Добірка наукової літератури з теми "Brin d’ADN"

Cet article décrit la réalisation et la mise en oeuvre du thermocycleur d’une puce PCR (Polymerase Chain Reaction) par des étudiants ingénieurs de niveau M1/M2 à ESIEE Paris. Les étudiants réalisent en salle blanche un prototype de puce PCR. Ils mettent en oeuvre une électronique de commande pour assurer les cycles de chauffage/refroidissement nécessaire à la duplication des brins d’ADN. Le procédé de micro-fabrication des puces inclut deux étapes de photolithographie avec un dépôt de métal et une passivation. L’électronique est constituée d’une partie détection de la température, d’une partie commande en température et d’une partie asservissement numérique. Ici, un Arduino est utilisé afin de contrôler les phases de température du thermocycleur. Les étudiants réalisent l’électronique sur plaquette d’essais. Un packaging imprimé en 3D, associé à des pointes en ressort, permet d’insérer la puce facilement sur la plaquette d’essais. Les étudiants restent très motivés durant l’ensemble de l’étude du thermocycleur. Ils conçoivent et réalisent une électronique sur un circuit qu’ils ont réalisé en salle blanche. Ils développent leur propre système embarqué. Le contexte de la COVID19 et la détection du virus sont également un très bon vecteur de motivation pour comprendre comment fonctionne une PCR.

Des tissus post mortem (du cortex cérébral, de l’hippocampe, du cervelet, des ganglions trigéminaux et des glandes salivaires), fixés dans du formaldéhyde et inclus dans de la paraffine, de 25 chiens ont été obtenus dans un laboratoire de diagnostic vétérinaire du Nigeria et soumis à des tests de recherche de l’ARN et de l’antigène du virus de la rage. L’ARN génomique et l’ARN messager (ARNm) du virus de la rage codant pour la glycoprotéine ont été détectés dans les tissus par la technique d’hybridation in situ (HIS) en utilisant des sondes d’ARN à simple brin marquées au 3H. L’antigène du virus de la rage a été mis en évidence par immuno-marquage avec de la peroxydase et le complexe avidine-biotine. L’ARNm viral a été détecté dans les tissus en utilisant des sondes d’ARN marquées à la digoxigénine. Le diagnostic histopathologique par coloration à l’hématoxyline-éosine a révélé des corps de Negri dans les tissus de 8 (32 p. 100) chiens ; 5 (20 p. 100) autres chiens ont présenté des modifications inflammatoires dues à des encéphalites virales sans corps de Negri. L’antigène a été détecté chez 11 (44 p. 100) des chiens examinés, soit dans les tissus des 8 chiens chez lesquels des corps de Negri ont été observés, de 2 des 5 chiens ayant présenté des modifications inflammatoires et d’un chien sur les 12 dont l’histopathologie était négative. L’ARN génomique et l’ARNm ont été détectés dans les tissus de tous les chiens où se trouvait l’antigène, et la distribution des signaux colorant pour les deux méthodes dans les neurones et dans les acini des glandes salivaires a été similaire. L’ARNm était plus abondant que l’ARN génomique et les signaux radioactifs étaient distribués de manière diffuse dans les périkaryons et les processus dendritiques des neurones, et dans les acini et les canaux salivaires. L’ARNm a également été trouvé en abondance dans les neurones et dans les acini avec des sondes marquées à la digoxigénine ; la méthode était plus simple. Par ordre décroissant de quantités, les marqueurs de l’antigène et de l’ARNm étaient les plus nombreux, venaient ensuite ceux de l’ARN génomique et enfin ceux des corps de Negri et d’histopathologie. La méthode de coloration par immunoperoxydase et la technique HIS utilisant des sondes marquées à la digoxigénine peuvent permettre d’effectuer des recherches sur la rage et d’en établir le diagnostic, en particulier dans les pays en développement où cette maladie continue de poser un problème de santé publique de grande importance.

