Дисертації з теми "Caratterizzazione strutturale e biochimica"
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Liberi, Stefano <1990>. "CARATTERIZZAZIONE STRUTTURALE DELL’ALBUMINA SIERICA UMANA IN COMPLESSO CON UN CONTAMINANTE AMBIENTALE." Master's Degree Thesis, Università Ca' Foscari Venezia, 2020. http://hdl.handle.net/10579/16297.
Повний текст джерелаMontefusco, Sandro. "Studio del ruolo funzionale e caratterizzazione strutturale del cuprocomplesso TFF1-Cu." Doctoral thesis, Universita degli studi di Salerno, 2012. http://hdl.handle.net/10556/1311.
Повний текст джерелаThe maintenance of gastrointestinal tissue integrity is physiologically essential in the presence of the persistent harassment of microbial flora and injurious agents. Even though the repair of the gastric epithelium may be modulated by several factors, the epithelial continuity also depends on a family of small peptides called trefoil factors (TFFs). The trefoil factors family comprises the gastric peptides pS2/TFF1, the spasmolytic peptide (SP)/TFF2 and the intestinal trefoil factor (ITF)/TFF3; they are characterized by a three looped domain, the “trefoil domain”, stabilized by three disulphide bridges. TFF1 and TFF3 also have a seventh cysteine that allows the formation of omo- and/or hetero-dimers. On the other hand TFF2 presents only a monomeric form, containing two trefoil domains in the same polypeptide chain. TFFs are small protease-resistant proteins that are abundantly produced by mucus-secreting cells of the gastrointestinal tract onto the mucosal surface. TFFs are essential in the protection of the mucosal epithelia against a wide range of biological threats, thus contributing to the mucosal repair. The signaling events that mediate the cellular responses elicited by TFFs are only partially understood. Moreover there are convincing evidence that TFFs do play an important role in tumorigenesis, even though their specific roles in cancer are still unclear. TFF1 expression is strongly induced after mucosal injury and it has been proposed that TFF1 functions as a gastric tumor suppressor gene. Several studies confirm that TFF1 expression is frequently lost in gastric cancer because of deletions, mutations or methylation of the TFF1 gene. Infection by Helicobacter pylori, a class 1 carcinogen according to WHO classification, is thought to promote stomach carcinogenesis through induction of aberrant DNA methylation. Samples from infected patients show lower expression of TFF1. Recent studies have also shown that there is a direct relationship between Helicobacter pylori and the dimeric form of the protein. In fact, it was demonstrated that the core oligosaccharide portion of H. pylori lipopolysaccharide (RF-LPS) is able to bind to TFF1. It also seems that the loss of TFF1 is an important event in shaping the NF-kB-mediated inflammatory response during the progression to gastric tumorigenesis, being TFF1 a negative regulator of NF-kB signalling. It is thus emerging a clear correlation between loss of TFF1, the development of inflammatory disease and the neoplastic process. Recent analyses made by our research group allowed us to point out the up-regulation of TFF1 gene expression in rats fed on copper deficient diets, and allowed us to find out the unexpected ability of TFF1 to bind copper ions. The presence of a cysteine surrounded by several negatively charged residues in the carboxy-terminus of the protein suggested the presence of a copper-binding site. Afterwards, it was shown that Cys58 and at least three Glu surrounding residues are essential to efficiently bind copper. Moreover, the incubation of the native peptide with copper salts increases the fraction of peptide omodimers produced by inter-molecular oxidation of Cys58 and disulphide bond formation. The Ph.D. research project was aimed at characterising the structure-function relationship of the TFF1-Cu complex. Briefly, we studied the influence of copper on known TFF1 biological activities and on its gene regulation, then we investigated its involvement in the TFF1 mediated mechanisms of Helicobacter pylori virulence and infection. A preliminary Real Time PCR quantitative analysis showed that copper deficiency positively modulates tff1 expression in an adenocarcinoma cell line (AGS), thus confirming our previous data obtained in vivo in copper deficient rat intestine. In order to map possible copper responsive elements in the proximal promoter sequence, we analysed the expression of a reporter gene (Luciferase) driven by deletion constructs of the tff1 gene promoter. AGS cells transfected with the deletion constructs allowed us to identify the upstream 5’ gene sequence -583/-435 as a promoter region sensitive to the changes of copper concentration. In fact, copper chelation treatments with bathocuproine disulfonate (BCS) were able to stimulate an increase of the promoter activity of the corresponding deletion construct. Following the sequence analysis (Transfac software) we focused our attention on a putative SP1 binding site identified in this region, whose binding ability was then confirmed by electrophoretic mobility shift assay (-561/-552). In agreemente with our in vitro results, it was also observed that copper favours the native TFF1 dimer formation in the culture medium of MCF-7 and HT29-MTX cells (a mucus-secreting clone obtained from the HT29 colon cancer cell line), thus confirming a possible role of the metal in the balance between the monomeric and the dimeric forms To evaluate the effect of copper-TFF1 interaction on the well known motogenic activity of the protein, we performed wound healing assays on an inducible clone of gastric cancer cells (AGS) able to overexpress the peptide (AGS-AC1). As expected, the overexpression of TFF1 stimulates an appreciable increase of cell migration, and copper chelation (BCS) undo the benefits of the increased peptide level. Our previous results showed that copper treatments decreased the amount of secreted protein in culture medium. Further experiments demonstrated that induced AGS-AC1 cells are able to store intracellularly higher amount of copper if compared to uninduced AGS-AC1 cells. This evidence suggests that TFF1 levels may also play a role also in the uptake/traffic of copper in this in vitro model. Finally, we studied the combined influence of TFF1 and copper in Helicobacter pylori infections. Our results demonstrate that Cu-TFF1 complex promotes H. pylori colonization of AGS cells. In fact, AGS-AC1 cells overexpressing TFF1 are more efficiently colonised by H. pylori wild-type (str. P12) if compared to uninduced cells. The presence of copper in a duplicate experiment further increases the colonization, as well as copper chelation by bathocuproine disulfonate (BCS) reduces the observed effect. The same result was obtained with H. pylori str. P12Δ479, an isogenic mutant expressing a truncated LPS core still able to bind to TFF1. On the other hand, H. pylori P12Δ1191, unable to bind TFF1, is not affected by copper levels in the culture medium. Parallel experiments were carried out on mucus secreting HT29-E12 goblet cells, to compare and/or confirm the results obtained in AGS-AC1. The results show that also in HT29-E12 cells the H. pylori colonization follows a similar trend, increasing when incubated in the presence of Cu and decreasing after BCS treatment. The present work contributed interesting results in the field of the biochemistry of the epithelia, in the wake of the research in progress in our laboratory aimed at studying the biological activities of the newly identified metalloprotein Cu-TFF1, whose properties are still poorly characterized. On the basis of the previous structural pieces of evidence we observed that the protein level and the balance of its oligomeric forms can be affected and regulated by copper ions. In turn, this delicate equilibrium is able to affect the integrity and the rheological properties of the epithelial barrier, thus representing a fine tuner, or an Achille’s heel, through which pathogenic microrganisms and deregulated proliferation of neoplastic cells may take advantage for their invasiveness. The role of copper in the TFFs biochemistry represents a new finding in the puzzling and versatile functions of this interesting peptide family, whose thorough comprehension still reserves many questions and surprises. [edited by author]
IX n.s.
Pucci, Kathleen. "Caratterizzazione strutturale e funzionale di proteine-effettori di patogenesi appartenenti alla "PcF Toxin Family"." Doctoral thesis, Università Politecnica delle Marche, 2009. http://hdl.handle.net/11566/242344.
Повний текст джерелаVETTRAINO, CHIARA. "O-fosfoetanolamina fosfo-liasi: dalla caratterizzazione strutturale ad applicazioni biomediche." Doctoral thesis, Università degli studi di Modena e Reggio Emilia, 2020. http://hdl.handle.net/11380/1200057.
Повний текст джерелаEnzymes have been used in many productive sectors for more than a hundred years. However, over the last 50 years, since the advent of recombinant DNA technologies, they have found a much wider and diverse range of applications, spanning across virtually any kind of human activities. In particular, because of their remarkable properties, enzymes have become the major choice for medical diagnostic applications and are being increasingly utilized for both the detection and the treatment of a broad variety of diseases. The purpose of this thesis is to study and exploit the high substrate specificity of a very peculiar human PLP-dependent enzyme, named O-phosphoethanolamine phospho-lyase (ETNPPL), for diagnostic applications. The enzyme promotes the irreversible degradation of O-phosphoethanolamine (PEA) to acetaldehyde, phosphate and ammonia. The physico-chemical characterization of ETNPPL reported in the literature suggests a mechanism of action that is very similar to other PLP-dependent enzymes, implying that the same residues are present in the active site. However, a structural characterization of human ETNPPL has not yet been reported in the literature. The first issue that I addressed in this thesis was to obtain the high-resolution 3D-structure of ETNPPL by X-ray crystallography in order to validate the mechanism of action proposed in the literature. To this end, starting from the cloning of the DNA fragment encoding for the human ETNPPL into a suitable expression vector, I expressed and purified the human ETNPPL. After assessing the enzymatic activity of the purified protein sample, I carried out crystallization experiments and I obtained good quality crystals for X-ray data collection. I determined the 3D-structure of ETNPPL at 2.3 Å resolution. Once I have completed the structural characterization of the enzyme and I have fully rationalized its high substrate specificity for phosphoethanolamine (PEA), its natural substrate, I set out to investigate one of its possible practical applications by designing and working towards the development of a biosensor for the selective detection of PEA in the urine. PEA levels in the urine of prostate cancer patients have been reported to decrease relative to healthy patients. Therefore, an ETNPPL-based assay for the measurement of PEA concentrations would be most useful in prostate cancer screening. To date, the early detection of prostate cancer involves the prostate-specific antigen (PSA) blood test. However, this approach is known to produce high rates of false positive results since increased PSA levels are often found in men with benign prostatic hyperplasia (BPH), prostatitis and prostate injury. For this reason, the need for new biomarkers that can be used for diagnostic purposes either alone or in combination with standard PSA tests appears evident. A method for the rapid and quantitative detection of this analyte would be of relevance for the diagnosis of such disease and, at the same time, would represent a potent validation tool of PEA as a prostate cancer biomarker.
