Дисертації з теми "Complexes ADN-protéines"

La microscopie a force atomique (afm) ouvre de nouvelles perspectives dans l'etude des interactions adn-proteines. Mon travail a consiste a developper de nouvelles methodologies pour controler l'adsorption de l'adn sur les surfaces et permettre l'etude en liquide de la dynamique des complexes. Nous avons caracterise les interactions entre l'adn et la surface de mica. Nous proposons un modele simple pour decrire les interactions electrostatiques en solution entre l'adn et le mica, en considerant le role des cations monovalents et divalents. La bonne correlation avec les donnees experimentales permet de valider un referentiel de conditions et une methode d'adsorption reversible de l'adn sur mica pretraite nickel. Nous avons parallelement developpe un systeme de plots pour ancrer l'adn par ses extremites. Le controle de ces methodologies permet de caracteriser l'accessibilite en fonction des etats d'adsorption. Nous abordons cette problematique en caracterisant l'activite de la bleomycine sur l'adn. Cette approche sur un systeme modele permet de caracteriser l'influence de la surface en termes d'accessibilite et d'activite. La derniere partie de ce travail considere la caracterisation des interactions de la proteine ku avec l'adn dans le cadre de l'etude de la reparation des cassures double brin. Notre approche qui combine les apports de la microscopie electronique a transmission et de l'afm met en evidence une polymerisation cooperative de ku sur l'adn double brin et un mode de fixation tres different sur l'adn simple brin. Ce travail montre l'interet de l'imagerie moleculaire pour caracteriser les mecanismes de recherche des sites cibles par les proteines
Atomic force microscopy (afm) opens new perspectives in the study of dna-protein interactions. My work consisted of developing new methodologies for controlling dna adsorption on surfaces and enabling the study of the dynamics of the complexes in liquid. We have characterized the interactions between dna and the mica surface. We propose a simple model to describe the electrostatic interactions in solution between dna and mica, considering the role of monovalent and divalent cations. The good correlation with experimental data allows validating referential adsorption conditions and a reversible adsorption method for dna on nickel-pretreated mica. In parallel we have developed a system of tethers to anchor dna by its extremities. The control of these methodologies allows characterizing accessibility in function of the adsorption states. We broach this issue by characterizing bleomycin activity on dna. This approach on a model system allows characterizing the surface influence in terms of accessibility and activity. The last part of this work considers the characterization of the interactions of the ku protein with dna, in the frame of the study of dna double-strand break repair. Our approach which combines the contributions of transmission electron microscopy and of afm shows a cooperative polymerization of ku along dna and a very different binding mode on single-stranded dna. This work shows the interest of molecular imaging for the characterization of target site research mechanisms by proteins

La ségrégation des chromosomes et des plasmides à bas nombre de copies chez les bactéries est basée sur un mécanisme actif de positionnement. Il repose sur des systèmes de partition qui assurent la répartition intracellulaire des réplicons afin qu'ils soient transmis de façon fidèle à la descendance. Ils font intervenir trois partenaires encodés par la molécule à ségréger. Une protéine de liaison à l'ADN (ParB) s'assemble en un complexe de partition autour d'une séquence centromérique (parS). Une protéine NTPase, interagissant avec le complexe de partition, est responsable de l'activité de ségrégation et du positionnement du complexe de partition et ainsi du plasmide. Mon projet de thèse vise d'abord à approfondir le mécanisme d'assemblage du complexe de partition du système majoritaire de type I des plasmides F et pESBL et ensuite, à déchiffrer le mécanisme global de partition du système atypique de R388 récemment découvert, n'utilisant pas de NTPase codée par le plasmide pour assurer son positionnement. Ainsi, mon projet s'articule en trois parties. (i) Comprendre par une approche mutationnelle le mécanisme d'initiation de l'auto assemblage de l'ensemble des ParB du plasmide F en un complexe de haut poids moléculaire dynamique, autour de parS. (ii) Identifier les partenaires du système de partition du plasmide pESBL, caractériser in vitro l'interaction de ParB avec parS et déterminer par une étude in silico, le groupe auquel il appartient. (iii) Identifier le rôle des différents domaines de la protéine de liaison à l'ADN StbA du plasmide R388 dans ses activités et caractériser les modalités d'interaction de StbA avec son site spécifique sur le plasmide, par des approches de séquençage à haut débit et de biochimie, pour comprendre l'architecture du complexe de partition. Cette étude a permis d'approfondir nos connaissances sur la biologie des plasmides portant un système de partition de type I et a mis en lumière les spécificités d'interactions ADN/protéines d'un système atypique, ouvrant la voie à la compréhension de son mécanisme de stabilisation
Bacterial chromosomes and low copy number plasmids segregation is based on an active positioning mechanism. It consists in the partition systems that ensures the proper intracellular positioning of replicons to be faithfully transmitted to the daughter cells. The partition systems involves three cis-encoded partners. A DNA binding protein (ParB), is assembled in partition complexes at centromeric sequences (parS). An NTPase, which interacts with the partition complex, drives the segregation process and allows the complexes, and thus the plasmids, to be properly positioned inside the cell. My Ph.D project focused first on the better understanding of the partition complex assembly of the widespread type I system of the F plasmid and pESBL. Then, to decipher the global mechanism of the partition process of the recently discovered atypical system on R388, which does not involve any plasmid encoded NTPase to ensure its intracellular positioning. Thus, my project is divided in three parts, aiming to (i) understand by an mutational approach, the initiation mechanism for the self-assembly of the majority of F plasmid ParB in a dynamic high molecular weight complex around parS, (ii) identify the pESBL partition system partners, in vitro characterize the ParB/parS interaction profile and in silico determine the group to which it belongs, (iii) identify the roles of the different domains of the R388 DNA binding protein StbA in its activities and characterize the StbA interaction modalities on its centromere by high throughput sequencing and biochemical approaches, to understand the partition complex architecture. This study allows us to improve our knowledge on the Type I partition system and to shed light on the DNA/protein interaction specificities of an atypical system, carried by broad-host-range plasmids, opening the way to a better understanding of DNA segregation mechanism

