Дисертації з теми "Criblage de chimiothèques"

Le criblage des interactions protéine-protéine représente une approche thérapeutique prometteuse et novatrice qui est encore sous-exploitées par l’industrie pharmaceutique et la recherche biomédicale. Par contre, la nature étendue de la surface d’interaction complique le développement d’inhibiteurs par les méthodes classiques de criblage avec des chimiothèques de petites molécules. En effet, l’espace chimique couvert par les structures moléculaires retrouvées au sein des chimiothèques disponibles est peu adapté à la réalité des interactions protéine-protéine. Dans le but de développer des structures privilégiées et mieux adaptées, le chimiste médicinal doit comprendre la nature de ces interactions et s’éloigner du dogme traditionnel des molécules dites « drug-like ». Les peptides sont d’excellents candidats pour inhiber et étudier ces interactions, mais leur faible perméabilité membranaire et leur sensibilité aux protéases limitent leur utilisation in vivo. Le peptidomimétisme devient alors un concept plus que pertinent pour combiner la sélectivité et l’efficacité d’interaction des peptides avec la biodisponibilité et la stabilité métabolique des molécules organiques. De nombreuses plateformes peptidomimétiques sont disponibles ou en émergence mais plusieurs défis de taille se présentent à l’horizon. En effet, l’incorporation d’une grande diversité moléculaire et l’adaptation de ces plateformes avec les méthodes de criblage biologique à haut débit ne sont que quelques exemples des défis auxquels les chimistes et biochimistes devront répondre. Cet ouvrage présente des travaux qui ont portés sur le développement et l’exploitation de diversités moléculaires peptidomimétiques de nature diverse, tant macrocyclique qu’hétérocyclique. Dans un premier temps, diverses méthodologies de synthèse novatrices ont été développées pour étendre la diversité moléculaire accessible des peptoïdes et pour permettre le criblage à haut débit de peptoïdes cycliques selon l’approche combinatoire «one-bead-one-compound». Dans un deuxième temps, la méthodologie de synthèse Ugi-deFmoc-SNAr a été développée pour permettre la synthèse rapide et efficace de benzo-1,4-diazépin-3-ones hautement diversifiées. C’est grâce à cette méthodologie qu’une chimiothèque de première génération a pu être produite et criblée sur des lignées cellulaires du cancer de l’ovaire, de la prostate et du pancréas. Un composé a d’ailleurs été identifié pour son activité antiproliférative in vitro et son activité antitumorale in vivo. Ces différents travaux répondent au même but : exploiter des structures privilégiées pour découvrir de nouveaux modulateurs d’interaction protéine-protéine ou simplement des agents bioactifs novateurs avec des propriétés pharmacologiques prometteuses.
Targeting protein-protein interactions represents an innovative and under-exploited therapeutic approach by the pharmaceutical industry and biomedical research. Because of their physicochemical nature, protein-protein interactions represent a major challenge for conventional screening methods with small molecule libraries. Indeed, the chemical space covered by the molecular structures found in the available libraries is poorly adapted to the reality of protein-protein interactions. In order to develop privileged and better adapted structures, the medicinal chemist must understand the nature of these interactions and move away from the traditional dogma of the so-called drug-like molecules. Peptides are excellent candidates for studying these interactions, nevertheless their pharmacological properties are generally disappointing in vivo. Peptidomimetism is then a more than relevant concept to combine the selectivity and efficiency of interaction against proteins with the concepts of bioavailability and metabolic stability. Many peptidomimetic platforms are available or emerging, and several major challenges are on the horizon. Indeed, the incorporation of a large molecular diversity and the adaptation of these platforms with the high throughput biological screening methods are only a few examples of the challenges that chemists and biochemists will have to meet. This work deals with the development and exploitation of different peptidomimetic molecular diversities, either macrocyclic or heterocyclic, but which serve the same purpose: to exploit privileged structures to discover new modulators of protein-protein interactions or simply innovative bioactive agents with advantageous pharmacological properties.