GALASSI, LUCIA. "Regolazione del metabolismo del NAD nell'uomo: caratterizzazione cinetica, funzionale, regolatoria e strutturale della nicotinato fosforibosiltrsferasi (NaPRT)." Doctoral thesis, Università Politecnica delle Marche, 2011. http://hdl.handle.net/11566/241869.
Повний текст джерелаNicotinate phosphoribosyltransferase (NaPRT) catalyzes the conversion of nicotinate (Na) to Na mononucleotide (NaMN), the first reaction of the Preiss-Handler pathway for the biosynthesis of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). The importance of NaPRT in NAD metabolism is demonstrated by the fact that, in human embryonic kidney cells, the addition of Na considerably increases NAD levels, which do not show feedback inhibition effect on the enzyme (1). Here we describe the enzymatic characterization of human NaPRT. The protein was expressed in E. coli BL21(DE3) cells and purified to homogeneity by Ni-NTA resin affinity chromatography. The principal kinetic parameters of human NaPRT were determined. It was found that the enzyme followed a Michaelis-Menten kinetic with a random bireactant mechanism, and the Km for Na and PRPP were 44 μM and 22 μM, respectively. The Vmax was attested to be 0.013 U/mg, although in presence of Pi this value increased to 0.3 U/mg. Interestingly, ATP had a stimulation effect on enzymatic activity only at low substrates concentration, whereas at higher substrates concentration (1 mM), it showed an inhibitory effect. In addition to the kinetic characterization, the effect of several metabolites on NaPRT activity was investigated. As expected, NAD and NaAD, in addition to NMN and NaMN, had no effect on the enzyme activity, whereas piruvate and dihydroxyacetone phosphate showed a stimulation effect. On the contrary, several metabolites involved in the glucose or fatty acid metabolism significantly inhibited the enzyme, leading to hypothesize an in vivo NaPRT-depending regulation of NAD synthesis by these compounds. In addition, site-directed mutagenesis experiments were performed to elucidate the role of highly conserved residues. We determined that mutations, which involved residues localized in the / barrel domain of the protein, sensibly lowered the activity of the enzyme with respect of the wild-type protein. Human NaPRT was co-crystallized in presence of the potent enzyme inhibitor Acetyl-CoA using PEG 4000 as the major precipitant. The resulting crystals showed diffraction up to 3.0 Å resolution using synchrotron radiation at the ESRF, Grenoble France and are currently being optimised to undertake crystal structure determination. Finally, the 3D structure of the enzyme was predicted by homology modeling and used to carry out molecular docking simulations in order to identify the residues involved in the recognition and stabilization of ligands
Ruggeri, Barbara. "Espressione batterica e caratterizzazione dei determinanti strutturali dell'attività biologica della proteina PcF da Phytophthora cactorum." Doctoral thesis, Università Politecnica delle Marche, 2009. http://hdl.handle.net/11566/242365.
Повний текст джерелаMELONI, CLAUDIA. "Caratterizzazione strutturale e funzionale dei sistemi emoglobinici di due specie di pesci (Mugil cephalus e Ophisurus serpens) e di due varianti emoglobiniche umane (HbRoma e HbF-SS-Monserrato)." Doctoral thesis, Università degli Studi di Cagliari, 2012. http://hdl.handle.net/11584/266179.
Повний текст джерелаMojumdar, Aditya. "Structural and Biochemical study of human RECQ4." Doctoral thesis, Università degli studi di Trieste, 2015. http://hdl.handle.net/10077/11141.
Повний текст джерелаRecQ helicases belong to a ubiquitous family of DNA unwinding enzymes that are essential to maintain genome stability by acting at the interface between DNA replication, recombination and repair. Humans have five different paralogues of RecQ helicases namely RecQ1, BLM, WRN, RecQ4 and RecQ5. This work focuses on the structural and biochemical study of human RecQ4. Germ-line mutations in the RECQ4 gene give rise to three distinct human genetic disorders (Rothmund-Thomson, RAPADILINO and Baller-Gerold syndromes). Despite the important roles of RecQ4 in various cellular processes, RecQ4 have never been fully characterized. In addition to the helicase domain, RecQ4 has a unique N-terminal part that is essential for viability and is constituted by a region homologous to the yeast Sld2 replication initiation factor, followed by a cysteine-rich region, predicted to fold as a Zn knuckle. A part of this work focuses on the structural and biochemical analysis of both the human and Xenopus RecQ4 cysteine-rich regions, and shows by NMR spectroscopy that the Xenopus fragment does indeed assumes the canonical Zn knuckle fold, whereas the human sequence remains unstructured, consistent with the mutation of one of the Zn ligands. Both the human and Xenopus Zn knuckles bind to a variety of nucleic acid substrates, with a preference for RNA. We also investigated the effect of an additional Sld2 homologous region upstream the Zn knuckle. In both the human and Xenopus system, the presence of this region strongly enhances binding to nucleic acids. These results reveal novel possible roles of RecQ4 in DNA replication and genome stability. Recently the catalytic core of RecQ4 has been predicted to include RecQ-like-C-terminal (RQC) domain at the C-terminus of the helicase domain, similar to other RecQ helicases. This domain is composed of a Zn-binding region and a winged helix (WH) domain. Another part of this thesis centers on the structural and biochemical characterization of the catalytic core of RecQ4 including the helicase and RQC domain. The results provide an insight in the Zn binding ligands present in the RQC domain that plays a role in DNA binding and unwinding activity of the protein. Also the presence of the characteristic aromatic residue at the tip of the WH β hairpin and its role in DNA binding and unwinding has been established. Finally, it provides a low resolution SAXS model of the catalytic core of RecQ4.
Elicasi RecQ appartengono a una famiglia ubiquitaria di DNA svolgimento enzimi che sono essenziali per mantenere la stabilità del genoma agendo all'interfaccia tra replicazione del DNA, ricombinazione e riparazione. Gli esseri umani hanno cinque diversi paralogues di RecQ elicasi cioè RecQ1, BLM, WRN, RecQ4 e RecQ5. Questo lavoro si concentra sullo studio strutturale e biochimica di RecQ4 umana. Mutazioni germinali nel gene RECQ4 danno luogo a tre malattie genetiche umane distinte (Rothmund-Thomson, RAPADILINO e sindromi Baller-Gerold). Nonostante i ruoli importanti di RecQ4 in diversi processi cellulari, RecQ4 non sono mai stati pienamente caratterizzato. In aggiunta al dominio elicasi, RecQ4 ha una parte unica N-terminale che è essenziale per la vitalità ed è costituito da una regione omologa al lievito Sld2 fattore di iniziazione replica, seguita da una regione ricca di cisteina, previsto per piegare come stinco Zn . Una parte di questo lavoro si concentra sull'analisi strutturale e biochimica sia della regioni ricche di cisteina Xenopus RecQ4 umana e, e spettacoli di spettroscopia NMR che il frammento Xenopus effettivamente assume la canonica Zn nocca volte, mentre la sequenza di resti umani non strutturato, coerente con la mutazione di uno dei ligandi Zn. Sia il nocche Xenopus Zn umana e si legano ad una varietà di substrati di acido nucleico, con una preferenza per l'RNA. Abbiamo anche studiato l'effetto di un ulteriore regione omologa Sld2 monte la nocca Zn. Sia il sistema Xenopus umano e, la presenza di questa regione migliora fortemente legame ad acidi nucleici. Questi risultati rivelano possibili ruoli nuovi di RecQ4 nella replicazione del DNA e la stabilità del genoma. Recentemente il nucleo catalitico di RecQ4 stato previsto per includere RecQ-like-C-terminale (RQC) dominio al C-terminale del dominio elicasi, simile ad altri elicasi RecQ. Questo dominio è costituito da una regione-Zn vincolanti e un'elica alato (WH) dominio. Un'altra parte di questa tesi incentrata sulla caratterizzazione strutturale e biochimica del nucleo catalitico della RecQ4 compreso il elicasi e il dominio RQC. I risultati forniscono una descrizione nel Zn ligandi presenti nel dominio RQC che svolge un ruolo nel legame al DNA e l'attività svolgimento della proteina legante. Inoltre è stata stabilita la presenza della caratteristica residuo aromatico sulla punta della forcella WH β e il suo ruolo nel legame al DNA e di svolgimento. Infine, esso fornisce una bassa risoluzione SAXS modello del nucleo catalitico di RecQ4.
XXVII Ciclo
1985
Faccioli, Marco <1979>. "Organizzazione strutturale della catena respiratoria mitocondriale." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2010. http://amsdottorato.unibo.it/2886/1/Faccioli_Marco_Tesi_PDF.pdf.
Повний текст джерелаFaccioli, Marco <1979>. "Organizzazione strutturale della catena respiratoria mitocondriale." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2010. http://amsdottorato.unibo.it/2886/.
Повний текст джерелаMoimare, Pierluigi. "Sintesi e caratterizzazione strutturale di derivati piperidinici e morfolinici chirali." Master's thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2019. http://amslaurea.unibo.it/19197/.
Повний текст джерелаOptale, Alice <1987>. "Caratterizzazione morfologica e strutturale di nanoparticelle disperse in liquidi ionici." Master's Degree Thesis, Università Ca' Foscari Venezia, 2016. http://hdl.handle.net/10579/7533.
Повний текст джерелаTomassini, Davide. "Studio numerico/sperimentale per la caratterizzazione del comportamento strutturale di pinze elastiche." Master's thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2019.
Знайти повний текст джерелаCasadio, Laura. "Caratterizzazione fisica, chimica e strutturale di cementi biomedici a componente multi-minerale." Bachelor's thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2012. http://amslaurea.unibo.it/4318/.