Les travaux décris dans cette thèse concernent l’étude de la réactivité de complexes ruthéniés, Ru(bpz)32+, Ru(bipy)32+ et Ru(phen)32+ avec l’ADN et une protéine, la Cu/Zn Superoxyde Dismutase. Les transfert d’électrons et la formation d’oxygène singulet sont deux voies empruntées par ces complexes afin d’induire des dommages oxydatifs sur l’ADN et sur la protéine. Des études de photocoupures sur ADN plasmidique et des techniques d’analyses comme la RPE, la photolyse éclair, la spectroscopie UV-Vis et de fluorescence ont permis d’établir différents mécanismes d’action des complexes en milieu biologique. De plus, à partir des similitudes existant entre la SOD et les plaques séniles de β-amyloïde, nous avons mis en évidence l’intérêt des complexes de ruthénium pour le traitement et le diagnostic de la maladie d’Alzheimer
Polyazaaromatic ruthenium(II) complexes are photoreactive probes used in the area of DNA photosensitization. The work described here focus on the study of the reactivity of 3 complexes, Ru(bpz)32+, Ru(bipy)32+ and Ru(phen)32+ with DNA and a protein : Cu/Zn Superoxyde dismutase. Electron transfer processes and singlet oxygen production are 2 ways used by these complexes to induce DNA and protein oxidation. DNA plasmid cleavage, EPR, flash photolysis, UV and fluorescent spectroscopy were used to understand and establish the mechanisms involved in the reactions of ruthenium complexes in biological medium. Furthermore, the similitude between SOD and β-amyloid senile plaques allowed us to exhibit the interest of polyazaaromatic ruthenium complexes for the treatment and the diagnosis of Alzheimer’s disease

La destruction radio-induite des complexes ADN-protéine peut avoir des conséquences graves pour des systèmes impliqués dans des fonctions cellulaires importantes. Le premier système qui a été étudié est un système de régulation de l'expression génique chez Escherichia coli, celui de l'opéron lactose. Le complexe répresseur-opérateur est détruit après l'irradiation du complexe ou de la protéine seule. L'endommagement du domaine de fixation du répresseur à l'ADN (appelé headpiece) a été démontré et étudié tant du point de vue de l'intégrité de la chaîne peptidique que de la conformation et des modifications de certains acides aminés. Dans un deuxième temps, des dysfonctionnements de l'induction in vitro d'un complexe répresseur irradié-opérateur non irradié ont été mises en évidence. Ces perturbations, dues à une diminution du nombre de sites de fixation sur le répresseur, sont corrélées à l'endommagement de résidus tryptophane. D'autre part, l'inducteur protège le répresseur lorsque ces deux partenaires sont irradiés ensemble, d'une part par capture (pouvoir scavenger) des radicaux en solution et d'autre part par le masquage de son site de fixation sur la protéine. Le deuxième système étudié est formé par Fpg (ou Formamidopyrimidine glycosylase), protéine de réparation de l'ADN, et par de l'ADN porteur d'une lésion oxidative. Les résultats obtenus montrent que l'irradiation de la protéine perturbe la réparation à la fois en diminuant son efficacité de reconnaissance et de fixation des lésions, et en modifiant son activité enzymatique.

