Дисертації з теми "Cultures cellulaires – Biotechnologie"

Dans les années 2000, les grandes instances de sécurité sanitaire ont proposé l’initiative PAT (Process Analytical Technology) pour inciter les acteurs des milieux pharmaceutiques et agroalimentaires à améliorer leurs méthodes de production et de contrôle des produits manufacturés en utilisant de nouvelles techniques innovantes. Cette thèse s’inscrit dans cette démarche et propose d’exploiter la spectroscopie Raman, couplée aux outils chimiométriques pour le suivi en temps réel de cultures cellulaires à visée pharmaceutique. Acquis à l’aide d’une sonde optique à immersion, les spectres Raman in situ permettent de bénéficier d’une vue d’ensemble de l’état biochimique du bioprocédé au cours du temps. Ainsi, en appliquant des outils chimiométriques adéquats, il est possible de tirer profit des informations spectrales générées, notamment pour prédire les concentrations métaboliques au cours du temps. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse proposent tout d’abord de démontrer la nécessité d’optimiser l’acquisition spectrale et le traitement statistique des données pour différentes cultures cellulaires. Des modèles de régression robustes intégrant plusieurs sources de variabilité sont alors développés. Ils prennent en compte les variations inter-cultures, les changements de paramètres « procédés », le repositionnement des sondes optiques, voire le changement de lignée cellulaire. Enfin, ces mêmes spectres Raman sont utilisés pour développer des outils de contrôle statistique des procédés afin de détecter en temps réel des états anormaux comme par exemple la contamination ou encore pour prédire la concentration d’un produit d’intérêt comme les anticorps
In the 2000s, the major sanitary safety authorities proposed the Process Analytical Technology initiative (PAT) encouraging pharmaceutical and agri-food industries to enhance their own processes and the control of manufacturing products by using new and innovative techniques. This thesis is directly related to this framework and proposes to use Raman spectroscopy, coupled to chemometric tools, to monitor cell cultures for pharmaceutical purposes. The in situ Raman spectra, acquired using an optical immersion probe, allow getting an overview of the biochemical state of the process in time. Thus, by applying the appropriate chemometric methods, it is possible to obtain biological information from the spectra, including the prediction of metabolite concentrations throughout the cultures. The research work presented here proposes to highlight the necessity to optimize spectral acquisition and statistical preprocessing of the data provided by different cell cultures. Then, robust regression models are developed, taking into account different sources of variability, such as inter-cultures variations, process parameters changes, optical probe repositioning and cell line variations. Finally, these spectra are used to determine the antibody concentration during the culture and to develop new tools for statistical process control of the batches. In this way, any abnormal behavior such as contamination can be detected

Les bioprocédés industriels mettant en œuvre la culture de cellules animales sont devenus incontournables pour la production d’anticorps monoclonaux (AcM). Cependant, l'état physiologique des cellules et la qualité des AcM produits, en particulier leur glycosylation, sont tributaires des variations intervenant au cours du procédé. Il en découle des risques d'altération de l'efficacité et de la sûreté des AcM. C'est pourquoi, depuis quelques années, l'initiative Process Analytical Technology (PAT) encourage le développement du suivi en ligne de ces procédés, avec l'objectif de mieux les maîtriser et d'assurer la qualité finale des produits. Dans ce contexte, cette thèse propose des approches innovantes pour le suivi en ligne de procédés de culture de cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) en bioréacteur, basées sur l'utilisation de trois types de spectroscopies in situ (diélectrique, Raman, proche infrarouge(NIR)). Le premier chapitre présente une nouvelle démarche permettant de prédire en temps réel l'état physiologique des cellules, au travers de la vitesse spécifique de croissance cellulaire (μ). A partir de la mesure en ligne de la permittivité grâce à la spectroscopie diélectrique, la µ a été calculée en temps réel, permettant de détecter le moment critique correspondant au moment où μ diminue. Comparée à une démarche hors ligne, l'utilisation de cette méthode pour le pilotage de cultures en mode recharge-récolte, permet d’assurer à la fois la quantité et la qualité de glycosylation des AcM. Le second chapitre aborde l'utilisation des spectroscopies NIR et Raman in situ combinées à des méthodes chimiométriques. Les performances de ces deux spectroscopies ont été comparées en parallèle. Des modèles en ligne ont été développés pour prédire la concentration de différents paramètres (cellules viables, glucose, lactate, glutamine, ions ammonium, anticorps). L'évaluation de ces modèles par facteurs de mérite (FOM), a révélé certains avantages de la spectroscopie Raman. La combinaison de ces deux spectroscopies par diverses stratégies de fusion de données a été également évaluée. Dans le troisième chapitre, l'intérêt de la spectroscopie Raman a été démontré pour le suivi en ligne, non seulement, de la concentration, mais aussi, de la glycosylation des AcM. Des modèles ont été développés pour la prédiction en ligne, à la fois, de la macro-hétérogénéité (sites de glycosylation), et de la micro-hétérogénéité (structures glycanniques) de la glycosylation des AcM dans le cas de cultures en mode discontinu et recharge-récolte. Le dernier chapitre a utilisé les spectroscopies NIR et diélectrique, en les intégrant à un « capteur logiciel » combinant des équations de bilans de matière. Ce « capteur logiciel », mis en œuvre au cours d'une culture en mode semi-continu pour le contrôle automatique du débit d'alimentation, a conduit à une augmentation de la productivité du procédé ainsi qu'à une meilleure glycosylation des AcM produits
Bioprocesses of mammalian cell culture have become essential for the production of therapeutic recombinant proteins, such as monoclonal antibodies (mAb). However, the physiological state of the cells and the quality of the mAb produced, in particular their glycosylation, may vary during the process, and may lead to the alteration of the safety and efficacy of the final product. Consequently, the Process Analytical Technology (PAT) initiative has encouraged the development of online monitoring techniques, with the aim to better control the process and ensure the quality of the final product. In this context, this thesis proposes innovative approaches for online monitoring of CHO (Chinese Hamster Ovary) cells bioreactor cultures, by using three types of in situ spectroscopic measurements (dielectric, Raman, near infrared (NIR)). The first chapter presents a novel approach to predict in real-time one of the major cell physiological state parameters, the specific growth rate (µ). Based on online permittivity measured by in situ dielectric spectroscopy, the cell concentration was estimated and µ was calculated in real-time, making possible to detect the critical moment when µ begins to decrease significantly. Compared to an offline approach, this online approach allowed to maintain the cells in a stable physiological state, ensuring the glycosylation of the mAb produced in feed-harvest cultures. The second chapter shows the use of in situ NIR and Raman spectroscopies combined with chemometric methods. For the first time, the performances of these two spectroscopies were compared in parallel in the same cultures. Online models were developed to predict in real-time the concentration of different parameters (viable cells, glucose, lactate, glutamine, ammonium ions and antibodies). The evaluation of these models by the multivariate Figures of Merit (FOM) revealed some of the advantages of Raman spectroscopy. The combination of the two spectroscopies by various data fusion strategies has also been evaluated. In the third chapter, the interest of Raman spectroscopy for the online monitoring of both the quantity and the glycosylation of the mAb was demonstrated. Models were developed for online prediction of both macroheterogeneity (glycosylation site occupancy) and microheterogeneity (glycan structures) of mAb glycosylation in batch and feed-harvest cultures. The last chapter used models previously developed for NIR and dielectric spectroscopies, to integrate into a “soft sensor” by combining with cell metabolic and mass balance equations. This “soft sensor”, implemented in a fed-batch cell culture for the automatic control of the feed rate, leads to an increased mAb productivity and better mAb glycosylation

