Дисертації з теми "Chimical Diversity"

Le champignon filamenteux Sarocladium zeae, un endophyte du maïs, produits des métabolites polycycliques complexes, les pyrrocidines. Ces composés possèdent des activités biologiques attractives comme antimicrobienne, apoptotique ou régulatrice de la biosynthèse de mycotoxines chez certains phytopathogènes. Ces molécules appartiennent à une large famille de composés fongiques structurés par un motif paracyclophane-décahydrofluorène assorti d’une dizaine de centres stéréogènes. Une étude menée dans l’équipe, alliant inactivations de gènes du cluster de biosynthèse et analyse métabolique, avait conduit à la caractérisation d’une grande variété de métabolites et permis d’établir un schéma de biosynthèse des pyrrocidines. La formation du squelette carboné de ces composés est régie par une méga-enzyme hybride, une polyketide synthase - non-ribosomal peptide synthetase (PKS-NRPS) composée d’une dizaine de domaines catalytiques. Le système polycyclique est ensuite construit par des enzymes auxiliaires. Une étude de ces enzymes clé menée dans le cadre de cette thèse a permis de proposer un mécanisme moléculaire pour la formation et le contrôle stéréochimique du motif paracyclophane-décahydrofluorène. Afin de générer une chimio-diversité dans la famille des pyrrocidines pour accéder à des molécules dotées d’activités biologiques potentielles, deux approches de bio-ingénierie complémentaires ont été envisagées. L’une consiste à remplacer des enzymes auxiliaires clé dans la formation du paracyclophane-décahydrofluorène par d’autres provenant de divers clusters de gènes. L’autre approche consiste à reprogrammer la séquence catalytique de la PKS-NRPS pour générer des squelettes carbonés variés en réassemblant les domaines catalytiques de diverses mégasynthases identifiées dans les génomes fongiques. Une première preuve de concept a pu être apportée en déconstruisant in silico le gène de la PKS-NRPS native selon ces domaines puis en le réassemblant in vitro par clonage modulatoire
The filamentous fungus Sarocladium zeae, an endophyte of maize, produces complex polycyclic metabolites known as pyrrocidines. These compounds have attractive biological activities, such as antimicrobial, apoptotic and mycotoxin biosynthesis regulation in certain plant pathogens. These molecules belong to a growing family of fungal compounds sharing a decahydrofluorene core connected to a highly strain paracyclophane with ten stereogenic centers. A study carried out by the team, combining gene inactivation in the biosynthetic cluster and metabolic analysis, led to the characterization of a wide diversity of metabolites and established a biosynthetic pathway for pyrrocidines. The formation of the carbon backbone of these compounds is governed by a hybrid mega-enzyme, a polyketide synthase - non-ribosomal peptide synthetase (PKS-NRPS) composed of ten domains. The polycyclic system is then built up by auxiliary enzymes. A study of these key enzymes carried out as part of this thesis proposed a molecular mechanism for the formation and stereochemical control of the paracyclophane-decahydrofluorene motif. In order to generate chemodiversity in the pyrrocidine family to access molecules with potential biological activities, two complementary bioengineering approaches were considered. One involves replacing key auxiliary enzymes in the formation of paracyclophane-decahydrofluoren core with others from various similar gene clusters. The other approach involves reprogramming the catalytic sequence of PKS-NRPS to generate diverse carbon skeletons by reassembling the catalytic domains of various megasynthases identified in fungal genomes. A first proof-of-concept was provided by deconstructing the native PKS-NRPS gene according to these domains in silico, then reassembling it in vitro by modular cloning

Lo scopo principale della presente tesi di Dottorato è stato lo sviluppo di nuovi catalizzatori omogenei per la copolimerizzazione dell'etilene con monomeri vinilici polari, come gli esteri acrilici, al fine di ottenere poliolefine funzionalizzate contenenti una quantità controllata di monomero polare. Il progetto di ricerca ha riguardato la sintesi e caratterizzazione di complessi di palladio(II) con nuovi leganti azotati non simmetrici di complessità via via crescente, appartenenti alla classe delle alfa-diimmine o a quella delle piridilimmine. Il comportamento catalitico dei complessi di palladio così ottenuti è stato studiato approfonditamente per la copolimerizzazione etilene/metil acrilato. Alcuni dei complessi sono stati testati quali catalizzatori anche per altre reazioni, come la copolimerizzazione CO/vinil arene e la doppia alcossicarbonilazione di alcheni, dimostrando la versatilità dei catalizzatori di palladio con leganti azotati.
The main goal of the PhD research was the development of novel homogeneous catalysts for copolymerization of ethylene with polar vinyl monomers, such as acrylic esters, in order to obtain functionalized polyolefins with a controlled content of the inserted polar monomer. The project focused on the synthesis and characterization of palladium(II) complexes with novel non symmetric nitrogen-donor ligands of increasing complexity, and belonging either to the class of alpha-diimines or to the group of the pyridylimines. The catalytic behaviour of the synthesized palladium(II) complexes in the ethylene/methyl acrylate copolymerization was investigated in detail. Some of the catalysts were also applied to other reactions such as the CO/vinyl arene copolymerization and the bis-alkoxycarbonylation of alkenes, demonstrating the versatility of palladium catalysts with N-donor ligands.