Les peptides constituent un moyen simplifié d’étudier le fonctionnement des protéines et des moyens thérapeutiques potentiellement très intéressants. Ce travail a permis l’investigation de deux peptides, le peptide synthétique LAH4 et le domaine T de la protéine diphtérique en interaction avec d’autres macromolécules. Le peptide LAH4 conçu et synthétisé par notre laboratoire, présente les propriétés générales des peptides amphipathiques et se lie également fortement à l’ADN permetant son transfert dans les cellules en tant que vecteur de transfection. Dans le but de mieux comprendre l’activité du peptide LAH4 pendant la transfection, j’ai examiné ses propriétés biophysiques par ITC (isothermal titration calorimetry), CD (Circular Dichroism) et RMN du solide. Les resultats montrent que la structure en hélice- du peptide est maintenue après complexation de l’ADN. A pH neutre des liaisons électrostatiques lient les molécules de façon non spécifique et un ratio très élevé de LAH4 est requis pour la saturation et la condensation de l’ADN. A plus faible pH des interactions électrostatiques et des contributions hydrophobes stabilisent le complexe peptide/ADN, et le ratio de saturation est réduit de presque moitié. Les données concordent à l’élaboration d’un model d’action du peptide LAH4 pendant les premières étapes de la transfection. En parallèle, nous avons developé une strategie d’expression du LAH4 chez E. Coli afin de le marquer 13C uniformément pour son étude par RMN. Des études par RMN du solide ont été entreprises sur le domaine T de la toxine diphtérique afin de comprendre la topologie dans des vésicules membranaires. Des échantillons de domaine T uniformément marqués en 15N ont été préparés en reconstituant les conditions présentes dans l’endosome de façon très simplifiée. Les résultats montrent un rôle important joué autant par le lipide anionique POPG que par le pH dans l’insertion du peptide dans la membrane et dans l’interruption de celle-ci
Membrane associated proteins and peptides constitute a privileged medical target. Some of them also present also an important potential in therapeutics. This work has permitted the investigation of two peptides, the synthetic peptide LAH4 and the diphtherias toxin T domain in interaction with other macromolecules. The LAH4 peptide designed and synthesized in our laboratory, presents all the general properties of amphipathic peptides and also binds strongly to the DNA allowing its transfer into the cells. In order to better understand the activity of the LAH4 peptide during transfection, I have examined its biophysical properties by ITC (Isothermal Titration Calorimetry), CD (Circular Dichroism) and solid-state NMR. The resultats show that the -helical structure of the peptide is maintained after DNA complexation. At neutral pH, the molecules are bound in an electrostatic non-specific manner and a high ratio of LAH4 is required for DNA saturation and condensation. At low pH electrostatic interactions and hydrophobic contributions stabilize the complex and the saturation ratio is reduced. The data lead to the elaboration of a model of action for the LAH4 peptide during the first steps of transfection. In parallel, we have developed a strategy of expression of the LAH4 peptide in E. Coli in order to uniformly label the peptide 13C for its study by NMR. Solid state NMR studies have been undertaken on the diphtheria toxin domain T in order to investigate its topology inside membrane vesicles. The samples of 15N uniformly labeled T domain were prepared in a simplified system mimicking endosomal conditions. The data show an important role of the pH and of the anionic lipid POPG in the peptides membrane insertion and interruption

La microscopie à force atomique (AFM) ouvre de nouvelles perspectives dans l'étude des interactions ADN-protéines. Mon travail a consisté à développer de nouvelles méthodologies pour contrôler l'adsorption de l'ADN sur les surfaces et permettre l'étude en liquide de la dynamique des complexes.
Nous avons caractérisé les interactions entre l'ADN et la surface de mica. Nous proposons un modèle simple pour décrire les interactions électrostatiques en solution entre l'ADN et le mica, en considérant le rôle des cations monovalents et divalents. La bonne corrélation avec les données expérimentales permet de valider un référentiel de conditions et une méthode d'adsorption réversible de l'ADN sur mica prétraité nickel. Nous avons parallèlement développé un système de plots pour ancrer l'ADN par ses extrémités.
Le contrôle de ces méthodologies permet de caractériser l'accessibilité en fonction des états d'adsorption. Nous abordons cette problématique en caractérisant l'activité de la bléomycine sur l'ADN. Cette approche sur un système modèle permet de caractériser l'influence de la surface en termes d'accessibilité et d'activité.
La dernière partie de ce travail considère la caractérisation des interactions de la protéine Ku avec l'ADN dans le cadre de l'étude de la réparation des cassures double brin. Notre approche qui combine les apports de la microscopie électronique à transmission et de l'AFM met en évidence une polymérisation coopérative de Ku sur l'ADN double brin et un mode de fixation très différent sur l'ADN simple brin. Ce travail montre l'intérêt de l'imagerie moléculaire pour caractériser les mécanismes de recherche des sites cibles par les protéines.

Le développement récent des techniques d'études structurales montre que la conformation de l'ADN en solution est bien plus complexe que la structure symétrique décrite par Watson et Crick. L'ADN est flexible et présente des conformations locales très différentes dépendantes de sa séquence de bases. Sa capacité a se déformer joue un rôle majeur dans son activité biologique, en particulier dans le cas de la reconnaissance protéine-ADN. Dans cette étude, nous avons utilisé deux approches théoriques de mécanique moléculaire (Jumna) et de dynamique moléculaire (Amber), pour aborder le rôle des propriétés intrinsèques de la séquence d'ADN dans ces mécanismes de reconnaissance. Afin de créer une passerelle entre ces deux types d'approches, une comparaison des champs de forces de chacun des programmes a été effectuée au sein de Jumna en utilisant différentes représentations implicites du solvant. Les résultats montrent un comportement très similaire entre le champ de forces de Jumna et le nouveau champ de forces d’Amber, avec un même choix optimal des conditions électrostatiques. La flexibilité de l'ADN en fonction de sa séquence de bases a ensuite été abordée par dynamique moléculaire sur une séquence biologiquement importante. Elle contient la séquence cible de la tata-box binding protein (TBP) impliquée dans l'initiation de la transcription. Les études cristallographiques décrivent des déformations majeures de cet ADN dans son complexe (déroulement local de l'hélice, courbure de 90 vers le grand sillon). Les résultats des simulations sur cette séquence ont montré que sa partie centrale présente une préférence intrinsèque pour une conformation a et une tendance à courber spontanément vers le grand sillon comme le montre le complexe cristallographique TBP-ADN. Cette technique a également permis de montrer une différence de comportement dynamique avec une séquence présentant seulement deux modifications de bases et dont l'affinité pour la TBP est très réduite.

