Дисертації з теми "Carcinome cutané"

L'objectif de ce travail de recherche est d'évaluer la capacité des spectroscopies optiques d'autofluorescence et de réflectance diffuse à caractériser les différents stades de la transformation néoplasique de la peau et ainsi d'aider au diagnostic des deux lésions de peau les plus létales : le mélanome malin et le carcinome épidermoïde. Dans l'étude portant sur le mélanome, un objet-test (« fantôme ») a été développé pour modéliser différentes épaisseurs de mélanome (indice de Breslow). La spectroscopie de réflectance diffuse résolue spatialement (grâce à l'utilisation de cinq fibres optiques réceptrices situées à cinq distances différentes de la fibre optique excitatrice) a montré sa capacité à discriminer (p<0,05) des indices de Breslow simulés grâce à des fantômes d'épaisseur variant par pas d'1 mm. D'autre part, des mesures de spectroscopie bimodale (combinant autofluorescence en multi-excitation et réflectance diffuse) ont été réalisées sur peau murine tout au long des sept mois de photocarcinogenèse. Des prélèvements cutanés ont permis d'établir trois classes histologiques (en plus de la classe saine du groupe contrôle) : hyperplasie compensatoire, hyperplasie atypique et dysplasie. Puis la précision diagnostique a été évaluée par analyse statistique multivariée. Nos principaux résultats montrent que la bimodalité associant autofluorescence (excitation à 410 nm) et réflectance diffuse permet une amélioration de la spécificité de 9 points de pourcentage comparées aux performances de chacune des modalités utilisée seule lors de la discrimination des trois types d'hyperplasie. Des études cliniques doivent maintenant confirmer l'intérêt de ces résultats.

Dans le contexte du carcinome cutané, la biopsie optique offre une alternative in-vivo non destructive à la biopsie conventionnelle pour informer le praticien dermatologue de l'état de santé du tissu en profondeur lors de la résection du cancer. Ce dernier est en effet à l'origine de modifications morphologiques et physiologiques de la peau, ce qui explique que les mesures optiques resultantes des interactions lumière/tissus y soient sensibles. Les travaux présentés dans ce manuscrit exploitent les données obtenues l'aide du dispositif de biopsie optique SpectroLive sur une centaine de patients juste avant la résection du cancer par le clinicien. Au contact de la peau, ce dispositif spectroscopique acquiert des signaux de réflectance diffuse (excitation large bande blanche) et d'autofluorescence (émission monochromatique pour exciter les fluorophores endogènes de la peau) résolus spatialement, i.e., pour plusieurs distances de séparation entre la fibre émettrice de lumière est les fibres collectrices en périphérie. Cette résolution spatiale est particulièrement d'intérêt pour la peau, puisque les différentes distances introduites permettent de collecter des photons parcourant les différentes couches en profondeur (épiderme, derme et hypoderme) de l'organe. L'essentiel des travaux présentés ici concerne l'estimation des propriétés optiques de la peau grâce à la résolution du problème inverse à partir de ces acquisitions cliniques. Cela consiste d'abord à établir une simulation de transport de photons fidèle aux caractéristiques (géométriques et spectrales) du dispositif réel avant de construire un modèle multicouche de la peau dans lequel les paramètres optiques (e.g. coefficients d'absorption et de diffusion, le facteur d'anisotropie) et géométriques (e.g. épaisseur des couches) peuvent être estimées par un processus d'optimisation visant à minimiser les différences entre les spectres générés par la simulation et les spectres "cibles" obtenus en clinique. Dans ce but, les contributions principales développées dans ce manuscrit sont d'abord le développement et l'exploitation totale de la simulation, avec notamment une étude visant à caractériser la pénétration des photons détectés aux différentes séparation source/détecteur, et ceci pour différents modèles de peau afin de représenter les différences inter- et intra-individu. Les connaissances acquises avec cette étude de profondeurs sondées sont ensuite utilisées dans la seconde contribution majeure, visant à adapter le processus d'estimations des propriétés optiques à partir des spectres cliniques (problème inverse) à la peau. Enfin, la dernière contribution, plus métrologique, est l'élaboration d'un banc optique à double sphères intégrantes permettant d'obtenir ces mêmes propriétés optiques pour un échantillon ex-vivo, et ainsi permettre la comparaison des estimations issues des deux modalités<br>In the context of cutaneous carcinoma, optical biopsy offers a in-vivo non-destructive alternative to conventional biopsy to inform the dermatologist of the state of health of the deep tissue during cancer resection. The latter is indeed at the origin of morphological and physiological modifications of the skin, which explains why the optical measurements resulting from the light/tissue interactions are sensitive to it. The work presented in this manuscript exploits the data obtained with the optical biopsy device extit{SpectroLive} on about a hundred patients just before cancer resection by the clinician. In contact with the skin, this spectroscopic device acquires diffuse reflectance (white broadband excitation) and autofluorescence (monochromatic emission to excite endogenous fluorophores in the skin) spatially resolved signals, extit{i.e.}, for several separation distances between the light emitting fiber and the collecting fibers at the periphery. This spatial resolution is of particular interest for the skin, since the different distances introduced allow the collection of photons traveling through the different layers in depth (epidermis, dermis and hypodermis) of the organ. The main part of the work presented here concerns the estimation of the optical properties of the skin by solving the inverse problem from these clinical acquisitions. This consists first in establishing a photon transport simulation faithful to the characteristics (geometrical and spectral) of the real device before building a multilayer model of the skin in which the optical parameters (e.g. absorption and scattering coefficients, the anisotropy factor) and geometrical parameters e.g. layer thickness) can be estimated by an optimization process aiming at minimizing the differences between the spectra generated by the simulation and the ``target'' spectra obtained in clinic. The main contributions developed in this manuscript are first the development and the full exploitation of the simulation, with in particular a study whose purpose is to characterize the penetration of the photons detected at the various source/detector separations, and this for various skin models in order to represent the inter- and intra-individual differences. The knowledge acquired with this study of probed depths is then used in the second major contribution, aiming at adapting the process of estimating optical properties from clinical spectra (inverse problem) to the skin. Finally, the last contribution, more metrological, is the development of an optical bench with double integrating spheres allowing to obtain these same optical properties for a sample ex-vivo, and thus to allow the comparison of the estimates resulting from the two modalities

Les carcinomes épidermoïdes cutanés (CEC) sont des cancers invasifs du kératinocyte qui se développent suite à la subversion du système immunitaire. Une reprogrammation de l’immunité antitumorale par stimulation locale des cellules dendritiques (DC) et des macrophages pourrait être bénéfique. Dans ce contexte, l’objectif de ma thèse a été de comprendre l’hétérogénéité ontogénique, phénotypique et fonctionnelle de ces cellules immunitaires au cours de la carcinogenèse cutanée afin de développer des approches thérapeutiques les stimulant. Nous avons, d’abord, caractérisé les macrophages de la peau de souris et infiltrant les CEC chez l’homme. Nous avons identifié par cytométrie en flux spectrale une population de macrophages matures, autofluorescents et résidents de la peau de souris. Ces macrophages résidents présentent une polarisation fonctionnelle d’homéostasie et de réparation tissulaire. Dans les CEC humains, les macrophages autofluorescents semblent avoir les mêmes caractéristiques que leurs équivalents dans la peau de souris. Dans une seconde étude, nous avons mis en évidence que les DC associées aux tumeurs sont dysfonctionnelles. Une immunothérapie locale composée d’un agoniste de TLR9 et d’un anticorps bloquant la signalisation sous le récepteur à l’IL-10 induit la régression de tumeurs cutanées. Cette approche permet la reprogrammation fonctionnelle des DC et la génération de lymphocytes T CD8+ producteurs d’IFNγ, de TNFα et d’IL-17. Ces résultats mettent en évidence l’hétérogénéité fonctionnelle des cellules myéloïdes dans la peau et les CEC. Leur reprogrammation fonctionnelle permettrait le développement de nouvelles thérapeutiques contre les CEC chez l’homme<br>Skin Squamous cell carcinoma (sSCC) are invasive keratinocyte tumor that develop after immune system subversion. The reprogrammation of anti-tumoral immunity using local stimulation of dendritic cells (DC) and macrophages could be useful. In this line, the aim of my thesis was to understand ontogenic, phenotypic and functional heterogeneity of these cell subsets along skin carcinogenesis to develop new immunotherapies. First, we characterized skin macrophage subsets in mouse and those infiltrating sSCC in human. Using spectral flow cytometry, we identified matured autofluorescent tissue-resident macrophages. These macrophages are anti-inflammatory polarized. In human sSCC, autofluorescent macrophages seem to have same properties that their mouse counterparts. In second study, we identified tumor-infiltrating DC with altered functions. We used a local immunotherapy composed by a TLR9 agonist and blocking antibody against α-chain of IL-10 receptor. This combination induced tumor regression through DC reprogrammation and IFNγ+, TNFα+ IL17A+ T CD8+ lymphocyte generation. These results highlight functional myeloid heterogeneity in skin and sSCC. Their reprogrammation could promote the development of immunotherapies against sSCC in human

Le carcinome épidermoïde cutané (CEC) représente un enjeu important par sa fréquence et sa gravité potentielle.L’agressivité de ce cancer est liée à l’invasion péri-nerveuse (IPN), mode d’envahissement tumoral reconnu comme un facteur de mauvais pronostic.L’objectif de ce travail est de s’intéresser aux mécanismes favorisant l’IPN, en comparant 2 groupes appariés de CEC humains, avec et sans IPN.Pour cela nous avons réalisé une étude de facteurs et récepteurs neurotrophiques, de marqueurs de la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), et de la molécule NCAM1, par analyse immunohistochimique à partir de pièces chirurgicales de CEC et par analyse moléculaire en droplet digital PCR sur des cellules tumorales microdisséquées.L’analyse immunohistochimique a trouvé une forte expression de BDNF, TrkB, p75NGFR, Snail 1 et NCMA1 dans les cellules tumorales péri-nerveuses, contrastant avec une faible expression de ces marqueurs dans les cellules tumorales à distance du nerf. L’E-cadhérine était diminuée dans les cellules tumorales péri-nerveuses.L’analyse moléculaire en ddPCR montrait une diminution d’expression de l’E-cadhérine et une surexpression de BDNF, TrkB, p75NGFR, Snail1, Slug, Zeb2, Twist1 et NCAM1 dans les cellules tumorales péri-nerveuses par rapport aux cellules tumorales distantes du nerf.Nous avons démontré dans ce travail que l’invasion péri-nerveuse dans les CEC humains est liée aux neurotrophines, à la TEM et implique NCAM1<br>Cutaneous squamous cell carcinoma (SCC) is an important issue because of its frequency and potential severity.The aggressiveness of this cancer is related to perineural invasion (PNI), a mode of tumor dissemination recognized as a poor prognosis factor.The aim of this work is to study the mechanisms of PNI, comparing 2 matched- groups of human SCC with and without PNI.For this, we studied neurotrophins, epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers, and the NCAM1 molecule, by immunohistochemistry analysis on surgical pieces of SCC and by molecular analysis with digital-droplet PCR on laser-microdissected tumor cells.Immunohistochemistry analysis found strong expression of BDNF, TrkB, p75NGFR, Snail 1 and NCMA1 in perineural tumor cells, contrasting with weak expression of these markers in tumor cells distant from the nerves. E-cadherin was decreased in perineural tumor cells.Molecular analysis in ddPCR showed decreased expression for E-cadherin and overexpression of BDNF, TrkB, p75NGFR, Snail1, Slug, Zeb2, Twist1 and NCAM1 in perineural tumor cells compared to tumor cells distant from the nerves.We have demonstrated in this work that PNI in human SCC is linked to neurotrophins and EMT, and involves NCAM1

Cette thèse présente les résultats de recherches dans le cadre de l'amélioration de l'analyse des propriétés optiques de la peau à l'aide de différentes techniques optiques, telles que la spectroscopie tissulaire multimodale et l'imagerie par tomographie par cohérence optique (OCT). Depuis de nombreuses années, les techniques optiques de caractérisation de la peau sont une alternative efficace aux méthodes de diagnostic invasives traditionnelles car elles permettent d'obtenir des informations sur la composition structurelle et biochimique de la peau in vivo en temps réel, ce qui a conduit à leur mise en œuvre extensive dans la pratique clinique de l'analyse des lésions cutanées. Même si la principale limitation à l'utilisation des méthodes optiques dans le diagnostic de la peau est la forte absorption et diffusion de cette dernière, les propriétés optiques de la peau peuvent être modifiées en utilisant la méthode de Clarification Optique tissulaire (OC). La combinaison des agents de clarification optique (OCA) avec divers activateurs chimiques et physiques de la perméabilité cutanée peut améliorer considérablement le potentiel des approches optiques multimodales avec une résolution spatiale. L'objectif de la première étude expérimentale dans le cadre de cette thèse était (i) d'étudier l'effet du processus OC appliqué à des échantillons de peau humaine ex vivo sur les spectres de réflectance diffuse (DR) et d'autofluorescence (AF) résolus spatialement (SR) en utilisant deux combinaisons d'OCA et de Chemical Permeation Enhancers (CPE), et (ii) pour quantifier l'effet de clarification du séchage et de la pression de la sonde spectroscopique sur la peau. Un dispositif spectroscopique multimodal à résolution spatiale a été utilisé sur un modèle « hybride » à deux couches composé de peau ex vivo et de gel fluorescent. La cinétique temporelle des spectres de fluorescence et de réflectance diffuse a démontré une augmentation de l'intensité rétroréfléchie de la fluorescence du gel après clarification optique. De plus, des résultats expérimentaux complémentaires ont montré une augmentation de la transmission de la lumière à travers la peau et ont confirmé que l'amélioration de la sensibilité en profondeur de l'approche spectroscopique multimodale était liée non seulement à la déshydratation et à la correspondance des indices de réfraction due à la clarification optique, mais aussi à la compression mécanique de tissus causés par l'application de la sonde spectroscopique. Étant donné que lors de la traduction de ces méthodes en utilisation clinique, il est nécessaire de se conformer aux réglementations établies, les concentrations d'OCA utilisées peuvent devoir être réduites. Ainsi, l'objectif principal de l'étude expérimentale ultérieure était d'évaluer expérimentalement pour la première fois, à l'aide d'une technique d'imagerie Line-field Confocal OCT (LC-OCT), l'efficacité de l'OC de la peau humaine in vivo avec l'OCA biocompatible combiné à des activateurs de perméabilité chimiques et physiques. Pour répondre aux exigences de concentration biocompatibles, les OCA ont été développés selon la base de données des ingrédients inactifs de la FDA. En analysant simultanément l'intensité moyenne et le contraste des images obtenues par la technique LC-OCT, nous avons déterminé l'efficacité en profondeur de l'OC biocompatible in vivo de la peau. Les résultats ont montré que la meilleure augmentation de l'intensité et du contraste de l'image après 10 minutes de clarification assistée par ultrasons a été obtenue en utilisant un mélange de PEG/OA/PG. Les résultats de l'ajustement des données expérimentales avec le modèle d'association exponentielle biphasique hypothétique sont en bon accord avec les résultats expérimentaux. Ainsi, l'efficacité de l'OC avec des concentrations biocompatibles d'OCA a été démontrée<br>This thesis presents the results of research in the context of improved analysis of the skin optical properties using various optical techniques, such as multimodal tissular spectroscopy and optical coherence tomography (OCT) imaging. Since many years optical techniques of skin characterization are an effective alternative to traditional invasive diagnostic methods as they allow to get information about the structural and biochemical skin composition in vivo in real time, which led to their extensive implementation in the clinical practice of skin lesions analysis. In the last decades it was demonstrated that combined use of several optical techniques allows to increase the diagnostic accuracy by increasing the variety of data acquired in one measurement. Spatial resolution may also increase the diagnostic potential by providing depth discrimination (resolution) between assessed layers. Even though the main limitation for the use of the optical methods in skin diagnostics is the strong absorption and scattering of the latter, skin optical properties can be changed using the method of skin optical clearing (OC). The combination of optical clearing agents (OCA) with various chemical and physical enhancers of skin permeability may significantly improve the potential of multimodal optical approaches with spatial resolution. The aim of the first experimental study within this thesis framework was (i) to investigate the effect of the OC process applied to ex vivo human skin samples on spatially resolved (SR) diffuse reflectance (DR) and autofluorescence (AF) spectra using two combinations of OCA and chemical permeation enhancers (CPE), and (ii) to quantify the clearing- like effect of drying and of spectroscopic probe pressure on skin. A spatially resolved multimodal spectroscopic device was used on a two- layered “hybrid” model made of ex vivo skin and fluorescent gel. Time kinetics of fluorescence and diffuse reflectance spectra demonstrate d an increase in the gel fluorescence back reflected intensity after optical clearing. In addition, complementary experimental results showed increased light transmittance through the skin and confirmed that the improvement in the depth sensitivity of the multimodal spectroscopic approach was related not only to the dehydration and refractive indices matching due to optical clearing, but also to the mechanical compression of tissues caused by the application of the spectroscopic probe. Since when translating these methods into clinical use there is a need to comply with established regulations, including the use of chemicals on healthy and pathologically changed skin of patients, the concentrations of the OCA used may need to be reduced in order to pass the threshold of clinical utility and biocompatibility. Thus, the main goal of the consecutive experimental study was to experimentally evaluate, by using for the first time a Line-field Confocal OCT (LC-OCT) imaging technique, the e fficacy of OC of human skin in vivo with biocompatible OCA combined with chemical and physical permeability enhancers. To satisfy the biocompatible concentration requirements, the mixtures of OCA and CPE were developed according to the FDA inactive ingredients database. To enhance the clearing effect, physical permeation methods were also used. By analyzing simultaneously the average intensity and contrast of the images obtained by LC-OCT technique, we determined the in-depth effectiveness of skin in vivo biocompatible OC. The results showed that the best increase in image intensity and contrast after 10 minutes of ultrasound-assisted clearing was achieved using a mixture of PEG/OA/PG. The results of the experimental data fitting with the hypothesized biphasic exponential association model are in a good agreement with experimental results. Thus, the effectiveness of OC with biocompatible concentrations of OCA was demonstrated