La seguente dissertazione è un riassunto di un progetto di dottorato della durata di tre anni, condotto con lo scopo di esplorare nuove regioni dello spazio chimico, che potrebbero contenere interessanti molecole bioattive. Infatti, al giorno d’oggi, solo una porzione molto limitata dello spazio chimico è stata investigata. Oltretutto, tale porzione diventa ancora più ristretta se si considerano solo molecole caratterizzate da attività biologica. In questa tesi sono state considerate due diverse strategie per consentire un’ulteriore esplorazione dello spazio chimico: si tratta della diversity-oriented synthesis (DOS) e di un particolare approccio chemoenzimatico, sviluppato durante sei mesi trascorsi presso l’Università di Warwick (UK), sotto la supervisione della Professoressa Manuela Tosin. Capitolo 1. Il primo capitolo della tesi contiene un’introduzione generale ai principi della diversity-oriented synthesis, che costituirà il tema principale della dissertazione. Successivamente viene presentata una overview dettagliata, riguardante un approccio DOS sviluppato negli ultimi anni nel gruppo Passarella. Tale approccio si basa sull’utilizzo del 2-piperidinetanolo (1) come precursore per ottenere una libreria di derivati piperidinici diversificati. Alla fine del capitolo, viene presentata la progettazione di un’ulteriore espansione di tale libreria, tramite la sintesi dei prodotti riportati in Figura 1 (La figura può essere visionata nella versione dell'abstract riportata nel file della tesi). Capitolo 2. Questo capitolo riguarda la sintesi enantioselettiva di otto prodotti polieterociclici, caratterizzati da tre scaffolds altamente diversificati. La diversificazione strutturale è stata ottenuta a partire da un intermedio comune, sfruttando la diversa reattività dei suoi diastereoisomeri syn e anti, che, posti nelle medesime condizioni di reazione, hanno portato a prodotti strutturalmente diversi. In tal modo, analoghi di alcaloidi naturali sono stati ottenuti. Capitolo 3. In questo capitolo viene presentata la sintesi di una libreria di potenziali inibitori dell’hedgehog signalling pathway. La struttura degli inibitori è stata disegnata sulla base di studi di docking, prendendo ispirazione da una classe di prodotti naturali, i withanolidi. Gli elementi chiave del design sviluppato sono un carbammato biciclico, ottenibile da 1, e un lattone α,β-insaturo. La struttura presenta tre stereocentri e, ad oggi, due su quattro stereoisomeri racemi sono stati sintetizzati. I test biologici hanno rivelato due intermedi attivi, che sono stati sintetizzati anche in versione enantiopura. Inoltre, studi preliminari, volti allo sviluppo di inibitori di seconda generazione, sono attualmente in corso. Capitolo 4. In questo capitolo viene presentata la sinesi di un prodotto naturale, la (-)-anaferina, ottenuta come ulteriore ramificazione del nostro approccio DOS. L’idea è nata prendendo ispirazione dall’intermedio 10, già usato per la sintesi degli inibitori hedgehog. Infatti, il suo alcol omoallilico può essere convertito in un lattame α,β-insaturo (usando una procedura analoga a quella impiegata per la sintesi del primo prodotto presente nel riquadro rosa in Figura 1). Una volta ottenuto il lattame, questo può essere ridotto a piperidina. La successiva ossidazione del ponte 2-idrossipropanico a chetone permette poi di completare la sintesi della (-)-anaferina. Il Capitolo 5 riporta la sintesi di coniugati bivalenti, potenzialmente in grado di interagire con le tubuline in modo sinergico. Gli elementi chiave di tali coniugati sono un composto ibrido, precedentemente sintetizzato nel gruppo Passarella a partire da 1, e la N-10-deacetiltiocolchicina, noto legante di β-tubulina. Il prodotto ibrido contiene invece i motivi fondamentali della struttura della pironetina, noto legante di α –tubulina. Le due funzionalità attive sono state connesse da linkers diversi. Tuttavia i test biologici hanno evidenziato come la scelta di impiegare linkers lipofilici abbia reso i nostri coniugati migliori substrati per la P-glicoproteina, coinvolta nello sviluppo della resistenza ai farmaci, sviluppata da diverse cellule tumorali. Per questo motivo, nuovi coniugati verranno presto prodotti nel nostro laboratorio, testando linkers diversi. Infine, il Capitolo 6 ha riguardato la generazione di versioni non naturali e diversificate di due antibiotici, lasaloside A e salinomicina. A tal fine, un approccio simile alla mutasintesi, basato sulla somministrazione di probes chimiche, mimiche del malonato, ai microrganismi produttori di tali antibiotici, è stato impiegato. In particolare, diverse strategie, per un facile recupero e analisi dei prodotti non naturali presenti nei complessi brodi di fermentazione, sono state considerate. Quattro probes sono state sintetizzate e diversi esperimenti sono stati sviluppati per verificare la loro applicabilità in tale contesto.
This dissertation is an overview of a three-years project, aimed at the exploration of new regions of the chemical space, that could contain new unusual bioactive compounds. The already discovered small molecules cover only a small portion of the chemical universe, that becomes even narrower when bioactive compounds are considered. In this context, two different strategies for the investigation of the chemical space have been considered: the diversity oriented-synthesis (DOS), that constitute the major topic of the work, and a chemoenzymatic approach, developed during a period spent at the University of Warwick (UK), in the laboratory of Professor M. Tosin. Chapter 1 deals with the general principles of the DOS approach, focusing then the attention on a library of piperidine-based compounds previously synthesised in Professor Passarella’s research group, starting from a common precursor, 2-piperidine ethanol (1). An overview of the main results previously accessed in this field is reported. At the end of the chapter, the planning of a further expansion of this library is presented. The structure of the newly accessed piperidine-based products is appreciable in Figure 1 (see Figure 1 in the abstarct version reported in the thesis file); their obtainment was the main goal of this thesis. Chapter 2 is focused on the stereoselective synthesis of eight highly diversified polyheterocyclic compounds, characterized by three different scaffolds. In particular, the different scaffolds were originated by the same precursor, considering that its different syn- or anti- stereocenter configuration, influenced the reaction outcome. This project opens the possibility of accessing analogs of some natural products, such as lupin and lycopodium alkaloids. Chapter 3 concerned the obtainment of a library of potential Hedgehog (Hh) signalling pathway inhibitors, rationally designed exploiting docking simulations and taking inspiration from a class of natural products, the withanolides. The designed scaffold contains two key motif, a bicyclic carbamate and an α,β-unsaturated lactone, and presents three stereocenters. So far, two out of the four racemic isomers have been accessed and biological evaluation revealed two interesting intermediates, that have been synthesised also as separate enantiomers. Moreover, preliminary studies toward the obtainment of 2nd generation inhibitors have been performed in our laboratory. Biological evaluation of these compounds is currently in progress and will orient the future development of this work. Chapter 4 is aimed at the synthesis of (-)-anaferine as an unexpected further ramification of our DOS approach. Key intermediate 10, already exploited for the synthesis of the inhibitors of chapter 3, has been employed as starting material, converting its homoallylic alcohol into an α,β-unsaturated lactam. To this extent, the same approach used in chapter 1, to transform 9 into a similar lactam (left compound in the pink box of Figure 1) was applied. After that, the synthesis of (-)-anaferine was accomplished in few steps, reducing the lactam to piperidine and oxidizing the 2-hydoxypropane bridge to the corresponding ketone. Chapter 5 deals with the synthesis of thiocolchicine-based bivalent compounds, possibly acting as microtubules binders. A hybrid compound, bearing the key structural features of pironetin (one of the few known α-tubulin binder), previously synthesised on our laboratory from 2-piperidine ethanol, was exploited as key building block. In fact, it was connected through different linkers to N-10-deacteyl-thiocolchicine, a model of β-tubulin binder. Biological tests revealed that the lipophilic nature of the linkers rendered our conjugates better substrates for P-glycoprotein, leading to a drop in activity on resistant cancer cells. Therefore, new bivalent compounds will be soon produced in our laboratory, changing linkers chemo-physical properties. Structures of the new compounds resulting from the expansion of the DOS-approach from 2-piperidine ethanol 1. Finally, chapter 6 concerned a project aimed at the generation of unnatural, diversified derivatives of lasalocid A and salinomycin, through feeding experiments of malonate-mimicking chemical probes to the natural Streptomyces producers, in an approach resembling mutasynthesis. The efforts were focused on the devopment of different strategies for an easier recovery and analysis of the unnatural products from the complex mixtures of the fermentation broths. To this extent, four chemical probes have been synthesised and proof on concept experiments were performed to verify their applicability in this field.