Повний текст джерелаCAMPAGNA, ALESSIA. "Caratterizzazione strutturale e funzionale della topoisomerasi IB umana e dei suoi mutanti." Doctoral thesis, Università degli Studi di Roma "Tor Vergata", 2008. http://hdl.handle.net/2108/422.
Повний текст джерелаHuman DNA topoisomerase IB (topo IN) is an essential monomeric enzyme involved in resolving the torsional stress assiciated with DNA replication, trascription and chromatin condensation. Topo IB catalyzes changes in the supehelical state of the duplex DNA by transiently breaking a single strand allowing the broken strand to move through the break. Phosphodiester bond energy is preserved during catalysis through the formation of a transient phosphotyrosine bond between the active-site tyrosine and the 3' end of the broken strand. According to X-ray crystallography and biochemical analysyses topo IB is organized into four domains: N-terminal domain,core, linker and C-terminal domain which contains the active site Tyr723. The topo IB is also an important target of the antitumor drug camptothecin for chemotherapy of uman cancers. The biochemical and structural-dynamical properties of the Asp677Gly-Val703Ile double mutant displaying a pronounced CPT sensitivity as been investigated to better understad the action mechanism of the enzyme and the interaction of CPT with the cleavable topoI-DNA complex. The results have shown that the CPT hypersensitivity of the mutations its done to a reduction of its religation rate and demonstrated the occurrence of a long range communication between domains localized far away one from the other.The inhibition efficiency on human topo IB wild type of the cEPA has been investigated analyzing the different steps of the enzyme catalytic cycle. The experiments show that cEPA has a mechanism different from CPT, inhibiting the cleavage of the enzyme on the DNA although permitting the non covalent enzyme-DNA interaction. The human topoI N-terminal domain is the only region of the enzyme with an unknown 3D structure since it is not possible to crystallize it. This domain has been overproduced into E.coli BL21,to carry out preliminary spectroscopic analysis consisting of CD, fluorescence and NMR spectra. The spectra indicate an equilibrium between the structured and unstructured regions. We are now producing the isotope labeled protein,growing the bacterial cells in minimum medium containing N15,in the attempt to gain further structural information by high-field 2D NMR spectroscopy.
Calabrese, Remo <1978>. "Metodi bioinformatici per la caratterizzazione dell'instabilità proteica, SNPs e malattie." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2007. http://amsdottorato.unibo.it/65/1/TesiRemo.pdf.
Повний текст джерелаCalabrese, Remo <1978>. "Metodi bioinformatici per la caratterizzazione dell'instabilità proteica, SNPs e malattie." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2007. http://amsdottorato.unibo.it/65/.
Повний текст джерелаNini, Antonella. "Analisi dei metaboliti secondari da fonti naturali: isolamento, caratterizzazione strutturale e attività biologiche." Doctoral thesis, Università degli studi del Molise, 2015. http://hdl.handle.net/11695/66298.
Повний текст джерелаThe research activity in Biological Sciences and Technology, PhD XXVII cycle, is focused on the chemistry of natural substances. The main aim is isolation and structural characterization of secondary metabolites from plants. The plant species used in this study are useful in folk medicine due to their herbal medicinal properties and edible food plants. The chemical investigation is mainly focused on the following plant species: Olea europea L., Gentiana lutea L. and Allium cepa L., a local variety found in Molise region. The decoction of the leaves of Olea europea, is widely used in folk medicine for hypotensive and hypoglycemic activities. The extract of Gentiana lutea roots is used to relieve an upset stomach. However, the roots are also used for the preparation of beverages. The species Allium cepa is known for its antibacterial activity in the digestive system. The purification and isolation of secondary metabolites was achieved by using chromatographic techniques such as column chromatography, thin layer chromatography (TLC), High Pressure Liquid Chromatography (HPLC), Droplet Countercurrent Chromatography (DCCC). The structural characterization of all isolated compounds was based on spectroscopic techniques using both mono-dimensional and two-dimensional experiments such as, NMRs (Nuclear Magnetic Resonance, i.e. 1H NMR, 13C NMR and COSY, HSQC, HMBC, ROESY, respectively). The analysis led to the isolation of several secondary metabolites. Many compounds were tested for biological activity and some of them showed a remarkable antioxidant activity and a potential inhibition of xanthine oxidase enzyme. Finally, some of the isolated compounds were analyzed in silico, by using a novel technique called ChemGPS. A predictive study on the biological activities was of the isolated test compounds was possible due to this analysis.
Naldi, Marina <1977>. "Caratterizzazione mediante HPLC-MS di modifiche post-trasduzionali di proteine istoniche." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2008. http://amsdottorato.unibo.it/688/1/Tesi_Naldi_Marina.pdf.
Повний текст джерелаNaldi, Marina <1977>. "Caratterizzazione mediante HPLC-MS di modifiche post-trasduzionali di proteine istoniche." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2008. http://amsdottorato.unibo.it/688/.
Повний текст джерелаALTAMURA, SANDRO. "IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI PARTNERS MOLECOLARI DELLE PROTEINE HMGA." Doctoral thesis, Università degli studi di Trieste, 2007. http://thesis2.sba.units.it/store/handle/item/12290.
Повний текст джерелаCelegato, Marta. "Caratterizzazione della regione carbossi-terminale della proteina strutturale GAG del virus dell'immunodeficienza felina (FIV)." Doctoral thesis, Università degli studi di Padova, 2009. http://hdl.handle.net/11577/3426022.
Повний текст джерелаLo studio dei determinanti virali e cellulari che regolano il rilascio delle particelle retrovirali dalle cellule infettate riveste un ruolo cruciale sia nello studio della biologia di base del virus, allo scopo di identificare nuovi target terapeutici, sia nello sviluppo di vettori per il trasferimento di proteine/geni a scopo vaccinale/terapeutico. In tale contesto, la poliproteina Gag, espressa in assenza di ogni altra proteina virale, è in grado di produrre particelle simil virali (VLP). I virus ad RNA dotati di envelope gemmano dalle cellule infettate sfruttando il pathway del Multivesicular Body (MVB). In questo ambito, fondamentali sono l'ubiquitinazione delle proteine strutturali virali e la loro diretta interazione con fattori cellulari coinvolti nella biogenesi dei MVB attraverso corti motivi aminoacidici ricchi in prolina, noti come domini di assemblaggio tardivo (Late assembly domain o L domain). Il presente lavoro di dottorato si inserisce in un progetto di ricerca più ampio che si propone di ottimizzare la produzione delle proteine strutturali del Virus dell'Immunodeficienza Felina (FIV), al fine di migliorare l'ottenimento di VLP. In particolare, ci si è proposti di valutare aspetti quali produzione e maturazione delle particelle simil virali e di studiare le interazioni della proteina Gag con proteine cellulari che cooperano con la funzione dei motivi tardivi in essa contenuti. A tale scopo, è stata ottenuta una serie di costrutti FIV-derivati, esprimenti la proteina Gag mutagenizzata nella regione carbossi-terminale a livello dell'L domain, che com'è noto svolge un ruolo essenziale nelle fasi tardive della replicazione virale. In questo modo è stato possibile dimostrare come FIV, a differenza del Virus dell'Immunodeficienza Umana (HIV), è strettamente dipendente per la sua gemmazione dal dominio L PSAP, indipendentemente dalla funzionalità della proteasi virale. E' stato inoltre identificato un secondo putativo L domain con funzione ausiliaria, motivo LLDL, localizzato all'interno della regione p2 di Gag situato a valle rispetto al primo. E' stato possibile dimostrare come i suddetti domini L permettano a FIV di sfruttare il pathway cellulare di biogenesi dei MVB per gemmare in modo efficiente dalle cellule e di come tale fenomeno sia correlato ad una significativa ubiquitinazione di Gag, possibile solamente in presenza di un L domain attivo. In particolare è stato osservato come il blocco del pathway dei MVB, mediante la sovraespressione di un mutante dominante negativo della proteina cellulare Vps4, essenziale per la formazione dei MVB, porti ad una riduzione significativa nel rilascio di VLP anche in assenza di proteasi attiva. Inoltre, questo risultato è supportato dalla dimostrazione dell'incorporazione di Tsg101 nelle particelle virali e del coinvolgimento di CHMP3 nella gemmazione virale. Infine, sono state fornite interessanti evidenze che, sebbene FIV non possieda un dominio PPxY, l'ubiquitino ligasi Nedd4-2s aumenta il livello di ubiquitinazione della proteina Gag. Probabilmente, Nedd4-2s può cooperare con altri L domain per aumentare il rilascio virale o forse può portare all'ubiquitinazione e conseguente attivazione di componenti del MVB come dimostrato in questo studio avviene per Tsg101. Inoltre, questa particolare ubiquitino ligasi è in grado, senza venire incorporata nelle particelle virali, di ripristinare un efficiente rilascio di un mutante di FIV privo di un attivo L domain. In conclusione i dati ottenuti hanno permesso di chiarire alcune caratteristiche peculiari della regione carbossi-terminale della proteina Gag di FIV e più in particolare della fase di rilascio delle particelle virali. E' stato dimostrato come un lentivirus dei non primati condivida con HIV-1 un nuovo meccanismo di collegamento al macchinario cellulare di gemmazione.
CUPAIOLI, FRANCESCA ANNA. "CARATTERIZZAZIONE DEI PIGMENTI DELL'INVECCHIAMENTO NEL CERVELLO UMANO:NEUROMELANINA E LIPOFUSCINE." Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano, 2010. http://hdl.handle.net/2434/150063.
Повний текст джерелаROMANELLO, MILENA. "CARATTERIZZAZIONE BIOCHIMICA DELLE FASI ORGANICA E MINERALE DEL TESSUTO OSSEO NEL RATTO." Doctoral thesis, Università degli studi di Trieste, 1996. http://thesis2.sba.units.it/store/handle/item/12832.