Les carcinomes spinocellulaires cutanés (cSCCs) sont le deuxième type de cancer par ordre de fréquence et sont responsables de 25% des décès dus aux cancers de la peau. Il est donc essentiel de caractériser les mécanismes responsables de la cancérisation de l'épiderme afin de développer de nouveaux traitements. Dans ce contexte, les miRNAs apparaissent comme des cibles de choix pour le développement de futures thérapies anti-tumorales. Toutefois, leur implication dans la physiopathologie des cSCCs est encore peu documentée. Au cours de cette étude, j’ai identifié, par séquençage à haut débit, 112 miRNAs dont l’expression est altérée au cours du développement tumoral dans un modèle murin de carcinogénèse chimique cutanée. J’ai ensuite focalisé mon attention sur le cluster miR-193b/365a et sur miR-708 dont les niveaux diminuent au cours de la progression tumorale, suggérant des fonctions de suppresseurs de tumeur. En accord avec cette hypothèse, l’expression ectopique de ces miRNAs inhibe la prolifération, la survie et la migration de cellules tumorales, alors que le blocage de leur action par des anti-sens stimule ces fonctions cellulaires dans des kératinocytes normaux. L’association d’approches in silico et d’analyses du transcriptome de cellules de cSCC sur-exprimant ces miRNAs m’a permis d’identifier leurs gènes cibles potentiels. J’ai validé KRAS et MAX comme cibles communes de miR-193b et miR-365a, et montré par l’utilisation de siRNAs que la répression de ces cibles mime les effets de ces miRNAs. Ces résultats suggérent que le ciblage de ces gènes pourrait médier en partie les effets suppresseurs de tumeur de miR-193b et de miR-365a dans les cSCCs<br>Cutaneous squamous cell carcinomas (cSCCs) are the second most common cancer and are responsible for up to 25% of all skin cancer deaths. It is therefore essential to characterize the mechanisms responsible for epidermis carcinogenesis to develop new treatments. In this context, miRNAs appear to be prime targets for the development of future anti-tumor therapies. However, their involvement in the pathophysiology of cSCCs is still poorly documented. In this study, I identified using Small RNA sequencing, 112 miRNAs whose expression is altered during tumor development in a mouse model of cutaneous two-stage chemical carcinogenesis. Then, I focused my attention on the miR-193b/365a cluster and on miR-708, that are down-regulated during tumorigenesis, suggesting tumor suppressor functions. Consistent with this hypothesis, the ectopic expression of these miRNAs inhibit the proliferation, survival and migration of tumor cells, while blocking their action with antisense oligonucleotides stimulates these cellular functions in normal keratinocytes. Combining in silico target-prediction approaches and transcriptome analyzes of cSCC cells over-expressing these miRNAs, I identified their potential target genes. I validated KRAS and MAX as direct targets of miR-193b and miR-365a, and I showed that repression of these genes using siRNAs mimics the effects of these miRNAs. These results suggest that targeting these genes might mediate, at least in part, the tumor suppressor action of miR-193b and miR-365a in cSCCs

Le carcinome épidermoïde cutané (CEC) est l'un des cancers les plus fréquents et il est résistant aux traitements chimiothérapeutiques classiques. De nombreuses études montrent que selon leur phénotype les cellules du microenvironnement inflammatoire peuvent inhiber (cellules Th1/M1) ou favoriser (cellules Th2/M2) le développement tumoral. En fonction des cytokines présentes dans ce microenvironnement, il est possible de reprogrammer les cellules immunitaires et de les rendre moins permissives au développement tumoral. L’onconstatine M (OSM) est une cytokine aux effets pléiotropes, elle peut favoriser la prolifération, l’invasion tumorale des cellules tumorales et induire une polarisation immunitaire Th2/M2. Nous avons montré que l'OSM a des effets pro-inflammatoires au niveau cutané et qu’elle module le phénotype des kératinocytes normaux mais son rôle dans les CEC n’est pas décrit. Nous avons donc étudié l’implication de l'OSM dans le développement des CEC. Nous avons montré que l'OSM était surexprimée dans les CEC humains ainsi que d'autres cytokines comme l'IL-6, l'IL-1β, l'IFNγ suggérant une polarisation Th1/M1 des cellules du microenvironnement. In vitro, l'OSM induit l’activation de voies de signalisation pro-tumorales (STAT3 - ERK) au niveau de kératinocytes murins malins ainsi que leur prolifération et leur migration. La greffe de ces cellules chez la souris entraine le développement de CEC associés à une surexpression d'OSM. Enfin, l’absence d'OSM entraine une diminution du volume tumoral de 30% et à une réduction de la polarisation M2. Collectivement, ces résultats suggèrent un rôle pro-tumoral de l'OSM dans le développement des CEC et le blocage de cette cytokine pourrait constituer une nouvelle alternative thérapeutique<br>Cutaneous squamous cell carcinoma (cSCC) is one of the most frequent keratinocyte malignancies worldwide and is chemotherapy resistant. Surgery is the curative treatment but there isn’t any alternative in advanced cSCC. Reprogramming tumor microenvironment and tumor immunosuppressive mechanisms is a new therapeutic approach. Indeed, depending on cytokine expressed in tumor microenvironment, immune cells can inhibit (Th1/M1 cells) or enhance (Th2/M2 cells) tumor development. It was previously showed that Onconstatin M (OSM) had pleiotropic effects on cancer cells. OSM can promote cancer by inducing tumor cells motility, invasiveness or by reprogramming immune cells toward a more permissive phenotype (M2 polarization). Our previous data showed that OSM has proinflammatory effects on skin and modulate normal keratinocyte phenotype both in vitro and in vivo. In this study, we hypothesized that OSM could be involved in cSCC development. We showed that OSM was overexpressed in human cSCC as well as other cytokines such as IL-6, IL-1β, IFNγ whereas IL-4 was decreased, suggesting a Th1/M1 polarization of cSCC microenvironment. In vitro, OSM induced STAT-3 and ERK signalization, modified gene expression, promoted proliferation and migration of malignant keratinocyte PDVC57 cells. PDVC57 cells grafted in skin mice led to cSCC development associated to OSM overexpression by immune infiltrated cells. Finally, we showed that the absence of OSM led to a 30% reduction of tumor size and reduced M2 polarization in tumor microenvironment. Collectively, these results support a pro-tumoral role of OSM in cSCC development and suggest a new therapeutic approach targeting this cytokine

Le carcinome basocellulaire (CBC) est un cancer cutané très fréquent représentant un problème de santé publique majeur. Il métastase rarement mais peut devenir très invasif localement s’il n’est pas pris en charge rapidement. Actuellement, le diagnostic de certitude du CBC est obtenu par examen anatomopathologique de coupes fines ; ce qui présente pour inconvénient d’être invasif et de donner une réponse différée. De plus, la chirurgie du CBC ne bénéficie pas d’outil permettant de définir en temps réel la largeur optimale des marges de sécurité ; celles-ci devant être minimales pour éviter les séquelles esthétiques mais suffisantes pour empêcher toute récidive. L’objectif de ces travaux de thèse est d’évaluer l’apport potentiel de la spectroscopie Raman dans la prise en charge du CBC. Cette technologie applicable in vivo grâce au développement de sondes adaptées, permet une exploration tissulaire à un niveau moléculaire relativement rapide. Au total, 32 patients ont été inclus dans cette étude. A partir des spectres enregistrés in vivo, un modèle de discrimination CBC / peau saine a été développé, à partir duquel les marges d’excision latérales ont pu être évaluées. Les marges profondes ont également été étudiées après enregistrement de spectres sur les pièces fraichement excisées. Des marqueurs Raman de discrimination ont été identifiés aux différentes échelles in vivo, ex vivo et in vitro; ils constituent des bio-indicateurs potentiels pour orienter la prise de décision chirurgicale. Enfin, la contribution des fonds spectraux, habituellement écartés des analyses Raman, a été considérée et leur intérêt dans le cadre de ce projet a été discuté<br>Basal cell carcinoma (BCC) is the most common skin cancer and a major problem for healthcare services worldwide. BCC rarely metastasizes but can become highly damaging for surrounding tissue in case of late diagnosis. Actually, the gold standard for BCC diagnosis relies on histopathological assessment of thin sections, but it is an invasive method which provides a delayed response. Moreover, it will be helpful during surgery of BCC to assess in real-time the optimal size of the security margins, which has to be small enough to minimize aesthetic sequelae but sufficient to avoid recurrence. The aim of this work is to evaluate the potential contribution of Raman spectroscopy in the management of BCC. This technology can be applied in vivo thanks to the development of appropriate probes and allows a relatively rapid tissue exploration at a molecular level. A total of 32 patients were included in this study. From in vivo recorded spectra, a model of discrimination BCC / healthy skin was implemented, from which the width of excision margins was evaluated. Deep margins were also studied after recording spectra on freshly excised pieces. Discriminant Raman markers were identified at different levels in vivo, ex vivo and in vitro; they are potential bio-indicators to help the surgeon to define ideal excision margins. In addition, the contribution of spectral backgrounds, usually removed from Raman analysis, was considered and their interest in this project was discussed

Les carcinomes cutanés constituent les cancers les plus fréquents chez l’homme et leur incidence est en constante croissance. Il en existe deux principaux types : les carcinomes baso-cellulaires et les carcinomes épidermoïdes. Les facteurs de risque sont principalement l’exposition aux rayons UV et l’immunosuppression. Ils sont traités par chirurgie ou par radiothérapie mais peuvent parfois évoluer vers des formes incurables. De nouvelles alternatives thérapeutiques sont donc nécessaires. L’immunothérapie est une récente révolution dans le traitement des cancers qui vise à réactiver l’immunité des patients cancéreux. Les carcinomes cutanés pourraient en bénéficier car ils se développent lors de situations d’immunosuppression. L’immunosurveillance implique à la fois les cellules immunitaires et le microenvironnement tumoral comme le stroma. Lorsque les réponses anti-tumorales, notamment médiées par les lymphocytes T CD8+ sont efficaces, on parle de phase d’élimination. Puis vient une phase d’équilibre où la tumeur reste stable et enfin, lors de la phase finale d’échappement, des mécanismes d’immunosuppression permettent à la tumeur de croître. Les neutrophiles, des cellules immunitaires de type myéloïde, sont recrutées très rapidement aux sites d’inflammation et au sein des cancers. Une méta-analyse récente sur 39 types de cancers humains a pu associer ces cellules aux plus mauvais pronostiques cliniques. Elles sont impliquées dans des fonctions anti-tumorales et pro-tumorales. Cette polarisation semble induite respectivement par l’interféron de type I et le TGF-β. Leur rôle lors de cancers et en particulier dans les carcinomes cutanés reste encore largement incompris. Notre objectif a été de caractériser les fonctions des neutrophiles et leur contribution au développement des carcinomes épidermoïdes. Pour cela, nous avons utilisé premièrement, un modèle de carcinogénèse cutanée chimio-induite. La tumorigénèse est séquentielle et donc très représentative du carcinome cutané chez l’homme. Dans ce modèle, nous observons une infiltration massive des neutrophiles au stade précancéreux et cancéreux. Une analyse de l’expression génique des neutrophiles isolés des lésions précancéreuses et cancéreuses et des peaux environnant ces lésions a été réalisée, qui montre une signature génique spécifique des neutrophiles des lésions, comparée aux peaux environnantes. Des comparaisons d’expression génique différentielle illustrent que les neutrophiles des lésions possèdent des fonctions pro-tumorales comparés aux neutrophiles des peaux.Deuxièmement, nous avons mis en place un modèle de greffe intradermique d’une lignée de carcinome épidermoïde. Une déplétion spécifique des neutrophiles retarde significativement la croissance tumorale, ce qui confirme le caractère pro-tumoral des neutrophiles. Nous avons caractérisé les mécanismes mis en jeu, qui incluent la génération de ROS et iNOS favorisant la croissance tumorale et une suppression de l’activation et de la prolifération des lymphocytes T CD8+ anti-tumoraux. Les neutrophiles produisent de l’arginase 1 qui dégrade l’arginine et inhibe la prolifération des lymphocytes T. Par ailleurs, l’environnement tumoral induit l’expression de PD-L1 en surface des neutrophiles et de PD1 en surface des lymphocytes T CD8+ et CD4+. Ceci suggère que l’interaction PD-L1/PD1 contribue à l’immunosuppression. De plus, une corrélation positive et significative a été observée entre la taille des tumeurs et la fréquence des neutrophiles exprimant PD-L1 au sein de ces tumeurs. Au vu de ces résultats, il semble intéressant d’évaluer les immunothérapies bloquant l’interaction PD-L1/PD1 dans le traitement des carcinomes cutanés. Ces traitements pourraient être combinés avec ceux qui bloquent le recrutement ou les fonctions des neutrophiles. Il reste à évaluer si la fréquence de neutrophiles exprimant PD-L1 peut être un bon marqueur de prédiction de la réponse aux immunothérapies anti-PD-L1 ou anti-PD1<br>Non-melanoma skin carcinomas are the most frequent cancers in Human and their incidence is constantly increasing. Two main types exist: the cutaneous basal cell carcinoma (cBCC) and the cutaneous squamous cell carcinomas (cSCC). Risk factors include sun radiation and immunosuppression. These cancers are mainly treated with surgery and radiotherapy but they can reach an incurable stage. For this reason, novel therapeutic alternatives are needed. At present, immunotherapies constitute a revolution in the treatment of cancers. Its mechanism of action relies on the stimulation of the immune system of cancer patients, so that they develop efficient anti-tumoral immune responses. cSCC may benefit from this type of treatment as they generally develop in the context of an immunosuppression. Immune surveillance involves both immune cells and the tumor microenvironment, in particular the stroma. During the elimination phase, the anti-tumoral responses, mediated mainly by CD8+ T lymphocytes, are efficient. Then, there is an equilibrium phase in which the tumor is stable before the escape phase, when the tumor can evade immune surveillance and grow. Our research interest focused on neutrophils, a subset of myeloid cells that are very rapidly recruited to the sites of inflammation and inside tumors. A recent meta-analysis of 39 human malignancies showed that neutrophils are associated with the worst clinical outcome. Neutrophils harbor both anti- and pro-tumoral functions. This polarization seems to be dependent on type I interferon and TGF-β, respectively. It remains to establish the exact role played by neutrophils in cancer and specifically in skin carcinomas. The aim of our research was to further characterize the functions and the contribution of neutrophils to the development of cutaneous squamous cell carcinomas. We first used a chemically-induced skin carcinoma mouse model that recapitulates the different stages of skin carcinoma development in Human. In this model, we saw a massive infiltration of neutrophils at the precancerous and cancerous stages. We performed transcriptomic analysis of highly purified neutrophil populations from precancerous, cancerous lesions and from the surrounding skin controls. These data revealed a specific gene signature in neutrophils from lesions compared to surrounding skins. Differential gene expression analysis identified a pro-tumoral phenotype for neutrophils infiltrating lesions compared to skins. In a second approach, we studied the growth of a cSCC cell line grafted in the dermis of mice. Specific depletion of neutrophils significantly delayed tumor growth, thus indicating that neutrophils were pro-tumoral. Mechanisms of action included the production of ROS and NO that favor tumor growth and the immune suppression of anti-tumoral responses mediated by tumor-associated CD8+ T cells. In the tumor, neutrophils produced arginase 1 which catalyzes the degradation of arginine, thus inhibiting the proliferation of CD8+ T cells. In addition, we found that the tumor microenvironment induced PD-L1 expression at the cell surface of neutrophils and concomitantly, PD1 on CD8+ and CD4+ T cells. These results suggested that PD-L1/PD1 interaction triggers immune suppression and contributes to SCC progression. Indeed, a positive and significant correlation was observed between tumor size and frequencies of PD-L1-expressing neutrophils inside tumors. Collectively, these results suggest that it is relevant to assess immunotherapies that block PD-L1/PD1 interaction for the treatment for cSCC. These approaches could be combined with treatments that aim to block the recruitment or inhibit neutrophils. Moreover, it remains to evaluate whether the frequency of PD-L1-expressing neutrophils could constitute a good predictive marker of the response to anti-PD-L1 and anti-PD1 immunotherapies