Il suolo è un ambiente complesso che è alla base di molteplici servizi ecosistemici per la produzione agricola. Questa complessità è riflessa nella composizione e nelle funzioni degli organismi microbici coinvolti. Lo scopo di questa tesi è stato quello di esplorare le risposte della comunità microbica all’intervento dell’uomo in suoli agricoli. Lo studio ha coinvolto suoli di comune origine, modificatisi negli ultimi 6-700 anni a causa di differente uso e gestione agronomica del suolo. Per ottenere questo risultato, il DNA del suolo è stato analizzato con tecniche di sequenziamento avanzato. I risultati indicano che i suoli disturbati sono più diversi rispetto ai suoli naturali. I fattori che influenzano la comunità microbica sono il disturbo, la disponibilità di nutrienti e la dormienza microbica. In un altro esperimento, a carico di batteri ammonio ossidanti, si sono studiati gli effetti di diversi stress come l’umidità e la concentrazione di zinco nel suolo o la presenza di pesticidi nella lettiera. In tutte queste situazioni i batteri hanno mostrato una ridondanza e una variabilità che permettono di rispondere agli stress. In conclusione i risultati di questa tesi dimostrano che l’intervento umano è responsabile nel determinare la struttura e le funzioni della comunità procariotica dei suoli.
Soil is a complex environment comprising the basis for several ecosystem services, with many of them being connected to agricultural production. This complexity is reflected on the composition and functions of the hosted microbial life mainly responsible for the acquired services. Aim of the described studies was to explore microbial community responses to ecosystem services related human intervention in agricultural soils. Total prokaryotic diversity was studied in soils of common origin, which diverged in properties during the late 6-7 centuries due to different land use and management. For achieving this, related DNA markers were screened with high throughput sequencing. Cultivated environments had increased diversity compared to more natural soils. Factors potentially affecting the microbial community structure were: soil disturbance events; available nutrients; and microbial dormancy. In a second approach, ammonia oxidizing prokaryotes were used as biomarkers for studying stress effects caused by humidity and increased zinc concentrations and also the presence of organic pesticides in soil and litter respectively. In both referred cases the studied microbial guilds responded to the applied stresses showing strain or taxon level functional redundancy potentials, and tolerance variability. Overall, results show that human intervention is determining for the prokaryotic structure and functions in agricultural soils.

Il suolo è un ambiente complesso che è alla base di molteplici servizi ecosistemici per la produzione agricola. Questa complessità è riflessa nella composizione e nelle funzioni degli organismi microbici coinvolti. Lo scopo di questa tesi è stato quello di esplorare le risposte della comunità microbica all’intervento dell’uomo in suoli agricoli. Lo studio ha coinvolto suoli di comune origine, modificatisi negli ultimi 6-700 anni a causa di differente uso e gestione agronomica del suolo. Per ottenere questo risultato, il DNA del suolo è stato analizzato con tecniche di sequenziamento avanzato. I risultati indicano che i suoli disturbati sono più diversi rispetto ai suoli naturali. I fattori che influenzano la comunità microbica sono il disturbo, la disponibilità di nutrienti e la dormienza microbica. In un altro esperimento, a carico di batteri ammonio ossidanti, si sono studiati gli effetti di diversi stress come l’umidità e la concentrazione di zinco nel suolo o la presenza di pesticidi nella lettiera. In tutte queste situazioni i batteri hanno mostrato una ridondanza e una variabilità che permettono di rispondere agli stress. In conclusione i risultati di questa tesi dimostrano che l’intervento umano è responsabile nel determinare la struttura e le funzioni della comunità procariotica dei suoli.
Soil is a complex environment comprising the basis for several ecosystem services, with many of them being connected to agricultural production. This complexity is reflected on the composition and functions of the hosted microbial life mainly responsible for the acquired services. Aim of the described studies was to explore microbial community responses to ecosystem services related human intervention in agricultural soils. Total prokaryotic diversity was studied in soils of common origin, which diverged in properties during the late 6-7 centuries due to different land use and management. For achieving this, related DNA markers were screened with high throughput sequencing. Cultivated environments had increased diversity compared to more natural soils. Factors potentially affecting the microbial community structure were: soil disturbance events; available nutrients; and microbial dormancy. In a second approach, ammonia oxidizing prokaryotes were used as biomarkers for studying stress effects caused by humidity and increased zinc concentrations and also the presence of organic pesticides in soil and litter respectively. In both referred cases the studied microbial guilds responded to the applied stresses showing strain or taxon level functional redundancy potentials, and tolerance variability. Overall, results show that human intervention is determining for the prokaryotic structure and functions in agricultural soils.

