficit n’est donc pas lié à la saisie de l’information visuelle (qui peut être simulée expérimentalement chez le sujet sain) mais lié à un processus de plasticité maladaptative chez les patients, associé à l’atteinte chronique du champ visuel périphérique (une réorganisation corticale des aires visuelles ayant été démontrée en cas de rétinite pigmentaire). Nous avons constaté par ailleurs que ces patients développent moins de compensations haptiques et qu’ils sont en difficulté sur des tâches d’imagerie mentale. L’ensemble des déficients visuels montraient des difficultés en arithmétique mais pas à nos tâches de cognition numérique non-visuelle (sauf en cas de cécité congénitale), ce qui souligne l’importance d’utiliser des supports non-visuels pour apprendre et évaluer les compétences mathématiques chez les déficients visuels. La prise en compte des déficits de la PVSE est d’autant plus importante que les populations que nous avons étudiées sont plus à risque d’avoir des troubles dans les apprentissages et des échecs scolaires. À partir de ces travaux, nous pourrons envisager des prises en charges préventives adaptées et ne pas attendre l’échec scolaire pour agir
It was established that visuo-spatial perception troubles were frequent in children with learning disabilities and that 60% of children with neuro-developmental disabilities have a deficit of elementary visuo-spatial perception (EVSP). We had a double objective in this phD. The first one was for fundamental research: to understand more clearly the role that the vision plays in spatial cognition. The second objective was clinical: to understand more clearly the EVSP developmental deficit and its functional consequences in contexts where it is not taken into consideration enough. So, we evaluated the prevalence of EVSP troubles in children with a motor deficit in the context of cerebral palsy. Our results showed that the development of the EVSP was more problematic with brain damage in the context of prematurity than in the context of neonatal lesion. To better understand this phenomenon, we also tested EVSP in children born prematurely without cerebral lesion but with scholar complaints. We found that even without neuro-developmental disabilities, prematurity upgrades the risk of developing EVSP deficit, and particularly hinders length perception. These two studies made us think that EVSP deficit would be linked to cerebral intra-utero development and would be independent of the environment of postnatal maturation of the cortex. But what about the role of the sensory inputs in the development of spatial abilities? The literature has mainly been focused on congenital blindness and its impact on spatial cognition, highlighting that vision appears as a privileged modality in the development of spatial cognition. Few studies have evaluated the impact of partial and progressive visual impairment on spatial perception, tested in the visual or non-visual modality, and on spatial and numerical cognition. We demonstrated an important prevalence of EVSP troubles in visually impaired people with residual vision, more in the population with reduced peripheral visual field than in the population with decreased visual acuity. This finding contrasts with the demonstration that simulating a deficit of peripheral vision with gaze-contingent masking in healthy controls did not impact the EVSP accuracy. Altogether, this put forward that the EVSP deficit in patients with peripheral vision deficit is not linked to the restricted capture of visual information (that can be experimentally stimulated in healthy subjects) but is rather linked to a process of maladaptive plasticity, associated to the chronic lack of sensory input from peripheral vision (a reorganization of cortical visual areas has been demonstrated in neuroimaging for patients with retinitis pigmentosa). We have also found that these patients tend to develop less haptic compensations and to have more difficulties in mental imagery task. While all groups of visually impairment had difficulties in arithmetic, none, except people with congenital blindness, struggled in our non-visual numerical cognition tasks involving pointing toward a mental number line or bimanual magnitude estimation. This highlights the importance of using non-visual media to learn and evaluate the mathematical skills in visually impaired people. Accounting for EVSP deficits is important in the populations studied in this phD because they are at greater risk of learning disabilities and academic failure. Based on these studies, we can think at adapted preventive care and should not wait for academic failure to react

Les variations du nombre de copies (CNVs) des régions chromosomiques sont une source importante de variabilité chez l’humain. Ainsi certaines altérations structurelles ont été associées à des maladies syndromiques comme les CNVs de la région 16p11.2. Les réarrangements de cette région représentent un facteur de risque important pour le diagnostic de troubles du neurodéveloppement, tels que la déficience intellectuelle et les troubles du spectre autistique (ASD). Pourtant, la grande densité en gènes de la région et la forte variabilité phénotypique rendent leur étude complexe. La modélisation chez la souris des réarrangements 16p11.2 a permis d’identifier plusieurs déficits cognitifs similaire aux traits humains afin d’identifier gènes responsables et comprendre les mécanismes moléculaires affectés. Les projets de recherche présentés dans ce manuscrit consistent en l’identification de gènes candidats à partir de la caractérisation comportementale de modèles