Дисертації з теми "Cellules souches humaines induites à la pluripotence"
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Jung, Laura. "Optimisation de protocoles de reprogrammation de cellules somatiques humaines en cellules souches à pluripotence induite (hiPSC)." Thesis, Strasbourg, 2013. http://www.theses.fr/2013STRAJ066.
Анотація:
En 2006 et 2007, les équipes de Yamanaka et Thomson réalisent la reprogrammation de cellules somatiques murines et humaines en cellules souches pluripotentes à partir de deux cocktails de gènes : OCT4, SOX2, KLF4, cMYC (OSKM) et OCT4, NANOG, SOX2, LIN28 (ONSL). Les cellules souches à pluripotence induite générées (iPS) partagent les propriétés fondamentales des cellules souches embryonnaires : l’auto-renouvèlement, le maintien de la pluripotence et la capacité de différenciation. Ces cellules laissent entrevoir des applications considérables tant en recherche fondamentale (compréhension des mécanismes de développement et de pathologies, développement de modèles) qu’en recherche appliquée (médecine régénérative, toxicologie prédictive, criblage de médicaments). L’avantage majeur de l’utilisation des iPS réside dans leur origine non embryonnaire. Les contraintes d’ordre éthique sont écartées et une grande diversité de types cellulaires à partir de n’importe quel donneur a priori est disponible pour une reprogrammation. L’établissement d’une banque d’hiPS issus de donneurs sains ou de patients, serait d’une grande utilité pour la communauté scientifique se consacrant à l’étude des mécanismes physiopathologiques ou de développement et une source considérable pour la dérivation à des fins de thérapie cellulaire. Dans le but de mettre en place une telle banque, nous avons développé avec la société Vectalys des rétrovirus de reprogrammation contenant les cassettes polycistroniques ONSL et OSKM. Dans un premier temps, nous avons établi un protocole de reprogrammation robuste à l’aide des rétrovirus RV-ONSL. Nous avons ensuite mis en évidence la synergie entre les facteurs ONSL et OSKM, la combinaison équimolaire de RV-ONSL et RV-OSKM permettant d’atteindre 2% d’efficacité de reprogrammation. Nous avons également entrepris la reprogrammation propre par transfections d’ARNm polycistroniques ONSL et OKM mettant à profit cette incroyable synergieIn 2006 and 2007, Yamanaka and Thomson teams achieved the reprogramming of mouse and human somatic cells into pluripotent stem cells through the transfection of two cocktails of genes: OCT4, SOX2, KLF4, cMYC (OSKM) and OCT4, NANOG, SOX2, LIN28 (ONSL). The generated cells, called induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) share the same fundamental properties of ESC : self-renewing, pluripotency maintenance and capacity of differentiation into the three germ layers and suggest the same application potential in basic research (developmental and epigenetic biology) as well as in therapy (regenerative medicine, disease modeling for drug development). One of the major advantages of iPSC lies in their non-embryonic origin. Indeed, the use of iPSC resolves the ethical constraints and offers the possibility to work with extensive cell types directly from the patient to treat. Stéphane Viville’s research team aims to develop a hiPSC bank from patient suffering from genetic or other diseases which will be available for the scientific community. We are experienced in human primary fibroblasts reprogramming especially with the use of two polycistronic cassettes: ONSL encoding Thomson’s cocktail and OSKM encoding Yamanaka’s cocktail separated with 2A peptides. Thanks to the combination of RV-ONSL and RV-OSKM retroviral vectors (developed with Vectalys) we are yielding more than 2% of reprogramming efficiency in a highly reproducible way. Indeed, we demonstrated the reprogramming synergy of ONSL and OSKM combination. We are now focusing our effort on non-integrative strategies (ie mRNA) which are more appropriate for clinical usage
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Hoarau, Priscilla. "Obtention de cellules souches humaines induites à la pluripotence à partir de cellules d'urine et leur différenciation neuronale." Master's thesis, Université Laval, 2017. http://hdl.handle.net/20.500.11794/27912.
Анотація:
Les cellules souches humaines induites à la pluripotence (hiPSCs) ont été conçues pour la première fois en 2007 par l’équipe du Docteur Yamanaka, au Japon. Ce sont des cellules somatiques reprogrammées par un virus permettant, par exemple, la différenciation neuronale à des fins d'étude de maladies neuro-développementales telle que la Schizophrénie. Le prélèvement des cellules somatiques se fait aujourd'hui majoritairement par des méthodes assez invasives, notamment les biopsies de peau ou prélèvements sanguins. Ceci peut représenter un frein à leur utilisation notamment chez les enfants et surtout les enfants malades. La différenciation neuronale privilégiée est la voie dopaminergique (DA) car c'est ce type cellulaire qui est principalement atteint chez les schizophrènes. C'est pourquoi on priorise pour ce projet l'utilisation de cellules contenues dans l'urine, qui seront reprogrammées via un virus non-intégratif, le virus de Sendaï (SeV). La différenciation neuronale nous permettra d'obtenir des neurones DA fonctionnels, caractérisés par électrophysiologie. Les expériences ont montré une très grande efficacité de reprogrammation cellulaire au niveau des cellules d'urine, ainsi qu'un grand potentiel de différenciation neuronale, malgré quelques différences observées entre les lignées saines et schizophréniques. Grâce à ce projet, la réalisation d'un modèle cellulaire pour la Schizophrénie a pu être établie. Les différences notées entre les lignées pendant la différenciation ouvrent une nouvelle voie pour approfondir l'étude de la maladie au niveau cellulaire et moléculaire.Human Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) were conceived for the first time in 2007 in Japan, by Doctor Yamanaka’s team. These are somatic cells reprogrammed thanks to a retrovirus allowing, for example, neuronal differentiation for the purpose of neurodevelopmental disorders studies such as Schizophrenia. Today, the removal of somatic cells is mainly made by enough invasive methods, including skin and blood biopsies. This can represent a brake in their use predominantly children, mainly sick children. The preferred neuronal differentiation is the dopaminergic (DA) way because it's the mostly cell type affected in schizophrenics. That's why we prioritize the use of urine cells for this project, reprogrammed via a non integrative virus, the Sendai virus (SeV). The neuronal differentiation enables us to get functional DA neurons characterized by electrophysiology. Experimentations show a huge efficiency of urine cells reprogramming as well as a great potential of neuronal differentiation despite some distinctions between the two lines. Thanks to this project, the achievement of a cellular model for Schizophrenia could be established. The differences noticed between the two lines during the differentiation open up a new way to make cellular and molecular studies of this disease deeper.
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Hafner, Anne-Laure. "Étude des progéniteurs adipeux dérivés des cellules souches pluripotentes induites humaines." Thesis, Nice, 2015. http://www.theses.fr/2015NICE4062.
Анотація:
Chez les mammifères, on distingue principalement deux types de tissu adipeux (TA) : le TA blanc permet le stockage de l’énergie alors que le TA brun est spécialisé dans la thermogénèse induisant une dépense énergétique. Aujourd’hui, un troisième type d’adipocyte, nommé beige/ brite, est également reconnu. Ces cellules recrutées au sein du TA blanc, possèdent le même potentiel que les adipocytes bruns. L’identification des voies de signalisation permettant de réguler le développement des adipocytes blancs, beiges et bruns reste encore aujourd’hui à être déterminée. La génération des cellules souches pluripotentes induites (hiPS) a permis d’établir un nouveau modèle d’étude des étapes précoces de l’adipogénèse humaine. Nous avons démontré que la génération des progéniteurs adipeux (PA) blancs et bruns est régulée par la voie de l’acide rétinoïque pendant la différenciation in-vitro des cellules hiPS. La caractérisation moléculaire de ces deux types de PA a révélé l’implication du facteur Pax3 dans l’acquisition du phénotype brun. Au cours de cette étude, nous avons constaté que les PA dérivés de cellules hiPS (hiPSC-PA) présentaient un faible potentiel adipocytaire. Nous avons identifiés les facteurs permettant de différencier avec une forte efficacité les hiPSC-PA comprenant l’EGF, l’acide ascorbique, l’hydrocortisone et l’inhibiteur de la voie du TGFβ, le SB 431542. Lors d’expériences préliminaires, nous avons analysé l’effet de la surexpression du facteur HOXC8 sur la différenciation des PA. L’expression ectopique de ce facteur conduit à des réponses distinctes sur le phénotype et la différenciation des hiPSC-PA et ceux provenant de tissus adultesIn mammals, two types of adipose tissue coexist: the white (WAT) wich is involved in energy storage and the brown (BAT) which is specialized in energy expenditure. Beige adipocytes have recently been described as brown –like adipocytes and represent a third type of adipocytes that are recruited in WAT. The molecular mechanisms involved in the generation of these different types of adipocytes remains unknow in humans, mainly because of the lack of appropriate in vitro cellular models. The human induced Pluripotent Stem (hips) cells are a good model to study the earliest steps of human adipogenesis. We have shown that the generation of white and brown adipocytes progenitors (AP) is regulated by acid retinoic signaling pathway during hips cells differentiation. Functional experiments indicated that the transcription factor Pax3 is a molecular mediator of the brown phenotype. During this study, we could see that AP derived from hips cells display a low adipogenic capacity as compared to progenitors derived from adult adipose tissue. We show in this work that treatment with TGFβ pathway inhibitor SB431542 together with ascorbic acid, hydrocortisone and EGF promoted differentiation of non- genetically modified hiPSCs-BAPs at a high rate. During preliminary results, we have analyzed the role of the transcription factor Hoxc8 on PA differentiation. The surexpression of this factor lead to distinct answers on the phenotype and differentiation between hiPSCs-AP and adult-derived AP
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Hafner, Anne-Laure. "Étude des progéniteurs adipeux dérivés des cellules souches pluripotentes induites humaines." Electronic Thesis or Diss., Nice, 2015. http://www.theses.fr/2015NICE4062.
Анотація:
Chez les mammifères, on distingue principalement deux types de tissu adipeux (TA) : le TA blanc permet le stockage de l’énergie alors que le TA brun est spécialisé dans la thermogénèse induisant une dépense énergétique. Aujourd’hui, un troisième type d’adipocyte, nommé beige/ brite, est également reconnu. Ces cellules recrutées au sein du TA blanc, possèdent le même potentiel que les adipocytes bruns. L’identification des voies de signalisation permettant de réguler le développement des adipocytes blancs, beiges et bruns reste encore aujourd’hui à être déterminée. La génération des cellules souches pluripotentes induites (hiPS) a permis d’établir un nouveau modèle d’étude des étapes précoces de l’adipogénèse humaine. Nous avons démontré que la génération des progéniteurs adipeux (PA) blancs et bruns est régulée par la voie de l’acide rétinoïque pendant la différenciation in-vitro des cellules hiPS. La caractérisation moléculaire de ces deux types de PA a révélé l’implication du facteur Pax3 dans l’acquisition du phénotype brun. Au cours de cette étude, nous avons constaté que les PA dérivés de cellules hiPS (hiPSC-PA) présentaient un faible potentiel adipocytaire. Nous avons identifiés les facteurs permettant de différencier avec une forte efficacité les hiPSC-PA comprenant l’EGF, l’acide ascorbique, l’hydrocortisone et l’inhibiteur de la voie du TGFβ, le SB 431542. Lors d’expériences préliminaires, nous avons analysé l’effet de la surexpression du facteur HOXC8 sur la différenciation des PA. L’expression ectopique de ce facteur conduit à des réponses distinctes sur le phénotype et la différenciation des hiPSC-PA et ceux provenant de tissus adultesIn mammals, two types of adipose tissue coexist: the white (WAT) wich is involved in energy storage and the brown (BAT) which is specialized in energy expenditure. Beige adipocytes have recently been described as brown –like adipocytes and represent a third type of adipocytes that are recruited in WAT. The molecular mechanisms involved in the generation of these different types of adipocytes remains unknow in humans, mainly because of the lack of appropriate in vitro cellular models. The human induced Pluripotent Stem (hips) cells are a good model to study the earliest steps of human adipogenesis. We have shown that the generation of white and brown adipocytes progenitors (AP) is regulated by acid retinoic signaling pathway during hips cells differentiation. Functional experiments indicated that the transcription factor Pax3 is a molecular mediator of the brown phenotype. During this study, we could see that AP derived from hips cells display a low adipogenic capacity as compared to progenitors derived from adult adipose tissue. We show in this work that treatment with TGFβ pathway inhibitor SB431542 together with ascorbic acid, hydrocortisone and EGF promoted differentiation of non- genetically modified hiPSCs-BAPs at a high rate. During preliminary results, we have analyzed the role of the transcription factor Hoxc8 on PA differentiation. The surexpression of this factor lead to distinct answers on the phenotype and differentiation between hiPSCs-AP and adult-derived AP
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Martineau, Sabrina. "Etude des mécanismes moléculaires de l'épidermolyse bulleuse simple à partir de cellules souches humaines induites à la pluripotence." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASQ020.
Анотація:
L'Epidermolyse bulleuse simplex (EBS) est une maladie cutanée principalement causée par des mutations dominantes dans les gènes codant les kératines 5 (KRT5) ou 14 (KRT14). Elle se caractérise notamment par la présence de cloques causées par un décollement de l'épiderme et une inflammation cutanée. D'un point de vue génétique, les mutations vont altérer l'assemblage du réseau de filaments intermédiaires de kératines dans les kératinocytes basaux de l'épiderme et entrainer une cytolyse cellulaire d'où la formation de cloques intra épidermiques. Il n'existe actuellement aucune approche thérapeutique efficace. La compréhension de la maladie et le développement de thérapies, ont été entravées par le manque de modèles cellulaires humains et murins relevant.Ainsi, l'objectif général de ma thèse a consisté à exploiter les propriétés des cellules souches induites à la pluripotence (hiPSc) pour modéliser l'EBS. Dans ce but, nous avons généré des kératinocytes à partir d'hiPSc provenant de patients EBS porteurs de mutations dans le gène KRT5 (Ker-EBS), et de patients sains (Ker-WT). La comparaison des Ker-EBS et Ker-WT nous a permis de montrer que les Ker-EBS récapitulent les principaux phénotypes associés à l'EBS à savoir une diminution de la prolifération cellulaire, une augmentation de la migration cellulaire, une altération des voies de signalisation (ERK et JNK), ainsi que des agrégats de filaments intermédiaires de kératines dans le cytoplasme, tel qu'observé dans kératinocytes primaires de l'EBS. Ces résultats démontrent que notre modèle cellulaire dérivés d'hiPSc est relevant pour l'étude de l'EBS.Afin d'identifier de nouveaux mécanismes moléculaires, une analyse trancriptomique comparant les Ker-EBS aux Ker-WT, a mis en évidence 138 gènes dérégulés, révélant un enrichissement dans les processus liés à la matrice extracellulaire, au packaging de l'ADN et à la réponse inflammatoire. La composante inflammatoire dans l'EBS n'ayant été que peu décrite, la suite de mes travaux a consisté à étudier le phénotype cytokinique pro-inflammatoire. Ainsi, nous avons pu démontrer, une augmentation de l'expression de l'IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 (CXCL8), CXCL5, CXCL10, CXCL11, CCL5 dans les Ker-EBS, au niveau ARN en condition basale ou stimulée à l'IFNγ pour mimer un contexte pro- inflammatoire. Seules les chemokines CXCL10 et CXCL11 sont secrétées à forte concentration dans le surnagent de culture des Ker-EBS stimulés ou non, démontrant l'implication de ces cytokines dans l'EBS. En parallèle, afin de s'affranchir des biais notamment dus au fond génétique, au sexe, à l'âge des patients et à l'épigénétique, nous avons généré une lignée de Ker-EBS isogénique (Ker-EBS corrigée) par la technique CRISPR-Cas9. Nous avons ainsi pu démontrer que la lignée de Ker-EBS corrigée montrait une restauration du niveau d'expression des cytokines pro-inflammatoires citées précédemment, à un niveau proche des Ker-WT, confirmant un lien direct entre les mutations du gène KRT5 et la signature pro-inflammatoire. Pour conclure, notre nouveau modèle cellulaire nous a permis de reproduire les phénotypes pathologiques connus dans la littérature et de mettre en évidence une dérégulation de l'expression des cytokines pro-inflammatoire dans l'EBS, notamment CXCL10 et CXCL11. Enfin, l'ensemble de ces résultats font de ce modèle un outil pertinent pour permettre une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires associés à la pathologie, notamment la composante inflammatoire, ce qui ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiquesEpidermolysis bullosa simplex (EBS) is a skin disorder caused mainly by dominant mutations in genes coding for keratin 5 (KRT5) or 14 (KRT14) genes. It is characterized by the presence of blisters caused by epidermal detachment, and by other complications such as cutaneous inflammation. From a genetic point of view, the mutations will alter the assembly of the keratin intermediate filament network in basal keratinocytes of the epidermis, leading to cell cytolysis and the formation of intra-epidermal blisters. Currently no effective therapeutic approach it is available. Understanding of the disease and the development of therapies have been hampered by the lack and limitations of relevant human cell and mouse models.So, the general aim of my thesis was to exploit the properties of human induced pluripotent stem cells (hiPSc) to modelling EBS. For this purpose, we generate hiPSc-derived keratinocytes from EBS patients carrying KRT5 mutations (Ker-EBS), and from healthy patients (Ker-WT). Comparison of Ker-EBS and Ker-WT enabled to show that Ker-EBS recapitulates the main phenotypes associated with EBS, namely decreased cell proliferation, increased cell migration, altered signalling pathways (ERK and JNK), as well as aggregates of intermediate keratin filaments in the cytoplasm, as observed in primary EBS keratinocytes. These results demonstrate that our hiPSc-derived cell model is relevant for study EBS.In order to identify new molecular mechanisms, a trancriptomic analysis comparing Ker-EBS with Ker-WT revealed 138 deregulated genes, revealing an enrichment in processes linked to the extracellular matrix, DNA packaging and the inflammatory response. As the inflammatory component in EBS has been poorly described, my next step was to study the pro-inflammatory cytokine phenotype. Thus, we were able to demonstrate increased expression of IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 (CXCL8), CXCL5, CXCL10, CXCL11, CCL5 in Ker-EBS, at RNA level under basal or IFNy-stimulated conditions to mimic a pro-inflammatory context. Only the chemokines CXCL10 and CXCL11 are secreted at high concentrations in the culture supernatants of stimulated and unstimulated Ker-EBS, demonstrating the involvement of these cytokines in EBS.In parallel, in order to avoid biases due to genetic background, gender, patient age and epigenetics, we generated an isogenic Ker-EBS line (corrected Ker-EBS) using the CRISPR-Cas9 technique. We were thus able to demonstrate that the corrected Ker-EBS line showed a restoration of the expression level of the pro-inflammatory cytokines mentioned above, to a level close to that of Ker-WT, confirming a direct link between mutations in the KRT5 gene and the pro-inflammatory signature.In conclusion, our new cellular model enabled us to reproduce the pathological phenotypes known in the literature, and to demonstrate deregulation of pro-inflammatory cytokine expression in EBS, notably CXCL10 and CXCL11. Taken together, these results make this model a relevant tool to allow a better understanding of the molecular mechanisms associated with the pathology, particularly the inflammatory component, paving the way for new therapeutic approaches
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Lemonnier, Thomas. "Modélisation de maladies neurodégénératives à l’aide de cellules souches pluripotentes induites humaines." Thesis, Paris 5, 2012. http://www.theses.fr/2012PA05T074/document.
Анотація:
La technologie de reprogrammation de cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites (iPS) offre aujourd’hui l’opportunité de modéliser des maladies neurodégénératives et d’étudier des neurones de patients. Nous avons utilisé cette technologie pour générer deux modèles de maladies neurodégénératives : la mucopolysaccharidose de type IIIB (MPSIIIB) et la forme ALS2 de la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Dans le modèle MPSIIIB, nous avons montré que les iPS et les neurones de patients présentaient des défauts caractéristiques de la pathologie telle que l’accumulation de vésicules de surcharge. Des altérations de l’appareil de Golgi dans ces cellules ont également été mises en évidence. Une analyse du transcriptome de précurseurs neuraux MPSIIIB a montré des modifications transcriptionnelles touchant notamment des gènes impliqués dans les interactions de la cellule avec la matrice extracellulaire. Ainsi, dans une seconde étude, des altérations de la migration et de l’orientation de cellules de souris mutantes MPSIIIB ou de patients ont été démontrées. Ces altérations pourraient être responsables des perturbations de la neurogénèse et de la neuritogénèse chez les enfants malades. Dans le modèle SLA/ALS2, nous avons montré que les neurones de patients présentaient des défauts incluant une diminution de la surface des endosomes et des anomalies de la croissance neuritique. Alors qu’il n’existait jusqu’alors aucun modèle cellulaire pertinent reproduisant cette maladie, ce modèle permettra à présent d’étudier les processus physiopathologiques impliqués dans la maladie. En conclusion, la génération de cellules iPS permet de modéliser des maladies neurodégénératives et d’étudier les processus physiopathologiques qui sont associés sur des neurones humains en culture. Ces modèles cellulaires pourraient permettre dans un avenir proche de réaliser des criblages de molécules à visée thérapeutiqueReprogramming technology of somatic cells in induced pluripotent stem cells (iPS) now offers the opportunity to model neurodegenerative diseases and to study patient’s neurons. We used this technology for generating two models of neurodegenerative diseases: the muccopolysaccharidosis type IIIB (MPSIIIB) and the ALS2 form of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). In the MPSIIIB model, we have shown that iPS and neurons of patients had characteristic defects of the disease such as the accumulation of storage vesicles. Alterations of the Golgi apparatus in these cells were also highlighted. Transcriptome analysis of MPSIIIB neural precursors showed transcriptional changes involving particularly genes implicated in cell-extracellular matrix interactions. Thus, in a subsequent study, alterations of migration and orientation of MPSIIIB mutant mouse cells and MPSIIIB patients’ cells have been demonstrated. These alterations may be responsible for the disruption of neurogenesis and neuritogenesis in sick children. In the ALS2 model, we have shown that patients’ neurons had defects including decreased endosomes’ surface and abnormal neurite outgrowth. As there was previously no relevant cellular model reproducing the disease, this model will now allow the study of physiopathological processes involved in the disease. In conclusion, the generation of iPS cells allows to model neurodegenerative diseases and to study associated physiopathological processes on cultured human neurons. These cell models could allow in the near future the screening of molecules of potential therapeutical interest
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Lemonnier, Thomas. "Modélisation de maladies neurodégénératives à l'aide de cellules souches pluripotentes induites humaines." Phd thesis, Université René Descartes - Paris V, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00806699.