Nous avons pu démontrer que des variants non associés au phénotype « cheveux roux » (Red Hair Color). Comme les variants V60L et V92M. étaient fortement assoeiés au risque de développement de CBC dans la population française (OR 3,21 et 2. 87). Un effet « dose-gène » associé au développement des carcinomes baso-cellulaire, c'est-à-dire l'expression combinée de plusieurs variants MC1R, dans la population que nous avons étudiée, a été clairement identifié (OR pour un variant : 2. 17 et deux variants : 7. 72). Nous avons pu corréler le génotype (c. 3944C&gt;T(P1315L) du gène PTCH au risque de développer des CBC (OR 1,94), et ce chez des sujets atteints de CBC multiples (OR 2,16). Dans un deuxième aspect plus moléculaire, nous avons étudié in vitro dans les cellules HeLa, le rôle de la protéine p161NK4A dans la réponse aux UVB. Des données récentes de la littérature suggèrent une augmentation de l'expression protéique de p16INK4A 24 heures après exposition aux UVB dans des kératinocytes. Corrèlée à un arrêt du cycle cellulaire en G2/M. Pour établir un rôle fonctionnel de p16INK4A dans l'arrêt du cycle cellulaire et les processus de réparation de l'ADN, nous avons choisi d'invalider p16INK4A in vitro dans des cellules HeLa en utilisant une stratégie d'ARN interférant. Nous avons montré que l'inhibition de l'expression protéique de p16INK4A dans les cellules exposées aux UVB ne modifiait pas l'arrêt des cellules en G2/M. De même, dans les conditions expérimentales choisies, nous n'avons pas observé de différence significative en terme de réparation des lésions de l'ADN induites par l'UVB dans les cellules HeLa exprimant ou non p161NK4A<br>L/We were able to demonstrate that variants not associated to the phenotype " red hair " (Red Hair Color). As variants V60L and V92M, were strongly associated with the risk of development of CBC in french population(OR3,21 and 2,87). A "dose-gene" effect associated to the development of the CBC, meaning combined expression of several MC1R variants, in the population that we studied, was clearly identified (OR for one : 2. 17 and two variants: 7,72). Besides, we were able to correlate the genotype (C. 3944C &gt; T ( P1315L) of the gene PTCH al the risk of developing CBC (OR 1,94) in patients with CBC multiple (OR 2,16). Il/ To establish the functional role of p16INK4A in the cell cycle arrest and the processes of DNA repair, we decided supress p16INK4A in vitro in HeLa cells by using the strategy of RNAi. HeLa Cell were used as a cellular support of our study since they are also deficient in p53 function. We shovved that the inhibition of the protein expression of p16INK4A in UVB irradiated cells did not modify the cell cycle arrest in G2/M Also. In the given experimental conditions, we did not observe significant difference in terms of DNA repair caused by UVB irradiation in cells expressing or not p16INK4A

Lo studio ha posto l'attenzione sul rapporto costo-efficacia tra le metodiche più utilizzate per la rimozione di carcinomi basocellulari: l'asportazione chirurgica e la terapia fotodinamica. Dai dati si evince che la rimozione chirurgica è la metodica più efficace per la minore frequenza di recidive (4.7%) rispetto alla terapia fotodinamica (6%). Questo dato è valido unicamente per i carcinomi superficiali; per i carcinomi nodulari la frequenza di recidiva con la terapia fotodinamica risulta essere più elevata (35%). La chirurgia è una metodica più costosa rispetto alla fotodinamica. La variabile dolore risulta essere minore per la chirurgia rispetto alla fotodinamica. Il risultato estetico invece è migliore per la fotodinamica rispetto alla terapia chirurgica. I costi invece sono più elevati per la terapia chirurgica. Rimane un'ultima considerazione: la terapia fotodinamica richiede talvolta un nuovo intervento a distanza di mesi o anni e pertanto questa scelta comporta costi aggiuntivi.<br>The study focused attention on the cost-effectiveness among the most popular methods used for removal of basal cell carcinomas: surgical resection and photodynamic therapy. From data it is clear that surgical removal is the most effective method for reducing the frequency of relapses (4.7%) compared to photodynamic therapy (6%). This figure is valid only for superficial carcinomas; for nodular carcinomas frequency of recurrence with photodynamic therapy turns out to be higher (35%). Surgery is a method more expensive than the photodynamic. The variable pain is less with surgery than the photodynamic therapy. The aesthetic result is rather better for photodynamic therapy compared to surgery. The costs however are higher for surgical therapy. One final consideration remains: photodynamic therapy sometimes requires reoperation after months or years and so this choice involves additional costs.

Lo studio ha posto l'attenzione sul rapporto costo-efficacia tra le metodiche più utilizzate per la rimozione di carcinomi basocellulari: l'asportazione chirurgica e la terapia fotodinamica. Dai dati si evince che la rimozione chirurgica è la metodica più efficace per la minore frequenza di recidive (4.7%) rispetto alla terapia fotodinamica (6%). Questo dato è valido unicamente per i carcinomi superficiali; per i carcinomi nodulari la frequenza di recidiva con la terapia fotodinamica risulta essere più elevata (35%). La chirurgia è una metodica più costosa rispetto alla fotodinamica. La variabile dolore risulta essere minore per la chirurgia rispetto alla fotodinamica. Il risultato estetico invece è migliore per la fotodinamica rispetto alla terapia chirurgica. I costi invece sono più elevati per la terapia chirurgica. Rimane un'ultima considerazione: la terapia fotodinamica richiede talvolta un nuovo intervento a distanza di mesi o anni e pertanto questa scelta comporta costi aggiuntivi.<br>The study focused attention on the cost-effectiveness among the most popular methods used for removal of basal cell carcinomas: surgical resection and photodynamic therapy. From data it is clear that surgical removal is the most effective method for reducing the frequency of relapses (4.7%) compared to photodynamic therapy (6%). This figure is valid only for superficial carcinomas; for nodular carcinomas frequency of recurrence with photodynamic therapy turns out to be higher (35%). Surgery is a method more expensive than the photodynamic. The variable pain is less with surgery than the photodynamic therapy. The aesthetic result is rather better for photodynamic therapy compared to surgery. The costs however are higher for surgical therapy. One final consideration remains: photodynamic therapy sometimes requires reoperation after months or years and so this choice involves additional costs.

Entre 1981 et 1991, 621 lésions tumorales ou prétumorales ont été traitées par cryochirurgie dans le service de dermatologie du CHU de Rouen. Deux cryogènes ont été employés : l'azote liquide et le protoxyde d'azote avec des résultats sensiblement identiques. Les bons résultats carcinologiques et esthétiques de la cryochirurgie en font un mode de traitement de choix pour les carcinomes cutanés des sujets âgés principalement au niveau de la face.

Il carcinoma a cellule basali (BCC) costituisce l'80 peercento dei tumori cutanei non-melanoma, rappresentando dunque il tumore maligno della cute più frequente nella popolazione generale. Tuttavia, non esistono ad oggi studi epidemiologici ampi ed approfonditi condotti su scala nazionale su questo tipo di neoplasia, poichè i tumori cutanei non-melanoma sono esclusi dal registro statistico dei tumori. A tale scopo presso la Dermatologia dell'Università di Bologna sono stati raccolti di tutti i casi di carcinoma basocellulare osservati dal 1 gennaio 1990 sino al 31 dicembre 2014, e sono stati rielaborati statisticamente. Il criterio di inclusione adottato è stato la positività per BCC all’esame istologico, sia in caso di biopsia semplice, sia in caso di asportazione radicale. Il progetto è stato svolto presso l’ambulatorio di chirurgia oncologica della nostra UO, così come il follow-up dei pazienti nei casi di recidività multiple o di comparsa di nuovi tumori cutanei. Ad oggi, tale neoplasia è risultata essere quella di più frequente osservazione nella Unità Operativa di Dermatologia dell’Università di Bologna. Non solo, la nostra casistica rimane quella più numerosa fino ad ora riportata in tutta Italia negli ultimi 24 anni.<br>Basal cell carcinoma (BCC) accounts for 80 percent of non-melanoma skin cancer, thus representing the most common malignant tumor of the skin. Nonetheless in our country the absolute incidence of BCC is difficult to establish with precision, since non-melanoma skin cancers are excluded from the statistical records of the tumors. The aim of the study we conducted was therefore to analyze retrospectively the cases of BCC of the Dermatology Unit of Bologna, in a period between 1990 and 2014. The inclusion criteria has been the positivity to BCC at histological examination, both in case of a simple biopsy, and in case of radical excision. Patients have been medical and/or surgical treated and followed up, in cases of multiple relapses or occurrance of new skin tumors, at the Oncologic-Dermatological-Surgery Unit of University of Bologna. We concluded that, by far, than any other skin cancers, basal cell carcinoma is the most frequently tumor observed in the Dermatology Unit of the University of Bologna. Not only that, our case study is also the largest so far reported throughout Italy in the last 24 years.

Il carcinoma a cellule basali (BCC) costituisce l'80 peercento dei tumori cutanei non-melanoma, rappresentando dunque il tumore maligno della cute più frequente nella popolazione generale. Tuttavia, non esistono ad oggi studi epidemiologici ampi ed approfonditi condotti su scala nazionale su questo tipo di neoplasia, poichè i tumori cutanei non-melanoma sono esclusi dal registro statistico dei tumori. A tale scopo presso la Dermatologia dell'Università di Bologna sono stati raccolti di tutti i casi di carcinoma basocellulare osservati dal 1 gennaio 1990 sino al 31 dicembre 2014, e sono stati rielaborati statisticamente. Il criterio di inclusione adottato è stato la positività per BCC all’esame istologico, sia in caso di biopsia semplice, sia in caso di asportazione radicale. Il progetto è stato svolto presso l’ambulatorio di chirurgia oncologica della nostra UO, così come il follow-up dei pazienti nei casi di recidività multiple o di comparsa di nuovi tumori cutanei. Ad oggi, tale neoplasia è risultata essere quella di più frequente osservazione nella Unità Operativa di Dermatologia dell’Università di Bologna. Non solo, la nostra casistica rimane quella più numerosa fino ad ora riportata in tutta Italia negli ultimi 24 anni.<br>Basal cell carcinoma (BCC) accounts for 80 percent of non-melanoma skin cancer, thus representing the most common malignant tumor of the skin. Nonetheless in our country the absolute incidence of BCC is difficult to establish with precision, since non-melanoma skin cancers are excluded from the statistical records of the tumors. The aim of the study we conducted was therefore to analyze retrospectively the cases of BCC of the Dermatology Unit of Bologna, in a period between 1990 and 2014. The inclusion criteria has been the positivity to BCC at histological examination, both in case of a simple biopsy, and in case of radical excision. Patients have been medical and/or surgical treated and followed up, in cases of multiple relapses or occurrance of new skin tumors, at the Oncologic-Dermatological-Surgery Unit of University of Bologna. We concluded that, by far, than any other skin cancers, basal cell carcinoma is the most frequently tumor observed in the Dermatology Unit of the University of Bologna. Not only that, our case study is also the largest so far reported throughout Italy in the last 24 years.

