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Les Cancers Epidermoïdes de la Tête et du Cou (CETC) représentent les septièmes tumeurs les plus fréquentes au niveau mondial en 2020. Si les perspectives thérapeutiques ont évolué favorablement ces dix dernières années, la recherche de biomarqueurs utiles pour la stratification thérapeutique reste un enjeu de taille pour ces tumeurs. En outre, l'induction d'une immunité adaptative antitumorale apparait comme un mécanisme de plus en plus important pour l'efficacité des thérapeutiques approuvées dans les CETC. Dans cette perspective, l'étude des interactions entre cellules tumorales et cellules immunitaires du microenvironnement tumoral (MT) est incontournable. Plusieurs thérapies anticancéreuses ont été rapportées pour induire la mort des cellules tumorales par ferroptose, une nécrose régulée dépendante du fer survenant lors d'un stress oxydant non résolu par la cellule. Nous nous sommes intéressés dans la première partie de nos travaux à la possibilité d'exploiter la ferroptose dans les CETC positifs au Papillomavirus Humain (CETC HPV+ve), les CETC HPV+ve montrant habituellement un état de stress oxydant supérieur aux CETC négatifs pour l'HPV (CETC HPV-ve). Nous avons mis en évidence une expression faible de SLC7A11, transporteur essentiel de la cellule pour la synthèse du glutathion inhibiteur du stress oxydant, dans les CETC HPV+ve par rapport aux CETC HPV-ve in silico. In vitro, nous avons mis en évidence une vulnérabilité supérieure à la ferroptose induite par l'érastine dans les lignées de CETC exprimant les protéines transformantes E6/E7 de l’HPV par rapport à leurs lignées parentales. Dans la deuxième partie de nos travaux, nous avons étudié la régulation de l'expression du ligand PD-L1 (Programmed Death-Ligand 1) par différentes thérapies approuvées dans les CETC. L'expression de PD-L1 par les cellules tumorales et inflammatoires du MT est en effet responsable en partie de l'inactivation fréquente des cellules T cytotoxiques du MT, et représente donc un obstacle pour l'induction de l'immunité adaptative antitumorale. Nous avons mis en évidence une régulation spécifique de PD-L1 par le 5-fluorouracile (5-FU) dépendante de la réponse aux dommages de l'ADN ainsi que de la voie JAK / STAT<br>Head and Neck Squamous Cell Carcinomas (HNSCC) were the seventh most frequent tumors worldwide in 2020. Although therapeutic perspectives have evolved favorably over the last ten years, the search for useful biomarkers for therapeutic stratification remains a major challenge for these tumors. In addition, the induction of antitumor adaptive immunity seems to be an increasingly important mechanism for the efficacy of approved therapies in HNSCC. In this perspective, the study of the interactions between tumor cells and immune cells of the tumor microenvironment (TM) is essential. Several anticancer therapies have been reported for the induction of tumor cell death by ferroptosis, an iron-dependent regulated necrosis that occurs during unresolved oxidative stress in the cell. In the first part of our work we focused on the possibility of exploiting ferroptosis in Human Papillomavirus positive HNSCC (HPV+ve HNSCC), which usually show higher oxidative stress than HPV negative HNSCC (HPV-ve HNSCC). Using in silico analyses, we observed low expression of SLC7A11, an essential transporter in the cell for the synthesis of glutathione, an inhibitor of oxidative stress, in HPV+ve HNSCC compared to HPV-ve HNSCC. In vitro, HNSCC cell lines expressing HPV E6/E7 transforming proteins showed higher sensitivity to erastin-induced ferroptosis compared to their parental cell lines. In the second part of our work, we studied the regulation of PD-L1 (Programmed Death-Ligand 1) expression by different approved therapies in HNSCC. The expression of PD-L1 by tumor and inflammatory cells of the TM is indeed partly responsible for the frequent inactivation of cytotoxic T cells of the TM, and thus represents an obstacle for the induction of antitumor adaptive immunity. We observed a specific regulation of PD-L1 by 5-fluorouracil (5-FU) that was dependent on the DNA damage response and the JAK / STAT pathway