Le travail présenté dans ce manuscrit est basé sur l’utilisation de la modélisation moléculaire, de la simulation et de la chimie théorique pour l’étude de la photosensibilisation de l’ADN ; c’est à dire l’augmentation de la sensibilité de l’ADN vis-à-vis de la lumière au travers de l’action d’agents photosensibilisants. Premièrement, les voies photophysiques et photochimiques de plusieurs molécules connues telles que nile bleu, nile rouge, BMEMC ou une base modifiée endogène, Pyo, ont été étudiés dans le but de comprendre leurs mécanismes de photosensibilisation. Les phénomènes associés qui ont été mis en évidence sont des transferts d’électrons et d’énergie, la production d’électrons solvatés et l’activation à deux photons. De plus, deux outils pour l’étude des interactions entre les molécules et l’ADN ont été dévellopés; i) un protocole calculatoire capable de fournir l’énergie libre d’interaction de drogues dans leurs poches; ii) un outil basé sur l’hamiltonien semi-empirique de Frenkel qui permet de modéliser le spectre de dichroïsme circulaire électronique de biomacromolécules. Ensuite, les effets de photolésions sur la structure et la flexibilité de l’ADN ont été étudiés ; i.e. les dimères de pyrimidines, la pyrimidine(6-4)pyrimidone (6-4PP) et les clusters de sites abasiques. Finalement, la reconnaissance de brins d’ADN lésés par des protéines de réparation et le rapport avec leurs activités enzymatiques a été analysé. Le lecteur peut se référer à la première partie de ce manuscrit pour une présentation vulgarisée du contexte de ce projet
The work presented in this manuscript is based on the use of molecular modeling, simulation and theoretical chemistry in order to study the photosensitization of DNA; i.e. the enhancement of the sensitivity of DNA to light through the action of a photosensitizing agent. A first aspect has been to study the photophysical and photochemical pathways of several known sensitizers such as nileblue, nilered, BMEMC or an endogenous modified nucleobase, Pyo, in order to understand their mechanisms of photosensitization. The related phenomena that have been observed are electron transfers, triplet-triplet energy transfers, production of solvated electrons and two-photons activations. Moreover, two tools have been developed to study the interaction between photosensitizing agents and DNA; i) a protocol able to provide the binding free energy of drugs in their interaction pockets; ii) a tool based on the semi-empirical Frenkel Hamiltonian to model the electronic circular dichroism of biomacromolecular systems in a straightforward way. Then the effects of photoinduced lesions on the DNA structure and flexibility have been investigated; i.e. cylcopyrimidine dimers (CPD), pyrimidine(6-4)pyrimidone (6-4PP) and cluster abasic sites. Finally the recognition of damaged DNA strands by repair enzymes is presented and the implication on enzymatic activities has been highlighted. The reader can refer to the first section of the manuscript for a popularized presentation of the project context

L'évolution de la chimiothérapie des cancers colorectaux métastatiques est liée à l'émergence de nouvelles molécules actives et au développement de méthodes de biologie moléculaire permettant d'identifier les marqueurs prédictifs de réponse à ces agents anticancéreux. Depuis la fin des années 1950, l'antimétabolite 5-fluorouracile (5-FU) était considéré comme la molécule de référence dans la chimiothérapie des cancers digestifs en dépit d'un faible taux de réponse objective (environ 20%), traduisant un phénomène de résistance des tumeurs à cette antipyrimidine. L'irinotécan (CPTƯ11), analogue hydrosoluble de la camptothécine inhibant la topoisomérase I, est actif dans les cancers colorectaux et particulièrement sur les tumeurs résistantes au 5-fluorouracile. . .

Le complexe Histone Acétyltransféranse (HAT) NuA4 s'inscrit comme un élément clef dans le contrôle de plusieurs fonctions cellulaires essentielles chez les eucaryotes. L'implication maintenant connu de NuA4 dans la transcription et dans la réponse aux dommages à l'ADN nous ont poussé à approfondir la caractérisation fonctionnelle des diverses sous-unités de NuA4, notamment au niveau des rôles que peuvent occuper les différents domaines protéiques retrouvés au sein de ce complexe. Une première série d'analyses a démontré l'importance de plusieurs résidus du chromodomaine de Esa1, la sous-unité catalytique de NuA4. La mutation de ces résidus engendre des défauts majeurs d'acétylation de la chromatine, suggérant ainsi un rôle du chromodomaine dans l'activité catalytique de Esa1. Parallèlement, d'autres études ont permis d'approfondir la fonction du domaine SANT de la protéine Eaf2, du PHD finger de Yng2 et du domaine PI-3 kinase de Tra1. Ce dernier domaine intéragit avec le complexe MRX, un complexe de levure recruté directement au site de cassure de l'ADN. Des recherches menées autour de l'étude de l'activité kinase de cette protéine ont permis de suggérer l'implication de NuA4 dans les événements précoces survenant suite à un bris double brin, précisant ainsi le rôle de ce complexe dans la réparation de l'ADN.

