Дисертації: "Clonage de génome"

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Baby, Vincent. "Analyse, clonage et transplantation du génome de la bactérie Mesoplasma florum." Thèse, Université de Sherbrooke, 2017. http://hdl.handle.net/11143/11582.

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Анотація:

Grâce aux progrès de la synthèse et de l’assemblage d’ADN, il est maintenant possible de créer des génomes complètement différents de ceux retrouvés dans la nature. Il sera bientôt possible de concevoir des bactéries ayant des génomes fait sur mesure pour pouvoir répondre à différentes problématiques qui touchent notre société. Par contre, le design rationnel de génome n’est pas encore possible, car les contraintes à respecter pour qu’un génome soit fonctionnel nous sont encore largement inconnues. De plus, le faible nombre d’organismes minimaux modèles ne permet pas encore de tirer de conclusions générales. J’ai donc cherché à améliorer ces deux aspects, en développant un nouveau modèle pour la génomique synthétique et en combinant plusieurs approches pour déterminer les éléments génétiques essentiels de son génome. Lors de mes travaux, j’ai dans un premier temps cloné le génome complet de la bactérie Mesoplasma florum L1 sous la forme d’un chromosome artificiel dans la levure Saccharomyces cerevisiae. J’ai fait une analyse transcriptionnelle ainsi qu’une analyse de croissance de cette souche de levure pour déterminer que le génome bactérien avait un impact limité sur son hôte. J’ai aussi observé de la transcription cryptique issue du génome cloné. J’ai ensuite pu découvrir que la transplantation du génome bactérien est une manipulation mutagène et que cet effet est amplifié par la distance phylogénétique entre le génome transplanté à partir de la levure et la bactérie réceptrice, Mycoplasma capricolum sous-espèce capricolum. Ces connaissances et la mise point de la boucle de clonage et transplantation permettent de mieux comprendre ce processus encore peu caractérisé et de positionner M. florum comme modèle pour la génomique synthétique. J’ai ensuite identifié les éléments importants du génome de M. florum en combinant une approche de génomique comparative sur 13 souches appartenant à cette espèce et la mutagénèse par transposons chez la souche L1. J’ai pu ainsi identifier des gènes plus ii propices à la délétion et à concevoir des plans de réduction du génome de cette souche. J’ai par la suite comparé ces plans au génome de la bactérie minimale Mycoplasma mycoides sous-espèce capri JCVI-syn3.0. J’ai finalement démontré que bien que ces bactéries soient phylogénétiquement proches, une bactérie minimale construite à partir de M. florum serait différente de la souche JCVI-syn3.0 et que la combinaison d’information sur la conservation et l’essentialité des gènes permet d’arriver à une bonne approximation de ce que serait génome minimal d’une bactérie.

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Rideau, Fabien. "Clonage et modification du génome de Mycoplasma hominis dans la levure Saccharomyces cerevisiae." Thesis, Bordeaux, 2018. http://www.theses.fr/2018BORD0227/document.

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Анотація:

Mycoplasma hominis est un pathogène humain opportuniste responsable d’infections génitales et néo-natales. Modifier génétiquement cette bactérie est nécessaire afin de comprendre les mécanismes de virulence et d’infection de ce pathogène. Il n’existe à ce jour aucun outil moléculaire efficace permettant de manipuler le génome de M. hominis, limitant les recherches sur sa pathogénicité et son métabolisme particulier reposant sur l’arginine. De nouvelles technologies rassemblées sous le terme de Biologie de Synthèse (BS) ont récemment émergé, offrant des perspectives inédites pour l’étude des mycoplasmes en permettant de modifier leurs génomes à grande échelle et de produire des souches mutantes. Ces travaux menés au J. Craig Venter Institute (JCVI, USA) ont montré que le génome de mycoplasmes apparentés pouvait être cloné et manipulé dans la levure avant d’être transplanté dans une cellule receveuse. La levure sert d’hôte d’accueil temporaire pour modifier le génome de la bactérie. Cette approche novatrice ouvre de nombreuses perspectives dans le cadre du développement de la génomique fonctionnelle chez les mycoplasmes pour lesquels les outils génétiques efficaces sont peu nombreux. Le but de cette thèse a été d’adapter pour la première fois certains outils de BS à M. hominis dans le but de créer des mutants déficients pour une fonction donnée. Pour cela, le génome de la souche type de M. hominis PG21 (665 kb) a été cloné dans la levure Saccharomyces cerevisiae par « Transformation-Associated Recombination cloning » (TAR-cloning). Deux clones (B3-2 et B3-4) de levure possédant le génome complet de M. hominis ont été validés par analyse en PCR simplex, PCR multiplex et électrophorèse en champs pulsé (PFGE). Ces clones levures ont ensuite été propagés en milieu sélectif durant 180 générations (30 passages), afin d’évaluer la stabilité du génome bactérien dans son hôte. Cette expérience a montré que (i) si la taille du génome de M. hominis ne variait pas au cours des premiers passages, elle diminuait progressivement à partir du dixième passage (≈60 générations), et que (ii) les zones du génome enrichies en séquence répétées étaient préférentiellement perdues. En tenant compte de ces résultats, le génome de M. hominis a été modifié chez le clone B3-4 par la technique « Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 » (CRISPR/Cas9) lors de passages précoces. Des clones de S. cerevisiae possédant un génome de M. hominis PG21 complet délété du gène vaa, codant une protéine d’adhésion majeure, ont été ainsi produits. La dernière étape de cette approche consistait à transplanter le génome modifié dans une cellule receveuse de M. hominis ou de Mycoplasma arthritidis, espèce phylogénétiquement la plus proche de M. hominis. Aucun protocole de transformation de M. hominis n’étant disponible au début de nos travaux, cette étape constituait un verrou majeur dans la mise en place des outils de BS chez cette espèce. Ce verrou a été en partie levé puisqu’une méthode de transformation de M. hominis basée sur du polyéthylène glycol (PEG) et mettant en jeu le plasposon pMT85 (plasmide contenant un transposon conférant la résistance à la tétracycline) a été mise au point au laboratoire. Cette technique de transformation, développée pour la souche de référence M. hominis M132 (745 kb) reste encore peu efficace ; elle est néanmoins reproductible et a permis d’obtenir des mutants d’intérêt de M. hominis. Le transformant n°28-2 a, ainsi, été muté dans le gène Mhom132_2390, codant le précurseur de la protéine P75, une adhésine putative de M. hominis. Le séquençage des génomes complets d’autres transformants a révélé l’insertion de multiples copies du transposon et la présence d’évènements de duplication et d’inversion de larges fragments d’ADN dans au moins deux génomes de M. hominis
Mycoplasma hominis is an opportunistic human pathogen responsible for genital and neonatal infections. Genetically modifying this bacterium is necessary to understand the virulence and infection mechanisms of this pathogen. There is currently no effective molecular tool to engineer the genome of this bacterium, limiting research on its pathogenicity and its peculiar metabolism based on arginine.New technologies have recently emerged in the field of Synthetic Biology (BS), offering new perspectives for the study of mycoplasmas by allowing large scale genome modifications and the production of mutant strains. Work at the J. Craig Venter Institute (JCVI, USA) has shown that the genome of related mycoplasmas can be cloned and manipulated in yeast before being transplanted into a recipient cell. The yeast serves as a temporary host to modify the genome of the bacterium. This innovative approach opens many perspectives in the development of functional genomics in mycoplasmas for which there are few effective genetic tools. The goal of this thesis was to adapt a number of BS tools to M. hominis for the first time, in order to create mutants deficient for a given function. To achieve this goal, the genome of the M. hominis type strain PG21 (665 kb) was cloned into the yeast Saccharomyces cerevisiae by Transformation-Associated Recombination cloning (TAR-cloning). Two yeast clones (B3-2 and B3-4) possessing the complete genome of M. hominis were validated by simplex PCR, multiplex PCR and Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) analyses. These yeast clones were then propagated in a selective medium for 180 generations (30 passages) to evaluate the stability of the bacterial genome in its host. This experiment showed that (i) the size of the genome of M. hominis did not change during the first passages, it decreased progressively from the tenth passage (≈60 generations), and (ii) the enriched genome areas in repeated sequence were preferentially lost. Thus, the genome of M. hominis was modified in the B3-4 clone at early passages using the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 (CRISPR/Cas9) technology. Yeast clones with a complete M. hominis PG21 genome with a deleted vaa gene, encoding a major adhesion protein, were produced using this approach. The final step of this approach was to transplant the modified genome into a recipient cell of M. hominis or Mycoplasma arthritidis, the species phylogenetically closest to M. hominis. As no M. hominis transformation protocol was available at the beginning of our work, this step constituted a major obstacle in the implementation of BS tools in this species. This barrier has been partially lifted since a method of transformation of M. hominis based on polyethylene glycol (PEG) and involving the plasposon pMT85 (plasmid carrying a transposon conferring resistance to tetracycline) has been developed in the laboratory. This transformation technique, developed for the reference strain M. hominis M132 (745 kb) still remains not very efficient; it is nevertheless reproducible and allowed to obtain M. hominis mutants of interest. The Mhom132_2390 gene, encoding the precursor of the P75 protein, a putative adhesin of M. hominis, was effectively mutated in transformant No. 28-2. Complete genome sequencing of other transformants revealed the insertion of multiple copies of the transposon and the presence of duplication and inversion of large DNA fragments within at least two M. hominis genomes.In conclusion, this data has opened the way for the development and transposition of existing genetic modification approaches to M. hominis, previously considered as a genetically intractable bacterium

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Zézé, Adolphe. "Isolement de séquences répétées du génome d'un champignon endomycorhizogène à arbuscules scutellospora castanea : application à la détection in planta." Dijon, 1995. http://www.theses.fr/1995DIJOS027.

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Les champignons endomycorhizogènes à arbuscules (glomales) sont des symbiotes obligatoires qui jouent un rôle très important pour le développement et la bioprotection de la plante. Les connaissances génétiques et moléculaires de ces champignons sont encore parcellaires, du fait de l'impossibilité de les cultiver sans la plante-hote. La mise au point d'une technique d'extraction d’ADN de spores de champignons endomycorhizogènes a arbuscules a permis de réaliser un clonage partiel de l’ADN de l'espèce scutellospora castanea. Le criblage de cette banque génomique a permis de mettre en evidence des séquences répétées par hybridation moléculaire. L'hybridation en dot ou en southern de l’ADN de spores des espèces s. Castanea, gigaspora rosea, glomus caledonium et acaulospora laevis avec un échantillon de séquences répétées a permis de mettre en évidence une séquence (sc1), spécifique de s. Castanea et une autre (myclire), présente chez les quatre espèces utilisées. Une caractérisation approfondie a été entreprise montrant que la séquence sc1 est organisée en tandem dans le génome de s. Castanea, et possède des séquences répétées directes ; aucun cadre de lecture ouvert n'a ete trouve. Par ailleurs cette séquence possède plusieurs codons stop et ne code pour aucune proteine. La séquence sc1 pourrait donc être une séquence de structure heterochromatique. La séquence myclire, dispersée dans le génome de s. Castanea, possède des séquences répétées directes et répétées inversées. Par ailleurs des séquences à autonomie de réplication (ars) et des éléments centromeriques (cde) ont été mis en évidence dans cette séquence ; ce qui ferait de cette séquence un élément centromérique a autonomie de réplication. En vue de mettre au point des outils de détection spécifique par la technique pcr, des amorces ont été choisies de la séquence sc1 pour amplifier électivement l’ADN de spores de s. Castanea et l’ADN de racines de poireau infectées par cette espèce. Le choix d'un couple d'amorces de la séquence non spécifique myclire a permis de suivre la variation inter générique de cette séquence après amplification de l’ADN de spores et analyse comparée des produits d'amplification. Cette analyse a permis de montrer que cette séquence est conservée sous forme allélique chez les espèces g. Rosea, g. Caledonium, s. Castanea et s. Pellucida alors qu'elle a subi une modification très importante chez l'espèce a. Laevis

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Lacasa, Michel. "Le virus herpétique du poisson-chat : structure et clonage du génome, transcription in vivo." Paris 6, 1986. http://www.theses.fr/1986PA066233.