Introducció: Els carcinomes de queratinòcits (CQ) són la neoplàsia maligna més freqüent a nivell mundial en poblacions caucàsiques. En conjunt, suposen un enorme problema de salut, tant en termes de morbiditat com de despesa sanitària. En les darreres dècades, la seva incidència ha augmentat de manera significativa. A més a mes, pel que fa al carcinoma basocel·lular (CBC), han augmentat dramàticament els casos entre la gent jove, sobretot dones. Els CQ tenen, en general, un bon pronòstic. Malgrat això, el CBC pot créixer localment destruint els teixits circumdants i causant importants seqüeles funcionals i estètiques, i el carcinoma escatós (CEC) és moderadament invasiu i es pot associar a un risc substancial de recurrències locals, metàstasis i mort (1.5-4 %). La fisiopatologia dels CQ és dependent de l’alteració de diverses vies de transducció de senyals i de control de la proliferació. Un dels efectes d’aquestes alteracions és la secreció de noves proteïnes a l’espai extracel·lular, que caracteritzaran el microambient tumoral. Les proteïnes i metabòlits senyalitzadors presents en el fluid intersticial que envolta el tumor (TIF) han estat estudiats en alguns tipus tumorals, però no hi ha res descrit pel que fa als CQ. Objectius: Aquesta tesi té dos objectius principals: 1) Estudi epidemiològic i de factors de risc del CBC a Catalunya (Capítol I), i 2) Caracteritzar el perfil proteòmic del TIF en els CQ i les implicacions en la seva fisiopatologia (Capítols II i III). Resultats i conclusions: En l’estudi epidemiològic hem observat que entre els < 60 anys el CBC ja és un tumor que té una incidència major en dones que en homes. Els factors de risc independents pel CBC en gent jove són el fototipus cutani, la història familiar de CQ, i la presència de ≥ 4 cremades a la infància. A més a més, la presència de repetides cremades a la infància és superior entre els casos de CBC en gent jove localitzats en zones cobertes que entre els localitzats en zones fotoexposades. De tots els factors de risc, entre la població general, l’ús de cabines de bronzejat és l’únic que és més freqüent entre les dones que entre els homes; per tant, la popularització del seu ús podria ser la causa de la tendència a la predominança femenina del CBC. En la segona part de la tesi, primer s’ha posat a punt el mètode d’aïllament de TIF. La centrifugació a 10 000 g permet obtenir una quantitat superior de proteïnes extracel·lulars, major sensibilitat i un maneig més ràpid i fàcil de les mostres, sense implicar un augment de la lisi cel·lular respecte als altres mètodes. Per aquests motius, la proposem com a mètode d’elecció en les mostres de tumors cutanis. L’anàlisi proteòmica mostra que el CBC, el CEC i la pell sana tenen cadascun un perfil específic de proteïnes secretades al seu TIF i suggereix l’existència d’una diferent resposta immunològica de l’organisme en front al CBC i al CEC. Hem determinat que la secreció de les proteïnes PNP, FABP5, SFN i LAD1 és un perfil propi del CEC, i que estan relacionades amb l’agressivitat tumoral i podrien ser dianes terapèutiques per al seu tractament. A més a més, el patró d’expressió de FABP5 permet distingir les zones diferenciades de les invasives en el CEC. També existeix una diferent localització cel·lular de l’SFN i la LAD1 en la pell sana vs. CEC, que podria estar relacionada amb el desenvolupament tumoral. Finalment, la secreció de cornulina és un marcador de CBC i tendeix a associar-se amb els subtipus més agressius.<br>Introducción: Los carcinomas de queratinocitos (CQ) son la neoplasia maligna más frecuente a nivel mundial en poblaciones caucásicas. En conjunto, suponen un enorme problema de salud, tanto en términos de morbilidad como de gasto sanitario. En las últimas décadas, su incidencia ha aumentado de manera significativa. Además, en el carcinoma basocelular (CBC), han aumentado dramáticamente los casos entre la gente joven, sobre todo mujeres. Los CQ tienen, en general, un buen pronóstico. A pesar de ello, el CBC puede crecer localmente destruyendo los tejidos circundantes y causar importantes secuelas funcionales y estéticas, y el carcinoma escamoso (CEC) es moderadamente invasivo y se puede asociar a un riesgo sustancial de recurrencias locales, metástasis y muerte (1.5-4 %). La fisiopatología de los CQ es dependiente de la alteración de varias vías de transducción de señales y de control de la proliferación. Uno de los efectos de estas alteraciones es la secreción de nuevas proteínas en el espacio extracelular, que caracterizarán el microambiente tumoral. Las proteínas y metabolitos señalizadores presentes en el fluido intersticial que rodea el tumor (TIF) han sido estudiados en algunos tipos tumorales, pero no hay nada descrito en cuanto a CQ. Objetivos: Esta tesis tiene dos objetivos principales: 1) Estudio epidemiológico y de factores de riesgo del CBC en Cataluña (Capítulo I), y 2) Caracterizar el perfil proteómico del TIF en los CQ y las implicaciones en su fisiopatología (Capítulos II y III). Resultados y conclusiones: En el estudio epidemiológico se ha observado que entre los < 60 años el CBC ya es un tumor que tiene una incidencia mayor en mujeres que en hombres. Los factores de riesgo independientes para el CBC en gente joven son el fototipo cutáneo, la historia familiar de CQ, y la presencia de ≥ 4 quemaduras en la infancia. Además, la presencia de repetidas quemaduras en la infancia es superior entre los casos de CBC en gente joven localizados en zonas cubiertas que entre los localizados en zonas fotoexpuestas. De todos los factores de riesgo, en la población general, el uso de cabinas de bronceado es el único que es más frecuente entre las mujeres que entre los hombres; por lo tanto, la popularización de su uso podría ser la causa de la tendencia a la predominancia femenina del CBC. En la segunda parte de la tesis, primero se ha puesto a punto el método de aislamiento de TIF. La centrifugación a 10 000 g permite obtener una cantidad superior de proteínas extracelulares, mayor sensibilidad y un manejo más rápido y fácil de las muestras, sin implicar un aumento de la lisis celular respecto a los otros métodos. Por estos motivos, la proponemos como método de elección en las muestras de tumores cutáneos. El análisis proteómico muestra que el CBC, el CEC y la piel sana tienen cada uno un perfil específico de proteínas secretadas en su TIF y sugiere la existencia de una diferente respuesta inmunológica del organismo frente al CBC y al CEC. Hemos determinado que la secreción de las proteínas PNP, FABP5, SFN y LAD1 es un perfil propio del CEC, y que están relacionadas con la agresividad tumoral y podrían ser dianas terapéuticas para su tratamiento. Además, el patrón de expresión de FABP5 permite distinguir las zonas diferenciadas de las invasivas en el CEC. También existe una diferente localización celular de la SFN y la LAD1 en la piel sana vs. CEC, que podría estar relacionada con el desarrollo tumoral. Finalmente, la secreción de cornulina es un marcador de CBC y muestra tendencia a asociarse con los subtipos más agresivos.<br>Introduction: Keratinocyte carcinomas (KC) are the most frequent malignancy in Caucasian populations worldwide. Altogether, they entail a huge health problem, both in terms of morbidity and health costs. In recent decades, their incidence has increased significantly. Moreover, basal cell carcinoma (BCC) cases have increased dramatically among young people, especially women. KC generally have a good prognosis. Despite this, BCC can grow locally, destroying surrounding tissues and causing important functional and aesthetic sequelae; and squamous cell carcinoma (SCC) is moderately invasive and can be associated with a substantial risk of local recurrences, metastasis, and death (1.5- 4 %). The physiopathology of KC depends on the alteration of several signal transduction pathways and proliferation control. One effect of these alterations is the secretion of new proteins in the extracellular space, which will characterize the tumor microenvironment. The signaling proteins and metabolites present in the interstitial fluid surrounding the tumor (TIF) have been studied in some tumor types, but nothing has been described in terms of KC. Objectives: This thesis has two main objectives: 1) Epidemiological and risk factors study of BCC in Catalonia (Chapter I), and 2) Characterization of the proteomic profile of TIF in KC and the implications in their physiopathology (Chapters II and III). Results and conclusions: In the epidemiological study, it has been revealed that, among those <60 years, BCC is already a tumor that has a higher incidence in women than in men. Independent risk factors for BCC in young people are skin phototype, family history of KC, and the presence of ≥ 4 sunburns in childhood. In addition, the presence of repeated sunburns in childhood is higher among BCC cases in young people in covered areas than among those in photo-exposed areas. Of all the risk factors, among the general population, the use of tanning beds is the only one that is more common among women than among men; therefore, the popularization of their use could be the crucial factor for the trend towards the female predominance of BCC. In the second part of the thesis, the TIF isolation method has been first developed. Centrifugation at 10 000 g allows obtaining a higher amount of extracellular proteins, greater sensitivity, and faster and easier handling of the samples, without increasing cell lysis when compared to other methods. For these reasons, we propose it as the method of choice in samples of skin tumors. The proteomic analysis shows that BCC, SCC, and healthy skin each have a specific profile of secreted proteins in their TIF, and suggests the existence of a different immune response of the organism against BCC and SCC. We have determined that the secretion of PNP, FABP5, SFN, and LAD1 proteins is a specific SCC profile, and that they are related to tumor aggressiveness and could be therapeutic targets for its treatment. Furthermore, the expression pattern of FABP5 makes it possible to distinguish differentiated from invasive areas in SCC. There is also a different cellular location of SFN and LAD1 expression in healthy skin vs. SCC, which could be related to tumor development. Finally, cornulin secretion is a BCC marker and tends to associate with the most aggressive subtypes.

L’étiologie des cancers cutanées est liée à des mutations génétiques résultant de l’exposition aux rayonnements ultraviolets (UV) émis par le soleil. La propagation des cellules cancéreuses dépend aussi des interactions avec les cellules présentes dans le microenvironnement circulant, notamment des fibroblastes associés au cancer (FAC) et des cellules immunitaires. Xeroderma pigmentosum (XP) est une maladie génétique qui comprend 7 groupes de complémentation génétique (XP-A à XP-G). Les patients XP présentent une déficience du mécanisme de réparation des lésions de l’ADN provoquées par les UV. Ces patients sont susceptibles au développement précoce de très nombreux cancers cutanées. XP-C est le groupe de complémentation le plus représenté en Europe. Chez ces patients, les carcinomes spino-cellularies (CSC) sont plus fréquents que les carcinomes baso-cellulaires (CBC) (taux 5 : 1). Les CSC ont un potentiel métastatique plus élevé que les CBC. Des travaux précédents ont suggéré que la réponse immunitaire chez les patients XP pouvait être altérée, incluant un déficit de l’activité cytolytique des cellules Natural Killer (NK) et une diminution du nombre des lymphocytes T circulants.L’objectif central de cette thèse était, d’identifier des facteurs du microenvironnement impliqués dans la progression des cancer cutanées agressifs, en prenant comme modèle de susceptibilité au cancer, des cellules de patients XP-C. Une analyse transcriptomique comparant les fibroblastes WT et des patients XP-C a permis d’identifier que CLEC2A, un ligand activateur du récepteur NKp65 des cellules NK, est exprimé par les fibroblastes WT mais pas par les fibroblastes XP-C. Nos travaux ont pu montrer une diminution du niveau d’expression de CLEC2A au cours de la sénescence réplicative ; une absence dans les FAC et dans les CSC et que, des facteurs solubles secrétés para les CSC diminuent l’expression de CLEC2A. Ces résultats suggèrent que la perte de CLEC2A peut induire un déficit d’activation des cellules NK au sein du microenvironnement tumoral et dans les dermes des patients XP-C. Par la suite, nous avons élaboré un modèle de culture de peau 3D, dans lequel nous avons introduit des cellules NK, en présence ou absence d’anticorps bloquants CLEC2A. Ce modèle nous a permis de montrer que l’interaction CLEC2A/NKp65 régule l’invasion des CSC via un dialogue entre fibroblastes et cellules NK. Nos résultats suggèrent que l’expression de CLEC2A dans les fibroblastes WT contribue à la surveillance immunitaire dans la peau et que son absence, par des facteurs encore inconnus, favorise le développement des cancers agressifs chez les patients XP-C. CLEC2A peut être une cible dans le combat contre la progression des CSC<br>Skin cancer etiology is related to genetic mutations arising after ultraviolet (UV) sun exposure. The propagation of cancer cells is also dependent of a crosstalk with cells present in the surrounding microenvironment, mainly cancer associated fibroblasts (CAF) and immune cells. Xeroderma pigmentosum (XP) is a genetic disease that comprises seven groups of genetic complementation (XP-A to XP-G). XP patients present a default in the mechanism responsible for the repair of UV-induced DNA lesions. They are prone to develop skin cancers with high frequencies early in their life. XP-C is the most represented complementation group in Europe and in XP-C patients squamous cell carcinoma (SCC) are more frequent than basal cell carcinoma (BCC) (ratio 5:1). SCC have high metastatic potential compared to BCC. Previous studies suggested that the immune responses in XP patients could be altered with defects in their NK lytic activity and a decrease in the levels of circulating T lymphocytes. The main objective of this thesis was to identify microenvironment factors that could contribute to the progression of aggressive skin cancers using XP-C disease cells as a model of skin cancer susceptibility. Comparative transcriptomic analysis of WT and XP-C dermal patient’s fibroblasts revealed that CLEC2A, a ligand of the activating NK receptor NKp65 implicated in the activation of the innate immune system, is expressed in WT fibroblasts and absent in XP-C fibroblasts. Additional work showed that CLEC2A level is decreased in WT fibroblasts during replicative senescence, is absent in CAF and SCC, and is down regulated by soluble factors secreted by SCC cells. These results suggest that the loss of CLEC2A may induce a deficit of NK cell activation in the tumor microenvironment of SCC and in the dermis of XP-C patients. Elaboration of 3D skin culture models including NK cells and, in the presence or absence of blocking anti-CLEC2A antibody, allowed us to show that CLEC2A/NKp65 interaction regulates SCC cells invasion through a crosstalk between fibroblasts and NK cells. Our results suggest that the expression of CLEC2A in fibroblasts contributes to skin immune surveillance while, conversely, its absence under yet unidentified factors, favors the development of aggressive cancers in XP-C patients. CLEC2A could be a potential target in the fight against SCC progression

El carcinoma escamoso cutáneo es el segundo cáncer cutáneo más frecuente. A pesar de que la mayoría de los pacientes se diagnostican en etapas precoces y la cirugía es curativa, aproximadamente un 5% de los pacientes desarrollan metástasis, generalmente a territorios linfáticos vecinos, lo que empeora el pronóstico con una supervivencia menor al 20% a los 10 años. Existen diferentes sistemas de clasificación que permiten estratificar a los pacientes en función del riesgo metastásico. Uno de las más utilizados es la clasificación de la American Joint Committee on Cancer, la AJCC8, y ha demostrado ser superior a otros sistemas de clasificación a la hora de identificar los pacientes de alto riesgo. No obstante, es necesario identificar nuevos factores pronósticos. Recientemente se ha estudiado el papel en cáncer de la familia de represores epigenéticos Polycomb que actúan como represores de la transcripción y silencian los genes sobre los que actúan. Se han descrito dos grupos en mamíferos: el complejo 2 o de iniciación, cuya subunidad catalítica más importante es EZH2 y el complejo 1 o de mantenimiento, cuya subunidad más importante es RING1B. Su expresión se ha demostrado en diferentes tumores sólidos y está aumentada en tumores metastásicos. Con el fin de estudiar el papel de las proteínas Polycomb en carcinoma escamoso cutáneo realizamos un estudio retrospectivo multicéntrico en el que se incluyeron un total de 107 carcinomas escamosos, 56 CEC primarios que dieron lugar a metástasis (metastásicos) y 51 CEC primarios no metastásicos (grupo control) que no habían desarrollado metástasis en un período de seguimiento de 5 años. En nuestro primer estudio demostramos, mediante técnicas de inmunohistoquímica que EZH2 y RING1B están sobreexpresados en carcinomas escamosos cutáneos metastásicos. Mediante estudios funcionales en líneas celulares de carcinoma escamoso hemos observado que EZH2 y RING1B regulan la vía NF-kb; de forma inversa, es decir en las células en las que se depleciona Polycomb la vía NF-kb está activada. La vía NF-kb está asociada a inflamación. Pudimos observar que la quimiotaxis de neutrófilos era mayor hacia los sobrenadantes procedentes de cultivos celulares en los que se ha deplecionado Polycomb. Además, valoramos el infiltrado inflamatorio en los microarrays de tejidos tumorales y observamos que los carcinomas escamosos no metastásicos presentaban un porcentaje mayor de neutrófilos y eosinófilos en el estroma. Por lo tanto, las proteínas Polycomb pueden estar silenciando genes implicados en la respuesta inmune del queratinocito, de tal manera que la expresión de polycomb reprimiría la respuesta inmune antitumoral y favorecería el escape de las células tumorales y el desarrollo de metástasis a distancia. El microambiente tumoral formado por el estroma, la celularidad inflamatoria acompañante, los fibroblastos asociados al tumor y las células endoteliales de los vasos sanguíneos no son simples observadores sino que interactúan con las células tumorales. Además de las células inflamatorias, los fibroblastos asociados al tumor pueden facilitar o impedir la diseminación de las células tumorales por su capacidad de producir diferentes tipos de fibrosis con valor pronóstico. La desmoplasia se ha asociado tradicionalmente a mal pronóstico y en algunos tumores sólidos, como el adenocarcinoma de páncreas, el estroma desmoplásico, supone una barrera para el infiltrado de las células tumorales y la difusión de fármacos quimioterápicos. En algunos tumores sólidos como en carcinoma colorrectal se han descrito diferentes patrones de reacción fibrótica con valor pronóstico. En nuestro segundo estudio investigamos los diferentes patrones de reacción fibrótica en nuestra serie de carcinomas escamosos cutáneos. El patrón inmaduro, caracterizado por cambios mixoides sin inflamación, se asociaba con gemación tumoral, desmoplasia, invasión perineural, profundidad tumoral y el desarrollo de metástasis.<br>Cutaneous squamous cell carcinoma is the second most common skin cancer. Despite the majority of patients are diagnosed at an early stage and surgical excision is curative, about 5% of patients develop metastasis, usually to regional lymph nodes, and prognosis worsens with a 10- year overall survival of less than 20%. There are different classification systems that allow stratifying patients in function of the metastatic risk. The new American Joint Committee on Cancer classification, AJCC8, is superior in identifying high risk patients but there is much more to investigate in this field. Recently, the expression of the family of transcriptional repressors Polycomb, that silence and inactivate the genes that they regulate, have been detected in different solid tumors and it is increased in metastatic tumors. Two complexes have been identified in mammals, PCR2 or initiation complex, being EZH2 its main catalytic subunit and PRC1 or maintenance complex formed by different proteins such as RING1B and BMI1. We performed a multicentric descriptive study and 107 cutaneous squamous cell carcinomas were included; 56 metastatic carcinomas and 51 non-metastatic carcinomas that hadn´t developed metastases in a 5-year period time. In our first study we have demonstrated, using immunohistochemical stains, that EZH2 and RING1B expression is increased in metastatic cutaneous squamous cell carcinomas. In vitro functional studies using cell lines revealed that EZH2 and RING1B regulate NF-kb, since NF-kb, pathway is upregulated in Polycomb deplected cells. NF-kb, pathway is associated with inflammation. We could observe that chemotaxis of neutrophils is higher towards supernatants from cell cultures in which Polycomb proteins have been deplected. In our group of non-metastatic cutaneous squamous cell carcinomas we detected lower levels of Polycomb proteins expression using immunohistochemical stains, lower percentage of cells expressing Polycomb and lower intensity of Polycomb expression. When evaluating the inflammatory infiltrate, and despite using tissue microarrays we could also observe that non metastatic carcinomas showed higher amount of neutrophils and eosinophils in their stroma. Polycomb proteins may act silencing genes implicated in the immune response of keratinocytes and may favour the escape of tumoral cells from the immune system and the development of distant metastasis. Tumor microenvironment is not just an observer and plays an important role interacting with tumoral cells. Besides inflammatory cells, stromal fibroblasts can facilitate or inhibit tumoral cell dissemination, since they can produce different types of fibrosis with a prognostic value. Desmoplasia has always been linked to worse prognosis and some solid tumors such as pancreatic adenocarcinoma are characterized by a desmoplastic stroma which is a barrier to immune cell infiltratrion and also to chemotherapy. Ueno et al described three different types of fibrotic reaction in colorrectal carcinoma with prognostic value. In our second study we investigated the different fibrotic reaction patterns in whole hematoxilin-eosin stained sections in our series. The immature pattern characterized by myxoid changes with no inflammation was associated with tumoral budding, desmoplasia, perineural invasion, tumoral depth and metastatic risk.