Анотація:
La technologie de reprogrammation de cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites (iPS) offre aujourd'hui l'opportunité de modéliser des maladies neurodégénératives et d'étudier des neurones de patients. Nous avons utilisé cette technologie pour générer deux modèles de maladies neurodégénératives : la mucopolysaccharidose de type IIIB (MPSIIIB) et la forme ALS2 de la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Dans le modèle MPSIIIB, nous avons montré que les iPS et les neurones de patients présentaient des défauts caractéristiques de la pathologie telle que l'accumulation de vésicules de surcharge. Des altérations de l'appareil de Golgi dans ces cellules ont également été mises en évidence. Une analyse du transcriptome de précurseurs neuraux MPSIIIB a montré des modifications transcriptionnelles touchant notamment des gènes impliqués dans les interactions de la cellule avec la matrice extracellulaire. Ainsi, dans une seconde étude, des altérations de la migration et de l'orientation de cellules de souris mutantes MPSIIIB ou de patients ont été démontrées. Ces altérations pourraient être responsables des perturbations de la neurogénèse et de la neuritogénèse chez les enfants malades. Dans le modèle SLA/ALS2, nous avons montré que les neurones de patients présentaient des défauts incluant une diminution de la surface des endosomes et des anomalies de la croissance neuritique. Alors qu'il n'existait jusqu'alors aucun modèle cellulaire pertinent reproduisant cette maladie, ce modèle permettra à présent d'étudier les processus physiopathologiques impliqués dans la maladie. En conclusion, la génération de cellules iPS permet de modéliser des maladies neurodégénératives et d'étudier les processus physiopathologiques qui sont associés sur des neurones humains en culture. Ces modèles cellulaires pourraient permettre dans un avenir proche de réaliser des criblages de molécules à visée thérapeutique
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Lay, Russo Nadège. "Différenciation des cellules souches embryonnaires murines et des cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules dendritiques : cellules d'intérêt pour les tests de toxicologie." Nice, 2012. http://www.theses.fr/2012NICE4077.
Анотація:
Le septième amendement à la directive cosmétique européenne impose un abandon des tests sur les animaux pour mesurer l’effet allergène ou irritant de certains composés utilisés en cosmétique. La réponse aux allergènes dans le modèle animal regroupe cinq aspects différents, mais dans les tests in vitro chaque aspect est étudié séparément. Parmi les tests de toxicité qui sont envisagés in vitre, les cellules dendritiques (cellules présentatrices de l’antigène) apparaissent come les cellules de choix pour étudier un de ces aspects. Cependant aujourd’hui il est difficile d’obtenir une source fiable et robuste de cellules dendritiques permettant de mettre au point un test réglementaire. Le but de mon projet de thèse a été de proposer un modèle alternatif à ces tests sur les animaux. Pour cela nous avons mis en place les conditions permettant de générer des cellules dendritiques à partir de cellules souches. Pour cela nous disposons de deux sources de cellules souches : les cellules souches embryonnaires murines (mES) et les cellules humaines pluripotentes induites (cellules hiPS). Les hiPS sont des cellules reprogrammées en cellules ayant toutes les caractéristiques des cellules embryonnaires sans que celles-ci ne posent de problèmes éthiques. Ces deux types de cellules souches devaient permettre de disposer d’une source inépuisable et abondante de cellules dendritiques, cellules de choix pour les tests de toxicité in vitro. Nous avons mis au point un protocole permettant de générer et purifier une population de cellules dendritiques à partir de cellules souches embryonnaires de souris. Ces cellules ont été caractérisées par l’expression de marqueurs tels que CD45, CD209, CD86, MHC II, CD14, CD205, CD11c, et par l’étude de marqueurs de surface tels que CD45, CD86. Enfin, nous avons réalisé des tests fonctionnels comme des expériences d’endocytose du dextran-FITC et de réponse de cette population cellulaire à des modèles allergènes de références telles que MCI/MI ou le TNBS. Nous avons ensuite essayé de générer des cellules « dendritiques-like » à partir de cellules iPS humaines en nous basant sur l’expression de marqueurs tels que CD45, CD34, CD1a, CD1c, CD14, CD209, CD207, CD86 et HLA-DR. Plusieurs protocoles ont été envisagés. Toutefois, les cellules « dendritiques-like » obtenues représentent un faible pourcentage des cellules différenciées et le protocole est en cours d’optimisation. De plus en plus de tests utilisent les kératinocytes pour évaluer un autre aspect de la réponse aux allergènes. Nous nous sommes donc intéressés aussi à ces cellules et nous présenterons les premières étapes de différenciation des hiPS qui devraient permettre de générer les kératinocytesThe seventh amendment in the European cosmetic directive imposes an abandonment of the tests on animals to measure the allergenic or irritant effects of some compounds used in cosmetic. The allergenic response in animals ‘models includes five aspects but in the in vitro test each aspect is studied separately. Among the in vitro tests of toxicity which are envisaged, dendritic cells, which are antigen presenting cells, were revealed as cells of choice for study one of these aspects. However today it is difficult to obtain a reliable and strong source of dendritic cells allowing working out a reglementary test. The aim of my thesis project was to propose an alternative model in these tests on animals. For it we set up the conditions allowing generating dendritic cells derived of stern cells. For it we have two sources of stem cells (hiPS) which having all the characteristics of the embryonic stem cells without raise ethical problems. These two types of cells allowed having an inexhaustible and plentiful source of dendritic cells. We set up one protocol allowing generating and purifying a population of dendritic cells from mouse embryonic stem cells. Cells were characterized by gene expression like CD45, CD86. Furthermore we realized as functional test that consists to measure the dextran-FICT endocytosis and the answer of this cellular population to allergenic reference molecules such as MCI/MI or TNBS. We also tried to generate “dendritic-like” cells from human iPS based to expression of specifics markers as CD45, CD34, CD1a, CD14, CD209, CD207, CD86 and HLA-DR. Several protocols were envisaged. However dendritic-like cells obtained represent a low percentage of differentiated cells and the protocol is in the course of optimization. Increasingly tests use keratinocytes cells for evaluate another aspect of allergenic response. So we were interesting also to these cells and we will present first steps differentiation of hiPS that will allow generating keratinocytes
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Denis, Jérôme Alexandre. "Applications médicales et pharmaceutiques des cellules souches pluripotentes : vers un changement de paradigme ?" Phd thesis, Université René Descartes - Paris V, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00637075.
Анотація:
Les lignées de cellules souches embryonnaires humaines (hES) et maintenant de cellules souches induites à la pluripotence (hiPS) sont des cellules qui présentent deux caractéristiques uniques : elles sont d'une part capables de s'auto-renouveler de manière continue en culture ce qui permet de générer de grande quantité de cellules et d'autre part, elles présentent la capacité de se différencier en n'importe quelle cellule de l'organisme lorsqu'elles sont soumises à un environnement permissif adéquat. Ces deux propriétés permettent d'envisager de nombreuses applications médicales comme la thérapie cellulaire mais aussi des applications dans le domaine de l'industrie pharmaceutique grâce au développement de modèles cellulaires innovants. Ce mémoire de thèse a pour objectif de présenter les caractéristiques biologiques principales de ces cellules et les enjeux médicaux et pharmaceutiques qu'elles représentent pour le futur, notamment pour le pharmacien.
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Mohsen-Kanson, Tala. "Cellules souches induites à la pluripotence : modèle d'étude des étapes précoces du développement adipocytaire humain." Nice, 2012. http://www.theses.fr/2012NICE4023.
Анотація:
Si, aujourd’hui, les étapes les plus tardives de l’adipogénèse humaine ont été bien caractérisées, les étapes précoces qui correspondent à la génération des précurseurs adipocytaires blancs et bruns restent encore à définir. Les cellules souches humaines induites à la pluripotence (hiPS) constituent un bon modèle d’étude de l’adipogénèse précoce. Le but de ce travail était de générer des cellules hiPS à partir des cellules souches multipotentes du tissu adipeux (hMADS), de les caractériser et de les utiliser comme un outil d’étude de l’apparition des précurseurs adipeux blancs et bruns in vitro. Nous avons également utilisé des cellules hiPS générées à partir des cellules souches neurales humaines (hNSC) en utilisant un vecteur PiggyBac. Nous avons mis au point un protocole de différenciation des cellules iPS-hMADS et iPS-hNSC en adipocytes. C’une façon intéressante, notre protocole de différenciation permet l’apparition d’adipocytes blancs et bruns. Nous avons montré que l’activation de la voie de l’acide rétinoïque (RA) au cours des étapes précoces de différenciation augmente fortement la génération d’adipocytes blancs, et diminue celle des adipocytes bruns. En revanche, l’utilisation du SB431542, un inhibiteur sélectif de la voie TGFβ/Activine, induit une augmentation de la génération es adipocytes blancs et une inhibition de l’apparition des adipocytes bruns. L’ensemble de nos résultats soutient un modèle dans lequel les progéniteurs adipeux blancs et bruns apparaissent précocement au cours du développement embryonnaire humain. Dans ce processus, la voie de l’acide rétinoïque et la voie du TGFβ/Activine régulent la génération des Pas blancs et brunsThe terminal steps of adipocyte differentiation are well established ; however the earliest steps controlling brown and white adipogenic lineage specification remain unknown in humans. We have investigated the human induced Pluripotent Stem cells (hips) as a model to study the early steps of brown and white adipogenesis. We will present the generation of hips cells from human multipotent adipose derived stem cells (hMADS). We have also used iPS cells reprogrammed from human neural stem cells generated using the PiggyBac technology. We provide an efficient protocol to differentiate iPS-hMADS and iPS-hNSC cells into adipocytes. Interestingly, our data show that hips cells are able to differentiate both into white and brown adipocytes. We show that Retinoic Acid (RA) pathway activation at an early phase of hips development dramatically enhanced generation of white adipocytes and inhibited generation of Brown adipocytes. In contrast, the use of SB431542, a selective inhibitor of TGFβ/Activin pathway, indicated that this pathway was required for the generation of brown adipocytes. Altogether, these data support a model in which brown and white adipocytes progenitors diverge early during human embryonic development. RA and TGFβ/Activin pathways regulate the generation of white APs and brown APs respectively
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Merien, Antoine. "Étude de la fonction des protéines MBNL au cours du développement à l’aide de cellules souches humaines induites à la pluripotence." Thesis, université Paris-Saclay, 2021. https://www.biblio.univ-evry.fr/theses/2021/interne/2021UPASQ015.pdf.
Анотація:
L'épissage alternatif est apparu comme un mécanisme fondamental non seulement pour la diversification des isoformes des protéines mais aussi pour la régulation spatio-temporelle du développement. Par conséquent, une meilleure compréhension de la manière dont ce mécanisme est régulé permettrait non seulement d'élucider les principes biologiques fondamentaux, mais aussi de déchiffrer les mécanismes pathologiques impliqués dans les maladies dans lesquelles ces processus moléculaires sont dérégulés. Dans le cadre de cette thèse, nous avons utilisé des cellules souches pluripotentes humaines pour déchiffrer, au cours de la myogenèse humaine, le rôle des protéines MBNL, une famille de régulateurs d'épissage spécifiques aux tissus dont la perte de fonction est associée à la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), une maladie neuromusculaire héréditaire. Grâce à la technologie CRISPR/Cas9, nous avons généré des cellules souches pluripotentes d'origine humaine (hiPSC) déplétées en protéines MBNL et évalué les conséquences moléculaires et fonctionnelles de cette perte sur la génération de cellules musculaires squelettiques. Nos résultats ont indiqué que les protéines MBNL sont spécifiquement requises pour la maturation myogénique tardive mais pas pour l'engagement myogénique précoce. Par une analyse transcriptomique, nous avons pu mettre en évidence les voies moléculaires régulées par ces protéines durant la myogenèse, ainsi que les phénomènes de compensation entre les paralogues MBNL. Cette étude nous a également permis d’identifier un nouveau défaut d’épissage alternatif dans la DM1, régulé par les protéines MBNL, et qui aboutit à des anomalies structurelles du compartiment post-synaptique musculaire. Ensemble, nos résultats révèlent à la fois la temporalité de l’action des protéines MBNL dans la myogenèse humaine et permettent également d’identifier de nouvelles voies moléculaires régulées par ces protéines et pouvant être impliquées dans le développement de la DM1. A plus long terme, les outils développés dans cette étude devraient également faciliter l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques capables de faire face à la perte de fonction de ces protéinesAlternative splicing has emerged as a fundamental mechanism not only for the diversification of protein isoforms but also for the spatiotemporal control of development. Therefore, a better understanding of how this mechanism is regulated has the potential not only to elucidate fundamental biological principles, but also to decipher pathological mechanisms involved in diseases where normal splicing networks are mis-regulated. As part of this thesis, we took advantage of human pluripotent stem cells to decipher during human myogenesis the role of MBNL proteins, a family of tissue-specific splicing regulators whose loss of function is associated with Myotonic Dystrophy type 1 (DM1), an inherited neuromuscular disease. Thanks to the CRISPR/Cas9 technology, we generated human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) depleted in MBNL proteins and evaluated the molecular and functional consequences of this loss on the generation of skeletal muscle cells. Our results indicated that MBNL proteins are specifically required for the late myogenic maturation but not for early myogenic commitment. By a transcriptomic analysis, we were able to highlight the molecular pathways regulated by these proteins during myogenesis, as well as the compensatory effects between MBNL paralogs. This study also allowed us to identify a new alternative splicing defect in DM1, regulated by MBNL proteins, which leads to structural abnormalities of the muscular post-synaptic compartment. Together, our results reveal the temporal requirement of MBNL proteins in human myogenesis and allow the identification of new molecular pathways regulated by these proteins that could be involved in the development of DM1. In the longer term, the tools developed in this study should also facilitate the identification of new therapeutic strategies capable to cope with the loss of function of these proteins
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Abed, Soumeya. "Développement et évaluation du potentiel hématopoïétique de cellules souches induites à la pluripotence chez le primate humain et non humain." Paris 7, 2014. http://www.theses.fr/2014PA077112.
Анотація:
Les cellules souches induites à la pluripotence (iPSC) sont un modèle cellulaire prometteur pour la recherche fondamentale et appliquée. Cependant, avant d'envisager des applications cliniques, le potentiel et l'innocuité des cellules hématopoïétiques dérivées d'iPSC doivent être testés dans un modèle animal proche de l'Homme. Nous avons généré des iPSC de macaques cynomolgus (Cy-iPSC) et optimisé leur différenciation hématopoïétique, par formation d'EB et co-culture sur des cellules stromales, dans le but d'avaluer leur potentiel après transplantation autologue. Nous avons démontré l'emergence de progeniteurs hématopoïétiques CD34+/CD45+ in vitro ainsi qu'un potentiel clonogénique. Cependant, la reconstitution des compartiments hématopoïétiques à partir de cellules dérivées des Cy-iPSC dans des souris immunodéficientes reste un challenge. Dans la 2ème étude, nous avons utilisé les iPSC comme modèle d'étude de la thérapie génique de la beta-thalassémie. Nous avons généré des iPSC à partir des cellules somatiques d'un patient beta thalassémique (thal-iPSC) et les avons transduites avec un vecteur lentiviral portant le gène de globine thérapeutique. Nous avons démontré la capacité des thal-iPSC à se différencier en cellules hématopoïétiques in vitro et in vivo après transplantation dans des souris immunodéficentes ainsi qu'un switch des globines endogènes. L'intégration du vecteur lentiviral a été retrouvée dans des régions à faible et forte génotoxicité et des sites d'intégration communs entre les thal-iPSC et les cellules isogéniques et non isogéniques de patients traités par thérapie génique ont été identifiés ; suggérant une intégration non stochastique du vecteurInduced pluripotent stem cells (iPSC) technology is a cellular model full of challenge for fundamental research and important for cellular and gene therapy applications. Before clinical application, capacity and safety of iPSC-hematopoietic derivates must be scrupulously tested in animal model close enough to humans. VVe generated Cynomolgus iPSC and carried out a kinetic analysis of hematopoietic ceil development during EB and co-culture differentiation in order to explore their capacity to engraft efficientely after autologus transplantation. We demonstrated improved hematopoietic differentiation, as evidenced by significant levels of CD34+CD45+ progenitors and CFU activity. However, achieving hematopoietic engraftment in immunodeficient mice using Cy-iPS-derived hematopoietic cells remain challenging. In the second study, we combined the iPS cells properties and the therapeutic potency of gene transfert for beta-thalassemia/HBE treatment. We have generated iPSC from the beta thalassemia/HBE patient's somatic cells and corrected them with a lentiviral vector (LV) carrying beta-globin therapeutic gene. We demonstrate their production of hematopoietic cells, in vitro, showing high expression of the transferred globin gene, differentiation into multiple blood cell types in immunocompromises mice, and endogenous globin switching in vivo. LV integration occured in regions of low and high genotoxicity and common integration sites (CIS) were identified across thal-iPSC and cells retrieved from isogenic and non isogenic gene therapy patients; suggesting that CIS observed in absence of tumorigenesis result from nonrandom LV integration rather than oncogenic in vivo selection
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Annab, Karima. "Etude de l’expression génique de différents syndromes progéroïdes en utilisant le modèle des cellules souches à pluripotence induite." Thesis, Aix-Marseille, 2019. http://www.theses.fr/2019AIXM0101.
Анотація:
Les syndromes progéroïdes regroupent un ensemble de pathologies caractérisées par un vieillissement précoce et accéléré. Le syndrome le plus connu et étudié est la progéria de Hutchinson-Gilford dont l'incidence est de 1 cas sur 8 millions ce qui en fait une maladie très rare. Nous avons étudié trois symptômes progéroïdes dont le syndrome HGPS, un syndrome HGPS-like ainsi qu'un syndrome APS. Ces pathologies ont de nombreux symptômes en commun dont une ostéolyse, une lipodystrophie, ainsi qu'une atteinte cardiovasculaire. Ces trois syndromes sont provoqués par différentes mutations du gène LMNA qui code pour les Lamines A et C. Nous avons utilisé le modèle des iPSCs afin d'étudier in vitro la physiopathologie de ces trois syndromes en les comparant à des cellules contrôles. Les cellules dérivées de la voie mésenchymateuse étant majoritairement altérées dans ces pathologies, nous avons créé des modèles in vitro d'étude de la différentiation en MSCs. De plus, ces patients présentant des altérations arterio-veineuses, nous avons analysé la différenciation en VSMCs. Le phénotype des ces cellules a été analysé et les profils transcriptomiques comparés pour les différentes lignées. Des gènes communs, impliqués dans le stress oxydatif et dans des systèmes de réparation géniques ont été retrouvés comme étant altérés. De plus, nous avons mis en évidence des altérations de voies de signalisation indispensables à la survie et à la prolifération cellulaire en comparant les cellules progéroïdes aux contrôles. Certaines de ces voies biologiques ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension des symptômes observés chez ces patientsProgeroid syndromes are a group of pathologies characterized by accelerated and early aging. One of the most studied of these diseases is HGPS, with an estimated incidence of 1 in 8 millions birth making it an extremely rare disease. We focused our attention on three different progeroid syndromes including classic HGPS, a HGPS-like and an atypical progeroid syndrome. These pathologies share many symptoms, including osteolysis, lipodystrophy, and cardiovascular alterations. These 3 syndromes are caused by 3 different mutations in the LMNA gene that encodes A- and C-type lamins, inducing production of a truncated Lamin A in HGPS and HGPS-like and production of a mutated Lamin with a p.T528M substitution in APS. We produced hiPSCs to create a model of these different diseases and investigate in vitro the physiopathology of these syndromes by comparing them to control cells. Cells derived from mesenchymal stem cells being the most impaired type of tissue, we established in vitro models in order to study the differentiation of hiPSCs into MSCs. In addition given the massive cardiovascular defects in these patients, we also investigated differentiation toward the VSMCs. Cell phenotypes were carefully characterized and we compared the transcripttomic profile of the different cell types. We identified dysregulation in genes involved in oxidative stress response and in DNA repair in progeroid cells. In addition, pathways essential for cell survival and proliferation are also modified when comparing progeroid and controls cells. Altogether, these results might explain some of the symptoms observed in progeroid patients but also reveal pathways involved in ageing
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Hiriart, Emilye. "Modélisation cellulaire des étapes précoces de la valvulogenèse à partir d'un modèle de cellules souches embryonnaires humaines, et étude de l'implication d'Oct4 dans le phénomène de transition endothélio-mésenchymateuse lors de la formation des coussins endocardiques." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLE011.