d’inactivation génétique et le développement d’approches thérapeutiques, afin de restaurer les phénotypes associés à la délétion de la région 16p11.2 chez la souris. En outre, nous avons également engagé la création de modèles porteurs des réarrangements 16p11.2 chez le rat. Grâce à ces nouveaux modèles, nous avons retrouvé des désordres de l’interaction sociale, un phénotype associé à l’autisme, ce qui rend ces modèles très pertinents pour la compréhension de ces désordres. Finalement, la caractérisation comportementale des modèles 16p11.2 à partir de ces deux espèces a mis en évidence un dimorphisme sexuel. La similitude retrouvée entre ces modèles animaux dans nos études et le biais sexuel des cas porteurs des réarrangements 16p11.2 avec l’ASD ou la déficience intellectuelle chez l’homme ouvre des perspectives intéressantes pour le développement de traitements futurs. Ce travail s’inscrit dans une perspective plus large qui permette de comprendre le rôle des gènes de la région dans le développement neurologique et leurs effets sur le comportement afin de comprendre et améliorer la pathologie humaine associée aux CNVs 16p11.2
Variations in copy number (CNVs) of chromosomal regions are an important source of variability in humans. Thus some structural alterations have been associated with syndromic diseases such as the CNVs of the 16p11.2 region. Indeed 16p11.2 rearrangement represent an important risk factor for the diagnosis of neurodevelopmental disorders, such as intellectual disability and Autism Spectrum Disorder (ASD). However, the high gene density of the region and the high phenotypic variability make their study complex. Mouse modeling of 16p11.2 rearrangements has allowed to identify several cognitive deficits similar to human traits for the purpose of identify responsible genes and to understand the molecular mechanisms affected. The work presented in this manuscript consists of the identification of candidate genes from the behavioral characterization of genetic inactivation models and the development of therapeutic approaches to restore the phenotypes associated with the 16p11.2 deletion in the mouse. In addition, we also initiated the creation of models carrying 16p11.2 rearrangements in rats. Thanks to these models, we found disorders of social interaction, a phenotype associated with autism, which makes these models very relevant for the understanding of these disorders. Finally, the behavioral characterization of the 16p11.2 models from these two species revealed a sexual dimorphism. The similarity found between these models in our studies and the sexual bias of cases carrying 16p11.2 rearrangements with ASD or intellectual disability in humans open interesting prospects for the development of future treatments. This work is part of a wider perspective that allows to understand the role of genes of the region in neurodevelopment to understand and improve the human pathology associated with CNVs 16p11.2

Les dystrophies rétiniennes sévères et précoces (EOSRD) et l'amaurose congénitale de Leber (ACL - MIM204000) sont les principales causes de cécité incurable chez les enfants. Ces maladies, variables sur le plan clinique, génétique et physiopathologique, peuvent être le signe de syndromes multisystémiques, tels que les ciliopathies. Elles se transmettent le plus souvent de manière autosomique récessive et l'implication de plusieurs gènes a été confirmée. Cependant, l'histoire et l'expression clinique de l'ACL sont imparfaitement comprises et de nombreuses mutations restent inconnues. Il est nécessaire de continuer à déchiffrer ces aspects pour affiner la compréhension de la physiopathologie. L'identification de nouveaux gènes responsables et les corrélations génotype-phénotype sont essentiels à la prise en charge des patients. Grâce au séquençage à haut débit des gènes connus de l'ACL/EOSRD et aux investigations dans les centres de référence cliniques, le Laboratoire de génétique ophtalmologique (LGO) a identifié les causes moléculaires de la maladie dans plus de 80 % des cas dans une cohorte de plus de 700 familles. À ce jour, 40 familles de ACL/EOSRD non résolues ont été soumises au séquençage de l'exome entier (WES), ce qui a permis d'identifier des gènes candidats, sélectionnés en vue d'une validation fonctionnelle. Des variants délétères de GPATCH11 ont été identifiés dans six familles comprenant 12 individus atteints de dystrophie rétinienne, présentant des troubles neurologiques et des anomalies squelettiques, fournissant des arguments forts que des mutations récessives dans le gène GPATCH11 sont responsables de la maladie. GPATCH11 est l'une des protéines contenant le domaine G-patch la moins étudiée, connues pour contribuer au spliceosome. Quatre mutations récessives ont été identifiées, avec la mutation du site d'épissage NM_174931.4 : c.328+1G>T commune à quatre familles sur six et affectant le site d'épissage consensus de l'intron 4, ce qui entraîne l'exclusion de l'exon 4 du transcrit sans rupture du cadre de lecture, produisant ainsi une protéine plus courte. La protéine GPATCH11, dans sa forme sauvage ou mutée, est localisée à la fois, de façon diffuse dans le nucléoplasme et dans le centrosome des cils primaires des fibroblastes, suggérant des rôles dans le métabolisme de l'ARN et des cils. Le modèle de souris (Gpatch11delta5/delta5) généré à l'Institut Imagine, portant la délétion de l'exon 5 équivalent à l'exon 4 de GPATCH11 humain, reproduit les défauts phénotypiques des patients, avec la présence d'une dystrophie rétinienne et des anomalies comportementales. Le transcriptome de la rétine a identifié