Дисертації з теми "Culture cellulaire en 3 dimensions"

Environ 90% des candidats-médicaments échouent en phase clinique, pour des raisons d’efficacité ou de toxicité qui impliquent souvent le système nerveux central (SNC). Ce fort taux d’échec souligne un manque de pertinence des modèles expérimentaux utilisés en amont, dont les modèles in vitro de cellules humaines. En effet, ces derniers ne prennent pas en compte toute la complexité du SNC, où les neurones organisés en 3 dimensions (3D) interagissent avec leur microenvironnement composé de cellules, de facteurs solubles et des molécules de la matrice extracellulaire (MEC). Les objectifs de ce travail étaient i) d’étudier l’influence de ces trois composantes du microenvironnement sur les cellules neuronales dans des modèles cérébraux in vitro par imagerie cellulaire automatisée, et ii) de développer des modèles cérébraux in vitro plus pertinents pour évaluer les effets neurotoxiques ou thérapeutiques de molécules par criblage phénotypique, notamment dans le cadre de la maladie de Parkinson (MP).Dans un premier temps, la technologie BIOMIMESYS® Brain a été développée. Cette matrice à base d’acide hyaluronique permet de mimer la MEC et de cultiver des cellules cérébrales en 3D dans des plaques 96 puits. La sensibilité des cellules Luhmes, une lignée de neurones dopaminergiques, aux inducteurs de la MP a été étudiée : les cellules ont montré une sensibilité plus faible dans BIOMIMESYS® Brain qu’en 2 dimensions (2D). Cette différence a pu être expliquée par deux phénomènes : une rétention partielle des molécules toxiques dans la matrice, et un phénotype de neurone dopaminergique moins mature qu’en 2D. L’importance du microenvironnement cellulaire a ensuite été étudiée au travers d’une co-culture de cellules Luhmes et d’astrocytes primaires humains en 2D. Cette co-culture a ensuite été transposée dans la matrice BIOMIMESYS®, formant ainsi un modèle complexe incluant à la fois le microenvironnement glial et le microenvironnement matriciel.En parallèle, l’influence du microenvironnement moléculaire a été étudiée sur les cellules SH-SY5Y, une lignée cellulaire issue d’un neuroblastome, couramment utilisée pour évaluer la neurotoxicité de molécules. Dans cette étude, les 24 principaux milieux décrits dans la littérature pour différencier ces cellules en neurones ont été criblés. Les 3 conditions les plus différenciantes en matière de ralentissement de la prolifération cellulaire et de croissance des neurites ont été sélectionnées : l’acide rétinoïque, la staurosporine, et l’Adénosine Monophosphate cyclique (AMPc) associée à du supplément B21. L’expression de marqueurs protéiques neuronaux et la sensibilité des cellules à des composés de toxicités connues ont été mesurées, en 2D et en 3D dans BIOMIMESYS® Brain. La maturité neuronale et la sensibilité aux composés neurotoxiques différaient selon le milieu, en étant les plus hautes en milieu B21+AMPc. La culture en 3D modifiait aussi la réponse des cellules, avec une sensibilité plus faible comparée aux cellules cultivées en 2D.Cette thèse a mis en évidence que le microenvironnement des neurones, qui inclut la MEC, les cellules gliales et les facteurs solubles, modifie la réponse neuronale in vitro et devrait par conséquent être considéré avec attention dans la recherche académique comme industrielle, dès les étapes de criblage de nouveaux médicaments
About 90% of drug candidates fail in clinical trials, for efficacy- and toxicity-related reasons, which often involve the Central Nervous System (CNS). This high failure rate highlights a lack of relevance in experimental models used upstream, including human in vitro models. Indeed, they do not take into account the complexity of the CNS, in which neurons are organized in 3 dimensions (3D) and interact with their microenvironment, composed of cells, soluble factors and extracellular matrix (ECM). The objectives of this PhD were i) to study the influence of these three microenvironment components on neuronal cells in cerebral in vitro models by automatized cellular imaging, and ii) to develop more relevant cerebral in vitro models for phenotypic screening, to assess neurotoxic or therapeutic effects, in the frame of Parkinson’s Disease (PD).First, the BIOMIMESYS® Brain technology has been developed. This acid hyaluronic based-matrix allows the simulation of the ECM and a 3D culture of cerebral cells in 96-well plates. The sensitivity of Luhmes cells, a dopaminergic neuronal cell line, to PD inducers has been studied: the cells displayed a lower sensitivity in BIOMIMESYS® Brain compared to cells cultured in 2 dimensions (2D). This difference was explained by two phenomena: a partial retention of toxic molecules in the matrix, and a lower neuronal maturity compared to cells cultured in 2D.The importance of the cellular microenvironment has been studied through a co-culture of Luhmes cells and primary human astrocytes in 2D. This co-culture has then been transposed in BIOMIMESYS® matrix, to form a complex model including both the glial and the matricial microenvironments.In parallel, the influence of the molecular microenvironment has been studied on the SH-SY5Y cells, a cell line derived from a neuroblastoma, commonly used for neurotoxicity assessment. In this study, the 24 major differentiation media described in the literature to differentiate these cells into neurons have been screened. The 3 most differentiating conditions in terms of proliferation slowdown and neurite elongation have been selected: retinoic acid, staurosporine, and cyclic Adenosine Monophosphate (cAMP) combined to B21 supplement. The neuronal protein marker expression and the cell sensitivity to compounds of known-toxicity have been measured, in 2D and in 3D in BIOMIMESYS® Brain. Both maturity and sensitivity of these neurons varied according to the differentiation medium, and were higher in B21+cAMP. The 3D cell culture modified also the cell response, with a lower sensitivity of cells cultured in 2D.This PhD highlighted that the microenvironment of neurons, including the ECM, the glial cells and the soluble factors, can modify the neuronal response in vitro, and should thus be considered carefully in academic research and as early as possible in the drug discovery industrial process