Анотація:
Les cardiopathies représentent la première cause de mortalité dans le monde, près de 30% des décès chaque année sont imputables à ce type de pathologies ; cette incidence a par ailleurs fortement augmentée au cours du siècle dernier (OMS). Les cardiopathies peuvent être classées en plusieurs sous-groupes de maladies cardio-vasculaires en fonction du tissu affecté par la pathologie. On différencie ainsi les maladies affectant les vaisseaux, le muscle cardiaque, le rythme (tissu pacemaker et de conduction) et les maladies des valves cardiaques. Les valvulopathies cardiaques peuvent être causées par des défauts des valves acquis ou innés et représentent près de 30 à 40% des malformations cardiaques recensées. Le pourcentage de patients atteints de valvulopathies augmente avec l’âge du patient, de plus, les valvulopathies représentent la principale cause de morbidité chez l’adulte, et l’enfant dans les pays développés.Ces défauts peuvent être d’origines génétiques, congénitales, toxicologique, ischémiques avec influence de différents facteurs de risques aussi bien génétiques qu’environnementaux, dans certains cas elles peuvent même être provoquées par des médicaments, le cas du Benfluorex (Mediator®) étant probablement le plus connu. Les défauts affectant les valves peuvent avoir de graves conséquences sur le fonctionnement du cœur. Ainsi, en 2008, aux États-Unis, il a été nécessaire de procéder au remplacement de près de 82000 valves cardiaques chez des patients adultes. Si le remplacement de valves cardiaques reste une avancée majeure pour les patients atteints de valvulopathies, l’utilisation de prothèses et de transplants valvulaires présentent néanmoins des limitations, notamment : une absence de croissance des prothèses, l’apparition de thromboses, ainsi que des rejets en cas de transplantation de valves allo-géniques, prélevées sur des donneurs en morts cérébrale. Ainsi, il est nécessaire d’étudier les mécanismes mis en jeu dès le développement embryonnaire, mécanismes qui pourrait avoir un effet délétère à plus ou moins long terme entrainant l’apparition d’une valvulopathie chez l’enfant, le jeune adulte ou chez la personne âgée. Pour cela l’utilisation d’un modèle cellulaire utilisable in vitro serait une avancée remarquable. Ce modèle permettrait à la fois d’élucider un certain nombre de mécanismes biologiques mis en place au cours du développement ou de la pathologie, mais aussi d’espérer la mise en place d’un protocole permettant l’utilisation clinique de cellules autologues reprogrammées pour la thérapie des tissus atteints de valvulopathies voire même une thérapie incluant une réparation endogèneHeart disease is the leading cause of death worldwide, nearly 30% of deaths each year are attributable to such diseases; this incidence has also greatly increased in the last century (WHO).Heart disease can be classified into several subgroups of cardiovascular disease based on the tissue affected by the pathology. It thus differs diseases affecting vessels, cardiac muscle, rhythm (fabric pacemaker and conduction) and heart valve disease. Heart valve disease can be caused by defects of innate and acquired or valves represent about 30-40% of heart defects identified. The percentage of patients with valvular heart disease patients increases with age of the patient, in addition, valvular heart disease is the leading cause of morbidity in adults and children in developed countries.These defects may be of genetic origin, congenital, toxicological, with ischemic influence of various risk factors both genetic and environmental, in some cases they can even be caused by medications, if the Benfluorex (Mediator®) are probably the most known. The defects in the valves can have serious consequences on the functioning of the heart. In 2008, the United States, it was necessary to proceed with the replacement of nearly 82,000 heart valves in adult patients.If the replacement heart valves remains a major advance for patients with valvular heart disease, the use of prostheses and transplants valves nevertheless have limitations, including: no growth prostheses, the occurrence of thrombosis and releases in cases of allo-transplantation of gene valves taken from brain dead donors. Thus, it is necessary to study the mechanisms involved early embryonic development, mechanisms that could have a deleterious effect more or less long term leading the development of valvular disease in children or young adults in the old person. For this the use of an in vitro cell model used is a remarkable achievement. This model would both elucidate a number of biological mechanisms during development or pathology, but also hope the development of a protocol for the clinical use of autologous cells reprogrammed to the therapy of patients with valvular tissue or even a therapy including an endogenous repair
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Ahmed, Engi. "Modélisation de l'épithélium bronchique par les cellules souches pluripotentes induites humaines dans la Bronchopathie Pulmonaire Chronique Obstructive (BPCO)." Thesis, Montpellier, 2018. http://www.theses.fr/2018MONTT070.
Анотація:
La BPCO (bronchopathie pulmonaire chronique obstructive) est un problème majeur de santé publique et représentera la 3ème cause de mortalité dans le monde en 2030. L’âge, le tabagisme, ainsi que la pollution atmosphérique via l’exposition aux particules de diesel mais également la pollution domestique – majoritairement représentée par la combustion domestique de biomasse – sont des facteurs de risque bien identifiés d’apparition d’une BPCO. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pouvant interférer avec l’histoire naturelle de la maladie.Les cellules souches pluripotentes, et notamment les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs), sont définies par deux propriétés fondamentales : l’auto-renouvellement et la capacité à se différencier en tous les types cellulaires de notre corps. Elles offrent une opportunité sans précédent de modéliser le développement humain normal et pathologique de l’appareil respiratoire.Ce projet de recherche a pour objectif de modéliser in vitro les trajectoires de la BPCO, en lien avec une origine développementale (racines pédiatriques) et/ou une susceptibilité au tabac. Afin d’élucider les mécanismes qui sous-tendent la pathogénie de la BPCO et de la susceptibilité au tabac, nous avons constitué deux groupes caricaturaux : i) 4 patients atteints d’une forme sévère de la BPCO, constituant le groupe « hautement susceptibles », ii) 4 patients fumeurs indemnes de BPCO ou tout autre comorbidité liée au tabac « hautement résistants » au tabac.Nous avons utilisés deux modèles de culture cellulaires in vitro : les hiPSCs et la culture de cellules épithéliales primaires bronchiques humaines (HBECs) cultivées en ALI (interface air liquide).Dans un premier temps, nous avons généré des lignées hiPSCs par reprogrammation cellulaire à partir du sang périphérique d’un sujet sain (contrôle), et de trois patients BPCO sévères hautement caractérisés. Dans un second temps, la différenciation dirigée des hiPSCs a permis de récapituler le développement pulmonaire précoce (génération de progéniteurs bronchiques NKX2.1) par la mise au point d’un protocole de différenciation dirigée robuste et reproductible sur plusieurs lignées hiPSCs. La maturation de ces progéniteurs bronchiques en culture 2D ou 3D a permis d’obtenir des structures épithéliales exprimant les marqueurs de cellules basales (KRT5), de cellules Club (CCSP), et ciliées (FOXJ1). Dans un second temps, ces épithélia seront exposés au tabac (CSE- cigarette smoke extract) afin d’induire un phénotype « BPCO-like ». Enfin, la culture des HBECs cultivées en ALI des patients BPCO sévères a été réalisée en condition exposée (CSE) et non exposée. La résistance transépithéliale, la motilité ciliaire, le profil sécrétoire et la diversité ARN ont été collecté.Ce travail a permis de mettre en place les outils nécessaires pour reproduire les trajectoires in vitro de la BPCO et élucider les origines de la pathologie. Les outils de séquençage à haut débit (transcriptomique dans notre étude), permettront de découvrir de nouveaux candidats, représentants de potentielles cibles en vue d’un criblage pharmacologiqueCOPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) is a major public health problem and will be the 3rd leading cause of death in the world in 2030. Age, smoking, and air pollution through the exposure to particulate matter but also domestic pollution - mostly represented by domestic biomass combustion - are well-identified risk factors for the development of COPD. To date, there is no cure that can interfere with the natural history of the disease.Pluripotent stem cells, including induced pluripotent human stem cells (hiPSCs), are defined by two fundamental properties: self-renewal and the ability to differentiate into all cell types in our body. They offer an unprecedented opportunity to model the normal and pathological human development of the respiratory system.This research project aimed to model in vitro the trajectories of COPD, related to a developmental origin (pediatric roots) and / or susceptibility to tobacco. In order to elucidate the underlying mechanisms of COPD and tobacco susceptibility, we established two extreme groups: i) 4 patients with a severe form of COPD, the "highly susceptible" group, ii) 4 patients who are free of COPD or other tobacco-related comorbidity despite heavy smoking, called as "highly resistant" to tobacco.We have used two different but complementary in vitro cell culture models: hiPSCs and human bronchial primary epithelial cell cultures (HBECs) grown in ALI condition (Air Liquid Interface).First of all, we generate hiPSCs cell lines by reprogramming cells from peripheral blood of a healthy subject (control), and three highly characterized severe COPD patients. In a second step, the directed differentiation of hiPSCs allowed to recapitulate the early pulmonary development (NKX2.1 generation of bronchial progenitors) by the development of a robust and reproducible directed differentiation protocol of several hiPSCs lines. The maturation of these bronchial progenitors in 2D or 3D culture allows the generation of epithelial structures expressing markers of KRT5 + basal cells , CSSP + Club cells and FOXJ1 + ciliated cells. In a second step, these epithelia will be exposed to tobacco (CSE-cigarette smoke extract) in order to induce a "COPD-like" phenotype. Finally, ALI culture of HBECs of severe COPD patients was performed in unexposed and exposed condition (CSE). Transepithelial resistance, ciliary motility, secretory profile, and RNA diversity were collected.This work allowed to put in place the necessary tools to reproduce the in vitro trajectories of COPD and to clarify the origins of this pathology. The high throughput sequencing tools (transcriptomic in our study), will allow the discovery of new candidates, that represent potential targets for future pharmacological screening
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Terray, Angélique. "Développement de modèles in vitro de rétinites pigmentaires à partir de cellules souches pluripotentes humaines." Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066614/document.
Анотація:
Les rétinites pigmentaires (RP) sont des pathologies rétiniennes cécitantes d'origine génétique caractérisées par une perte des photorécepteurs. Nous avons ciblé des formes de RP autosomique dominante consécutives à des mutations dans le gène du pigment visuel de la RHODOPSINE, du facteur d'épissage PRPF31 et du facteur de transcription impliqué dans le développement des photorécepteurs NR2E3. Les fibroblastes, issus de biopsies de peau de patients, ont été reprogrammés en cellules iPS par une technique dite non intégrative. Après stabilisation des cellules iPS, nous avons vérifié leur propriété de pluripotence et l'absence d'anomalies caryotypiques.Les cellules iPS porteuses d'une mutation sur le gène RHODOPSINE ont été différenciées dans le lignage des photorécepteurs. Nos résultats montrent que les photorécepteurs porteurs de la mutation P347L du le gène RHODOPSINE récapitulent la dégénérescence observée chez les patients.Nous montrons que les cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de cellules iPS porteuses de la mutation Cys294X du gène PRPF31 présentent des problèmes d'adhésion cellulaire due à l'absence de lame basale. Leur activité de phagocytose est alors perturbée, suggérant qu'un dysfonctionnement de l'EPR pourrait être à la base de la RP causée par la mutation Cys294X du gène PRPF31. Les modèles développés nous ont permis de mieux comprendre les processus à la base de la pathogénèse de certaines RP. Ces modèles associés à des protocoles de criblage, pourraient permettre d'évaluer l'efficacité et la toxicité de nouvelles molécules pharmacologiques, mais également être utilisés pour valider des approches de thérapie géniqueRetinitis pigmentosa (RP) is an inherited retinal diseases characterized by a loss of photoreceptors. We focused specific forms of autosomal dominant RP with mutations in the rod visual pigment RHODOPSIN, the ubiquitous splicing factor PRPF31 and the transcription factor involved in the development of photoreceptors NR2E3. Fibroblasts from skin biopsies of patients were reprogrammed into iPS cells by a non-integrative approach. After stabilization of iPS cell lines, we verified their pluripotency property and the absence of karyotype abnormalities. Based on the retinal differentiation protocol, iPS cells carrying a mutation in the RHODOPSIN gene have been differentiated in the photoreceptor lineage. Our results showed that the photoreceptors expressing the mutated form of RHODOPSIN summarizing the process of degeneration observed in RP patients. We show that retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from iPS cells carrying a mutation in the PRPF31 gene lack basal membranes and have cell adhesion disorders. Consequently, their phagocytic activity is disturbed, suggesting that a malfunction of the RPE could be the primary step of the development of RP caused by mutation Cys294X in the PRPF31 gene. The models developed from specific-patient iPS cells have enabled us to better understand the processes underlying the pathogenesis of some RP. These models associated with screening protocols could be used to evaluate the efficacy and toxicity of new pharmacologic compounds but also used to validate new gene therapy approaches
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Rabesandratana, Oriane. "Les cellules ganglionnaires rétiniennes dérivées de cellules souches pluripotentes humaines : de la caractérisation à la transplantation." Thesis, Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS322.
Анотація:
Parmi les stratégies en développement de nouveaux traitements pour les neuropathies optiques, la thérapie cellulaire par transplantation de cellules ganglionnaires rétiniennes (CGRs) dérivées de cellules pluripotentes humaines est l’un des axes de recherche les plus prometteurs. Au cours de la réalisation du projet présenté dans ce document, nous avons validé la production optimisée de CGRs, à partir de quatre lignées de cellules souches pluripotentes induites (iPS) humaines, par une double sélection selon les conditions de culture in vitro et un protocole de tri magnétique basé sur l’expression de l’antigène de surface CD90/THY1. Nous avons caractérisé les CGRs enrichies par ce double protocole de sélection selon leurs propriétés morphologiques, moléculaires et fonctionnelles. Ces résultats furent validés pour un total de quatre lignées cellulaires iPS, dont une lignée rapportrice fluorescente ubiquitaire, générée par stratégie Crispr-Cas9. La transplantation par injection intravitréenne des CGRs dérivées de cette lignée rapportrice, sur un modèle murin ayant subi un écrasement du nerf optique, a permis d’observer une intégration partielle des cellules survivantes dans la rétine hôte permettant d’établir la preuve de concept quant à la possibilité de réaliser ce type de transplantation. Ce travail devra être poursuivi afin d’étudier la capacité de ces cellules à établir des contacts fonctionnels avec les partenaires rétiniens et cérébrauxAmong the different treatments for optic neuropathies, cell therapy using transplantation of retinal ganglion cells (RGCs) derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC) is one of the most promising strategy. In this project, we validated the optimized production of RGCs from retinal organoids derived from four different hiPSC lines. Our methodology included a double selection process, comprising the culture of retinal dissociated cell in adherent conditions and a magnetic sorting protocol, based on the expression of surface antigen CD90/THY1. We identified enriched RGCs resulting from this double protocol, according morphological, molecular and functional properties. These results were validated for all four hiPSC lines, including a ubiquitous fluorescent reporter cell line, using Crispr/Cas9 strategy. Intravitreal injection of reporter hiPSC line-derived RGCs into an optic nerve crush mouse model led to a partial integration of surviving cells into the host retina establishing the possibility to performed RGC transplantation. This work will be continued in order to explore the capacity of hiPSC-derived RGCs to reconnect with both retinal partners and with the different targets in the brain
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Lahlou, Hanae. "Génération de progéniteurs otiques dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) : application à la thérapie cellulaire dans l'oreille interne." Thesis, Aix-Marseille, 2017. http://www.theses.fr/2017AIXM0245/document.
Анотація:
La surdité neurosensorielle est définie par une atteinte de l’oreille interne, il résulte principalement d’une perte de cellules ciliées (CC). Chez les mammifères, ce processus est malheureusement irréversible. Le développement de la thérapie cellulaire a fait naître de nouveaux espoirs pour le traitement des surdités neurosensorielles. Les cellules souches d’origine embryonnaire ou adulte seraient capables de se différencier in vitro en progéniteurs otiques et de restaurer partiellement les fonctions auditives in vivo après transplantation. Cependant, les protocoles de différenciation in vitro des CC à partir de cellules souches sont insatisfaisants, et les signaux qui contrôlent ce phénomène restent mal connus. Ainsi, l’objectif de ce travail de thèse était d’étudier in vitro la différenciation des CC à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC). Nous nous sommes intéressés à deux voies de signalisation majeures impliquées dans le développement de l’oreille interne in vivo, la voie Notch et la voie Wnt. Dans une première partie, nous avons montré que l’inhibition tardive de la voie Notch favorise la différenciation des hiPSC en CC. Dans une seconde partie, nous avons étudié le rôle de la voie Wnt dans la différenciation des hiPSC en cellules otiques. Nos résultats indiquent que l'inhibition de la voie Wnt durant la première phase d’induction favorise l'expression des marqueurs de la placode otique et initie la spécification des CC.Les travaux présentés dans cette thèse améliorent ainsi les protocoles de différenciation des hiPSC et suggèrent que ce type de cellules serait parfaitement adapté pour traiter les surdités neurosensoriellesNeurosensory hearing loss is associated to inner ear disorders and degeneration of hair cells (HCs). Unfortunately, this process is irreversible in mammals. Currently, no curative treatment allows these cells to regenerate. For this reason, the development of cell therapy arose new hopes for the treatment of neurosensory hearing loss. Stem cells, either of embryonic or adult origin, seem able to differentiate in vitro into otic progenitors and to partially restore auditory functions in vivo. However, current protocols for in vitro differentiation of stem cells into HCs are unsatisfactory, and the signals that control this phenomenon remain poorly understood. Thus, the objective of this thesis was to study in vitro HC differentiation from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). We were particularly interested in two major signaling pathways involved in vivo in inner ear development, the Notch and Wnt signaling pathways.In a first part, we demonstrated that Notch inhibition during late otic differentiation enhances hiPSC differentiation into hair cell-like cells. In a second part, we studied the role of the Wnt signaling pathway during otic induction and HC specification. Our results indicate that Wnt inhibition during early otic induction promotes the expression of otic placode markers and initiate HC specification. The work presented here thus propose improved protocols to obtain HCs from hiPSCs, and suggest that this cell type is perfectly adapted for the treatment of neurosensory hearing loss
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Roudaut, Méryl. "Les cellules souches pluripotentes induites humaines : un modèle innovant pour la découverte d’une nouvelle fonction de PCSK9 et la mise en place d’organoïdes de foie." Thesis, Nantes, 2020. http://www.theses.fr/2020NANT1023.
Анотація:
Les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) offrent une alternative particulièrement attractive pour l ‘étude de nouvelles fonctions liées à des pathologies ainsi que la mise en place de modèles d’études innovants. C’est dans ce contexte que nous étudions un acteur clé de la régulation du métabolisme du cholestérol par les hépatocytes, PCSK9. Lors de la différenciation des hiPSC en hépatocytes, nous avons mis en évidence un rôle inattendu de PCSK9 dans les cellules indifférenciées. Grâce à l’utilisation d’outils de surexpression, d’invalidation de gène par une approche CRISPR/Cas9 ou d’hiPSC d’un patient portant des mutations pertes de fonction de PCSK9, nous avons pu mettre en évidence une action régulatrice de PCSK9 sur la voie TGFß. Cet effet serait médié par une action de PCSK9 sur la protéine DACT2, un régulateur négatif de la sous-unité R1 du récepteur au TGFßR. Les effets de PCSK9 sur DACT2 entrainent une modification de la phosphorylation de SMAD2 et subséquemment la prolifération des hiPSC. En parallèle, afin d’améliorer les fonctions hépatiques des hiPSC différenciées, nous avons mis en place une nouvelle procédure permettant d’obtenir de façon simple des organoïdes hépatiques. Pour cela les hiPSC sont mises en culture dans un hydroscaffold modifié, BIOMIMESYS®, produit par HCS Pharma dans un format 96-puits pour adapter le modèle au criblage moléculaire. Notre procédure récapitulant les étapes clés du développement hépatiques nous a permis d’obtenir des organoïdes hépatiques comprenant en plus des hépatocytes, des cellules biliaires, étoilées et endothéliales. Leur caractérisation fonctionnelle nous a permis de mettre en évidence des activités de cytochrome supérieur au modèle en 2D, ainsi qu’une excellente réponse pharmacologique suite à leur capacité à accumuler les lipides lors d'un traitement à l'amiodarone ou à l’éthanol ainsi qu’à absorber les LDL-bodipy après traitement aux statines. Notre modèle pouvant être personnalisé et automatisable, offre de nouvelles perspectives pour le criblage moléculaire à haut débitHuman induced pluripotent stem cell (hiPSC) offer an attractive alternative to study novel functions linked to diseases and to setup innovative models. In this context, we studied a key player of the hepatic cholesterol metabolism regulation, PCSK9. Upon hiPSC differentiation into hepatocyte-like cells, we found an unexpected role of PCSK9 in undifferentiated cells. Using tools such as overexpression, CRISPR/Cas9-mediated gene invalidation, and hiPSC derived from a patient carrying PCSK9 loss of functions mutations, we found a regulatory effect of PCSK9 on the TGFß pathway. This effect is mediated by DACT2, a negative regulator of the TGFßR subunit R1. Through DACT2 modulation by PCSK9, the SMAD2 phosphorylation is impacted, thus hiPSC proliferation. In parallel, to enhance hepatic cells functions generated from hiPSC, we setup a new simplified procedure to obtain liver organoïdes. hiPSC are cultured in a modified hydroscaffold, BIOMIMESYS®, produced by HCS Pharma in a 96-well format suitable for molecular screening. Our procedure, recapitulating key steps of liver development, allowed us to generate liver organoids including not only hepatocytes but also, biliary-, stellate- and endothelial-cells. Functional characterizations showed enhanced cytochrome activities compared to HLC and excellent pharmacological responses with lipid accumulation upon amiodarone or ethanol treatments and LDL-bodipy uptake upon statin treatments. As our model can be personalized and automatized, if offers a new perspective for high content molecular screening
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Dianat, Noushin. "Cellules souches pluripotentes humaines et modélisation de maladies hépatiques : l'hypercholestérolémie familiale et les cholangiopathies." Thesis, Paris 11, 2014. http://www.theses.fr/2014PA114810.