des voies dérégulées dans l'expression et l'épissage des gènes, impactant des processus clés tels que les réponses à la lumière des photorécepteurs, la régulation de l'ARN et le métabolisme associé aux cils primaires. L'analyse par spectrométrie de masse a trouvé des protéines régulées à la baisse impliquées dans la perception visuelle, la fonction synaptique et les mécanismes de liaison et d'épissage de l'ARN, et des protéines régulées à la hausse impliquées principalement dans le métabolisme et l'épissage de l'ARN (Publication 1). En outre, l'implication de GPATCH11 dans le cerveau est en cours d'exploration par immunomarquage et analyse transcriptomique/protéomique, en se concentrant sur l'hippocampe, structure cérébrale responsable de la mémoire. Les souris Gpatch11delta5/delta5 sont viables et se développent normalement, toutefois les mâles sont complètement infertiles et présentent des testicules plus petits que la normale et vides, dont la cause est en cours d'étude en collaboration avec un laboratoire externe (Part 2A, B)
Early onset retinal dystrophies (EOSRD) and Leber congenital amaurosis (LCA - MIM204000) are the leading cause of incurable blindness in children. These diseases, clinically, genetically, and pathophysiologically variable, can be the sign of multisystemic syndromes, such as ciliopathies. They are mostly inherited in autosomal recessive manner, and several genes have been confirmed to be involved. However, the history and clinical expression of LCA are imperfectly understood and many mutations remain unknown. There is a need to continue deciphering these aspects to refine the understanding of pathophysiology. The identification of new responsible genes and the genotype-phenotype correlations are essential for disease management. Thanks to high-throughput gene panel-based sequencing of known LCA/EOSRD genes and investigation in clinical reference centres, the Laboratory of Genetics in Ophthalmology (LGO) has identified the molecular causes of the disease in more than 80% of cases in a cohort of over 700 families. To date, 40 unresolved LCA/EOSRD families have been submitted to whole exome sequencing (WES), leading to the identification of candidate genes, which have been selected for functional validation. Deleterious GPATCH11 variants have been identified in six families comprising 12 affected individuals with retinal dystrophy, exhibiting neurological disorders and skeletal anomalies, providing compelling evidence that recessive mutations in the GPATCH11 gene are responsible for the disease. GPATCH11 is one of the lesser-explored G-patch domain containing proteins, which are known to contribute to the spliceosome. Four recessive mutations were identified, with the splice-site NM_174931.4: c.328+1G>T being common to four out of six families and affecting the consensus splice site of intron 4, causing exon 4 to be excluded from the transcript without breaking the reading frame and producing a shorter protein. Both wild-type and mutated GPATCH11 proteins are localised in the nucleoplasm with a diffuse pattern and in the centrosome of the primary cilia of fibroblasts, suggesting roles in RNA and cilia metabolism. The mouse model (Gpatch11delta5/delta5) generated at the Institute Imagine, carrying the deletion of exon 5 equivalent to exon 4 of human GPATCH11, replicates the patients' phenotypic defects, such as retinal dystrophy and behavioural abnormalities. Retina transcriptome analysis identified deregulated pathways in gene expression and splicing, impacting key processes, such as photoreceptor light responses, RNA regulation, and primary cilia-associated metabolism. Mass-spectrometry analysis found downregulated proteins involved in vision perception, synaptic function and RNA binding and splicing pathways, and upregulated proteins mostly involved in RNA processing and splicing (Publication 1). Furthermore, the involvement of GPATCH11 in the brain is currently being explored through immunostaining and transcriptome/proteome analysis, focusing on the hippocampus, a brain structure responsible for memory. Gpatch11delta5/delta5 mice are viable and develop normally, except that males are completely infertile and exhibit smaller than normal and empty testis. The cause of this infertility is under investigation in collaboration with an external laboratory (Part 2A, B)

Les mutations du gène Aristaless-related homeobox (ARX) sont responsables d’un large spectre de phénotypes allant de malformations cérébrales sévères telle que la lissencéphalie, à des formes plus modérées de retard mental sans anomalie de structure du cerveau mais souvent associées à de l’épilepsie. ARX code un facteur de transcription à homéodomaine, fortement exprimé au cours du développement du cerveau, et plus particulièrement dans les interneurones GABAergiques. Plusieurs études ont montré l’implication d’ARX dans la prolifération des neuroblastes, la migration et la différenciation neuronales. Afin de mieux comprendre le rôle d’ARX et de caractériser les voies de signalisation impliquées, j’ai cherché à identifier ses cibles par la technique d’immunoprécipitation de la chromatine associée aux puces à ADN (ChIP-on-Chip). Les complexes protéine/ADN, issus soit de cellules de neuroblastome de souris transfectées par ARX, soit de cerveaux embryonnaires de souris à E15. 5, ont été immunoprécipités par un anticorps anti-ARX. L’ADN cible a ensuite été marqué et hybridé de manière compétitive avec un ADN de référence sur des puces ciblant les promoteurs des gênes de la souris. Environ 285 gènes apparaissent communs aux cellules et au tissu. Une vingtaine de cibles ont été confirmées par ChIP/QFM-PCR et qRT-PCR en temps réel. Dès études de transcriptomiques sont en cours pour permettre de valider la régulation de ces gènes par ARX. Cette étude devrait ainsi contribuer à une meilleure compréhension du rôle d’ARX dans la corticogenèse et à une meilleure caractérisation des mécanismes physiopathologiques du retard mental et de l’épilepsie associés aux mutations d’ARX