Le choix des molécules à tester joue un rôle essentiel dans le succès d'un criblage destiné à identifier de nouveaux composés bioactifs. Les deux étapes importantes dans la préparation des molécules pour le criblage sont le choix de l'espace chimique à considérer et la sélection des molécules pertinentes dans cet espace.
Idéalement la préparation des composés destinés au criblage devrait se faire grâce à un logiciel dédié à cette problématique. Il n'existe cependant aucun logiciel qui soit complètement adapté. Nous avons donc entrepris le développement d'un logiciel de ce type : ScreeningAssistant.
Ce logiciel s'appuie sur un système de gestion de bases de données et permet de créer et de maintenir à jour des chimiothèques de plusieurs millions de molécules uniques provenant de fournisseurs différents. Il permet également de filtrer les structures, en éliminant les molécules potentiellement problématiques ou avec des probabilités d'activités faibles, et de sélectionner un ensemble de composés divers.
Ce logiciel a été utilisé pour l'analyse d'une base de 5 millions de références provenant de 38 fournisseurs de produits chimiques. La proportion de composés uniques, originaux, « drug-like », « lead-like », et divers ont été comparés. La diversité a été étudiée en utilisant des notions différentes, et un score de diversité globale, prenant en compte la diversité suivant les différents critères, a été proposé.
Différentes applications de sélection de composés pour le criblage sont présentées. Ces applications utilisent le programme ScreeningAssistant et d'autres algorithmes développés pour résoudre certains problèmes particuliers.

Les biothérapies (anticorps monoclonaux, récepteurs solubles) ciblant les cytokines IL-6 etTNF-alpha pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques ont constitué un succèsmajeur de l’industrie pharmaceutique. Elles présentent néanmoins des inconvénientsimportants : résistances, mode d’administration contraignant, coût élevé.Notre équipe travaille sur l’identification de petites molécules inhibant directement cescytokines, afin d’élargir l’offre thérapeutique existante. Administrées par voie orale, ellesconstitueraient une alternative particluièrement favorable aux patients.Durant ma thèse, j’ai réalisé le criblage expérimental (tests cellulaires et tests biochimiquesde liaison) des meilleurs composés identifiés par criblage virtuel d’un grande chimiothèque dediversité, ainsi que de composés dérivés de pyridazine issus d’une chimiothèque médicinale. J’aiainsi pu identifier plusieurs inhibiteurs directs du TNF-alpha et de l’IL-6. De plus, mon travail apermis d’affiner les procédures de criblage du Laboratoire.Ces travaux ouvrent de nouvelles pistes pour le développement de médicaments anti-cytokines
Anti-cytokine biologics (monoclonal antibodies, soluble receptors) targeting TNF-alpha and IL-6in chronic inflammatory diseases have been a major success for pharmaceutical industry.However, they exhibit several drawbacks : resistance, difficult administration, high costs.Our team works on the discovery of small molecule inhibitors of cytokines suck as TNF-alphaand IL-6, in order to widen the range of therapeutic drugs. Orally active drugs would represent ahighly beneficial alternative for patients.During my PhD, I have performed an experimental screening (using cellular and biochemicalbinding testings) of the best compounds identified through virtual screening of a large chemicallibrary, and on pyridazine compounds of a medicinal chemical library. I have been able toidentify several small molecules inhibiting the interaction of TNF-! and IL-6 with their receptor.Moreover, my work will have an impact on the laboratory screening strategies.Overall, this work opens new avenues for anti-cytokine drug discovery

La chimie informatique permet d'intégrer dans un modèle mathématique (QSAR) les données structurales et biologiques obtenues au cours du processus de recherche et développement d'un futur médicament (Activité=f (Structure). Le chimiste informaticien peut utiliser de tels modèles pour proposer les molécules que l'on testera ultérieurement. Dans le premier chapitre, à partir des données structures/activité d'un ensemble de ligands affins pour la cible protéique I2, nous avons construit un modèle 3D-QSAR CoMFA reliant quantitativement l'affinité I2 d'une molécule à sa description structurale tridimensionnelle. La description structurale est un échantillonnage tridimensionnel des propriétés électrostatiques, stériques et lipophiles d'une molécule. Dans le deuxième chapitre, à partir des données structures/activité d'un ensemble d'inhibiteurs de l'enzyme COX-2, nous avons construit plusieurs modèles 2D-QSAR reliant le pouvoir d'inhibition COX-2 d'une molécule à sa description structurale bidimensionnelle. La description structurale ne prend pas en compte la conformation de la molécule décrite et estime les propriétés électrostatiques, lipophiles et pharmacophoriques d'une molécule en termes de surface moléculaire. Après l'exploration de la méthodologie utilisant une technique 3D-QSAR (CoMFA) dans le premier chapitre, nous explorons dans ce deuxième chapitre la méthodologie utilisant huit techniques 2D-QSAR. Nous abordons également une application des modèles 2D-QSAR au criblage virtuel d'une chimiothèque de deux millions de structures. Dans le troisième chapitre, nous avons analysé la base de données moléculaire dont les deux millions de molécules correspondantes sont disponibles auprès de 15 organismes ou fournisseurs différents. L'architecture de programmation C++ mise en place pour ces réalisations (traitement de larges matrices numériques, algorithme génétique) est présentée en annexe.