Повний текст джерелаCiabatti, Iacopo. "Cocristalli di acidi dicarbossilici: sintesi, caratterizzazione e stabilità allo stato solido." Master's thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2011. http://amslaurea.unibo.it/2545/.
Повний текст джерелаGARGARO, Danilo. "Analisi modale output-only e monitoraggio strutturale per la caratterizzazione dinamica di componenti strutturali e non strutturali in complessi ospedalieri." Doctoral thesis, Università degli studi del Molise, 2018. http://hdl.handle.net/11695/84857.
Повний текст джерелаRecent earthquakes occurred in Italy and throughout the world have remarked the critical role of health facilities for post-earthquake emergency management. Due to earthquake, several hospitals (L’Aquila 2009, Amatrice 2016) have lost their functionality because of damage to structural as well as non-structural members, equipment and installations. The primary role of hospitals after hazardous events leads to develop specific analysis and monitoring strategies aimed at assessing their conditions, possibly in real time. As a result of this process, health facilities become “smart” and they can effectively support the mitigation of seismic vulnerability, by acting on preparedness of the medical staff and supporting the management and the maintenance of structural as well as non-structural subsystems over time. Continuous monitoring of health and performance of hospitals can support the formulation of disaster mitigation plans and the definition of investment priorities to ensure the overall safety. In the present thesis, the main monitoring programs focused on post-earthquake damage assessment of health facilities are reviewed, pointing out their limitations in assessing the performance of structural as well as non-structural members, equipment and installations. Some results of an on-going monitoring project for the main hospital in Campobasso (Southern Italy) are presented, afterwards. Attention is focused on the response of the structure in operational conditions and after seismic events. A modal-based damage detection method is proposed. The results of experimental as well as operational modal analysis tests on a drug dispenser are also discussed in order to assess their applicative perspectives for qualification of medical equipment in view of seismic vulnerability assessment of non-structural components. The potentialities of modal based damage detection methods for the assessment of non-structural components are finally assessed by laboratory testing of a steel tank. Ensuring supply of liquids and medical gases after an earthquake is one of the most important tasks to keep the hospital operational. Unanchored tanks are vulnerable to earthquake loadings. This type of tanks is frequently encountered in existing hospitals. Rooftop water tanks or diesel fuel tanks for emergency generators are examples of usually unanchored tanks. Their damage can cause explosions and leakage of toxic substances, with the related consequences in terms of pollution and life losses. Due to their configuration, liquid and gas storage tanks apply large forces to the supports, which can collapse causing tank toppling. Thus, some output-only modal identification tests have been carried out to characterize the dynamic response of a vertical atmospheric water tank under different filling ratios and anchoring. The study has provided useful hints for the development of modal based structural health monitoring systems able to diagnose the health state of similar tanks after seismic events.
Coppolino, Francesco Saverio. "Prove di caratterizzazione meccanica della canna comune (Arundo Donax) in prospettiva di un uso strutturale sostenibile." Master's thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2020. http://amslaurea.unibo.it/20173/.
Повний текст джерелаGrillo, Caterina. "Analisi strutturale e funzionale della proteina ERp57: caratterizzazione dei complessi nucleari macromolecolari in cui è coinvolta." Doctoral thesis, La Sapienza, 2005. http://hdl.handle.net/11573/916791.
Повний текст джерелаSTORICI, PAOLA. "LE CATELICIDINE, UNA NUOVA FAMIGLIA DI PRECURSORI DI PEPTIDI ANTIMICROBICI DEI NEUTROFILI. CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE E STRUTTURALE." Doctoral thesis, Università degli studi di Trieste, 1996. http://thesis2.sba.units.it/store/handle/item/12831.
Повний текст джерелаPEROZZI, SILVIA. "Caratterizzazione dell'ACMS decarbossilasi e della chinolifato fosforibosiltrasferasi, enzimi regolatori della via metabolica "Triptofano-NAD+" nell'uomo." Doctoral thesis, Università Politecnica delle Marche, 2008. http://hdl.handle.net/11566/242601.
Повний текст джерелаMasi, Daniele. "Valutazione sperimentale della risposta strutturale di una macchina radiologica odontoiatrica." Master's thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2013. http://amslaurea.unibo.it/5068/.
Повний текст джерелаBocci, Paola. "Analisi funzionale e strutturale della nicotinammide mononucleotide deamidasi, un nuovo enzima del metabolismo della vitamina B3." Doctoral thesis, Università Politecnica delle Marche, 2012. http://hdl.handle.net/11566/242101.
Повний текст джерелаNicotinamide mononucleotide (NMN) deamidase is one of the key enzymes of the pyridine nucleotide cycle (PNC), a network of biochemical transformations that allow cells to recycle the byproducts of endogenous NAD consumption back to the coenzyme, and to salvage the available pyridine bases, nucleosides and nucleotides as NAD precursors. By catalyzing the deamidation of the mononucleotide form of the vitamin (NMN), the enzyme provides the substrate to the subsequent step towards NAD biosynthesis. Recently, through a biochemical approach, a protein endowed with NMN deamidase activity was identified in the bacterium Shewanella oneidensis. In this work, in vivo genetic studies confirmed the role of the enzyme in the vitamin B3 biosynthesis. Sequence homology analyses revealed that NMN deamidase is a highly conserved enzyme present in most bacterial species; it is absent in Archaea and in Eukaryotes. In some bacterial species, the NMN deamidase functional domain is found fused with a protein of unknown function. Both the single- and the two- domain enzymes show a remarkable high affinity for the substrate, as well as a high catalytic efficiency; this result is consistent with the proposed enzyme’s role in contributing to NMN levels regulation. NMN deamidase is both phylogenetically and structurally distinct from enzymes catalyzing the hydrolysis of amide bonds belonging to known superfamilies. The recombinant enzyme was used to set up an enzymatic assay for the determination of intracellular levels of both the monucleotide forms of the vitamin B3, NMN and NaMN.
D'URSI, PASQUALINA. "Varianti naturali della proteina C: interpretazione strutturale con approccio computazionale e costruzione della banca ProCMD." Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano, 2007. http://hdl.handle.net/2434/43912.
Повний текст джерелаMANCINI, CHIARA, and CHIARA MANCINI. "Identificazione e caratterizzazione di una nuova famiglia di regolatori trascrizionali della biosintesi del NAD+ nei batteri." Doctoral thesis, Università Politecnica delle Marche, 2009. http://hdl.handle.net/11566/242343.
Повний текст джерелаEVANGELISTA, Giovanna. "Caratterizzazione molecolare e funzionale della Polinucleotide fosforilasi dall'eubatterio antartico Pseudoalteromonas Haloplanktis." Doctoral thesis, Università degli studi del Molise, 2010. http://hdl.handle.net/11695/66405.
Повний текст джерелаPolynucleotide phosphorylase (PNPase) is involved in the nucleotide metabolism pathway of both eukaryotes and prokaryotes. The enzyme catalyzes the phosphorolytic degradation of RNA, releasing nucleoside 5’-diphosphates from the 3’ end of the substrate, and the reverse reaction of nucleoside 5’-diphosphate polymerization. In this work it’s described the procedure of isolation and the characterization of PNPase from the psychrophilic eubacterium Pseudoalteromonas haloplanktis (Ph, optimal growth condition 4-20°C), identified for its ability to catalyse the following reversible reaction: RNA(n) + Pi ↔ RNA(n-1) + ppN PhPNPase showed a homotrimeric structure of 255 kDa, as evaluated by molecular mass analysis under native and denatured conditions. Using bioinformatic software, starting from the amino acid sequence, a prediction of the secondary and tertiary monomer structure have been obtained. Besides, studies on the amino acid composition have been carried out, thus evidencing that PhPNPase shows the typical adaptation of proteins isolated from psychrophilic organisms. The kinetic parameters have been determined at 15°C, using poly(A) as a primer and [3H]GDP as substrate. The effect of increasing concentration of [3H]GDP on the activity has been evaluated, thus allowing the determination of the kinetic parameters of the polymerization reaction. The activity of PhPNPase is stimulated by selected monovalent cations added in the reaction mixture, a feature already observed for other enzymes isolated from P. haloplanktis. Among the cations tested, CsCl, added to 0.9 M final concentration, has resulted the most effective, enhancing PhPNPase activity of about 7-fold. The effect of temperature on the activity and stability of PhPNPase has also been tested. In particular, the activity of PhPNPase increases with increasing temperature, reaching a maximum at 40°C; beyond this temperature a straight decay of the activity has been observed, due to thermal inactivation of the enzyme. In the 0-40°C interval, a value of 87 kJ/mol for the energy of activation of the reaction (Ea) has been calculated. Studies about the effect of temperature on PhPNPase stability have shown that this enzyme is a quite thermolabile protein; in fact, the Ea of the thermal inactivation reaction in the 30-70°C interval, is 96.7 kJ/mol, a value significantly lower than those observed for other proteins isolated from mesophilic and thermophilic sources. The thermostability of this enzyme has also been investigated by spectroscopic analysis. UV-melting curves have shown a temperature for half-denaturation of 46°C, a value significantly higher than that found for the maximum catalytic activity. These results indicate that the catalitic centre of PhPNPase is less stable of the overall protein structure.
Ancarani, Valentina <1978>. "Marcatura di molecole biologiche a funzione antigenica per lo studio e la caratterizzazione di protocolli di vaccinoterapia in oncologia medica." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2008. http://amsdottorato.unibo.it/692/1/Tesi_Ancarani_Valentina.pdf.
Повний текст джерелаAncarani, Valentina <1978>. "Marcatura di molecole biologiche a funzione antigenica per lo studio e la caratterizzazione di protocolli di vaccinoterapia in oncologia medica." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2008. http://amsdottorato.unibo.it/692/.
Повний текст джерелаDi, Foggia Michele <1980>. "Studio di biomateriali usati come scaffold per Tissue Engineering e loro caratterizzazione con tecniche spettroscopiche vibrazionali e di analisi termica." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2008. http://amsdottorato.unibo.it/703/1/Tesi_Di_Foggia_Michele.pdf.