Une tumeur est une structure hautement organisée en 3D, intégrant des relations entre les cellules et avec son environnement. Le remodelage de l'environnement par la tumeur et sa croissance dans un environnement restreint induisent un déséquilibre de l'homéostasie tissulaire et l'accumulation d'un stress mécanique au niveau de la tumeur. Il a été montré que ce stress mécanique est un paramètre important du développement tumoral qui influence, entre autre, la migration et la prolifération des cellules tumorales. Un des aspects majeurs du contrôle de la prolifération cellulaire est la régulation du cycle cellulaire. De nombreuses études montrent que le déroulement de la mitose, étape de division du cycle cellulaire, est régulée par les propriétés mécaniques de l'environnement cellulaire. Cependant, l'impact des contraintes mécaniques sur la progression en mitose a essentiellement été étudié sur des modèles de culture en monocouche et les conséquences induites sur le développement tumoral sont encore méconnues. Dans ce contexte, l'objectif de mes travaux est d'étudier l'impact des contraintes mécaniques sur la division cellulaire, dans un modèle tumoral multicellulaire 3D, le sphéroïde. Ce modèle mime l'organisation multicellulaire et l'hétérogénéité cellulaire telles qu'elles existent in vivo dans des microrégions tumorales. Afin de mimer un environnement confiné, des microsdispositifs ont été fabriqués pour restreindre la croissance et contraindre mécaniquement les sphéroïdes. Ces conditions expérimentales nous ont permis de démontrer que la contrainte mécanique altère la division des cellules au sein des sphéroïdes. L'étude de la dynamique de progression en mitose de sphéroïdes contraints dans un dispositif en agarose adapté à l'imagerie en temps réel, a révélé un délai en prométaphase induit par la contrainte mécanique, probablement du à un défaut transitoire de mise en place du fuseau bipolaire et impliquant le cytosquelette d'actomyosine. Ce défaut ne semble pas induire un défaut d'orientation préférentiel de l'axe de division observé dans les sphéroïdes. De plus, ces résultats montrent qu'en condition de croissance en présence d'un stress mécanique, des traitements déstabilisant le cytosquelette d'actomyosine n'induisent pas d'altération de la mitose, suggérant que des voies de signalisation permettant d'éviter les erreurs de progression en mitose soient activées. L'ensemble de ces résultats suggèrent que la contrainte mécanique induite par la croissance progressive des sphéroïdes dans un environnement confiné ralentit la progression en mitose. Ce ralentissement peut être responsable d'erreurs de ségrégations des chromosomes induisant une augmentation de l'instabilité génétique et une hétérogénéité cellulaire. Cette hétérogénéité est caractéristique des tumeurs et souvent responsable de l'efficacité limitée des stratégies thérapeutiques actuelles. Les travaux réalisés viennent enrichir les connaissances de la réponse des cellules tumorales à leur environnement mécanique tel qu'il existe in vivo et ses conséquences sur le développement tumoral. Il permet aussi d'identifier les caractéristiques importantes des paramètres mécaniques à prendre en compte pour définir l'efficacité des traitements, et ouvre de nouvelles perspectives de thérapies antitumorales
A tumor micro-region consists of a heterogeneous cancer cell population organized in a 3D structure in which cell growth is influenced by interaction with the microenvironment. Changes in mechanical homeostasis within tissues are observed during tumor growth, leading to high pressure and tension forces within the growing tumor. Those changes in mechanical properties of the microenvironment participate to tumor development by influencing, amongst others, proliferation and migration of tumor cells. One important aspect of the control of proliferation is the regulation of the cell cycle. Many studies have demonstrated that mitosis progression, the division process of cell cycle, is not only biochemically regulated, but also mechanically regulated. However, the impact of mechanical cues on mitotic progression has essentially been documented using 2D monolayer-based models and very little is known about the consequences of mechanical stress on cell division within tumors. In this context, my goal was to investigate the impact of mechanical stress on cell division in MultiCellular Tumor Spheroids (MCTS), an in vitro model that mimics 3D cell organization and heterogeneity found in tumor microregions in vivo. We first induced mechanical stress on MCTS by restricting their growth in a confined environment. We demonstrated that mechanical