Les carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou (CETEC) sont des cancers fréquents et de mauvais pronostic avec une survie globale à 5 ans inférieure à 50%. La thérapie photodynamique (PDT) est une alternative thérapeutique consistant en l’injection systémique d’un photosensibilisant (PS) dont la toxicité est localement activée par illumination de la tumeur. A travers l’étude de deux PS à base de ruthénium (Ru1 et Ru2), nous avons mis en évidence l’efficacité anti-tumorale in vitro de ces deux PS dans des lignées de CETEC, avec des IC50 &lt; 1µM après activation à la lumière. Nos résultats montrent que Ru1 et Ru2 sont deux capables d’induire in vitro des marqueurs de l’autophagie, de la ferroptose et de la mort cellulaire immunogène. Cependant, alors que Ru1 semble induire une apoptose tolérogène, caspase-7 dépendante et corrélée avec l’induction d’un stress du réticulum endoplasmique, Ru2 ne semble pas ou peu induire ces mécanismes mais induit une immunogénicité in vivo. L’ensemble de nos résultats mettent en avant la complexité des mécanismes impliqués dans la phototoxicité de ces PS et la nécessité d’analyses plus approfondies avant leur transfert en clinique<br>Head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) are frequent cancers with a poor prognosis, and a 5-year overall survival below 50%. Photodynamic therapy (PDT) is a therapeutic alternative involving the systemic injection of a photosensitizer (PS) whose toxicity is locally activated by tumor illumination. Through the study of two ruthenium-based PS (Ru1 and Ru2), we have demonstrated the in vitro anti-tumor efficacy of these two PS in HNSCC cell lines, with IC50 &lt; 1µM after light activation. Our results show that Ru1 and Ru2 are both capable of inducing markers of autophagy, ferroptosis and immunogenic cell death in vitro. However, whereas Ru1 appears to induce a tolerogenic, caspase-7-dependent apoptosis correlated with the induction of endoplasmic reticulum stress, Ru2 appears to induce little or none of these mechanisms but induces immunogenicity in vivo. Taken together, our results highlight the complexity of the mechanisms involved in the phototoxicity of these PS and the need for further analysis before their transfer to the clinic

L’objectif de ce travail était de comprendre l’état moléculaire des cellules dendritiques (CD) dans le microenvironnement tumoral. En intégrant l’analyse de tumeurs humaines par cytométrie en flux, de transcriptome, de secretome tumoral et l’analyse d’une base de données d’interaction CD-lymphocyte T générées in vitro, j’ai obtenus 2 résultats majeurs. Tout d’abord, nous proposons une nouvelle classification de CD activées humaines, qui sont soit « secrétantes », c’est-à-dire spécialisées dans la production de cytokines et chemokines, soit « aidantes » c’est-à-dire spécialisées dans l’induction de la sécrétion de nombreuses cytokines T helper après co-culture. Les CD infiltrant les tumeurs ORL inflammées correspondaient au type « sécrétantes ». Au-delà du nouveau concept biologique, cette classification est base théorique importante pour l’immunothérapie à base d’adjuvants. Deuxièmement, nous avons montré que l’inflammation tumorale n’était pas un facteur pronostic majeur des cancers ORL, mais que MMP2 et l’effraction extra-capsulaire étaient des facteurs pronostiques indépendants de la survie liée à la maladie. Nous avons pu classer les patients en 4 niveaux de risque et montré qu’ils avaient des chances équivalentes de réponse à l’immunothérapie. Nos données sont une base pour un essai clinique dirigé par biomarqueur, proposant de la chimiothérapie ou de l’immunothérapie néoadjuvantes, dans le but de diminuer le pourcentage de patients présentant des récidives sévères et précoces<br>The objective of the thesis was to decipher the molecular state of tumor infiltrating dendritic cell (DC) and their relation to the tumor microenvironment. By combining the analysis of human tumor samples by flow cytometry and RNA sequencing, of tumor secretome and of a large dataset of in vitro DC-Tcell interactions I obtained 2 main findings. First, we reported a novel classification of human activated DC, that are either “secretory” that is specialized in secreting cytokines and chemokines, or “helper” that is specialized at inducing the secretion of a broad range of T helper cytokines after cell co-culture. DC infiltrating inflamed human head and neck cancer matched the “secretory” phenotypic