Les bioprocédés mettant en œuvre la culture de cellules animales sont devenus incontournables pour l'obtention de bioproduits thérapeutiques. Il reste cependant essentiel de réussir à mieux les prédire, les optimiser et les contrôler. Ceci nécessite, en particulier, le développement de nouveaux outils expérimentaux et méthodologiques permettant notamment l'analyse en ligne de paramètres liés, soit aux cellules soit aux protéines recombinantes produites. Ainsi, pour répondre à ce défi, la directive PAT (Process Analytical Technology) préconise de développer des méthodologies de suivi en ligne des procédés pour leur conduite en temps réel, notamment grâce aux méthodes spectroscopiques. A l'heure actuelle, le suivi en ligne de ces procédés reste assuré par des méthodes simples ne reflétant pas la complexité du catalyseur biologique. Dans ce contexte, ce sujet se propose de relever le défi de l'identification, par spectroscopies en ligne, de paramètres fonctionnels de cellules animales CHO (Chinese Ovarian Cell) productrices d'anticorps monoclonaux (AcM). Dans un premier chapitre, l'étude des milieux de culture a été évoquée afin de définir un environnement optimal pour la production des AcM par les cellules animales. Le développement de modèles de prédiction performants est abordé sous deux angles : le deuxième chapitre traite de l'analyse des prétraitements des données spectrales obtenues en temps réel à partir des capteurs spectroscopiques (spectroscopie Raman), puis l'étude des régressions utilisées est abordée au chapitre III. A partir de ces dernières, la prédiction de paramètres plus complexes, tels que la vitesse spécifique de croissance µ ou le rendement métabolique YX/S ont pu être calculés de façon précise. Les résultats obtenus à partir de ces deux chapitres ont été combiné dans le chapitre IV. Les différents modèles développés y sont comparés à l'aide de facteurs de mérite reflétant leur fiabilité. Enfin, à l'aide du modèle optimal, il a été possible de piloter en temps réel l'alimentation de bioréacteurs. Le dernier chapitre présente les résultats obtenus de ces expériences en mode semi-continu et montre une réelle avancée pour le pilotage de bioprocédés en vue d'assurer le maintien des caractéristiques optimales pour les performances du procédé
Bioprocesses implementing animal cell culture have become essential for obtaining therapeutic bioproducts. However, it remains essential to better predict, optimize and control them. This requires, in particular, the study of new experimental and methodological tools allowing in particular the on-line analysis of related parameters, either to the cells or to the recombinant proteins produced. Thus, to meet this challenge, the PAT (Process Analytical Technology) directive recommends developing methodologies for on-line monitoring of processes for their conduct in real time, in particular by means of spectroscopic methods. In this context, this subject proposes to take up the challenge of identifying, by in-line spectroscopies, functional parameters of CHO (Chinese Ovarian Cell) animal cells producing monoclonal antibodies (mAbs). In the first chapter, the study of culture media was discussed in order to define an optimal environment for the production of mAbs by animal cells. The development of efficient prediction models is discussed from two angles: the second chapter deals with the analysis of the preprocessing of spectral data obtained in real time from spectroscopic sensors (Raman spectroscopy), then the study of the regressions used is discussed in chapter III. From the latter, the prediction of more complex parameters, such as the specific growth rate µ or the metabolic yield YX/S could be calculated accurately. The results obtained from these two chapters have been combined in chapter IV. The different developed models are compared there with the help of factors of merit reflecting their reliability. Finally, with the help of the optimal model, it was possible to control the feeding of bioreactors in real time. The last chapter presents the results obtained from these experiments in semi-continuous mode and shows a real progress for the closed-loop control of bioprocesses in order to ensure the maintenance of the optimal characteristics for the process performances