stress impairs cell division. The study of the dynamics of mitosis progression within MCTS mechanically constrained in agarose, showed that mechanical stress induces a delay in prometaphase. This delay may be due to a transient defect in spindle assembly, and possibly implies actin filament dynamics. This defect in spindle assembly does not seem to induce a preferential orientation deviation of the division axis of cells within spheroids. Futhermore, we showed that in this mechanical stressed condition, drugs destabilizing the actomyosin cytoskeleton do not alter mitosis anymore, suggesting that signaling pathways could be activated and avoid aberrant mitosis progression. Altogether these results suggest that mechanical stress induced by progressive confinement of growing spheroid could slow down mitotic progression. However, a defect in mitosis progression could lead to chromosomes missegregation, responsible for increased genomic instability and cellular heterogeneity. This genetic heterogeneity characteristic of tumors is one of the major reasons for the limited efficiency of current therapeutic strategies. Mechanical stress might also induce the activation of specific pathways able to bypass the effect of certain drugs. This study paves the way for future research to a better understanding of the tumor cell response to mechanical cues similar to those encountered during in vivo tumor development. It could contribute to defining important characteristics of mechanical parameters of tumor on drug efficiency and open new perspectives in anti-tumor therapy

Traumatic brain injury (TBI) results from a physical insult to the head and often results in temporary or permanent brain dysfunction. However, the cellular pathology remains poorly understood and there are currently no clinically effective treatments. The overall goal of this work was to develop and characterize a novel three-dimensional (3-D) in vitro paradigm of neural trauma integrating a robust 3-D neural co-culture system and a well-defined biomechanical input representative of clinical TBI. Specifically, a novel 3-D neuronal-astrocytic co-culture system was characterized, establishing parameters resulting in the growth and vitality of mature 3-D networks, potentially providing enhanced physiological relevance and providing an experimental platform for the mechanistic study of neurobiological phenomena. Furthermore, an electromechanical device was developed that is capable of subjecting 3-D cell-containing matrices to a defined mechanical insult, with a predicted strain manifestation at the cellular level. Following independent development and validation, these novel 3-D neural cell and mechanical trauma paradigms were used in combination to develop a mechanically-induced model of neural degeneration and reactive astrogliosis. This in vitro surrogate model of neural degeneration and reactive astrogliosis was then exploited to assess factors influencing neural stem cell (NSC) survival and integration upon delivery to this environment, revealing that specific factors in an injured environment were detrimental to NSC survival. This work has developed enabling technologies for the in vitro study of neurobiological phenomena and responses to injury, and may aid in elucidating the complex biochemical cascades that occur after a traumatic insult. Furthermore, the novel paradigm developed here may provide a powerful experimental framework for improving treatment strategies following neural trauma, and therefore serve as a valid pre-animal test-bed.

L'organisme humain présente de nombreuses constantes de régénération tissulaires et c'est cette caractéristique essentielle qui maintient l'équilibre physiologique. Toutefois, l'existence de lésions importantes provoquée par un déséquilibre interne ou externe peut empêcher l'organisme de s'auto-régénerer. Dans ce cas, l'application des biomatériaux développés pour des applications biomédicales peuvent améliorer le processus de guérison. Pour les applications en tissus durs, les biomatériaux doivent posséder des propriétés similaires aux matrices naturelles tant sur le plan biologique que physico-mécanique. Dans les applications en bioingénierie osseuse, les composites à base de collagène (Col) et d'hydroxiapatite (HA) sont devenus tellement performant qu'ils peuvent être classifiés comme des matériaux biomimétiques. Cette thèse propose la production d'une matrice 3-D poreuse à base d'HA et de Col (50:50wt%). Ce composite réticulé par le glutaraldéhyde a été caractérisé par des différentes techniques et servira de support pour la culture cellulaire. Des cellules estromales ostéoprogénitrices ont été cultivées dans un environnement statique et dynamique (deux vitesse de flux) et leurs capacités de colonisation ainsi que leurs comportements d'adhésion, de prolifération, de différentiation seront observés. A travers les résultats de diffraction de rayons X et de spectroscopie infrarouge, il est possible d'affirmer la présence dans la matrice collagène d'une phase minérale peu cristalline constituée par de l'hydroxiapatite carbonatée du type-B déficiente en calcium. La viabilité cellulaire a été fortement influencée par les systèmes de culture au cours des 21 jours. Les résultats du système dynamique en haute vitesse montrent une excellente capacité du composite à supporter les processus cellulaires. Les cellules sont capables d'adhérer, de proliférer et de coloniser la matrice tridimensionnelle.