BMP9 est un ligand de la famille TGF-β et considéré comme un facteur de quiescence vasculaire. Différents acteurs de la voie de signalisation de BMP9 comme les récepteurs ALK1, et BMPR2 sont mutés dans deux pathologies vasculaires rares, la maladie de Rendu-Osler ou Télangiectasie Hémorragique Héréditaire et l’Hypertension Artérielle Pulmonaire, qui sont liées à une dysfonction endothéliale. Les traitements actuels visent à améliorer les symptômes des patients, sans apporter de réelle guérison de la maladie. Aussi, il est primordial aujourd'hui de trouver de nouveaux traitements étiologiques rétablissant cette voie de signalisation. Pour ce faire, j'ai utilisé le criblage à haut débit afin de repositionner de potentiels candidats-médicaments venant des chimiothèques Prestwick et TargetMol, comprenant au total 2133 molécules approuvées par FDA et EMA. Ces criblages ont été effectués sur des modèles de cellules endothéliales rapportant la voie BMP9 grâce à un promoteur sensible aux BMPs (BRE, BMP Response Element). J’ai développé et minaturisé un premier modèle de cellules endothéliales HMEC-1 secrétant une Metridia Luciférase sous le contrôle de BRE, puis un deuxième modèle utilisant une double transfection permettant l’expression de la Firefly Luciférase sous le contrôle de BRE et de la Renilla Luciférase comme contrôle de transfection. Le premier modèle n’a révelé que des faux positifs. Par contre, le deuxième modèle m’a permis d’identifier plusieurs molécules qui ont la particularité d’activer la voie de l’AMPc mais dont l’action n’a pas pu être confirmée au niveau moléculaire. Un dernier crible utilisant des cellules non endothéliales (myoblastes C2C12BRA) a permis d’identifier deux autres molécules qui sont en cours de caractérisation
BMP9 is a ligand of the TGF-β family and is considered as a vascular quiescence factor. Different actors within BMP9 signaling pathway such as receptors ALK1 and BMPR2 are found to be mutated in two rare vascular diseases, Rendu-Osler disease also called Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia and Pulmonary Arterial Hypertension, which are due to endothelial dysfunction. Current treatments aim to improve symptoms in patients, whitout providing a real cure. Thus, it is essential today to find new etiological treatments restoring this signaling pathway. To do this, I used high-throughput screening to reposition potential drug candidates from the Prestwick and TargetMol libraries, a total of 2133 molecules approved by FDA and EMA. These screens were realized on endothelial cells models reporting the BMP9 pathway using a BMP sensitive promoter (BRE, BMP Response Element). I developed and miniaturized a first endothelial model HMEC-1 secreting a BRE-controlled Metridia Luciferase, then a second one using double transfection of Firefly luciferase under BRE control and Renilla Luciferase as a transfection control. The first model revealed only false positives hits. However, the second one allowed us to identify several molecules activating the cAMP pathway but which action hasn’t been confirmed at molecular levels. A last screen was performed on non-endothelial cells (Myoblasts C2C12BRA), allowing us to identify two other molecules which are currently undergoing characterisations