Nel presente studio sono stati indagati i meccanismi di degrado di alcuni materiali da scrittura trattati con inchiostro di tipo ferrogallico e sottoposti a invecchiamento simulato con diverse tempistiche e modalità. A tale scopo sono stati analizzati gli spettri ATR-FTIR di campioni di carta filtro e pergamena inchiostrati e non. Per le prove svolte si sono utilizzati due inchiostri prodotti in laboratorio seguendo ricette del XV e XVI secolo e uno commerciale. I risultati dell’interpretazione delle variazioni dei profili spettrali in opportuni intervalli costituiscono un contributo per l’individuazione di una procedura non distruttiva per lo studio di campioni storici.

L’inquinamento dell’aria rappresenta un problema sempre più diffuso in Italia e nel resto del mondo. La regione Veneto, situata nella parte nord orientale della Pianura Padana, è nota per essere una zona molto inquinata. Il lavoro di tesi proposto si inserisce all’interno di un progetto più ampio di analisi della qualità dell’aria su scala regionale. In particolare si vogliono misurare le concentrazioni di otto idrocarburi policiclici aromatici (IPA) in sei stazioni all’interno della regione Veneto, 5 di background urbano e una di traffico. Le aree di interesse riguardano le province di Belluno, Treviso, Vicenza, Padova, Venezia e Rovigo. L’obiettivo principale del lavoro è quello di misurare il carico di IPA adsorbiti su campioni di particolato fine e valutare i possibili effetti nocivi sulla salute pubblica. Il progetto è stato svolto in collaborazione con l’ARPAV di Padova, che ha effettuato una campagna di campionamento annuale del PM2.5 (aprile 2012 – marzo 2013) in sei siti all’interno della regione Veneto. L’analisi dei campioni ha interessato sei mesi: aprile, giugno, agosto, ottobre, dicembre e febbraio. Di ciascun mese sono stati scelti 10 campioni relativi a 10 giorni consecutivi per ciascuna stazione di campionamento. Le analisi svolte non hanno interessato l’intero filtro, ma un sottocampione circolare con diametro pari a 16 mm. La suddivisione in sottocampioni è stata compiuta mediante l’uso di una fustella. Ciascuna fustella è stata poi posta in provette di vetro a cui sono stati aggiunti 5 o 3 ml di aceto nitrile (CH3CN). Il passo successivo ha previsto l’estrazione dei campioni mediante bagno a ultrasuoni e la filtrazione con filtri in PTFE e porosità pari a 0.2 μm. Per l’analisi e la quantificazione degli otto congeneri è stato utilizzato un cromatografo liquido ad alte prestazioni (HPLC) interfacciato a un detector a fluorescenza. La variabilità delle concentrazioni di IPA determinate nei diversi periodi e nelle stazioni di campionamento sarà interpretata sulla base di una serie di parametri di contorno come quelli micro meteorologici e degli spostamenti delle masse d’aria.

Nell’ambito della valutazione della sostenibilità delle bonifiche sono stati sviluppati molteplici strumenti decisionali in grado di orientare le scelte dei decisori e soddisfare le esigenze degli stakeholder. Tuttavia, tali strumenti spesso risultano difficilmente applicabili a causa della complessità del sistema in esame. Per far fronte a questa criticità è nata una collaborazione tra Eni Rewind e Fondazione Università Ca’ Foscari (con il supporto di GreenDecision S.r.l.), volta allo sviluppo di un framework per la valutazione della sostenibilità degli interventi di bonifica. All’interno di questo importante progetto si è inserito il seguente lavoro di tesi che si è focalizzato in prima istanza nello sviluppo di una revisione di studi LCA internazionali, aventi come obiettivo la valutazione degli impatti ambientali associati a diverse tecnologie di bonifica. Questo al fine di individuare le variabili e i processi che hanno un’incidenza maggiormente rilevante a livello di impatti ambientali generati. Tra gli importanti risultati emersi, è stata rilevata una grande lacuna relativa alla valutazione LCA della gestione dei rifiuti provenienti dai diversi siti di bonifica. Infatti, spesso la gestione del rifiuto di bonifica non è oggetto di un’analisi approfondita e ricade spesso in valutazioni troppo semplificate che non riflettono l’entità reale degli impatti. Da tale evidenza si è sviluppata la necessità di un approfondimento sulla gestione delle diverse tipologie di rifiuti prodotti dai siti di bonifica, al fine di comparare mediante un approccio LCA diversi scenari di gestione di tali rifiuti. È stata quindi svolta una valutazione dell’entità degli impatti associati ai diversi scenari di gestione dei rifiuti da bonifica di Eni Rewind attraverso l’utilizzo del software SimaPro e della banca dati Ecoinvent in cui sono modellizzate diverse tipologie di gestione dei rifiuti (trattamenti piuttosto che tipi di discariche) alle quali sono associati impatti ambientali differenti. All’interno del software sono stati identificati i processi che meglio rappresentassero i destini finali delle diverse tipologie di rifiuto di bonifica sulla base del suo codice CER. L’inclusione di questi processi e quindi la contabilizzazione dei relativi impatti in uno studio LCA consentirà sia di supportare la scelta dello scenario di gestione del rifiuto più idoneo, sia di effettuare una valutazione più completa della sostenibilità dell’intervento di bonifica.