Un des acteurs essentiels de la réplication de l’ADN est le complexe MCM2-7. Ce complexe est composé de 6 protéines (MCM2 à MCM7) organisées en hexamères qui sont recrutés aux origines de réplication pendant la phase G1. Le complexe MCM2-7 possède une activité hélicase permettant la formation des fourches de réplication et le recrutement des ADN polymérases. L’arrimage à la chromatine et l’activité du complexe MCM2-7 doivent être finement contrôlés notamment par des interactions avec différents partenaires protéiques et par un ensemble de modifications post-traductionnelles (MPTs). Des travaux de l’équipe ont identifié la O-GlcNAcylation comme une nouvelle MPT sur certaines protéines MCM. C’est une glycosylation dynamique et réversible des protéines nucléocytoplasmiques et mitochondriales, gouvernée par la O-GlcNAc transférase (OGT) et la O-GlcNAcase (OGA). Lors de mes travaux de thèse j’ai cherché à comprendre le rôle de la O-GlcNAcylation sur le complexe MCM2-7 dans des lignées cellulaires humaines. J’ai démontré que toutes les MCM sont O-GlcNAcylées et que cette modification n’intervient que sur la fraction des MCM liées à l’ADN. Mes travaux montrent que l’OGT interagit avec certaines sous-unités MCM et que l’extinction de l’expression de l’OGT diminue la fixation à la chromatine des MCM2, 6 et 7. Enfin, la perturbation de la dynamique O-GlcNAc déstabilise les interactions entre les sous-unités MCM2/6, MCM4/7 et MCM4/6. L’ensemble de mes travaux montre que l’OGT est un nouveau partenaire du complexe MCM2-7 dans les cellules humaines, et suggère que l’homéostasie de O-GlcNAcylation pourrait réguler le maintien du complexe MCM2-7 à la chromatine
The MCM2-7 complex is one of the major players for regulating the DNA replication. MCM2-7 contains six evolutionarily conserved subunits (MCM2 to MCM7) which bind together to form a hexameric complex. The MCM2-7 complex is progressively loaded onto chromatin to licence origins of replication during G1 phase, and forms the core of the replicative helicase necessary to fuel the unwinding of double-stranded DNA at the replication fork, allowing the loading of the DNA polymerases. The MCM2-7 helicase must be tightly regulated through interactions with specific protein partners and also by post-translational modifications (PTMs). In our team, O-GlcNAcylation has previously been identified as a new PTM of several MCM2-7 subunits. It is a dynamic and reversible glycosylation of nucleocytoplasmic and mitochondrial proteins, and is governed by O-GlcNAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA). The aim of my thesis was to decipher the role of O-GlcNAcylation on the MCM2-7 complex in human cells. I show that each MCM subunit is O-GlcNAcylated mainly in the chromatin-bound protein fraction of cells. Moreover, my results show that OGT stably interacts with several MCM proteins and OGT down-regulation induces a decrease in the chromatin loading of MCM2, 6 and 7. Finally, I show that perturbation of O-GlcNAc cycling destabilizes interactions between MCM2/6, MCM4/7 and MCM4/6 subunits. To conclude, my results show that OGT is a new partner of the MCM2-7 replicative helicase complex in human cells, and suggest that O-GlcNAc homeostasis might be essential to ensure the maintenance of the MCM2-7 complex onto chromatin during DNA replication