RésuméCet écrit se veut une synthèse des principales trouvailles afférentes aux études de terrain conduites annuellement de 1997 à 2006 en zones intertidales du fjord du Saguenay, et de celles situées autour de sa confluence avec l’estuaire du Saint-Laurent, dans le but de mieux comprendre les stress anthropiques auxquels est soumise la mye commune (Mya arenaria), bivalve ubiquiste de ces habitats sédimentaires. À l’aide d’une batterie variée de biomarqueurs, lesquels ont fait l’objet de mesures chez l’animal entier, certains de ses tissus ou cellules, nous avons pu mettre en évidence divers effets écotoxiques qui sont vraisemblablement imputables aux sources (urbaines, industrielles, portuaires, diffuses ou atmosphériques) de contamination chimique impactant le Saguenay. Dépendant du site et de ses caractéristiques pollutionnelles, nous avons noté des dérèglements de santé chez la mye qui incluent des effets sur son système reproducteur (divers types de perturbation endocrine associés aux substances estrogéniques, aux métaux ou aux TBT), sur son système immunitaire (stimulation ou dépression d’immunocompétence jaugée par la capacité de phagocytose d’hémocytes), ainsi que des effets cumulatifs de polluants qui se traduisent par des réponses, à la hausse ou à la baisse, de biomarqueurs de défenses (e.g., métallothionéines, CYP1A1, glutathione S-transférases), de dommages (e.g., augmentation de brins d’ADN, augmentation de l’activité de cyclo-oxygénase témoignant d’inflammation, peroxydation des lipides) et morphologiques (e.g., inhibition de croissance, baisse d’indice gonado-somatique). Nous démontrons aussi une plus grande dépense en énergie au niveau mitochondrial (transport d’électrons mitochondrial dans la gonade ou glande digestive) chez les myes de zones impactées, laquelle semble pouvoir être exacerbée en conditions de stress thermiques que laissent présager les changements climatiques à venir. Au final, ce bilan d’études de biomarqueurs confirme l’utilité du modèle bivalveMya arenariacomme bio-indicateur de la qualité hydrique du Saguenay et il renseigne sur les divers affronts que subissent ces invertébrés dans ce milieu toujours aux prises avec des sources de contamination variées. D’autres études envisagées affineront nos connaissances au sujet des risques cumulatifs liés à la contamination chimique du fjord.

Malgré l’impact des répétitions sur la plasticité et l’évolution des génomes eucaryotes, leurs mécanismes de formation sont encore très spéculatifs. L’insertion continue de nouvelles copies devrait conduire à une augmentation constante de la taille des génomes. Or, ce n’est pas le cas. Afin d’étudier la dynamique des répétitions, j’ai développé un ensemble de programmes informatiques pour la détection des duplications segmentaires et des répétitions en tandem. J’ai ensuite proposé un modèle de formation des duplications segmentaires chez Drosophila melanogaster, basé sur un modèle de recombinaison homologue non-allélique et montré l’implication des éléments transposables dans ce processus. Afin de caractériser la relation existante entre les répétitions et la structure de la chromatine, j’ai ensuite réalisé une analyse comparative de la dynamique des répétitions euchromatiques et hétérochromatiques chez Arabidopsis thaliana. Nos résultats suggèrent un turnover aussi rapide dans l’euchromatine que dans l’hétérochromatine avec des forces d’élimination prédominantes différentes dans chacun des domaines chromatiniens.

Les génomes de bactériophages ont une capacité remarquable d'évolution. L'objectif de ma thèse a été d'étudier le rôle des recombinases de bactériophages dans cette évolution. Notre hypothèse était que les recombinases phagiques diffèrent de la recombinase bactérienne RecA par une fidélité relâchée lors de la réaction de recherche d'homologie, qui pourrait expliquer en partie la très grande plasticité des génomes de bactériophages. Nous avons tout d'abord utilisé une approche bioinformatique basée sur la recherche d'homologies lointaines pour prédire un maximum de gènes de recombinases dans les génomes entièrement séquencés, puis nous avons confirmé l'activité de recombinaison de certaines d'entre elles, par un test d'appariement d'ADN simple brin entre séquences identiques in vivo. Ceci nous a permis de conclure qu'il existait trois superfamilles de recombinases chez les bactériophages, de type Rad52, Rad51/RecA et Gp2.5, présentes dans 42% des 465 génomes analysés. Dans un deuxième temps, nous avons comparé six de ces recombinases à RecA et avons montré que toutes étaient capables de faire de l'appariement simple brin in vivo, contrairement à RecA. Pour deux d'entre elles, Redβ de Lambda (type Rad52) et Sak4 de HK620 (type Rad51/RecA), nous avons observé que l'appariement simple brin continuait à se produire, avec une efficacité diminuée, jusqu'à 13% de divergence entre les séquences. L'appariement d'ADN simple brin est donc une propriété commune aux recombinases de bactériophages qui les distingue de RecA, et semble pouvoir se maintenir pour un niveau élevé de divergence, ce qui soutient l'hypothèse d'une recombinaison homologue différente et plus relâchée dans sa fidélité chez les bactériophages.