En réponse à l'expression d'oncogène (tel que BRAF-V600E), à des traitements génotoxiques ou à d'autres stress, les cellules eucaryotes peuvent éviter l'apoptose et déclencher la sénescence. La sénescence est un destin cellulaire caractérisé par un arrêt prolifératif quasi-irréversible et une reprogrammation transcriptionnelle profonde, conduisant notamment à une sécrétion importante de facteurs inflammatoires collectivement appelés phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP). En raison de l'augmentation de la demande sécrétoire et de stress chroniques, la protéostase peut être perturbée en sénescence. Comme elle limite la prolifération de cellules susceptibles de présenter un potentiel pré-néoplastique, la sénescence est un processus essentiel de suppression tumorale ; cependant, l'accumulation de cellules sénescentes au cours du vieillissement, dans des contextes pathologiques, ou après chimiothérapie ou radiothérapie, est préjudiciable et entraîne un dysfonctionnement tissulaire. Les sénolytiques sont des composés qui induisent sélectivement l'apoptose dans les cellules sénescentes tout en épargnant les cellules normales, et leur application thérapeutique s'est avérée une stratégie pharmacologique efficace dans différents contextes pathologiques où la sénescence joue un rôle moteur. Le but de ce projet était d'identifier de nouveaux composés sénolytiques, notamment dans la sénescence induite par BRAF-V600E, et de caractériser leurs mécanismes d'action, ajoutant ainsi à la compréhension de la régulation des voies de survie cellulaire en sénescence. Les cardioglycosides constituent une classe de composés qui ont été identifiés comme de puissants sénolytiques dans le criblage d'une chimiothèque de repositionnement. Nous avons montré que les cellules sénescentes BRAF-V600E étaient remarquablement sensibles à la sénolyse induite par les cardioglycosides. Nous avons démontré que les cellules sénescentes BRAF-V600E ont un flux autophagique accru, essentiel à leur survie, et que les cardioglycosides agissent comme sénolytiques en inhibant l'autophagie via la transduction du signal par la Na,K-ATPase. En conséquence, le blocage de l'autophagie par d'autres voies, comme avec la chloroquine, était également sénolytique. Pour mieux comprendre la régulation de l'autophagie et de la protéostase en sénescence et identifier de nouvelles cibles sénolytiques, nous avons ensuite évalué le stress du réticulum endoplasmique et la réponse aux protéines mal repliées (UPR) dans différents modèles de sénescence. En parallèle, nous avons criblé diverses chimiothèques, dans lesquelles nous avons identifié des sénolytiques potentiels ciblant différentes facettes de la protéostase. Notamment, nous avons découvert que le senseur de l'UPR Ire1 était régulé à la hausse en sénescence induite par l'expression d'oncogènes. Ire1 régule le destin cellulaire par plusieurs voies, et de nombreux composés qui modulent de manière différentielle son activité sont disponibles. Nous avons donc utilisé un panel de modulateurs d'Ire1 pour commencer à caractériser son rôle en sénescence, et établir de nouvelles stratégies sénolytiques. En résumé, nos résultats soulignent le potentiel sénolytique du ciblage de l'autophagie et de la protéostase dans la sénescence induite par l'expression d'oncogènes, et l'importance de caractériser en détails les mécanismes d'action des sénolytiques pour identifier de nouvelles cibles et voies de régulation
In response to oncogene expression (such as BRAF-V600E), genotoxic insults, or other stresses, eukaryotic cells can suppress apoptosis and enter senescence. Senescence is a cell fate characterized by a quasi-irreversible proliferative arrest and deep transcriptional reprogramming, notably leading to an important secretion of inflammatory factors collectively termed the senescence-associated secretory phenotype (SASP). Due to increased secretory demands and chronic stress, proteostasis may be challenged in senescence. As it limits the proliferation of cells possibly bearing pre-neoplastic potential, senescence is an essential tumor suppressing process; however, the accumulation of senescent cells during aging, in pathological contexts, or following chemotherapy or radiotherapy, is detrimental and leads to tissue dysfunction. Senolytics are drugs that selectively induce apoptosis in senescent cells while sparing normal cells, and their therapeutical application has proved a valuable pharmacological strategy in pathological contexts in which senescence plays a driving role. The aim of this project was to identify novel senolytic compounds, notably in BRAF-V600E-induced senescence, and to characterize their mechanisms of action, thereby adding to the understanding of cell survival pathways regulation in senescence. Cardioglycosides constitute a class of drugs that were identified as potent senolytics in the screen of a repurposing library. We showed that BRAF-V600E senescent cells were remarkably sensitive to senolysis induced by cardioglycosides. We demonstrated that BRAF-V600E senescent cells have a heightened autophagy flux that is essential to their survival, and that cardioglycosides acted as senolytics by inhibiting autophagy through Na,K-ATPase signal transduction. Accordingly, blocking autophagy through other routes such as with chloroquine was also senolytic. To gain insight into the regulation of autophagy and proteostasis in senescence and identify new senolytic targets, we then assessed endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response (UPR) in different senescence models. In parallel, we screened various chemical libraries, in which we identified potential senolytics targeting different facets of proteostasis. Interestingly, we found that UPR sensor Ire1 was upregulated in oncogene-induced senescence. Ire1 regulates cell fate through several pathways, and many small compounds that differentially modulate its activity are available. We thus employed a panel of Ire1 modulators to begin characterizing its role in senescence, and establish novel senolytic strategies. Collectively, our results highlight the senolytic potential of targeting autophagy and proteostasis in oncogene-induced senescence, and the importance of deciphering the mechanisms of action of senolytics to identify new targets and regulatory pathways