La valutazione del comportamento ambientale del metabolita di un pesticida è stato suddiviso in due studi indipendenti ma complementari tra loro utilizzando il metabolita radiomarcato con 14C: 1. Valutazione della degradazione aerobica del 14C-metabolita nel suolo; 2. Valutazione dell'assorbimento e desadsorbimento del 14C-metabolita nel suolo. L'attività di studio delle normative e dei regolamenti concernenti le Buone Pratiche di Laboratorio nell'ambito di studi multisito ed è poi sfociato nella gestione di uno studio di validazione di un metodo di analisi per la determinazione dei residui di glyphosate in frutta ed ortaggi.
The behaviour evaluation of a pesticide metabolite was divided in two different but complementary studies, using the radiolabeled metabolite: 1. evaluation of aerobic degradation of 14C-metabolite in soil; 2. evaluation of sorption of 14C-metabolite in soil. The study of GLP (Good Laboratory Practices) for multisite studies lead to the management of validation study for determination of glyphosate residues in fruits and vegetables.

La valutazione del comportamento ambientale del metabolita di un pesticida è stato suddiviso in due studi indipendenti ma complementari tra loro utilizzando il metabolita radiomarcato con 14C: 1. Valutazione della degradazione aerobica del 14C-metabolita nel suolo; 2. Valutazione dell'assorbimento e desadsorbimento del 14C-metabolita nel suolo. L'attività di studio delle normative e dei regolamenti concernenti le Buone Pratiche di Laboratorio nell'ambito di studi multisito ed è poi sfociato nella gestione di uno studio di validazione di un metodo di analisi per la determinazione dei residui di glyphosate in frutta ed ortaggi.
The behaviour evaluation of a pesticide metabolite was divided in two different but complementary studies, using the radiolabeled metabolite: 1. evaluation of aerobic degradation of 14C-metabolite in soil; 2. evaluation of sorption of 14C-metabolite in soil. The study of GLP (Good Laboratory Practices) for multisite studies lead to the management of validation study for determination of glyphosate residues in fruits and vegetables.

Il seguente lavoro di tesi è basato sullo sviluppo e la valutazione di catalizzatori a base di Rh, supportati da Ce0.5Zr0.5O2 e ZrO2 sintetizzati tramite microemulsione inversa, impiegati per un processo di produzione di idrogeno attraverso steam reforming del metano a bassa temperatura per applicazioni in reattori catalitici integrati con membrana al Pd per la separazione di idrogeno. Lo studio si è incentrato sull’analisi delle prestazioni e dell’attività di catalizzatori del tipo Rh cluster e Rh IWI, effettuando diversi test in un reattore a letto fisso in modo da trovare le migliori condizioni operative. Tali condizioni sono state trovate confrontando le due tipologie di catalizzatori, supportati con Ce0.5Zr0.5O2, aventi una quantità di rodio dello 0,58% in peso ciascuno. Tuttavia dal confronto non si osservano differenze sostanziali riguardo l’attività catalitica e non è possibile affermare quale dei due catalizzatori risulti il migliore, per cui si è scelto di effettuare ulteriori test a bassa concentrazione di rodio (0,05%), per monitorare la disattivazione, e successivamente anche con supporto di ZrO2. Da questi test risulta una rapida disattivazione del cluster rispetto all’IWI, ma con il supporto di zirconia tale disattivazione non avviene infatti il cluster presenta inizialmene una conversione di metano lievemente maggiore rispetto all’IWI.