L’urbanisation et la mondialisation sont des phénomènes de société qui multiplient et complexifient les sources de pollution. Parmi elles, la pollution atmosphérique impacte notablement la santé humaine à l’échelle mondiale de par son caractère transfrontière. L’appareil respiratoire est une voie d’absorption de nombreux xénobiotiques, sous forme de gaz, d’aérosols ou de nanoparticules. Une fois dans les voies respiratoires, les substances inhalées sont susceptibles d’interagir avec les cellules pulmonaires. Les mécanismes par lesquels des xénobiotiques inhalés induisent des dommages pulmonaires sont complexes, notamment en raison de l’hétérogénéité cellulaire des poumons. En raison de cette complexité, les modèles animaux constituent un outil de référence pour les études toxicologiques prédictives, cependant, dans le contexte européen de réduction de l’expérimentation animale (REACH, et les règles 3R), le développement de méthodes alternatives fiables est devenu une nécessité. Les modèles in vitro sont de bons candidats car plus simple et moins couteux à mettre en oeuvre que les modèles vivo et permettent de travailler avec des cellules ou des tissus d’origine humaine ce qui contribue à améliorer la pertinence des résultats. Cependant, l’extrapolation limitée du vitro au vivo est souvent liée à un manque de complexité des modèles, notamment en raison de l’absence de communication inter-organes. Les technologies des multi-organes sur puce cherchent à surmonter ces limitations en connectant plusieurs organoïdes métaboliquement actifs au sein d’un même circuit de culture afin de reproduire des interactions de type systémiques. Dans ce contexte, nous décrivons un modèle permettant de connecter in vitro, par le biais de la microfluidique, une barrière pulmonaire (voie d’entrée des xénobiotiques inhalés) à un organe détoxifiant tel que le foie, afin d’évaluer la toxicité liée à un stress inhalatoire de façon plus systémique. Cette approche permet de considérer la biotransformation des composés inhalés et l’interaction inter-organes comme possible modulateurs de la toxicité. Le projet étant dans les premières phase de développement, la robustesse expérimentale était au coeur du projet. L’objectif principal était de prouver qu’une substance modèle était capable de transiter dans le dispositif, au travers des deux compartiments tissulaires, afin de pouvoir étudier la dynamique inter-organes poumon/foie en condition de stress xénobiotique. Le projet a été articulé en trois phases expérimentales : - Caractérisation des réponses biologiques spécifiques aux tissus pulmonaire et hépatique en réponse à un stress. La viabilité, la fonctionnalité et les activités métaboliques des monocultures ont été évaluées après exposition à une substance modèle. - Adaptation et préparation des monocultures aux conditions de co-culture afin de préserver la viabilité et la fonctionnalité des tissus. - Les compartiments pulmonaire et hépatique ont été cultivés jointement dans un circuit de culture microfluidique fermé. La co-culture a été exposée à une substance modèle à travers la barrière pulmonaire afin d’imiter un mode d’exposition inhalatoire. Les paramètres de viabilité et de fonctionnalité des tissus ont été évalué post-culture afin de mettre en évidence quelconque phénomène d’interaction inter-organe. La caractérisation du modèle de co-culture a été réalisé grâce à l’exposition d’un agent hépatotoxique de référence, largement étudié dans la littérature : l’acétaminophène aussi connu sous le nom de paracétamol (APAP). L’exposition à la barrière pulmonaire n’est pas physiologique mais permet d’observer quantitativement le passage et la circulation du xénobiotique à travers le dispositif car l’APAP interfère avec la viabilité et les performances métaboliques hépatique, permettant ainsi de vérifier que le compartiment hépatique peut avoir accès à l’exposition effectuée à travers la barrière pulmonaire
Urbanization and globalization are prevailing social phenomena that multiply and complexify the sources of modern pollution. Amongst others, air pollution has been recognized as an omnipresent life-threatening hazard, comprising a wide range of toxic airborne xenobiotics that expose man to acute and chronic threats. The defense mechanisms involved in hazardous exposure responses are complex and comprise local and systemic biological pathways. Due to this complexity, animal models are considered prime study models. However, in light of animal experimentation reduction (3Rs), we developed and investigated an alternative in vitro method to study systemic-like responses to inhalationlike exposures. In this context, a coculture platform was established to emulate interorgan crosstalks between the pulmonary barrier, which constitutes the route of entry of inhaled compounds, and the liver, which plays a major role in xenobiotic metabolism. Both compartments respectively comprised a Calu-3 insert and a HepG2/C3A biochip which were jointly cultured in a dynamically-stimulated environment for 72 hours. The present model was characterized using acetaminophen (APAP), a well-documented hepatotoxicant, to visibly assess the passage and circulation of a xenobiotic through the device. Two kinds of models were developed: (1) the developmental model allowed for the technical setup of the coculture, and (2) the physiological-like model better approximates a vivo environment. Based on viability, and functionality parameters the developmental model showed that the Calu-3 bronchial barrier and the HepG2/C3A biochip can successfully be maintained viable and function in a dynamic coculture setting for 3 days. In a stress-induced environment, present results reported that the coculture model emulated active and functional in vitro crosstalk that seemingly was responsive to high (1.5 and 3 mM) and low (12 and 24 μM) xenobiotic exposure doses. Lung/liver crosstalk induced modulation of stress response dynamics, delaying cytotoxicity, proving that APAP fate, biological behaviors and cellular stress responses were modulated in a broader systemic-like environment