Mutations in the ARX (Aristaless-related homeobox) gene are responsible for a wide spectrum of disorders extending from phenotypes with severe neuronal migration defects, such as lissencephaly, to milder forms of mental retardation without apparent brain abnormalities but associated features of dystonia and epilepsy. ARX encodes a homeobox transcription factor which is primarily expressed in the developing telencephalon, and particularly in populations of GABAergic neurons during development and in adult brain. Many studies have recently shown the involvement of ARX in several fundamental processes for brain development such as neuroblast proliferation as well as neuronal migration, maturation and differentiation. In order to better characterize the role of ARX and the pathways involved, I performed some ChIP-on-Chip (chromatin immunoprecipitation on DNA microarrays) experiments to identify some 0f its target genes. DNA/protein complexes from either mouse neuroblastoma cells transfected by Arx or embryonic mouse brain were immunoprecipitated using a specific antibody against Arx. DNA was purified, amplified, labelled and simultaneously hybridized with the input chromatin DNA on mouse promoter microarrays. A total of 285 genes in common were obtained. Candidate genes were validated by ChIp/QFM-PCR and quantitative real time RT-PCR. Moreover, transcriptomic studies on cells transfected by Arx vs. Contral were performed to validate the regulation of these candidate genes. The identification of ARX downstream genes should allow a better understanding of the role of this gene during brain development and the pathophysiological mechanisms associated with its mutations

Contexte : Plusieurs approches thérapeutiques sont utilisées afin d’améliorer la mobilité en contexte de réadaptation. La danse-thérapie fait partie des approches innovantes auprès de populations ayant des troubles neurologiques. Une étude quasi expérimentale avec un groupe témoin n'a pas apporté d’évidence de l'efficacité d'un programme de danse-thérapie de 12 semaines, dispensé une fois par semaine à des personnes souffrant d'un handicap physique (DTDP) et visant à améliorer leur mobilité. Étant donné les avantages perçus de l'intervention, il était important de poursuivre les recherches. Méthode : Nous avons mené une étude expérimentale à cas unique avec la statistique Tau-U sur 28 semaines avec des mesures répétées (quatre outils pour évaluer la mobilité) dans la phase pré-danse (A1), la phase du programme de danse (B) et la phase post-danse (A2). L'échelle de l’état de flow (Flow State Scale, FSS) et l'échelle de confiance de l’équilibre spécifique à l'activité (ABC Scale) ont fourni des scores avant et après l'intervention. Résultats : Cinq participants ont amélioré de manière significative (p <0,05) leurs scores pour le Mini BESTest (MBT), 2/5 pour le 4 Square Step Test (4Sq) et 4/5 pour le Multi Directional Reach Test - Behind (MDRT-behind) avec de très grandes tailles d'effet (TE). Les TE agrégés pour A1 et A2 sont passés de modérés à très grandes. Les changements sur les échelles FSS et ABC n'étaient pas significatifs. Les objectifs personnels ont été perçus et mesurés comme atteints. Conclusions : Ces résultats suggèrent l'efficacité du programme DTDP pour les adultes souffrant de troubles neurologiques et l'utilisation du devis expérimental à cas unique avec la statistique Tau- U pour explorer l'efficacité des interventions en danse pour des cohortes hétérogènes. Les outils utilisés pour mesurer la mobilité semblent prometteurs pour détecter les changements dus à la danse.
Background: Several therapeutic approaches are used to improve mobility in rehabilitation settings. Dance therapy is one of the innovative approaches for populations with neurological disorders. A quasi-experimental study with a control group did not provide evidence to support the effectiveness of a 12-week weekly outpatient dance therapy program for persons with physical disability (DTPD) aimed at improving their mobility. Given the perceived benefits of the intervention, further investigation was important. Method: We conducted a single case experimental design (SCED) with the Tau-U statistic over 28 weeks with repeated measures (4 tools to assess mobility) in the pre-dance phase (A1), dance program phase (B) and post-dance phase (A2). The Flow State Scale and the Activity-specific balance confidence scale (ABC) provided scores pre-and post intervention. Results: Five participants significantly (p <0.05) improved scores for the Mini BESTest (MBT), 2/5 for the 4 Square Step Test (4Sq) and 4/5 for the Multi-Directional Reach Test – Behind (MDRT- behind) with very large effect sizes (ES). Aggregated ES for A1 and A2 went from moderate to very large. Changes on the FSS and ABC scales were not significant. Personal objectives were perceived and measured as attained. Conclusions: These results support the effectiveness of the DTPD program for adults with neurological conditions, and for the use of SCED with the Tau-U statistic to explore effectiveness of dance interventions for heterogeneous cohorts. The tools used to measure mobility appear promising to detect changes due to dance.