Le cancer du sein est une maladie complexe et difficile à caractériser. Parmi les différents sous-types moléculaires, les tumeurs du sein Triple-Négatives (TN) sont particulièrement agressives et de mauvais pronostic. Elles sont caractérisées par une absence d’expression des récepteurs aux œstrogènes (ER), à la progestérone (PR), l’absence de surexpression du récepteur Human Epidermal growth factor 2 (HER2) et de fréquentes mutations sur les gènes BRCA1/2 (profil « BRCAness »). En absence de thérapies ciblées efficaces, de nombreux traitements ciblés notamment les inhibiteurs de poly-ADP-ribose polymérases (anti-PARPs) sont actuellement en cours de développement, en recherche préclinique et clinique. Basés sur le principe de létalité synthétique, les anti-PARPs ciblent les propriétés BRCAness des tumeurs TN. Dans ce contexte, ces travaux de recherche ont été orientés sur le développement d’outils diagnostics afin d’optimiser l’efficacité des anti-PARPs sur des tumeurs TN. Pour ce faire, dans un premier temps, des cultures cellulaires en 3D via la technique Liquid Overlay ainsi que des tests de cytotoxicités associés ont été développés, à partir des lignées cellulaires MDA-MB-231 et SUM1315 de phénotype TN. Ces deux modèles de sphéroïdes ont ensuite été optimisés/normalisés dans un milieu de culture synthétique intitulé OPTIPASS (BIOPASS). Dans un deuxième temps, l’efficacité d’un co-traitement combinant l’anti-PARP1 Olaparib à faibles et à fortes doses et la radiothérapie fractionnée (5x2 Gy) a été modélisée sur les deux lignées MDA-MB-231 et SUM1315, en conditions 2D et 3D. Ces expériences ont clairement mis en évidence un effet potentialisateur de l’Olaparib sur la radiothérapie (i) en présence de faibles doses de cet anti-PARP (5 µM ou inférieur) (ii) à long terme et (iii) en présence d’un fractionnement maximum (5x2 Gy). De plus, les lignées tumorales TN étudiées présentaient des différences de sensibilité vis-à-vis du co-traitement. Ainsi, une analyse transcriptomique in silico a mis en évidence des profils très différents de ces lignées hautement métastatiques et très agressives. Notamment, la lignée SUM1315 semblait présenter un engagement neuronal, suggérant son origine métastatique cérébrale. Ces résultats encourageants pourraient ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement des métastases cérébrales de tumeurs mammaires TN, très fréquentes chez ce sous-type. Dans un troisième temps, afin de mieux caractériser le mode d’action de l’Olaparib sur ces modèles de sphéroïdes, un dérivé fluorescent de l’Olaparib, l’Ola-FL, a été synthétisé et caractérisé. L’analyse de la pénétration et de la distribution de l’Ola-FL au sein des sphéroïdes MDA-MB-231 et SUM1315 a mis en évidence une distribution rapide et homogène du composé ainsi que sa persistance après 3h d’incubation, dans toute la profondeur des sphéroïdes et notamment dans les zones hypoxiques centrales. Enfin, l’analyse de la co-expression de deux pompes Multidrug Resistance (MDR) majeures, la MRP7 et la P-gp après le traitement des deux lignées TN avec l’Olaparib, a mis en évidence sur les cultures 2D, une expression de type relai de la MRP7 et la P-gp. Sur les sphéroïdes traités avec une faible dose d’Olaparib à long terme, une expression basale de la MRP7 et une surexpression de la P-gp ont été détectées, au sein des cellules résiduelles périphériques des sphéroïdes. Ces résultats mettent clairement en évidence l’implication des pompes d’efflux dans les mécanismes de résistances à l’Olaparib, dans ces tumeurs agressives. L’ensemble des résultats issus de la modélisation de l’action de l’Olaparib sur des sphéroïdes MDA-MB-231 et SUM1315 laissent supposer sa plus grande efficacité à faible dose et à long-terme, notamment dans les zones hypoxiques des sphéroïdes, probablement aussi à l’origine de son effet potentialisateur avec la radiothérapie
Breast cancer is a very complex and heterogeneous disease. Among the different molecular subtypes, Triple-Negative (TN) breast cancers are particularly aggressive and of poor prognosis. TN tumours are characterized by a lack of estrogen receptors expression (ER), progesterone receptors expression (PR), the absence of Human Epidermal growth factor receptor 2 overexpression (HER2) of the frequent mutations on BRCA1 / 2 genes ("BRCAness" phenotype). In the absence of effective targeted therapies, many targeted therapies including poly-ADP-ribose polymerase inhibitors (anti-PARPs) are currently under development in preclinical and clinical studies. Based on the synthetic lethality concept, the anti-PARPs specifically target the BRCAness properties of TN tumors. In this context, these works were focused on the development of diagnostic tools for the optimization of TN tumours treatment with anti-PARPs. For this, firstly, 3D cell cultures formed with the Liquid Overlay technique as well as associated cytotoxicity tests were developed, from the TN breast cancer cell lines MDA-MB-231 and SUM1315. These two spheroid models were then optimized and standardized in a synthetic culture medium called OPTIPASS (BIOPASS). Secondly, the efficacy of a co-treatment combining anti-PARP1 Olaparib at low and high doses and fractioned radiotherapy (5x2 Gy) was analyzed on the two cell lines MDA-MB-231 and SUM1315 cultured in 2D and 3D conditions. These experiments clearly demonstrated a potentiating effect of Olaparib on radiotherapy (i) in presence of low doses of this anti-PARP (5 μM or inferior) (ii) at long term and (iii) in presence of the maximum fractionation (5x2 Gy). In addition, these two TN cell lines showed a heterogeneous sensitivity to the co-treatment. Thus, an in silico