El carcinoma escatós cutani (CEC) és el segon tumor maligne cutani més freqüent. La majoria dels CECs es desenvolupen a partir de lesions precursores (queratosis actíniques [QA]). No obstant, només una minoria de QA evolucionen a CECs sense que es coneguin, de forma precisa, els mecanismes que participen en aquesta transformació. Tot i que en la majoria dels casos el pronòstic del CEC és excel·lent, hi ha un petit grup de tumors considerats d’alt risc (metastàtics o localment avançats) que presenten una evolució agressiva i mal pronòstic. En l’actualitat no hi ha biomarcadors fiables en la pràctica clínica que permetin detectar els CECs amb més risc metastàtic. S’ha proposat que l’expressió de PD-L1 per les cèl·lules tumorals podria ser un marcador pronòstic en diferents tumors. Si bé la seva utilitat en el CEC no ha estat prèviament estudiada, diferents assaigs clínics amb nous fàrmacs dirigits enfront de l’eix PD1 / PD- L1 en CECs han mostrat resultats esperançadors. L’objectiu d’aquesta tesi és estudiar els mecanismes moleculars implicats en les diferents etapes de la carcinogènesi del CEC (des de la pell sana fotoexposada [PF] fins al CEC metastàtic) amb la finalitat d’identificar els gens i les vies moleculars implicades en la seva progressió i determinar possibles factors pronòstics. A la primera part d’aquest treball hem estudiat les diferències transcripcionals i genòmiques en PFs, QAs i CECs a partir de 30 mostres aparellades per pacient, analitzades utilitzant plataformes d’arrays. Els resultats obtinguts els hem confirmar per tècniques de RT-qPCR, immunohistoquímica i Western blot. Hem identificat dos factors de transcripció, BNC1 i FOSL1, l’expressió dels quals es troba augmentada en el CEC i que podrien actuar com a gens essencials en la transformació tumoral. La integració de les dades obtingudes en els estudis de transcriptòmica i de genòmica mostra que les alteracions en el número de còpies del gen NEK10 es correlacionaven amb els nivells d’expressió de NEK10. Aquest gen codifica un quinasa relacionada amb el gen NIMA ( “Never in Mitosi gene A”), localitzada en una regió de mida petita a la banda 3p24.1, delecionada en 7 dels 10 CECs estudiats. Mitjançant tècniques d’ immunohistoquímica i de Western blot hem confirmat la pèrdua progressiva de l’expressió de NEK10 des de la PF fins al CEC i la realització d’estudis funcionals ens ha permès demostrar la seva participació en la regulació del cicle cel·lular en cèl·lules epitelials HaCaT. Tot això recolza el paper de NEK10 com a gen supressor tumoral en el CEC. A la segona part d’aquest treball hem estudiat el valor pronòstic dels nivells de PD-L1 en el CEC, analitzant la seva expressió mitjançant immunohistoquímica en 99 CECs primaris amb metàstasis limfàtiques (n = 48) i sense metàstasis (n = 51) i en 24 metàstasis limfàtiques. Hem observat una associació entre l’expressió de PD-L1 en ≥ 1% de les cèl·lules tumorals i la presència de metàstasis limfàtiques, així com amb la recurrència, una mala diferenciació histopatològica i la presència d’invasió perineural. En la majoria dels casos (90%) existia una bona concordança en l’expressió de PD-L1 entre els CEC primaris i les seves metàstasis, amb una tendència cap a una expressió més important en les últimes. No hem trobat diferències entre els tres tipus de mostres analitzades respecte a l’expressió de PD-L1 o de CD8 per les cèl·lules de l’infiltrat peritumoral. Els nostres resultats suggereixen que PD-L1 podria ser un biomarcador útil amb possible valor pronòstic en el CEC.<br>El carcinoma escamoso cutáneo (CEC) es el segundo tumor maligno cutáneo más frecuente. La mayoría de los CECs se desarrollan a partir de lesiones precursoras (queratosis actínicas ([QA]). Sin embargo, sólo una minoría de QAs evolucionan a CECs, sin que se conozcan de forma precisa los mecanismos que participan en dicha transformación. A pesar de que en la mayoría de los casos el pronóstico del CEC es excelente, existe un pequeño grupo de tumores considerados de alto riesgo (metastásicos o localmente avanzados) que presentan una evolución agresiva y mal pronóstico. En la actualidad no existen biomarcadores fiables en la práctica clínica que permitan detectar los CECs con mayor riesgo metastásico. Se ha propuesto que la expresión de PD-L1 por las células tumorales podría ser un marcador pronóstico en distintos tumores, si bien su utilidad en el CEC no ha sido previamente estudiada, distintos ensayos clínicos con nuevos fármacos dirigidos frente al eje PD1/PD-L1 en CECs han mostrado resultados esperanzadores. El objetivo de esta tesis es valorar los mecanismos moleculares implicados en las distintas etapas de la carcinogénesis del CEC (desde la piel sana fotoexpuesta [PF] hasta el CEC metastásico) con la finalidad de identificar los genes y las vías moleculares implicadas en su progresión y determinar posibles factores pronósticos. En la primera parte de este trabajo estudiamos las diferencias transcripcionales y genómicas en PFs, QAs y CECs a partir de 30 muestras apareadas por paciente, analizadas utilizando plataformas de arrays. Los resultados obtenidos se confirmaron por técnicas de RT-qPCR, inmunohistoquímica y Western blot. Identificamos dos factores de transcripción, BNC1 y FOSL1, cuya expresión se hallaba aumentada en el CEC y que podrían actuar como genes esenciales en la transformación tumoral. La integración de los datos obtenidos en los estudios de transcriptómica y de genómica reveló que las alteraciones en el número de copias del gen NEK10 se correlacionaban con los niveles de expresión de NEK10. Este gen codifica una quinasa relacionada con el gen NIMA (“Never in Mitosis gene A”), localizada dentro una región de pequeño tamaño en la banda 3p24.1, delecionada en 7 de los 10 CECs estudiados. Mediante técnicas inmunohistoquímicas y Western blot confirmamos la pérdida progresiva de la expresión de NEK10 desde la PF hasta el CEC y la práctica de estudios funcionales permitió demonstrar su participación en la regulación del ciclo celular en células epiteliales HaCaT. Todo ello apoyaría el papel de NEK10 como gen supresor tumoral en el CEC. En la segunda parte de este trabajo evaluamos el valor pronóstico de los niveles de PD-L1 en el CEC, analizando su expresión mediante inmunohistoquímica en 99 CECs primarios con metástasis linfáticas (n=48) y sin metástasis (n=51) y en 24 metástasis linfáticas. Detectamos una asociación entre la expresión de PD-L1 por ≥ 1% de las células tumorales y la presencia de metástasis linfáticas, así como con la recurrencia, una mala diferenciación histopatológica y la presencia de invasión perineural. En la mayoría de los casos (90%) existía una buena concordancia en la expresión de PD-L1 entre los CEC primarios y sus metástasis, con una tendencia hacia una mayor expresión en las últimas. No encontramos diferencias entre los tres tipos de muestras analizadas con respecto a la expresión de PD-L1 o de CD8 por las células del infiltrado peritumoral. Nuestros resultados sugieren que PD-L1 podría ser un biomarcador útil con posible valor pronóstico en el CEC.”<br>Cutaneous squamous cell carcinoma (cSCC) is the second most common skin cancer. Most cSCCs develop from precursor lesions (actinic keratosis [AK]). However, only a minority of AKs will eventually progress into cSCCs and the key mechanisms for this transformation remain unclear. Although in most cases the prognosis of cSCC is excellent, there is a small percentage of tumors with high metastatic risk. Metastatic or locally advanced cSCCs have high mortality, with no effective treatments available. Unfortunately, there is a lack of reliable biomarkers in clinical practice for detecting those cSCCs with the highest metastatic risk. Expression of PD-L1 by tumor cells has been proposed as a prognostic marker in different tumors. While the usefulness of PD-L1 expression in cSCC has not been addressed yet, new drugs aimed to block the PD1/PD-L1 axis are showing encouraging results in clinical trials in cSCC. The objective of this thesis is to evaluate the molecular mechanisms involved in the different stages of cSCC carcinogenesis (from healthy sun-exposed skin to metastatic cSCC) in order to identify the genes and molecular pathways involved, and their putative role as prognostic biomarkers. In the first part of this work we studied the differences in the transcriptome and the genome of sun-exposed skin, AKs and cSCCs of 30 samples matched by patient, using different array platforms. The results obtained were confirmed by quantitative RT-PCR, immunohistochemistry, and Western blot. We detected two transcription factors, BNC1 and FOSL1, whose expression was increased in cSCC and that could contribute to cSCC development. Additionally, a strong correlation between copy numbers and gene expression of NEK10 was identified by integrating the transcriptomic and genomic array data. NEK10 gene encodes a NIMA (“Never in Mitosis gene A”) related kinase, located within a small region in the 3p24.1 band, which was found to be deleted in 7 out of 10 cSCCs studied. By immunohistochemistry and Western blot, we confirmed the progressive loss of NEK10 from sun-exposed skin to cSCC and functional studies demonstrated the role of NEK10 in the regulation of the cell cycle in the epithelial HaCaT cells. These data support the role of NEK10 as a tumor suppressor gene in cSCC. In the second part of this work we evaluated the usefulness of PD-L1 expression, determined by immunohistochemistry, as a prognostic marker in cSCC. PD-L1 expression was analyzed in ninety-nine primary cSCCs with lymphatic metastases (n = 48) and without metastases (n = 51), and 24 metastases. An association between PD-L1 expression by ≥1% of tumor cells and the presence of lymphatic metastases, as well as with recurrence, poor histopathological differentiation and perineural invasion was detected. In most cases (90%), PD-L1 expression remained constant between primary cSCCs and their metastases, with a trend towards a higher expression in the latter. No differences among the three types of samples analyzed with respect to the expression of PD-L1 or CD8 by the cells of the peritumoral infiltrate were found. Our results suggest that PD-L1 could be useful as a prognostic biomarker in cSCC.

El carcinoma basocel•lular (CBC) és la neoplàsia més freqüent en l’ésser humà. La importància d’aquest tumor rau tant en la gran morbiditat que produeix com en l’enorme despesa sanitària que ocasiona als sistemes de salut de gairebé tot el món. Malgrat que el seu tractament és essencialment quirúrgic, existeixen casos on no està indicat aquest abordatge terapèutic i seria interessant el fet de conèixer les alteracions moleculars que comporten la formació de la neoplàsia per tal d’establir possibles dianes farmacològiques. Per aquestes raons hem cregut convenient aprofundir en l’estudi d’aquest tumor, centrant-nos en la fisiopatologia i intentant cultivant-lo “in vitro”. A través de l’estudi de la síndrome de Gorlin-Goltz s’ha establert la importància de la via Sonic hedgehog (Shh) en la fisopatologia del CBC. Nosaltres, mitjançant tècniques com l’immunoblot i la immunohistoquímica (mesurant els nivells de proteïna Gli1) hem determinat que aquesta via està activada en aproximadament la meitat dels casos de CBC esporàdic, confirmant les dades que es coneixen sobre aquest tema. Analitzant vies alternatives, hem trobat mostres amb alta activitat de b-catenina sense afectació de la via Shh i això ens fa pensar que la via Wnt pot tenir un paper fonamental en aquests casos. Hem detectat per immunoblot l’acumulació de b-catenina en la meitat dels casos estudiats, relacionat-se de forma directa amb l’activitat proliferativa de la neoplasia.<br>El carcinoma basocelular (CBC) es la neoplasia más frecuente en el ser humano. La importancia de este tumor radica tanto en la gran morbilidad que produce como en el enorme gasto sanitario que ocasiona a los sistemas de salud de casi todo el mundo. A pesar de que su tratamiento es esencialmente quirúrgico, existen casos donde no está indicado este abordaje terapéutico y sería interesante el hecho de conocer las alteraciones moleculares que comportan la formación la neoplasia para establecer posibles dianas farmacológicas. Por estas razones hemos creído conveniente profundizar en el estudio de este tumor, centrándonos en la fisiopatología e intentando su cultivo “in vitro”. A través del estudio del síndrome de Gorlin-Goltz se ha establecido la importancia de la via Sonic hedgehog (Shh) en la fisiopatología del CBC. Nosotros, mediante técnicas como el inmunoblot y la inmunohistoquímica (midiendo los niveles de proteína Gli1) hemos determinado que esta vía está activada en aproximadamente la mitad de los casos de CBC esporádico, confirmando los datos que se conocían sobre este tema. Analizando vías alternativas, hemos encontrado muestras con alta actividad de b-catenina sin afectación de la vía Shh y esto nos hace pensar que la vía Wnt puede tener un papel fundamental en estos casos. Hemos detectado por inmunoblot la acumulación de b-catenina en la mitad de los casos estudiados, relacionándose de forma directa con la actividad proliferativa de la neoplasia.<br>Basal cell carcinoma (BCC) is the most common malignancy in humans. The importance of this tumor lies both in the high morbidity produced as in the high costs caused to the health systems of whole world. Although its treatment is essentially surgical, there are cases where it is not indicated this therapeutic approach, then it would be interesting to know the molecular alterations that involve the formation of this neoplasm to establish potential drug targets.For these reasons we have decided to study this tumor, focusing on the physiopathology and their culture "in vitro". Through the study of Gorlin-Goltz syndrome, the importance of the Sonic hedgehog pathway (Shh) in the pathophysiology of BCC was well established. Using techniques such as immunoblotting and immunohistochemistry (measuring protein levels Gli1), we have determined that this pathway is activated in about half of cases of sporadic BCC, confirming the previously known data. Analyzing alternative pathways, we found samples with high activity of b-catenin pathway without affecting Shh. This fact makes us think that the Wnt pathway may have a important role in these cases. We detected by immunoblot the accumulation b-catenin in half of the cases studied, interacting directly with the proliferative activity of the neoplasm.