Cette thèse concerne l'utilisation de Cartographie Topographique Générative (Generative Topographie Mapping - GTM) pour l'analyse, la visualisation et la modélisation de grands volumes de données chimiques. Les principaux sujets traités dans ces travaux sont le criblage virtuel multi-cibles dans la conception de médicaments et la visualisation, l'analyse et la comparaison de grandes chimiothèques. Plusieurs développements méthodologiques ont été proposés : (1) un algorithme de zoom hiérarchique automatisé pour la GTM afin d'aider à résoudre le problème de la résolution des cartes ; (i1) un protocole d'extraction automatisé des Sous-structures Maximum Communes (MCS) pour améliorer l'efficacité de l'analyse de données ; (iit) un criblage contraint basé sur la GTM permettant de détecter les molécules avec un profil pharmacologique souhaité, et (iv) une technique de GTM parallèle, qui réduit significativement le temps nécessaire pour construire une carte. Les méthodologies développées ont été implémentées sous forme de logiciel, utilisé à la fois dans des projets académiques (Université de Strasbourg, France) et industriels (Compagnie Boehringer lngelheim Pharma, Allemagne)
This thesis concerns the application of the Generative Topographic Mapping (GTM) approach to the analysis, visualization, and modeling of Big Data in chemistry. The main topics covered in this work are multi-target virtual screening in drug design and large chemical libraries visualization, analysis, and comparison. Several methodological developments were suggested: (i) an automatized hierarchical GTM zooming algorithm helping to resolve the map resolution problem; (ii) an automatized Maximum Common Substructure (MCS) extraction protocol improving efficiency of data analysis; (iii) constrained GTM-based screening allowing to detect molecules with a desired pharmacological profile, and (iv) a parallel GTM technique, which significantly increases the speed of GTM training. Developed methodologies were implemented in a software package used in both academic (University of Strasbourg, France) and industrial (Boehringer Ingelheim Pharma company, Germany) projects

L’identification de petites molécules contrôlant les mécanismes d’action des systèmes biologiques est un problème central de la chimie médicinale. Afin d’identifier des structures actives sur la thymidilate synthase X, une cible importante pour le développement d’agents antibactériens spécifiques, nous avons mis au point la synthèse deux nouvelles familles de composés comportant des squelettes triazole et thiazolidine. Les différentes évaluations conduisent à l’identification de deux entités possédant un pouvoir inhibiteur important. Ces deux familles ont également été testées sur des lignées de carcinome hépatocellulaire ainsi qu’une lignée cellulaire du cancer du sein. Le criblage a révélé une structure présentant une grande cytotoxicité.

De nouvelles voies de recherche de médicament ont favorisé l'émergence de méthodes I capables d'identifier des composés actifs sur des cibles thérapeutiques. A partir de la structure | de la cible, L'une d'elle s'appuie sur le criblage in silico, de milliers de molécules que forment les chimiothèques. L'estimation du mode d'association et de l'affinité de liaison avec la cible s'avère aujourd'hui un outil efficace pour sélectionner un nombre restreint de molécules pertinentes. Leur validation expérimentale nécessaire évite les tests expérimentaux sur l'ensemble de la chimiothèque. Deux le cadre de deux collaborations à l'Institut Pasteur, nous recherchons ainsi de nouveaux antipaludéens et antituberculeux. Notre premier cas d'étude a nécessité la construction d'un modèle structural de l'enzyme SUB2 de Plasmodium falciparum, par homologie à des protéines bactériennes de la même famille. Plusieurs inhibiteurs de cette enzyme essentielle à l'invasion des érythrocytes ont ensuite été confirmés in vitro et in vivo a différents stade du parasite. En ce qui concerne la recherche d'antituberculeux, l'obtention récente par cristallographie aux rayons X d'une structure de PimA, glycosyltransférase impliquée dans la synthèse de constituants essentiels de la paroi des mycobactéries, a rendu possible inhibiteurs prometteurs de PimA. Nous avons également initié une phase d'optimisation des inhibiteurs de ces deux enzymes, nécessaire pour accéder à la prochaine étape de mise au point de médicaments. En parallèle à ces recherches, nos travaux de sont également portés sur le mécanisme d'association à la membrane plasmique de ces deux protéines
Nowadays, the identification of leads from a therapeutic target becomes a classic pipeline for drug discovery. In silico virtual screening approaches, based on this target structure allow the enrichment of a large compounds databank in a significantly reduced subset. This selection involves a docking procedure, for each compound, which predicts their binding mode to the target and their affinity, in order to classify them. Finally, the experimental validation of these relevant compounds is a performing substitute to a costly High-Throughput Screening. On two collaborative projects at Institut Pasteur, we apply a structure-based screening to help antimalarial and antituberculous leads finding. The therapeutic target SUB2 is an essential protease in the erythrocyte invasion. We successfully manage to identify compounds able to inhibit its activity, in vitro. Since no experimental structure of SUB2 is available, the screening required a prior comparative modeling of the P. Falciparum on homologous bacterial proteins. The second project concerna PimA, a fundamental glycosyltransférase for the construction of the mycobacteria cell wall. In contract to SUB2, the virtual screening process take advantage of the recent structure frorn PimA crystal and lead the determination of promising inhibitors. For both projects, we also initiate a optimization campaign based on the understanding of the inhibitory mecanism of the leads in the aim to design their chemical structure. Improvement of their efficiency is indeed necessary at this point of the preclinical step. We also study the non specific and superficial association of these enzymes to the plasmatic membrane