Au cours des six dernières décennies, la culture cellulaire est devenue une pratique courante. Elle est un outil majeur de la recherche biologique pour la compréhension du vivant, l'étude de maladies et la découverte de nouveaux médicaments. Elle représente un outil très répandu dans de nombreuses industries étant impliquées dans la production de produits alimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques.Cependant, les cultures cellulaires en recherche et en industrie sont aujourd'hui confrontées à des limites et soulèvent des besoins à satisfaire. Elles sont toutes deux associées à des coûts élevés du fait des ressources nécessaires (cellules, réactifs, opérateurs qualifiés). Plus précisément, la culture en recherche est caractérisée par le faible débit des expériences, une variabilité importante et un risque de contamination due à la répétition d'opérations manuelles. De plus, les expériences de culture sont effectuées dans des conditions statiques et sur des modèles (cultures 2D, animaux...) relativement éloignés de la physiologie humaine. La culture cellulaire industrielle, quant à elle, a besoin de systèmes miniaturisés qui miment les procédés des bioréacteurs à grande échelle et qui offrent des possibilités de criblage plus élevés.Les systèmes de culture microfluidique représentent un outil prometteur pour résoudre ces problèmes et ces besoins. Le changement de comportement de la physique à petite échelle dans ces dispositifs permet de contrôler temporellement et spatialement le microenvironnement des cellules. Ce qui n'est pas possible avec des méthodes de culture classiques. Le degré d'automatisation et d'intégration permet une nette augmentation du nombre d'expériences par système et la réduction conséquente de la consommation de ressources. Ainsi, de nombreuses petites architectures 3D cellulaires cultivées dans des conditions dynamiques et à haut débit ont été réalisées et ont démontré leur capacité à recréer rapidement des environnements plus physiologiques. En ce qui concerne la culture industrielle, des cultures miniaturisées ont déjà montré leur capacité à reproduire les caractéristiques observées dans les macrobioreactors avec des possibilités de criblages élevées.Dans ce contexte, un bioréacteur microfluidique de paillasse, se conformant aux formats standards utilisés dans le laboratoire d'accueil, a été fabriqué avec succès au cours de cette thèse pour effectuer des cultures cellulaires en continu. Des solutions intégrées ont été mises au point pour fournir de façon continue les conditions adéquates pour la prolifération cellulaire (perfusion, régulation de température…). Des études ont également été menées afin d'automatiser la récolte des cellules avec pour but final de cultiver ces cellules sur du long terme dans le bioréacteur.Le système fabriqué garantit ainsi des conditions stériles pour les cultures sur un simple banc de laboratoire. En outre, ces cultures ont été réalisées de façon autonome sans utiliser un incubateur encombrant. Dans ces conditions, le bioréacteur permet de réaliser des cultures en continu de divers types cellulaires sur plusieurs jours: des cellules d'insectes ont été cultivées pendant 5 jours et des cellules de mammifère pendant 3 jours. En ce qui concerne les cultures de cellules de mammifère, une avancée majeure a été effectuée par rapport aux cultures réalisées dans les systèmes microfluidiques en utilisant comme support de culture des microporteurs (diam. : 175 µm).Bien que la culture de cellules sur microporteurs soit réalisée en routine dans l'industrie, aucun système de culture microfluidique autonome n'a encore intégré ce type de culture. Ce genre de miniaturisation est une avancée majeure pour des applications en bioprocédés où il devrait permettre de raccourcir et réduire les coûts associés au développement de bioproduits
Over the past six decades, cell culture has become a common practice. It is a major tool in biological research for the understanding of life science, such as the study of disease and the discovery of new drugs. It plays an important role in many industries since it is involved in the production of many food, cosmetic, and pharmaceutical products.However, Research and the industry are now facing some limits and are expressing needs to be addressed. They are both associated with high costs due to a large consumption of resources (cells, reagents, qualified operators). More specifically, cell culture in research is characterized by low throughput of experiments, important variability and risk of contamination due to the recurrent manual operations performed by operators. Additionally, experiments are performed in static conditions and on models (2D cultures, animals…) which poorly resemble the human physiology. Industrial cell culture needs miniaturized systems that mimic the large scale bioreactors and offer higher screening possibilities.Microfluidic cell culture systems represent a promising tool to address the aforementioned issues and needs. The change of physical behaviors at the small-scale in microfluidic devices allow controlling temporally and spatially the cell microenvironment, unattainable with conventional cell culture methods. The level of automation and integration allows the substantial increase of the number of experience per system and considerable reduction of resource consumption. Thus, many small cellular 3D architectures grown under dynamic conditions and in high-throughput have been performed and have demonstrated their ability to quickly re-create more physiological environments. Regarding the industrial culture, miniaturized cultures have already shown their ability to reproduce the characteristics of the culture observed in macrobioreactors with higher screening capabilities.In this framework, a benchtop microfluidic bioreactor, complying with the standard microfluidic platform and format used in the host laboratory, has been successfully fabricated to perform continuous cell cultures. Integrated solutions were developed to provide continuously the adequate conditions for cell proliferation (perfusion, thermal regulation…). Integrated cell harvest was also performed with the final goal to achieve long-term cell culture in the bioreactor.The fabricated system proved to guarantee sterile conditions for cell cultures on a regular lab bench. Moreover, these cultures were achieved autonomously without requiring a cumbersome incubator. In these conditions, the bioreactor demonstrated the possibility to perform continuous cell cultures of various cell types during several days: insects cells were cultured during 5 days and mammalian cells during 3 days. Regarding the mammalian cell cultures performed, a breakthrough has been achieved compared to the cultures performed in microfluidic systems since microcarriers (diam.:175 µm) were used as growth support.Although microcarrier cell culture is routinely performed in the industry, no autonomous microfluidic culture system has addressed this type of culture yet. Such a miniaturization is a major step forward for bioprocess applications where the need to develop scale-down bioreactors that mimic large scale operation has been clearly identified to shorten and reduce the costs associated to bioproduct development

Les glycosaminoglycanes (GAGs) sont des polymères de sucres linéaires, présents chez tous les animaux. Certaines bactéries pathogènes synthétisent également des polysaccharides identiques ou très similaires aux GAGs humains. Cette thèse a porté en particulier sur la synthèse de la chondroïtine sulfate et de l’héparosan qui font partie de cette famille de polysaccharides. L’intérêt pour ces deux GAGs est grandissant dans l’industrie pharmaceutique du fait des nombreuses applications médicales qu’ils pourraient permettre. La chondroïtine sulfate est d’ores et déjà extraite de tissus animaux ce qui peut engendrer des problèmes sanitaires, notamment des contaminations virales ou aux prions. En revanche, le procédé de production pour l’héparosan reste à mettre en place. Il est donc nécessaire de développer des procédés de production pour ces deux molécules. La synthèse enzymatique est une voie particulièrement prometteuse pour la production de la chondroïtine sulfate et de l’héparosan, et a fait l’objet de ce travail de thèse
Glycosaminoglycans (GAGs) are long linear polysaccharide chains, found in all animals. Some pathogenic bacteria also synthesize polysaccharides identical or similar to human GAGs. This thesis deals with chondroitin sulfate and heparosan syntheses, members of the GAGs family. There is a growing interest in these two GAGs in the pharmaceutical industry due to numerous potential applications they offer. Chondroitin sulfate is currently extracted from animal tissues which can lead to sanitary problems such as viral or prion contaminations. On the other hand, a production process still needs to be developed for heparosan. Therefore, it is necessary to develop new methods for the production of these two polymers. Enzymatic synthesis, which is a promising alternative for the production of chondroitin sulfate and heparosan, was the subject of this thesis