transcriptomic analysis revealed very different profiles of these highly metastatic and highly aggressive cell lines. Notably, the SUM1315 cell line presented a neuronal commitment, suggesting its cerebral metastatic origin. These promising results could open up new perspectives for the treatment of TN tumours brain metastases, which are very common in this subtype. Thirdly, in order to better characterize the mode of action of Olaparib on these spheroid models, a fluorescent derivative of Olaparib, Ola-FL, was synthesized and characterized. The analysis of Ola-FL penetration and distribution in MDA-MB-231 and SUM1315 spheroids showed a rapid and homogeneous distribution of the compound as well as its persistence after 3h of incubation, in all the depth of the spheroids and especially in the central hypoxic zones. Finally, the analysis of the co-expression of two major Multidrug Resistance (MDR) pumps, MRP7 and P-gp after the treatment of the two TN lines with Olaparib, revealed on 2D cultures, a relay type expression of the MRP7 and the P-gp. On spheroids treated with a low dose of Olaparib art long term (10 days), a basal expression of MRP7 and an overexpression of P-gp were detected in the peripheral residual cells of the spheroids. These results clearly highlighted the involvement of these efflux pumps in Olaparib resistance mechanisms, in these aggressive tumors. All the results resulting from the modeling of the action of Olaparib on MDA-MB-231 and SUM1315 spheroids suggest its greater efficacy at low dose and at long-term, especially in the hypoxic zones of the spheroids. This parameter might be probably at the origin of its potentiating effect with radiotherapy

Manipuler génétiquement ou physiquement des cellules présente un très grand intérêt pour l'ingénierie tissulaire mais soulève encore de nombreux challenges. Les technologies actuelles pour la fabrication de tissus, comme l'assemblage de micro-gels, le remplissage de matrice 3D, le modelage ou l'impression biocompatible sont limités dans leur capacité à organiser spatialement des cellules, souffrent d'un temps de manipulation conséquent, d'effets secondaires potentiellement cytotoxiques et d'une grande complexité de mise en œuvre, empêchant leur utilisation à grande échelle. Nous nous sommes intéressés dans cette thèse à développer des techniques biocompatibles, faciles à implémenter, rapides et facilement transférables dans des laboratoires de biologie. Nous les avons orientées vers deux applications stimulantes car en grand essor et pour lesquelles les techniques actuelles ne permettent pas encore une utilisation grande échelle : la réparation osseuse et l'ingénierie tissulaire neuronale
Genetic or physical cells manipulation aspires to be new challenges in tissue engineering. Current technologies to generate tissues, such as micro-scale hydrogels (microgel) assembly, scaffold seeding, molding or bio-printing suffer from the difficulty to control cells organization, multi-steps time consuming procedures and/or potentially cytotoxic side effects. In this PhD, we aimed at developing cell-friendly and rapid techniques, easily transferable to biological laboratories, for two broadly challenging applications: bone healing and neural tissue engineering, for which the above-mentioned techniques cannot yet provide widely reliable models. In case of a bone critical size defect, external help is often needed for bone healing, and gold-standard for care is bone autograft. Alternatively, the fracture healing process can be stimulated and restored by the implantation at the fracture site of hydrogels embedding growth factors. Both technologies suffer however from side effects such as donor site morbidity or cells over-proliferation in the hydrogel proximity. Moreover, the kinetic of growth factors release cannot be temporally controlled. In this work, we aim at developing an alternative method using ultrasound to spatially and temporally control growth factors release within a biocompatible material: fibrin hydrogels. Towards this goal, we encapsulated, in lipoplexes, plasmids that are under the control of a heat-shock promoter. We then transfected cells, stimulate the production of the targeted protein by heat shock and reported its expression. We also optimized an encapsulation protocol for cells within fibrin gels. This proof of concept demonstrates the feasibility of transfection by lipoplexes with a plasmid under control of heat shock, and pave the way for future developments of in situ transfection of autologous cells, for a tight temporal and spatial control of therapeutic proteins expression using ultrasound-induced hyperthermia

Le present memoire decrit notre contribution a la mise au point de cultures pures de neurones a partir d'hemispheres cerebraux d'embryon de poulet ou de foetus humain. Les avantages des cultures de neurones mais aussi les inconvenients et leurs limites sont discutes tout au long de ces memoires

Etude de la regulation hormonale de la myclinisation; les hormones thyroidiennes t3 et t4 modulent l'activite de la 2',3'-nucleotide cyclique 3' phosphohydrolase (cnpase) et de la cerebroside sulfotransferase (cst). L'insuline est un inducteur de la cst

Caracterisation des recepteurs beta -adrenergiques humains a ete realisee par des methodes immunologiques (anticorps polyclonaux et anticorps monoclonaux ont ete developpes. Un anticorps anticodytypique ab2b4 reconnait egalement le recepteur beta -adrenergique et stimule l'activite de l'adenylate cyclase comme des ligands agonistes. Au cours de certaines maladies autoimmunes, l'existence d'autoanticorps diriges contre les recepteurs beta -adrenergiques ont ete detectes dans le serum de patients atteints de la maladie de chagas. Le developpement des groupes d'anticorps anti-recepteur obtenus permettront une etude structurale et fonctionnelle du systeme beta-adrenergique