L'autofluorescenza (AF) è definita come l'emissione di fluorescenza osservata quando determinate molecole sono eccitate da raggi UV o luce visibile di lunghezze d'onda adeguate. Quando una molecola viene illuminata ad una lunghezza d'onda di eccitazione, assorbirà questa energia e verrà attivata dal suo stato fondamentale a quello eccitato. La molecola (fluoroforo) può quindi rilassarsi dallo stato eccitato a fondamentale generando energia sotto forma di fluorescenza, a lunghezze d'onda di emissione più lunghe di quella di eccitazione. I fluorofori endogeni sono molecole ampiamente distribuite in cellule e tessuti, come proteine ​​contenenti aminoacidi aromatici, flavine e lipopigmenti. I principali fluorofori della cute sana si trovano nell'epitelio (ad es. cheratina, nicotinamide adenine dinucleotide o NADH e flavin adenine dinucleotide o FAD) e nella sottomucosa (ad es. collagene ed elastina). Queste molecole, quando irradiate tra le lunghezze d'onda da 375 a 440 nm, mostrano fluorescenza nell'intervallo spettrale del verde. Il non-melanoma skin cancer (NMSC) è il tumore maligno più comune al mondo. Lo sviluppo dei NMSC è accompagnato da cambiamenti istopatologici nell'epidermide come perdita di maturazione cellulare, alterazione della produzione di cheratina, ispessimento generale dello strato epiteliale e alterazioni biochimiche (riduzione del NADH). I NMSC sono anche accompagnati da cambiamenti istopatologici nello stroma e nella sottomucosa sottostanti, tra cui la neovascolarizzazione e la distruzione del legame crociato di collagene da parte delle proteasi. Queste alterazioni portano ad una generale riduzione dell’AF dovuta all'alterazione della distribuzione dei fluorocromi e in particolare al NADH e al collagene. Negli ultimi due decenni, gli studi riguardanti ll’AF cellulare e tissutale hanno avuto un notevole aumento. Sono stati condotti studi sull’AF sia in vitro che in vivo, per lo studio dei tessuti normali e per la discriminazione tra tessuti normali e lesioni neoplastiche di mucosa orale, cute, esofago, colon, polmone, bronchi, cervello e vescica. I metodi utilizzati sono sia il direct visual fluorescence examination (DVFE) sia lo spettrofotometria. In particolare, il DVFE è stato ampiamente utilizzato per studi clinici sulla mucosa orale. Per quanto riguarda l’AF della cute, questa è stata studiata più frequentemente usando lo spettrofotometria. Il principio è la scansione e l'analisi della luce emessa dalla cute dopo l'esposizione a una fonte di luce attivante. Tuttavia, ad oggi non sono emersi metodi che fossero traducibili nella pratica clinica. L'obiettivo principale di questo studio è quello di analizzare la correlazione tra la misurazione spettrale dell’AF cutanea e le caratteristiche istopatologiche della cute maligna e pre-maligna nel campo dei NMSC. Dopo la rimozione chirurgica, verrà eseguita una valutazione ex vivo dell’AF. Il campione verrà irradiato con una sonda che emette una luce nello spettro blu (lunghezza d'onda 400-440 nm) e la fluorescenza emessa dal tessuto verrà misurata mediante uno spettrofotometro in modalità spot standardizzata. Eventuali modifiche rilevate verranno riportate sul campione chirurgico con l'applicazione di un repere. Verrà eseguito un esame istopatologico della lesione e eventuali cambiamenti nel pattern di fluorescenza saranno correlati con possibili alterazioni del pattern istopatologico, facendo riferimento ai reperi chirurgici. Le alterazioni delle misure spettrali sono correlate alle alterazioni istopatologiche dei NMSC. La misurazione spettrale può essere un nuovo supporto per la diagnosi precoce dei NMSC, una guida per le biopsie incisionali mirate, uno strumento per la definizione dei margini chirurgici intraoperatori e per il follow-up dei pazienti trattati.<br>Autofluorescence (AF) is defined as the fluorescence emission observed when certain cell molecules are excited by UV or visible light of suitable wavelenghts. When a biologic molecule is illuminated at an excitation wavelength within the absorption spectrum of that molecule, it will absorb this energy and be activated from its ground state to an excited state. The molecule (fluorophore) can then relax back from the excited to the ground state by generating energy in the form of fluorescence, at emission wavelengths, which are longer than that of the excitation wavelength. The most important endogenous fluorophores are molecules widely distributed in cells and tissues, like proteins containing aromatic aminoacids, flavins and lipopigments. The main fluorophores of healthy skin are located in the epithelium (eg. keratin, nicotinamide adenine dinucleotide or NADH and flavin adenine dinucleotide or FAD) and the submucosa (e.g. collagen and elastin). These molecules when irradiated between the wavelengths from 375 and 440 nm, show fluorescence in the green spectral range. Nonmelanoma skin cancer (NMSC) is the most common malignancy worldwide. The developement of NMSC is accompanied by histopathological changes in epidermis such as loss of cellular maturation, alteration in keratin production, overall thickening of the epithelial layer and biochemical alterations (NADH decrease). NMSC is also accompanied by histopathological changes in the underlying stroma and submucosa, including neovascularization and destruction of the collagen cross-link by proteases. These alterations lead to a general decrease in AF due the alteration in distribution of the fluorochromes and in particular to NADH and collagen. In the last two decades, studies concerning cell and tissue AF has had a dramatic increase. AF studies have been performed both in vitro and in vivo, for the study of normal tissue and for the discrimination between normal tissues and neoplastic lesions of oral mucosa, skin, esophagus, colon, lung, bronchi, brain and bladder. The methods used are both direct visual fluorescence examination (DVFE) and spectrophotometry. In particular, DVFE has been widely used for clinical studies on oral mucosa. Regarding AF of the skin, this has been studied more frequently by using spectrophotometry. The principle is scanning and analyzing reflected light from the skin after exposure to an activating light source. AF spectroscopy is a very sensitive technique for quantitative measurements of tissue constituents. However, to date no methods have emerged that can be translated into clinical practice. The primary objective of this study is to investigate the correlation between spectral mesurement of cutaneous AF and the histopathological characteristics of malignant and pre-malignant skin in NMSC. Following surgical removal of the cancer, an ex vivo evaluation of the AF will be performed. The specimen will be irradiated with a probe that emits a light in the blue spectrum (wavelength 400-440 nm) and the fluorescence emitted by the tissue will be measured using a spectrophotometer in a standardized spot modality. Any changes detected will be reported on the surgical specimen with the application of a surgical mark. Histopathological examination of the lesion will be performed and any changes in the fluorescence pattern will be correlated with possible alterations in the histopathological pattern, referring to surgical marks. Alterations in AF spectral measurement correlate with histopathological alterations in NMSC. the spectral measurement can be a new support for the early diagnosis of NMSCs, a guide for the targeted incisional biopsies, a tool for the definition of the intraoperative surgical margins, and for the follow-up of treated patients.

Les genodermatoses sont des maladies génétiques rares à expression cutanée. Parmi elles, les dysplasies ectodermiques (DE) caractérisées par des anomalies du développement d’au moins deux structures ectodermiques (dents, ongles, glandes sudorales et poils), constituent un groupe hétérogène de genodermatoses de plus de 200 syndromes rares. Si la plupart de ces syndromes associent des anomalies des seuls dérivés ectodermiques, d'autres plus complexes, tels que le syndrome de Bazex-Dupré-Christol et l’Incontinentia Pigmenti, rassemblent en plus des manifestations disparates. Le syndrome de Bazex-Dupré-Christol (SBDC) associe une DE à la prédisposition aux carcinomes basocellulaires (CBCs) de survenue précoce. L’étude de 6 familles nous a permis d’identifier, chez 2 d’entre elles, une mutation tronquante dans le gène ACTRT1, codant la protéine Arp-T1. Dans l’épiderme, la protéine Arp-T1 est diminuée chez tous les patients atteints de SBDC, porteurs ou non de mutations dans le gène ACTRT1. Le séquençage à haut débit de la région candidate a permis d’identifier des mutations dans des régions transcrites, régulatrices du gène ACTRT1 chez les patients des 4 autres familles. Notant que la voie Hedgehog est dérégulée dans 70 % des CBCs, nous avons démontré qu’ACTRT1 est un nouvel inhibiteur de cette voie, en particulier par sa liaison au promoteur de GLI1 dont il inhibe l’expression. Enfin, ACTRT1 est un nouveau gène suppresseur de tumeur capable de réduire in vivo la progression tumorale de certaines lignées cancéreuses par la régulation de gènes impliqués dans la prolifération, la mort et la survie cellulaire, ou encore la migration. L’Incontinentia Pigmenti (IP) est une affection multisystémique caractérisée par une atteinte de la peau, des dents, des yeux et parfois du système nerveux central. Elle résulte de mutation dans le gène NEMO et l’abolition de l’activation de la voie NF-KB. L’étude d’une famille concernée par l’IP à permis d’identifier une nouvelle mutation d’épissage du gène NEMO aboutissant à l’expression d’une protéine tronquée. Cette protéine conserve l’intégralité des domaines fonctionnels de NEMO connus à ce jour. Sa caractérisation a révélé une perte d’interaction avec SHARPIN, composants du complexe LUBAC permettant l’ubiquitination linéaire. Il s’agit de la première mutation humaine de NEMO montrant l’importance de son ubiquitination linéaire dans l’activation de la voie NF-KB. Mes travaux de thèse ont ainsi mis en évidence de nouveaux mécanismes physiopathlogiques responsables de deux formes de dysplasie ectodermique. Ces mécanismes reflètent la complexité des voies moléculaires impliquées dans le développement de la peau et le maintien de son homéostasie durant la vie adulte<br>Genodermatoses are rare genetic diseases with cutaneous expression. Among them, ectodermal dysplasia (ED) characterized by abnormal development of at least two ectodermal structures (teeth, nails, sweat glands and hair) constitute a heterogeneous group of genodermatoses of more than 200 rare syndromes. While most of these syndromes associate only abnormalities of the ectodermal derivatives, others more complex, such as Bazex-Dupré-Christol syndrome and Incontinentia Pigmenti, bring together disparate manifestations. Bazex-Dupré-Christol syndrome (BDCS) associates ED with predisposition to early basal cell carcinoma (BCCs). The study of 6 families allowed us to identify, in 2 of them, a truncated mutation in the ACTRT1 gene, encoding the Arp-T1 protein. In the epidermis, Arp-T1 protein is decreased in all patients with BDCS, carrying or not of mutations in ACTRT1 gene. High-throughput sequencing of the candidate region allowed to identify mutations in transcribed enhancer regions, regulating the ACTRT1 gene in patients of the remaining 4 families. Noting that the Hedgehog pathway is deregulated in more than 70% of BCCs, we have demonstrated that ACTRT1 is a novel inhibitor of this pathway, via its binding to GLI1 promoter and inhibiting its expression. Finally, ACTRT1 is a new tumor suppressor gene capable of reducing in vivo the tumor progression of certain cancer lines by the regulation of genes involved in proliferation, death and cell survival, or migration. Incontinentia Pigmenti (IP) is a multisystemic disorder characterized by involvement of skin, teeth, eyes and sometimes the central nervous system. It results from mutation in the NEMO gene and the abolition of activation of NF-KB pathway. The study of a family concerned with IP allowed to identify a new splicing mutation of NEMO gene leading to a truncated protein expression. This protein retains all the functional domains of NEMO known. Its characterization revealed a loss of interaction with SHARPIN, components of LUBAC complex allowing linear ubiquitination. This is the first human mutation of NEMO showing the importance of its linear ubiquitination in the activation of the NF-KB pathway. Thus, my thesis work revealed novel physiopathological mechanisms responsible for two forms of ectodermal dysplasia. These mechanisms reflect the complexity of the molecular pathways involved in the development of the skin and the maintenance of its homeostasis during adult life

The purpose of the present PhD thesis was to study two different nanosized systems, liposomes and nanosuspensions. Liposomes were develop with the aim to improve the Triiodothyronine (T3) delivery to hepatic cancer cells and nanosuspensions were proposed to enhance dermal bioavailability of Diclofenac acid, a potent nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) with a very low aqueous solubility. T3, is a thyroid hormone normally synthesized and secreted by the thyroid gland and through interaction with its nuclear receptors (TRs) plays an essential role in morphogenesis and differentiation. However, there is increasing evidence for its role in hepatocellular carcinoma (HCC) suppression. Three different liposome systems, such as, conventional, Stealth (PEGylated) and Lf-modified-Stealth liposomes were successfully prepared, by the film hydration method, and characterized. Liposomes showed a mean diameter ranging between 86 and 126 nm and a PI lower than 0.28, as shown by PCS measurements. Liposomes cell interactions and cellular uptake were evaluated in three different HCC target cells (FaO, HepG2 and SKHep) by confocal microscopy using liposomes labeled with the lipophilic marker Rho-PE and loaded with the hydrophilic probe CF. Finally, in vitro cytotoxicity studies were carried out by using MTT assay to evaluate the toxicity of the liposome delivery system and to test the effect of T3 when incorporated into liposomes. These studies provides the great potential of liposomes as suitable carrier for T3 delivery to hepatoma cells. Internalization studies performed using Lf-modified-liposomes labeled with the lipophilic marker Rho-PE and loaded with the hydrophilic probe CF clearly demonstrated the effective internalization of both hydrophilic and lypophilic markers. Lf-liposome might markedly enhance the specific cell binding and cellular uptake in hepatoma cells due to the mediating of Lf that could bind to multiple receptors on cell surface such as ASGP-R with high affinity. From our data, emerges that liposome delivery system may insure a specific and sustained drug delivery, a reduced therapeutic dose and, in particular, should avoid deleterious side effects of T3 treatment. Overall, our results showed that liposomes are good candidates as liver delivery system of T3 since cell viability tests performed by using hepatoma cell lines demonstrated a very low toxicity of all three lyposome formulations. On the other hand, nanocrystal formulations, containing two different diclofenac acid crystal forms, were developed with the aim to improve dermal drug bioavailability. Nanosuspensions were obtaining using wet media milling technique and were characterized in terms of size distribution, morphology, zeta potential, differential scanning calorimetry and X-ray diffraction powder. The ability of the nanocrystals to improve dermal drug bioavailability was investigated in vitro using Franz diffusion vertical cells and newborn pig skin, in comparison with diclofenac acid coarse suspensions and a commercial topical formulation containing diclofenac sodium. Nanocrystals exhibited a mean diameter ranging between 279 and 315 nm and a PI lower than 0.25, as shown by PCS measurements. The XRDP and DSC analysis clearly indicated that the preparation process did not modify the diclofenac polymorphic forms. In vitro transdermal delivery experiments showed an improved skin deposition and permeation of the nanocrystals compared to coarse suspensions and diclofenac sodium commercial topical formulation. These results highlight the fundamental role of the crystal size on drug solubility and, thus, on the ability of a poorly soluble drug to cross the skin and accumulate in the deeper skin layers. Afterwards, the aims of the work were to develop Diclofenac acid (DCF) nanosuspensions obtained by the addition of a permeation enhancer, Transcutol (TRC), in the aqueous stabilizer solution and to study the effect of Transcutol on the transdermal permeation and skin accumulation of DCF nanocrystals. DCF-TRC-nanosuspensions, prepared using the wet media milling technique, were characterized in terms of size distribution, morphology, zeta potential, differential scanning calorimetry, X-ray diffraction powder and Fourier transform infrared spectroscopy.The influence of Transcutol concentration on skin penetration ability of DCF nanosuspensions was evaluated by in vitro skin penetration and permeation studies using Franz diffusion vertical cells and newborn pig skin, in comparison with DCF nanosuspension without TRC, DCF coarse suspension and a commercial topical formulation containing diclofenac sodium. Nanosuspensions with Transcutol exhibited a mean diameter of ∼350 nm and a polydispersity index ranging between 0.21 and 0.26, values greater than those of the nanosuspension without TRC. In vitro permeations studies showed that the increase of TRC in the nanosuspension formulations decreased the DCF skin delivery probably because the higher average diameter values of TRC nanosuspensions could decrease the DCF dissolution velocity with respect to nanosuspension without TRC. Moreover, although TRC is considered a powerful solubilizing agent, the increase of its concentration in the nanosuspension formulations determined the DCF solubility decrease. In light of these results, in the last part of this thesis nanocrystals of diclofenac (DCF) are proposed as a novel approach to treat skin inflammation, and their efficacy was validated in an animal model. Diffusion of DCF through mouse skin was investigated ex vivo, and the topical anti-inflammatory potential of the DCF nanosuspension was assessed in vivo by testing their activity against common inflammatory endpoints: inhibition of chemically induced oedema and leucocyte infiltration (reflected in myeloperoxidase–MPO-activity). TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) is commonly used to induce inflammation in animal models. The therapeutic efficacy of the nanosuspension was compared with those of a DCF coarse suspension and a commercial topical preparation containing diclofenac diethylamine, Voltaren Emulgel®. In vivo and ex vivo results have proven the superior anti-inflammatory efficacy of the nanocrystal suspension and its actual ability to localize the drug in the site of inflammation, compared to a commercial product (Voltaren). In conclusion, this study highlights the great potential of using nanocrystal suspensions as an effective strategy to improve topical bioavailability of poorly water-soluble drugs as well as a valid therapeutic approach.