La déficience intellectuelle affecte de 1 à 3% de la population mondiale, ce qui en fait le trouble cognitif le plus commun de l’enfance. Notre groupe à découvert que des mutations dans le gène SYNGAP1 sont une cause fréquente de déficience intellectuelle non-syndromique, qui compte pour 1-3% de l’ensemble des cas. À titre d’exemple, le syndrome du X fragile, qui est la cause monogénique la plus fréquente de déficience intellectuelle, compte pour environ 2% des cas. Plusieurs patients affectés au niveau de SYNGAP1 présentent également des symptômes de l’autisme et d’une forme d’épilepsie. Notre groupe a également montré que SYNGAP1 cause la déficience intellectuelle par un mécanisme d’haploinsuffisance. SYNGAP1 code pour une protéine exprimée exclusivement dans le cerveau qui interagit avec la sous-unité GluN2B des récepteurs glutamatergique de type NMDA (NMDAR). SYNGAP1 possède une activité activatrice de Ras-GTPase qui régule négativement Ras au niveau des synapses excitatrices. Les souris hétérozygotes pour Syngap1 (souris Syngap1+/-) présentent des anomalies de comportement et des déficits cognitifs, ce qui en fait un bon modèle d’étude. Plusieurs études rapportent que l’haploinsuffisance de Syngap1 affecte le développement cérébral en perturbant l’activité et la plasticité des neurones excitateurs. Le déséquilibre excitation/inhibition est une théorie émergente de l’origine de la déficience intellectuelle et de l’autisme. Cependant, plusieurs groupes y compris le nôtre ont rapporté que Syngap1 est également exprimé dans au moins une sous-population d’interneurones GABAergiques. Notre hypothèse était donc que l’haploinsuffisance de Syngap1 dans les interneurones contribuerait en partie aux déficits cognitifs et au déséquilibre d’excitation/inhibition observés chez les souris Syngap1+/-. Pour tester cette hypothèse, nous avons généré un modèle de souris transgéniques dont l’expression de Syngap1 a été diminuée uniquement dans les interneurones dérivés des éminences ganglionnaires médianes qui expriment le facteur de transcription Nkx2.1 (souris Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1). Nous avons observé une diminution des courants postsynaptiques inhibiteurs miniatures (mIPSCs) au niveau des cellules pyramidales des couches 2/3 du cortex somatosensoriel primaire (S1) et dans le CA1 de l’hippocampe des souris Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1. Ces résultats supportent donc l’hypothèse selon laquelle la perte de Syngap1 dans les interneurones contribue au déséquilibre d’excitation/inhibition. De manière intéressante, nous avons également observé que les courants postsynaptiques excitateurs miniatures (mEPSCs) étaient augmentés dans le cortex S1, mais diminués dans le CA1 de l’hippocampe. Par la suite, nous avons testé si les mécanismes de plasticité synaptique qui sous-tendraient l’apprentissage étaient affectés par l’haploinsuffisance de Syngap1 dans les interneurones. Nous avons pu montrer que la potentialisation à long terme (LTP) NMDAR-dépendante était diminuée chez les souris Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1, sans que la dépression à long terme (LTD) NMDAR-dépendante soit affectée. Nous avons également montré que l’application d’un bloqueur des récepteurs GABAA renversait en partie le déficit de LTP rapporté chez les souris Syngap1+/-, suggérant qu’un déficit de désinhibition serait présent chez ces souris. L’ensemble de ces résultats supporte un rôle de Syngap1 dans les interneurones qui contribue aux déficits observés chez les souris affectées par l’haploinsuffisance de Syngap1.
Intellectual disability affects 1-3% of the world population, which make it the most common cognitive disorder of childhood. Our group discovered that mutation in the SYNGAP1 gene was a frequent cause of non-syndromic intellectual disability, accounting for 1-3% of the cases. For example, the fragile X syndrome, which is the most common monogenic cause of intellectual disability, accounts for 2% of all cases. Some patients affected by SYNGAP1 also showed autism spectrum disorder and epileptic seizures. Our group also showed that mutations in SYNGAP1 caused intellectual disability by an haploinsufficiency mechanism. SYNGAP1 codes for a protein expressed only in the brain which interacts with the GluN2B subunit of NMDA glutamatergic receptors (NMDAR). SYNGAP1 possesses a Ras-GAP activating activity which negatively regulates Ras at excitatory synapses. Heterozygote mice for Syngap1 (Syngap1+/- mice) show behaviour abnormalities and learning deficits, which makes them a good model of intellectual disability. Some studies showed that Syngap1 affects the brain development by perturbing the activity and plasticity of excitatory neurons. The excitatory/inhibitory imbalance is an emerging theory of the origin of intellectual disability and autism. However, some groups including ours, showed that Syngap1 is expressed in at least a subpopulation of GABAergic interneurons. Therefore, our hypothesis was that Syngap1 happloinsufficiency in interneurons contributes in part to the cognitive deficits and excitation/inhibition imbalance observed in Syngap1+/- mice. To test this hypothesis, we generated a transgenic mouse model where Syngap1 expression was decreased only in GABAergic interneurons derived from the medial ganglionic eminence, which expresses the transcription factor Nkx2.1 (Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1 mouse). We showed that miniature inhibitory postsynaptic currents (mIPSCs) were decreased in pyramidal cells in layers 2/3 in primary somatosensory cortex (S1) and in CA1 region of the hippocampus of Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1 mice. Those results suggest that Syngap1 haploinsufficiency in GABAergic interneurons contributes in part to the excitation/inhibition imbalance observed in Syngap1+/- mice. Interestingly, we also observed that miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs) were increased in cortex S1 but decreased in CA1 region of the hippocampus. We further tested whether synaptic plasticity mechanisms that are thought to underlie learning and memory were affected by Syngap1 haploinsufficiency in GABAergic interneurons. We showed that NMDAR-dependent long-term potentiation (LTP) but not NMDAR-dependent long-term depression (LTD) was decreased in Tg(Nkx2,1-Cre);Syngap1 mice. We also showed that GABAA receptor blockade rescued in part the LTP deficit in Syngap1+/- mice, suggesting that a disinhibition deficit is present in these mice. Altogether, the results support a functional role of Syngap1 in GABAergic interneurons, which may in turn contributes to the deficit observed in Syngap1+/- mice.