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Jegot, Gwenhael. "Mise au point d'un système dérivé du transposon Mos1 comme vecteur non viral de transfert de gène en cellules eucaryotes." Tours, 2007. http://www.theses.fr/2007TOUR4014.

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Le transposon Mariner Mos 1 a la capacité intrinsèque de changer de position dans le génome. Le premier axe de mes travaux de thèse est consacré aux caractéristiques du transposon influençant l'activité de transposition de l'élément Mos1 (dont la composition nucléique du transposon et sa taille). Il a permis de montrer qu'un de transgène de taille supérieure à 2,5kb limite l'efficacité de transposition, qu'un fort pourcentage en GC favorise la transposition, et qu'il n'existe pas de taille minimale pour la transposition de Mos1. Le deuxième axe de recherche porte sur l'adaptation et l'amélioration du système Mos1 au contexte des cellules eucaryotes, pour développer un vecteur intégratif non viral de transfert de gène. L'ajout d'une séquence de localisation nucléaire améliore le transfert du noyau, l'humanisation de la séquence de la transposase augmente son expression en cellules de mammifères, et l'utilisation d'un système suicide HSVVtK permet de limiter les évènements de recombinaison
The mariner Mos 1 transposon can naturally move into the genome. The first research axis of this work concern the transposon characteristics which act upon the transposition activity of Mos1 (like the nucleic content of the transposon and its size). It have shown that a size of transgene upper than 2,5 kb limit the transposition efficiency, that a strong GC percentage favour the transposition, and that there is no minimal size for Mos1 transposition. The second research axis concern the adaptation and improvement of the Mos1 system to the eukaryotic cells, to developp a nonviral vector for gene transfer. The addition of a nuclear localization sequence improve the nuclear transfer, the "humanization" of the transposase sequence increase it expression in mammal cells, and the use of the HSVtK suicide system permit to limit the recombination events

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Bui, Linh Chi. "Interactions entre informations ovocytaires et informations embryonnaires au moment de l'activation du génome chez les mammifères." Paris 11, 2006. http://www.theses.fr/2006PA112254.

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L’activation transcriptionnelle du génome est une étape critique de l’embryogenèse. Jusqu’alors régulé strictement par l’information maternelle, le développement passe progressivement sous le contrôle embryonnaire. Cette transition (MET - Maternal Embryonic Transition) suppose des interactions, étroitement régulées et déterminantes pour le développement ultérieur de l’embryon, entre l’information maternelle cytoplasmique et le noyau embryonnaire qui devient totipotent. Parce qu’il perturbe les interactions nucléocytoplasmiques mais permet un développement à terme, donc la restauration de la totipotence nucléaire ("reprogrammation"), le clonage représente un modèle d’étude de ces interactions. Dans ce contexte, notre recherche a été conduite avec l’objectif d’analyser comment s’acquiert l’état particulier qui caractérise le noyau embryonnaire au moment oū il initie ses premières synthèses en devenant transitoirement totipotent. A cette fin, nous avons développé une étude comparative du patron d'expression des gènes dans l'embryon de bovin issu d'un développement normal, représentant le contrôle de rétablissement optimal de la totipotence (reprogrammation MET), et d'un développement où les interactions nucléocytoplasmiques sont expérimentalement perturbées par clonage somatique, représentant des situations de décroissance progressive de l’efficacité de reprogrammation. Le choix du modèle bovin, parce qu’il procure ces situations biologiques différentielles, et la volonté d’obtenir une information pertinente sur un processus global par analyse transcriptomique de ces situations nous ont conduit à développer des outils et des approches moléculaires appropriés (réseau d'ADNc dédié, procédure pertinente de criblage différentiel à partir de matériel rare). Notre travail a permis d’accéder à une description dynamique des deux modes de reprogrammation étudiés. Ces résultats mettent en lumière une corrélation directe et "quantitative" entre: l’ampleur de la reprogrammation de l’expression des gènes (ou le degré de corrélation entre les 2 modes de reprogrammation) et l’efficacité fonctionnelle de la reprogrammation se soldant par un développement à terme des individus clonés. Ils pourraient donc déboucher sur la mise en œuvre d’un critère prédictif précoce de l’aptitude de lignées de cellules donneuses de noyaux à une reprogrammation efficace, permettant de prévoir le potentiel de développement à terme des embryons reconstitués par transfert de leurs noyaux. Au-delà de ces perspectives d’application, l'utilisation de cette approche de comparaison globale devrait nous permettre de mieux caractériser l'état totipotent en vue de comprendre les conditions de sa restauration
Transcriptional activation of the genome is a critical step in embryogenesis. Until that point, development is regulated strictly by maternal information, before gradually moving under embryonic control. This transition (MET for Maternal Embryonic Transition) implies interactions which are closely regulated and determinant regarding subsequent embryonic development between maternal cytoplasmic information and the embryonic nucleus which becomes totipotent. Because it perturbs nucleocytoplasmic interactions but enables long-term development, and hence the restoration of nuclear totipotence ("reprogramming"), cloning constitutes a study model for these interactions. In this context, our research was carried out with the aim of analysing the acquisition of the particular state which characterises the embryonic nucleus at the time it initiates its first syntheses by becoming transiently totipotent. For this purpose, we developed a comparative study of the pattern of gene expressionin bovine embryo arising from normal development, thus representing control of the optimum restoration of totipotence (MET reprogramming), and development where the nucleocytoplasmic interactions were experimentally perturbed by somatic cloning, representative of a gradual decline in reprogramming efficiency. The choice of the bovine model (because it enables these differential biological situations) and our desire to obtain relevant data on a global process through transcriptomic analysis of these situations, led us to develop appropriate molecular tools and approaches (dedicated cDNA network, appropriate procedure for differential screening starting from scarce material). Our work enabled access to a dynamic description of the two reprogramming modes studied. These results highlighted a direct and "quantitative" correlation between the extent of reprogramming of gene expression (or the degree of correlation between the two reprogramming modes) and the functional efficacy of reprogramming resulting in the subsequent long term development of cloned individuals. The results may thus enable the implementation of an early-stage predictive criterion concerning the aptitude of nucleus-donor cell lines for efficient reprogramming, enabling prediction of the long-term potential for development of embryos reconstituted by transfer of their nuclei. In addition to these perspectives for application, use of this global comparative approach should allow us to better characterise the totipotent state and thus understand more clearly the conditions required for its restoration

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Breuils, Laure. "Clonage et caractérisation de récepteurs de type olfactif humains exprimés dans la langue." Nantes, 2003. http://www.theses.fr/2003NANT2040.

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L'expression de récepteurs de type olfactif (OLRs) dans les bourgeons gustatifs de rat a été rapportée, suggérant leur implication dans la perception du goût en tant que récepteurs gustatifs. L'objectif de cette thèse était d'identifier et de caractériser des OLRs exprimés dans les tissus gustatifs humains. Neuf gènes et huit pseudogènes d'OLRs exprimés dans la langue humaine adulte et/ou fœtale ont été identifiés par RT-PCR. Leurs orthologues murins ont été déterminés : 5 sont exprimés dans la langue de souris adulte, dont 3 spécifiquement dans les papilles gustatives. Ils sont tous exprimés dans les tissus sensoriels et le cerveau, mais sont rarement détectés dans d'autres organes. L'un d'eux semble cependant présenter une expression ubiquitaire. Les expériences d'hybridation in situ, n'ont pas permis de détecter clairement l'expression de ces récepteurs dans les cellules gustatives. Un outil cellulaire visant à identifier les ligands de ces récepteurs a été construit
The expression of olfactory like receptors (OLRs) in rat taste buds has been previously described, suggesting their involvement in taste perception as gustatory receptors. The aim of this work was to identify and characterize human OLRs expressed in human gustatory tissues. Nine OLRs genes and eight pseudogenes expressed in human adult and/or foetal tongue were identified by RT-PCR. Their murine orthologs were assigned: 5 are expressed in adult mouse tongue, among which 3 are expressed specifically in gustatory papillae. The latter were detected in sensory tissues and brain, but rarely in other organs. Nevertheless, one of them seems to be ubiquitously expressed. In situ hybridization experiments did not show a clear expression of these receptors in mouse taste buds. A cellular tool was constructed in order to identify the ligands of these receptors

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Jourdan, Mireille. "Clonage et séquençage du génome infectieux d'un Parvovirus d'Insecte, le Densovirus du Lépidoptère Junonia coenia." Montpellier 2, 1990. http://www.theses.fr/1990MON20320.

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La carte physique du genome du densovirus de junonia coenia (jc dnv) a ete etablie pour 37 sites de restriction a l'aide de 25 enzymes. Une sequence correspondant a la quasi-totalite du genome a ete clonee dans pbr322 au site unique eco rv. Le plasmide obtenu (pbrj) est capable de transfecter les larves de l'insecte sensible spodoptera littoralis avec la meme efficacite que l'adn extrait des virions. Les virions issus de cette transfection sont identiques a ceux de type sauvage par leurs proprietes biologiques et biophysiques. L'insert viral de pbrj a ete sequence dans sa totalite, soit 5908 nucleotides. Plusieurs proprietes remarquables du genome sont detuites de cette sequence. Les extremites du genome sont constituees d'une repetition inversee de 517 nucleotides dont les 96 premiers du cote du site hind iii de pbr322 forment une structure bicatenaire en y. L'analyse de cette sequence a revele une organisation originale au sein de la famille des parvoviridae. En effet, les eux brins d'adn possedent une capacite de codage equivalente contrairement aux parvovirus de vertebres dont un seul des brins est codant. Sur l'un des brins, l'orf1 majeur code pour les proteines structurales tandis que trois autres orfs sur le brin oppose codent pour les proteines non structurales. La comparaison au niveau des sequences proteiques entre le genome du jc dnv et celui des autres parvovirus a mis en evidence des homologies au niveau des proteines de capside (region pgy) et de la proteine non structurale (ns1, region gkrn). Par l'organisation unique de son genome, le densovirus de j. Coenia constitue un phylum a part au sein des parvoviridae

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Lecerf, Frédéric. "Déterminisme génétique de la prolificité chez les ovins : clonage positionnel du gène Booroola et localisation du gène Lacaune." Montpellier, ENSA, 2003. http://www.theses.fr/2003ENSA0010.

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La folliculogenèse assure le déroulement de la fonction de reproduction femelle. L'étude des variations phénotypiques affectant le taux d'ovulation dans des populations permet d'identifier des mutations naturelles dans des gènes ayant une incidence majeure sur la fonction ovarienne. Mes travaux de thèse ont permis de localiser le locus Lacaune dans une région chromosomique de 4 cM sur le chromosome 11 ovin. Mes travaux de thèse ont permis d'identifier la mutation causale dans le gène BMPR-IB responsable du phénotype hyperprolifique Booroola. Durant l'étape d'identification du gène Booroola, une nouvelle méthode (HSA) a été mise au point pour sélectionner les transcrits spécifiques d'un tissu et d'une région chromosomique. L'identification du gène Booroola a contribué à la mise en évidence du rôle primordial des BMP sur la fonction ovarienne. L'identification du gène responsable du phénotype Lacaune permettra de mettre en lumière un autre facteur important pour cette fonction
Folliculogenesis is the biological mechanism of the female reproductive function. The study of phenotypic variations affecting ovulation rate in populations enables to identify natural mutations with a major impact on ovarian function. In the Course of my thesis research, I have localised the Lacaune locus within a 4 cM region on ovine chromosome 4 and identified the causal mutation of the hyper prolific Booroola phenotype in the BMPR-IB gene. For the identification of the Booroola gene, 1 developed a new method (HSA, for Hybrid Specific Amplification) to select transcripts specific of a tissue and a chromosomal region. The identification of the Booroola gene contributed to highlight the primordial role of Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) in ovarian function. The identification of the gene responsible for the Lacaune phenotype will enable to identify another factor important for this function

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Khan, Daulat Raheem. "Reprogrammation embryonnaire et somatique au moment de la mise en route du génome dans l’embryon bovin." Thesis, Paris 11, 2011. http://www.theses.fr/2011PA11T060.