La timidilato sintasi umana (hTS) svolge un ruolo fondamentale nella sintesi del DNA, essenziale per la sopravvivenza cellulare. L’hTS è coinvolta nel percorso dei folati, nello specifico nella biosintesi ex novo delle pirimidine. La struttura della proteina e le sue funzioni sono strettamente correlate per l’esplicazione dell’attività enzimatica. Nonostante il quantitativo di lavori riportati in letteratura, le caratteristiche delle relazioni struttura-funzione dell’ hTS non sono ancora chiare, in particolare le diverse conformazioni e le forme di equilibrio monomero/dimero di questa proteina omodimerica obbligata e il suo ruolo nella regolazione dell’espressione genica. Il concetto espresso precedentemente è stato ampiamente investigato durante il progetto AIRC intitolato “Inibitori dell’interazione proteina-proteina della timidilato sintasi contro il cancro al colon retto”, che è stato parte del mio progetto di dottorato. Inoltre, il mio progetto è incluso nel programma del PhD regionale ONCOPENTA1. hTS è tra i bersagli più studiati per la progettazione di farmaci antitumorali. Oltre 3300 studi clinici sono stati condotti dall'inizio degli anni sessanta, alcuni dei quali hanno portato alla scoperta di farmaci anti-TS come il Fluorouracile (FU), Pemetrexed e Raltitrexed che sono utilizzati in diversi tipi di tumori come quello del colon-retto (CRC), e recentemente, dell’ovarico (OC). I farmaci citati, dopo un uso prolungato determinano resistenza farmacologica rendendoli inefficaci. Inoltre nell’ OC è presente la resistenza incrociata per l’utilizzo di farmaci al platino. Uno dei principali meccanismi di tale resistenza è la sovraespressione dell’hTS. Un risultato importante è l’ottenimento di nuovi farmaci abili di superare l’effetto della resistenza farmacologica indotta da elevati livelli della proteina TS. Pertanto, l'inibizione proteica rispetto alla sua regolazione TSmRNA richiede una strategia alternativa e la scoperta di un nuovo meccanismo di inibizione. Attualmente, i farmaci anti-TS sono inibitori che si legano nella tasca catalitica, mimando i substrati. Gli inibitori allosterici (non substrati analoghi), legandosi all’interfaccia dimerica della proteina, possono alterare l’equilibrio dimero\monomero con l’incremento della forma monomerica, ed innescando così la modulazione delle vie cellulari, ad ora inesplorate. E7 è stato il primo composto recentemente individuato con tali caratteristica ma necessita di un lavoro di ottimizzazione per migliorare le proprietà farmacologiche. Lo scopo principale della tesi è la progettazione e lo sviluppo di nuovi inibitori, analoghi di E7, che alterano l’equilibrio dimerico della proteina. I nuovi composti dovrebbero indurre una perturbazione dell’ equilibrio dimero monomero in favore della forma monomerica, inibendo la funzione catalitica, preservando l’attività regolatoria e conseguentemente la riduzione della resistenza farmacologica. Per raggiungere tali obiettivi, ho sintetizzato più di 40 composti che sono stati testati ed analizzati con studi di inibizione enzimatica e di FRET, la quale rileva la capacità di questi composti di ridurre la forma dimerica della TS. Per stabilire se i nostri composti determinano la separazione del dimero a livello cellulare, ho progettato e sintetizzato composti legati a sonde fluorescenti. Inoltre, ho sviluppato una nuova sintesi per la produzione del composto in grande quantità e la risoluzione enantiomerica tramite HPLC preparativa chirale per ottenere i dati in vivo del nostro composto migliore. Il mio lavoro di ottimizzazione ha portato all’ottenimento del composto AIC-C37 che presenta una migliore attività biologica e solubilità (rispetto ad E7 e FU) ed un interessante punto di collegamento molecolare per studiare il meccanismo in vivo.
Human thymidylate synthase (hTS) plays a fundamental role in the synthesis of DNA, essential for cell survival. hTS is involved in the folate pathways, specifically in the de novo pyrimidine biosynthesis. Protein structure and functions are intimately correlated for the explication of the enzymatic activity. Despite the enormous amount of work reported in the literature, hTS structure-function relationships features are still unclear, especially the different conformations and monomers/dimer equilibrium of this obligate homodimeric protein and its role in protein expression regulation. The above-mentioned concept was largely investigated during the execution of the AIRC project entitled “Protein-protein interaction inhibitors of thymidylate synthase against colorectal cancer” that was also in part the topic of my PhD thesis. Additionally, my project was included in the PhD regional program dedicated to ONCOPENTA1. hTS is the most renowned anticancer drug target. Over 3300 clinical trials have been performed since the early sixties, some of them providing anti-TS clinical drugs as Fluorouracil (FU), Pemetrexed and Raltitrexed that are adopted in different cancer types such as colorectal cancer (CRC) and recently in ovarian cancer (OC). All the mentioned drugs, after prolonged use, cause drug resistance that makes the drug ineffective. In OC, cross-resistance with platinum drugs is also observed. One of the main resistance mechanisms is the overexpression of hTS. The development of new drugs able to overcome drug resistance effects due to high TS protein level would be an important achievement. This requires a change of strategy and the discovery of new mechanisms of inhibition that should unpair the protein inhibition with respect to its TSmRNA regulation. Currently, TS-targeting drugs bind at the catalytic-pocket and mostly resemble the protein substrates. Allosteric inhibitors (non-substrate analogues) binding at the protein dimeric interface may alter the dimer/monomer equilibrium by increasing the monomer form amount thus triggering cellular pathways modulation previously unexplored. The first compound with the mentioned features (E7) was recently identified. However a lead optimization work is necessary to optimize the compound properties. The specific aim of my thesis work is the design and development of novel dissociative inhibitors stemming from the E7 lead. The new compounds should induce a perturbation in the dimer-monomer equilibrium in favour of the monomeric form thus, inhibiting the catalytic function, preserving the regulatory activity and consequently reduce the development of drug resistance. To achieve this aim, I have synthesized more than 40 compounds that were tested and analyzed using enzyme kinetic inhibition studies and fluorescence resonance energy transfer (FRET) assays that revealed the capability of these compounds to disrupt the dimeric form of hTS. To gain evidence that our compounds determine hTS dimer disrupters engagement in cells, I have designed and synthesized compounds with fluorescence probe that we resorted in fluorescence microscopy. Moreover, I have developed a scale-up methodology for chemical processes and preparative chiral HPLC resolution to obtain the in vivo data. My lead optimization work provided a compound, AIC-C37, that showed higher solubility and efficacy with respect to E7 and Fluorouracil and interesting anchoring point for in vitro and in vivo mechanism of action studies. 1 Progetto (ONCOPENTA): Oncologia di Precisione e Nuove Terapie Antitumorali. Sviluppo di inibitori dell’interazione protein-proteina contro la farmaco-resistenza nei sarcomi e carcinomi