Une étude expérimentale des transferts d'humidité dans l'aubier de pin sylvestre dans le domaine hygroscopique a été effectuée. L'étude de l'influence de plusieurs paramètres sur les transferts (direction de diffusion, teneur en eau du bois, température, dimensions de l'échantillon) a permis d'obtenir les données nécessaires à l'élaboration d'un modèle mathématique. Ce modèle permet de simuler les cinétiques de transfert d'humidité dans le bois (aubier de pin mais aussi d'autres espèces), à humidité relative constante ou variant au cours du temps. Le modèle étant tridimensionnel, on peut connaitre les teneurs en eau à chaque instant et en chaque point de l'échantillon. Ces renseignements sont nécessaires pour prévoir une éventuelle biodégradation par les champignons

La thrombine est une glycoproteine de la famille des proteases a serine. Comparee a celles des autres membres de sa famille, sa structure tertiaire possede une serie de boucles d'insertion particulierement exposees, organisees autour du site actif. Parce que la specificite restreinte de la thrombine pour ses substrats semble faire appel a des interactions a la surface de la molecule, il nous est apparu interessant de determiner quels etaient les roles de ces boucles dans certaines des activites de l'enzyme. Des mutations ponctuelles ont ete realisees dans deux de ces boucles (la boucle b et la boucle ) ainsi que sur la serine du site actif. L'analyse des resultats nous a permis de conclure qu'une thrombine dont le site actif est mutee est denuee de toute activite catalytique. La boucle b est confirmee dans son role de determinant majeur lors de la reconnaissance de tous les substrats testes. En revanche, les mutants que nous avons realises dans la boucle ne modifient que subtilement la poche de specificite primaire et peu les interactions avec les substrats macromoleculaires. En plus de cette etude structurale, nous avons etudier le mecanisme d'augmentation de la permeabilite de l'endothelium induite par la thrombine. La variation de permeabilite depend exclusivement du clivage du recepteur et necessite donc une enzyme catalytiquement active. La reponse des cellules endotheliales depend aussi de l'activation de la proteine kinase c et de phosphorylation sur les tyrosines. Le retour d'une sensibilite a l'enzyme requiere la synthese de nouveaux recepteurs. L'utilisation de nos outils moleculaires nous a permis de montrer que l'activite catalytique de l'enzyme est necessaire pour activer les megacaryocytes et inhiber specifiquement la pousse de leurs progeniteurs, ces deux mecanismes etant medies par le recepteur de la thrombine

L'objet de cette thèse est d'étudier la construction de la culture émergente dans les espaces virtuels numériques ainsi que les processus de formation des enseignants. Les discussions ont été orientées de manière à comprendre comment les êtres humains coexistent dans la nature numérique virtuelle, quels aspects de la nature numérique virtuelle contribuent à construire une «nouvelle culture» et quels sont les éléments du processus de formation et de pratique pédagogique impliqués dans la construction de la culture émergente dans les espaces numériques virtuels.Pour la compréhension du problème, nous nous sommes appuyés sur les théories de la biologie de la cognition de Maturana et Varela, de la biologie de l'Amour de Maturana et de la Biologie-culturelle de Maturana et Yáñez. Ces théories ont été complétées par des théories contemporaines qui traitent de questions liées à la technologie numérique virtuelle, notamment des mondes numériques virtuels en 3D et des processus d'enseignement et d'apprentissage dans les espaces de la nature numérique virtuelle.Les processus de formation propres à cette recherche ont été développés dans des espaces hybrides, configurés par plusieurs technologies numériques, dans un contexte commun au Brésil et à la France, afin d'établir un dialogue entre la théorie et la façon de vivre des étudiants.La recherche s'est développée à partir des méthodes scientifiques proposées par Maturana et Varela, sur la base des données recueillies dans l'étude des processus d'interactions, processus identifiés pendant la formation des enseignants. L'analyse des données est une analyse de contenu de natures qualitative et quantitative. Ces données ont ensuite été analysées en trois étapes. La première est une analyse qualitative qui consiste à identifier les facteurs significatifs, la seconde est l'analyse quantitative des ces facteurs à travers une analyse statistiques implicative (software CHIC), et la troisième consiste à reprendre l'analyse qualitative avec l'éclairage apporté par les résultats de l'analyse statistique. Cette analyse complexe des données a permis l'identification des processus d'interaction dans des couplages structurels de trois ordres : couplage structurel, couplage structurel technologique et couplage structurel de la nature numérique virtuelle.Les espaces numériques virtuels sont configurés par l'autonomie des acteurs, leur statut d'auteur et la congruence avec la technologie numérique virtuelle. La coexistence dans la nature numérique virtuelle trouve sa source dans l'émotion, la perturbation et la récurrence des différentes actions. La dialectique entre cette configuration et cette coexistence permet la construction, par les étudiants en processus de formation, de la culture émergente, dans le respect mutuel, la légitimité et la notion de culture dans l'éducation.La formation des étudiants contribue à renforcer la construction de la culture émergente lorsqu'on utilise une pratique pédagogique qui problématise et contextualise les connaissances, dans laquelle les relations se font par le dialogue et où tous sont co-enseignants et co-apprenants. Dans ce contexte, les êtres humains sont conscients de leurs actions et auteurs de leurs choix