Cette étude a permis de mettre en évidence quelques paramètres physico-chimiques qui ont une influence sur la croissance cellulaire, le taux de reprise et la densité cellulaire à la confluence des cellules de lignées épithéliales de foie de rat propagées dans des boîtes de Cooper et dans des biogénérateurs dans des milieux contenant du sérum, sans sérum complétés par de l'albumine et totalement synthétique et aprotéique. La densité cellulaire inoculée, le type de microsupport utilisé et les conditions d'attachement des cellules affectent la croissance cellulaire dans les milieux contenant du sérum. Dans ce même milieu, les cellules synthétisent des facteurs qui agissent sur leurs propres mitoses déterminant la façon de renouveler les mileux dans les biogénérateurs pour que la croissance cellulaire soit maximum. Un système d'oxygénation composé d'un tube de silicone enroulé dans le biogénérateur de 2 L dans lequel peut circuler de l'air ou de l'oxygène permet un apport d'oxygène dissous efficace dans le milieu. Cet apport d'oxygène a pouir effet d'augmenter la densité cellulaire et de réduire la consommation de glucose et la production d'acide lactique par les cellules. Des effets favorables sur la croissance cellulaire ont été constatés en remplaçant dans le biogénérateur le milieu synthétique de base F10 de HAM par le MEM de DUBELCCO dans les conditions de culture sans sérum en présence d'albumine. Dans les conditions de culture sans sérum et sans protéine, cet effet favorable a été constaté aussi bien dans les boîtes de culture que dans les biogénérateurs. Pour induire l'attachement cellulaire dans ces deux conditions de culture sans sérum, l'utilisation de milieu usagé soit mélangé au milieu frais soit comme moyen de remplacement du sérum, pour le prétraitement des substratums a permis d'omettre l'addition des facteurs sériques et le prétraitement des surfaces de culture par du sérum. De même, la trypsine n'est pas nécessaire pour les repiquages dans les conditions de culture dans un milieu synthétique aprotéique dans les boîtes de Cooper car elle peut être remplacée par l'utilisation de citrate trisodique. Ce travail ouvre des perspectives à l'échelle industrielle, dans des conditions de culture économiquement rentables, de cellules dépendantes d'un support cultivées dans des milieux totalement dépourvu de sérum.

Des limitations nutritionnelles, provoquees par une diminution des concentrations en acide 2,4 dichlorophenoxyacetique et en ions phosphates, entrainent un ralentissement de croissance suffisant pour maintenir la stabilite du ploymere d'inclusion de cellules de catharanthus roseus. Simultanement, une stimulation de la synthese d'ajmalicine est observee. Dans ces conditions, l'immobilisation des cellules dans l'alginate stabilise leur activite metabolique sur une periode d'au moins 600 heures. La production specifique d'ajmalicine atteint alors 970mug/sec et est multipliee d'un facteur 50 par rapport a celle observee lors d'une culture sur milieu d'entretien. En reacteur continu, l'utilisation de cellules immobilisees a ete possible sur une duree de 2 mois. Le mecanisme d'excretion repond a une loi de diffusion simple. La productivite obtenue est faible mais elle peut etre amelioree par un abaissement de ph du milieu de culture qui entraine une modification de l'equilibre de diffusion. Des traitements de permeabilisation membranaire (mannitol, dimethylsufoxyde) n'augmentent la productivite du systeme que si la resultante entre leurs effets sur la repartition des metabolites entre les cellules et le milieu et sur les taux de biosynthese est positive

Alors que l’éthique et la loi poussent la recherche à plus de sécurité, ainsi qu’à une moindre utilisation des animaux, il est devenu crucial de développer des systèmes in vitro d’une plus grande pertinence. Depuis la fin du XXe siècle, plusieurs systèmes ont fait leur apparition pour tenter de pallier les difficultés rencontrées, et notamment les « organes-sur-puces » (organ-on-chip systems). Ces systèmes microfluidiques de culture cellulaire avancés permettant de recréer certaines fonctions tissulaires grâce au contrôle très précis des conditions du microenvironnement cellulaire. Malgré les avancées de la bioingénierie et l’amélioration de nos méthodes de culture in vitro, la discipline est jeune et de nombreux progrès restent à faire. Les travaux présentés ici détaillent le développement d’un organe-sur-puce incluant une membrane d'hydrogel déformable et dégradable, aux propriétés physico-chimiques proches de tissus mous tels que les poumons ou les intestins. Cette puce semble pertinente pour accueillir des tissus barrières, composés de plusieurs types cellulaires, organisés de part et d'autre, ainsi qu'au sein de cette barrière, souvent soumise à des stimuli mécaniques. Durant ce doctorat, plusieurs objectifs ont été atteints : - Concevoir et fabriquer un organe-sur-puce incluant un hydrogel biocompatible et déformable, ainsi qu’un système microfluidique permettant le contrôle indépendant du flux et de la déformation de la membrane d’hydrogel. - Caractériser la déformation subie par l’hydrogel. - Cultiver dans la puce des cellules intestinales, formant un épithélium structuré en trois dimensions, et caractériser sa perméabilité à des molécules de tailles variées
Modern day ethics and laws call for more safety and use of fewer animals in biomedical research. It became crucial to develop novel in vitro devices of higher relevance. Since the end of the twentieth century, several systems have been proposed by researchers in attempts to palliate the shortcomings of current systems. Notably, organs-on-chip systems are specifically tailored to recapitulate tissue functions in a manner that remains easily accessible for the experimenter. Despite the significant improvements that were brought during the last century to in vitro cell and tissue culture systems, the field of bioengineering is still young and much progress remains to be done. The work presented here details the development of an organ-on-chip that includes a biocompatible and actuatable hydrogel membrane, with controlled physico-chemical properties. Such chip is relevant when hosting barrier tissues, which are composed of several cell types, disposed on each side of a barrier, as well as within its bulk, and are often submitted to mechanical stimuli. During this PhD, several objectives have been attained. Notably, we: - Designed and produced an organ-on-chip including a biocompatible and actuatable hydrogel layer, as well as a microfluidic system allowing the independent control of both flow and actuation. - Characterized the deformation of the hydrogel layer. - Cultured intestinal cells within the chip, which formed a three dimensionally structure epithelium, and characterized its apparent permeability to molecules of varying sizes