Анотація:
La thérapie cellulaire pourrait représenter une alternative à la transplantation hépatique dans certaines pathologies comme les maladies métaboliques sévères. Toutefois, la pénurie de donneurs d’organes implique la nécessité de trouver de nouvelles sources de cellules hépatiques comme les cellules souches pluripotentes qui peuvent être amplifiées extensivement et différenciées en tout type cellulaire. Les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) générées à partir des cellules somatiques de patients puis différenciées en hépatocytes représentent une source potentielle d’hépatocytes. Ces cellules permettent en outre d’envisager la transplantation d’hépatocytes autologues génétiquement modifiés comme alternative à la transplantation hépatique pour le traitement de certaines maladies génétiques du foie. L’hypercholestérolémie familiale (HF) est une maladie autosomale dominante due à des mutations dans le gène codant le Récepteur aux Low Density Lipoproteins (RLDL) qui est à l’origine d’un taux élevé de cholestérol sanguin de patients HF. Les patients homozygotes doivent épurer leur sérum par LDL-aphérèse en moyenne deux fois par mois dès le plus jeune âge pour éviter les infarctus mortels survenant dès l’enfance. Les hépatocytes différenciées à partir des iPSC de patients et leur correction in vitro, permettent d'évaluer la faisabilité de la transplantation d'hépatocytes autologues génétiquement modifiés pour le traitement de l’hypercholestérolémie familiale.Au cours du développement du foie, des hépatocytes et des cholangiocytes, les deux types de cellules épithéliales hépatiques, dérivent de progéniteurs hépatiques bipotents (les hépatoblastes). Bien que les cholangiocytes formant les canaux biliaires intrahépatiques ne représentent qu'une petite fraction de la population cellulaire totale du foie (3%), ces cellules régulent activement la composition de la bile par réabsorption des acides biliaires, un processus qui est important dans des maladies choléstatiques du foie. Dans la première partie de cette étude nous avons mis au point une approche de différenciation des cellules souches pluripotentes (hESC et hiPSC) en cholangiocytes fonctionnels. Ces cellules serviront à la modélisation des maladies génétiques touchant les cholangiocytes formant des canaux biliaires. Dans la deuxième partie, nous avons généré des iPSC spécifiques de patients HF (HF-iPSC), différenciées en hépatocytes et corrigé le défaut phénotypique par transfert lentiviral de l’ADNc codant le LDLR dans les HF-iPSCCell therapy can be an alternative to liver transplantation in some cases such as severe metabolic diseases. However, the shortage of organ donors implies the need to find new sources of liver cells such as hepatocytes derived from pluripotent stem cells that can be amplified and differentiated extensively into any cell type. Human embryonic stem cells (hESC) and human induced pluripotent stem cells (hiPSC) generated from somatic cells of patients and then differentiated into hepatocytes represent a potential source of transplantable hepatocytes. These cells now make it possible to consider the transplantation of genetically modified autologous hepatocytes as an alternative to liver transplantation for the treatment of genetic diseases of the liver.Familial hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder caused by mutations in the gene encoding the receptor for Low Density Lipoproteins (LDLR), which is the cause of high blood cholesterol in these patients. Homozygous patients should purify their serum LDL-apheresis on average twice a month starting at a young age to avoid fatal myocardial infarction occurring in childhood.Human hepatocytes differentiated from patient’s induced pluripotent stem cells (iPSCs) allow assessing the feasibility to transplant genetically modified autologous hepatocytes as treatment of familial hypercholesterolemia.During the liver development, hepatocytes and cholangiocytes, the two types of hepatic epithelial cells, derive from bipotent hepatic progenitors (hepatoblasts). Although cholangiocytes, forming intrahepatic bile ducts, represent a small fraction of the total liver cell population (3%), they actively regulate bile composition by secretion and reabsorption of bile acids, a process that is important in cholestatic liver diseases. In the first part of this study we developed an approach to differentiate pluripotent stem cells (hESC and hiPSC) into functional cholangiocytes. These cells could be used for the modeling of genetic biliary diseases. In the second part, we generated FH patient specific iPSCs (HF-iPSC), differentiated them into hepatocytes and tried to correct the disease phenotype by lentiviral introduction of LDLR cDNA cassette in HF-iPSC
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Bourguignon, Chloé. "Modélisation de l’effet de la pollution atmosphérique sur l’épithélium bronchique : les cellules souches pluripotentes induites humaines, une nouvelle voie d’étude de l’exposome ?" Thesis, Montpellier, 2020. http://www.theses.fr/2020MONTT018.
Анотація:
La pollution atmosphérique est responsable d’environ 7 millions de décès prématurés par an au niveau mondial. Les particules fines (PM2.5) en particulier, jouent un rôle majeur dans le développement de pathologies respiratoires chroniques telles que la bronchopneumopathie obstructive chronique et l’asthme. Plusieurs études ont récemment mis en évidence que ces maladies pouvaient prendre racine dès l’enfance, au cours du développement pulmonaire. Il existe cependant peu de modèles précliniques permettant d’étudier ces étapes précoces et critiques en santé respiratoire. Les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) sont capables de se différencier vers tous les types cellulaires de l’organisme. Elles offrent ainsi une formidable opportunité de modéliser in vitro le développement pulmonaire et plus particulièrement celui de l’épithélium bronchique, dans le cadre de ces pathologies respiratoires chroniques.Grâce à un protocole de différenciation de hiPSC vers un épithélium bronchique fonctionnel, nous pouvons mimer les étapes clés de la morphogenèse bronchique in vitro en reproduisant les stades d’endoderme définitif, d’intestin primitif antérieur, de progéniteurs bronchiques jusqu’au stade d’épithélium bronchique composé de cellules multiciliées, à mucus, basales, club et neuroendocrines. En exposant à différents stades du protocole cet épithélium à des particules fines de pollution atmosphérique, nous avons pu mettre en évidence une cytotoxicité provoquée par de fortes doses de PM2.5, une induction de mécanismes de stress oxydant et d’inflammation, ainsi qu’un impact sur le processus de différenciation : diminution des marqueurs d’intestin primitif antérieur et de progéniteurs bronchiques aux étapes précoces ; modifications de la proportion des marqueurs de cellules terminales aux étapes tardives.Les résultats de ce travail ouvrent de nouvelles perspectives dans l’étude de l’impact de la pollution atmosphérique sur le développement pulmonaire. En enrichissant ce modèle d’autres compartiments cellulaires du poumon, en développant de nouveaux systèmes d’exposition et en variant le fond génétique des hiPSC, les propriétés d’auto-renouvellement virtuellement illimité de ces cellules souches pourraient permettre une évaluation à grande échelle de l’impact de nombreux facteurs environnementaux, au cours du développementABSTRACTAir pollution is one of the largest environmental cause of disease and every year, 7 millions of premature deaths are attributable to air pollution worldwide. Ambient fine particulate matter plays a major role in the development of chronic respiratory diseases such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD) or asthma. Recently, several studies have highlighted pediatric roots in the trajectories of these diseases. However, only few preclinical models are available to study these early developmental stages yet critical in respiratory health. Human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are able to differentiate into all cell types of human body. Thus, they offer a great opportunity to recapitulate lung development in vitro, especially bronchial airway development.Thanks to our differentiation protocol of hiPSC into functional airway epithelium, we can mimic in vitro key bronchial development steps: definitive endoderm, anterior foregut endoderm, lung progenitors towards functional epithelial cells such as ciliated cells, goblet cells, basal cells, club cells and neuroendocrine cells. PM2.5 exposure performed at different steps of the protocol showed high doses related cytotoxicity, oxidative stress and inflammatory responses. An effect on differentiation process was also observed with a decrease of anterior foregut endoderm and lung progenitors markers along with a modification in differentiated cells proportion.These results open new possibilities to study air pollution impact on lung development. Thanks to hiPSC self-renewal property, high scale exposure studies of environmental factors impact on lung development could emerge by adding new cell types to this model, developing new exposure systems and modifying genetic background of hiPSC
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Mery-Bories, Julie. "Utilisation des cellules souches pluripotentes humaines pour avancer dans la compréhension des atteintes neuromusculaires associées à la Dystrophie Myotonique de type 1 Building neuromuscular junctions invitro." Thesis, université Paris-Saclay, 2021. https://www.biblio.univ-evry.fr/theses/2021/interne/2021UPASL012.pdf.
Анотація:
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie neuromusculaire rare, principalement caractérisée par une myotonie, une faiblesse et une atrophie musculaire. La DM1 est une maladie autosomique dominante causée par une expansion anormale de triplets CTG, corrélée à la gravité de la maladie, située dans la région 3' non codante du gène DMPK. Cette mutation engendre un gain de fonction toxique des ARNm mutants qui s'agrègent dans le noyau en séquestrant des protéines de liaisons à l'ARN comme la famille des protéines MBNL. Plusieurs études ont suggéré une implication des motoneurones et de la jonction neuromusculaire dans les défauts musculaires observés chez les patients DM1. Cependant, les mécanismes à l'origine de ces atteintes sont encore peu compris. Le but de ce projet était de mettre en lumière les conséquences directes et indirectes de la mutation DMPK et de la séquestration des protéines MBNL dans le compartiment pré-synaptique et de déterminer la contribution pathologique des motoneurones dans la physiopathologie de la DM1. Grâce à un récent développement publié par l'équipe permettant de différencier efficacement des motoneurones à partir de cellules souches humaines induites à la pluripotence (hiPSC), nos résultats démontrent que les motoneurones dérivés de hiPSC DM1 présentent un défaut d'arborisation neuritique, retrouvé lors de la déplétion des protéines MBNL dans ce même type cellulaire. Pour évaluer les conséquences fonctionnelles de ce défaut, nous avons développé un modèle humain de co-culture de motoneurones dérivés de hiPSC associés à des cellules musculaires primaires humaines sur un support micropatterné. Nos résultats démontrent que la mutation DM1, présente uniquement dans le compartiment pré-synaptique, mène à des défauts fonctionnels post-synaptiques. De façon intéressante, des résultats identiques sont obtenus après l'extinction des protéines MBNL dans le compartiment pré-synaptique. Par une approche transcriptomique, nous avons identifié un panel de gènes dérégulés impliqués dans la plasticité synaptique pouvant potentiellement affecter la fonctionnalité ou l'intégrité de la jonction neuromusculaire. Ces résultats soulèvent l'importance de nouvelles contributions dans la pathogénicité de la DM1Myotonic Dystrophy type I (DM1) is a rare neuromuscular disease that is mainly characterized by myotonia, progressive muscle weakness and wasting. DM1 is an autosomal dominant disorder caused by an expanded CTG repeat in the 3' UTR of DMPK gene. This abnormal expansion leads to a toxic gain-of-function of the mutated mRNAs which aggregate within the nucleus in association with different RNA binding proteins such as the MBNL family proteins. Several studies suggest the involvement of motoneurons and the neuromuscular junction in the muscular defects observed in DM1 patients. However, the mechanisms by which this intercellular system might be affected in DM1 is still poorly understood. The aim of this project was to decipher the direct and indirect consequences of the DMPK mutation and the impact of MBNL sequestration in the pre-synaptic compartment and determine the pathological contribution of motorneurons in DM1 physiopathology. Thanks to the recent development by the team of a protocol allowing the efficient conversion of human pluripotent stem cells (hiPSCs), our results demonstrated that DM1 hiPSC-derived motoneurons exhibit a defective neuritic arborization that can be mimicked by the depletion of MBNL proteins. To further evaluate the functional consequences of these findings, we developed a humanized cellular model based on the coculture of hiPSC-derived motoneurons and micropatterned human primary skeletal muscle cells. Our results demonstrated that expression of DM1 mutation only in the pre-synaptic compartment led to functional defects at the post-synaptic level. Interestingly, similar results were obtained with the specific depletion of MBNL proteins in the pre-synaptic compartment.Thanks to a transcriptomic approach, we identified a panel of deregulated genes involved in synaptic plasticity which may affect function or stability of the neuromuscular junction. Altogether, these findings hold several new implications for DM pathogenesis
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Bizy, Alexandra. "Sélection des myocytes atriaux et ventriculaires dérivés des cellules souches pluripotentes humaines induites basée sur l’expression des isoformes de chaînes légères de myosine." Paris 6, 2013. http://www.theses.fr/2013PA066590.
Анотація:
Current cardiac differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) lead to mixed populations of atrial-, ventricular-, and nodal-like cardiac myocytes (CMs), which limits their use for cardiac research. To overcome this limitation, we have developed an iPSC-CM marking system using recombinant adenoviral reporter constructs with atrial- or ventricular-specific myosin light chain-2 promoters, MLC-2a and MLC-2v. FACS-purified MLC-2a and MLC-2v CMs recapitulate well-known structural and functional differences between human atrial and ventricular CMs. However, if MLC-2v constitutes a robust marker to purify ventricular CMs, promoting maturation of hiPSC-CMs would increase the specificity of the MLC-2a promoter for atrial cells. Another hurdle to overcome when working with hiPSC-CMs is their immature phenotype. Previous studies have demonstrated the importance of the extracellular matrix in the maturation of the cells. Thus, we have tested the influence of different matrices on hiPSC-CMs and we have identified 2- and 3-dimensional extracellular matrices that enhance maturation of the CMs towards an adult-like phenotype. Purification and maturation of hiPSC-CMs constitute important advances in the field and offer interesting perspectives for fundamental and clinical researchLes protocoles de différentiation des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) humaines en cardiomyocytes (CMs) aboutissent à la présence concomitante de cellules atriales, ventriculaires et nodales, ce qui limite leur utilisation. Pour surmonter cette limitation, nous avons construit des adénovirus avec le gène de la GFP sous le contrôle des promoteurs des chaînes légères de myosine atriale et ventriculaire MLC-2a et MLC-2v. Nous montrons que ce système de marquage à la GFP associé à la technique de cytometry en flux est efficace pour la purification de CMs présentant les caractéristiques structurales et fonctionnelles de cellules atriales et ventriculaires humaines. Cependant, si MLC-2v est un marqueur robuste pour purifier les cellules ventriculaires, promouvoir la maturation des CMs dérivés des CSPi renforcerait la spécificité du promoteur MLC-2a pour les cellules atriales. Une autre barrière à l’utilisation des CMs différenciés est leur phénotype immature. Plusieurs études ont démontré l’importance de la matrice extracellulaire dans la maturation des cellules. Nous avons donc testé l’influence de différents types de matrices sur la maturation des CMs dérivés CSPi et avons identifié des matrices extracellulaires en 2 et 3 dimensions favorisant le développement des CMs vers un phénotype adulte. Purification et maturation des CMs dérivés des CPSi constituent des avancées importantes pour leur utilisation en recherche fondamentale et clinique
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Raïs, Célia. "Analyse histologique et fonctionnelle du développement de précurseurs neuraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines greffés dans le cortex de la souris." Thesis, Sorbonne université, 2019. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=http://theses-intra.upmc.fr/modules/resources/download/theses/2019SORUS333.pdf.
Анотація:
Les anomalies du neurodéveloppement sous-tendent entre autres les maladies psychiatriques telles que la schizophrénie ou l’autisme. L'hétérogénéité génétique de l'être humain rend cependant complexe l'établissement d'un lien entre un génome donné et les programmes de développement qui peuvent mener à une maladie. Pour répondre à ce problème, les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont un outil ethique et efficace. Elles sont capables de se développer et de se différencier en neurones fonctionnels, en utilisant un mécanisme similaire au développement in vivo. J’ai étudié un modèle permettant de suivre l’intégration et la migration de précurseurs neuraux issus d’iPSC humaines dans le cortex de souris. En marquant les cellules greffées par immunofluorescence, j’ai pu montrer qu’elles se différencient principalement en neurones des couches supérieures du cortex. J’ai étudié les relations entre l’hôte et la greffe, et montre que les cellules de la souris participent au développement de la greffe, en apportant une vascularisation, et en myélinisant les neurones humains en développement. Enfin, j’ai suivi le développement fonctionnel des neurones humains en utilisant une lignée exprimant un indicateur calcique, le GCaMP6f, et en observant chroniquement les souris injectées au microscope 2-photons. Cette activité évolue au cours du temps, et reflète un cerveau prénatal humain. Ce modèle offre des possibilités nouvelles de modélisation in vivo du developpement cortical humain, notamment dans l’étude de l’impact d’altérations génétiques dans le cadre de maladies psychiatriquesNeurodevelopmental abnormalities underlie psychiatric diseases such as schizophrenia or autism, among others. However, the genetic heterogeneity of human beings makes it difficult to establish a link between a given genome and development programs that can lead to a disease. To address this problem, induced pluripotent stem cells (iPSCs) are an ethical and effective tool. They are able to develop and differentiate into functional neurons, using a mechanism similar to in vivo development. I studied a model enabling the integration and migration of neural precursors from human iPSCs into the mouse cortex. By labelling the cells grafted by immunofluorescence, I was able to show that they differentiate mainly into upper layer cortical neurons. I have studied the relationship between host and grafted cells , and show that mouse cells participate in the development of the graft, providing vascularization, and myelinating developing human neurons. Finally, I followed the functional development of human neurons using a cell line expressing a calcium indicator, GCaMP6f, and chronically observing injected mice under a 2-photon microscope. This activity changes over time, and reflects a prenatal human brain. This model offers new possibilities for in vivo modelling of human cortical development, particularly in the study of the impact of genetic alterations in the context of psychiatric diseases
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Roux, Clémence. "Activité immunosuppressive des cellules stromales mésenchymateuses dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines : induction de lymphocytes T régulateurs in vitro et in vivo et expression de PD-L1." Thesis, Université Côte d'Azur (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018AZUR4226/document.
Анотація:
La grande originalité de mon projet réside dans la génération de cellules stromales mésenchymateuses (MSCs) à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPS). Je rappellerai les propriétés phénotypiques, de multipotence et immunosuppressives des MSCs et m’attarderai sur leurs différents mécanismes immunomodulateurs. Cependant, leur nombre limité et leur isolation difficile limitent leur utilisation thérapeutique nécessitant une autre source de cellules.Mon travail a donc été de générer et de caractériser des MSCs issues d’iPS (huiPS-MSCs). L'avantage des huiPS-MSCs réside dans leur plus grande disponibilité et la possibilité d'en avoir à volonté. Encore faut-il valider l’intérêt thérapeutique potentiel de ces huiPS-MSCs. Premièrement, mes résultats in vitro montrent que les huiPS-MSCs présentent une activité immunosuppressive sur les lymphocytes T (LT) activés conduisant à une induction de LT régulateurs FoxP3+ fonctionnels. Deuxièmement, dans une approche plus axée sur la thérapie, j’ai analysé in vivo l’activité́ immunosuppressive des huiPS-MSCs dans un modèle de réaction xénogénique de greffon contre l'hôte (souris immunodéficientes NSG injectées avec des LT humains). Je montre clairement, après traitement avec les huiPS-MSCs, une réduction de la proportion de LT humains producteurs de cytokines inflammatoires (IFNγ et TNFα) typiques de la pathologie et l’apparition concomitante de LT présentant un phénotype régulateur (production d’IL10 et expression de FoxP3). La fin de mon travail a été de caractériser moléculairement la régulation de l’expression de PD-L1, une molécule immuno-régulatrice puissante, entre les MSCs issues de la moelle osseuse (BM-MSCs) de donneurs sains et nos huiPS- MSCs. Les huiPS-MSCs ont une expression constitutive de PD-L1, qui est absente sur les BM-MSCs. J’ai analysé les microARNs susceptibles de limiter l’expression de PD-L1, j’ai pu en identifier plusieurs. En mesurant leur expression dans les différentes MSCs à notre disposition, je montre que cette expression est inverse par rapport à celle de PD-L1. J’ai ainsi pu démontrer l’activité immunosuppressive de nos huiPS-MSCs in vitro et in vivo avec une perspective d’induction de tolérance immune, et caractériser la régulation de l’expression de PD-L1, molécule immunosuppressive exprimée par les huiPS-MSCsThe mesenchymal stromal cells (MSCs) present many features that render attractive as therapeutic cells. Their phenotype, multipotency and immunosuppressive properties are well described. Nevertheless, major restriction for their clinical use is due to the limited in vitro expansion and low quantity of cells that can be collected from adult tissues. The originality of my project consisted in the generation of mesenchymal stromal cells (MSCs) from human induced pluripotent stem cells (iPS). These huiPS-MSCs could fulfill some of the specification required to improve MSCs use in therapeutic approaches: welldefined and unlimited number of cells with reproducible functional characteristics. In a first approach, I characterized the huiPS-MSCs generated in the laboratory. My results highlight the immunosuppressive activity in vitro of the huiPS-MSCs on T-cell stimulation that induces a switch in T-cell cytokine polarization toward the generation of Treg cells. Secondly, in a more therapy-oriented approach, I analyzed in vivo immunosuppressive activity of huiPS-MSCs in a xenogeneic graft versus host model (NSG immunodeficient mice injected with human T lymphocytes). My data showed significantly reduced percentages of human-differentiated T cells producing Th1 inflammatory cytokines (IFNγ and TNFα). By contrast, T cells producing IL-10 and FoxP3+ Treg cells, absent in nontreated animals, were detected in huiPS-MSCs treated mice, confirming the in vitro results of a tolerizing process. The end of my work was to characterize the molecular regulation of the expression of PDL1, an immunoregulatory molecule expressed by the MSCs. Comparing bone marrow MSCs (BM-MSCs) from healthy donors and our huiPS-MSCs, I showed that the huiPSMSCs have a constitutive expression of PD-L1, which is absent on BM-MSCs. Analysing microRNAs that could limit the expression of PD-L1, I could identify several microRNAs which expression is inverse to the expression of PD-L1. For the first time, my results highlight the immunosuppressive activity of huiPS-MSCs on human T-cell stimulation with a concomitant generation of human Treg cells in vivo and characterize the regulation of PD-L1 expression, an immunosuppressive molecule expressed by the MSCs. They may favor the development of new tools and strategies based on the use of huiPS cells and their derivatives for the induction of immune tolerance
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Roux, Clémence. "Activité immunosuppressive des cellules stromales mésenchymateuses dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines : induction de lymphocytes T régulateurs in vitro et in vivo et expression de PD-L1." Electronic Thesis or Diss., Université Côte d'Azur (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018AZUR4226.