L’excitotoxicité est un mécanisme physiopathologique majeur impliqué dans la pathogenèse de la déficience en thiamine (DT). Dans les régions cérébrales vulnérables à la DT, on observe une mort cellulaire induite par excitotoxicité dont l’origine semble être la conséquence d’une perturbation du métabolisme énergétique mitochondrial, d’une dépolarisation membranaire soutenue et d’une diminution de l’absorption du glutamate par les astrocytes suite à la diminution de l’expression des transporteurs EAAT1 et EAAT2. Il est clairement établi que le glutamate joue un rôle central dans l’excitotoxicité lors de la DT. Ainsi, la mise en évidence des mécanismes impliqués dans la diminution de l’expression des transporteurs du glutamate est essentielle à la compréhension de la physiopathologie de la DT. L’objectif de cette thèse consiste en l’étude de la régulation des transporteurs astrocytaires du glutamate et la mise au point de stratégies thérapeutiques ciblant la pathogenèse de l’excitotoxicité lors de l’encéphalopathie consécutive à la DT. Les principaux résultats de cette thèse démontrent des perturbations des transporteurs du glutamate à la fois dans des modèles animaux de DT et dans des astrocytes en culture soumis à une DT. La DT se caractérise par la perte du variant d’épissage GLT-1b codant pour un transporteur du glutamate dans le thalamus et le colliculus inférieur, les régions cérébrales affectées lors d’une DT, en l’absence de modification des niveaux d’ARNm. Ces résultats suggèrent une régulation post-transcriptionnelle de l’expression des transporteurs du glutamate en condition de DT. Les études basées sur l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des facteurs de transcription NFkB et de l’enzyme nucléaire poly(ADP)ribose polymérase-1 (PARP-1) démontrent que la régulation de l’expression du transporteur GLT-1 est sous le contrôle de voies de signalisation NFkB dépendantes de PARP-1. Cette étude démontre une augmentation de l’activation de PARP-1 et de NFkB dans les régions vulnérables chez le rat soumis à une DT et en culture d’astrocytes DT. L’inhibition pharmacologique du facteur de transcription NFkB par le PDTC induit une augmentation des niveaux d’expression de GLT-1, tandis que l’inhibition de PARP-1 par le DPQ conduit à l’inhibition de l’hyperactivation de NFkB observée lors de DT. L’ensemble de ces résultats met en évidence un nouveau mécanisme de régulation des transporteurs du glutamate par l’activation de PARP-1. L’accumulation de lactate est une caractéristique de la DT. Un traitement avec le milieu de culture d’astrocytes en condition de DT sur des cultures d’astrocytes naïfs induit une diminution de l’expression de GLT-1 ainsi qu’une inhibition de la capacité d’absorption du glutamate par les astrocytes naïfs. En revanche, l’administration de lactate exogène ne modifie pas le niveau d’expression protéique de GLT-1. Ainsi, des facteurs solubles autres que le lactate sont sécrétés par des astrocytes en condition de perturbation métabolique et peuvent potentiellement réguler l’activité des transporteurs du glutamate et contribuer à la pathogenèse du syncytium astroglial. En outre, la ceftriaxone, un antibiotique de la famille des β-lactamines, augmente de façon différentielle l’expression du variant-d’épissage GLT-1 dans le colliculus inférieur chez le rat DT et en culture d’astrocytes DT. Ces résultats suggèrent que la ceftriaxone peut constituer une avenue thérapeutique dans la régulation de l’activité des transporteurs du glutamate lors de DT. Pour conclure, la mort cellulaire d’origine excitotoxique lors de DT survient en conséquence d’une dysfonction mitochondriale associée à une perturbation du métabolisme énergétique cérébral. La modification de l’expression des transporteurs du gluatamate est sous le contrôle des voies de signalisation NFkB dépendantes du facteur PARP-1. De plus, l’inhibition métabolique et l’augmentation des sécrétions de lactate observées lors de DT peuvent également constituer un autre mécanisme physiopathologique expliquant la diminution d’expression des transporteurs de glutamate. Enfin, la ceftriaxone pourrait représenter une stratégie thérapeutique potentielle dans le traitement de la régulation de l’expression des transporteurs du glutamate et de la perte neuronale associés à l’excitotoxicité observée lors de DT.