The object of this thesis research is the study of culture that emerges from virtual digital spaces during teacher educational processes. The considerations about that intend to understand how the co-living based on virtual digital nature is constituted, to identify aspects of this digital virtual nature of co-living that may contribute to build a “new culture” and to apprehend elements from the educational process and pedagogical practice that imply emergent culture from digital virtual spaces. The comprehension of this problematic is built on a theoretical basis, which includes: Biology of Knowledge, by Maturana and Varela; Biology of Love, by Maturana; Cultural-Biology, by Maturana and Yáñez. This basis is complemented by contemporary theorists who approach questions related to digital virtual technology, especially about digital virtual worlds in 3D (MDV3D), and teaching and learning processes in spaces of digital virtual nature.The data results from the development of educational processes, in spaces designed by digital technological hybridism, on a Brazil – France context, in order to establish a dialog among theories and living and co-living of students from these countries. The research is developed using a scientific method, proposed by Maturana and Varela, and the collected data from the interaction processes during teaching education. The data analysis is from a qualitative and quantitative nature, submitted to a content analysis. This analysis occurs in three moments. The first moment is based on qualitative analysis of data, by the identification of the units of the analysis. In the sequence, on a second moment, the data that were analyzed qualitatively are submitted to CHIC software to do an implicative statistical analysis and, at the end, it is done a qualitative analysis again, designing the third moment of the data analysis process. This complex data analysis makes possible to identify, in interactional processes, structural couplings that are from three orders: structural coupling, structural technological coupling and structural coupling of digital virtual nature. It is also possible to identify dialectical characteristics between the design of co-living digital virtual space (through autonomy, authorship and congruence TDV) and co-living form virtual digital nature (by feeling emotions throughout perturbation and recursion), to build an emergent culture (with mutual respect, legitimacy of the other self and elements from culture in education) from the students during educational process.Considering the dialectical aspect on an emergent culture building, it is possible to conclude that the educational process needs to be done using pedagogical practices that takes into perspective the proposition of problems and contextualization of knowledge using dialogical relationships, where everybody is co-teacher and co-learner
O objeto de investigação desta tese consiste no estudo da cultura que emerge nos espaços digitais virtuais em processos de formação do educador. As reflexões abordadas intencionam compreender como se constitui a convivência de natureza digital virtual, identificar os aspectos dessa convivência de natureza digital virtual que podem contribuir para construir uma “nova cultura” e apreender os elementos do processo formativo e da prática pedagógica que implicam na cultura emergente nos espaços digitais virtuais.A compreensão dessa problemática é construída a partir de uma fundamentação teórica que inclui: a Biologia do Conhecer, de Maturana e Varela; a Biologia do Amor, de Maturana; e a Biologia-Cultural, de Maturana e Yáñez. Esta fundamentação é complementada por teóricos contemporâneos que abordam questões referentes à tecnologia digital virtual, sobretudo a de mundos digitais virtuais em 3D (MDV3D), e processos de ensinar e aprender em espaços de natureza digital virtual. A empiria resulta do desenvolvimento de processos formativos, em espaços configurados pelo hibridismo tecnológico digital, no contexto Brasil e França, a fim de estabelecer o diálogo entre as teorias e o viver e conviver de estudantes desses dois países.A pesquisa se desenvolve por meio do método científico, proposto por Maturana e Varela, e a partir dos dados coletados nos processos de interação durante a formação dos educadores. A análise desses dados é de natureza qualitativa e quantitativa, submetida a uma análise de conteúdo. Esta análise ocorre em três momentos. O primeiro momento configura-se na análise qualitativa dos dados, por meio da identificação das unidades de análise. Na sequência, num segundo momento, os dados analisados qualitativamente são submetidos ao software CHIC para a análise estatística implicativa e, por fim, realiza-se novamente uma análise qualitativa, configurando o terceiro momento do processo de análise de dados.Esta análise complexa dos dados possibilita identificar, nos processos de interação, acoplamentos estruturais de três ordens: acoplamento estrutural, acoplamento estrutural tecnológico e acoplamento estrutural de natureza digital virtual. Também é possível identificar a dialeticidade entre a configuração do espaço digital virtual de convivência (por meio da autonomia, autoria e congruência TDV) e a convivência de natureza digital virtual (no emocionar, por meio da perturbação e recursão), para a construção da cultura emergente (no respeito mútuo, legitimidade do outro e com elementos da cultura na educação) dos estudantes em processo formativo. Considerando-se o aspecto dialético na construção da cultura emergente, concluímos que o processo formativo precisa se efetivar em práticas pedagógicas que contemplem a problematização e contextualização dos conhecimentos por meio de relações dialógicas, onde todos são co-ensinantes e co-aprendentes. Nesse processo formativo, os seres humanos, e-habitantes, são conscientes de suas ações e autores de suas escolhas