Au cours des dernières années, des thérapies anti-cancéreuses ciblant l'angiogenèse tumorale ont été développées et ont démontré un bénéfice en terme de survie globale pour les patients atteints de certains cancers métastatiques. Cependant, dans de nombreux cas, les tumeurs acquièrent des résistances échappent au traitement. Le développement de nouveaux composés anti-angiogène est donc une réelle nécessité pour être proposés en seconde ligne thérapeutique. Dans ce travail, notre objectif était d'identifier de nouvelles molécules anti-angiogènes par le criblage à haut débit, de la chimiothèque académique de l'Université de Grenoble. Nous avons adapté le test de blessure sur cellules endothéliales au format des plaques de 96 puits et avons identifié une famille de molécules qui inhibent spécifiquement leur fermeture. L'activité anti-angiogène de la molécule leader (COB223) a été confirmée dans des modèles d'angiogenèse tridimensionnels in vitro, et, chez la souris, dans un modèle d'angiogenèse sous-cutanée. Nous avons testé l'activité anti-tumorale de COB223 dans un modèle de xénogreffe chez la souris et observé une diminution significative de la taille des tumeurs dans les souris traitées. A la recherche de son mécanisme d'action, nous avons observé que COB223 inhibe la prolifération cellulaire et diminue les phosphorylations de MEK et Raf, de ERK1/2 induites par le VEGF-A dans les cellules endothéliales. Nous avons également montré que COB223 n'inhibe pas les phosphorylations du VEGFR2 et de PLC. D'après ces résultats, nous proposons que la cible de COB est localisée dans la voie de signalisation VEGF/ PLC /PKC/ERK entre PKC et Ras
Several anti-tumoral therapies targeting angiogenesis have been developed over the recent years and have demonstrated benefits for several metastatic cancers. However, in many cases, resistances to these treatments appear over time, allowing tumor escape. The development of new anti-angiogenic compounds is thus dramatically urged in order to propose second-line anti-angiogenic treatments. In this work, our aim was to identify new anti-angiogenic compounds through high throughput screening of the academic library from the University of Grenoble. We adapted the endothelial cell scratch assay to 96-well plates. We identified a family of molecules that specifically inhibited endothelial cell migration. The anti-angiogenic activity of the leader molecule (COB223) was confirmed in vitro in 3D cellular models of angiogenesis and in vivo using a mouse model of subcutaneous sponge implantation. We tested the anti-tumoral activity of COB223 on a mouse xenograft model. We observed that tumor growth was significantly reduced in treated mice correlated with decreased microvessel density. In search for its mechanism of action, we observed that COB223 inhibits cell proliferation and reduces VEGF-A-induced phosphorylation of MEK and ERK1/2 in endothelial cells. We also showed that COB223 did not affect VEGFR2 and PLC phosphorylation but reduces Raf phosphorylation responsible for its activity. These results allow us to propose that the molecular site of action of COB223 is located in the VEGF/ PLC /PKC/ERK pathway, between PKC and MEK

La protéine kinase DYRK1A fait partie du groupe des CMGC kinases et est impliquée dans divers processus neurodégénératifs tels que la maladie d’Alzheimer.Dans ce cadre, une étude topologique a été menée autour d’un hit imidazo[1,2-B]pyridazine identifié par un criblage biologique. Ce composé a servi à concevoir des inhibiteurs ATP-Compétitifs de DYRK1A par l’utilisation de méthodes métallo-Catalysées (Pd, Cu) pour introduire divers fragments fonctionnalisés.Sur les soixante dérivés imidazo[1,2-X]azine synthétisés, sept composés ont montré une affinité nanomolaire pour DYRK1A (IC50 = 41-130 nM). En parallèle de ce travail de pharmacochimie, le développement de nouvelles méthodologies de synthèse a visé à la polysubstitution régiosélective du cycle pyridazine.En dernier lieu, nous avons donné les éléments et concepts permettant la construction de chimiothèques virtuelles dérivées de pyridazines et destinées à être criblées in silico
DYRK1A protein kinase belongs to the CMGC group and is involved in neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease.In this context we examined an imidazo[1,2-B]pyridazine hit identified by biological screening, through detailed structure-Activity relationship studies. This compound was used to synthesize DYRK1A ATP-Competitive inhibitors by using metallo-Catalyzed methodologies (Pd, Cu) in order to introduce various functionalized moieties.Out of the 60 derivatives synthesized, 7 compounds showed nanomolar activities (IC50 = 41-130 nM).Beside this work of medicinal chemistry, new synthetic methodologies has been developed to regioselectively access polysubstituted pyridazine derivatives. Finally, we developed data and concepts to establish virtual pyridazine libraries for in silico screening