Excitotoxicity has been implicated as a major pathophysiological mechanism in the pathogenesis of thiamine deficiency (TD). Excitotoxic-mediated cell death is localized in areas of focal vulnerability in TD and may occur as a consequence of impairment in mitochondrial energy metabolism, sustained cell membrane depolarization and decreased uptake of glutamate by astrocytes due to the loss of excitatory amino acid transporters, (EAAT1 and EAAT2). Over the years, a number of studies have identified glutamate as being a major contributor to excitotoxicity in the pathophysiology of TD. Thus, downregulation of astrocytic glutamate transporters resulting in excitotoxicity is a key feature of TD and understanding the regulation of these transporters is essential to understanding the pathophysiology of the disorder. The objective of the present thesis project was to examine the underlying basis of astrocytic glutamate transporter regulation during TD encephalopathy. Major findings of the studies presented in this thesis project provide evidence for glutamate transporter abnormalities in TD animal models and astrocyte cultures exposed to TD. TD results in the loss of the glutamate transporter splice variant-1b (GLT-1b) in vulnerable areas of brain, i.e. thalamus and inferior colliculus, with no significant alteration in the mRNA levels of the transporters, suggesting that glutamate transporter regulation under conditions of TD is a posttranscriptional event. Studies using a specific inhibitor of the transcription factor, Nuclear factor-kappa B (NF-κB) and a nuclear enzyme poly (ADP)ribose polymerase-1 (PARP-1) provided evidence for the regulation of GLT-1 by PARP-1 dependent NF-κB signalling pathways. The major findings of this study suggested an increase in the activation of PARP-1 and NF-κB molecule in the vulnerable areas of TD rat brain and TD astrocyte cultures. Pharmacological inhibition of NF-κB showed an increase in the levels of GLT-1, while inhibition of PARP-1 using a specific PARP-1 inhibitor, DPQ inhibited the increased activation of NF-κB that was observed during TD. Overall results of this finding provided evidence for a mechanism involving PARP-1 activation in the regulation of glutamate transporters. Given the increased lactate accumulation as a classical feature of TD, we studied the effect of soluble factors produced by astrocytes on glutamate transporter function. Treatment of naïve astrocyte cultures with TD conditioned media resulted in decreased levels of GLT-1 and inhibition of glutamate uptake capacity concomitant with a loss of mitochondrial membrane potential. Administration of exogenous lactic acid produced a similar reduction in glutamate uptake to that resulting from conditioned media. However, lactic acid treatment did not result in a change in GLT-1 protein levels. In addition, the pro-inflammatory cytokine TNF-α was shown to be increased in astrocytes treated with TD along with elevated levels of the phospho-IκB fragment, indicative of increased activation of NFκB. Inhibition of NFκB led to an amelioration of the decrease in GLT-1 that occurs in TD, along with recovery of glutamate uptake. Thus, soluble factors released from astrocytes under conditions of metabolic impairment such as lactate and TNF-α impairment appear to exert a regulatory influence on glutamate transporter function. Ceftriaxone, a β-lactam antibiotic, has the ability to differentially stimulate GLT-1b (splice-variant) expression in the inferior colliculus in TD rats and under in vitro conditions with TD astrocyte cultures. Thus, ceftriaxone may be a potential therapeutic strategy in the regulation of glutamate transporter function during TD. In summary, excitotoxic cell death in TD occurs as a consequence of mitochondrial dysfunction associated with cerebral energy impairment and abnormal glutamate transporter status. A major underlying mechanism for glutamate transporter abnormalities is mediated by PARP-1 dependent NF-κB signaling pathways. In addition, metabolic inhibition with substantial production of lactate and TNF-α may be perhaps another mechanism responsible for glutamate transporter downregulation in TD.