Premiere cause de mortalite par cancer dans le monde, les cancers bronchiques se distinguent des autres cancers par leur detection tardive, un potentiel metastatique imprevisible pour la plupart des tumeurs operables de petits stades et un pronostic sombre avec les therapeutiques actuelles (10% de survie a 5 ans). Aucune des alterations phenotypiques et genetiques (activation des genes myc, inactivation des genes p53 et rb) precedemment identifiees au sein du groupe de recherche sur les cancers bronchiques n'est correlee au pouvoir metastasiant de ces tumeurs. L'objectif de ce travail etait donc d'analyser dans ces cancers les mecanismes d'invasion locale et de dissemination metastatique. Les acteurs moleculaires dont nous avons decrit la presence par hybridation in situ et immunohistochimie sont les proteases degradant la matrice extracellulaire et le facteur de transcription c-ets-1 qui est susceptible de participer a la regulation de l'expression de ces enzymes. La collagenase 1, les stromelysines 1 et 3, la matrilysine et l'urokinase sont frequemment exprimees dans le stroma des cancers bronchiques non ne et rarement exprimees dans les carcinomes presentant une differenciation ne. Le niveau d'expression stromale de la stromelysine 3 et de l'urokinase dans les carcinomes bronchiques non ne serait un signe d'agressivite tumorale. Ces resultats suggerent egalement que c-ets-1 regulerait in vivo l'expression stromale du gene collagenase 1 dans ces cancers. Nous montrons que les genes des proteases matricielles, et non pas c-ets-1, sont frequemment exprimes dans les lesions precancereuses bronchiques, precocement dans les cellules epitheliales et tardivement dans les fibroblastes. Les proteases matricielles seraient des marqueurs potentiels de precancerisation et constitueraient des cibles therapeutiques precoces pour une chimioprevention du developpement des cancers bronchiques

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une structure retrouvée au niveau des capillaires cérébraux. Elle représente un véritable obstacle pour les actifs qui doivent se rendre au cerveau pour y exercer un effet pharmacologique. Durant les étapes du développement du médicament, des modèles cellulaires in vitro sont utilisés pour l’évaluation de la perméabilité au cerveau des nouveaux médicaments. Le modèle assemblé avec des cellules endothéliales (CEs) isolées des capillaires des cerveaux de souris présente un intérêt particulier pour la recherche en raison de sa facilité d’obtention et sa pertinence pour le criblage des médicaments. Le but de ce projet a été de construire et de caractériser un modèle monocouche de CEs primaires de souris. En parallèle, un modèle monocouche de la lignée murine b.End3 a été investigué. L’évaluation de ces modèles a été basée sur les valeurs de TEER et de perméabilité aux marqueurs fluorescents, ainsi que sur la présence des protéines spécifiques de la BHE. La validation du modèle a été établie par la corrélation des résultats de perméabilité obtenus avec le modèle développé (in vitro) avec ceux obtenus chez la souris (in vivo). L’intégrité et l’expression des protéines spécifiques de la BHE du modèle primaire se sont montrées supérieures au modèle bEnd.3. La corrélation in vitro/in vivo du modèle primaire a abouti à un r2 = 0,765 comparé au r2 = 0,019 pour le modèle bEnd.3. Ce travail de recherche montre que le modèle primaire monocouche issu de cellules endothéliales cérébrales de souris est un modèle simple et fiable pour la prédiction de la perméabilité des actifs à travers la BHE.
The blood-brain barrier (BBB), a central nervous system structure, is found in the cerebral capillaries. It represents a major obstacle for the drugs that have to reach the brain in order to exercise their pharmacological effect. In the early stages of the drug development, in vitro cell models are used to evaluate the brain permeability of new drugs. Models assembled using primary endothelial cells (ECs) isolated from mouse brain capillaries are of particular interest for research, as for their ease of obtaining and relevance for the drug screening. Thus, the goal of this project was to build and characterize a primary mouse monolayer model. At the same time, a murine b.End3 cell line monolayer model was investigated. The evaluation of these models was based on the TEER and fluorescent marker permeability values, as well as on the presence of the BBB hallmark proteins. The model validation was established by the correlation of the permeability data obtained with the in vitro model and the data obtained in mice (in vivo). As a result, the primary mouse model showed superior monolayer integrity and higher expression of the tight junction and membrane transporter proteins when compared with the bEnd.3 cell line model. The in vitro/in vivo correlation of the primary model resulted in r2 = 0.765 compared to the bEnd.3 model with r2 = 0.019. This research work shows that the primary monolayer mouse model is a simple and reliable model for predicting the drug permeability across the BBB.