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Lors de la fécondation, le sperme et l'ovule s'unissent pour former un zygote totipotent. Initialement, le zygote est transcriptionnellement inactif. Au cours des premiers clivages a lieu la mise en route du génome embryonnaire (EGA) et le développement passe alors sous le contrôle de l’information embryonnaire (au stade 8-16-cellules chez le bovin). Cette transition d’un contrôle maternel à un contrôle embryonnaire est appelée « maternal to embryonic transition (MET) ». De la même façon, lors du transfert nucléaire (clonage), un noyau de cellule somatique placé dans un ovocyte énucléé devient totipotent. Ce processus est appelé «reprogrammation nucléaire somatique?». En fait, la reprogrammation nucléaire lors du clonage est équivalente à la MET, toutefois, le clonage est très peu efficace. Les objectifs de cette étude chez les bovins sont a) d'explorer le processus de reprogrammation lors de la MET dans des embryons fécondés in vitro (FIV) et b) d’estimer l'efficacité de la reprogrammation génique après le transfert nucléaire lors du clonage. Nous émettons l'hypothèse que l'acquisition d'un profil d'expression génique correct pourrait être prédictif d’un potentiel de développement à terme de l'embryon, et pourrait être évalué dès juste après l'activation du génome embryonnaire (EGA) chez les bovins. Nous avons développé notre travail selon deux axes a) des analyses globales d'expression génique utilisant une puce dédiée à l’EGA et b) l’analyse du profil d'expression de gènes candidats par qRT-PCR dans les embryons fécondés et clonés. Dans un premier temps nous avons optimisé le protocole d'amplification d'ARNm pour l'analyse du transcriptome de matériels rares. Puis nous avons fait l'analyse du transcriptome avant et après EGA d’embryons issus d’ovocytes prélevés sur des vaches phénotypées comme « bonnes » ou « mauvaises » donneuses d’embryons. En outre, ces ovocytes ont été maturés soit in vivo soit in vitro. Nos analyses montrent que l'effet individuel est plus important que l'effet « bonne ou mauvaise donneuse » ou même que l’effet « conditions de maturation ». Nous avons ensuite analysé les expressions géniques de 5 types d'embryons clonés ayant différents potentiels de développement à terme en fonction de la lignée cellulaire utilisée comme source de cellules donneuses. Globalement, leur expression génique est proche de celle de morulae FIV, mais quelques gènes présentent une expression différente. Ces gènes varient avec la lignée de cellules donneuses et leur nombre n’est pas lié à l’aptitude au développement à terme. L’analyse d’un lien éventuel entre leur nature et cette aptitude devra être poursuivie. Dans un deuxième temps, nous avons analysé les profils d'expression spatio-temporelle des transcrits et des protéines des gènes de pluripotence (OCT4, SOX2 et NANOG) et les niveaux d'ARNm de certains de leurs cibles dans les ovocytes et les embryons précoces chez le bovin. Les profils d'expression de ces gènes ont aussi été analysés dans des embryons clonés présentant différents potentiels de développement à terme. Nos résultats montrent que (1) la triade de gènes de pluripotence n'est probablement pas impliquée dans l’EGA bovine. (2) les transcrits et protéines de SOX2 et de NANOG sont restreints au lignage pluripotent plus tôt que ceux de OCT4, (3) les embryons à faible taux de développement à terme ont un taux de transcription plus élevé, néanmoins, l’équilibre précaire entre les gènes de pluripotence est maintenue. Cet équilibre pourrait permettre un développement normal in vitro, mais le taux de transcription plus élevé pourrait avoir des conséquences délétères sur le développement ultérieur
In natural fertilization, sperm and ovum unite to form a totipotent zygote. Initially, the zygote is transcriptionally inactive and after few cleavages (8-16-cell stage in bovine) embryonic genome activation (EGA) takes place and embryo shifts from maternal to embryonic control, the process called maternal to embryonic transition (MET). Likewise, in nuclear transplantation (cloning) a somatic cell nucleus achieves totipotency when placed in an enucleated oocyte, the process called “nuclear reprogramming”. In fact, nuclear reprogramming in cloning experiments is equivalent to MET; however, this process is afflicted with low efficiency. The objectives of this study in bovine were a) to explore the process of MET reprogramming of in vitro fertilized (IVF) embryos and b) to estimate the efficiency of gene reprogramming after nuclear transfer in animal cloning. We hypothesized that the acquisition of a proper gene expression pattern could herald development potential of the embryos, which could be assessed as early as morula stage or after embryonic genome activation (EGA) in bovine. Here, we opted for a study plan consisting of two axes a) global gene expression analysis using an EGA-dedicated microarray and b) candidate gene expression profiling through qRT-PCR in the fertilized and cloned bovine embryos. Firstly, we optimized the protocol of mRNA amplification for transcriptome analysis which generates antisens-RNA (aRNA). Then we did transcriptomic analysis of the 4-cell and morulae derived from two genotypes having better and two genotypes having poorer in vitro embryonic development potentials. In addition, these oocytes were either matured in vivo or in vitro. We observed that the effect of individual genotype was more important than the effect of the phenotypic category (poorer or better) or conditions of oocyte maturation. Furthermore, we explored the expression patterns of 5 types of cloned embryos having different full term developmental potentials depending upon the donor cell line used. Their genes expression patterns closely resembled to the IVF morulae, except for few genes which present differences. These genes vary with the cell line used as somatic cell donor for SCNT and the number of these deregulated genes did not increase with the poorer developmental potential of the cloned embryos. The analysis of an eventual correlation between the potential for embryonic development to term and nature of the deregulated genes should be addressed. Secondly, we charted quantitative and/or qualitative spatio-temporal expression patterns of transcripts and proteins of pluripotency genes (OCT4, SOX2 and NANOG) and mRNA levels of some of their downstream targets in bovine oocytes and early embryos. Furthermore, to correlate expression patterns of these genes with term developmental potential, we used cloned embryos, instead of gene ablation, having similar in vitro but different full term development rates. We chose these genes to be analysed since pluripotency genes are implicated in mouse embryonic genome activation (EGA) and pluripotent lineage specification. Moreover, their expression levels have been correlated with embryonic term development. Our findings affirm: first, the core triad of pluripotency genes probably is not implicated in bovine EGA since their proteins were not detected during pre-EGA phase, despite the transcripts for OCT4 and SOX2 were present. Second, an earlier ICM specification of SOX2 and NANOG makes them better candidates of bovine pluripotent lineage specification than OCT4. Third, embryos with low term development potential have higher transcription rates; nevertheless, precarious balance between pluripotency genes is maintained. This balance presages normal in vitro development but, probably higher transcription rate disturbs it at later stage that abrogates term development

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Boutin, Fontaine Marjorie. "Vers la modification et l’assemblage de novo du génome baculoviral en vue de la production de vecteurs AAV." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLE013.

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Анотація:

Le système baculovirus / cellules d’insectes est un outil performant pour la production de vecteurs AAV recombinant pour la thérapie génique. Cette production nécessite que, les gènes rep et cap de l’AAV ainsi que le transgène encadré par les ITR, soient codés dans le génome du baculovirus AcMNPV. L’utilisation de cassettes de recombinaison pour intégrer ces gènes provoque à grande échelle une certaine instabilité au sein des 134Kb du génome. Pour pallier à ce phénomène, une nouvelle stratégie d’intégration de gènes a été mise en place. Celle-ci doit permettre notamment d’éviter la présence de cicatrices de recombinaison et de modifier le génome du bacmid d’AcMNPV. Basée sur la technique de Gibson Assembly, nous avons tenté d’assembler de novo le génome du baculovirus d’AcMNPV à partir de fragments PCR chevauchants. Nous avons réussi à pré assembler en 4 parties la totalité du génome. Celles-ci ont permis d’insérer le gène de la GFP comme gène d’intérêt mais également d’éliminer le gène de résistance antibiotique et le Mini-F réplicon, facteur d’instabilité en cellules d’insecte. Plusieurs clones obtenus ne contiennent aucune mutation. Cette technique pourrait être appliquée à la production de vecteurs AAVr
The baculovirus / insect cell system allows AAV vector production for gene therapy purposes. Current baculoviruses used for the production of rAAV vectors are a bottleneck for Scaling up production. Indeed the use of recombination boxes to insert the genes brings instability to the134kb genome. To avoid this, a new gene integration strategy has been implemented. In this work, we have assayed the full assembly of AcMNPV´s genome using the Gibson Assembly technic. PCR fragments covering the totality of genome and able to assemble through overlapping terminal regions have been pre-assembled in 4 segments. The finally assembly should contain the eGFP gene used has gene of interest along with replacement of the Mini-F replicon by polyhedrin gene. This feasibility study has shown that we could obtain segments without any mutation. Final assembly is still on-going. This technology should be applied next for the generation of baculovirus used for the production of rAAV vectors. This marker less combination method should solve problems of genome instability

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Marin, Frédéric. "Diversification du répertoire génomique immun chez le mouton : analyse moléculaire du segment Vl et étude de sa possible implication sur le mécanisme de diversification somatique du répertoire B, première exploration du "locus" H et du processus dediversificatiom qui y opère." Paris 5, 1993. http://www.theses.fr/1993PA05P230.

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Le, Gall Olivier. "Clonage moléculaire du génome névopirus de la mosai͏̈que chromée de la vigne, GCMV : analyse de l'organisation génétique de l'ARN-1." Bordeaux 2, 1989. http://www.theses.fr/1989BOR22024.

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Mselli-Lakhal, Laïla. "Construction de vecteurs lentiviraux défectifs pour la réplication : étude du transport des ARN et des séquences impliquées dans l'encapsidation du génome du virus de l'arthrite et de l'encéphalite caprine (CAEV)." Lyon 1, 1997. http://www.theses.fr/1997LYO1T058.

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Cornu, François. "Etude de la structure primaire de l'oncogène c-kit." Paris 5, 1989. http://www.theses.fr/1989PA05P001.

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Shi, Zhengli. "Etude d'un virus bacilliforme des crevettes Penaeidae ("White Spot Syndrome Virus", WSSV) : clonage, analyse partiel[le] du génome et outils de diagnostic." Montpellier 2, 2000. http://www.theses.fr/2000MON20058.

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Анотація:

Le wssv (white spot syndrome virus) est un agent viral hautement pathogene pour les crevettes penaeidae en elevage. Il est a l'origine de l'effondrement de la production de crevettes en asie et plus particulierement en chine. Nos recherches ont d'abord porte sur la construction de differentes banques genomiques issues de fragments d'adn viral. A partir de ces donnees nous avons tente d'assembler des fragments afin de reconstituer le genome viral, d'en dresser la carte physique et d'en determiner sa taille. Un certain nombre de fragments sequences on pu etre analyses, et utilises comme outils de diagnostic. Nos resultats montrent que le wssv possede un genome d'une taille tres importante pour un virus (environ 300 kbp), montrant un profil de restriction (eco ri, hind iii et bam hi) tres complexe de par le nombre de sites detectes. L'analyse de sequences nucleiques et proteiques partielles n'a que tres peu montre de similarite avec des genes connus de virus. En revanche, certaines de ces sequences semblent plutot se rapprocher (par alignement de sequences et analyse phylogenetique) de genes d'eucaryotes comme la tata-box binding protein ou la ribonucleotide reductase. Ces resultats montrent que ce virus, malgre une convergence morphologique de sa structure avec celle des baculoviridae, serait eloigne de par ses caracteres genetiques de cette famille et appartiendrait plutot a une nouvelle famille virale. Enfin, de par son spectre d'hotes extremement large parmi les crustaces aussi bien marins que d'eau douce, le wssv apparait comme un virus extremement dangereux pour l'elevage des crustaces en general. Aussi, il etait important de developper des methodes de diagnostic specifiques, sensibles et precoces pour controler sa transmission au niveau de l'ecosysteme particulier que constitue la ferme d'elevage.