La peau est en permanence exposée à des stress extrinsèques notamment aux rayonnements ultraviolets, principale cause de cancer cutané. Les cancers cutanés non mélanocytaires (NMSC) sont divisés en deux types : le carcinome basocellulaire (BCC) et le carcinome spinocellulaire (SCC). Les BCC surviennent après une exposition aigüe et précoce aux UVs au cours de l'enfance et présentent un faible potentiel métastatique. Les BCC dérivent des cellules souches du follicule pileux. Alors que les SCC se développent après une exposition chronique à de faibles doses d’UV et présentent un potentiel métastatique plus élevé. Les SCC dérivent de cellules souches de l’épiderme inter folliculaire. Le ratio BCC/SCC est de 4 pour 1 dans la population générale. Au laboratoire, nous nous intéressons à la pathologie Xeroderma Pigmentosum (XP). XP est une maladie génétique récessive autosomique rare. En Europe, la majorité des patients XP sont porteurs de mutations du gène XPC entrainant l'absence d’une protéine fonctionnelle. Le rôle canonique de XPC est la reconnaissance des dommages à l’ADN induits par les UVs et permet la réparation de l’ADN par le mécanisme de réparation par excision de nucléotide (NER). Les patients XP-C présentent une hypersensibilité aux rayons UV et développent très précocement des cancers cutanés et particulièrement des SCC avec une incidence plus élevée. L'objectif de ma thèse est d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la susceptibilité des kératinocytes XP-C au SCC. En utilisant des kératinocytes primaires humains de patients XP-C ou d’individus sains, nous avons développé un protocole pour mimer une exposition solaire chronique en les exposant de manière récurrente à de faibles doses d’UV. Nous avons choisi d’effectuer une approche non biaisée en effectuant un séquençage génomique entier de kératinocytes XP-C et WT exposés ou non aux UV. Comme attendu, les kératinocytes XP-C chroniquement irradiés présentent de nombreuses mutations particulièrement dans les séquences codantes. L’analyse bio-informatique de ces données révèle un défaut dans des gènes impliqués dans l'organisation de la chromatine. De façon intéressante, chez les kératinocytes non exposés aux UV, nous observons une augmentation de mutation dans les séquences codantes, l’analyse des gènes portant des mutations stop a mis en évidence un défaut dans les réseaux de gènes impliqués dans l'organisation de chromatine. Ces résultats suggèrent un état plus ouvert de chromatine dans les kératinocytes XP-C amenant l’hypothèse que les cellules XP-C présenteraient un phénotype cellule souche de l’épiderme. Pour valider ce modèle, nous avons utilisé des kératinocytes primaires humains issus de patients. Nous avons montré que des kératinocytes sains dont l’organisation de la chromatine a été altérée, présentent un défaut de différenciation terminale comparable à celui observé dans nos cellules XP-C. De plus, ce phénotype est complémenté par la réexpression de la protéine XPC fonctionnelle. Nous avons montré que les kératinocytes XP-C forment majoritairement des clones issus de cellules souches dans un test de clonogénicité. Ils présentent une expression plus élevée de marqueurs de cellules souches spécifiques de l’épiderme inter folliculaire. Les résultats obtenus au cours de ma thèse, grâce à notre modèle in silico et à nos résultats in vitro, suggèrent une nouvelle piste dans la compréhension de la susceptibilité des patients XP-C à développer des SCC. Le changement d’identité cellulaire lié à XP-C entraine la présence d’une chromatine plus ouverte et une identité plus proche des cellules souches, cellules à l’origine des SCC. Ce phénotype étant directement lié à l’absence de la protéine XPC fonctionnelle, nous mettons en évidence un nouveau rôle de XP-C dans l’organisation de la chromatine et la régulation de l’expression du génome. Ces travaux ouvrent donc de nouvelles perspectives dans l’approche des pathologies liées à une déficience en XPC<br>Skin as the outer layer of the body is constantly exposed to UV, the main cause of skin cancer. Non-Melanoma Skin Cancer are divided in two cancer types: Squamous cell carcinoma (SCC) and Basal cell carcinoma (BCC). BCC arise after early acute UV exposure during childhood and present a low metastatic potential; while SCC arise after low chronic UV exposure during life time, present higher metastatic potential. Ratio between BCC and SCC is 4 to 1 in general population.In the lab, we are interested in Xeroderma Pigmentosum (XP) pathology. XP is a rare autosomal recessive genetic disease. In Europe, a large majority of XP patients carry a mutation in XPC gene. resulting in the absence of XPC protein. Canonical role of XPC is to recognize UV DNA damage and allowed DNA reparation by Nucleotide Excision Repair mechanism (NER). XP-C patients present a hypersensitivity to UV radiations and develop very early skin cancer with a higher incidence. They develop 10 000 times more non-melanoma skin cancer (NMSC) compare to general population. Interestingly, we observe that XP-C patients develop 1 BCC for 4 SCC. The objective of my PhD is to decipher the molecular mechanisms underlying XP-C keratinocytes susceptibility to SCC.In our laboratory, we used human primary keratinocytes isolated from biopsies of XP-C patients or healthy individuals. We developed a protocol to mimic chronic solar exposure by exposing primary keratinocytes to chronic low UV irradiation. We have chosen to perform an unbiased approach using whole genomic sequencing (WGS) from XP-C and WT keratinocytes exposed or non-UV exposed. As expected, chronically irradiated XP-C keratinocytes presented an increase of mutation burden particularly in coding sequence. A gene network analysis of UV mutation shows a defect in chromatin organization. Very interestingly, without UV exposure, we saw already an increase of mutation in coding sequence even though no differences in mutation burden was observed. Then performing again, a network analysis focusing only on stop mutations, we highlighted a defect in chromatin organization. These results suggested a chromatin organization defect and a more open state of chromatin in XP-C keratinocytes. Our putative model is that open chromatin could be linked to a more stem cell state of XP-C keratinocytes, suggesting a new role of XPC in chromatin organization. To validate this putative model, we mimic chromatin organisation defects by using epigenetic modifier drugs on WT primary keratinocytes. After this treatment, WT cells presented terminal differentiation defect. We then checked our XP-C keratinocytes differentiation potential. And we observed a similar phenotype to treated WT cells. XP-C keratinocytes seems to have defect in cell differentiation and cell fate commitment. We showed that XP-C keratinocytes presented a higher percentage of stem cell, a higher expression of interfollicular epidermis markers and presented a defect in terminal differentiation program. These results strongly supported our hypothesis that the absence of XP-C leads to a switch in cell identity.In conclusion, the absence of XP-C reveals a stem cell like phenotype of XP-C deficient keratinocytes with a more open chromatin that could be linked to the more aggressive type of cancer observed in patients. Indeed, the cell of origin of NMSC are different. Thus, the aggressive one has a progenitor like cell as a cell of origin. Altogether, these data correlate nicely with our putative model, giving a first clue in the explanation of the inverted ratio of NMSC cancer in XP-C pathology

Les mutations germinales du gène suppresseur de tumeur PATCHED engendrent un syndrome rare, autosomique et dominant : le syndrome de Gorlin ou naevomatose basocellulaire (NBC). PATCHED est le récepteur membranaire du morphogène diffusible SONIC HEDGEHOG (SHH). La NBC prédispose au carcinome basocellulaire (CBC), tumeur humaine la plus fréquente et d'origine kératinocytaire. Les ultraviolets (UV) constituent le facteur étiologique majeur des CBC sporadiques, mais leur rôle n'est pas clair dans la NBC. Nos résultats montrent que les fibroblastes et kératinocytes primaires NBC et contrôles, irradiés aux UV, survivent et réparent l'ADN de façon comparable, écartant ainsi le rôle des UV dans la prédisposition au CBC des patients NBC. Les fibroblastes contrôles et les kératinocytes NBC, en culture organotypique de peau, miment la perte supposée d'un allèle de PATCHED dans les kératinocytes à l'origine des CBC sporadiques. Dans ce modèle, les kératinocytes envahissent le derme, leur différenciation est altérée, et la voie SHH/PATCHED semble activée, comme dans les CBC. Les fibroblastes activés du stroma stimulent la tumorigénèse. Nous avons voulu déterminer si les fibroblastes sains NBC pouvaient jouer un rôle similaire dans la prédisposition au CBC des patients NBC. Un crible microarray entre fibroblastes contrôles et NBC, cultivés en équivalent de derme, a révélé la surexpression par les fibroblastes NBC de facteurs favorisant la prolifération et l'invasion tumorales. Chez les patients NBC, ces propriétés pro-tumorales des fibroblastes et l'état « pré-tumoral » des kératinocytes, pourraient favoriser la formation de CBC, notamment dans les zones cutanées non photo-exposées<br>The germinal mutations of the tumor suppressor gene PATCHED are responsible for rare, autosomal and dominant syndrome called Gorlin syndrome or nevoid basal cell carcinoma syndrome (NBCCS). PATCHED is the transmembrane receptor of the diffusible morphogen SONIC HEDGEHOG (SHH). NBCCS patients are predisposed to basal cell carcinoma (BCC), the commonest human cancer, originating from keratinocytes. Ultraviolet (UV) irradiation represents the major etiologic factor of sporadic BCC, but its role in NBCCS is not known. Our results show that NBCCS and control primary fibroblasts and keratinocytes exhibit similar survival and DNA repair capacities following UV irradiation, suggesting that UVs are not responsible for BCC predisposition in NBCCS patients Control fibroblasts and NBCCS keratinocytes in skin organotypic cultures mimic the loss of one PATCHED allele that is thought to occur in keratinocytes early upon sporadic BCC development. In this model, the keratinocytes proliferate and invade the dermis, their differentiation is altered and the SHH/PATCHED pathway seems to be active, as in BCC. Stromal activated fibroblasts stimulate the tumorigenesis. We aimed at determining if healthy NBCCS fibroblasts could play such a role in the BCC predisposition of NBCCS patients. A microarray screen between NBCCS and control fibroblasts, cultivated in dermal equivalents, revealed the over-expression by NBCCS fibroblasts of proliferation and invasion facilitating factors. In NBCCS patients, these pro-tumoral characteristics, associated with "pre-tumoral" keratinocytes could favour BCC development, including in photo-protected skin areas

Le cancer du rein papillaire de type 2 (PRCC2) est un cancer très agressif avec un potentiel métastatique élevé et pour lequel il n’y a pas de traitement efficace. La forme héréditaire de PRCC2 est associée au syndrome rare de la léiomyomatose cutanéo-utérine héréditaire (HLRCC). HLRCC est due à une mutation germinale hétérozygote du gène Fumarate Hydratase (FH) qui code l'enzyme du cycle de Krebs, la Fumarase. Le déficit en fumarase induit l’accumulation de fumarate et active les voies de signalisation du facteur de transcription inductible par l’hypoxie (HIF) et des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Néanmoins, aucune mutation du gène FH n’a été rapportée dans les cas de PRCC2 sporadiques. Le projet de recherche porte sur la caractérisation moléculaire des PRCC2 héréditaires et sporadiques. Notre analyse du transcriptome a identifié des différences entre les signatures moléculaires des PRCC2 héréditaires et sporadiques. Cependant, l’étude d’immunohistochimie n'a pas révélé de biomarqueurs potentiels. Les analyses bio-informatiques de profils d’expression génique ont révélé que les tumeurs PRCC2 héréditaires et sporadiques partagent une dérégulation de la voie principale NRF2/KEAP1. Il a été montré que la surexpression de AKR1B10 (Aldo-Keto Reductase Family 1 Membre B10) est la conséquence directe de l’activation de l'élément de réponse antioxydant (ARE). Finalement, nous avons établi un nouveau modèle in vitro de lignée cellulaire, NCCFH1 (FH-/-), issue d’un patient HLRCC. NCCFH1 représente une plateforme idéale pour les études fonctionnelles, métaboliques et thérapeutiques. Bortézomib pourrait être la meilleure alternative thérapeutique pour les patients avec PRCC2<br>Papillary Renal Cell Carcinoma type 2 (PRCC2) is known to be a very aggressive type of kidney cancer with a high metastatic potential, poor outcome and absence of effective therapy. Hereditary form of PRCC2 is associated with rare hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma (HLRCC). HLRCC is characterized by germline heterozygous mutations in the Fumarate Hydratase (FH) gene that encodes an enzyme of the Krebs cycle, Fumarase. It has been shown that the accumulation of fumarate induces activation of Hypoxia Inducible Factor (HIF) and ROS (Reactive Oxygen Species) pathways. Nevertheless, no FH gene mutation has been reported in sporadic PRCC2 tumors. The goal of this study is to better characterize hereditary and sporadic PRCC2. Our transcriptome analysis identified the set of genes that are differentially expressed between the two types of PRCC2. Subsequent immunohistochemistry screening did not reveal any potential diagnostics biomarkers. Further, the comprehensive computational analysis of gene profiling data revealed that hereditary and sporadic PRCC2 share the similar molecular signature with NRF2-KEAP1 axis deregulation as one of the major pathway in both forms. We demonstrated that over expression of Aldo-keto reductase family 1 member B10 (AKR1B10) is the direct consequence of the antioxidant response element (ARE) activation shared in hereditary and sporadic tumors. Finally, we have established FH-deficient cell line (NCCFH1) a new preclinical model of hereditary PRCC2. It presents the perfect platform for studying the metabolic features and testing new therapies for hereditary PRCC2, while bortezomib appears to be a potential efficient therapeutic option