Les protéines Ets appartiennent à une vaste famille de facteurs de transcription, qui comprend à ce jour plus d'une trentaine de membres impliqués dans de nombreux processus physiologiques, comme la différenciation et la prolifération cellulaire, ainsi que dans les phénomènes de cancérisation. Au sein de cette famille, nous nous sommes particulièrement intéressés aux protéines Erg (Ets Related Gene) afin d'étudier leurs spécificités fonctionnelles. Nous savons que celles-ci, faibles transactivateurs, sont capables d'établir une coopération fonctionnelle avec l'hétérodimère Jun/Fos. Cette synergie nécessite la formation d'un complexe quaternaire Erg/Jun/Fos/ADN impliquant une interaction physique entre le domaine de liaison à l'ADN des protéines Erg et le domaine basique de Jun. Dans ce contexte, nous avons visualisé dans les cellules vivantes par les techniques de pbFRET (photobleaching Fluorescence Resonance Energy Transfer) et de FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) l'interaction physique entre Erg et Jun et ainsi confirmé le rôle essentiel de la tyrosine 371 de la protéine Erg dans cette interaction. Cette étude nous a également permis de mettre en évidence la localisation nucléaire stricte des protéines Erg et de montrer que leur co-expression avec les protéines Jun n'entraîne pas de délocalisation de l'un ou l'autre de ces facteurs transcriptionnels. Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons élargi notre étude à la protéine de fusion EWS-Erg, impliquée dans les sarcomes d'Ewing. Cette protéine oncogénique résulte, suite à la translocation chromosomique t(21 ; 22), de la fusion de la partie N-terminale de la protéine EWS avec la région C-terminale de la protéine Erg. Nous avons montré que cette protéine est capable de transactiver et de fonctionner en synergie avec le dimère Jun/Fos sur l'enhancer du virus du Polyome mais elle semble cependant avoir une activité répressive sur le promoteur de la collagénase1. Ainsi, la protéine EWS-Erg est susceptible de réguler différemment les gènes cibles de Erg, ce qui pourrait en partie expliquer ses propriétés oncogéniques. Ces résultats nous ont amenés à rechercher, par une méthode différentielle, les gènes cibles des protéines Erg et en particulier, à discriminer ceux régulés ou non en synergie avec le complexe AP1. Un gène cible putatif, le gène de la fibronectine1 codant une glycoprotéine de la matrice extracellulaire, s'avère être activé par la protéine Erg. L'ensemble de ce travail nous a permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires avec lesquels les protéines Erg exercent leurs fonctions physiologiques. Ces dernières ne sont pas connues précisément à l'heure actuelle mais la recherche des gènes cibles de Erg permettra certainement de les approfondir
The Ets proteins belong to a large family of transcription factors, which to date includes more than thirty members involved in many physiological processes, such as differentiation, cellular proliferation, and cancerisation mechanisms. Within this family, we have a particular interest in the functional specificities of the Erg (Ets Related Gene) proteins. We know that these weak transcriptional activators are able to establish a functional cooperation with the Jun/Fos heterodimer and that this synergy requires the formation of an Erg/Jun/Fos/DNA quaternary complex, therefore implying a physical interaction between the DNA binding domain of the Erg proteins and the basic domain of Jun. In this context, we used pbFRET (photobleaching Fluorescence Resonance Energy Transfer) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) analyses, and we were able to visualize the physical interaction between Erg and Jun in living cells and to confirm the essential role of tyrosine 371 of the Erg protein in this interaction. This study also allowed us to observe the strict nuclear localisation of the Erg proteins and to show that their co expression with the Jun proteins does not involve delocalisation of one or the other of these transcriptional factors. In the second part of our work, we extended our study to the EWS-Erg fusion protein involved in Ewing's sarcomas. This oncogenic protein results of the fusion of the N-terminal part of the EWS protein with the C-terminal part of the Erg protein further to the t(21; 22) chromosomal translocation. We showed that this protein is able to transactivate and to function in synergy with the Jun/Fos dimer on the Polyomavirus enhancer but it seems to have a repressive activity on the collagenase1 promoter. Thus, the EWS-Erg protein might differently control the target genes of Erg, which could partly explain its oncogenic properties. These results led us to seek, by a differential method, the target genes of the Erg proteins and in particular, to discriminate those controlled or not in synergy with the AP1 complex. A putative target gene, the fibronectin1 gene coding a glycoprotein of the extracellular matrix, proved to be activated by the Erg protein. The whole of this work enabled to better understand the molecular mechanisms with which the Erg proteins exert their physiological functions. Although the latter are not precisely known at the present time, the research of the Erg target genes will certainly allow deepening them in the near future

Tout d'abord, les ptérines, photosensibilisateurs endogènes photo-activables par les UVA, sont des composés organiques hétérocycliques qui participent en tant que cofacteurs à des réactions biologiques importantes comme par exemple la biosynthèse des mélanines. Elles sont retrouvées à des taux anormalement élevés dans certaines pathologies comme le vitiligo. Le rôle des ptérines dans cette maladie reste à être déterminé. Dans ce cadre, nous avons étudié la photosensibilisation du tryptophane (Trp) par la ptérine sous irradiation par des UV-A. Les résultats obtenus par spectrométrie UV-Visible, chromatographie liquide de haute performance et résonance paramagnétique électronique (RPE) révèlent deux voies importantes d'oxydation du Trp qui sont i) le transfert d'électron photo-induit qui conduit à la formation d'un radical cation tryptophane et d'un radical anion ptérine ii) la formation de l'oxygène singulet, espèce réactive de l'oxygène. Cette réactivité des ptérines avec les acides aminés doit jouer un rôle dans le processus de dépigmentation cutané observé dans le vitiligo. Nous nous sommes également intéressés aux complexes de ruthénium (II), photosensibilisateurs exogènes, qui en raison de leurs propriétés photoredox versatiles peuvent réagir avec des cibles biologiques selon différents mécanismes photochimiques. Nous avons étudié la réactivité de ces complexes avec des acides aminés de faible potentiel rédox tels que le Trp et la tyrosine, ainsi qu'avec un tripeptide le Gly-Trp-Glu. Par photolyse éclair et RPE, nous avons mis en évidence la présence d'un transfert d'électron entre le complexe de ruthénium trisbipyrazine ([Ru(Bpz)3]2+) à l'état excité et le trp conduisant à la formation du complexe mono réduit et du radical cation Trp. L'analyse de cette réaction en spectrométrie de masse a révélé la formation de photo-adduits entre [Ru(Bpz)3]2+ et le Trp isolé ou présent dans le tripeptide dont nous proposons certaines structures. L'ensemble de ces résultats mécanistiques nous ont conduit à orienter nos recherches vers la mise au point de la synthèse de complexes de ruthénium capable d'inhiber sélectivement des ADN polymérases par transfert d'électron photo-induit. Ces enzymes jouant un rôle clé dans les processus de prolifération cellulaire, le développement de tels inhibiteurs serait un atout sur le plan thérapeutique. Afin de réaliser ce ciblage, nous avons choisi de conjuguer un complexe de ruthénium de haut potentiel redox à l'état excité à des oligonucléotides sélectivement reconnus par l'ADN polymérase désirée. Les travaux de mise au point de cette synthèse sont encore à développer
First pterins, endogenous UVA -photosensitizers, are heterocyclic organic compounds. They are mainly enzymatic cofactor and are involved in key biological responses such as melanin biosynthesis. They are found at abnormally high levels in certain diseases such as vitiligo. The role of pterins in this disease remains to be determined. In this context, we studied the photosensitisation of the tryptophan (Trp) by pterin under UV-A irradiation. The results obtained by UV-Visible spectroscopy, high performance liquid chromatography and electron paramagnetic resonance (EPR) revealed that trp may be oxidized via two different pathways i) photo-induced electron transfer leading to the formation of a radical cation tryptophan and the radical anion pterin ii) the production of singlet oxygen. This reactivity of pterins with amino acids may contribute to skin depigmentation process in vitiligo. In a second part, we have studied amino acids photosensitisation by ruthenium (II). Due to their versatile photoredox properties, these compounds can react with biological targets by different photochemical mechanisms. In our work we have demonstrated by flash photolysis and EPR Investigations, the involvement of an electron transfer between the ruthenium complex trisbipyrazine ([Ru(Bpz)3]2+) in the excited state and trp leading to the formation of the mono reduced complex and radical cation trp. Mass spectrometry analysis of this reaction revealed the formation of photo-adducts between [Ru(Bpz)3]2+ and Trp free or in the tripeptide Gly-Trp-Glu and allow us to propose some structures. All of these results led us to focus our research into the synthesis of new ruthenium complexes able to selectively inhibit DNA polymerases via a photo-induced electron transfer. In cells, these enzymes play a key role in cell proliferation. The development of such photo-activable inhibitors would be an asset for the photodynamic therapy. For this purpose we have decided to conjugate a high photo-ozidizing ruthenium complex with oligonucleotides selectively recognized DNA polymerase. The synthesis of such complex is still under development