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Kivilcim, Forsman Zeynep. "Génie génétique et droit international." Paris 2, 2002. http://www.theses.fr/2002PA020067.

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Анотація:

Une réglementation internationale du génie génétique est indispensable en vue d'établir le partage équitable des retombées bénéfiques de ces techniques prometteuses et de fixer les limites de leur utilisation pour éviter les dangers éventuels. Cependant l'élaboration de cette réglementation suppose de résoudre le délicat problème de la conciliation des convictions éthiques diversifiées et des intérêts économiques contradictoires. Les questions de la recherche sur l'embryon, de la brevetabilité du génome ou encore de la prévention des risques engendrés par les organismes génétiquement modifiés soulèvent des difficultés politiques, économiques et juridiques. Diverses organisations internationales ont adopté des normes juridiques de force et de nature différentes pour régir ce domaine. Le processus d'élaboration des normes internationales en matière de génie génétique nous indique un enrichissement des modes procéduraux en droit international avec l'intervention des comités d'éthiques et des organisations non gouvernementales dans la formation des normes juridiques. La réglementation internationale du génie génétique atteste l'apparition des nouveaux droits qui sont difficiles à organiser juridiquement. Elle constitue par ailleurs un nouveau champ d'application pour le principe de précaution. Le concept de "patrimoine commun de l'humanité", concept très discuté du droit international s'implante également dans le domaine. Les mécanismes de contrôle du respect des normes sont plus poussées au niveau européen et plus particulièrement au sein de l'Union européenne. Au niveau universel, les textes n'ont souvent qu'une valeur de "soft law" mais témoignent de l'émergence d'une opinio juris concernant particulièrement les recherches sur le génome humain. Ceci dit en raison des fortes centrifuges économiques et politiques qu'il subit, le droit international du génie génétique reste divisé en des régimes conflictuels et s'avère en conséquence défectueux.

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Doyon, Kathy. "Clonage de gènes de petits vertébrés susceptibles de voir leur expression induite par des pesticides environnementaux et séquençage et assemblage du génome de l'hirondelle bicolore (Tachycineta bicolor)." Mémoire, Université de Sherbrooke, 2015. http://hdl.handle.net/11143/6869.

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Анотація:

Environ 3500 tonnes de pesticides sont étendues chaque année sur les terres agricoles du Québec. L’utilisation de plusieurs de ces substances a été interdite, car les ingrédients actifs qui les composaient avaient des effets toxiques sur les humains et/ou l’environnement. Malheureusement, certains qui sont toujours en vente ont aussi des effets secondaires non désirables. En effet, ces molécules exogènes ont le potentiel de moduler l’activation de protéines régulatrices comme le récepteur aux dioxines (AhR). AhR active, entre autres, l’expression de gènes faisant partie de la famille du cytochrome P450 (CYP1A1 et CYP1B1) qui sont impliqués dans la détoxification. Or, dans certains cas, ces enzymes mènent à la production de molécules mutagènes en augmentant la toxicité des ingrédients actifs en les métabolisant. Le projet global dans lequel s’insère ce projet de maîtrise vise à déterminer les effets génomiques des pesticides environnementaux sur des organismes vivants en milieu naturel dans les environs de la région de l’Estrie. Les espèces choisies comme modèles d’étude sont des insectivores, car les pesticides s’accumulent dans les lipides et que les insectes en sont une excellente source. Les consommateurs d’insectes sont donc d’excellents marqueurs du niveau de contamination de leur environnement par les pesticides. Les deux espèces sélectionnées sont l’hirondelle bicolore (Tachycineta bicolor) et la grande musaraigne (Blarina brevicauda). De façon plus spécifique, le projet de maîtrise se divise en deux principaux objectifs. Le premier objectif est de valider que les pesticides présents dans l’environnement sont en concentration suffisante pour modifier la régulation génétique d’animaux en milieu naturel. Cette validation se fera en comparant le taux d’expression de CYP1A1 et CYP1B1 (suite de leur activation par AhR) chez des bêtes ayant été exposées (ou non) à des pesticides. Comme le génome des deux modèles d’étude n’est pas encore séquencé, le clonage partiel des gènes à étudier (AhR et CYP1) a été entamé de même que la conception d’amorces qui permettra de quantifier le niveau d’expression de ces gènes par des réactions en chaîne par polymérase en temps réel (qPCR). À ce jour, une partie de la séquence d’AhR, de CYP1B1 et de trois gènes contrôles ont été séquencés pour l’hirondelle, ce qui a permis de concevoir des amorces pour la quantification de l’expression d’AhR et de deux contrôles. Pour la musaraigne, ce sont les gènes AhR, potentiellement CYP1A1 et trois contrôles qui ont été séquencés partiellement et ce sont les gènes AhR et les contrôles pour lesquels des amorces sont prêtes à être utilisées pour la quantification par qPCR. Le deuxième objectif est d’observer les effets génétiques des pesticides de manière globale sur des organismes vivants. Un génome de référence est donc nécessaire pour identifier les régions qui vont être régulées (directement ou indirectement) par les polluants d’origine agricole. Pour la grande musaraigne, c’est le génome de la musaraigne commune (Sorex araneus) qui sera utilisé, car ces deux espèces sont très proches phylogénétiquement. Par contre, pour l’hirondelle bicolore, le séquençage, l’assemblage et l’annotation de son génome seront essentiels parce que les espèces d’oiseaux actuellement séquencées sont trop éloignées pour permettre l’identification des régions qui seront régulées différemment en présence de pesticides. Le séquençage a été fait et l’assemblage a permis de couvrir 55% du génome de l’hirondelle bicolore. Cependant, il est très fractionné avec un N50 de 1339 et un peu plus de 600 000 contigs. Quelques étapes restent à accomplir pour optimiser l’assemblage tel que l’élimination de la contamination (estimée à 5%). L’annotation pourra être faite lorsque l’étape précédente sera finie. Compte tenu de l’ampleur du projet, ce qui a été effectué dans le cadre de la maîtrise contribuera grandement à la bonne continuation de celui-ci. Le projet global permettra de mieux comprendre l’impact des pesticides sur des organismes sauvages.

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Guesdon, Gabrielle. "Développement de méthodes de clonage de génomes entiers chez la levure pour la construction de souches châssis semi-synthétiques de Bacillus subtilis." Thesis, Bordeaux, 2022. http://www.theses.fr/2022BORD0204.

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Анотація:

Un des défis de la biologie de synthèse (BS), est d’apporter des solutions nouvelles à des enjeux globaux majeurs (thérapeutiques/sanitaires, climatiques), en particulier via la construction de souches de production utiles, performantes et respectueuses de l’environnement.Bacillus subtilis (Bsu) est une bactérie Gram+ non pathogène utilisée en biotechnologie comme plateforme de production de molécules d’intérêt. Or, des études récentes ont établi que des souches de Bsu génétiquement modifiées permettaient d’obtenir une plus grande production de protéines recombinantes. Cela suggère que la production de châssis Bsu réduits pourrait être une étape importante dans l’amélioration des souches à visée industrielle.Le projet ANR Bacillus 2.0 dans lequel s’inscrit cette thèse, vise à transposer à Bsu des outils récents du domaine de la BS, et à mettre en place un pipeline efficace pour construire à haut débit des châssis modulables selon l’application biotechnologique. Ce pipeline rassemble les technologies suivantes : (i) design d’un génome synthétique (ii) assemblage de fragments d’ADN chevauchants au sein de la levure Saccharomyces cerevisiae (iii) isolement du génome et transplantation dans une cellule receveuse bactérienne et (iv) sélection et caractérisation des souches mutantes.Les objectifs de cette thèse étaient d’attester la faisabilité de ces méthodes, en tentant de cloner et maintenir le génome réduit de Bsu MPG192 (2,86 Mb) dans la levure, puis de le modifier avec les outils d’ingénierie disponibles chez S. cerevisiae. Dans un premier temps des stratégies déjà décrites dans la littérature ont été déployées afin de cloner le génome entier de Bsu, mais sont restées infructueuses. En nous basant sur une approche de TAR-Cloning, nous avons tenté de cloner plusieurs fragments obtenus par restriction du génome de Bsu. Initialement, seuls cinq fragments sur sept ont été clonés. L’incapacité à cloner le plus grand de ces fragments (1,50 Mpb) est vraisemblablement due à un manque d’ARS et/ou à sa taille. Concernant le second fragment, un ensemble de facteurs peuvent expliquer notre échec : à nouveau le manque d’ARS mais aussi, la présence de nombreux éléments répétés (7 opérons ribosomiques) ou l’expression délétère de ces gènes. Finalement, d’autres expérimentations ont permis de découper le génome en sous-fragments de tailles variables (6kb à 515kb) et ainsi de cloner en 21 morceaux la totalité du génome de Bsu MGP 192. Le TAR-Cloning imposant des contraintes dans le choix des sites de restriction, une nouvelle méthode de clonage, appelée CReasPy-Fusion, a été développée. Elle combine le système d’édition CRISPR-Cas9 et la fusion entre des sphéroplastes de levure et des cellules bactériennes. Comme preuve de concept, nous avons d’abord travaillé avec six espèces de mycoplasmes, et démontré qu’il est possible de cloner et modifier des génomes entiers. Cette approche a ensuite été transposée à Bsu, validant pour la première fois la fusion entre des sphéroplastes de levure et des protoplastes de bactéries Gram+. Elle a permis la capture précise d’un fragment d’environ 150kb.Bien que le génome entier de Bsu n’ait pas été cloné dans la levure à ce jour, plusieurs éléments critiques ont pu être identifiés. Tout d’abord, ces travaux soulignent l’importance de la méthode de clonage à adopter en fonction de l’organisme avec lequel on travaille. Ensuite, ils mettent en exergue l’existence de facteurs biologiques et techniques qui expliquent les difficultés actuelles et qui devront être pris en compte dans la suite des expérimentations. Enfin, ils ont permis le développement d’une nouvelle technique de clonage appelée CReasPy-Fusion, qui vient étoffer le catalogue des méthodes déjà décrites. Par sa versatilité, elle ouvre des perspectives pour la capture de grands fragments de génome, pour l’élimination de loci problématiques, ou encore, en appui à l’assemblage de fragments synthétiques
One of the major challenges in the synthetic biology (BS) field, is to provide new solutions to global issues (therapeutic/sanitary or climatic), in particular through the construction of useful, efficient and environmentally friendly production strains.The well-characterized, non-pathogenic, Gram+ bacterium Bacillus subtilis (Bsu), is widely used in industry as a biotechnological workhorse. Recent studies have established that mutant strains with modified genomes are able to produce larger amounts of recombinant proteins. This suggests that the production of rationally designed Bsu chassis could be an important step in the improvement of valuable strains for industrial purposes.This work was performed within the Bacillus 2.0's ANR project, which aims at applying SB tools for Bsu, and at developing an effective pipeline for the high-throughput construction of versatile Bsu chassis strains. Selected SB technologies for the pipeline include (i) the synthetic genome design, (ii) the in-yeast DNA assembly methods using Saccharomyces cerevisiae, (iii) the from-yeast whole genome isolation and transplantation (GT) to a recipient bacteria cell and, (iv) the characterization of recombinant strains.The objectives of this thesis were to ensure the feasibility of these methods using a Gram+ bacterium, by showing, in particular, that it was possible to clone and maintain in S. cerevisiae the genome of a minimal Bsu strain, MPG192 (2.86 Mbp) and to modify it using the large repertoire of yeast genetic tools. Our first attempts to clone the entire Bsu genome into yeast using already described methods failed. Using a TAR-Cloning approach, we then attempted to clone large DNA fragments obtained by restriction of the Bsu genome. In a first experiment, five out of seven fragments were cloned. Difficulties to clone the largest fragment (1.50 Mbp), are presumably related to its size, and/or the lack of ARS elements. Concerning the other fragment, several factors have been proposed to explain the cloning failure: again, an insufficient number of ARS elements, but also, the presence of many repeated sequences (7 ribosomal operons), and/or the deleterious expression of these genes. Finally with other experiments, the whole 2.86 Mb genome was cloned in 21 pieces ranging from 6 kbp to 515 kbp. As TAR-Cloning imposes constraints in the choice of restriction sites, a new cloning method, called CReasPy-Fusion, was developed. This method allows the simultaneous cloning and engineering of mega-sized genome in yeast using the CRISPR-Cas9 system, after direct bacterial cell to yeast spheroplast cell fusion. As a proof of concept, we demonstrated that the method can be used to capture a piece of genome, or to clone and edit the whole genome from six different Mycoplasma species. This method was then adapted to Bsu, showing for the first-time yeast spheroplast and Gram+ protoplast cell fusion. A fragment of ~150 kb has been successfully cloned in yeast.Even if, the entire Bsu genome has not yet been cloned in yeast, several critical elements have been identified. First of all, this work underlines the importance of the cloning method to be adopted depending on the organism of interest. Then, it emphasizes the existence of both biological and technical factors that explain current difficulties and that will have to be taken into account in subsequent experiments. Finally, it enabled the development of the new in-yeast cloning method called CReasPy-Fusion which expands the catalog of technics already described. Through its versatility, it opens up prospects for the capture of large genome fragments, the suppression of problematic loci, and to support the assembly of synthetic fragments