Повний текст джерелаDi, Foggia Michele <1980>. "Studio di biomateriali usati come scaffold per Tissue Engineering e loro caratterizzazione con tecniche spettroscopiche vibrazionali e di analisi termica." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2008. http://amsdottorato.unibo.it/703/.
Повний текст джерелаGESIOT, LORENZO. "CARATTERIZZAZIONE DI DOMINI STAS DI PROTEINE DELLA FAMIGLIA SULP MEDIANTE TECNICHE DI RISONANZA MAGNETICA NUCLEARE." Doctoral thesis, Università degli studi di Padova, 2010. http://hdl.handle.net/11577/3426995.
Повний текст джерелаLe Permeasi del Solfato (SulP) rappresentano una famiglia di trasportatori di membrana che assorbono o scambiano anioni inorganici. Nei batteri e nelle piante, questi trasportatori mediano l’assorbimento del solfato, una fondamentale fonte di zolfo, essenziale per il metabolismo di Procarioti ed Eucarioti. È stato dimostrato che alcuni geni coinvolti nel metabolismo dello zolfo costituiscono dei fattori di virulenza in alcuni patogeni di mammifero. Nei Micobatteri, ad esempio, l’analisi dell’espressione genica in risposta a stress ambientali ha dimostrato un accumulo inducibile e stabile della proteina Rv1739c, un trasportatore ad alta affinità e specifico per il solfato appartenente alla famiglia SulP. Nei mammiferi, i trasportatori SulP sono rappresentati dalla famiglia SLC26 (Solute Linked Carrier). I trasportatori di mammifero sono degli scambiatori anionici molto versatili, essenziali per normale fisiologia e coinvolti nella fisiopatologia umana. La rilevanza clinica della famiglia Slc26 è stata evidenziata con l’identificazione di mutazione patogeniche in quattro geni coinvolti in patologie ereditarie (Slc26A2 - displasia diastrofica, Slc26A3 - diarrea congenita con perdita di cloruro, Slc26A4 - sindrome di Pendred, Slc26A5 - sordità non sindromica). Le proteine SulP sono costituite da una regione idrofobica N-terminale composta da un numero variabile di segmenti trans-membrana e da una porzione C-terminale citoplasmatica che include un dominio STAS (Sulphate Transporter and Anti-Sigma factor antagonist). Il dominio N-terminale è associato al trasporto anionico, mentre la funzione del dominio STAS rimane sconosciuta; ciononostante, nei trasportatori SulP vegetali e SLC26 di mammifero, lo STAS è considerato fondamentale per il corretto indirizzamento verso la membrana plasmatica e per la funzione di trasporto. L'analisi di sequenza ha dimostrato un’inattesa similarità tra la regione citoplasmatica C-terminale dei trasportatori SulP e le proteine batteriche ASA (AntiSigma-factor Antagonist), caratterizzate grazie alla determinazione strutturale di SPOIIAA (117 aa) di Bacillus subtilis. SpoIIAA presenta un foglietto β costituito da quattro filamenti, circondato da quattro α-eliche. A differenza degli ASA batterici, i domini STAS dei trasportatori anionici sono scarsamente caratterizzati per quanto riguarda sia la loro funzione, sia la loro struttura. Nei domini STAS, il foglietto β e il loop compreso tra il filamento β3 e l’elica α2 sono molto conservati, mentre, a livello del loop compreso tra l’elica α1 e il filamento β3 e in posizione C-terminale, sono previste delle estensioni variabili di differente lunghezza. Queste osservazioni indicano che, probabilmente, la struttura tridimensionale dei domini STAS dei trasportatori anionici devia in modo imprevedibile da quella degli ASA batterici. Pertanto, la caratterizzazione strutturale degli STAS della famiglia SulP è fondamentale per comprenderne la fisiologia e il ruolo che le mutazioni hanno nell’insorgere delle patologie. Attualmente non è disponibile alcuna struttura tridimensionale sperimentale né dei trasportatori SulP, né dei loro domini. La determinazione strutturale dei domini STAS è il principale scopo di questo progetto. In effetti, le dimensioni limitate di queste proteine le rendono studiabili mediante tecniche di NMR in soluzione. I domini STAS delle proteine presentate qui di seguito sono stati espressi in E. coli e studiati mediante NMR: 1) STAS di Rv1739c da Mycobacterium tuberculosis: abbiamo espresso un campione marcato con l’isotopo 15N, che ci ha consentito di raccogliere esperimenti HSQC di ottima qualità; la proteina tuttavia si è dimostrata estremamente sensibile alla temperatura e si è denaturata mentre venivano testate diverse condizioni. Il principale problema con questa proteina è comunque stata la bassa resa ottenuta dalla sua espressione. Sfortunatamente, poco prima di cambiare strategia di clonaggio (passando da una comune His-tag rimuovibile con trombina ad un dominio di fusione SUMO rimuovibile), l’assegnazione NMR della stessa proteina è stata pubblicata. 2) STAS di SULTR1;2 da Arabidopsis thaliana: abbiamo espresso un campione marcato con l’isotopo 15N, che ci ha consentito di raccogliere esperimenti HSQC che hanno dimostrato un livello di aggregazione compatibile con la formazione di omodimeri. La proteina si è dimostrata molto instabile ed è precipitata in modo massivo entro poche ore dall’inizio degli esperimenti. 3) STAS di Prestina da Rattus norvegicus. La Prestina (SLC26A5) è espressa in grandi quantità e in modo quasi esclusivo nelle cellule cigliate esterne OHC (Outer Hair Cell) dell’organo del Corti, nell’orecchio interno dei mammiferi; a differenza degli altri membri della famiglia SLC26, ha la proprietà unica di subire modificazioni conformazionali voltaggio-dipendenti, ed è considerata fondamentale nell’elettromotilità delle cellule OHC. In risposta a variazioni del voltaggio trans-membrana, agisce come un motore molecolare, subendo riarrangiamenti strutturali che ne alterano la sezione nella membrana plasmatica, modificando di conseguenza la lunghezza cellulare di anche il 5%. Mutazioni della Prestina sono state individuate come la causa di gravi deficit uditivi. Abbiamo prodotto un campione di STAS marcato con 15N e un campione doppiamente marcato con 15N e 13C; questo dominio si è dimostrato stabile alle concentrazioni millimolari (1.2 mM), nella forma di un monomero ben strutturato. Abbiamo raccolto i seguenti esperimenti NMR 13C,15N-eteronucleari: HNCO, HNCA, HN(CA)CO, CBCA(CO)NH, HNCACB, H(CA)NH, HBHA(CBCACO)NH, H(CCCO)NH, (H)CC(CO)NH, HCCH-TOCSY, CBHD, 13C-HSQC per gruppi aromatici, (H)C(NC)H-His, (HB)CB(CGCC)H-TOCSY (per Tyr e Phe), 13C-NOESY (per gruppi aromatici and alifatici), 15N-NOESY, oltre ad un C-detected HCACO. Tutti questi esperimenti hanno richiesto un tempo macchina di oltre 45 giorni. L’assegnazione della catena principale e delle catene laterali è completa per circa il 90% dei residui. Purtroppo questa proteina presenta alcuni problemi di scambio conformazionale che ne sopprimono i segnali dei gruppi HN in catena principale di due sequenze (35-55 and 73- 80). È stato tuttavia possibile fare alcune interessanti considerazioni di tipo strutturale.
Succol, Ginevra <1993>. "Sviluppo di una tecnica alternativa per la trasformazione di microalghe mediante l'uso di nanoparticelle di chitosano: sintesi, caratterizzazione ed applicazione in vivo." Master's Degree Thesis, Università Ca' Foscari Venezia, 2018. http://hdl.handle.net/10579/13560.
Повний текст джерелаZanetti, Manuela. "caratterizzazione funzionale di un canale del potassio del cianobatterio Synechocystis sp. PCC 6803." Doctoral thesis, Università degli studi di Padova, 2008. http://hdl.handle.net/11577/3425198.
Повний текст джерелаCICCONE, SARAH. "Studio dei polimorfismi delle glutatione trasferasi nell'aumentata suscettibilità ai processi tumorali: caratterizzazione strutturale e funzionale della glutatione trasferasi di cianobatterio." Doctoral thesis, Università degli Studi di Roma "Tor Vergata", 2010. http://hdl.handle.net/2108/1219.