La sequence ontogenetique de la rhizogenese transformee et les effets cellulaires induits par trois souches d'a. Rhizogenes (1855, 2659 et 8196) chez l'epicotyle de pois sont recherches. Apres inoculation par la souche 1855, on enregistre une large gamme de symptomes comparables a ceux produits par des auxines exogenes. Il s'agit de symptomes comparables a ceux produits par des auxines exogenes. Il s'agit de symptomes cytophysiologiques (hyperhydrie, synthese d'adn, fragmentations nucleaires), histologiques (cambiogenese, tracheogenese) et morphogenetiques (rhizogenese transformee aux points d'inoculation et non transformee dans les regions sous-jacentes aux inoculations). La sequence morphogenetique de la mise en place des racines transformees a ete etablie

Les sequences cis-regulatrices du gene de l'albumine de rat ont ete analysees par transfection transitoire de clones cellulaires d'hepatome de rat presentant differents phenotypes quant a l'expression de l'albumine, mais de meme origine histogenetique. Un fragment de 150 paires de bases en amont du site d'initiation de la transcription suffit a specifier l'expression du gene indicateur et cela uniquement dans les cellules dont le propre gene albumine est exprime. L'extinction selective de l'expression de l'albumine dans des hybrides entre cellules d'un clone differencie d'hepatome de rat et microcellule de fibroblaste de souris depend de la presence d'un chromosome specifique de souris dit "extincteur" de l'albumine. Cette extinction est imposee au promoteur specifique du gene albumine introduit dans les hybrides. Ce promoteur contient donc la (ou les) cible(s) d'une regulatrice

L’objectif de ce travail est l'élaboration d'outils d'estimation d'état simples d'emploi pour l'évaluation de la composition des milieux de culture cellulaires. La première partie concerne le développement d'un nouvel estimateur appelé observateur à base de bilans de matière construit sur le principe de l'observateur asymptotique. Il peut être appliqué à n'importe quel type de culture. Il ne nécessite aucun réglage. La possibilité de prendre en compte certaines lois cinétiques connues permet de le faire fonctionner avec un nombre restreint de mesures. La seconde partie traite de la mise au point d'une nouvelle variante du filtre de Kalman, le filtre de Kalman auto-ajustable. Le réglage du filtre de Kalman est délicat et peut conduire à des problèmes de stabilité de l'erreur d'estimation et de convergence des valeurs estimées vers les valeurs réelles. Le filtre de Kalman auto-ajustable assura la stabilité des erreurs d'estimations avec un nombre réduit de réglages. Les deux nouveaux observateurs ont été appliqués à trois cultures d'hybridomes productrices d'anticorps monoclonaux. À partir de deux mesures expérimentales (glucose et lactate déshydrogénase ou ammoniaque et lactate déshydrogénase), la composition du milieu de culture est évaluée par les deux techniques. L’observateur à base de bilans de matière a donné de bons résultats et ceux obtenus avec le filtre de Kalman auto-ajustable sont acceptables tant que l'on ne sort pas du domaine de validité du modèle