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Robaglia, Christophe. "Étude du génome du virus Y de la pomme de terre : construction et utilisation de vecteurs d'expression en vue d'obtenir des plantes transgéniques résistantes à ce virus." Paris 11, 1988. http://www.theses.fr/1988PA112247.

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Анотація:

L’ADN complémentaire de l’ARN génomique de ce virus a été clone et séquence entièrement. Cet Arn comporte 9704 bases et peut coder pour une poly protéine de 3063 acides aminés que l'on a comparés à d'autres polyvirus. Des vecteurs d'expression bases sur le système de transformation génétique du plasmide ri d'agrobacterium rhizogenes ont été construits et utilisés pour introduire dans des plantes un gène artificiel codant pour la protéine de capside du virus

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Mathieu-Daude, Françoise. "Mode de reproduction de "Trypanosoma brucei" dans ses populations naturelles : implications taxonomiques et épidémiologiques." Montpellier 2, 1991. http://www.theses.fr/1991MON20284.

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Анотація:

Une analyse de genetique des populations menee sur 78 stocks de trypanosoma brucei s. L. Provenant de toute la zone de distribution du parasite, et basee sur l'utilisation de 18 loci isoenzymatiques variables, nous permet de presenter les conclusions suivantes: les populations naturelles de t. Brucei presentent une structure quasi-clonale. Les variants genetiques individualises sont assimilables a des clones naturels, ou a des familles de clones etroitement apparentes, stables dans l'espace et dans le temps. Ces clones naturels sont a considerer comme des unites taxonomiques (agamospecies) dans toute etude appliquee. Il n'est pas possible, en l'etat actuel de la genetique des populations des microorganismes, d'evaluer l'impact d'eventuels processus de recombinaison occasionnels sur le dernier des clones a l'echelle evolutive. De meme, on ne peut dire si la variabilite genotypique superieure observee dans le reservoir sauvage du parasite, par rapport aux cycles domestiques, est imputable a des phenomenes de recombinaison plus frequents, ou a une variabilite clonale plus forte. Il nous a ete possible d'individualiser un groupe de genotypes qui renferme la majeure partie des isolats humains d'afrique centrale et occidentale, et d'elaborer une sonde d'adn kinetoplastique specifique de ce groupe par la technique dite pcr. Ce groupe correspond a la sous-espece traditionnelle trypanosoma brucei gambiense. Notre sonde, qui confirme l'hypothese clonale, constitue un outil epidemiologique prometteur pour l'identification des parasites de ce groupe. Les autres sous-especes sont plutot a considerer comme des nosodemes que comme des phylums distincts

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Citti, Christine. "Contribution à l'étude de l'organisation du génome de S. Citri : caractérisation de deux tRNAs TRP chez S.Citri et des gènes correspondants, organisation de gènes de tRNAs et identification des gènes pyrG, purA et purB." Bordeaux 2, 1992. http://www.theses.fr/1992BOR28215.

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Montanié, Hélène. "Recherches sur des virus cytoplasmiques non enveloppés de "Portunidae" de Méditerranée." Montpellier 2, 1992. http://www.theses.fr/1992MON20276.

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Анотація:

Ce travail s'inscrit dans le cadre de l'etude de la specificite cellulaire avec pour modele biologique deux virus pathogenes de crustaces marins p et w2 et leurs hotes respectifs macropipus depurator et carcinus mediterraneus. La necessite de repliquer ces deux agents in vivo, permet de suivre l'expression d'autres viroses endemiques. De ce fait, un nouvel agent, le mdilv (macropipus depurator iridolike virus), a ete isole chez m. Depurator et rapproche de par ses caracteristiques de la famille iridoviridae. L'etude des virus p et w2 a permis de definir leur structure genomique respective. Tous deux ont un genome forme de 12 segments lineaires d'arn double brin repartis en trois classes selon la distribution 1/5/6 (l1, m1-m5, s1-s6). Cette caracterisation montre que, tres proches, ils font partie de la famille des reoviridae. Leur rattachement au genre aquareovirus est discute et la creation d'un nouveau genre ou tout au moins d'un sous-groupe dans le genre aquareovirus est proposee. Un clonage global d'adnc des 12 segments du virus p a permis d'obtenir trois clones, d6, e2 et b3, possedant un plasmide recombine dont l'insert correspond a un fragment de trois segments genomiques differents. L'insert bk 0,5 reconnait le segment l1, bk 0,7c l'un des cinq segments moyens (m) et bk 0,7a un des six petits (s). Ce sont les premieres sondes construites pour un reovirus aquatique

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Guidet, François. "Clonage et séquençage des ADNc de la petite sous-unité de la Rubisco et de la LHCP chez Raphanus sativus : leur utilisation comme marqueur de modifications du génome associées au photocontrôle de la transcription." Rouen, 1987. http://www.theses.fr/1987ROUES042.

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Анотація:

Deux sondes moléculaires, DNA complémentaire de la petite sous-unité de ribulose-1,5. Bisphosphate carboxylase (PSU) et de la "light harvesting chlorophyll a/b binding proteins" (LHCP) ont été clonées. Leur utilisation a permis de mettre en évidence des modifications du génome reliées à l'état de différenciation et/ou de l'irradiation donnée. La transcription de ces deux polypeptides (PSU) et (LHCP) est régulée par le phytochrome chez le radis (raphanus sativus)

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Ahombo, Gabriel. "Génétique de la fixation d'azote chez la bactérie Rhodobacter capsulatus : clonage et caractérisation d'un gène de type nifA." Grenoble 1, 1986. http://www.theses.fr/1986GRE10097.

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Thomas, Franck. "Expression des gènes rpl23, rpl2, rps19 et rps19' du génome chloroplastique d'épinard : identification des produits de quelques gènes de protéines ribosomiques." Grenoble 1, 1987. http://www.theses.fr/1987GRE10171.

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Анотація:

Le genome chloroplastique d'epinard est constitue d'une molecule d'adn circulaire (140 kbp) organisee en 4 regions: une sequence unique (lsc) et une petite sequence unique (ssc) separees par deux regions inversees repetees (ira et irb). L'expression des genes rp12, rps19 et rps19' est etudie. Les techniques de clonage et de cartographie a la nuclease s1 ont peris de montrer que le gene rps19' n'est pas exprime "in vivo" dans le chloroplaste en raison de la co-transcription sur l'autre brin des genes psba et trn h-gug. Les genes rp12 et rps19 codent respectivement pour les proteines ribosomiques chloroplastiques d'epinard l4 et s23 fortement homologues aux l2 et s19 d'e. Coli

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Mazan, Sylvie. "Structure et organisation des gènes codant pour l'ARN nucléolaire U3 chez la souris." Toulouse 3, 1990. http://www.theses.fr/1990TOU30081.

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Анотація:

L'arn u3, implique dans le controle de la biogenese des ribosomes, est code chez la souris par une petite famille multigenique, constituee de quatre genes fonctionnels codant pour la forme majeure u3b et d'un gene unique codant pour une forme variante u3a. Les deux formes d'arn u3a et u3b divergent assez substantiellement en sequence (environ 15%), gardent une structure secondaire tres analogue, (mais avec quelques differences selectivement maintenues chez les deux rongeurs etudies, le rat et la souris). Les deux types de genes sont exprimes differentiellement selon les conditions de croissance cellulaire. Les quatre genes u3b sont regroupes dans l'adn chromosomique mais ne s'organisent pas en repetition reguliere. Les homologies de sequence entre les quatre unites geniques u3b se limitent a une region relativement peu etendue dont le domaine central (contenant la region transcrite) reste parfaitement identique. La comparaison des segments de sequence homologues flanquant le domaine de sequence identique suggerent que des series de conversions geniques ont joue un role majeur dans l'evolution concertee de la famille multigenique. Le restant des regions intergeniques ne montre pas d'autre similarite mais revele l'accumulation de sequences repetitives (b1, b2 et l1) et la presence de motifs connus pour servir d'activateurs inductibles qui pourraient permettre des modulations differentes de l'expression de chacun des genes en reponse a des conditions de croissance cellulaire variees

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Rasschaert, Denis. "Étude d'un coronavirus, le virus de la gastro-entérite transmissible du porc : identification des gènes structuraux et non-structuraux et localisation d'un site antigénique majeur sur la séquence de la glycoprotéine de spicule E2." Paris 11, 1988. http://www.theses.fr/1988PA112082.

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Анотація:

Le virus de la Gastro-entérite du porc appartient à la famille des Coronaviridae, un groupe de virus enveloppés dont le génome est constitué d'un long ARN de polarité positive. La séquence des 8300 nucléotides en région 3' de l'ARN génomique du VGET (souche Purdue-115) a été établie à partir de clones d'ADNc. Par rapport au génome entier (> 20 kb) cela recouvre l'ensemble des séquences exprimées par l'intermédiaire des 6 ARNs subgénomiques détectés dans les cellules infectées. Ces ARNs forment, avec l'ARNg, des séquences emboîtées coterminales en 3', caractéristiques du mode de réplication des coronavirus. Une séquence hexamérique 5'CUAAAC3', présente juste en amont de chaque région codante, constituerait le site d'initiation de la transcription des ARNs du VGET. Outre les gènes des 3 protéines structurales E2, E1 et N, correspondant à la région unique des ARNm 2, 5 et 6, 4 autres cadres de lecture X1, X2a et X2b, et X3 (ARN3, 4 et 7) sont identifiés. Ces 4 cadres de lecture pourraient coder pour 4 polypeptides non structuraux, non encore détectés dans les cellules infectées. Le produit du gène N (PM = 43,5K) est fortement basique et riche en résidus sérine, sites potentiels de phosphorylation. Le gène E1 dirige la synthèse d'un polypeptide de PM = 27,7K, qui après excision du peptide signal, resterait essentiellement enfoui dans la membrane virale. L'analyse du produit du gène E2 (158K) fait apparaître : a) une séquence signal absente de la protéine mature. B) 32 sites potentiels de N glycosylation. C) une région d'ancrage, très hydrophobe, près de l'extrémité COOH. D) une hélice amphipatique pouvant correspondre à la tige des spicules. Un rôle fonctionnel pour chaque séquence peptidique conservée entre les différents coronavirus est proposé. Des fragments couvrant la majeure partie du gène E2 ont été exprimés dans E. Coli sous la forme de protéines hybrides cro-bêta-galactosidase, ce qui a permis la localisation du site C (l'un des 4 sites antigèniques majeurs identifiés sur la protéine E2 à l'aide d'Ac. Mo. ) entre les résidus 362 et 512.