Повний текст джерелаGlutathione S-transferases (GSTS) are considered part of a coordinated defence strategy, together with other GSH-dependent enzymes, the cytochrome P450s (Phase I enzymes) and some membrane transporters (Phase III) such as MRP1 and MRP2, to remove from the cell the products of oxidative stress generated after interaction of reactive oxygen species, that escape the first line of defense, with cellular macromolecules such as DNA, lipids and proteins. Glutathione S-transferases (EC 2.5.1.18) catalyze the conjugation of glutathione (GSH) with a variety of toxic compounds (carcinogens, anticancer drugs, reactive oxygen species and products of cellular metabolism) that contain an electrophilic atom, i.e. carbon, nitrogen or sulphur. In mammals, there are three major families of proteins that exhibit glutathione transferase activity: two of these, the cytosolic and mitochondrial GSTs, comprise soluble enzymes, while the third family are microsomal (MAPEG) and are referred to as membrane-associated proteins in eicosanoid and glutathione metabolism (Hayes et al., 2005). The human cytosolic GSTs are dimeric proteins; each subunit contains a very similar binding site for GSH (G-site) and a second one for the hydrophobic co-substrate (H-site). Structural differences at the H-site confer a certain degree of substrate selectivity. The human cytosolic GSTs can be grouped into at least seven gene-independent classes on the basis of their amino acid sequence and immunological properties: Alpha, Mu, Pi, Sigma, Theta, Omega, and Zeta Cytosolic GSTs display polymorphisms in humans, and this is likely to contribute to interindividual differences in responses to xenobiotics . A lot of studies suggest that that combinations of polymorphisms in Mu, Pi, and Theta class GST contribute to diseases development. In the first part of this work we analyzed three common polymorphisms in the GSTP1, GSTT1, and GSTM1 genes either decrease or abolish GST enzyme activity: the GSTP1 allelic variants, that differ at either a single codon position (Ile104 (HGSTP1*A), Val104 (HGSTP1*B), Val113 HGSTP1*D) or at two different positions (Val104/Val113 (HGSTP1*C)), and the homozygous deletions of the GSTT1 or GSTM1 gene that lead to an absence of enzymatic activity. The commonly used anti-cancer drug chlorambucil is the primary treatment for patients with chronic lymphocytic leukaemia. Chlorambucil has been shown to be detoxified by human glutathione transferase Pi (GST P1-1), an enzyme that is often found over-expressed in cancer tissues. The allelic variants of GST P1-1 are associated with differing susceptibilities to leukaemia and differ markedly in their efficiency in catalysing glutathione (GSH) conjugation reactions. Here, we perform detailed kinetic studies of the allelic variants with the aid of three representative co-substrates. We show that the differing catalytic properties of the variants are highly substrate-dependent. We show also that all variants exhibit the same temperature stability in the range 10 °C to 55 °C. We have determined the crystal structures of GST P1-1 in complex with chlorambucil and its GSH conjugate for two of these allelic variants that have different residues at positions 104 and 113. Chlorambucil is found to bind in a non-productive mode to the substrate-binding site (H-site) in the absence of GSH. This result suggests that under certain stress conditions where GSH levels are low, GST P1-1 can inactivate the drug by sequestering it from the surrounding medium. However, in the presence of GSH, chlorambucil binds in the H-site in a productive mode and undergoes a conjugation reaction with GSH present in the crystal. The crystal structure of the GSH–chlorambucil complex bound to the *C variant is identical with the *A variant ruling out the hypothesis that primary structure differences between the variants cause structural changes at the active site. Finally, we show that chlorambucil is a very poor inhibitor of the enzyme in contrast to ethacrynic acid, which binds to the enzyme in a similar fashion but can act as both substrate and inhibitor. In another part of this work we determined in the peripheral blood lymphocytes of 157 workers exposed to benzene, using 25 individuals not exposed as external controls, the presence of polymorphic genes GSTT1 and GSTM1 and the distribution of GSTP1 allelic variants. We have also evaluated the glutathione transferases (GST) activities and the levels of glutathionylated hemoglobin in the RBC of the same samples. Because this study is in progress again, we can’t estabilish the finals conclusions. During my Phd project I have also analyzed the presence of GSTP1-1 enzyme in prostatic cancer cells lines. In contrast to frequent overexpression of GST-pi observed in many types of cancer, the vast majority of primary human prostate tumors contain no detectable GST pi. So, this enzyme is abundant in normal prostate basal epithelial cells, but basal cells are lost during development of invasive cancer. Absence of GST pi expression in human prostate cancer is accompanied by hypermethylation of regulatory sequences within the GST pi gene, whereas no such hypermethylation is present in normal tissues or benign prostatic hyperplasia (HPB). So we employed Western blot analysis and specific activity assays to measure GST pi expression in diferrents prostatic cancer cells lines selected on the basis of their tumor staging. We have analyzed HBP lines (positive controls), G1 cells lines (associated with a negative prognosis), G2 cells lines (associated with good prognosis) and LNCaP (negative controls). At the and of this study we observed that the most relevant expression of GST pi was detectable in HPB cells, but also in G2 and G1 cells is possible to note a very low presence of this enzyme. The last part of my project comprehend the purification and the enzymatic caratherization of a new GST, called GST short, sequenzed by the cyanobacteria Synechocystis sp PCC 6803 genome. Cyanobacteria represent a group of widely distributed prokaryotes performing oxygenic photosynthesis similar to plants. This, together with their generally accepted role as progenitors of plant plastids, and their ease of genetic manipulation, has made them extremely useful in studies of environmental gene regulations and the mechanism of oxygenic photosynthesis. In according to its phylogenetic origin, GST short presents a very similar G-site sequence with the sequence previously described for GSTI and GSTIII of Zea mays. It is also active towards several classical substrates, but at the same moderate rates that have been observed for other glutathione transferases derived from prokaryotes. Particulary, it was possible observe a strong perossidase activity. We have also analyzed the GST short thermal stability respect to hGSTP1-1 (10°-55°C) and the results indicate that the cyanobacterial enzyme is less resistant at this temperatures than human enzyme probably because its different structure. The cloning, expression and characterization of this cyanobacterial glutathione transferase is also described . The possible significance of the observed catalytic properties is discussed in the context of structural organization and glutathione transferase evolution.
Santecchia, Eleonora. "Studio di materiali nanostrutturati mediante tecniche di microscopia elettronica e diffrazione di raggi X." Doctoral thesis, Università Politecnica delle Marche, 2014. http://hdl.handle.net/11566/242892.
Повний текст джерелаThis Ph.D. Thesis is about the application of electron microscopy and X-ray diffraction to several classes of materials. Three different macro areas have been addressed to: materials for solid state hydrogen storage (thin films and composites), materials for biomedical use (biomaterials and detectors) and light metal alloys. In the first thematic area, thin films of pure Mg and Mg doped with 5at.% Nb and composite samples of particles of Pd and silicon, have all been subjected to cycles of absorption/desorption of hydrogen. The characterization showed that Nb in thin films forms clusters, creating percolative paths that speed up the reaction with H2. The composites showed a behavior with hydrogen which makes them materials having their own scientific identity, opening new application perspectives . In the field of biomaterials a Co-Cr-Mo alloy produced via Direct Metal Laser Sintering (DMLS) has been characterized, in order to optimize the production parameters and clarify the phenomena occurring in the microstructure during production. The results showed that the laser induces, in the powder, a martensitic athermal transformation from the γ (fcc) phase to the ε phase (hcp), producing an intricate network of ε lamellae in the γ phase. This is the first time ever that this phenomenon was observed in similar conditions. In the field of detectors for medical applications a series of LYSO crystal scintillators (detectors for PET) has been characterized. This work allowed to clarify the microstructure and to correlate the light yield properties to the microstructure of the crystals. In the field of light metal alloys for aeronautical applications, the research was focused on the structural characterization of the AZ31B alloy welded with Friction Stir Welding (FSW) and on the aluminum alloy 2219 subjected to Equal Channel Angular Pressing (ECAP).
SPANO', DELIA. "Nucleotide pirofosfatasi/fosfodiesterasi dal lattice di Euphorbia characias e dai frutti di Opuntia ficus indica: purificazione e caratterizzazione." Doctoral thesis, Università degli Studi di Cagliari, 2011. http://hdl.handle.net/11584/266300.
Повний текст джерелаCimolino, Aurelie. "Caratterizzazione delle risorse geotermiche della bassa pianura friulana (regione FVG)." Doctoral thesis, Università degli studi di Trieste, 2010. http://hdl.handle.net/10077/3620.