Cette thèse porte sur l’étude et la quantification des molécules sécrétées par des cellules mammifères, organisées sous forme de sphéroïdes 3D dans des gouttes microfluidiques.Le sécrétome joue un rôle prépondérant dans la régulation des communications entre cellules eucaryotes, et contribue à la réponse collective des cellules de l’organisme. Caractériser la diversité des protéines sécrétées par des populations de cellules est ainsi une clé pour relier leur phénotype à leurs fonctions sécrétoires. Au cours des deux dernières décennies, des solutions technologiques ont ainsi permis de quantifier séparément le sécrétome de cellules non-adhérentes individuelles. Ces technologies, qui ouvrent la voie vers des mesures multiplexées de plusieurs molécules sécrétées par un très grand nombre de cellules, sont cependant difficiles à transposer dans le cas de cellules ayant besoin d’un substrat physique pour survivre.Dans ce manuscrit, on commence donc par présenter la plateforme microfluidique utilisée au cours de la thèse pour la culture de cellules adhérentes sous forme d’agrégats 3D particuliers, appelés sphéroïdes. Dans cette plateforme, nous développons un premier test immunologique type ELISA pour la quantification de la cytokine inflammatoire IL-1β, en utilisant des billes fonctionnalisées par des anticorps spécifiques à cette cytokine. L’utilisation combinée de la microscopie de fluorescence et de l’analyse informatisée des images permet de relier un signal optique lié au test immunologique à une grandeur biologique, ici la concentration de cytokine. Dans une goutte de 400µm, la vitesse de diffusion des molécules concurrence la cinétique chimique du test immunologique : une part importante de la réflexion se voit donc dédiée à l’étude, expérimentale et théorique, de la capture des cytokines sur le substrat du test ELISA en goutte.On applique ce test immunologique à la sécrétion de sphéroïdes de cellules souches mésenchymateuses humaines hMSC. Ces cellules constituent une population hétérogène progénitrice de plusieurs types cellulaires, et démontrent une action trophique importante lorsqu’elles sont cultivées en 3D. Dans la plateforme microfluidique présentée, on mesure ainsi des sécrétions importantes d’IL-1β, mais aussi de la molécule-signal de l’angiogenèse VEGF. Un modèle numérique de réaction-diffusion permet de prédire les temps caractéristiques de capture par le test immunologique. En plus de mettre en évidence l’accumulation des molécules dans le temps, ce test révèle les effets d’un médicament non-stéroïdien sur la sécrétion de VEGF. Ces effets sur le sécrétome sont combinés à l’observation de la morphologie du sphéroïde, et à la mesure de sa production intracellulaire de VEGF.Les signaux associés à la production intra et extra-cellulaire présentent une large variabilité au sein d’un même répliqua biologique. Le dernier chapitre relie ces variabilités à celles de la population de cellules qui constituent nos sphéroïdes. Il semble exister un effet collectif à l’intérieur de l’agrégat qui dépasse la simple sommation des hétérogénéités cellulaires
This thesis presents some results about sécrétome quantification by 3D-organized mammalian cells. Secretome has a key role in cell-to-cell interactions, and ultimately contributes to collective cellular response. The characterization of individual diversity within a population for protein secretion is therefore required to better understanding the link between cellular phenotype and secretory functions. Researches of the last two decades have led to multiplexed and high-throughput methods for quantifying cellular secretion of anchorage-independent cells. But these methods are difficult to transpose to cells needing a physical substrate to adhere on. In this manuscript is presented a microfluidic platform that allows the culture of anchorage-dependent cells as a dense array of spheroids. In this platform, we developed an immuno-assay to quantify the presence of the cytokines IL-1β, based on antibody-grafted beads. Using fluorescence microscopy and image analysis, an optical signal read on micrometric beads is translated to a biological information on cytokine concentration. As diffusion times compete with reaction kinetics within our device, a theoretical study of cytokine transport and capture inside the droplet is developed.This immune-assay is tested on human mesenchymal stem cells spheroids. hMSCs constitute a cell population of progenitors of several cellular types of connective tissues and display important trophic functions while cultivated in 3D. In our microfluidic device, we demonstrated important secretions of IL-1β, but also of the angiogenesis chemokine VEGF. A numerical model of reaction-diffusion allows to predict characteristic times of cytokine capture by the immune-assay. In addition of evidencing VEGF accumulation over time, the assay unravels the effect of a non-steroidal drug on VEGF secretion.Signals associated with intra and extracellular production of VEGF by spheroids show a wide variability within a single biological replicate. The last chapter is therefore trying this variability with heterogeneities at the cell level, as there seems to be a collective effect within spheroids that goes beyond the simple summation of cellular features

L'organisme humain présente de nombreuses constantes de régénération tissulaires et c'est cette caractéristique essentielle qui maintient l'équilibre physiologique. Toutefois, l'existence de lésions importantes provoquée par un déséquilibre interne ou externe peut empêcher l'organisme de s'auto-régénerer. Dans ce cas, l'application des biomatériaux développés pour des applications biomédicales peuvent améliorer le processus de guérison. Pour les applications en tissus durs, les biomatériaux doivent posséder des propriétés similaires aux matrices naturelles tant sur le plan biologique que physico-mécanique. Dans les applications en bioingénierie osseuse, les composites à base de collagène (Col) et d'hydroxiapatite (HA) sont devenus tellement performant qu'ils peuvent être classifiés comme des matériaux biomimétiques. Cette thèse propose la production d'une matrice 3-D poreuse à base d'HA et de Col (50:50wt%). Ce composite réticulé par le glutaraldéhyde a été caractérisé par des différentes techniques et servira de support pour la culture cellulaire. Des cellules estromales ostéoprogénitrices ont été cultivées dans un environnement statique et dynamique (deux vitesse de flux) et leurs capacités de colonisation ainsi que leurs comportements d'adhésion, de prolifération, de différentiation seront observés. A travers les résultats de diffraction de rayons X et de spectroscopie infrarouge, il est possible d'affirmer la présence dans la matrice collagène d'une phase minérale peu cristalline constituée par de l'hydroxiapatite carbonatée du type-B déficiente en calcium. La viabilité cellulaire a été fortement influencée par les systèmes de culture au cours des 21 jours. Les résultats du système dynamique en haute vitesse montrent une excellente capacité du composite à supporter les processus cellulaires. Les cellules sont capables d'adhérer, de proliférer et de coloniser la matrice tridimensionnelle.

Le diadenosine tetraphosphate (ap**(4)a) est le principal produit de la reaction d'aminoacylation catalysee par certaines aminoacyl-trna synthetases. L'ap**(4)a est une molecule "signal" s'accumulant a l'interphase g1/5 du cycle cellulaire des cellules eucarydes declenchant ainsi la synthese du dna precedant la division cellulaire. Quantification du contenu cellulaire en ap**(4)a et en atp apres synchronisation des cellules (hepertome de rat, fibroblaste de souris) en culture par l'aphidicoline agent bloquant les cellules en phase s et par privation de serum qui arrete la croissance en mi-phase g. Mise au point d'un modele de reparation, dans les ovocytes ou les oeufs non fecondes de xenopus laevis, du plasmute pbr322 modifie par l'acetylaminofluorene. L'effet de l'ap**(4)a sur la reparation est etudie