La découverte d’un candidat médicament repose sur l’identification de hits, présentant des propriétés physico-chimiques adéquates pour leur optimisation. Le criblage à haut débit et l’approche par fragments sont deux techniques couramment utilisées lors de cette étape d’identification et elles ont été mises en œuvre au cours de ma thèse dans le but de découvrir de nouveaux composés ciblant d’une part le complexe CD81/CLDN-1 pour empêcher l’entrée du virus de l’hépatite C (VHC) dans les hépatocytes et d’autre part EthR2, un régulateur transcriptionnel mycobactérien, afin de potentialiser l’activité d’un antituberculeux sur les souches résistantes de M. tuberculosis.Dans une première partie, un criblage à haut débit sur le complexe CD81/CLDN-1 a permis d’identifier des modulateurs en série thiéno[2,3-c]pyrazole. Ces composés ont été pharmacomodulés et un composé spécifique de l’étape d’entrée du VHC, non toxique et présentant une activité submicromolaire a pu être ainsi identifié. Cette sonde pharmacologique permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le processus d’entrée virale.Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés à la conception de nouveaux fragments dits privilégiés. Ainsi, le développement des voies de synthèse, sous irradiation micro-onde, de deux entités moléculaires, le noyau 1,4-benzodiazepine-2,5-dione et le noyau spirohydantoïne, nous a permis d’obtenir 34 composés originaux. Afin d’évaluer le potentiel de cette stratégie, une librairie virtuelle de fragments a été générée et son criblage in silico sur la protéine MDM2 a été effectué. La mesure in vitro de l’activité des hits identifiés permettra de valider l’intérêt de cette approche pour la découverte de nouveaux ligands ciblant les interactions protéine-protéine.Dans une troisième partie, des inhibiteurs d’un répresseur transcriptionnel mycobactérien impliqué dans la potentialisation de l’activité de l’éthionamide ont été développés. A l’issue d’un criblage de 960 fragments, l’identification d’un hit en série tropinone, et sa cocristallisation avec la protéine EthR2, a permis d’entamer une optimisation rationnelle qui a conduit à l’obtention rapide de composés présentant de meilleures activités
The discovery of drug candidates is based on the identification of hits with appropriated physico-chemical properties for further development. High throughput screening and fragment-based drug discovery approaches are two strategies commonly used for this identification. These strategies were applied during my PhD research work for identifying not only new modulators of the CD81/CLDN-1 complex to prevent entry of the Hepatitis C virus (HCV) into hepatocytes but also inhibitors of the mycobacterial transcriptional repressor, called EthR2, to boost ethionamide antibacterial activity against resistant strains of M. tuberculosis.Firstly, a high throughput screening assay was developed to identify molecules bearing a thieno[2,3-c]pyrazole scaffold that modulate the CD81/CLDN-1 complex. The structure-activity relationships allowed us to design and synthesize one non-toxic compound that inhibits viral entry with an IC50 in the submicromolar range. This best analog will be used as pharmacological tool to understand the molecular mechanism involving the CD81/CLDN-1 interaction during virus entry.Secondary, we worked on the design and synthesis of a new generation of fragments called privileged fragments. We focused our interest on the 1,4-benzodiazepine-2,5-dione and spirohydantoin scaffolds and using microwave-assisted conditions 44 original privileged fragments have been synthesized. To further illustrate the potential of our privileged fragments, a virtual focused library has been generated and screened in silico on MDM2 protein. The in vitro evaluation of the identified hits will allow us to validate our approach and to show the potential of our privileged fragments for the discovery of new hits against protein-protein interactions.Finally, inhibitors of a new mycobacterial transcriptional repressor involved in the boosting of ethionamide activity have been developed. Screening of 960 fragments allowed us to identify a hit bearing a tropinone scaffold which was cocrystallized with EthR2. A rational design from this cocrystal structure led rapidly to more potent ligands

Depuis l'émergence du concept de cellules souches cancéreuses (CSC), de telles cellules ont été isolées à partir de diverses tumeurs solides, dont les glioblastomes. Les CSC et les propriétés qui les caractérisent permettent de mieux comprendre l'hétérogénéité tumorale, ainsi que l'agressivité de certaines tumeurs et les récidives après traitement. Avec la mise en évidence des CSC, un nouveau paradigme est apparu dans le domaine de la thérapie anticancéreuse visant à cibler non seulement les cellules de la masse tumorale, mais également les CSC, plus résistantes aux chimio- et radiothérapies, mais aussi capables d'entrer en quiescence et de reformer la tumeur d'origine. L'isolement de CSC à partir des tumeurs, leur physiopathologie et la recherche de molécules capables de les détruire ou de les différencier afin de les rendre plus sensibles aux traitements mobilisent un nombre croissant d'équipes de recherche et certaines industries pharmaceutiques. Cette thèse présente un travail sur des CSC isolées de glioblastomes humains et s'inscrit dans la démarche énoncée ci-dessus.