Nous avons mis en evidence l'existence d'une reponse t anti-tumorale dans deux modeles de tumeurs solides : les cancers bronchiques non-a-petites cellules et le lymphome t cutane. Nous avons montre la presence dans l'infiltrat tumoral de lymphocytes t reactionnels cytotoxiques specifiques des cellules tumorales. Nous avons caracterise phenotypiquement et fonctionnellement ces lymphocytes t reactionnels en etablissant des populations lymphocytaires t clonales. En ce qui concerne le cancer bronchique non a petites cellules, cancer decrit comme peu immunogene, aucun antigene, utilisable en immunotherapie specifique de ce type de tumeurs n'a ete caracterise. A partir d'une biopsie d'un patient, nous avons isole plusieurs clones til capables d'exercer une activite cytotoxique restreinte par les molecules hla-a2. 1 contre la lignee tumorale autologue. L'analyse par pcr de la chaine du tcr, a permis de montrer l'amplification de ces clones au sein de la tumeur fraiche et non au sein des lymphocytes du sang peripherique. Ceci suggere fortement leur implication dans une reponse immune anti-tumorale locale. Une approche genetique a ete developpee pour identifier les antigenes tumoraux reconnus par ces clones t cytotoxiques. Le premier antigene rapporte dans cette etude et reconnu par le clone ctl heu 127 dans un contexte hla-a*0201 correspond a un peptide mute issu du produit d'un nouveau gene recemment identifie, le gene actn4 qui code l'-actinine-4, une proteine qui se fixe au filament d'actine et qui est impliquee dans l'organisation du cytosquelette et l'adhesion cellulaire. Le peptide reconnu par le clone heu171 est identique a celui reconnu par le clone heu127, ce qui suggere que le peptide mute (91-100) est tres immunogene

Ce travail avait deux objectifs: 1) définir des groupes de patients (pts) susceptibles de bénéficier d’un conseil génétique par l’identification de facteurs prédictifs de l’existence d’une mutation du gène CDKN2A, un des gènes majeurs de prédisposition au mélanome, dans les familles ne comportant que deux cas (Fam_2 cas). 2) la caractérisation épidémiologique et clinique d’entités particulières du mélanome dans l’objectif secondaire de contribuer à l’identification de gènes de prédisposition à ces entités. Les 2 entités étudiées étaient le mélanome cutané (MC) associé au cancer du rein (CR) et les mélanomes muqueux de la sphère ano-génitale (MMAG).Les populations d’étude sont une collection de 293 pts atteints de MC recrutés de façon consécutive sans connaissance à priori de l'histoire familiale et la collection française MELARISK qui comprend ≥ 3000 sujets prélevés appartenant à des familles à cas multiples de mélanomes ou ayant un MC survenant dans un contexte particulier (association à un autre cancer, topographie rare, survenue avant l’âge de 20 ans, MC multiples sporadiques). Nous avons étudié l'effet de 3 facteurs prédictifs potentiels sur la présence d’une mutation de CDKN2A dans une famille en fonction du nombre de pts atteints dans une famille (2 pts versus ≥3 pts). L’étude a été menée dans 483 familles françaises comprenant 387 Fam_2 cas, et 96 familles avec ≥3 pts atteints de mélanome (Fam_3+ cas). Les facteurs étudiés dans la famille un à un puis conjointement étaient : l’âge médian &lt;50 ans au diagnostic de MC, la survenue de ≥1 cas de MC primitifs multiples (MPM) et la survenue de ≥1 cas de cancer du pancréas (CPCP). La fréquence des mutations était plus élevée dans les Fam_3+ cas (32%) que dans les Fam_2 cas (13%). Alors qu’un âge jeune au diagnostic et la survenue de ≥ 1 MPM étaient associés à la présence de mutations de CDKN2A dans les Fam_2 cas, un âge jeune au diagnostic ainsi que la présence de ≥1 cas de CP était associé significativement aux mutations de CDKN2A dans les Fam_3+ cas. L’étude a montré que les caractéristiques cliniques associées aux mutations de CDKN2A varient, en France, pays de faible incidence de mélanome, en fonction du degré d’agrégation familiale. L’identification de facteurs prédictifs de mutations de CDKN2A dans les Fam_2 cas a contribué à définir des sous-groupes de familles (âge jeune au diagnostic, survenue de MPM) dans lesquels la fréquence des mutations de CDKN2A est supérieure à 20% et auxquels il est légitime de proposer un test génétique. L’analyse des deux séries de pts MM+CR et MMAG a permis d’identifier, en les comparant à la série de MC recrutés de manière consécutive, leurs caractéristiques cliniques et histologiques. Dans ces deux séries, nos résultats ont mis en évidence un contexte de prédisposition héréditaire en partie indépendant de CDKN2A. L’étude de l’association MC et CR chez un même patient a eu deux conséquences pratiques: pour les cliniciens ces résultats suggèrent l’intérêt d’un examen dermatologique en cas de CR et l’intérêt de l’échographie abdominale dans le bilan initial d’un MC pour le dépistage du CR; pour la recherche en génétique, cette série a contribué à l’identification d’une mutation germinale dans le gène MITF qui augmente le risque de développer un MC, un CR ou l’association des deux cancers et qui a des propriétés biologiques intéressantes. L’étude des MMAG a montré que ces mélanomes pouvaient être associés à des MC chez un même malade et/ou survenir dans un contexte familial de mélanome. Le corollaire clinique de ces résultats est que l’examen dermatologique de dépistage ou de surveillance doit être à la fois cutané et muqueux dans un contexte familial de mélanome et qu’en cas de MMAG un examen dermatologique des apparentés doit être proposé comme c’est la règle dans les MC. L’absence de mutation de CDKN2A dans ces localisations muqueuses incite à entreprendre des études génétiques pour identifier les gènes impliqués<br>This thesis had two main objectives: 1) To define groups of patients which may benefit from genetic counseling by identifying predictors of mutations of the CDKN2A gene, a major gene predisposing to cutaneous melanoma (CM) in families with only two cases. 2) Epidemiological and clinical characterization of specific entities of melanoma with the secondary objective of contributing to the identification of susceptibility genes for these entities. Coexistence of CM with renal cell carcinoma and mucosal anogenital melanomas were studied.The study populations are a collection of 293 melanoma patients that were ascertained systematically and the French collection MELARISK which is a collection including over 3000 subjects drawn from families with multiple cases of melanoma or melanoma occurring in a particular context (association with another cancer, rare locations, occurrence before the age of 20, multiple sporadic melanomas).We investigated association of three clinical features with the presence of a CDKN2A mutation in a family by extent of CM family clustering (2 versus ≥3 CM patients among first-degree relatives in a family).The study was conducted in 483 French families including 387 families with two melanoma patients, and 96 families with three or more patients with melanoma. The factors examined individually and in a joint analysis in a family were: median age at diagnosis &lt;50 years, ≥1 patient in a family with multiple primary melanomas (MPM) or with pancreatic cancer. The frequency of CDKN2A mutations was higher in F3+ families (32%) than in F2 families (13%). While early age at melanoma diagnosis and occurrence of MPM in ≥1 patient were significantly associated with the risk of a CDKN2A mutation in F2 families, early age at melanoma diagnosis and occurrence of pancreatic cancer in a family were significantly associated with CDKN2A mutations in F3+ families. Thus this study showed that clinical features associated with CDKN2A mutations vary, in France, a country of low incidence of melanoma, according to the degree of familial clustering. Identifying predictors of CDKN2A mutations in families with two melanoma cases has helped to define subgroups of families (early age at CM diagnosis, and/or ≥1 MPM patient) in which the frequency of CDKN2A mutations is above 20% such that these subgroups of F2 families should be offered genetic testing.The analysis of two series of patients, either patients with melanoma coexisting with renal cell carcinoma or patients with anogenital mucosal melanoma identified their clinical and histological features by comparing them to a series of melanomas that were ascertained systematically. In both series, our results suggested a genetic predisposition at least partly independent of CDKN2A. The study of the c renal cell carcinoma; coexistence of CM and renal cancer in the same patient had two practical consequences for clinicians: it suggests the interest of a dermatologic screening visit in patients with renal cell carcinoma and that abdominal ultrasonography or computed tomography scanning performed at the initial workup and during the follow-up of patients with CM may be of value for the early detection of renal cancer. Regarding genetic research, this series has contributed to the identification of a germline mutation in the MITF gene that increases the risk of developing melanoma, renal cancer or both cancers and has interesting biological properties. The study of anogenital melanoma has shown that these melanomas could be associated with cutaneous melanoma in the same patient and it has also shown a high frequency of family history of melanoma associating mucosal and CM suggesting a shared genetic predisposition. Consequently dermatological screening or monitoring must include examination of both skin and mucosa in families with multiple cases of CM; and in case of a mucosal melanoma, a dermatological examination should be offered to relatives. The genetic mechanism has to be identified

L’ablazione laser percutanea (PLA) è stata proposta come trattamento efficace nell’ottenere un’ablazione completa di piccoli epatocarcinoma (<4cm). Tuttavia, non ci sono dati riguardo l’efficacia della PLA nel trattamento di lesioni cosiddette ad “alto rischio”. Obiettivo. Valutare se le cosiddette lesioni a rischio (vicine a strutture vitali) hanno un impatto sulla probabilità di ablazione completa, di recidiva locale e di sopravvivenza complessiva in pazienti con piccolo HCC trattato con PLA ecoguidata Materiali e Metodi. 182 piccoli HCC in 164 pazienti cirrotici sono stati trattati con PLA sotto guida ecografica tra il 1996 ed il 2008. Centosei pazienti (52M/54F; età media 69 anni) avevano 116 HCC (diametro medio 2.7 cm ; range 0.8- 4.0 cm ), sia con crescita esofitica o situati a meno di 1cm dalla capsula epatica o da strutture vitali (Gruppo ad alto rischio). Cinquantotto pazienti (38M/20F, età 68anni) avevano 66 HCC (diametro medio 2.4 cm ; range 0.8- 4.8 cm ) situati in sedi non ad alto rischio (gruppo a basso rischio). Curve di sopravvivenza sono state calcolate mediante lo stimatore di Kaplan-Meier e confrontate mediante il Log-Rank test. L’analisi multivariata è stata condotta mediante il modello di Cox. Risultati. L’ablazione completa iniziale non ha mlostrato differnze significative nei due gruppi ( 96.5 % vs 92.4%) (p= .497). La mediana di follow-up complessivoè stata di 81 mesi. Per I pazienti che hanno ottenuto un’ablazione completa, il tempo mediano di recidiva locale stimato è stato di 84 mesi nel gruppo ad alto rischio e di 134 in quello a basso rischio. La sede non ha mostrato un effetto significativo sulla probabilità di recidiva locale (p= .53) sia all’aalisi univariata che multivariata. L’analisi secondo il modello di Cox ha mostrato che il diametro massimo della lesione è l’unico fattore predittivo di recidiva locale (p= .01). la sopravvivenza complessiva non differisce in maniera significativa tra i due gruppi (p= .374) e la sopravvivenza a 1, 3- e 5-anni è stata dello 0.90 (s.e.=0.029), 0.54 (s.e.=0.053) e 0.33 (s.e.=0.054) nel gruppo ad alto rischio e dello 0.95 (s.e.=0.030), 0.66 (s.e.=0.070) e 0.33 (s.e.=0.074) nel gruppo a basso rischio. All’analisi multivariata la sede non ha mostrato un impatto sulla sopravvivenza statisticamente significativo. Conclusioni. La sede ad alto rischio di piccolo epatocarcinomi trattati con PLA sotto guida ecografica non influenza in maniera significativa la sopravvivenza ed il tempo di recidiva locale di questi pazienti.<br>Background. Percutaneous laser ablation (PLA) has been proposed as an active treatment in patients with hepatocellular carcinoma with a significant activity in inducing complete ablation in HCC <4cm,. However, to date no data reported using PLA in treating lesions at high-risk located. Aim. To evaluate if the so-called high-risk location (e.g. close to vital structures) affects initial complete ablation rate, local recurrence rate and overall survival in cirrhotic patients with small hepatocellular carcinoma (HCC) treated with US-guided percutaneous laser ablation (LA) Materials and Methods. 182 small HCC nodules in 164 cirrhotic patients were treated by US-guided PLA (USg-PLA) between 1996 and 2008. One hundred six patients (52M/54F; mean age 69 yrs) had 116 HCC nodules (mean diameter 2.7 cm ; range 0.8- 4.0 cm ), either with exophytic growth or located <1cm from the liver edge or vital structures (high-risk group). Fifty eight patients (38M/20F, age 68yrs) had 66 HCC tumors (mean diameter 2.4 cm ; range 0.8- 4.8 cm ) located in not high-risk sites (low-risk group). Survival curves obtained via the Kaplan-Meier method were compared using the Log-Rank test. Multivariate analysis was based on Cox model. Results. The initial complete ablation did not significantly differ between the two groups ( 96.5 % vs 92.4%) (p= .497). The overall median follow-up was 81 months. For patients who achieved a complete response, the estimated local recurrence median time was 84 months in the low-risk group and 132 months in the high-risk group. Location did not significantly affect local recurrence free survival (p= .53) at both univariate and multivariate analysys after adjusting for diameter and tumour histology. Results by Cox model suggest the maximum diameter as the only significant predictor of local recurrence (p= .01). The overall survival did not differ significantly between the two groups (p= .374) and the 1-, 3- and 5-yr survival probability was 0.90 (s.e.=0.029), 0.54 (s.e.=0.053) and 0.33 (s.e.=0.054) in the high-risk group and 0.95 (s.e.=0.030), 0.66 (s.e.=0.070) and 0.33 (s.e.=0.074) in the low-risk one. At multivariate analysis location turned out not to be a significant predictor of overall survival. Conclusion. High-risk location of small HCC nodules treated with USg-PLA seems not to affect complete tumor ablation rate, local tumour recurrence rate and patients’ survival.

The use of noninvasive imaging technologies has recently changed the clinical approach to diagnosis and management of skin cancers, becoming an essential tool in daily dermatological practice. The present research focused on new applications of noninvasive imaging techniques, namely: a) evaluation of clinical and dermoscopic criteria of nevus-associated melanoma (NAM); b) assessment of the accuracy of dermoscopy, compared to clinical examination, in the detection of borders of basal cell carcinoma (BCC) and description of the most common dermoscopic findings in the clinically healthy tissue surrounding BCC, in case of not-matching clinically and dermoscopically detected margins; c) evaluation of the diagnostic accuracy of electrical impedance spectroscopy in the diagnosis of actinic keratosis (AK) and subclinical lesions in comparison to the naked eye examination and dermoscopy. Concerning NAM, different clinical and dermoscopic features of melanomas associated with congenital or non-congenital nevi and their correlation with specific patients’ characteristics were discovered. As regards BCC, dermoscopic findings in the area between clinically and dermoscopically detected margins were described, which are useful to better define the actual tumor margins and achieve a really radical excision. Finally, the possible usefulness of electrical impedance spectroscopy in the management of AKs was evaluated, obtaining preliminary data of good sensitivity but low specificity, likely open to improvement in the future. These results confirm the pivotal role of noninvasive imaging in both diagnostic and therapeutic phase of dermato-oncology, and suggest possible additions and/or changes to currently employed criteria.

Following abnormal cytologic results, high resolution anoscopy with biopsy is considered the gold standard for the diagnosis of high-grade lesions. We present the results of our experience with high resolution anoscopy in the diagnosis of anal intraepithelial neoplasia in a high-risk group of patients. Prospectively collected data of patients undergoing to HRA during a 3-year period were retrospectively analyzed. Histological results were recorded and a comparison between the clinico-pathological features of patients following biopsy was performed. The improvement in diagnostic efficacy among different period of study was also evaluated. HRA was performed for suspected lesions. The majority of cases were men who have sex with men infected with human immunodeficiency virus. The incidence rates of high-grade lesions and squamous cell cancer were reported. A significative correlation between cytologic and histologic HSIL was recorded (p &lt;0.01) between patients with low-grade and high-grade lesions. High resolution anoscopy with biopsy allows the detection of precancerous lesions following abnormal cytologic screening in high risk group of patients. Extensive training of both anoscopist and pathologist in experienced centers is warranted.