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La grande originalité de mon projet réside dans la génération de cellules stromales mésenchymateuses (MSCs) à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPS). Je rappellerai les propriétés phénotypiques, de multipotence et immunosuppressives des MSCs et m’attarderai sur leurs différents mécanismes immunomodulateurs. Cependant, leur nombre limité et leur isolation difficile limitent leur utilisation thérapeutique nécessitant une autre source de cellules.Mon travail a donc été de générer et de caractériser des MSCs issues d’iPS (huiPS-MSCs). L'avantage des huiPS-MSCs réside dans leur plus grande disponibilité et la possibilité d'en avoir à volonté. Encore faut-il valider l’intérêt thérapeutique potentiel de ces huiPS-MSCs. Premièrement, mes résultats in vitro montrent que les huiPS-MSCs présentent une activité immunosuppressive sur les lymphocytes T (LT) activés conduisant à une induction de LT régulateurs FoxP3+ fonctionnels. Deuxièmement, dans une approche plus axée sur la thérapie, j’ai analysé in vivo l’activité́ immunosuppressive des huiPS-MSCs dans un modèle de réaction xénogénique de greffon contre l'hôte (souris immunodéficientes NSG injectées avec des LT humains). Je montre clairement, après traitement avec les huiPS-MSCs, une réduction de la proportion de LT humains producteurs de cytokines inflammatoires (IFNγ et TNFα) typiques de la pathologie et l’apparition concomitante de LT présentant un phénotype régulateur (production d’IL10 et expression de FoxP3). La fin de mon travail a été de caractériser moléculairement la régulation de l’expression de PD-L1, une molécule immuno-régulatrice puissante, entre les MSCs issues de la moelle osseuse (BM-MSCs) de donneurs sains et nos huiPS- MSCs. Les huiPS-MSCs ont une expression constitutive de PD-L1, qui est absente sur les BM-MSCs. J’ai analysé les microARNs susceptibles de limiter l’expression de PD-L1, j’ai pu en identifier plusieurs. En mesurant leur expression dans les différentes MSCs à notre disposition, je montre que cette expression est inverse par rapport à celle de PD-L1. J’ai ainsi pu démontrer l’activité immunosuppressive de nos huiPS-MSCs in vitro et in vivo avec une perspective d’induction de tolérance immune, et caractériser la régulation de l’expression de PD-L1, molécule immunosuppressive exprimée par les huiPS-MSCsThe mesenchymal stromal cells (MSCs) present many features that render attractive as therapeutic cells. Their phenotype, multipotency and immunosuppressive properties are well described. Nevertheless, major restriction for their clinical use is due to the limited in vitro expansion and low quantity of cells that can be collected from adult tissues. The originality of my project consisted in the generation of mesenchymal stromal cells (MSCs) from human induced pluripotent stem cells (iPS). These huiPS-MSCs could fulfill some of the specification required to improve MSCs use in therapeutic approaches: welldefined and unlimited number of cells with reproducible functional characteristics. In a first approach, I characterized the huiPS-MSCs generated in the laboratory. My results highlight the immunosuppressive activity in vitro of the huiPS-MSCs on T-cell stimulation that induces a switch in T-cell cytokine polarization toward the generation of Treg cells. Secondly, in a more therapy-oriented approach, I analyzed in vivo immunosuppressive activity of huiPS-MSCs in a xenogeneic graft versus host model (NSG immunodeficient mice injected with human T lymphocytes). My data showed significantly reduced percentages of human-differentiated T cells producing Th1 inflammatory cytokines (IFNγ and TNFα). By contrast, T cells producing IL-10 and FoxP3+ Treg cells, absent in nontreated animals, were detected in huiPS-MSCs treated mice, confirming the in vitro results of a tolerizing process. The end of my work was to characterize the molecular regulation of the expression of PDL1, an immunoregulatory molecule expressed by the MSCs. Comparing bone marrow MSCs (BM-MSCs) from healthy donors and our huiPS-MSCs, I showed that the huiPSMSCs have a constitutive expression of PD-L1, which is absent on BM-MSCs. Analysing microRNAs that could limit the expression of PD-L1, I could identify several microRNAs which expression is inverse to the expression of PD-L1. For the first time, my results highlight the immunosuppressive activity of huiPS-MSCs on human T-cell stimulation with a concomitant generation of human Treg cells in vivo and characterize the regulation of PD-L1 expression, an immunosuppressive molecule expressed by the MSCs. They may favor the development of new tools and strategies based on the use of huiPS cells and their derivatives for the induction of immune tolerance
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Badja, Cherif. "Optimisation de la différenciation neuronale et musculaire de cellules pluripotentes induites humaines pour la modélisation des maladies rares : exemple du syndrome de DiGeorge." Thesis, Aix-Marseille, 2015. http://www.theses.fr/2015AIXM5027/document.
Анотація:
Le syndrome de DiGeorge ou microdélétion 22q11.2, est la délétion chromosomique la plus fréquente chez les êtres humains. Cette délétion est liée à la recombinaison homologue non-allélique au cours de la méiose induisant la perte d’en moyenne 40 gènes. Les études de corrélation génotype/phénotype chez les patients ont révélé des différences phénotypiques entre individus et cela indépendamment de la taille des microdélétions. L’hypothèse de l’implication des mécanismes épigénétiques dans la variabilité phénotypique observée a été soulevée mais reste encore inexplorée. C’est dans ce contexte que nous nous intéressons à l’étude des mécanismes épigénétiques au cours du développement, dans cette pathologie à travers l’utilisation d’un modèle de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSs). En particulier, nous avons ciblé nos travaux sur le rôle de la chaperonne d’histone HIRA dont le gène est localisé dans la région délétée. HIRA est impliquée dans la déposition du variant d’histone H3.3, une histone majeure dans le cerveau. Afin de comprendre l’implication de HIRA dans les manifestations neurologique du syndrome de DiGeorge et en particulier dans la schizophrénie, nous avons développé et optimisé un nouveau protocole pour la différenciation de cellules hiPSCs en progéniteurs neuronaux, neurones corticaux et neurones dopaminergiques. L’ensemble de ces travaux ouvre donc de nouvelles perspectives pour la modélisation d’un grand nombre de pathologies, et dans le contexte du laboratoire, pour l’exploration des mécanismes épigénétiques associés à la variabilité phénotypique dans différentes maladies génétiquesThe DiGeorge syndrome also known as 22q11.2 microdeletion syndrome, is the most common deletion in humans. This deletion is linked to a non-allelic homologous recombination that occurs during meiosis and involves sequences called LCRs for "Low Copy Repeats". Depending on the LCRs involved, different deletions are observed, inducing the loss of approximately 40 genes. The absence of genotype/phenotype correlation in patients and the phenotypical differences regardless of the size of the microdeletion suggests the involvement of additional parameter. The hypothesis of epigenetic changes associated with the onset or variability of symptoms has been suggested but never investigated. In order to tackle this question, we decided to focus our attention of the role of the HIRA histone chaperone encoded by a gene located in the 22q11.2-deleted region. HIRA is involved in the deposition of the H3.3 histone variant, one of the main histone in the brain. In order to determine whether HIRA is implicated in the neurological manifestations in DiGeorge patients and particularly in schizophrenia, we developed and optimized a new protocol for the direct differentiation of human induced pluripotent stem cell (hiPSCs) into neural progenitors, cortical and dopaminergic neurons. In parallel, we developed a new protocol for hiPSCs differentiation toward the skeletal muscle lineage and the production of multinucleated muscle fibers. Altogether, these results open new perspectives for the modeling of a large number of pathologies, and in the context of our laboratory, the exploration of epigenetic mechanisms associated with phenotypic variability in different genetic diseases
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Khedher, Ahmed. "Utilisation de technologies d'édition du génome afin de générer des cardiomyocytes matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines induites CtIP Fusion to Cas9 Enhances Transgene Integration by Homology-Dependent Repair." Thesis, université Paris-Saclay, 2021. http://www.theses.fr/2021UPASL002.
Анотація:
Les cardiomyocytes dérivés des cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC-CMs) représentent des modèles in vitro prometteurs pour plusieurs applications scientifiques et thérapeutiques allant de la modélisation de pathologies à la découverte de médicaments et de la toxicologie prédictive à la médecine régénérative. Malgré les nombreux progrès dans ce domaine, les protocoles de différenciation actuels ne permettent pas d’atteindre le stade de maturité que l’on retrouve chez le myocarde adulte de l’Homme. En effet, certaines caractéristiques majeures des hiPSC-CMs demeurent similaires à celles de cardiomyocytes fœtaux telles que l’expression de plusieurs gènes cardiaques, l’électrophysiologie ou leur fonction contractile. En effet, des analyses transcriptomiques réalisés au sein de notre laboratoire à Sanofi ont révélé que les gènes KCNJ2 et CASQ2, impliqués respectivement dans l’électrophysiologie et la gestion du calcium, étaient sous-exprimés dans les hiPSC-CMs en comparaison aux cardiomyocytes adultes. Cette thèse avait pour objectif d’améliorer la maturation des hiPSC-CMs en utilisant des technologies d’édition du génome. Ainsi, nous avons généré des lignées stables de hiPSC-CMs qui expriment de manière inductible KCNJ2 ou CASQ2 ou les deux gènes simultanément puis nous avons examiné leurs phénotypes fonctionnels et électrophysiologiques par le biais de méthodes d’analyses complémentaires. A la suite à l’induction de l’expression de KCNJ2 et CASQ2 par la doxycycline, les hiPSC-CMs montraient des bénéfices phénotypiques tels que la diminution drastique de la fréquence des battements spontanés, une hyperpolarisation du potentiel de repos membranaire, la diminution de la durée du potentiel d’action et l’amélioration du flux de calcium transitoire. En plus de ces bénéfices attendus, l’expression concomitante de ces deux gènes a amélioré la pente de la pointe du potentiel de champ extracellulaire associée au courant sodique ainsi que la gestion du calcium. Nous avons ensuite évalué le bénéfice de l’expression de ces transgènes sur la toxicologie prédictive en testant des molécules agonistes ou antagonistes de canaux ioniques utilisées classiquement dans le cadre des essais précliniques de toxicité cardiaque. Nous avons notamment observé plus d’arythmies induites par l’E4031 avec les hiPSC-CMs exprimant conjointement KCNJ2 et CASQ2 par rapport aux cardiomyocytes contrôles. Ainsi, les hiPSC-CMs exprimant simultanément KCNJ2 et CASQ2 présentent un phénotype plus mature que les hiPSC-CMs natifs et de tels cardiomyocytes édités génétiquement peuvent être utiles pour l’évaluation de la toxicité cardiaque de nouveaux médicaments candidatsHuman induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are a very promising model for several scientific and therapeutic applications ranging from disease modeling to drug discovery, and from predictive toxicology to regenerative medicine. Despite numerous efforts, current protocols do not yet lead to a maturation phenotype equivalent to adult human myocardium. Indeed, key features of hiPSC-CMs remaining closer to fetal stages of development, such as gene expression, electrophysiology and function. Transcriptome analysis performed at Sanofi have confirmed these findings at the genome-wide level. Indeed, KCNJ2 and CASQ2 which are implicated in the two major physiological characteristics of cardiac cells, their electrophysiological behavior and calcium handling, respectively, were expressed at very low levels in hiPSC-CMs in comparison with adult cardiomyocytes. This thesis aimed to improve the maturation of hiPSC-CMs by using genome editing technologies. We generated stable hiPSC-CMs with inducible expression of KCNJ2, or CASQ2 or both genes (KCNJ2-CASQ2 hiPSC-CMs) and studied their functional and electrophysiological phenotype by several complementary methods. Upon doxycycline induction of KCNJ2 and CASQ2, KCNJ2-CASQ2 hiPSC-CMs displayed phenotypic benefits expected from previous studies of each maturation gene, including a drastic reduction of spontaneous beating, hyperpolarized resting membrane potential, shortened action potential duration and enhanced calcium transients. In addition, co-expression of the two genes enhanced Na+ spike slope of extracellular field potential and Ca2+ handling. We tested four reference drugs and observed signatures of known cardiac effects in KCNJ2-CASQ2 hiPSC-CMs, including arrhythmias induced by QT prolonging drug (E-4031), which were more easily detected than in control hiPSC-CMs. Therefore, KCNJ2-CASQ2 hiPSC-CMs exhibited a more mature phenotype than hiPSC-CMs and such genetically engineered hiPSC-CMs could be useful for testing cardiac toxicity of novel candidate drugs
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Corbineau, Sébastien. "Génération de progéniteurs hépatiques dérivés de cellules souches : application à l’hypercholestérolémie familiale." Thesis, Paris 11, 2011. http://www.theses.fr/2011PA114821/document.
Анотація:
La transplantation d’hépatocytes représente une alternative à la transplantation hépatique pour le traitement de certaines maladies métaboliques dont l’hypercholestérolémie familiale. Les cellules souches embryonnaires (ES) et les cellules souches pluripotentes induites (iPS) humaines représentent de nouvelles sources de cellules hépatiques. Nous avons mis au point une approche de différenciation des cellules souches humaines en cellules hépatiques et généré ainsi des cellules dérivées de cellules iPS de patients atteints d’hypercholestérolémie familialeHepatocyte transplantation represents an alternative to liver for the treatment of metabolic diseases including familial hypercholesterolaemia. Embryonic stem cells (ES) and induced pluripotent stem cells (iPS) represent new sources of hepatic cells. We have developed an approach to differentiate human stem cells into hepatic cells and thus we have generated hepatic cells derived from iPS of familial hypercholesterolaemia patients
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Mianné, Joffrey. "Thérapie génique par CRISPR/Cas9 pour corriger des épithéliums bronchiques dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) de patients atteints de dyskinésie ciliaire primitive (DCP) : une preuve de concept." Thesis, Montpellier, 2020. http://www.theses.fr/2020MONTT045.
Анотація:
La dyskinésie ciliaire primitive (DCP) est une maladie génétique rare et hétérogène affectant la structure et la fonction des cils motiles. Dans l'épithélium des voies respiratoires, l’altération du mouvement ciliaire entraîne des infections chroniques responsables du déclin progressif et définitif des fonctions pulmonaires. Il n'existe actuellement aucun traitement efficace pour la DCP. Par ailleurs, la recherche de nouvelles thérapies reste limitée par le manque de modèles fiables.Dans ce contexte, les deux objectifs de cette thèse sont : 1) de développer un nouveau modèle in vitro de la DCP basé sur la différenciation dirigée de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) en épithélium des voies respiratoires multiciliées, et 2) d'utiliser ce modèle pour étudier le potentiel d'une approche de thérapie génique basée sur la technologie CRISPR/Cas9.Dans ce but, nous avons dérivé deux lignées de CSPi, une d'un individu sain et une seconde d'une patiente atteinte de la DCP contenant des mutations hétérozygotes composites dans le gène CCDC40. En utilisant la lignée « saine » et la technologie CRISPR/Cas9, nous avons généré des contrôles isogéniques knock-out pour trois gènes impliqués dans la DCP incluant CCDC40, DNAH5 et MCIDAS. Parallèlement, la lignée de CSPi dérivée de la patiente a été corrigée à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9 et de l'approche de réparation dirigée par homologie. En appliquant à ces lignées cellulaires notre protocole de différenciation préalablement optimisé, nous générons efficacement un épithélium multicilié fonctionnel des voies aériennes récapitulant les phénotypes ciliaires en fonction du génotype. En outre, ce nouveau modèle nous a permis d'étudier le potentiel d'une approche de thérapie génique basée sur la technologie CRISPR/Cas9 pour restaurer le cadre de lecture et de rétablir le phénotype ciliaire dans la lignée DCP.En conclusion, le nouveau modèle développé dans ce travail pourrait représenter un outil majeur pour la modélisation de la DCP in vitro. Ce modèle sera particulièrement intéressant pour étudier directement sur le tissu humain concerné la faisabilité et l'efficacité de thérapies innovantes. Notre pipeline pourrait donc permettre d’accélérer la recherche et le développement de nouvelles thérapies pour la DCP ainsi que d'autres pathologies pulmonairesPrimary Ciliary dyskinesia (PCD) is a rare and heterogeneous genetic disorder affecting the structure and function of motile cilia. In the airway epithelium, impaired ciliary motion results in chronic airway infections responsible for progressive and definitive decline of lung functions. There is currently no effective treatment for PCD, and research is limited by the lack of convenient models to study this disease and investigate innovative therapies.In this context, the main goals of this thesis are: 1) to develop a new in vitro PCD model based on the directed differentiation of patient-derived or genetically-engineered induced pluripotent stem cells (iPSC) into multiciliated airway epithelium, and 2) to use this model to investigate the potential of an innovative CRISPR/Cas9 gene therapy approach.To this aim, we have derived two iPSC lines, one from an healthy individual and a second from a PCD patient harbouring compound heterozygous mutations in the CCDC40 gene. Using the “healthy” iPSC line and the CRISPR/Cas9 technology we have generated isogenic knock-out controls for three PCD genes including CCDC40, DNAH5 and MCIDAS. In parallel, using the CRISPR/Cas9 technology and the homology directed repair approach, we have corrected the patient-derived iPSC line. By applying our optimized differentiation protocol to these cell lines, we are efficiently generating functional multiciliated airway epithelium recapitulating the ciliary phenotypes in function of the genotype. Furthermore, this new model has allowed us to investigate the potential of a CRISPR/Cas9-mediated reframing gene therapy approach to rescue ciliary phenotype in the patient line.In conclusion, the new model developed in this work could represent a major tool for in vitro PCD modelling. This model will be of particular interest for investigating the feasibility and efficacy of personalized therapies directly on the relevant human tissue. Our pipeline could therefore accelerate the development and translation of new therapeutics for PCD and other lung diseases
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Paiva, Solenne. "Facteurs environnementaux et épigénétiques impliqués dans la différenciation cardiaque de cellules souches humaines pluripotentes induites MiRroring the Multiple Potentials of MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction Acellular therapeutic approach for heart failure: in vitro production of extracellular vesicles from human cardiovascular progenitors." Thesis, Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS457.
Анотація:
L’objectif de cette thèse a été d’évaluer certains paramètres physiques et épigénétiques impliqués dans la différenciation cardiaque de cellules souches humaines pluripotentes induites. Un premier paramètre physique souvent sous-évalué a été étudié, celui de la rigidité. Classiquement, les cellules souches sont cultivées et adaptées à des rigidités in vitro allant de 1-10 GPa très éloignées des valeurs physiologiques, de l’ordre du kPa. L’impact de support de culture à 3, 12 et 25 kPa a été évalué sur les cellules souches initiales. Les résultats montrent que des rigidités inférieures à 25 kPa ne permettent pas le maintien de la pluripotence au bout de 6 passages. De plus, les colonies cellulaires se développent en 3D et créent leur propre microenvironnement. Un second paramètre étudié concerne les microRNAs appartenant à la famille let-7 dont la fonction exacte au niveau cardiaque reste à définir. Les résultats montrent qu’au cours de la différenciation son expression se caractérise par une augmentation transitoire précoce au moment de la formation du mésoderme, puis s’éteint pour ne ré-augmenter que plus tard lors de la maturation des cardiomyocytes. Des modulations via des mimics ou des inhibiteurs dans différents contextes cellulaires suggèrent qu’initialement let-7 contribue à une future spécification cardiaque, mais que plus tard cette famille devra être réprimée pour générer des progéniteurs cardiaques. À l’opposé, miR-1, spécifique au cœur, contribue toujours à la progression en cardiomyocytes. Ensemble, ces recherches contribuent à la recherche fondamentale sur le développement du cœur humain et à la recherche appliquée en ingénierie tissulaire cardiaqueThe objective of this thesis was to evaluate some physical and epigenetic parameters involved during cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells. Environmentally, an often undervalued physical parameter remains, the stiffness defined by the Young’s modulus. Commonly stem cells are cultured and adapted to in vitro rigidities ranging between 1-10 GPa very far from physiological values, for instance 10-15 kPa for the heart. The impact of soft culture substrates with 3 kPa, 12 kPa and 25 kPa was studied on the initial stem cells. Globally, results indicated that rigidities lower than 25 kPa were not suited for total pluripotency maintenance after 6 passages. Also, cellular colonies started to grow in 3D suggesting that softness drove them to build their own microenvironment. Epigenetically, the exact role of one of the first discovered microRNAs, the let-7 family has not yet been fully elucidated. Throughout differentiation its expression was characterized by an early transient peak at the time of mesoderm formation, after which their expression extinguished to only gradually re-increase later in the course of cardiomyocytes maturation. Modulation experiments involving mimics or inhibitors of the let-7 family on different cellular contexts suggested that initially let-7 acted on future cardiac specification but later, this family had to be repressed in order for cardiac progenitors to emerge. Oppositely, the cardiac specific miR-1 always contributed to their progression into cardiomyocytes. Together these researches contribute to fundamental research on human heart development and to applied research on human engineered cardiac tissues
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Secardin, Lise. "Modélisation des néoplasmes myéloprolifératifs grâce aux cellules souches induites à la pluripotence (IPSC)." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCC313/document.