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Leclercq, India. "Aspects moléculaires de l'intégration du rétrovirus HTLV-1 et de l'expansion clonale de sa cellule hôte." Lille 1, 2000. https://pepite-depot.univ-lille.fr/LIBRE/Th_Num/2000/50376-2000-312.pdf.

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L'intégration est une étape fondamentale du cycle replicatif des rétrovirus. Si tout le génome cellulaire peut être le siège d'une intégration, des études menées in vitro ont montré que certaines régions semblaient plus souvent concernées que d'autres. Pour aborder cette question in vivo, nous avons séquencé plus de 200 sites d'intégration du virus htlv-1, à partir d'échantillons provenant d'individus infectés. L'étude montre que htlv-1 s'intègre dans les régions riches en a/t, caractérisées par une distribution nucléotidique inhomogène dans le voisinage immédiat du provirus et par une fréquence élevée de longs motifs a/t. Cette composition particulière suggère que l'intégration obéit à des contraintes structurales de l'ADN cellulaire. Ainsi, certains sites correspondent à des séquences intrinséquement courbées alors que d'autres ont une distribution nucléotidique apparemment propice à la fixation de protéines susceptibles d'en modifier la conformation
Six pour cent des virus s'intégrent dans des régions transcriptionnellement actives de la cellule et pourraient donc modifier l'expression de certains gènes impliqués dans la pathogénie de l'infection. Les relations structure-intégration ont été étudiées in vitro, à l'aide d'intégrases recombinantes, de ltr synthétiques et de cibles oligonucléotidiques ayant des structures différentes en solution. Cette étude montre que les intégrases du vih-1 et de htlv-1 privilégient de manière identique l'intégration dans des molécules d'ADN de structure courbée en solution. Enfin, nous avons évalué l'impact de mutations somatiques de l'extrêmité du ltr 3' sur le rendement de la réaction de transfert de brin. Huit séquences ru5 mutées et isolées d'individus infectés ont servies de substrats pour des réactions d'intégration in vitro. Les résultats montrent que par rapport aux séquences ru5 consensus, certaines mutations étaient associées à un gain ou à une perte significative du rendement d'intégration

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Lubat, Vincent. "Approches biologiques et moléculaires dans l'étude des Myxosporidies, du PKX et des Marteilia : impacts en aquaculture." Montpellier 2, 1990. http://www.theses.fr/1990MON20282.

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L'etude de la parasitofaune des poissons marins mediterraneens des cotes francaises du languedoc-roussillon et de la baie de kotor (adriatique) en yougoslavie, a revele la presence de 45 especes de myxosporidies, dont huit nouvelles pour la science. Plusieurs aspects de la biologie de ces parasites sont abordes. L'impact de ces parasites en aquaculture a ete etudie a travers le modele thelohanellus nikolskii responsable d'epizooties dans les elevages de carpes d'europe centrale et d'asie. La pathologie liee a cette espece, ainsi que les stades initiaux de la sporogenese ont ete precises. Les affinites des myxosporidies avec le parasite pkx et les marteilia nous a amene a etudier egalement le cas de ces deux autres parasitoses: l'hepatonephrite parasitaire des salmonides (pkd), ainsi que la marteiliose de l'huitre plate ostrea edulis. Les premieres approches moleculaires de ces organismes ont permis la construction d'une banque genomique de m. Refringens et la caracterisation d'une premiere sonde nucleique specifique. L'etude preliminaire de celle-ci a ete realisee, et son utilisation comme outil epidemiologique et de diagnostic, est abordee

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Prawirosukarto, Sudharto. "Etude d'un virus pathogène de "Setothosea asigna" Van Eecke (Lepidoptera : limacodidae), ravageur du palmier à huile en Indonésie : caractérisation, diagnostic et épidémiologie en plantation." Montpellier 2, 1996. http://www.theses.fr/1996MON20261.

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Un virus fortement pathogene pour les larves de setothosea asigna van eecke qui causent d'importants degats aux palmiers a huile en indonesie a ete isole et caracterise. Avec une capside de symetrie cubique de 35 nm de diametre, un seul polypeptide capsidaire de 55 kda et un genome constitue d'une molecule d'arn monocatenaire lineaire de 6,2 kb, ce virus presente les proprietes essentielles des virus -nudaurelia de la famille des tetraviridae. Par transcription reverse de l'arn viral des fragments d'adnc ont ete obtenus et clones. L'un d'eux de 945 paires de bases a ete sequence. Deux methodes de diagnostic, l'un immunologique: test elisa, l'autre reposant sur l'hybridation du genome viral avec un adnc clone: sonde nucleique non radioactive, ont ete mis au point. Le pouvoir pathogene du virus etudie en laboratoire sur des larves de differents stades s'est avere tres fort quelque soit le stade, les jeunes larves etant les plus sensibles. Les prelevements effectues en plantation et lors d'epizooties naturelles ont montre une incidence importante de la virose sur la dynamique des populations naturelles du ravageur. Le traitement d'une parcelle a base de broyats de chenilles infectees et le suivi pendant deux generations des larves ont montre l'efficacite du virus pour juguler une pullulation du ravageur et les potentialites du virus comme biopesticide

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Chuchana, Paul. "Production par génie génétique de l'alpha-l-antitrypsine humaine : clonage moléculaire, procédé de purification industrialisable, approche informatique." Bordeaux 2, 1986. http://www.theses.fr/1986BOR22033.

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Guelin, Emmanuel. "L'ATP synthase mitochondriale de levure : clonage et séquençage des gènes mitochondriaux ATP6 et ATP8. Clonage, séquençage et délétion du gène nucléaire ATP-E." Bordeaux 2, 1992. http://www.theses.fr/1992BOR28205.

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Bahri, Racha. "Séquençage du génome complet du virus d’Epstein-Barr dans des prélèvements issus de lymphomes T angio-immunoblastiques." Thesis, Limoges, 2017. http://www.theses.fr/2017LIMO0106.

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Анотація:

Le virus d’Epstein-Barr (EBV) est un herpèsvirus humain qui infecte plus de 90% de la population mondiale. Il est décrit comme associé à plusieurs pathologies cancéreuses humaines comme les carcinomes nasopharyngés et gastriques et divers lymphomes, comme le lymphome de Burkitt, les lymphomes NK/T et certains lymphomes de Hodgkin. Le lymphome T angio-immunoblastique (LTAI), un cancer des cellules T folliculaires helper TFH, contient souvent des cellules B porteuses de l’EBV. Mais jusqu’à présent le rôle de l’EBV dans la pathogenèse de cette maladie reste inconnu. Dans ce contexte, notre travail avait pour objectif de déterminer si l’EBV associé au LTAI présentait une particularité laissant envisager son rôle dans cette pathologie. Pour ce faire, nous avons étudié la séquence complète de l’EBV au sein d’échantillons de LTAI et comparé les résultats à ceux obtenus pour d’autres lymphomes (B, NK/T) ainsi qu’aux séquences publiées. Le séquençage a tout d’abord été réalisé sur 7 lignées cellulaires positives pour l’EBV, afin de valider la technique, et a ensuite été appliqué aux échantillons d’adénopathies de 40 patients atteints de syndrome lymphoprolifératif, parmi lesquels 20 souffraient de LTAI. L’enrichissement en génome viral a été réalisé par capture à l’aide de sondes spécifiques du génome de l’EBV. Ensuite les librairies ont été synthétisées et séquencées sur les plateformes Illumina MiSeq et NextSeq. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé l’assemblage de novo des reads et déterminé la séquence complète du virus majoritaire dans chaque échantillon. Les données obtenues ont été analysées bioinformatiquement. D’une manière intéressante, le virus a été trouvé clonal ou quasi-clonal dans les LTAI alors que les lymphocytes B étaient dans la plupart des cas polyclonaux. En outre, le profil de mutations trouvé présentait des similitudes avec ce qui était trouvé pour les autres lymphomes associés à l’EBV, notamment au niveau des épitopes cibles des cellules de l’immunité suggérant un processus de sélection de la souche virale identique à celui d’une tumeur clonale associée à l’EBV. Ceci pourrait jouer un rôle important dans l’échappement au système immunitaire du virus dans ce contexte multicellulaire complexe. La présence de cellules B polyclonales avec un EBV clonal dans un compartiment T tumoral clonal pourrait relever d’une double sélection tumorale, endogène T et exogène EBV clonal, et pourrait suggérer l’existence de cross-talk entre les cellules B-T
More than 90% of the world's population is infected by Epstein-Barr virus (EBV), a human herpesvirus. EBV is thought to be implicated in the pathogenesis of several human malignancies including epithelial tumors such as nasopharyngeal and gastric carcinomas as well as lymphoproliferative diseases such as Burkitt's lymphoma, NK/T lymphomas and some Hodgkin lymphomas. In angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), a peripheral neoplasm of follicular helper T (TFH) cells, a recurrent finding is the presence of EBV-positive B lymphocytes at the beginning of the disease. However, whether this EBV infection of B cells plays a role in AITL pathogenesis remains unclear. In this context, our work aimed to determine if the EBV associated with the AITL presented an oncogenic profile allowing us to consider its role in this pathology. To do this, we sequenced the whole EBV genomes in AIL samples and compared the results to those obtained for other lymphomas (B, NK / T) as well as to previously published sequences. Sequencing was first performed on 7 EBV-positive cell lines to validate the technique, and then was applied to lymphadenopathy specimens from 40 patients with lymphoproliferative disease, of whom 20 had AITL. Enrichment of the viral genome was performed by capture using specific EBV genome probes. The libraries were synthesized and sequenced on Illumina MiSeq and NextSeq platforms. In a second step, we performed de novo assembly and determined the sequence of the virus in each sample. The data obtained were analyzed bioinformatically. Interestingly, the virus was found to be clonal or quasi-clonal in AITL, while B cells were in some cases polyclonal. In addition, the mutational pattern was similar to other EBV-associated lymphomas, especially at the level of the target epitopes of immune cells suggesting a process of selection of the viral strain identical to that of a clone tumor associated with EBV. This could play an important role in the virus escape from the immune system in this context. The presence of polyclonal B cells with clonal EBV in a clonal tumor T cell compartment could be a dual tumor selection; or that is endogenous T and exogenous clonal EBV, and could therefore suggest the existence of a cross-talk between B-T cells

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Chan, Kwo Chion Chan Ka Ning. "Constitution d'un système de clonage pour une souche de Brevibacterium à applications industrielles." Montpellier 2, 1990. http://www.theses.fr/1990MON20246.