Le syndrome de Wernicke-Korsakoff (SWK) est un désordre neuropsychiatrique causé par la déficience en thiamine (DT). Dans la DT expérimentale comme dans le SWK, on observe une mort neuronale et des hémorragies dans certaines régions précises du diencéphale et du tronc cérébral. Les lésions diencéphaliques du SWK sont particulièrement sévères et entraînent souvent des séquelles amnésiques permanentes. Le lien entre la dysfonction métabolique induite par la DT et la mort neuronale n’est pas connu. Des rapports précédents ont démontré que la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) était altérée et ce, précédant l’apparition du dommage neuronal, suggérant un rôle critique de la dysfonction vasculaire. Les jonctions serrées (JS) interendothéliales, la base anatomique de la BHE, constituent un réseau moléculaire incluant l’occludin et les zonula occludens (ZOs). Cette thèse démontre une perte d’expression et une altération de la morphologie de ces protéines en relation avec la dysfonction de la BHE dans le thalamus de souris déficientes en thiamine, fournissant une explication pour la présence d’hémorragies. Le stress oxydatif peut entraîner des dommages directs aux protéines des JS et interférer avec leurs mécanismes de régulation. De plus, l’oxyde nitrique (NO) peut induire la métalloprotéinase matricielle-9 (MMP-9) impliquée dans la dégradation de ces protéines. L’endothélium vasculaire cérébral (EVC) semble être une source importante de NO dans la DT, l’expression de l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS) étant sélectivement induite dans les régions vulnérables. Le NO peut réagir avec les espèces réactives oxygénées et former du peroxynitrite, entraînant un stress oxydatif/nitrosatif endothélial. Les résultats présentés démontrent que la délétion du gène de eNOS prévient le stress oxydatif/nitrosatif cérébrovasculaire, l’extravasation des immunoglobulins G (IgGs) et l’altération de l’occludin et des ZOs dans le thalamus de souris déficientes en thiamine. De plus, cette délétion prévient l’induction de l’expression de MMP-9 dans l’EVC. Des résultats similaires ont été obtenus avec l’antioxydant N-acétylcystéine (NAC). Les mécanismes précis par lesquels les espèces réactives altèrent les protéines des JS sont inconnus. Caveolin-1, une composante majeure du caveolæ de l’EVC, est impliquée dans la régulation de l’expression des protéines des JS, et celle-ci est modulée par le stress oxydatif/nitrosatif; l’altération de l’expression de caveolin-1 a été récemment associée à la rupture de la BHE. Les résultats présentés démontrent que l’expression de caveolin-1 est sélectivement altérée dans l’EVC du thalamus de souris déficientes en thiamine, coïcidant avec la rupture de la BHE, et démontrent que la normalisation de l’expression de caveolin-1 par le NAC est associée avec l’atténuation du dommage à la BHE. Pris ensemble, ces résultats démontrent un rôle central du stress oxydatif/nitrosatif cérébrovasculaire, particulièrement celui provenant de eNOS, dans l’altération des JS de la BHE via des dommages directs et via l’induction de MMP-9 et de caveolin-1. Cette rupture de la BHE contribue par conséquent à la mort neuronale dans le thalamus, puisque la prévention des altérations cérébrovasculaires par la délétion du gène de eNOS et le NAC atténue significativement la mort neuronale. L’administration précoce d’antioxydants en combinaison avec la thiamine devrait donc être une considération importante pour le traitement du SWK.
Wernicke-Korsakoff syndrome (WKS) is a neuropsychiatric disorder caused by thiamine deficiency (TD). In experimental TD as in WKS, neuronal cell death and hemorrhages are observed in specific diencephalic and brainstem areas. Diencephalic lesions in WKS are especially severe and often lead to permanent amnesic symptoms. The link between TD-induced metabolic dysfunction and neuronal cell death is unknown. Previous reports have shown that blood-brain barrier (BBB) permeability was impaired and that this occurred prior to the onset of neuronal damage, suggesting a critical role for vascular dysfunction. Interendothelial tight junctions (TJs), the anatomical basis of the BBB, constitute a molecular network comprising occludin and zonula occludens (ZOs). This thesis shows a loss of expression and alterations in the morphology of these proteins in relation to BBB dysfunction in the thalamus of thiamine-deficient mice, providing an explanation for the presence of hemorrhages. Oxidative stress can lead to direct oxidative damage to TJ proteins and interfere with their regulation mechanisms. Also, nitric oxide (NO) can induce matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) involved in the degradation of these proteins. Cerebral vascular endothelium (CVE) seems to be an important source of NO in TD, since endothelial nitric oxide synthase (eNOS) expression is selectively induced in vulnerable areas. NO can react with reactive oxygen species and form peroxynitrite, leading to endothelial oxidative/nitrosative stress. Results have show that eNOS gene deletion prevents cerebrovascular oxidative/nitrosative stress, immunoglobulins G (IgGs) extravasation and occludin and ZOs alterations in the thalamus of thiamine-deficient mice. Also, eNOS gene deletion prevents the induction of MMP-9 in CVE. Similar results have been obtained with the antioxidant N-acetylcysteine (NAC). Precise mechanisms by which reactive species alter TJ proteins are unknown. Caveolin-1, a major component of CVE caveolæ, is involved in the regulation of TJ protein expression, and is modulated by oxidative/nitrosative stress; alteration in caveolin-1 expression has been recently associated with BBB breakdown. The present results show that caveolin-1 expression is selectively altered in CVE of the thalamus of thiamine-deficient mice, and show that normalization of caveolin-1 expression by NAC is associated with the attenuation of BBB damage. Taken together, these results demonstrate a central role for cerebrovascular oxidative/nitrosative stress, especially coming from eNOS, in BBB TJ protein alterations via direct damage and via induction of MMP-9 and caveolin-1. As a result, BBB breakdown contributes to neuronal cell death in the thalamus, since prevention of cerebrovascular alterations by eNOS gene deletion and NAC significantly attenuates neuronal cell death. Early administration of antioxidants combined with thiamine should therefore be an important consideration for the treatment of WKS.