Анотація:
Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont hémopathies malignes aboutissant à la surproduction d'une ou plusieurs lignées myéloïdes. Elles sont dues à l'acquisition de mutations sur l'axe de signalisation MPL/JAK2 incluant des mutations de JAK2V617F, de MPL et plus récemment de la calréticuline (CALR), dont les deux principales sont CALRdel52 et CALRins5. Ces mutations de signalisations peuvent être accompagnées de mutations de l'épigénétique, les plus importantes étant des mutations dans TET2. Le but de cette thèse était d'étudier le rôle des mutations de TET2 et de la calrdel52 dans les NMP grâce à une technologie de cellules souches induites à la pluripotence (IPSC). Dans la première partie j'ai pu démontrer que TET2 joue un rôle dans le processus de reprogrammation, vraisemblablement de manière indépendante de son activité catalytique. Dans la seconde partie, j'ai démontré que CALRdel52 joue un rôle dans les MPN en provoquant une hypersensibilité et une pousse indépendante de la TPO des progéniteurs mégakaryocytaires ainsi qu'une hyperprolifération des mégacaryocytes, liées à l'activation constitutive de stat3 et de ERK. J'ai également démontré une pousse indépendante du GCSF des granulocytes. Ce travail a donc permis de mettre en lumière le rôle du facteur épigénétique TET2 dans le processus de reprogrammation ainsi que le rôle de CALRdel52 dans les MPN dans un contexte d'expression endogèneMyeloproliferative neoplasms (NMP) are hematological malignancies that lead to an ovrproduction of one or more myeloid lineages. They are driving by mutations in MPLl/jak2 signaling pathway, mainly JAK2V617F, MPL, and more recently calreticulin (CARL), with two main mutations being calrdel52 and calrins5. These signaling mutations are sometimes associated with epigenetic mutations, the major one being in tet2. The objective of my thesis was to study the role of TET2 and CALRdel52 in MPN thanks to an induced pluripotent stem cells (IPSC) model. In the first part i demonstrated the role of TET2 in reprogramming process, probably independently of the catalytic domain. In the second part i demonstrated that CALRdel52 induced a TPO hypersensitivity and a TPO indenpendant growth of the megakaryocytic progenitors as well as a hyperproliferation of the megakaryocytes. This phenotype is associated with a constitutive activation of stat3 and ERK. A G-CSF independent growth of the granulocyte was also demonstrated. In conclusion this work underline the role of an epegenetic factor, TET2, in the reprogramming process and demonstrate the role of CALRdel52in MPN with an endogenous expression model
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Sansac, Caroline. "Modélisation de l'épithélium bronchique humain par la technologie des cellules souches pluripotentes induites (iPS)." Thesis, Montpellier, 2016. http://www.theses.fr/2016MONTT014/document.
Анотація:
Les cellules souches pluripotentes (CSP) incluent les cellules souches embryonnaires (ES) et les celles souches pluripotentes induites (iPS). Elles sont définies par deux propriétés fondamentales : l’auto-renouvellement et la capacité à se différencier dans tous les types cellulaires. Les ES sont dérivées de la masse cellulaire de l’embryon. Elles soulèvent l’intérêt de la communauté scientifique du fait de leur capacité à générer tous les tissus. Il s’agit d’un outil biotechnologique majeur dont les applications thérapeutiques et pharmacologiques comporteront notamment la médecine régénératrice, la modélisation in vitro de maladies humaines et le criblage de candidat-médicaments. Cependant l’utilisation d’embryons humains pour générer les ES soulève des problèmes éthiques. Les iPS contournent ces difficultés car elles sont dérivées de cellules somatiques différenciées. En effet, S. Yamanaka, qui a reçu le prix Nobel en 2012, a découvert en 2006 une technique simple de reprogrammation cellulaire. L’expression transitoire de quatre gènes (OCT4, SOX2, c-MYC and KLF4) est suffisante pour reprogrammer des fibroblastes murins en iPS. Ces cellules iPS ont la même morphologie et les mêmes propriétés que les cellules ES. L’année suivante, S. Yamanaka a appliqué avec succès son cocktail à des fibroblastes humains pour produire des iPS humaines (hiPS). Les hiPS peuvent également dépasser les problèmes immunologiques soulevés par l’utilisation d’ES dans la thérapie cellulaire, par le simple fait que les hiPS pourront être dérivées du patient à traiter. De plus, parce qu’il est possible de choisir les cellules du donneur à reprogrammer selon son génotype, il est plus facile de modéliser des maladies génétiques à partir d’hiPS que d’ES. Enfin, d’un point de vue pharmaceutique, les hiPS peuvent fournir une plateforme quasi-infinie pour le criblage de molécules afin de traiter diverses pathologies. Le but de mon projet de recherche est l’utilisation de la technologie hiPS afin de modéliser le développement de l’épithélium bronchique. Premièrement, in vivo, des tératomes ont été générés après injection d’hiPS dans des souris immunodéficientes. Les tératomes démontrent la capacité de nos hiPS à se différencier en épithélium bronchique. Secondairement, in vitro, reproduire le développement embryonnaire et fœtal permet d’offrir une méthode simple pour modéliser l’épithélium bronchique dans un puits. Cette technologie ouvre la voie vers de nombreuses recherches, du criblage de molécules à la production de cellules souches pour réparer l’épithélium bronchique, et in fine à la promotion de nouveaux traitements pharmacologiques ou de thérapie innovante pour les maladies respiratoiresPluripotent stem cells (PSC) include embryonic stem cells (ES) and induced pluripotent stem cells (iPS). They are defined by two fundamental properties: self-renewal and the capacity to differentiate into all cell types. ES cells are derived from the inner cell mass of embryos. They arouse the interest of the scientific community in particular for their ability to generate all tissues. They provide major therapeutic and pharmacological applications, including regenerative medicine, in vitro modelling of human diseases and molecular screening. However, the use of human blastocysts to generate ES cells raises many ethical problems. iPS circumvent these ethical issues as they can be derived from differentiated somatic tissues. Indeed, S. Yamanaka, Nobel Prize in 2012, discovered in 2006 a simple technique of cellular reprogramming. The transient expression of four genes (OCT4, SOX2, c-MYC and KLF4) is sufficient to reprogram mouse fibroblasts into iPS. These iPS cells have the same morphology and the same properties than ES cells. The following year, S. Yamanaka applied successfully his cocktail to human fibroblasts to produce human iPS (hiPS). hiPS may also overcome immunological problems raised by the use of ES cell for cellular therapy, as hiPS can be derived from the patient to be treated. In addition, it is easier to model genetic diseases from hiPS than ES, because it is possible to choose the donor cells to reprogram according to its genotype. Finally, from a pharmacological point of view, hiPS can provide a broad platform of molecular screening to treat various diseases. The aim of my research project is to use the hiPS technology to model the development of bronchial epithelium. First, in vivo, teratomas were formed by the injection of hiPS into immunodeficient mice. Teratomas highlight the ability of differentiation of our hiPS into bronchial epithelium. Second, in vitro, reproducing embryonic and foetal bronchial development provides a way to model bronchial epithelium in a dish.These techniques open the door to many potential research avenues from screening small molecules to engineering stem cells to repair bronchial epithelium, and will in fine promote new pharmacologic or cell-based treatments for respiratory diseases
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Barbet, Romain. "Cellules souches embryonnaires humaines : rôle central des contrôles de la pluripotence par la superfamille des TGF-ßs." Paris 11, 2008. http://www.theses.fr/2008PA11T095.
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Carbonell, Bornay Antoine. "Modèles in-vitro de la dystrophie myotonique de Steinert : les cellules souches induites à la pluripotence." Thesis, Université Laval, 2014. http://www.theses.ulaval.ca/2014/30770/30770.pdf.
Анотація:
La maladie de Steinert est la plus fréquente des dystrophies musculaires de l’adulte. Les mécanismes moléculaires responsables de cette maladie sont en grande partie inconnus. Afin de faire progresser les recherches sur cette maladie, il est essentiel de pouvoir disposer de modèles cellulaires in vitro possédant une grande capacité proliférative. Il est également important de pouvoir disposer de modèles cellulaires non seulement du muscle squelettique, mais aussi du cerveau et du cœur, deux organes touchés par la maladie. La reprogrammation de cellules somatiques humaines en cellules souches induites à la pluripotence (iPS) est une nouvelle technique apparue en 2007 (Yamanaka et al, 2007). Mon projet de recherche a porté sur la reprogrammation de fibroblastes humains DM1 en iPS DM1. Nous avons été en mesure de dériver plusieurs lignées d’iPS à partir de fibroblastes de patients atteints de la DM1. Nous avons été en mesure de réaliser une caractérisation préliminaire d’une des lignées attestant le caractère pluripotent des cellules souches obtenues. Nous avons également été capables de générer des précurseurs de neurones, à partir de ces iPS, exprimant les marqueurs MAP2 et TAU. Les résultats obtenus nous permettent de penser que l’objectif initial de reprogrammer des fibroblastes de patients en iPS a été atteint.Steinert disease is the most common adult muscular dystrophy. Unfortunately, the molecular mechanisms of that disease still misunderstood. To increase the knowledge’s, it is essential to have some cellular models available with a good proliferation capacity. It is also important to be able to establish in vitro models of heart and brain, which are also affected by the disease. Since 2007, it is possible to turn somatic cells into pluripotent stem cells. My project was to differentiate human fibroblasts of patients into induced pluripotent stem cells. We were able to reach that goal. A preliminary characterization was done to show the pluripotency of those cells. We were also able to differentiate those cells into neurons precursors expressing MAP2 and TAU proteins. Those results allow us to think that the original goal of establish induced pluripotent stem cells from Steinert patients is reach.
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Tapponnier, Yann. "Cellules souches pluripotentes induites de lapin : caractérisation moléculaire et fonctionnelle des états naïf et amorcé." Thesis, Lyon 1, 2015. http://www.theses.fr/2015LYO10029/document.
Анотація:
Deux états d'autorenouvellement des cellules souches pluripotentes (PSCs) ont été définis, à savoir les états naïf et amorcé. De nombreuses différences existent entre ces deux états dont la plus marquante est la capacité unique des PSCs à l'état naïf, de coloniser l'embryon préimplantatoire et former des chimères. L'objectif de mon projet doctoral a été d'étudier la pluripotence chez le lapin. Dans ce cadre, j'ai d'abord entrepris de fabriquer et de caractériser des cellules souches pluripotentes induites (RbiPSCs), puis d'évaluer leur capacité à coloniser l'embryon et à former des chimères. Trois lignées de RbiPSCs dépendantes du FGF2 ont été obtenues par reprogrammation de fibroblastes de lapin. Leur caractérisation moléculaire et fonctionnelle a révélé des caractéristiques mixtes, naïves et amorcées. En revanche, sur le plan fonctionnel, elles sont incapables de coloniser l'embryon de lapin, une caractéristique de la pluripotence amorcée. La seconde partie de mon projet doctoral a consisté à reprogrammer des RbiPSCs vers l'état naïf. Dans ce but, j'ai surexprimé KLF2 et KLF4, deux gènes appartenant au réseau de pluripotence naïf, et utilisé les conditions de culture des PSCs de souris. Les cellules ainsi obtenues présentent un profil d'expression génique plus proche de celui de l'ICM de lapin, dû notamment à la réactivation de marqueurs spécifiques de la pluripotence naïve. Enfin, les cellules ainsi reprogrammées présentent une capacité accrue pour la colonisation de l'embryon préimplantatoire de lapin. Mes travaux constituent le premier exemple de reprogrammation de cellules souches pluripotentes vers l'état naïf chez le lapin. Les cellules ainsi produites ouvrent la voie à la fabrication de chimères somatiques et germinalesPluripotent stem cells (PSCs) can self-renew at two distinct states, the naive and primed states. Many differences exist between these two states, the most striking is the unique ability of PSCs naïve to colonize the preimplantation embryo and form chimeras. The purpose of my doctoral project was to study pluripotency in rabbits. In this context, I initially manufactured and characterized induced pluripotent stem cells (RbiPSCs) and then evaluated their ability to colonize the embryo and form chimeras. Three RbiPSCs lines were obtained by rabbit fibroblasts reprogramming. Their molecular characterization revealed mixed characteristics, naïve and primed. However, functionally, they are unable to colonize the rabbit embryo, a feature of primed pluripotency. The second part of my doctoral project was to reprogram RbiPSCs to the naïve state. To this end, I have overexpressed Klf2 and Klf4, two genes belonging to the naïve pluripotency network and the mouse PSCs culture conditions. These new cell lines have a gene expression profile closer to that of the rabbit ICM, particularly due to the reactivation of specific markers of naïve pluripotency. Finally, the reverted cells have an increased capacity of colonization of the preimplantation embryo rabbit. My work represents the first example of pluripotent stem cells reprogramming toward the naive state in rabbits. The cells thus produced pave the way for the production of somatic and germline chimeras
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Blondel, Sophie. "Utilisation des cellules souches induites à la pluripotence pour la modélisation pathologique du syndrome de Hutchinson Gilford." Thesis, Evry-Val d'Essonne, 2013. http://www.theses.fr/2013EVRY0014/document.
Анотація:
La progéria est une maladie génétique rare caractérisée par un vieillissement global, prématuré et accéléré entrainant le décès des enfants atteints aux alentours de l’âge de 13 ans. La compréhension des mécanismes moléculaires à l’origine de ce syndrome ont récemment permis de démarrer deux protocoles d’essai clinique, avec un objectif commun : ralentir la progression de la maladie en bloquant la maturation de la protéine mutée. Cependant, l’identification de nouvelles voies thérapeutiques reste encore, pour cette pathologie, un défi à relever. L’objectif de ce travail de thèse a consisté à utiliser le potentiel unique des cellules souches induites à la pluripotence (iPSCs) pour explorer les mécanismes cellulaires et moléculaires de ce syndrome, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et proposer des pistes innovantes de traitement.La première étape de cette thèse s’est consacrée à la dérivation et la caractérisation des lignées d’iPSCs à partir de cellules de patients atteints par ce syndrome. De manière surprenante,cette étude a mis en évidence une préservation des neurones générés à partir d’iPSCs de patients progeria. L’étude des mécanismes moléculaires à l’origine de cette protection neuronale a par la suite permis d’identifier l’implication d’un microARN, miR-9, capable de réguler l’expression de la progérine et de protéger les neurones de ce vieillissement accéléré. La seconde partie de ces travaux de thèse s’est attachée à explorer le potentiel de ces cellules pour étudier l’efficacité des composés proposés aux patients dans le cadre des différents essais cliniques réalisés ces dernières années. Bien que l’ensemble des molécules testées améliore de façon significative les défauts de structuration de l’enveloppe nucléaire, nos travaux soulignent un certain nombre de différences fonctionnelles tant au niveau de leurs effets sur la prolifération cellulaire que sur la différentiation ostéogénique ou encore le métabolisme énergétique. Enfin, sur la base de ce travail de modélisation pathologique, la dernière partie de ce projet de thèse a eu pour objectif de développer et réaliser un criblage à haut contenu de plus de vingt mille petites molécules pouvant réguler le processus de maturation de la prélamine A. Au cours de cette étude, onze composés à fort potentiel thérapeutique ont été identifiés, dont trois appartenant à la même famille chimique, les mono-aminopyrimidines, ouvrant de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la progériaProgeria is a rare genetic disease characterized by a global, premature and accelerated aging, leading to patient death at average 13 years old. The understanding of the molecular mechanism of this syndrome has recently opened the possibility to start two clinical trials, with one common objective: slow down the disease progression blocking the maturation of the mutated protein. However, the identification of new therapeutic pathway is still a challenge to rise for this pathology. The objective of this PhD thesis has consisted to use the unique potential of induced pluripotent stem cells (iPSCs) to explore cellular and molecular mechanisms of this syndrome, identify new therapautical target and propose innovative trails of treatment. The first step of this thesis was focused on the derivation and the characterization of the iPSCs lines from patient's cells affected by this syndrome. In a surprising manner, this study has highlighted a preservation of neurons generated from progeria patients. The study of the molecular mechanisms led to the identification of the microRNA miR-9 involvement. This latter regulates progerin expression, protecting neurons from accelerated aging. The second part of this work has endeavored to explore the potential of progeria iPSCs to study the efficiency of chemical compounds proposed to patients in the different clinical trials realized these last years. Although the set of tested molecules significantly improved nuclear architecture, differences in proliferation or in osteogenic differentiation or in metabolic energetic have been detected. Finally, on the basis of this pathological modeling work, the last part of this thesis praject was to develop and realize a high content screening of more than twenty thousand small molecules to select drugs which block the maturation process of prelamin A. Eleven molecules with a high therapeutical potential have been identified, with three belonging to the same chemical family, the mono-aminopyrimidins, opening new therapeutical perspectives in progeria
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Mouiseddine, Moubarak. "Utilisation des cellules souches mésenchymateuses humaines dans le traitement des atteintes tissulaires radio-induites." Versailles-St Quentin en Yvelines, 2008. http://www.theses.fr/2008VERS0038.
Анотація:
Les rayonnements ionisants peuvent induire des effets toxiques sur l'organisme. Ils entraînent des modifications physiologiques des tissus et/ou organes pouvant être létales. L'intestin est le premier tissu concerné par ces complications. L'irradiation induit une perturbation de l'absorption intestinale et une perte de l'intégrité de l'intestin. Les effets physiopathologiques radio-induits sur l'intestin peuvent entraîner des effets sur d’autres tissus ou organes comme le foie. Les traitements actuels n'ont qu’une efficacité limitée ou ne sont pas toujours adaptés aux atteintes du système gastro-intestinal. En effet, dans ce type d'atteintes l'hétérogénéité des systèmes concernés et la gravité des lésions compliquent la prescription médicale. Notre but est de montrer que la thérapie cellulaire par les cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines constitue une voix de recours efficace pour ce type d'atteintes. Nos travaux montrent que les CSM sont des cellules multipotentes possédant une expression hétérogènes de molécules. Ces cellules sont capables de s’implanter dans différents tissus dans un modèle de souris irradiée. Nous avons montré que les CSM sont capables de restaurer l’intestin altéré par l’irradiation. De même nous avons observé que via leur action sur l’intestin, les CSM peuvent indirectement rétablir l'intégrité du foieIonising radiation can induce toxic effects on body. They provoke physiological modifications of tissues and organs which can be lethal. Total body irradiation or local abdominal irradiation can induce serious complications. Intestine is the first tissue concerned by these side effects. Radiation induces malabsorption of the intestine and lost of it integrity. Radio-induced physiopatological effects on intestine could lead to distant effects on other tissues and organs such as liver. The actual treatments have a limited efficiency or are not adapted to gastro-intestinal damages. Indeed, in this type of lesions, the heterogeneous systems which are concerned and the gravity of lesions complicate the medical care. Our purpose is to show that cell therapy using human mesenchymal stem cells (MSC) constitutes resolution in this type of illness. Our works show that MSC are multipotent and have heterogeneous expression of molecules. These cells are able to establish its selves in many organs and tissues after injection into irradiated mouse model. Thus we have shown that MSC can prevent the small intestine from radio-induced damages. Indeed we demonstrate that through their action on gut, MSC can indirectly restore hepatic integrity
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Gouder, Laura. "Etude de l'effet de mutations du gène SHANK3 dans les TSA à partir de neurones corticaux humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCB089/document.