In agricoltura, i pesticidi sono stati usati molto frequentemente per salvaguardare le colture dagli attacchi di parassiti e dalle malattie. Questi pesticidi, oltre a uccidere gli organismi target, molte volte colpiscono anche gli organismi non-target. Tra gli organismi non-target, possiamo individuare molti microrganismi utili a determinare la fertilità e la qualità del terreno. La presenza di questi xenobiotici nel terreno può influenzare i principali cicli biogeochimici (N, C, S, P) e altre vie metaboliche (es. β-ketoadipate). In questo studio abbiamo analizzato gli effetti di isoproturon, tebuconazole e chlorpyrifos sull’abbondanza, sulla struttura e sulla diversità della comunità microbica. Inoltre, abbiamo anche studiato gli effetti di questi pesticidi sui geni coinvolti nel ciclo dell’azoto. Si è potuto notare che l’abbondanza della comunità batterica è molto influenzata dall’applicazione del fungicida tebuconazole . Per quanto riguarda gli studi sulla funzionalità e diversità della popolazione microbica, l’applicazione di questi pesticidi sembra non indurre una chiara dose-dipendente e un effetto tempo. Diversamente, in relazione all’analisi sulla diversità microbica, possiamo affermare che l’applicazione di questi tre pesticidi ha influenzato il numero di OTU rilevate; tuttavia, l’indice di diversità (H’) ci dice che l’uso di questi pesticidi porta ad un incremento della diversità all’interno dei campioni trattati. In conclusione, è possibile affermare che l’applicazione di questi pesticidi influenza l’abbondanza e la funzionalità della popolazione microbica, ma non induce una diminuzione della diversità all’interno della medesima comunità.
In agriculture, pesticides have been frequently used to protect crops from pest and disease attacks. Many times such pesticides, besides killing the target organisms, hit non-target organisms. Among the non-target organisms, we can find many useful microorganisms that determine fertility and soil quality. The presence of these xenobiotics in soil can influence the main biogeochemical cycles (N, C, S, P) and other metabolic pathways (eg. Β-ketoadipate). In this study, we investigated the effects of isoproturon, tebuconazole and chlorpyrifos on the abundance, the structure and the diversity of the microbial community. We have also studied the effects of these pesticides on the genes involved in the nitrogen cycle. It was observed that the abundance of the bacterial community is significantly affected by the application of the fungicide tebuconazole. As for the studies on the functionality and the diversity of the bacterial population, the application of these pesticides does not seem to induce a clear dose-dependent nor a time effect. On the contrary, with respect to the analysis on microbial diversity, we observed that the application of these three pesticides did influence the number of detected OTU, whereas the diversity index (H') tells us that the use of such pesticides leads to an increase of diversity within the treated samples. Finally, we can conclude that the application of these pesticides affects the abundance and function of the microbial population, but does not lead to lower diversity within the same community.

In agricoltura, i pesticidi sono stati usati molto frequentemente per salvaguardare le colture dagli attacchi di parassiti e dalle malattie. Questi pesticidi, oltre a uccidere gli organismi target, molte volte colpiscono anche gli organismi non-target. Tra gli organismi non-target, possiamo individuare molti microrganismi utili a determinare la fertilità e la qualità del terreno. La presenza di questi xenobiotici nel terreno può influenzare i principali cicli biogeochimici (N, C, S, P) e altre vie metaboliche (es. β-ketoadipate). In questo studio abbiamo analizzato gli effetti di isoproturon, tebuconazole e chlorpyrifos sull’abbondanza, sulla struttura e sulla diversità della comunità microbica. Inoltre, abbiamo anche studiato gli effetti di questi pesticidi sui geni coinvolti nel ciclo dell’azoto. Si è potuto notare che l’abbondanza della comunità batterica è molto influenzata dall’applicazione del fungicida tebuconazole . Per quanto riguarda gli studi sulla funzionalità e diversità della popolazione microbica, l’applicazione di questi pesticidi sembra non indurre una chiara dose-dipendente e un effetto tempo. Diversamente, in relazione all’analisi sulla diversità microbica, possiamo affermare che l’applicazione di questi tre pesticidi ha influenzato il numero di OTU rilevate; tuttavia, l’indice di diversità (H’) ci dice che l’uso di questi pesticidi porta ad un incremento della diversità all’interno dei campioni trattati. In conclusione, è possibile affermare che l’applicazione di questi pesticidi influenza l’abbondanza e la funzionalità della popolazione microbica, ma non induce una diminuzione della diversità all’interno della medesima comunità.
In agriculture, pesticides have been frequently used to protect crops from pest and disease attacks. Many times such pesticides, besides killing the target organisms, hit non-target organisms. Among the non-target organisms, we can find many useful microorganisms that determine fertility and soil quality. The presence of these xenobiotics in soil can influence the main biogeochemical cycles (N, C, S, P) and other metabolic pathways (eg. Β-ketoadipate). In this study, we investigated the effects of isoproturon, tebuconazole and chlorpyrifos on the abundance, the structure and the diversity of the microbial community. We have also studied the effects of these pesticides on the genes involved in the nitrogen cycle. It was observed that the abundance of the bacterial community is significantly affected by the application of the fungicide tebuconazole. As for the studies on the functionality and the diversity of the bacterial population, the application of these pesticides does not seem to induce a clear dose-dependent nor a time effect. On the contrary, with respect to the analysis on microbial diversity, we observed that the application of these three pesticides did influence the number of detected OTU, whereas the diversity index (H') tells us that the use of such pesticides leads to an increase of diversity within the treated samples. Finally, we can conclude that the application of these pesticides affects the abundance and function of the microbial population, but does not lead to lower diversity within the same community.