Le développement important des biocapteurs pour des applications médicales entraînent, depuis ces dernières années, à envisager d'autres façons de construire des plans d'expérience. Ainsi, les travaux ici présentés tentent de répondre à une problématique originale consistant à détecter des événements ayant une faible probabilité de se produire selon deux approches "antagonistes" ; d'une part, le criblage pharmaceutique de molécules chimiques et d'autre part, la détection de toxines à usage bioterroriste. Alternativement, ce sont les sondes et les cibles qui présentent une activité inconnue vis-à-vis de leur partenaire. Pour y répondre, nous avons envisagé la combinaison de la technique d'imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi) et l'utilisation de biopuces. L'immobilisation de composés chimiques issus de la chimie combinatoire est effectuée selon une conception préalable des molécules afin qu'elles soient compatibles en vue d'une immobilisation dans un polymère fin de polypyrrole. Appliquée à la recherche de nouvelles molécules interagissant avec l'ARN polymérase bactérienne, enzyme cible pour l'élaboration de molécules à activité antibiotique, ce procédé a permis d'isoler plusieurs molécules appartenant à la famille des hydantoïnes et des quinazoline-2,4-diones capables de réagir avec la cible pharmacologique choisie. Une miniaturisation des procédés de fabrication ouvre la voie vers une augmentation des débits de criblage de ce type de méthode. Dans le cadre de la détection de toxines, la chaîne B de la ricine a été prise pour modèle d'étude. Afin de surmonter les limitations de la technique par SPRi, un protocole d'amplification du signal a été mis au point. Celui-ci a permis de déceler jusqu'à 10 pM en analyte, c'est-à-dire une sensibilité comparable aux autres méthodes de transduction. Grâce à cette stratégie analytique multi-étape, une gamme dynamique de 3 ordres de grandeur a été établie. Une extension de cette approche analytique pourra à court terme amener à doser simultanément plusieurs toxines.

Face à l'émergence de bactéries multi-résistantes aux antibiotiques, il est nécessaire de trouver de nouvelles molécules, actives contre les bactéries, ou qui inhibent leurs mécanismes de résistance et restaurent ainsi l'activité des antibiotiques existants. Dans ce contexte, nous avons mis en place un système de criblage robotisé à moyen débit permettant d'étudier l'activité de molécules sur des bactéries en milieu liquide. Les composés testés sont des molécules synthétiques, provenant de la Chimiothèque nationale du CNRS, et des extraits naturels de plantes. La collection de bactéries utilisée se compose de souches sensibles et de nombreuses souches résistantes. Dans le cadre de cette étude, nous nous sommes intéressés à la résistance par mécanisme d'efflux actif. Nous avons étudié en particulier deux systèmes d'efflux chez Staphylococcus aureus: la pompe NorA, qui confère une résistance multiple aux antibiotiques, dont les fluoroquinolones, et la pompe Msr(A), qui est spécifique des macrolides. Un premier criblage sur les souches sensibles (Escherichia coli et S. aureus) permet de détecter des molécules ayant une activité antibactérienne. Pour celles-ci, une étude plus approfondie est menée. Les molécules dépourvues d'activité antibactérienne sont ensuite testées sur les deux souches de S. aureus résistantes par efflux, pour déceler une potentielle activité d'inhibiteur de pompe. Cette activité est alors confirmée par des expériences d'accumulation de l'antibiotique. Au cours de cette étude, une nouvelle série de molécules présentant une bonne activité antibactérienne vis-à-vis des deux souches sensibles a été mise en évidence. Des résultats préliminaires indiquent que ces molécules inhibent la synthèse des protéines. Le criblage réalisé vis-à-vis de la pompe d'efflux NorA a mis en évidence trois familles de molécules actives, dont on a vérifié qu'elles permettent de restaurer l'activité de plusieurs antibiotiques efflués par la pompe. Un criblage similaire réalisé sur la protéine Msr(A) a révélé quelques touches qui montrent une synergie avec l'antibiotique efflué; leur activité sur l'accumulation de l'antibiotique doit être vérifiée. Par ailleurs, un modèle tridimensionnel de la protéine Msr(A) a été établi, par homologie avec les pompes cristallisées de la même famille (protéines à ATP-Binding Cassette). Ce modèle est en cours de validation.