and transcriptomic signatures. Beyond this novel biological concept, this classification is of importance as a theoretical basis for adjuvant-based immunotherapy. Secondly, we showed that tumor inflammation was not the main prognostic factor for oral cavity cancer (OCC) patients, but that MMP2 and the presence of extra-nodal extension were independent predictors of reduced disease-specific survival. We could stratify OCC into 4 prognostic groups and showed that they had similar expected rates of response to immunotherapy. Our data may serve to design a biomarker-driven clinical trial proposing neoadjuvant chemotherapy or immunotherapy to high-risk patients, with the goal of reducing the percentage of OCC patients that will present with early and severe recurrences

Dans notre modèle de carcinome épidermoïde humain de la tête et du cou (HNSCC), si l’on observe une surexpression du récepteur au facteur de croissance épidermique (EGFR) dans plus de 15 % des cas, les cellules cancéreuses (SCC) sont réfractaires à un traitement par des inhibiteurs de l’activité Tyrosine kinase de l’EGFR (EGFR TKI) tels que le Géfitinib et l’AG1478. A ce jour, les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la résistance des HNSCC aux EGFR TKI sont encore inconnus. On sait aujourd’hui que les niches tumorales jouent un rôle crucial dans la résistance des cellules cancéreuses aux traitements chimiothérapeutiques conventionnels et que les fibroblastes associés au cancer (CAF) présents dans ces niches, participent très certainement à ce processus. Les CAF sont notamment responsables de la fibrose du tissu tumoral et d’un remodelage excessif de la matrice extracellulaire (MEC) aboutissant à une augmentation de sa rigidité. Dans les cellules de carcinome, l'adhésion sur un substrat rigide déclenche des voies de signalisation intracellulaires mécano-dépendantes qui favorisent la résistance des tumeurs aux chimiothérapies conventionnelles. Mes travaux démontrent que la rigidification de la MEC est responsable d'une augmentation significative de la survie des cellules de carcinome épidermoïde (SCC) en réponse aux traitements par des ITK de l'EGFR, aux chimiothérapies conventionnelles ou à une combinaison des deux. Comparé à des cellules ensemencées sur matrice molle, des cellules cultivées sur matrice rigide survivent mieux (+60%) au traitement avec le Gefitinib (EGFR TKI). Le même effet a été observé sur une matrice dérivée de CAF dont on sait qu'elle est plus rigide que celle dérivée de fibroblastes isolés d'une peau normale. Une analyse plus poussée a révélé une induction partielle de la transition épidermo-mésenchymateuse (EMT) dans des cellules SCC étalées sur des matrices rigides. L’EMT joue un rôle dans la résistance des cellules cancéreuses aux traitements, j’ai ainsi démontré que la régulation négative des facteurs de transcription connus pour être impliqués dans l’EMT conduit, dans le cas de cellules ensemencées sur une matrice rigide, à une augmentation de la sensibilité cellulaire aux EGFR TKI. Pour comprendre plus en détails ce qui induit la résistance des cellules SCC lorsqu’elles sont étalées sur une plaque rigide, nous avons effectué un séquençage d’ARN. Le séquençage de l'ARN des cellules SCC12 étalées sur une matrice souple et rigide a révélé que la protéine AXL pouvait contribuer à la résistance au Géfitinib des HNSCC. J'ai pu démontrer que l'inhibition de l’expression d'AXL dans les cellules SCC ensemencées sur des matrices rigides, réduit totalement la résistance à l'EGFR TKI induite par la niche tumorale. De plus, je montre, en culture cellulaire 3D, l’importance de combiner AXL et EGFR TKI dans le traitement des SCC. Notre objectif global était d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques présentant une opportunité de résistance réduite. Les recherches présentées dans ce manuscrit ont le potentiel d’établir un biomarqueur de prédiction de la réponse des HNSCC et d’autres types de cancers aux EGFR TKI<br>Resistance to epidermal growth factor receptor (EGFR) targeted therapy triggered by the tumor niche in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) represents a challenge in research and in clinics. Despite the fact that over 15% of HNSCC overexpress EGFR, HNSCC are refractory to EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors (TKIs) targeted therapy and yet the molecular and cellular mechanisms of EGFR-TKIs resistance in HNSCC are unknown. The tumor niche plays an important role in conventional chemotherapeutic resistance. Cancer associated fibroblasts (CAFs), the most prominent stromal cell in tumor niche, participate in this process. Notably, CAFs are responsible for tumor tissue fibrosis an excessive extracellular matrix (ECM) remodeling that increases matrix stiffness. In carcinoma cells, adhesion to stiff substrate triggers mechano-dependent intracellular signaling pathways that favor tumor resistance to conventional chemotherapies. My work demonstrates that ECM stiffening is responsible for a significant increase of squamous cell carcinoma (SCC) survival upon the treatment with EGFR TKIs, conventional chemotherapies and combination of both. Over 60% more cells survive treatment with the gefitinib EGFR TKI compared to cells plated on soft matrix. Same effect was observed on matrix derived from CAFs that is known to be stiffer compared to the one derived from fibroblasts isolated from normal skin. Further analysis revealed an induction of partial epidermal-to-mesenchymal transition (EMT) in cells plated on rigid matrices. EMT is know to play a role in resistance of cancer cells to treatments, and I have demonstrated that downregulation of know transcriptional factors involved in EMT leads to an increase of cell susceptibility to EGFR TKI when plated on stiff matrix. To understand in more detail what drives the resistance of SCC cells when plated on stiff we conduced an RNA sequencing. RNA sequencing of SCC12 cells plated on soft and stiff matrix revealed AXL as main driver of EGFR TKI resistance in HNSCC. I was able to demonstrated that inhibiting AXL in SCC cells, lying on stiff matrices, reverts the EGFR TKI resistance triggered by the tumor niche. Moreover, I show in 3D cell culture the importance of combining AXL and EGFR TKI in treatment of SCCs. Our overall goal was to identify novel therapeutic targets with reduced resistance opportunity. Finally, research presented in this manuscript carries potential in establishing a prediction biomarker to the response of HNSCCs and other cancers to EGFR TKIs

Le cetuximab est indiqué, en monothérapie pour les carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou récurrents et/ou métastatiques. Cependant sur les tumeurs primaires, il s'est révélé d'une efficacité modeste. Dans divers types tumoraux, il a été montré que la perte d'expression de PTEN est associée à une résistance aux thérapies anti-EGFR, il s'agit d'un évènement relativement fréquent dans les carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou.Cette étude est la première à investiguer directement le rôle de la perte d'expression de PTEN dans la réponse au cetuximab des carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou. Aussi, la mise au point d'un modèle PTEN déficient montre que la perte d'expression de PTEN dans les cellules Cal 27 conduit à une suractivation des voies de la survie et de prolifération cellulaire qui n'aboutit cependant pas à une résistance au cetuximab. Ces travaux montrent que les cellules Cal 27 sont plus dépendantes de l'activation de la voie PI3K/AKT que de l'activité de l'EGFR pour leur croissance, expliquant l'effet modeste du cetuximab.Notre étude de l'angiogenèse par un modèle d'anneaux aortiques cultivé en milieux conditionnés, montre que le bourgeonnement endothélial n'est pas dépendant du VEGF. Le silencing de PTEN dans ces cellules, régule positivement les facteurs anti-angiogéniques TSP1 et IGFBP 3 et diminue la capacité d'induction du bourgeonnement endothélial.Dans les carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou, la perte d'expression de PTEN ne semble pas être un évènement important dans la tumorigenèse mais avoir un impact déterminant en tant qu'évènement tardif. L'ensemble des données fournies par notre modèle permet de proposer, pour la perte d'expression de PTEN, un rôle d'initiation du processus métastatique dans les carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou<br>Cetuximab has been recently accepted as a single agent to treat recurrent and/or metastatic head and neck squamous cell carcinoma. However, modest efficacy of cetuximab used as a single agent has been reported on primary