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Анотація:

Brevibacterium sp. R312, une souche coryneforme d'importance industrielle, possede une enzyme amidase etroitement impliquee dans la biotransformation des derives nitriles, amides et acides. Deux axes de recherche ont ete poursuivis dans le but de cloner le gene de l'amidase. La premiere voie consiste a utiliser les techniques de clonage developpees chez escherichia coli. Ainsi, une banque genomique de brevibacterium sp. R312 a ete constituee. La proteine amidase a ete purifiee et le microsequencage peptidique n-terminal effectue. Des sondes oligonucleotidiques adequates ont ete recherchees et testees sur la banque. Les travaux preliminaires des clones positifs sont abordes. Le deuxieme axe de recherche concerne le developpement d'un systeme de clonage chez brevibacterium sp. R312. Les methodes de transformation de protoplastes et l'electroporation de cellules entieres ont ete testees avec succes. La technique d'electrotransformation a ete optimisee. La replication de differents plasmides cryptiques de souches voisines a ete examinee chez brevibacterium sp. R312. Deux vecteurs navettes escherichia coli/brevibacterium ont ete construits; ils possedent plusieurs sites de clonage uniques et expriment la resistance a la neomycine et a la tetracycline chez brevibacterium

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Breton, Christian. "Embryogenèse précoce des plantes à fleurs : clonage et caractérisation de gènes exprimés durant l'embryogenèse zygotique précoce du maïs." Lyon 1, 1993. http://www.theses.fr/1993LYO10200.

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Анотація:

L'embryogenese est une phase cruciale du developpement des plantes. Jusqu'a present, seule l'embryogenese tardive durant laquelle les embryons sont en cours de maturation ou de deshydratation a ete etudiee sur le plan moleculaire. L'embryogenese precoce correspondant a la differenciation de l'embryon proprement dit est peu accessible. Durant ce travail sur le mais, nous avons mis au point et utilise une technique d'amplification de l'adn par pcr non selective pour construire les banques d'adnc a partir de materiel obtenu en faible quantite: des embryons en phase de transition et des gametes males isoles. Les banques obtenues sont de qualite: elles nous ont deja permis d'isoler et de caracteriser des adnc codant pour la calmoduline et d'autres correspondant a des genes potentiellement homeotiques impliques dans l'embryogenese precoce

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Lévy, Julien. "Clonage positionnel du gène DMI3 impliqué dans la nodulation et la mycorhization chez Medicago truncatula." Toulouse 3, 2003. http://www.theses.fr/2003TOU30193.

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Ané, Jean-Michel. "Vers le clonage positionnel du gène DMI1 impliqué dans la nodulation et la mycorhization chez Medicago truncatula." Toulouse 3, 2002. http://www.theses.fr/2002TOU30130.

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Labaille, Jennifer. "Conception d'un vaccin recombinant contre la maladie de Marek d'après l'étude de la dynamique des populations de variants du vaccin CV1988/RISPENS." Thesis, Tours, 2013. http://www.theses.fr/2013TOUR4014.

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Анотація:

Le Gallid herpesvirus 2 (GaHV-2), responsable de lymphomes T du poulet, est contrôlé par le vaccin CVI988/Rispens. Mes travaux de thèse ont montré que le vaccin était composé, au contraire des souches virulentes, d’une population dynamique de variants viraux majoritairement délétés de la région promotrice et d’une partie variable de l’extrémité 5’ du gène LAT codant des microARN et associé à la latence virale. Dans une approche vaccinale, un virus recombinant correspondant à l’un des variants majoritaires du vaccin CVI988/Rispens a été généré à partir d’une souche GaHV-2 hypervirulente, clonée en bacmide. Nous avons montré que ce recombinant, présentant une perte de pathogénicité presque totale, était capable de protéger significativement les poulets lors d’une épreuve avec des souches GaHV-2 hypervirulentes. Ces travaux posent les bases du développement de nouveaux vaccins à partir de souches hypervirulentes émergentes
Gallid herpesvirus 2 (GaHV-2), responsible for T-cell lymphomas chicken, is controlled by the vaccine CVI988/Rispens. My work has shown that the vaccine contains, unlike virulent strain, a viral variants population mostly deleted from the promoter region and a variable portion of the 5' end of the gene LAT encoding microRNA and associated with viral latency. In a vaccine approach, a recombinant virus corresponding to a majority variant of the CVI988/Rispens vaccine was generated from a hypervirulent strain GaHV-2, cloned as bacmid. We showed that recombinant, with an almost total loss of pathogenicity, was able to significantly protect chickens against challenge with virulent strains GaHV-2. This work lays the basis for the development of new vaccines from emerging virulent strains

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Riou-Khamlichi, Catherine. "Isolement et caractérisation de l'ADNc codant pour la mévalonate kinase d'Arabidopsis thaliana par complémentation chez la levure Saccharomyces cerevisiae." Poitiers, 1994. http://www.theses.fr/1994POIT2282.

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Анотація:

La mevalonate kinase (mv) est une enzyme cle de la voie de biosynthese des isoprenes (sterols, carotenoides, facteurs de croissance. . . ) qui catalyse la premiere etape de phosphorylation de l'acide mevalonique. Nous avons utilise un mutant thermosensible de la levure saccharomyces cerevisiae (erg12-1) deficient dans l'activite mk pour isoler, par complementation fonctionnelle, l'adnc codant pour la mk d'arabidopsis thaliana. L'adnc d'arabidopsis porte par le plasmide pcra complemente aussi bien la mutation erg12-1 que la disruption du gene erg12 de levure. Pour les deux souches transformees par pcra, le pourcentage de 5-7 dienols determine est comparable a celui d'une souche sauvage et l'activite specifique mk bien que detectable reste tres faible. L'adnc (1,64 kb) a ete sequence. Une region 5 non codante importante (322 pb) a ete observe. Cet adnc code pour une proteine de 378 acides amines qui presente 39, 38 et 34% d'identite avec les mks humaine, de rat et de levure. L'enzyme d'arabidopsis comme les trois autres mks est tres hydrophobe (40%). Nous avons identifie quatre domaines tres conserves, communs aux quatre mks. Nous avons verifie l'origine vegetale de l'adnc clone par analyses par southern et pcr menees sur l'adn genomique d'arabidopsis. L'analyse par pcr a montre que la partie codante du gene codant pour la mk de plante ne contenait pas de region intronique et l'analyse par southern a revele qu'il n'y avait probablement qu'un seul locus pour la mk dans le genome nucleaire d'arabidopsis thaliana

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Kerviel, Vincent. "Clonage et caractérisation de deux gènes codant des enzymes lipolytiques de la microalgue Isochrysis galbana." Thesis, Le Mans, 2014. http://www.theses.fr/2014LEMA1017/document.

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Анотація:

Les enzymes lipolytiques sont des ester hydrolases impliquées dans le métabolisme lipidique. Leurs caractéristiques se sont révélées être des atouts dans de nombreuses applications industrielles. Chez les microalgues, l’isolement et la caractérisation de ces enzymes d’un point de vue structural et fonctionnel restent des domaines de recherche peu explorés à ce jour.Certaines espèces bénéficient pourtant de contenus en lipides intéressants, source de matière première pour les industries de l’agroalimentaire ou de l’énergie. Par exemple, l’acide docosahexaénoique (DHA), un acide gras polyinsaturé de la série des omégas 3, est reconnu pour ses propriétés en santé humaine. Parmi de nombreuses espèces, Isochrysis galbana, une microalgue unicellulaire appartenant à la classe des Prymnesiophycées est considérée comme une source possible de DHA. La présence d’acides gras libres a été montrée par l’analyse des lipides, suggérant la présence d’enzymes lipolytiques potentiellement intéressantes pour leur sélectivité et leur spécificité de substrat.L’analyse d’une banque de marqueurs de séquences exprimées a permis l’identification de séquences susceptibles de coder des enzymes lipolytiques. Les ARN messagers ont été extraits et les ADN complémentaires ont été clonés.Ce travail de thèse présente l’analyse et le clonage de deux gènes codant une ester hydrolase putative et une thioestérase putative, issues de la microalgue Isochrysis galbana.Les deux séquences codent des protéines de poids moléculaires de 35,41 kDa et de 42,31 kDa. Elles montrent 30 à 40 % d’identité et de similarité avec des hydrolases notamment des carboxylestérasesde différents organismes. Les séquences protéiques ont permis l’identification du pentapeptide consensus Gly-X-Ser-X-Gly caractéristique des enzymes lipolytiques et les acides aminés Ser/Asp/His de la triade catalytique.Les deux séquences codantes ont été clonées et exprimées dans la levure Saccharomyces cerevisiae et la bactérie Escherichia coli. Le clonage dans E. coli a permis d’identifier à la taille attendue une protéine par Western blot. En présence de cette protéine, la composition en acides gras des lipides de la bactérie a été modifiée. L’analyse CPG a notamment montré une augmentation des proportions en acides gras C16 :1 et C18 :1 par rapport au témoin. Ce résultat permet de caractériser l’activité thioestérase pour IgTeCe
Lipolytic enzymes present in all known species play a key role in lipid metabolism and are involved in several industrial processes. They catalyse lipid hydrolysis and synthesis. Actually and particularly in microalgae, isolation and characterization of this type of enzyme remains an unexplored research area.The potential of the lipidic content of microalgae in food industry or energy field requires specific lipolytic enzymes. Docosahexaenoic acid (DHA), an 3 poly insaturated fatty acid (3 PUFA) is well known for its beneficial effects on human health. Among many species, Isochrysis galbana, a unicellular marine microalga belonging to the Prymnesiophyceae class, is considered as a potential alternative source of DHA.Lipid analysis of I. galbana shows free fatty acids and suggests the presence of lipolytic enzymes with potential interesting selectivities and substrate specificities. Analysis of incomplete expressed sequence tag (EST) listed in the EST bank of Isochrysis galbana, identified incomplete genes that encode lipolytic enzymes. Messenger RNAs were extracted, characterized and cloned.This work describes the analysis and cloning of two genes encoding a putative ester hydrolase and a putative thioesterase in marine microalgae Isochrysis galbana. Sequences encode two proteins with predicted molecular weights of approximately 35,41 kDa and 42,31 kDa. Slight similarity and identity (from 30 to 40 %) were observed between the gene sequence and various  fold hydrolase found in diverse phyla (including carboxylesterase).Sequences also included the consensus Gly-X-Ser-X-Gly and the catalytic triad Ser/Asp/His. To characterize the predicted enzymatic functions, an experimental procedure was introduced: coding sequences were cloned into expression vectors and expressed in Saccharomyces cerevisiae and in Escherichia coli.Western blot identification of recombinant enzyme shows a convenient protein production in bacteria. Furthermore, the expression of the protein in E. coli shifted the fatty acid composition predominantly towards C16:1 and C18:1 fatty acids. The enzyme called IgTeCe showed a thioesterase activity

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Marais, Armelle. "Transfert de genes chez le mollicute phytopathogene Spiroplasma citri : expressions d'un epitope de l'Adhesine P1 de Mycoplasma pneumoniae, mise en évidence d'évènements de recombinaison impliques dans l'instabilité du vecteur viral recombinant, caractérisation du gene recA de la Souche Hote." Bordeaux 2, 1995. http://www.theses.fr/1995BOR28371.

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Arpin, Corinne. "Contribution au développement d'un vecteur d'expression de gènes chez les spiroplasmes, caractérisation fonctionnelle d'un promoteur et d'un terminateur de transcription, clonage et expression du gène de la chloramphenicol acetyltransferase (gène CAT) dans Spiroplasma Citri." Bordeaux 2, 1992. http://www.theses.fr/1992BOR28169.