Dans l'optique de la production industrielle de proteines recombinantes, l'utilisation de la levure saccharomyces cerevisiae, bien que presentant de nombreux avantages, est souvent limitee par la faible permeabilite de la paroi de ce micro-organisme vis-a-vis des solutes de grande taille. Pour etudier ce probleme, nous avons construit des souches de levure recombinantes exprimant l'alpha-galactosidase de saccharomyces uvarum, enzyme majoritairement periplasmique, qui nous a permis de mesurer des cinetiques d'excretion. A l'aide de cet outil, nous avons dans un premier temps caracterise le mecanisme de passage de l'alpha-galactosidase a travers la paroi en proposant un modele rendant compte de la variation de la permeabilite cellulaire en fonction de la vitesse de croissance. Puis dans un second temps, nous avons fait varier les conditions de culture pour identifier les determinants structuraux limitant cette permeabilite et pour tenter de maximiser la production d'enzyme excrete

Le retrovirus leucemogene murin f-mulv, competent pour la replication, entraine des leucemies myeloblastiques apres un temps de latence de plusieurs mois. L'infection de culture de cellules medullaires par ce virus entraine la transformation des cellules de la lignee myeloblastique apres une latence equivalente. En utilisant une sonde specifique du f-mulv, l'analyse du spectre d'integration des provirus dans les lignees obtenues in vitro a montre qu'il y a proliferation d'un clone cellulaire tres tot pendant le processus de leucemogenese. Une banque d'adn genomique a ete construite a partir d'une lignee ayant 5 provirus integres; les f-mulvs s'integrent preferentiellement dans 3 regions appelees fim-1, fim-2 et fim-3, fim-2 est la partie 5' de l'oncogene c-fms qui code pour le recepteur au csf1. L'integration d'un f-mulv dans la gene fim-2/cfms entraine sa surexpression sans apparente modification de structure. Role possible d'un recepteur a facteur de croissance physiologique dans un processus leucemogene

"Le phénomène de floculation des souches kluyveromyces lactis haploides est sous l'influence des facteurs nutritionnels et physicochimiques liés à l'environnement. Ce phénomène observe au milieu de la phase de croissance se produit entre le PH 4,0 et 4,5. La présence de glucose est indispensable pour l'apparition de la floculation, alors que le galactose et ses dérivés sont des inhibiteurs potentiels. Les ions CA**(2+) à 4 MM induisent une floculation optimale. Les ions MG**(2+) peuvent partiellement substituer les ions CA**(2+), mais les ions NA**(+) et K**(+) sont des antagonistes. Le mécanisme d'action des ions CA**(2+) sur la floculation est en relation avec leur capacité à se lier sur les phosphopeptidomannannes. Cette fixation se réalise très probablement sur les groupements carboxyles comme le montre l'incapacité des molécules de phosphopeptidomannannes modifiés chimiquement à fixer les ions CA**(2+). Une composante lectinique intervient aussi dans ce mécanisme de floculation. Cette composante ayant un poids moléculaire apparent de 70. 000 est localisée sur la surface cellulaire au niveau d'un récepteur ayant une configuration stéréochimique reconnaissant l'alpha -D-galactopyranose. Dans le mécanisme de floculation, cette "composante lectine" jouerait le rôle de ligand, par contre la partie polyosidique des phosphopeptidomannannes jouerait le rôle du récepteur et les ions CA**(2+) joueraient un rôle de cofacteur ou d'activateur. Les ions CA**(2+) sont reconnus aussi comme stabilisateurs des liaisons mannannes-lectine en se fixant sur les groupements carboxyles des parties peptidiques des phosphopeptidomannannes. "

Sous l'effet de glycopeptides extraits de parois du mycelium de (phytophtora parantica nicotianae) et appeles eliciteurs, les cellules de tabac en culture synthetisent de grandes quantites d'ethylene. L'etude de l'hormone aux differentes etapes de sa voie de biosynthese montre une stimulation rapide et transitoire de l'activite acc-synthase, vraisemblablement par synthese de novo de l'enzyme, entrainant l'augmentation du taux intracellulaire d'acc sans pour autant modifier celui du n-malonyl-acc. (. . . )

Les cellules du muscle squelettique peuvent subir une differenciation terminale en culture "in vitro" lorsque les myoblastes mononuclees fusionnent en myotubes multinuclees. Pour etudier les mecanismes impliques dans cette expression differentielle, des sequences d'adn complementaire (cdna) codant pour differentes proteines contractiles ont ete utilisees. La mise en evidence, dacumulatin d'arnm (proteins contractiles) au cours de cette cytodifferenciation suggere une regulation principalement au niveau transcriptionnel. Ces sondes cdna ont permis d'etudier l'accumulation d'arnm des chaines boucles de la myosine (mhc) au cours du developpement "in vivo" du muscle squelettique, ainsi que la localisation chromosomique des genes correspondant, dans le genome murin. En utilisant les techniques de transfection de cellules musculaire en culture, les auteurs ont montre que les regions situees s'en amont du site d'initiation de la transcription renferment des elements suffisants pour conferer une expression tissulaire specifique et regulee au cours de la differenciation des myoblastes

Confirmation de la carte genetique du camv et identification de 4 produits de transcription. Caracterisation des regions promotrices de type "tata". Construction d'un vecteur hybride par association de sequences virales strategiques a un plasmide bacterien et au gene de resistance a la kanamycine

Nous avons adopte une strategie, consistant en la modification qualitative et quantitative de la composition sterolique de plantes. Pour cefaire, nous avons traite des plantes a l'aide d'inhibiteurs de la biosynthese des sterols, possedant essentiellement deux cibles: la cycloeucalenol-obtusifoliol isomerase et la delta-huit-delta-sept-sterol isomerase. En agissant de la sorte, en bloquant diverses etapes de la biosynthese des phytosterols, nous accumulons de nouveaux sterols, en l'occurence des cyclopropylsterols. La molecule utilisee pour induire de telles modifications, est un fongicide systemique: le fenpropimorphe. Nous avons etudie le comportement de cette molecule en tant qu'inhibiteur chez des cellules animales (fibroblastes de souris) et chez des cellules vegetales (mais et ble)