Анотація:
Les Troubles du Spectre Autistique (TSA) affectent un individu sur 100 en France et sont caractérisés par des déficits de la communication et des interactions sociales ainsi que par la présence d’intérêts restreints et de comportements répétitifs. Le laboratoire a démontré l’implication de protéines synaptiques dans le développement des TSA et en particulier celle des protéines SHANK. Ces protéines sont des protéines d’échafaudage présentes au niveau de la densité post-synaptique (PSD) des neurones glutamatergiques et interagissant avec différents partenaires. Dans le cadre de mon projet de thèse, nous nous sommes particulièrement intéressés à la protéine SHANK3. Des mutations au sein du gène SHANK3 ont été détectées chez environ 1 à 2% des patients, selon le degré de sévérité du retard mental. Un déficit de SHANK3 altère le fonctionnement synaptique. En effet, des analyses sur modèles de souris invalidées pour le gène SHANK3 ont montré une diminution de la densité des épines dendritiques, de la taille de la densité post-synaptique et de l’expression des partenaires protéiques de SHANK3. Mon modèle principal d’analyse a consisté en la reprogrammation de fibroblastes en cellules pluripotentes induites (iPSC « induced pluripotent stem cells »). Les iPSCs ont ensuite été sélectivement dérivées en neurones corticaux. Nos études se sont focalisées sur l’analyse des conséquences fonctionnelles de mutations de novo du gène SHANK3 retrouvées chez 4 patients à l’état hétérozygote et présentes au sein de l’exon 21. Ces mutations conduisent à un codon stop prématuré. En parallèle, nous avons obtenu des cellules de 4 individus témoins ne présentant aucun trouble psychiatrique identifié. L’analyse a porté d’une part sur des aspects morphologiques et d’autre part sur des aspects fonctionnels. Nous avons étudié l’effet des mutations sur la maturation et les caractéristiques morphologiques des épines dendritiques. Nous avons établi un protocole permettant une analyse détaillée de la morphologie en 3D des épines dendritiques et suivi leur maturation. Un résultat majeur est l’observation d’une diminution de la densité des épines sur les dendrites des neurones pyramidaux issus des patients par rapport aux témoins. Comme attendu, la maturation des épines n’est pas complètement achevée mais varie peu dans son évolution d’un individu à l’autre (témoins vs. patients). Nous avons poursuivi ces études par deux approches fonctionnelles : l’imagerie calcique et des études d’électrophysiologie. Les données électrophysiologiques sont en cours d’analyse. En conclusion, nous avons pu obtenir des cultures de neurones corticaux glutamatergiques et les maintenir en culture durant 40 jours pour effectuer différentes analyses à un stade de maturation suffisant pour la mise en évidence de phénotypes morphologiques et fonctionnels. Nous avons principalement observé une diminution de des densités synaptiques et de maturation des épines dendritiques au sein des neurones issus de patients liée à des altérations d’oscillations calciques spontanéesAutism Spectrum Disorders (ASD) is a neurodevelopmental disorder affecting 1% of population ; characterised by impairments in social interaction and reciprocal communication as well as repetitive and stereotyped behaviors. The work of the laboratory lead to the identification of several genes associated with ASD, among which genes of the synaptic pathway such as SHANK. The SHANK proteins are scaffolding proteins of the post-synaptic density (PSD) of glutamatergic neurons and interact with several partners. In my thesis project, we were particularly interested in SHANK3 mutations. First, Shank3 mutations represent up to 2.12% of ASD cases with moderate to high ID. A SHANK3 deficit leads to the alteration of the synaptic functioning. Indeed, studies of mice KO for SHANK3 gene showed a decrease of the dendritic spines density, of the PSD size and of the expression of SHANK3 partners. My principal model of analysis consisted in the reprogrammation of fibroblasts into induced pluripotent stem cells (iPSCs). Then, the iPSCs were selectively derived into cortical neurons. Our studies were focus on the analysis of functional consequences of SHANK3 de novo mutations found within 4 patients. These mutations are heterozygous and within the exon 21. They result in a premature stop codon. In parallel, we obtained cells from 4 healthy individuals. The work was about the morphological and functional aspects. We analysed the mutations effects on the maturation and morphological caracteristics of the dendritic spines. We finalized a protocol that enabled a detailed analysis of the spine dendritic 3D morphology and their maturation follow-up. A important result was the observation of a decrease of the spine density on pyramidal neurons dendrites from patients compared to those from controls. Moreover, spines maturation was not fully accomplished but was not much different in its evolution between individuals (controls vs patients). Then, we used two functional skills : calcium imaging and electrophysiological experiments. The electrophysiological data are in progress. To conclude, we succeeded in the obtention of glutamatergic cortical neurons and to maintain them in culture during 40 days in order to realize some analysis at a sufficient maturation stage to observe morphological and functional phenotypes. We mainly observed a decrease of the dendritic spines density and maturation for the neurons from patients, with alterations of the spontaneous calcium oscillations
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Luce, Eléanor. "Hépatocytes différenciés à partir de cellules souches pluripotentes induites : modèle pour la thérapie cellulaire et génique autologue de l'hémophilie B et modèle préclinique chez le primate." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLS520/document.
Анотація:
Ce projet de thèse vise à modéliser puis à apporter la preuve de concept d’une thérapie cellulaire et génique autologue de maladies héréditaires du foie par la transplantation d’hépatocytes différenciés à partir des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) spécifiques du patient, une fois celles-ci corrigées du défaut génétique. L’hémophilie B (HB) est une maladie héréditaire causée par une mutation du gène F9, codant le facteur IX (FIX) de la coagulation synthétisé dans le foie par les hépatocytes. Des fibroblastes d’un patient porteur de la « mutation royale » ont été reprogrammés en iPSC puis différenciés en hépatocytes. L’étude de l’ARNm du F9 par séquençage haut débit a confirmé la présence d’un site d’épissage anormal codant une protéine tronquée. D’autres iPSC ont été obtenues à partir des cellules d’un second patient HB exprimant un FIX inactif. Après insertion ciblée d’une cassette thérapeutique codant le FIX dans un site génomique sûr à l’aide d’endonucléases artificielles (CRISPR/Cas9), nous avons différencié les iPSC corrigées et non corrigées en hépatocytes (respectivement corr-HB-Heps et HB-Heps) et confirmé une expression plus importante de l’ARNm du F9 et de la protéine FIX dans les corr-HB-Heps. En revanche, nous n’avons pas détecté d’activité du FIX transgénique sans doute à cause d’une différenciation incomplète des hépatocytes. Nous avons alors développé un protocole de différenciation en sphéroïdes permettant une différenciation plus efficace confirmée aux niveaux ARN et protéine FIX. L’analyse de l’activité du FIX produit nous permettra de valider la correction in vitro avant de la valider in vivo en transplantant les corr-HB-Heps dans un modèle de souris F9KO. Finalement, la dernière partie de ce travail a consisté à développer un protocole de différenciation d’iPSC de singe en hépatocytes en vue d’une transplantation autologue dans le foie de l’animal donneur pour valider la faisabilité et la sécurité de cette approche chez le gros animalThis PhD project aims to model and to bring a proof of concept for autologous cell/gene therapy of inherited liver diseases by transplanting hepatocytes differentiated from patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs), after correction of the genetic defect. Hemophilia B (HB) is an inherited disease caused by a mutation in the F9 gene encoding clotting factor IX (FIX), synthesized in the liver by hepatocytes. Fibroblasts of a patient with the "royal mutation" were reprogrammed in iPSCs then differentiated into hepatocytes. The study of the F9 mRNA by high-throughput sequencing confirmed the presence of an abnormal splice site leading to a truncated protein explaining hemophilia. Other iPSCs were obtained and characterized from the cells of a second HB patient expressing an inactive FIX. By targeting in these iPSCs the insertion of a therapeutic cassette encoding FIX into a safe harbor site using artificial endonucleases (CRISPR/Cas9), we differentiated the corrected and non-corrected iPSC into hepatocytes. Quantitative analyzes confirmed a higher expression of F9 mRNA and FIX protein in the corrected clones. In contrast, we did not detect transgenic FIX activity due to a lack of post-translational modifications necessary for FIX activity. We then developed a protocol of differentiation in spheroids quantitatively more efficient to produce FIX. Detection of FIX activity will validate our in vitro approach before validation in vivo by transplanting the corrected hepatocytes in a F9KO mouse model. Finally, the last part of this work consisted in the development of a differentiation protocol of nonhuman primate iPSCs into hepatocytes for autologous transplantation into the liver of the donor animal in order to validate the feasibility and the safety of such an approach in the large animal
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Laaref, Abdelhamid Mahdi. "Contribution of U2AF1, NCBP1 and eIF4A3 to the control of pluripotency maintenance and cell fate determination." Thesis, Montpellier, 2017. http://www.theses.fr/2017MONTT146.
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Contribution de U2AF1, NCBP1 et eIF4A3 dans le contrôle du maintien de la pluripotence et le devenir cellulaire.Les mécanismes de maturation du transcrit primaire peuvent profondément affecter la diversité et la fonction des protéines produites à partir d’un gène unique dans le but de mettre en place un programme complexe impliqué dans le maintien de pluripotence et/ou l’initiation de la différenciation des cellules souches humaines. Les réseaux transcriptionnels régulant la pluripotence et la différenciation ont été intensément étudiés contrairement au rôle de l’épissage alternatif dans ces mécanismes, rôle qui pour le moment reste mal compris et pour lequel il n’existe que très peux d’exemples de groupes de gènes subissant un changement général de variant d’épissage aboutissant à la modification du devenir cellulaire. Notre objectif est d’identifier les composés essentiels du spliceosome qui sont impliqués dans le maintien de la pluripotence et la différenciation précoce dans les trois feuillets embryonnaires et d’explorer leurs rôles dans ces processus. Via l’analyse de données de séquençage d’ARN nous avons identifié plusieurs facteurs d’épissage différentiellement exprimés entre les cellules souches et les trois feuillets embryonnaires. Parmi ces facteurs nous focaliserons notre étude sur les facteurs préférentiellement surexprimés dans les cellules souches, qui par conséquent devraient y jouer un rôle primordial. Les candidats sélectionnés, U2AF1, NCBP1 et eIF4A3 ont été déplétés dans des cellules souches en utilisant un système shRNA inductible puis une analyse de séquençage ARN à haut débit a été effectuée pour comprendre les changements du transcriptome induits par ces déplétions. La déplétion d’U2AF1 entraine un changement majeur de l’expression de gènes impliqués dans le développement alors que la déplétion de NCBP1 et eIF4A3 entraine un changement d’expression de gènes impliqués dans le métabolisme, le remodelage de la chromatine et le développement. Des analyses complémentaires ont permis de mettre en lumière une régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle des gènes différentiellement exprimés dans les conditions étudiées. L’épissage alternatif a pour ça part été modifié par les trois déplétions de manière individuelle. Un programme d’épissage tissu spécifique a été associé à chaque candidat et les conséquences de chaque programme seront décrites au niveau du contrôle qualité de l’ARNm et de la synthèse protéique.Nos résultats construisent une nouvelle vision concernant le rôle des composés essentiels du spliceosome dans le contrôle du devenir cellulaire à travers la modulation de l’épissage alternatif. Cet apport ajoute une nouvelle variable au contrôle de l’expression des gènes et permettra de mieux comprendre les mécanismes du développement précoce et de la diversité tissulaireContribution of U2AF1, NCBP1 and eIF4A3 to the control of pluripotency maintenance and cell fate determination.Alternative pathways for processing the primary transcript can profoundly affect the diversity and function of the protein products that are generated from a single gene to set up complex programs involved in pluripotency and/or differentiation of human Embryonic Stem Cells (hESCs). While transcriptional networks regulating pluripotency and differentiation has been intensively studied, the role of Alternative Splicing (AS) in this process is not yet completely understood and clear examples of concerted switching of multiple genes from one isoform to another have not been demonstrated. Our goal is to identify Core Spliceosomal Factors (CSF), involved in the control of pluripotency maintenance, early differentiation into the three germ layers, and to explore their role in these processes. By RNA-Seq data analysis, we have identified several splicing factors that are differentially expressed between pluripotent stem cells and the three of the germ layers. Among these identified candidates, we focused on the factors that are more highly expressed in pluripotent stem cells, thereby they play a specific role in pluripotency maintenance. The selected candidates, U2AF1, NCBP1 and eIF4A3 were depleted in pluripotent stem cells using inducible shRNA system and RNA-Seq analyzes have been performed to understand transcriptomic changes induced by these depletions. U2AF1 depletion causes a major switch of developmental genes expression, while NCBP1 and eIF4A3 depletions regulate the expression of genes involved in metabolism, chromatin remodeling and development. Further analysis highlighted a transcriptional and post-transcriptional regulation of differentially expressed genes. Alternative Splicing (AS) were shown to be affected by both depletions. A tissue specific AS program was associated to each of the candidates and the consequences of these changes on mRNA quality control and protein synthesis will be described.Our results build a new idea regarding the role of Core Spliceosomal Factors in cell fate control trough the modulation of AS. This knowledge adds a new layer of gene expression control and will allow a better understanding of early development mechanisms and tissue diversity
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Kilens, Stéphanie. "Direct reprogramming of somatic cells into human induced naive pluripotent stem cells, a novel model of preimplantation epiblast cells." Thesis, Nantes, 2017. http://www.theses.fr/2017NANT1024/document.
Анотація:
Les cellules souches à pluripotence induite (iPSCs) ont considérablement impacté la biologie du développement ainsi que la médecine régénérative, particulièrement parce qu’elles sont une alternative à l’utilisation de cellules d’origine embryonnaire mais surtout parce qu’elles offrent la possibilité de générer des cellules souches pluripotentes spécifiques du patient. Cependant, les protocoles de reprogrammation conventionnels génèrent des iPSCs humaines (hiPSCs) dans un état développemental avancé ou état amorcé, limitant leur utilisation à la modélisation du développement humain post-implantatoire. Ainsi, il est devenu nécessaire d’identifier des hiPSCs qui soient dans un état naïf, représentatif de l’épiblaste de l’embryon humain pré-implantatoire. Nous avons développé un protocole permettant de reprogrammer des cellules somatiques directement en hiPSCs naives par surexpression d’OKMS dans des conditions de culture spécifiques, sans transiter par un état de pluripotence amorcé. Ce protocole permet, en outre, de générer en parallèle des lignées isogéniques arborant différentes potentialités dont l’état amorcé représentant un contrôle majeur. Pour évaluer les hiPSCs naives générées, nous les avons comparé à l’épiblaste pré-implantatoire humain ce qui a montré une remarquable concordance au regard de leur transcriptome, leur dépendance à la respiration mitochondriale, la méthylation de leur ADN ainsi qu’au status du chromosome X. En somme, ces résultats sont essentiels pour comprendre la régulation de la pluripotence au cours du développement préimplantatoire et ouvrent de nouvelles perspectives pour la modélisation de maladies ainsi qu’en médecine régénérativeInduced pluripotent stem cells (iPSCs) have considerably impacted human developmental biology and regenerative medicine, notably because they circumvent the use of cells from embryonic origin and offer the potential to generate patient-specific pluripotent stem cells. However, conventional reprogramming protocols produce developmentally advanced, or primed, human iPSCs (hiPSCs), restricting their use to post-implantation human development modelling. Hence, there is a need for hiPSCs resembling preimplantation naive epiblast. Here, we developed a method to generate naive hiPSCs directly from somatic cells using OKMS overexpression and specific culture conditions without transitioning through a primed pluripotent state. Besides, this protocol enables parallel generation of isogenic lines bearing different potencies among which the primed state as it is a major control line. To evaluate the generated naive hiPSCs, we benchmarked them against human preimplantation epiblast and reveal a remarkable concordance in their transcriptome, dependency on mitochondrial respiration, DNA methylation and X chromosome status. Collectively, these results are essential for the understanding of pluripotency regulation throughout preimplantation development and will generate new opportunities for disease modeling and regenerative medicine
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Corbineau, Sébastien. "Génération de progéniteurs hépatiques dérivés de cellules souches : application à l'hypercholestérolémie familiale." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00684386.
Анотація:
La transplantation d'hépatocytes représente une alternative à la transplantation hépatique pour le traitement de certaines maladies métaboliques dont l'hypercholestérolémie familiale. Les cellules souches embryonnaires (ES) et les cellules souches pluripotentes induites (iPS) humaines représentent de nouvelles sources de cellules hépatiques. Nous avons mis au point une approche de différenciation des cellules souches humaines en cellules hépatiques et généré ainsi des cellules dérivées de cellules iPS de patients atteints d'hypercholestérolémie familiale.
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Julita, Emeline. "Modélisation de la dysfonction des neurones dopaminergiques associée à la maladie de Lesch-Nyhan à l'aide des cellules souches induites à la pluripotence." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLE047.
Анотація:
La maladie de Lesch-Nyhan (MLN) est une maladie rare dont la prévalence est estimée à une naissance sur 380 000. Il s’agit d’une maladie métabolique d’origine génétique liée au chromosome X, impliquant le gène de la HGPRT (hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl-transférase). Les mutations dans ce gène entrainent un déficit d’activité de l’enzyme qui joue un rôle central dans le métabolisme des purines. Cette baisse d’activité provoque un défaut de fonctionnement de la voie de recyclage des purines induisant l’accumulation d’acide urique dans les articulations (goutte) et les reins (lithiase) qui peut être contrôlée par la prise d’allopurinol. En revanche, ces symptômes sont généralement accompagnés de troubles neurologiques quant à eux encore totalement inexpliqués et non traités. Ces derniers se traduisent par un handicap moteur important avec des mouvements anormaux (dystonie) et des troubles du tonus (hypotonie axiale). Dans les cas les plus graves des troubles du comportement peuvent également survenir se manifestant par des évènements importants d'automutilation (morsure des lèvres et des doigts). Des études menées en imagerie cérébrale, ont permis d’identifier chez les malades une diminution de la concentration cérébrale en dopamine mais aucune étude n’a encore pu lier de façon évidente le déficit en dopamine et la HGPRT, rendant difficile le développement de thérapies efficaces. L’objectif de ce travail a été de tirer avantage des propriétés d’auto renouvellement et de pluripotence des cellules souches induites à la pluripotence humaines (iPSC) pour produire d'authentiques neurones dopaminergiques (nDA) puis de les utiliser afin de déterminer dans quelle mesure la HGPRT est essentielle au développement et à l’homéostasie des nDA. Pour cela nous avons sélectionnés des fibroblastes obtenus à partir de biopsie de peau d’enfants atteints par la MLN que nous avons reprogrammé en iPSC. Ces iPSC ont été caractérisées et en particulier, l’expression protéique et l’activité enzymatique de la HGPRT a été contrôlée afin de valider notre modèle pathologique. Un protocole de différenciation de neurones dopaminergiques à partir d’iPSC a ensuite été mis au point pour permettre l’étude des différents stades de développement des neurones DA. Celui-ci permet d’obtenir des précurseurs exprimant pour 60% des cellules les marqueurs caractéristiques des précurseurs du mésencéphale ventral (MV), tout en respectant les différentes étapes clés du développement des nDA. Après l’induction de la différenciation des précurseurs en neurones, la population neuronale est composée d’au moins 20% de nDA exprimant les deux enzymes de la voie de synthèse de la dopamine TH et AADC. Ces différentes étapes du développement des nDA ont ensuite été analysées en comparant des cellules porteuses de mutations associées à la MLN et des cellules contrôles. Une anomalie neuro-développementale survenant à un stade précoce de la formation des nDA a été identifiée. Lors de l’étape ultime de différenciation, la proportion de précurseurs du MV capables de sortir du cycle cellulaire et donnant des neurones matures est plus faible dans les cultures de cellules porteuses des mutations MLN. Cette étude a permis dans un premier temps de démontrer qu’il était possible de modéliser une maladie impactant un gène essentiel dans le métabolisme à l’aide des iPSC. De plus, nous avons montré qu’il est possible d’identifier l’étape critique dans la genèse des nDA en utilisant des neurones humains dérivés d’iPSC issus d’enfants atteints de MLN. Cette approche apporte ainsi une meilleure compréhension sur les mécanismes responsables de la pathologie, et de nouveaux axes de recherche pour des approches thérapeutiquesLesch-Nyhan disease (LND) is a rare genetic disease with a prevalence estimated to 1:380,000. LND is a metabolic Xchromosome linked disorder that essentially affects boys and involves HGPRT gene (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase). Mutations in this gene result in a deficit of enzyme activity that plays a central role in the metabolism of purines. This activity deficiency induces a dysfunction on purine recycling pathway and promotes accumulation of uric acid in the joints (gout) and kidneys (stones) controlled using allopurinol. Next to these metabolic symptoms are neurological disorders which are not understood and efficiently controlled. These involve abnormal movements (dystonia) and low tonus (axial hypotonia). A unique feature of LND is the occurrence of self-injurious behaviors known as SIB (biting of lips and fingers). Brain imaging studies have revealed in LND patient a decrease of cerebral dopamine concentration but no study has yet been able to clearly link dopamine defect and HGPRT loss of activity, making it difficult to develop effective therapies. The aim of my study was to take advantage of the self-renewal and pluripotency properties of human induced pluripotent stem cells (iPSC) to produce dopaminergic neurons (nDA), then to use them to determine in which extend HGPRT is essential to the development and homeostasis of nDA. To that purpose, we selected fibroblasts obtained from skin biopsies of LND children that we have reprogrammed into iPSC. These iPSC were characterized and in particular, protein expression and enzymatic activity of HGPRT was assessed to validate our pathological model. We developed a protocol to differentiate dopaminergic neurons from iPSC to allow the study of different stages of nDA development. It provides mature precursors of nDA, expressing the typical marker of ventral midbrain (VM), while respecting the different key stages of nDA development. Upon terminal differentiation, these precursors produce at least 20% of nDA that express the two main enzymes of the dopamine synthesis pathway, namely TH and AADC. These different stages of nDA development were analyzed comparing LND and control IPSC. Neurodevelopmental abnormality occurring at an early stage of nDA formation was identified. At the final stage of differentiation, the proportion of MV precursors able to exit the cell cycle and differentiate as mature neurons is lower in LND culture compared to controls. This study provided evidences that it is possible to model a metabolic disease with iPSC and that they are essential tools to study neurodevelopmental disorders. This approach provides a better understanding of mechanisms responsible for the disease, and new research directions for therapeutic approaches
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Saliba, Joseph. "Modélisation des néoplasmes myéloprolifératifs sporadiques et familiaux avec les cellules de patients induites à la pluripotence." Thesis, Paris 11, 2013. http://www.theses.fr/2013PA11T061.