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Les spiroplasmes sont des organismes procaryotes, a morphologie helicoidale et motiles dont certains sont pathogenes de plantes ou d'insectes. Depourvus de paroi, ils appartiennent a la classe des mollicutes. Ils derivent du phylum des bacteries gram+ a faible pourcentage de bases g+c par evolution regressive. Le developpement recent de la biologie moleculaire a permis de caracteriser le genome de ces organismes et d'identifier un certain nombre de genes. Cependant, peu d'informations sont disponibles concernant l'expression des genes et la fonction des proteines pour lesquelles ils codent. Dans ce contexte, nous avons etudie la transcription du virus spv4 de s. Melliferum pour caracteriser des signaux de regulation de la transcription fonctionnels chez les spiroplasmes. L'analyse des produits de transcription par northern blot, hydrolyse a la nuclease s1 et extension d'amorce a montre que ce signaux sont de type eubacterien. Ils sont fonctionnels chez e. Coli et chez s. Melliferum. Par ailleurs, les travaux du laboratoire ont montre que chez les spiroplasmes, le codon uga n'est pas un codon de terminaison de la traduction, mais code pour le tryptophane. De ce fait, les genes de spiroplasmes contenant un ou plusieurs codons tga (uga sur le mrna) ne peuvent etre etudies par clonage et expression dans une bacterie non suppressive. Pour contourner cette difficulte, le developpement d'un vecteur d'expression de genes chez les spiroplasmes a ete envisage. En utilisant la forme replicative du virus spv1 comme vecteur, le gene de la chloramphenicol acetyltransferase (gene cat) a ete clone et exprime dans s. Citri. Spv1 est un virus non lytique. Sa nucleocapside en batonnet contient un dna monocatenaire circulaire d'environ 8 kb dont la sequence nucleotidique a ete determinee. La technique d'electroporation a ete mise en uvre pour transfecter s. Citri avec la rf de spv1. L'efficacite de transfection atteint 10#6 transfectants par g de rf. Les spiroplasmes transfectes produisent des virions dont la presence est revelee par la formation de plages d'inhibition de croissance sur une pelouse de cellules indicatrices. L'insertion du gene cat, dans une region intergenique de la rf n'empeche pas la production de virions. Dans s. Citri, le gene cat est transcrit a partir d'un promoteur de spv1 et il est traduit en une proteine fonctionnelle. Pour demontrer que le systeme s. Citri/rf de spv1 est apte a exprimer des genes renfermant des codons tga, un tel codon a ete introduit dans le gene cat par mutation d'un codon tgg en tga. La mutagenese a ete realisee dans e. Coli et le gene cat, mute, a ete reintroduit dans s. Citri. Les resultats montrent que, dans e. Coli, il n'y a pas d'activite cat lorsque le gene est mute. Au contraire, dans s. Citri, l'activite cat n'est pas affectee par la mutation du codon tgg en tga

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Leriche, Françoise. "Recherche d'outils, génétiques utilisables chez la bactérie psycrotrophe MFO, étude de leur comportement aux différentes températures de croissance de la souche et construction d'une fusion traductionnelle par génétique réverse." Rouen, 1993. http://www.theses.fr/1993ROUES040.

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Recherche d'outils génétiques utilisables chez la bactérie pseudomonas fluorescens MFO et mise au point des conditions de leur utilisation aux différentes températures de croissance de la souche. Mise au point d'un vecteur de clonage, de conditions d'intégration de gènes étrangers dans le chromosome bactérien, d'une méthode de cartographie par transfert chromosomique et de transposition par génétique réverse

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Noël, Thierry. "Etude génétique de l'incompatibilité et du changement de type sexuel chez le basidiomycète Agrocybe aegerita et développement de systèmes de transformation homologue et hétérologue." Bordeaux 2, 1992. http://www.theses.fr/1992BOR28194.

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Dubessy, Christophe. "Hétérogénéité clonale de lignées cellulaires de carcinomes épidermoïdes des voies aéro-digestives supérieures après exposition aux radiations ionisantes : Prolifération cellulaire, mort cellulaire radio-induite et voies de détoxification des espèces réactives de l'oxygène (Doctorat : Génie biologique et médical)." Nancy 1, 1999. http://docnum.univ-lorraine.fr/public/SCD_T_1999_0314_DUBESSY.pdf.

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Weill, Mylène. "Organisation et évolution des gènes des immunoglobulines et des récepteurs T gamma/delta humains." Montpellier 2, 1991. http://www.theses.fr/1991MON20018.

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Nous avons etudie les genes des immunoglobulines et des recepteurs t dans le but de mieux connaitre leur organisation moleculaire et leur evolution ainsi que pour mieux comprendre les relations qui existent entre la structure et la fonction de ces proteines. Notre travail a porte sur l'etude de polymorphisme de la region constante des chaines lourdes gamma, des chaines legeres lambda des immunoglobulines et de la region variable des chaines gamma du recepteur t. Nous avons par ailleurs etudie l'organisation du locus preb humain des immunoglobulines, qui se compose des genes vpreb et lambda-like. Enfin, nous avons isole les genes variables vh et vl d'un anticorps monoclonal. Leur expression et leur mutagenese nous permettront d'etudier la liaison antigene-anticorps

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Péneau, Camille. "Mécanismes moléculaires et conséquences oncogéniques des intégrations du Virus de l’Hépatite B dans les tissus hépatiques." Thesis, Université de Paris (2019-....), 2020. https://theses.md.univ-paris-diderot.fr/PENEAU_Camille_va2.pdf.

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Анотація:

Malgré l’existence d’un vaccin efficace et de traitements supprimant la réplication virale, l’infection par le Virus de l’Hépatite B (VHB) reste une des maladies chroniques les plus fréquentes, avec une mortalité associée dans 39% des cas au développement d’un carcinome hépatocellulaire (CHC), le cancer primitif du foie le plus courant et la troisième cause mondiale de décès par cancer. Le VHB est en effet le facteur de risque principal de survenue d’un CHC, chez des patients ayant généralement une cirrhose du foie induite par l’infection. Cependant, le fait que certains CHC liés au VHB surviennent sans inflammation chronique souligne les propriétés oncogéniques directes de ce virus à ADN, qui peut promouvoir la transformation cellulaire des hépatocytes en s’intégrant dans le génome humain. Ce projet a eu pour but de décrire les formes du VHB présentes dans des tissus hépatiques tumoraux et non-tumoraux de 177 patients majoritairement d’origine africaine et européenne, en utilisant des techniques de capture virale et de séquençage de nouvelle génération, et de caractériser les intégrations du virus en fonction des données génétiques et cliniques des patients. Nous avons montré que les tissus non-tumoraux contiennent plus fréquemment de l’ADN viral réplicatif et un nombre total plus élevé d’insertions, principalement localisées dans des régions de chromatine ouverte mais sans conséquence fonctionnelle directe. Dans les tumeurs en revanche, les intégrations du VHB sont souvent clonales, enrichies à proximité de gènes impliqués dans la carcinogenèse hépatique comme TERT (dans un tiers des CHC liés au VHB), CCNE1, ou KMT2B, et peuvent entraîner directement le développement tumoral en activant ces gènes en cis. Les intégrations du VHB dans CCNA2 ou CCNE1 génèrent par exemple un stress réplicatif et une signature de réarrangements structuraux spécifique, favorisant le développement de CHC agressifs en absence de cirrhose. Nous avons décrit par ailleurs un nouveau mécanisme oncogénique associé aux intégrations du VHB qui repose sur des réarrangements du génome humain délimités par des séquences virales intégrées, qui induisent des altérations du nombre de copies de gènes « driver » situés à distance comme TP53 ou MYC. Nous avons donc approfondi la caractérisation des intégrations virales du VHB dans les CHC, mais également celles du virus adéno-associé (AAV) qui peut également s’intégrer dans l’ADN humain et favoriser le développement tumoral par mutagénèse insertionnelle en altérant les mêmes gènes que le VHB (TERT, CCNA2, CCNE1, KMT2B)
Despite the existence of an effective vaccine and of treatments that suppress viral replication, Hepatitis B Virus (HBV) infection remains one of the most frequent chronic diseases. 39% of HBV-related deaths are associated with the development of hepatocellular carcinoma (HCC), the most common primary liver cancer and the third leading cause of cancer death worldwide. HBV is indeed the main risk factor of HCC development in patients who generally already have a liver cirrhosis induced by the infection. However, the fact that some HBV-related HCC occur without chronic inflammation underlines the direct oncogenic properties of this DNA virus, which can promote hepatocyte cell transformation through integration into the human genome. This project aimed to describe the HBV genomes in tumor and non-tumor liver tissues from 177 patients, mostly with African and European origin, using viral capture and next-generation sequencing techniques, and characterized viral integrations according to the genetic and clinical data of the patients. We showed that non-tumor tissues contain more frequently replicating HBV DNA and a higher number of insertions, mainly located in open chromatin regions but without direct functional consequences. In tumors, on the other hand, HBV integrations are often clonal and enriched in proximity of genes involved in hepatocarcinogenesis such as TERT (in one-third of HBV-related HCC), CCNE1, or KMT2B, and can directly lead to tumor development by activating these genes in cis. HBV integrations in CCNA2 or CCNE1, for example, generate replicative stress and a specific signature of structural rearrangements, thus promoting the development of aggressive HCC in the absence of cirrhosis. We also described a novel oncogenic mechanism associated with HBV integrations based on rearrangements of the human genome delimited by integrated viral sequences, which induce copy number alterations of distant "driver" genes such as TP53 or MYC. We have therefore further characterized the viral integrations of HBV in HCC, but also those of the adeno-associated virus (AAV) which can also integrate into human DNA and promote tumor development through insertional mutagenesis by altering the same genes as HBV (TERT, CCNA2, CCNE1, KMT2B)

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Blesa, Stéphane. "Étude moléculaire de l'interaction plante-pathogène (Basidiomycète Rhizoctonia Solani riz Oryza Sativa) : mise au point du modèle expérimental : Clonage et séquençage d'ADNc impliqués dans la différenciation des structures infectieuses de Rhizoctonia Solani." Bordeaux 2, 1997. http://www.theses.fr/1997BOR28546.

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Pineau, Christophe. "Caractérisation phénotypique et moléculaire du mutant d'Arabidopsis thaliana hca, high cambial activity." Toulouse 3, 2005. http://www.theses.fr/2005TOU30254.

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Анотація:

Le criblage des mutants ADN-T d'Arabidopsis thaliana de l'INRA de Versailles a permis d'isoler le mutant high cambial activity présentant des tissus vasculaires disposés en anneau continu. Ce phénotype est la conséquence de divisions précoces du cambium. La mutation entraîne des effets pléïotropiques, tels qu'une augmentation de la ramification des hampes, des feuilles gaufrées, un retard du développement. Hca est également affecté dans les voies de réponses aux phytohormones auxines et cytokinines. Ces observations sont appuyées par une analyse transcriptomique. La mutation est monogénique récessive mais non liée à l'insertion d'un ADN-T. Nous avons réalisé un clonage qui a permis de localiser la mutation sur le chromosome IV dans une zone de 240 Kb, le gène muté n'a pas été isolé. Nous pensons que le gène HCA est impliqué dans la régulation de l'activité cambiale, par le biais d'une régulation des réponses aux hormones, en particulier la cytokinine
By screening a T-DNA population of Arabidopsis mutants, we have isolated the high cambial activity (hca) mutant with a dramatic increase in vascular tissue development, characterized by a continuous ring of xylem/phloem. This phenotype is the consequence of premature and numerous cambial cell divisions. The hca mutation also resulted in pleiotropic effects: twisted leaves, additional shoot branching, delay in development. The physiological characterization revealed an altered hormones response, and enhanced sensitivity to cytokinin. These results were substantiated by microarray analysis. The mutant was not tagged by T-DNA and hca mutation segregated as a single recessive locus, on the long arm of chromosome 4, in an area of 240 Kb. No gene was associated with the mutation for the moment. We propose that hca is involved in mechanisms controlling the arrangement of vascular bundles throughout the plant by regulating auxin-cytokinin sensitivity of vascular cambial cells

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Дисертації з теми "Clonage de génome"

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