Повний текст джерелаScopo della ricerca. La ricerca di dottorato è mirata allo studio delle risorse geotermiche profonde (acquiferi profondi e sub superficiali) presenti nel sottosuolo della Bassa Pianura Friulana, mediante l’integrazione di metodi geofisici applicati con metodi stratigrafici e idrogeologici, geochimici e numerici. Le tematiche del dottorato si sono focalizzate su: delimitazione spaziale e caratterizzazione dei sistemi acquiferi (anche come reservoirs a bassa entalpia); studio dei meccanismi di ricarica e circolazione delle acque; definizione della struttura geotermica e valutazione della risorsa nell’area di Grado (Gorizia), dove è stato perforato un pozzo esplorativo (1110 m di profondità). I risultati preliminari della ricerca costituiscono il primo studio integrato in Regione per la caratterizzazione e valutazione della risorsa geotermica effettuato con metodi geofisici da pozzo. Alla luce del modello geologico preesistente, il nuovo modello concettuale emerso dalle ricerche effettuate risulta per molti versi innovativo. Fasi di acquisizione dei dati. Il dottorato è risultato sinergico alle attività di ricerca sviluppate dal DICA dell’Università degli Studi di Trieste, nell’ambito di alcuni progetti innovativi finanziati negli ultimi anni dal Servizio Geologico regionale (Direzione Centrale Ambiente e Lavori Pubblici - RFVG) che hanno permesso la raccolta di numerosi dati inediti. I progetti sono: “Realizzazione della Carta Geologico-Tecnica della Risorsa Geotermica Nazionale e definizione delle Linee Guida per il suo Utilizzo”[Progetto 1]; “Perforazione del pozzo esplorativo Grado-1 per la quantificazione della Risorsa Geotermica - Progetto Geotermia Grado”[Progetto 2]; “Studio sugli acquiferi regionali finalizzato anche alla definizione di linee guida per il corretto e compatibile utilizzo delle loro acque”[Progetto 3]. Questi progetti sono stati completati con diverse collaborazioni con DISGAM e DST dell’Università di Trieste e l’OGS di Trieste. Attività di ricerca. La ricerca si è articolata in diverse fasi operative, anche in accordo ai progetti sopraccitati: 1)Definizione del quadro geologico e strutturale dell’avampaese friulano mediante analisi della letteratura esistente. 2)Studio degli acquiferi sotterranei profondi della Pianura friulana (fino alla profondità massima di 600 m circa) [Progetto 1]. In particolare, in questa fase: sono stati esaminati i dati in sito, analisi geochimiche ed isotopiche di campioni di acqua provenienti da alcuni acquiferi significativi; sono state elaborate mappe delle isobate del tetto dei sistemi acquiferi e mappe delle isoterme delle acque di strato. 3)Raccolta, analisi e contributo alla realizzazione di un database dei pozzi per acqua perforati nella Pianura Friulana che ha integrato oltre 1800 litostratigrafie e altri dati accessori [Progetto 3]. Lo studio ha compreso l’elaborazione numerica delle superfici delimitanti i principali sistemi di acquiferi e delle relative mappe, mediante l’applicazione di diverse metodologie statistiche e l’analisi dei variogrammi sperimentali. Questo ha aggiornato il modello idrogeologico ottenuto dal Progetto 1. 4)Studio del reservoir geotermico profondo mediante un pozzo esplorativo di circa 1100 m di profondità a Grado (Gorizia) e all’acquisizione e all’elaborazione dei dati del pozzo [Progetto 2]. Questa fase ha impegnato la dottoranda in assistenza continua alla D.L. in cantiere (tra gennaio ed aprile 2008) e nelle specifiche attività di: acquisizione e analisi di dati tecnici di perforazione, parametri chimico-fisici dei fluidi di circolazione, produzione del master log e well log di cantiere; monitoraggio termico e prove idrauliche di pompaggio nel reservoir geotermico; raccolta e analisi dei cuttings e delle carote, descrizione macroscopica delle litologie, ricostruzione della stratigrafia sulla base delle analisi preliminari di laboratorio sui cuttings e sulle carote; analisi delle caratteristiche geochimiche principali delle acque campionate; acquisizione e analisi dei logs geofisici di pozzo, che hanno fornito gli elementi-chiave per la ricostruzione delle strutture profonde. 5)Ricostruzione geologica della struttura di Grado e modello idrogeologico e termico per il termalismo profondo, mediante l’integrazione dei dati disponibili e dei nuovi dati acquisiti, con particolare attenzione a: stratigrafie e logs geofisici provenienti da pozzi perforati da Eni, Ina Naftaplin e altri; sezioni sismiche a terra, in Laguna di Grado e Marano e nel Golfo di Trieste; carte del tetto dei carbonati e delle isobate del Quaternario nella Pianura Friulana; mappe di anomalia gravimetrica e magnetica per il Golfo di Trieste ed il suo entroterra. Risultati del dottorato di ricerca. I dati acquisiti nell’area di Grado e Laguna circostante, integrati con le informazioni regionali hanno permesso di individuare e ricostruire una struttura dinarica esterna, non nota precedentemente, che costituisce la sede del sistema di circolazione termale che è caratterizzato da diversa permeabilità. La struttura è interessata da rilevanti faglie beanti sub-verticali e strutture tettoniche che probabilmente mettono in contatto i sistemi termali più profondi con il tetto del reservoir. L’area di Grado è caratterizzata da: una copertura di età plio-pleistocenica di sedimenti sciolti alternati, caratterizzati da granulometria variabile da ghiaioso-sabbiosa a limoso-argillosa; una potente successione clastica costituita da sedimenti neogenici marnoso-arenacei (semilitoidi) e dalle torbiditi del Flysch paleogenico; un basamento carbonatico composito, reservoir del sistema geotermico, rinvenuto a partire da 618 m di profondità nel pozzo Grado-1. Il basamento è risultato suddiviso in intervalli ben distinti. Sono stati individuati calcari di rampa paleogenici e la loro sequenza di sviluppo e annegamento con la comparsa del flysch. I calcari ad Alveolinidae e Nummulitidae sono stati differenziati dai sottostanti calcari micritici di piattaforma di età cretacica superiore anche grazie al riconoscimento di netti marker nel Gamma Ray Log. La correlazione tra i diversi logs geofisici acquisiti in pozzo ha permesso di differenziare ulteriormente il reservoir carbonatico in intervalli distinti per litologia (densità, porosità, resistività, radioattività naturale, …) e moduli elastici; le facies geofisiche sono risultate ben relazionabili a quelle riscontrate nell’offshore croato. I dati idraulici acquisiti durante le prove di strato (con portata naturale e stimolata) e le analisi geochimiche ed isotopiche delle acque hanno permesso di affinare il modello di circolazione idrotermale. Questo considera almeno due sistemi di circolazione all’interno dei carbonati, separati da un setto idraulico: il tratto 616–830 m circa è caratterizzato da circolazione di acque in poche fratture ma molto aperte (con portata spontanea di circa 15 l/s e temperatura di circa 41.4°C); nel tratto 830–1000 m circa si ha una debole circolazione di acque all’interno di un ammasso roccioso più massiccio, interessato da un reticolo fitto ma con modesta apertura; a partire da 1000 m circa si rinvengono acque più calde (45°C a fondo pozzo) in un reservoir a notevole permeabilità (per fratturazione e incarsimento) che potrebbe richiamare i fluidi del sistema idrotermale presente alla profondità di 600-800 m. A scala locale, le strutture tettoniche presenti e probabilmente riattivate recentemente costituiscono una importante via di migrazione, circolazione e cortocircuitazione dei fluidi profondi (acqua e gas) con i sistemi più superficiali. A scala più ampia, il quadro strutturale elaborato per l’area di Grado è caratterizzato da un sistema di strutture inverse ovest-vergenti che coinvolgono il basamento carbonatico e le soprastanti coperture e da un raddoppio tettonico individuato nei calcari; queste strutture sono state interpretate come il fronte dinarico più esterno e costituiscono la diretta prosecuzione di fronti compressivi affioranti in Istria. Il modello stratigrafico elaborato risulta inoltre coerente con il quadro stratigrafico generale desumibile dai pozzi perforati nell’offshore croato e con quanto ipotizzato a partire dalle mappe di anomalia gravimetrica e dalle sezioni sismiche disponibili. Nel più ampio contesto della Bassa Pianura friulana le attività di ricerca hanno consentito di: caratterizzare preliminarmente dal punto di vista chimico-fisico ed isotopico le acque profonde circolanti a diverse profondità (in seno alle coperture post paleogeniche) nelle aree caratterizzate da anomalie geotermiche e le relative mappe delle isoterme valutare la presenza di alcune strutture tettoniche (coinvolgenti le coperture prequaternarie e giungenti in prossimità della superficie) in grado di veicolare fluidi profondi con acque superficiali nelle aree a nordorientali della Laguna di Grado rappresentare mappe regionali delle superfici delimitanti tetto e letto dei principali sistemi di acquiferi confinati evidenziati dalle litostratigrafie dei pozzi e ricostruire un modello numerico schematico del sottosuol. L’insieme dei risultati ottenuti ha permesso dunque di validare le ipotesi di lavoro formulate inizialmente e di proporre un più solido, rinnovato e, per molti versi, innovativo modello geologico-termico basato su inediti dati sperimentali. Il modello geologico elaborato risulta decisivo anche in relazione all’imminente realizzazione del pozzo esplorativo Grado-2, che permetterà al contempo di validare le ipotesi assunte e fornire ulteriori dati sperimentali.
XXII Ciclo
1979
Semenzato, Martina. "FORMAZIONE DI COMPLESSI DELLA PROTEINA MITOCONDRIALE OPA 1 NEL MIOCARDIO ESPOSTO A STRESS OSSIDATIVO E CARATTERIZZAZIONE DI MUTANTI IN RESIDUI CISTEINICI." Doctoral thesis, Università degli studi di Padova, 2010. http://hdl.handle.net/11577/3426992.
Повний текст джерелаIl cuore è particolarmente soggetto a disfunzioni mitocondriali e numerose cardiomiopatie sono associate ad un anomalo metabolismo mitocondriale o ad alterazioni bioenergetiche mitocondriali. Studi recenti hanno messo in evidenza come l’attività dei mitocondri e le vie di trasduzione del segnale cellulare influenzino la morfologia dei mitocondri, ad esempio, la frammentazione della rete mitocondriale è correlata al processo di apoptosi. La proteina OPA 1, GTPasi appartenente alla famiglia delle dinamine, è coinvolta nel processo di fusione della membrana interna mitocondriale e nel mantenimento della struttura delle cristae interne mitocondriali. Tuttavia sono necessari maggiori studi atti a contribuire ad una maggiore comprensione delle proteine e dei meccanismi alla base delle funzionalità di OPA 1. Nel presente lavoro di tesi è stato studiato l’effetto dello stress ossidativo sulla proteina mitocondriale OPA 1 nel cuore, dato che i mitocondri sono sede di produzione e bersaglio delle specie reattive dell’ossigeno (ROS). Inizialmente, utilizzando cuori di ratto isolati e perfusi ex-vivo, è stato valutato l’effetto di ischemia/riperfusione e perfusione con perossido di idrogeno (H2O2) sulla proteina OPA 1. Nei campioni trattati è stata osservata la formazione di complessi ad alto peso molecolare (high molecular weight, HMW) della proteina in esame. In condizioni riducenti, tali complessi vengono disgregati. Questi risultati indicano che in condizioni di forte stress ossidativo con H2O2 si ha l’aggregazione di OPA 1 e che nella formazione dell’aggregato è coinvolta la formazione di ponti disolfuro. In seguito, mediante Blue Native-PAGE (BN-PAGE), è stata eseguita un’analisi dei complessi proteici a partire da mitocondri isolati da cuore di ratto in condizioni normossiche e da cuori perfusi con H2O2. L’analisi ha dimostrato che OPA 1 aggrega in complessi di diverso peso molecolare in condizioni native. La formazione del complesso di OPA 1 è stata analizzata sia cellule HL-1, una linea di cardiomiociti da atrioma murino, che in fibroblasti embrionali murini (mouse embryonic fibroblasts, MEFs). Al fine di indurre stress ossidativo le cellule sono state incubate con 1 mM H2O2 per 2 ore. Il complesso di OPA 1 scompare in condizioni riducenti, confermando la formazione di ponti disolfuro intermolecolari. Inoltre, in cellule HL-1 incubate con concentrazioni crescenti di H2O2 è stata osservata frammentazione della rete mitocondriale. Ci siamo proposti di individuare quali fossero i residui cisteinici coinvolti nella formazione del ponte disolfuro. La struttura della proteina OPA 1 non è stata determinata né mediante NMR né mediante tecnica cristallografica. In collaborazione con il Prof. S. Moro (Facoltà di Farmacia, Università degli Studi di Padova) è stata ipotizzata la struttura 3D della proteina mediante homology modelling al fine di caratterizzare quali fossero i residui cisteinici esposti sulla superficie proteica. In questo modo le cisteine 853, 856 e 874 sono stati individuati come residui più probabilmente coinvolti nella formazione del complesso di OPA 1. Per confermare questa ipotesi, sono stati eseguiti degli esperimenti di mutagenesi sito-diretta a partire da un costrutto plasmidico contenente la sequenza genica per l’isoforma 1 umana del gene OpaI. Mediante questa tecnica sono stati ottenuti plasmidi mutati a livello delle singole cisteine 853 (C853S) e 874 (C874S), ed un doppio mutante cisteina 853-6 (C853-6S). I cloni sono stati sequenziati per confermare le avvenute mutazioni. Sono stati prodotti vettori lentivirali contenenti i plasmidi mutagenizzati al fine di esprimere stabilmente la proteina di interesse nella linea cellulare MEF OPA 1-/- (gentilmente fornita dal Prof. L. Scorrano). Sono state ottenute linee cellulari esprimenti la proteina OPA 1 mutata a livello del singolo residuo cisteinico 853 e dei residui 853-6, mentre non è stata ottenuta la linea esprimente la proteina mutata in C874S. È stata quindi valutata la morfologia mitocondriale nelle linee cellulari ottenute. Le cellule C853-6S presentano mitocondri disgregati con un fenotipo simile alla linea MEF OPA 1-/-; al contrario, nelle cellule esprimenti la proteina OPA 1 mutata a livello del residuo 853, si verifica il ripristino del fenotipo di fusione mitocondriale. Al fine di chiarire la relazione tra l’aggregazione di OPA 1 e la formazione dei ponti disolfuro, le cellule sono state incubate con H2O2. La formazione del complesso di OPA 1 risulta inibita in ambedue le linee cellulari contenenti la proteina mutata. Le cellule C853S sono state trattate con H2O2 per verificare la correlazione tra l’aggregazione della proteina in esame e il processo di fissione mitocondriale. I cloni C853S completano il processo di fissione mitocondriale in un tempo doppio rispetto alla linea MEF WT. Per concludere, in condizioni di elevato stress ossidativo la proteina OPA 1 è esposta ad ossidazione che ne modifica lo stato di aggregazione. Tale processo è correlato ad una diminuzione della fusione mitocondriale e, nelle cellule HL-1, ad un aumentato rilascio di citocromo c. Il meccanismo di aggregazione della proteina è stato stabilito mediante mutagenesi sito specifica che mette in luce il ruolo del residuo cisteinico 853.