tumor. In many tumor types, loss of PTEN expression has been described to be associated to resistance to anti-EGFR therapies. Loss of PTEN expression is a frequent event in head and neck squamous cell carcinoma.This study is the first one to directly investigate the role of PTEN loss of expression in response of head and neck squamous cell carcinoma to cetuximab. PTEN-deficient cellular model shows that loss of PTEN expression leads to an overactivation of the signaling pathways ruling cell survival and proliferation but do not impact on cetuximab efficacy. According to our data, Cal 27 cells growth rather depends on PI3K/AKT activation than on EGFR.Observation of angiogenesis, using an aortic ring assay cultured in conditioned media, shows that endothelial sprouting is not dependent on VEGF. PTEN silencing in Cal 27 cells induces anti-angiogenic TSP1 and IGFBP 3 levels in the conditioned medium and reduces the sprouting induction ability by Cal 27 cells.Finally, it is likely that loss of PTEN expression is not a key event in head and neck squamous cell carcinoma tumorigenesis, but might be determinant when occurring as a late event. Taken together, our data suggest that loss of PTEN expression could be involved in initiating metastasis process in head and neck squamous cell carcinomas

Le cancer est une maladie génétique acquise. Le gène p53 est non fonctionnel dans 50% des cancers épidermoïdes de la tête et du cou et est un facteur de mauvais pronostique. Actuellement, plusieurs stratégies sont envisagées dans la recherche en Oncologie et parmi elles, la thérapie génique. Son but est de corriger les anomalies d'un gène non fonctionnel par l'apport d'un nouveau gène. L'utilisation des vecteurs non viraux en thérapie génique est limitée à cause de leur faible pouvoir de transfection. L'objectif de notre étude est de voir l'influence de l'internalisation photochimique (PCI) sur le transfert du gène p53 couplé à un vecteur non viral dérivé polyéthylènimine (PEI). La PCI est une technologie permettant d'augmenter l'efficacité de transfert des vecteurs non viraux combinant l'action d'un photosensibilisant et de la lumière. Après avoir optimisé les conditions d'utilisation combinée du PEI et de la PCI, nous avons montré que le couplage PCI + PEI permettait d'augmenter significativement le niveau et la durée d'expression du transgène in vitro puis in vivo. Cette augmentation a conduit à une forte induction d'apoptose et une forte inhibition de la croissance cellulaire in vitro. Ln vivo, le couplage PCI + PEI a permis d'éradiquer les tumeurs et vraisemblablement par l'apoptose.

Le cetuximab (CTX) est un anticorps monoclonal anti-EGFR indiqué dans les cancers ORL dont les modalités de prescription pourraient être améliorées. Après chimiothérapie d’induction (étude Tremplin), en comparaison au cisplatine, il était moins toxique mais sans améliorer la préservation laryngée. À la première injection, le CTX peut déclencher un choc anaphylactique lié à la préexistence d’IgE anti-αGal. Des tests prédictifs détectant ces IgE ont été développés et réalisés chez 41 patients avec une sensibilité et une valeur prédictive négative de 100%. La relation entre concentrations sériques et efficacité/toxicité a été étudiée chez 34 patients. La pharmacocinétique a été décrite à l’aide d’un modèle combinant des mécanismes d’élimination non saturable (CL) et saturable (k0). La clairance globale du CTX, reflet de l’exposition des patients, était reliée aux survies sans progression et globale (SG). Le grade de radiodermite était associé à la SG. Une simulation pharmacocinétique suggère, qu’en comparaison à l’injection standard de CTX, une injection toutes les trois semaines entrainera des AUC proches mais des concentrations résiduelles différentes<br>Cetuximab (CTX) is an anti-EGFR monoclonal antibody approved in head and neck cancer, which prescription modalities may be improved. After induction chemotherapy (Tremplin study), compared to cisplatin, CTX was less toxic but did not improve larynx preservation. During first infusion, CTX can induce an anaphylaxis reaction due to the presence of preexisting anti-αGal IgE. Predictive assays detecting these IgE were developed and tested in 41 patients, with sensitivity and negative predictive values of 100%. Relationship between serum concentrations and efficacy/toxicity was studied in 34 patients. CTX pharmacokinetics was described using a model combining non-saturable (CL) and saturable (k0) eliminations. Global clearance, which reflects patient exposure, was related to progression free and overall (OS) survivals. Severe radiation dermatitis was also associated with OS. A pharmacokinetic simulation suggests that, in comparison to standard CTX infusion, an infusion every three weeks will lead to similar AUC but to different residual concentrations