Анотація:
Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des maladies acquises touchant la cellule souche hématopoïétique et qui aboutissent à une hyperproduction de cellules sanguines dont le phénotype dépend du type du NMP. La mutation la plus proéminente des NMP est JAK2V617F. Elle peut être associée à différents NMP sporadiques et familiaux.Une des problématiques, non résolue, des NMP est de comprendre comment une même mutation JAK2V617F peut donner plusieurs maladies. Notre hypothèse est que le phénotype observé pourrait dépendre du nombre de copies de JAK2V617F. Une autre inconnue concerne la cause génétique des formes familiales.Pour ces raisons, nous avons modélisé des NMP sporadiques et un cas familial par les iPS. Cette approche devrait nous permettre d’une part, de comparer les effets de JAK2V617F à l’état hétérozygote et homozygote sur l’hématopoïèse et d’autre part, d’avancer dans la compréhension des effets d’une duplication de 5 gènes que nous avons identifiée, par une approche de génétique, comme un facteur de susceptibilité chez 2 familles.Dans la première partie du travail, concernant la modélisation des NMP sporadiques, nous avons montré que JAK2V617F augmente la prolifération des cellules myéloïdes obtenues à partir des iPS. D’autre part, nous avons pu mettre en évidence une différence marquée dans l’hypersensibilité à la TPO et à l’EPO entre les lignées hétérozygotes et homozygotes pour JAK2V617F permettant d’expliquer le phénotype des PV et des TE. Dans la deuxième partie concernant les NMP familiaux, nous avons pu mettre en évidence un phénotype spécifique attribuable à la seule duplication. Grace à ce modèle, nous allons pouvoir identifier le(s) gène(s) responsable(s) du phénotype. Ce travail apporte la preuve de concept que les iPS sont un bon outil pour modéliser les NMP sporadiques et familiaux et qu’elles peuvent servir comme outils de criblage de petites molécules développées à des fins thérapeutiquesMyeloproliferative neoplasms (MPN) are clonal hematologic diseases which lead to an overproduction of blood cells. The affected myeloid lineage depends on the type of MPN. JAK2V617F is the most predominant mutation in MPN and can be associated with various sporadic and familial cases.One main issue to address in MPN is to understand how a single mutation JAK2V617F can give rise to several diseases. Our hypothesis is that this phenotypic heterogeneity might be due to the JAK2V617F gene dosage. Another goal is to identify the genetic cause of familial MPN.For these reasons, we modeled sporadic and familial MPN cases with iPS technology. This approach allowed us i) to compare the impact of heterozygous and homozygous JAK2V617F mutation on hematopoiesis and ii) to get insight into the effects of a 5 genes duplication that we identified as a susceptibility locus uncovered by a genetic approach in 2 families.In the first part of the work concerning sporadic MPN modeling, we showed that JAK2V617F increases iPS myeloid potential. Furthermore, we showed a marked difference in the TPO and EPO hypersensitivity between heterozygous and homozygous JAK2V617F iPS cell lines that could be linked to the difference between PV and ET. In the second part of the work, we demonstrated a specific phenotype due to the sole duplication. This model will allow us to identify the gene(s) responsible of the phenotype. This study brings the proof of concept that iPS can be used for sporadic and familial MPN modeling and drug screening
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Zhou, YI-Ping. "Lignées de cellules souches pluripotentes humaines : contribution à l'étude des contrôles de la balance pluripotence / différenciation par la super-famille des TGF-ßs." Paris 11, 2009. http://www.theses.fr/2009PA11T041.
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Muller, Quentin Philippe Sylvain. "Développement par génie tissulaire d’un modèle de peau humaine innervée, vascularisée et immunocompétente pour l’étude des réactions inflammatoires cutanées." Thesis, Strasbourg, 2018. http://www.theses.fr/2018STRAJ061.
Анотація:
Les réactions immunitaires de la peau sont initiées par les cellules dendritiques cutanées (dendritic cells, DCs). L'effet potentiellement sensibilisateur d'un composé peut être prédit in vitro en utilisant des monocytes humains différenciés en DCs (MonoDCs). Cependant, ces modèles simplistes restent imprécis car l'activation des DCs cutanés par les sensibilisateurs peut être déclenchée ou modulée par des interactions microenvironnementales avec de multiples types de cellules non immunitaires. Notre objectif est de développer une peau immunocompétente qui combinera des MonoDCs avec tous les éléments structurels et fonctionnels de la peau, c'est-à-dire une barrière épidermique posée sur un derme contenant une pseudo-vascularisation et des neurones nociceptifs. Une matrice de collagène a été ensemencée avec des fibroblastes et des cellules endothéliales, puis avec des précurseurs de fibres nerveuses dérivées soit de l'iPSC humaine, soit de la DRG embryonnaire murins. Enfin, nous avons introduit les MonoDC et les kératinocytes. Nous avons observé que les neurones différenciés in situ innervent l'épiderme comme observé habituellement dans la peau humaine normale. De plus, les neurones dérivées d’iPSCs, expriment neuropeptides et canaux calcique spécifiques des fibres nociceptives. Enfin, les Mono-DC intégrés au modèle restent stable pendant toute la durée nécessaire à la formation de l’épiderme et peuvent être stimulé. Le modèle sera utilisé pour prédire le potentiel irritant des composés chimiques et l'impact de l’innervation nociceptive sur l'activation des DCsImmune reactions in the skin are initiated by the cutaneous dendritic cells (DCs). The potential sensitizing effect of a compound can be predicted in vitro using human monocytes differentiated into DCs (Mono-DCs). However, these simplistic models remain inaccurate because the activation of cutaneous DCs by sensitizers may be triggered or modulated by microenvironmental interactions with multiple types of non-immune cells. Our goal is to develop an immunocompetent human tissue-engineered skin that will combine DCs with all structural and functional element of the skin, i.e. an epidermal barrier laid upon a dermis containing a pseudo-vascularization and nociceptive neurons. Collagen matrix was seeded with fibroblasts and endothelial cells, then with precursors of nerve fibers derived from either human iPSC or murine embryonic DRG. Finally, we introduced Mono-DCs and keratinocytes. We observed that in situ differentiated neurons grow axons towards the epidermis as usually observed in normal human skin. What's more, the neurons derive from iPSC, express neuropeptides and calcium channel as normal nociceptive fibers. Moreover, Mono-DCs settled as expected beneath the epidermis and remained sessile to stimulation for several weeks. The model will be used to predict the irritant potential of chemical compounds, and the impact of nerves on DC activation
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Bouckenheimer, Julien. "Rôle fonctionnel des longs ARN non codants dans l'adaptation et la pluripotence des cellules souches en culture." Thesis, Montpellier, 2016. http://www.theses.fr/2016MONT3505.
Анотація:
Les applications des cellules souches pluripotentes humaines (CSP) dans le domaine biomédical sont particulièrement prometteuses, aussi bien au niveau expérimental qu’au niveau clinique. Leur utilisation comme source inépuisable de cellules permettant de tester et développer de nouvelles molécules thérapeutiques (notamment par modélisation de pathologies in vitro, criblage haut-débit et tests de cytotoxicité) s’ajoute à l’important potentiel qu’elles présentent en médecine régénérative et en thérapie cellulaire. Utilisables comme matériel biologique permettant de restaurer partiellement ou totalement un organe ou un tissu défaillant, il reste essentiel de vérifier l’intégrité génétique des lignées cellulaires utilisées afin de garantir une utilisation sécurisée pour le patient. Parmi les facteurs responsables de l’apparition d’anomalies génétiques chez les CSP, les conditions cultures jouent un rôle essentiel. Des techniques de culture inadaptées peuvent facilement provoquer l’émergence d’une instabilité génomique. Toute altération doit être détectée et documentée afin de pouvoir définir des critères d’acceptation préalable à leur utilisation clinique.Les CSP sont des cellules particulièrement sensibles au stress qui peut résulter de techniques de repiquage inappropriées. La dérive génétique qui découle de ce stress peut être précoce et apparaître dès les premiers passages des lignées cultivées. Notre équipe a pu tester de nombreuses méthodes de repiquage sur différentes lignées cellulaires pluripotentes. Nous avons notamment observé que des anomalies génétiques majeures caryotypiques (trisomies) et infra-caryotypiques (SNPs) ainsi que des changements phénotypiques (survie augmentée, acquisition de mobilité) apparaissaient rapidement suite à l’utilisation de techniques de repiquage basées sur l’utilisation d’enzyme de dissociation (TryPLE). Ces altérations apparaissent dans des lignées qui s’adaptent progressivement à la dissociation en cellules uniques (dissociation « single-cell ») provoquées par ces enzymes.Notre équipe étudie les conséquences cellulaires liées à ce phénomène d’adaptation des CSP provoquée par la dissociation « single-cell ». Grâce à des techniques de séquençage dernière génération (RNA-Seq), nous avons comparé les profils transcriptomiques de CSP repiquées par des techniques standard (comme le passage mécanique) et par des techniques basées sur la dissociation « single-cell » (comme le passage enzymatique par TryPLE). Cette comparaison a montré au niveau transcriptionnel une surexpression spectaculaire d’ARNs non codants appartenant à une classe récemment décrite : les longs ARNs non codants (lncRNAs).L’objectif principal de ce travail de thèse a été d’évaluer le niveau d’implication de ces lncRNAs dans le processus d’adaptation des CSP en culture, et leur rôle fonctionnel potentiel. Nous avons ainsi dans un premier temps déterminé in silico quels lncRNAs étaient différentiellement exprimés dans les CSP adaptées, et après validation expérimentale par biologie moléculaire des candidats les plus prometteurs, nous avons utilisé des tests fonctionnels (notamment par RNA interférence (siRNA)) afin de déterminer le rôle de ces lncRNAs dans la machinerie cellulaire et la pluripotence des CSP. Autour de ce projet principal, nous avons essayé de comprendre les mécanismes régissant les changements phénotypiques et comportementaux provoquées par la dissociation « single-cell ». Nous avons notamment pu suggérer la mise en place d’un phénomène de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) chez des CSP dissociées. Enfin, l’attractivité que représente un sujet d’étude récent comme les lncRNAs et la disponibilité croissante de publications les concernant nous ont poussé à publier une revue approfondie ainsi qu’une méta-analyse sur l’implication des longs ARN non codants dans le développement précoce de l’embryon et dans les cellules souches pluripotentesThe actual and future applications of human pluripotent stem cells (PSC) in the biomedical field are highly promising. Their use for the discovery of new therapeutic drugs through the development of high-throughput screening tests, cytotoxicity tests and in vitro disease modeling has been added to their tremendous interests in regenerative medicine and cellular therapy. As a source of biological material that can be used to restore partially or totally the lost functions of a damaged organ or tissue, or as a source of normal cells to study human development or test putative new drugs, their genomic integrity has to be thoroughly assessed. Therefore, an effective optimization of their culture conditions has to be considered, in order to control the absence of genomic instability and prevent their potential emergence. Any genetic or epigenetic alteration resulting from cell culturing must be detected in order to define and characterize acceptance criteria for scientific and medical purposes.PSC are particularly sensitive to stress resulting from unappropriated passaging techniques, which cause rapid genetic drift. Indeed, our team observed that many genomic abnormalities arise from aggressive single cell, enzymatic based, passaging methods, and that substantial phenotypical changes such as increased survival after cell dissociation and variation in cell shape can then occur.In order to understand the mechanisms governing the emergence of those adverse alterations, the team focused on the consequences resulting from the adaptation of PSC to single-cell dissociation. By using new generation sequencing techniques as RNA-Seq, we compared transcriptomics of PSC passaged by standard techniques (such as mechanical passaging) versus single-cell enzymatic dissociation (such as TRyPLE-based single-cell passaging). This comparison showed that the most striking difference in the gene expression pattern between adapted and non adapted cells concerned the dramatic overexpression of RNAs from a recently discovered class: long non-coding RNAs (lncRNAs).The aim of this thesis work was to determine to which extent some of these lncRNAs were functionally linked to adaptation of PSC. In order to address this matter, we first investigated in silico which lncRNAs were upregulated by single-cell dissociation, and after experimental validation of lncRNA candidates by molecular biology, we performed functional in vitro analysis (notably by siRNA-mediated loss of function) and sought their cellular localization in order to decipher their role in the cellular machinery and their level of implication. Beside this main project, other auxiliary projects were grafted. The observation of major changes in cell phenotype and behavior led to the investigation of the global mechanisms governing these modifications, underlining the potential role of epithelial-to-mesenchymal transition provoked by single-cell dissociation. Finally, the global attractiveness of lncRNAs and the emergence of exponential documentation concerning non-coding RNAs prompted the writing of an extensive review and meta-analysis concerning the implications of lncRNAs during embryo development and in pluripotent stem cells
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Ferratge, Ségolène. "Immaturité, sénescence et hiérarchie fonctionnelle des progéniteurs endothéliaux humains." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCC221/document.
Анотація:
Les ECFC (endothelial colony forming cells) sont considérées comme des cellules endothéliales dérivées des progéniteurs endothéliaux circulants in vitro. Les capacités angiogéniques de ces cellules leur confère un intérêt thérapeutique pour traiter les lésions ischémiques résultant des pathologies cardio-vasculaires. Les ECFC isolées à partir de sang périphérique adulte (ECFC-SPA) sont moins fonctionnelles et perdent leur capacité à former des vaisseaux sanguins persistants contrairement aux ECFC de sang de cordon ombilical (ECFC-SC). Une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans cette dysfonction est requise pour comprendre et prévenir l’altération des ECFC-SPA au cours du vieillissement en vue d’une stratégie autologue. De même, l’utilisation des ECFC-SC en thérapie cellulaire hétérologue est conditionnée par une caractérisation fonctionnelle plus poussée de cette source de cellules angiogéniques.Ce travail de thèse a permis d’établir un profil précis du rendement en ECFC du SPA et du SC. Aucune corrélation avec l’âge du donneur n’a été mise en évidence. Les ECFC-SC sont particulièrement hétérogènes, générant de 0 à plus de 100 colonies. Les échantillons générant moins de 10 colonies présentent une altération fonctionnelle similaire aux ECFC-SPA, associée à une perte de leur caractère immature. Les ECFC-SC les plus clonogéniques sont également les plus angiogéniques. La clonogénicité primaire des ECFC apparait donc comme le marqueur le plus précoce accessible au cours de leur culture permettant de prédire leur future fonctionnalité. Ce pourrait être un critère pertinent pour hiérarchiser et sélectionner les ECFC-SC les plus efficaces en thérapie cellulaireECFCs (endothelial colony forming cells) are derived from endothelial progenitor cells in vitro. Angiogenic capacity of these cells confers a therapeutic benefit for treating ischemic injuries resulting from cardiovascular pathologies. ECFC isolated from peripheral blood adult (AB-ECFC) are less functional and lose their ability to form long lasting blood vessels in contrast to umbilical cord blood ECFC (CB-ECFC). A better understanding of mechanisms involved in this dysfunction is required to understand and prevent alteration of AB-ECFC during aging for autologous strategy. Similarly, the use of CB-ECFC in heterologous cell therapy is conditioned by further functional characterization of this source of angiogenic cells.This thesis has established a specific profile of ECFC yield from adult and cord blood. No correlation with donor age has been demonstrated. The CB-ECFC are particularly heterogeneous, generating from 0 to more than 100 colonies. Samples generating less than 10 colonies have a similar dysfunction than AB-ECFC, associated with loss of their immature features. The most clonogenic CB-ECFC are also the most angiogenic. The initial clonogenicity of ECFC therefore appears to be the earliest marker available during their culture to predict their future functionality. It could be a relevant criterion for classifying and selecting the most effective CB-ECFC cell therapy
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Nassor, Férid. "Etude de mécanismes de type prion impliqués dans la maladie d’Alzheimer sur un modèle de mini-cerveaux humains avec exploration par microscopie 3D." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019SACLS105.
Анотація:
Les principales maladies neurodégénératives humaines, qui reposent toutes sur des mécanismes de type prion (auto-propagation d’agrégats protéiques pathogéniques), représentent un risque sociétal majeur avec une augmentation de leur prévalence directement corrélée avec l’augmentation de la longévité de la population mondiale. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif ni aucun modèle expérimental suffisamment pertinent pour ces maladies.L'objectif de ce travail a été d'utiliser le potentiel des mini-cerveaux humains comme modèle in vitro auto-assemblé en trois dimensions (3D) capable de restituer la complexité du cortex cérébral et d’étudier les mécanismes de type prion en développant une méthodologie de validation basée sur la microscopie 3D. Ces nouvelles structures 3D qui peuvent être obtenues à partir de cellules adultes reprogrammées de patients en cellules souches pluripotentes induites (iPSC), offrent des possibilités uniques pour accéder, observer et perturber les processus biologiques dans le cerveau humain sans les biais ni les complications des modèles animaux ou des échantillons de cerveau humain ex vivo. Ce modèle permet notamment d’observer l’apparition d’agrégats d’Aß et de Tau phosphorylée, deux protéines qui s’accumulent et se propagent de cellule en cellule dans la maladie d’Alzheimer.Nous avons été en mesure de rendre le modèle des mini-cerveaux compatible avec une future approche de criblage de molécules thérapeutiques en modifiant la méthodologie de différenciation pour augmenter leur rendement de production. D’autre part, nous avons pu tester différentes modalités de modélisation pour la Maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la Démence Fronto-Temporale et la maladie de Creutzfeldt-Jakob : à l’aide de molécules d’induction chimique, à l’aide de cellules issues de patients, par modification génétique et par mise en contact de matériel infectieux. Ces différentes approches nous ont permis d’établir que le modèle d’organoïde cérébral permet de reproduire des aspects-clés retrouvés dans l’apparition de la pathologie chez les patients. Pour compenser l’hétérogénéité de notre modèle, nous avons réalisé une analyse in toto par imagerie, c’est-à-dire dans sa totalité sans coupes préalables. La modalité retenue pour cette acquisition est la microscopie à feuillet de lumière utilisée après marquage et clarification des mini-cerveaux. Pour ce faire, nous avons évalué et développé différentes stratégies en vue d’obtenir une plateforme d’analyse à haut contenu pour nos organoïdes cérébraux.Cette plateforme centrée autour de l’organoïde cérébral, sous-tendue par l’analyse en microscopie 3D, a été développée dans le cadre du projet « Investissements d’Avenir » 3DNeuroSecure. Ce projet a pour ambition d’apporter des solutions de calcul haute performance au domaine de la biologie, notamment avec la possibilité de traiter des informations de très grand volume, dit « exascale », telles que celles que nous obtenons avec la microscopie 3D. Le développement de cet aspect nous permettrait à terme de pouvoir établir les bases d’un outil de criblage thérapeutique par les organoïdes cérébraux pour les maladies neurodégénératives. Nous avons démontré que les mécanismes de type prion pouvaient être étudiés dans ce modèle de mini-cerveaux humains et de multiples voies de recherche fondamentale et appliquée sont désormais possibles. A plus long terme, une telle plateforme pourrait accueillir tout type d’organoïdes pour modéliser l’ensemble du corps humain et s’inscrire comme un compagnon biologique dans le cadre des futurs développements de la médecine personnaliséeHuman neurodegenerative diseases, which are all based on prion-like mechanisms (self-propagation of pathogenic protein aggregates), represent a major societal risk with the increase of their prevalence directly correlated to the increasing longevity of the world population. There is to date neither any cure nor any pertinent experimental model for their study.The objective of this work was to use the potential of human mini-brains, a self-assembled three-dimensional in vitro model able to restitute the complexity of the cerebral cortex. This model will allow us to study prion-like mechanism by developing a validation methodology based on 3D microscopy. These novel 3D structures can be obtained from reprogrammed adult cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) and offer unique possibilities to access, observe and disrupt biological processes in the human brain without bias nor complications as in animal models and ex vivo human brain samples. This model makes it possible to observe the development of aggregates of Aβ and hyper-phosphorylated Tau, two proteins that accumulate and propagate from cell to cell during Alzheimer’s disease.We have been to able to adapt the cerebral organoid model for a future screening approach by modifying the differentiation methodology to enhance its production ratio. We also have been able to test different modalities for disease modeling for Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Fronto-Temporal Dementia and Creutzfeldt-Jakob disease: with chemical induction, with patient specific cells, through genetic modification and through contact with infectious material. These different approaches allowed us to validate that the cerebral organoid can indeed reproduce key aspects found during pathological development within patients. To compensate for the heterogeneity of the cerebral organoid, we performed an in toto analysis through microscopy, meaning in its totality without prior slicing. The chosen method of acquisition is fluorescence light-sheet microscopy used after staining and optical clearing of cerebral organoids. To do so, we have evaluated and established different strategies in order to obtain a high content screening platform for our cerebral organoid model.This platform centered around the cerebral organoid model, underpinned by 3D microscopy analysis, was developed during the “Investissements d’Avenir” project 3DNeuroSecure. This project has for ambition to bring high performance computing to the biological sciences, notably with the possibility to deal with large scale data, also called “exascale”, like the ones obtained with 3D microscopy. The development of this aspect would allow us to establish the basis for a therapeutic screening tool based on cerebral organoids for neurodegenerative diseases. We have demonstrated that prion-like mechanisms can be studied in a human mini-brain model and multiple research avenues are now opened for both fundamental and applied research. This platform could in turn become the basis for any kind of organoids derived from patients to model the whole human body and become a biological companion for personalized medicine