Giuliante, Rachela. "Caratterizzazione di cellule staminali tumorali ottenute da linee cellulari di carcinoma della laringe e di carcinoma della vescica." Doctoral thesis, Università Politecnica delle Marche, 2016. http://hdl.handle.net/11566/243113.
Повний текст джерелаAccording to cancer stem cells theory, tumor development would be maintained by a distinct subpopulation of tumor cells, termed cancer stem cells (CSCs), that have the ability to self-renew and to resist to chemotherapeutic agents. In the present study, we setup a culture system to enrich CSCs from Hep-2 (laryngeal cancer), T24 (bladder cancer), MG63 (osteosarcoma), CaCo-2 (colorectal cancer) and A549 (lung cancer) cancer cell lines, through sphere formation. We further performed molecular and phenotypic characterization of CSC-enriched cell populations, by exploring the expression levels of stem markers and in vivo evaluating their tumorigenic potential, respectively. Moreover, we investigated the expression levels of the enzyme nicotinamide N-methyltransferase (NNMT) in CSCs and parental cells. Real-Time PCR and immunocytochemistry revealed that CSC-enriched populations showed increased expression levels of stem markers compared with controls. After subcutaneous injection of Hep-2 cells into immunocompromised mice, CSC-enriched population yielded tumors of a much larger size compared with those generated by parental cells, suggesting the strong ability of CSCs to form tumors in vivo. NNMT expression analysis revealed enzyme upregulation in CSC-enriched populations compared to parental counterpart. Considering the fundamental role of CSCs in tumor relapse and onset of metastases, findings reported in this work could contribute to the development of new therapeutic strategies for cancer treatment and suggest an important involvement of NNMT in cancer cell metabolism.
Bonaiuto, Emanuela. "Ammino Ossidasi umana sensibile alla semicarbazide: dalla caratterizzazione cinetica agli studi cellulari in adipociti." Doctoral thesis, Università degli studi di Padova, 2009. http://hdl.handle.net/11577/3426068.
Повний текст джерелаL’ammino ossidasi umana sensibile alla semicarbazide (SSAO/VAP-1) è una glicoproteina transmembrana, che catalizza la deamminazione ossidativa di ammine primarie ad aldeidi, con rilascio dello ione ammonio e perossido di idrogeno. Il suo ruolo fisiologico non è ancora chiaro: in adipociti, l’attività SSAO/VAP-1 ha un effetto che mima quello dell’insulina, mentre nell’endotelio vascolare e sinusoidale epatico, SSAO/VAP-1 è coinvolta nell’extravasazione dei leucociti ai siti di infiammazione. Su queste basi, lo sviluppo di nuovi specifici inibitori per SSAO/VAP-1 è un target importante per lo sviluppo di nuovi farmaci antinfiammatori, mentre lo sviluppo di nuovi specifici substrati può contribuire a chiarire le funzioni fisio-patologiche di questo enzima. Per ottenere informazioni sulle caratteristiche che una molecola dovrebbe possedere per essere riconosciuta dal sito attivo dell’enzima umano SSAO, è stata eseguita una caratterizzazione cinetica di SSAO/VAP-1 da adipociti, utilizzando ammine primarie, caratterizzate da differente lunghezza, ingombro sterico e distribuzione di carica. L’1,12 diamminododecano e la cis-4-cloro-butenilammina sono risultati i substrati con la più alta efficienza catalitica fra quelli provati. E’ stato possibile stimare il valore di costante dielettrica del sito attivo di SSAO/VAP-1, che è compreso in un intervallo di circa 10-20. Dall’effetto del pH sul rapporto Vmax/KM della SSAO/VAP-1 per alcuni substrati, è stato possibile evidenziare che un residuo nella sua forma protonata inibisce la catalisi. Da un’analisi preliminare delle strutture 3D di VAP-1, questo residuo potrebbe essere la lisina 393. Dall’effetto della forza ionica e della temperatura sull’attività enzimatica è stato possibile dedurre che l’effetto idrofobico sembra avere un ruolo importante nella fase di riconoscimento substrato - sito attivo della SSAO/VAP-1. Sono state anche provate varie classi di composti (sali di fosfonio ed ammonio, piridina, anilina e i suoi derivati e gli N-ossidi), che sebbene siano buoni inibitori per l’enzima da siero bovino, si sono rivelati inibitori poco efficienti per l’enzima umano SSAO/VAP-1 (valori minimi di Ki=3-4 mM), anche se l’omologia di sequenza fra i due enzimi è elevata (82%). Dall’insieme di questi studi, è emerso che un buon substrato o inibitore per l’enzima umano SSAO/VAP-1 dovrebbe essere una molecola caratterizzata da una larga porzione apolare e dalla presenza di una carica positiva ad una distanza maggiore di 10-12 ? dal gruppo amminico reattivo. Per ovviare all’impiego di isotopi radioattivi, è stato messo a punto un metodo fluorimetrico discontinuo per la misura dell’attività di SSAO/VAP-1 nel plasma umano. Il metodo è stato validato e applicato alla misura dell’attività della forma solubile di SSAO/VAP-1 nel plasma umano di individui controllo e in pazienti affetti da diverse patologie. Un aumento significativo dei livelli di attività SSAO/VAP-1 plasmatica è stato trovato in pazienti con Alzheimer “moderato-grave” ed in pazienti con impianto di stent coronarico. In questi pazienti oltre a SSAO/VAP-1, è stato trovato inoltre un aumento dei livelli di attività della superossido dismutasi circolante nel plasma, suggerendo una condizione di “stress ossidativo”, probabilmente dovuta alla presenza dello stent. Nel caso dei pazienti con cirrosi epatica esotossica (indotta da abuso di alcool), è stato messo in luce un aumento dell’attività della forma solubile si SSAO/VAP-1 nei pazienti con cirrosi epatica “lieve-moderata” (classificazione Child), mentre nei pazienti con cirrosi epatica “grave”, questo aumento si riduce. I risultati ottenuti suggeriscono che elevati livelli della forma solubile di SSAO/VAP-1, sono la conseguenza di un’intensa risposta infiammatoria, mentre la relativa diminuzione del livello di SSAO/VAP-1 nello stato più grave della patologia, potrebbe essere dovuto ad un crollo delle difese immunitarie in questi pazienti. Per cercare di chiarire un possibile ruolo dell’attività di SSAO/VAP-1 negli adipociti, è stato condotto uno studio preliminare trattando le cellule con fattori quali insulina, metilammina, catalasi e malvidina 3-glucoside. L’analisi SDS-PAGE, evidenzia che alcune proteine sono espresse in maniera differente nell’incubazione degli adipociti con questi fattori. In particolare, la presenza di questi composti modula l’espressione di SSAO/VAP-1 e delle MAO, suggerendo che entrambi gli enzimi sono coinvolti in una comune via di segnale, mediata dall’insulina. In futuro l’identificazione delle proteine espresse tramite Spettrometria di Massa, associata ad analisi tramite Immunoblotting con anticorpi specifici, potrà contribuire a chiarire il collegamento tra SSAO/VAP-1 e la via di segnale mediata dall’insulina e a dare nuove informazioni sul ruolo di questo enzima.
ARBA, MORENA. "Caratterizzazione proteomica di fluidi e tessuti in diverse condizioni fisio-patologiche." Doctoral thesis, Università degli Studi di Cagliari, 2015. http://hdl.handle.net/11584/266808.
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