Pontine et Reptine constituent de nouvelles cibles thérapeutiques encore très méconnues à ce jour. Outre leur activité ATPase, les complexes multimériques de Pontine et Reptine ont été décrits comme des hélicases capables d’ouvrir les acides nucléiques. La modélisation moléculaire constitue un outil puissant pour l’étude des systèmes protéiques et c’est pourquoi une approche par docking et dynamique a été envisagée. Au vue de la taille d’un complexe à douze sous-unités, les simulations prenant en compte tous les atomes se sont avérées trop coûteuses en termes de puissance de calcul. Une approche mésoscopique,appelée gros-grains, a donc été utilisée pour réduire le nombre de particules à traiter. Legain de temps de calcul offert par ce modèle nous a permis d’étudier les complexes de Pontine et Reptine en présence de partenaires de type ligands, l’ATP et l’ADP, et de type acide nucléique. Par le biais d’un retour au niveau atomique, une ouverture de la double hélice d’ADN a pu être observée ainsi qu’une orientation préférentielle des brins. Des hypothèses mécanistiques de l'activité hélicase du complexe ont alors pu être formulées sur la base de ces résultats
Pontin/Reptin complexes offer new therapeutic opportunities despite the fact they are still notwell known. In addition to their ATPase activity, multimeric complexes of Pontin/Reptin were reported as hélicases able to unwind nucleic acids. Molecular modeling techniques are a powerful tool to study proteins, both a docking and molecular dynamics were applied.Considering the size of a twelve sub-units complex, simulations taking into account all atoms were too expensive in terms of computational costs. A mesoscopic approach, called coarse grain,was used to reduce the number of particles. The calculation time saved with this model allowed the study of Pontin/Reptin complexes in the presence of diverse partners like small ligands (ATP or ADP) and/or nucleic acids. Reverse transformation from coarse-grain to the atomic level led to a DNA double helix opening along to the single strands rearrangement.Several mechanistic hypotheses for the complex helicase activity were formulated from these results