Despite significant efforts have been directed toward reducing waste generation and encouraging alternative waste management strategies, landfills still remain the main option for Municipal Solid Waste (MSW) disposal in many countries. Hence, landfills and related impacts on the surroundings are still current issues throughout the world. Actually, the major concerns are related to the potential emissions of leachate and landfill gas into the environment, that pose a threat to public health, surface and groundwater pollution, soil contamination and global warming effects. To ensure environmental protection and enhance landfill sustainability, modern sanitary landfills are equipped with several engineered systems with different functions. For instance, the installation of containment systems, such as bottom liner and multi-layers capping systems, is aimed at reducing leachate seepage and water infiltration into the landfill body as well as gas migration, while eventually mitigating methane emissions through the placement of active oxidation layers (biocovers). Leachate collection and removal systems are designed to minimize water head forming on the bottom section of the landfill and consequent seepages through the liner system. Finally, gas extraction and utilization systems, allow to recover energy from landfill gas while reducing explosion and fire risks associated with methane accumulation, even though much depends on gas collection efficiency achieved in the field (range: 60-90% Spokas et al., 2006; Huitric and Kong, 2006). Hence, impacts on the surrounding environment caused by the polluting substances released from the deposited waste through liquid and gas emissions can be potentially mitigated by a proper design of technical barriers and collection/extraction systems at the landfill site. Nevertheless, the long-term performance of containment systems to limit the landfill emissions is highly uncertain and is strongly dependent on site-specific conditions such as climate, vegetative covers, containment systems, leachate quality and applied stress. Furthermore, the design and operation of leachate collection and treatment systems, of landfill gas extraction and utilization projects, as well as the assessment of appropriate methane reduction strategies (biocovers), require reliable emission forecasts for the assessment of system feasibility and to ensure environmental compliance. To this end, landfill simulation models can represent an useful supporting tool for a better design of leachate/gas collection and treatment systems and can provide valuable information for the evaluation of best options for containment systems depending on their performances under the site-specific conditions. The capability in predicting future emissions levels at a landfill site can also be improved by combining simulation models with field observations at full-scale landfills and/or with experimental studies resembling landfill conditions. Indeed, this kind of data may allow to identify the main parameters and processes governing leachate and gas generation and can provide useful information for model refinement. In view of such need, the present research study was initially addressed to develop a new landfill screening model that, based on simplified mathematical and empirical equations, provides quantitative estimation of leachate and gas production over time, taking into account for site-specific conditions, waste properties and main landfill characteristics and processes. In order to evaluate the applicability of the developed model and the accuracy of emissions forecast, several simulations on four full-scale landfills, currently in operative management stage, were carried out. The results of these case studies showed a good correspondence of leachate estimations with monthly trend observed in the field and revealed that the reliability of model predictions is strongly influenced by the quality of input data. In particular, the initial waste moisture content and the waste compression index, which are usually data not available from a standard characterisation, were identified as the key unknown parameters affecting leachate production. Furthermore, the applicability of the model to closed landfills was evaluated by simulating different alternative capping systems and by comparing the results with those returned by the Hydrological Evaluation of Landfill Performance (HELP), which is the most worldwide used model for comparative analysis of composite liner systems. Despite the simplified approach of the developed model, simulated values of infiltration and leakage rates through the analysed cover systems were in line with those of HELP. However, it should be highlighted that the developed model provides an assessment of leachate and biogas production only from a quantitative point of view. The leachate and biogas composition was indeed not included in the forecast model, as strongly linked to the type of waste that makes the prediction in a screening phase poorly representative of what could be expected in the field. Hence, for a qualitative analysis of leachate and gas emissions over time, a laboratory methodology including different type of lab-scale tests was applied to a particular waste material. Specifically, the research was focused on mechanically biologically treated (MBT) wastes which, after the introduction of the European Landfill Directive 1999/31/EC (European Commission, 1999) that imposes member states to dispose of in landfills only wastes that have been preliminary subjected to treatment, are becoming the main flow waste landfilled in new Italian facilities. However, due to the relatively recent introduction of the MBT plants within the waste management system, very few data on leachate and gas emissions from MBT waste in landfills are available and, hence, the current knowledge mainly results from laboratory studies. Nevertheless, the assessment of the leaching characteristics of MBT materials and the evaluation of how the environmental conditions may affect the heavy metals mobility are still poorly investigated in literature. To gain deeper insight on the fundamental mechanisms governing the constituents release from MBT wastes, several leaching experiments were performed on MBT samples collected from an Italian MBT plant and the experimental results were modelled to obtain information on the long-term leachate emissions. Namely, a combination of experimental leaching tests were performed on fully-characterized MBT waste samples and the effect of different parameters, mainly pH and liquid to solid ratio (L/S,) on the compounds release was investigated by combining pH static-batch test, pH dependent tests and dynamic up-flow column percolation experiments. The obtained results showed that, even though MBT wastes were characterized by relatively high heavy metals content, only a limited amount was actually soluble and thus bioavailable. Furthermore, the information provided by the different tests highlighted the existence of a strong linear correlation between the release pattern of dissolved organic carbon (DOC) and several metals (Co, Cr, Cu, Ni, V, Zn), suggesting that complexation to DOC is the leaching controlling mechanism of these elements. Thus, combining the results of batch and up-flow column percolation tests, partition coefficients between DOC and metals concentration were derived. These data, coupled with a simplified screening model for DOC release, allowed to get a very good prediction of metal release during the experiments and may provide useful indications for the evaluation of long-term emissions from this type of waste in a landfill disposal scenario. In order to complete the study on the MBT waste environmental behaviour, gas emissions from MBT waste were examined by performing different anaerobic tests. The main purpose of this study was to evaluate the potential gas generation capacity of wastes and to assess possible implications on gas generation resulting from the different environmental conditions expected in the field. To this end, anaerobic batch tests were performed at a wide range of water contents (26-43 %w/w up to 75 %w/w on wet weight) and temperatures (from 20-25 °C up to 55 °C) in order to simulate different landfill management options (dry tomb or bioreactor landfills). In nearly all test conditions, a quite long lag-phase was observed (several months) due to the inhibition effects resulting from high concentrations of volatile fatty acids (VFAs) and ammonia that highlighted a poor stability degree of the analysed material. Furthermore, experimental results showed that the initial waste water content is the key factor limiting the anaerobic biological process. Indeed, when the waste moisture was lower than 32 %w/w the methanogenic microbial activity was completely inhibited. Overall, the obtained results indicated that the operative conditions drastically affect the gas generation from MBT waste, in terms of both gas yield and generation rate. This suggests that particular caution should be paid when using the results of lab-scale tests for the evaluation of long-term behaviour expected in the field, where the boundary conditions change continuously and vary significantly depending on the climate, the landfill operative management strategies in place (e.g. leachate recirculation, waste disposal methods), the hydraulic characteristics of buried waste, the presence and type of temporary and final cover systems.