Le pronostic des carcinomes épidermoïdes des VADS reste sombre. Le décryptage des mécanismes moléculaires impliqués dans la genèse et la prolifération de ses tumeurs ouvre des voies vers la découverte de marqueurs tumoraux pour le dépistage, le diagnostic, la classification ou la prédiction de la réponse aux traitements de cette maladie. L'analyse du transcriptome est une technique prometteuse dont le développement est considérable depuis l'apparition des micro-puces à ADN et de la RT-qPCR. Ce travail illustre les applications possibles de l'analyse du transcriptome pour la recherche de marqueurs tumoraux des carcinomes épidermoïdes des VADS. Nous présentons les différents projets de recherche : I- Validation de 9 marqueurs diagnostiques des carcinomes épidermoïdes des VADS issus des analyses transcriptionelles par micro-puce. Nous montrons que les niveaux d'expression des gènes FN1, MMP1, PLAU et SPARC sont supérieurs dans le tissu tumoral par rapport au tissu sain. Au contraire, ces niveaux sont plus faibles pour les gènes KRT4, KRT13, ILNR1, MAL et TGM3. L'analyse du niveau d'expression en RT-qPCR de l'un des 3 gènes ILNR1, MAL ou MMP1 permet de déterminer correctement la nature saine ou carcinomateuse de 87 des 92 échantillons. II- Etude de l'intérêt de la détection de l'ARNm salivaire de MMP1 comme teste diagnostic des carcinomes épidermoïdes des VADS. La détection de l'ARNm salivaire de MMP1a permit le diagnostique d'un carcinomes des VADS avec une sensibilité de 20% et une spécificité de 100%. III- Etude de l'intérêt de 12 gènes de ménage pour la normalisation des données de RT-qPCR en temps réel dans les carcinomes épidermoïdes des VADS. Parmi les 12 gènes testés (ACT, ALAS, B2M, GAPGH, HMBS, HPRT, KALPHA, RPS18, RPL27, RPS29, SHAD, TBP) tous présentent des stabilités suffisantes pour être utilisé comme gène de normalisation dans les études transcriptionnelles des carcinomes des VADS. Parmi ceux-ci, GAPDH et SADH semblent cependant les plus adapté<br>Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) prognosis is globally poor. The development of new tools for the management of this disease is urgent. Gene expression profiling is a promising biologiCai approach that has been extensively used in cancer research. Examples include elucidating the biological mechanisms involved in tumorigenesis and metastatic progression, identifying potential biological targets for the development of new drugs, identifying biological pathways involved in tumour resistance to chemotherapy or radiotherapy and improving tumour staging and patient outcome prediction. With gene expression profiling, it is possible to observe and quantify gene expression deregulation in tumour cells or their surrounding environment. Two technologies are currently used: DNA microarrays and RT-qPCR. Based on a comprehensive review of the literature and original researches this work presents an updated state of the art of the potential clinical applications of gene expression profiling in the field of HNSCC. In the study "Clinical relevance of nine transcriptiory!al molecular markers for the diagnosis of head and neck squamouscell carcinoma in tissue and saliva rinse" we found that ILIRN, MAL and 11MPI are prospective tumor diagnostic markers for HNSCC. :M1vfPl overexpression is the most promising marker, and its detection could help identify tumor cells in tissue or saliva. In the study "Reference gene selection for head and neck squamous cell carcinoma gene expression studies" we found that in HNSCC and/or normal mucosa, the four best normalizat!on genes were ALAS, GAPDH, RPS18 and SHAD and the most stable combination of two genes was GAPDH-SHAD. We recommend using KALPHA-TBP for the study of Tl-T2 tumors, RPL27 -SHAD for T3-T4 tumors, KALPHA-SHAD for NO tumors, and ALAS-TBP for N+ tumors