Tip60 est une histone acétyltransférase qui agit sous forme d'un complexe multiprotéique dans la cellule : le complexe Tip60. Elle est impliquée dans de nombreux processus cellulaires comme la prolifération, l'apoptose et la réponse aux dommages à l'ADN. Concernant ce dernier aspect, nous avons tout d'abord montré l'implication de Tip60 dans la voie du suppresseur de tumeur p53 en réponse aux dommages à l'ADN. Puis, nous avons mis en évidence que Tip60 est requise pour l'apoptose et l'arrêt du cycle cellulaire en réponse aux UV, tout en révélant un antagonisme fonctionnel entre Tip60 et p400, une autre sous-unité du complexe Tip60. Enfin, nous avons récemment découvert l'implication de Tip60 dans la recombinaison homologue, une voie de réparation des cassures double-brin. Nous montrons également une interaction entre Tip60 et le complexe MRN, impliqué dans la reconnaissance des lésions. Nos résultats suggèrent que le complexe Tip60/MRN puisse être le complexe responsable de l'activation de la kinase ATM en réponse aux cassures double-brin. L'ensemble de ces travaux ont largement contribué à montrer l'importance cruciale de Tip60 à de multiples niveaux de la réponse aux dommages à l'ADN : signalisation, réparation, arrêt du cycle cellulaire et apoptose
Tip60 is a histone acetyltransferase acting as as a multimolecular complex in the cell : the so-called Tip60 complex. It is involved in several cellular processes such as proliferation, apoptosis and DNA damage response. As far as the latter aspect is concerned, we showed that Tip60 is involved in the p53 tumour suppressor pathway in response to DNA damage. Then we showed that Tip60 is required for apoptosis and cell cycle arrest in response to UV irradiation, and revealed a functional antagonism between Tip60 and p400, another subunit of the Tip60 complex. We also recently discovered that Tip60 is involved in homology-driven double-strand break repair. We showed an interaction between Tip60 and the MRN complex which allows the recognition of double-strand breaks in DNA. Our results suggest that the Tip60/MRN complex could be the one responsible for the ATM kinase activation in response to double-strand breaks. Altogether, our results contributed to show the crucial role of Tip60 at multiple levels of the DNA damage response : damage signaling, DNA repair, cell cycle arrest and apoptosis

Les protéines Hox sont des protéines à homéodomaine. Elles sont très conservées et impliquées dans l'identité cellulaire selon les axes antéropostérieur, dorsoventral et proximodistal. Elles reconnaissent l'ADN pour réguler l’expression des gènes. La coopérativité avec des partenaires de la famille PBC est un modèle pour l'amélioration de la spécificité. Cette étude utilise Ubx (Hox) et Exd (PBC) de D. melanogaster comme modèles. Deux modes d'interaction entre Ubx et Exd : un par le motif « hexapeptide » d'Ubx et un autre par le motif UbdA objet de ce travail. UbdA se situe en C-terminal de l'hélice de reconnaissance de l'ADN d'Ubx. Nous avons résolu différentes structures de complexes Ubx-Exd-ADN avec deux types de séquences d'ADN. Ces structures montrent que le motif UbdA peut adopter différentes conformations permettant différents rôles : surface d'interaction avec Exd ou charnière entre l'HD et les domaines C-terminaux. En plus des motifs d'Ubx important pour la fonction de régulation, Ubx et Exd comportent des motifs intrinsèquement désordonnés appelés linker et bras N-terminal de l'homéodomaine, respectivement. Ces motifs interagissent avec l'ADN au niveau du sillon mineur et ont la capacité d'explorer l’environnement. Nous avons étudié l'extrémité en C-terminale d'Exd. Ce motif forme une quatrième hélice dont le repliement peut influer sur les contacts établis avec Ubx et avec l'ADN. L'ensemble de ces observations nous a permis d'apporter des éléments supplémentaires pour la compréhension de la spécificité de fonctions et de contribuer à alimenter les modèles de scannage de l'ADN de type monkey bar et d'« interface glissante »
Hox proteins are homeodomain proteins belonging to the Transcription Factors superfamilly. These proteins are necessary for the determination of the cellular identity along the anteroposterior, dorsoventral and proximodistal axes. It's essential to recognize DNA targets with high specificity. One possible mechanism to acquire specificity implies the cooperativity between Hox and their PBC partners. Ubx (Hox) and Exd (PBC) proteins from D. melanogaster are the object of this work. One mechanisme of coopertivity involves the “hexapeptide” motif in Ubx and another one that involves its UbdA motif. The UbdA motif is located C-terminal to the recognition helix. We have solved seven different structures of Ubx-Exd-DNA complexes. Thanks to these structures, we show that UbdA can have a multipurpose role : it can provide an interaction surface to contact Exd and it can also act like a hinge between the C-terminal regions of Ubx and its homeodomain. UbdA and HX motifs from Ubx are not the only regions involved in the control of these proteins functions. Ubx and Exd also contain intrinsically disordered regions which are the linker region and the homeodomain N-terminal arm, for Ubx and Exd respectively. They interact with the DNA in the minor groove and can explore the space around. We studied the Exd 's C-terminal motif and determined that it has a flexible, helical fold. The folding of this fourth helix could modify the contacts established with Ubx and with the DNA. All these observations allow us to add supplementary information for the understanding of functional specificity and provide new arguments for the monkey-bar and for the « gliding interface » DNA- scanning models

Ma thèse a porté sur des complexes de polyélectrolytes en solution et en films LbL pour la transfection de cellules et le contrôle des interactions cellule-surface. Il est possible de doser un agent de transfection et de l'ADN plasmidique dans des films LbL en ajustant le nombre de couches. Les efficacités de transfection avec différentes lignées cellulaires ont été au moins aussi bonnes que celles rapportées dans la littérature, mais sont restées globalement faibles. Différents nanobags ont également été systématiquement testés menant à un protocole de transfection très efficace avec une faible cytotoxicité pour des fibroblastes humains qui sont difficiles à transfecter. Nous avons pu identifier les architectures LbL qui permettent de contrôler l'adhésion cellulaire même en présence de sérum. Cela nous a permis d'introduire une nouvelle technique pour le suivi in situ de la transfection par QCM-D en suivant la mobilité du cytosquelette qui sera poursuivie dans un futur projet.