Les biocapteurs sont des systèmes de détection en temps réel d’espèces biologiques largement utilisés dans le diagnostic. La Spectroscopie Raman Exaltée par effet de Surface (SERS) grâce à sa capacité d’identification spécifique et sensible est un bon moyen de détecter des biomolécules (aptamère, peptide, …) à l’aide de surfaces adaptées (telles que nanostructures métalliques, nanoparticules, ...). Dans l’optique de développer un biocapteur SERS, une plateforme de détection à base de monocouche auto-assemblées (SAMs) fonctionnalisée avec des nanoparticules d’or sphériques ou cylindriques a été élaborée. Les travaux de thèse ont consisté à réaliser des SAMs à base d’organosilane porteur d’une fonction terminale azide ou amine. Les SAMs ont été modifiées ensuite par réaction avec des linkers soit par couplage peptidique soit par chimie click afin d’avoir des fonctions terminales thiols ou cyclooctynes. Ces modifications sont caractérisées par diverses techniques comme le PM-IRRAS, l’AFM, l’XPS ou le ToF-SIMS. Les nanoparticules d’or ont été immobilisées avec succès par deux voies différentes : sur des SAMs à terminaison azoture par chimie click et sur des SAMs à terminaison thiol par échange de ligand. Des premiers résultats prometteurs ont été obtenus démontrant la détection SERS du biorécepteur immobilisé sur les nanoparticules
Biosensors are real-time detection systems for biological species widely used in diagnostics. Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS), with its specific and sensitive identification capability, is a good way of detecting biomolecules (aptamers, peptides, etc.) using suitable surfaces (such as metal nanostructures, nanoparticles, etc.). With a view to developing a SERS biosensor, a detection platform based on self-assembled monolayers (SAMs) functionalized with spherical or cylindrical gold nanoparticles was designed. The thesis work consisted in producing SAMs based on organosilane bearing an azide or amine terminal function. The SAMs were then modified by reaction with linkers, either by peptide coupling or click chemistry, to provide thiol or cyclooctyne end functions. These modifications are characterized by various techniques such as PM-IRRAS, AFM, XPS or ToF-SIMS. Gold nanoparticles have been successfully immobilized by two different routes: on azide-terminated SAMs by click chemistry and on thiol-terminated SAMs by ligand exchange. Promising initial results have been obtained demonstrating SERS detection of the bioreceptor immobilized on the nanoparticles

Abstract : 5-Methylcytosine is an epigenetic mark, which can be oxidized to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in DNA by ten-eleven translocation (TET) oxygenases. It is an initial step in the demethylation of 5mC. Levels of 5hmC is relatively high in the brain compared to other organs, but these levels are known to be significantly reduced during the development of a brain tumor, especially in glioblastoma multiforme (GBM). However, no known mechanisms may fully explain this abnormality. The objectives of my project were to (1) understand the implications of the demethylation pathway mediated by TET, and (2) gain a deeper insight in the epigenetic make-up of brain tumors. (1) U87 cells were incubated with 5mC, 5hmC, 5-formylcytosine (5fC) or co-incubated of 5hmC with 3,4,5,6-tetrahydro-2’-deoxyuridine (dTHU) over a timeline of 0, 24, 48 and 96 hours. (2) 130 brain tumors (GBM= 79; grade II/III= 51) were obtained directly from surgery and immediately suspended in DNA extraction buffer. Both cell samples and tumor tissues underwent DNA extraction and DNA digestion protocols. The percent per cytosine (%/C) was obtained by quantification of 5mC, 5hmC, 5fC, 5-hydroxymethyluracil (5hmU) and 5formyluracil (5fU) using LC-MS/MS. (1) Cellular incubations showed that it is possible to increase levels of 5hmC in DNA, but also a slight increase in 5mC levels throughout the experiment. 5HmC levels dramatically increased by 1.9-fold after 96h. On the other hand, no increase was observed in 5fC levels. Both 5hmC and 5fC incubations were accompanied by high increases in 5hmU and 5fU levels respectively. The addition of dTHU to the 5hmC incubation decreased 5hmU incorporation by 65%. (2) The average levels of 5mC, 5hmC and 5fC, in brain tumors, were 4.0, 0.15 and 0.021 %/C respectively. 5HmU and 5fU levels were present at comparable levels of 5hmC and 5fC. Levels of 5hmC, 5hmU and 5fU were significantly lower in the DNA of GBM specimens. There was a strong correlation between 5mC with 5hmC and 5fC in GBM, but this was absent in low grade tumors. The presence of 5hmU and 5fU in brain tumor and the increase in their levels during cell incubations indicate a deamination activity in these cancerous cells, which may impinge on the cellular levels of 5hmC, in particular. Furthermore, upon the incubations with 5hmC, downstream levels of 5fC did not increase suggesting a TET malfunction. TET activity is maintained in GBMs, but impaired in low grade tumors due to isocitrate dehydrogenase-1 (IDH1) mutations. Therefore, in brain tumors, a strong deamination activity and TET impairment may lead to epigenetic reduction of 5hmC.
Résumé : 5Mtéthylcytosine (5mC) est une marque épigénétique qui peut être oxydée en 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) par ten-eleven translocation (TET) oxygénases. Ceci amène à l’étape initiale de la déméthylation de 5mC. Le niveau de 5hmC est plus élevé dans le cerveau par rapport aux autres organes. Par contre, ce niveau a une réduction marquante au cours du développement d’une tumeur cérébrale, notamment le glioblastome multiforme (GBM). Toutefois, il n’y a aucun mécanisme connu pour expliquer cette anomalie. Les objectifs de ce projet étaient de (1) discerner l’implication de la voie de déméthylation obtenu par médiation de TET et (2) d’avoir une compréhension plus profonde de la constitution épigénétique des tumeurs cérébraux. (1) Des cellules U87 ont été incubées avec 5mC, 5hmC, 5-fomylcytosine (5fC) et une co-incubation de 5hmC avec 3,4,5,6-tétrahydro-2’-déoxyuridine (dTHU). Les échantillons ont été récoltés à 0, 24, 48, 96 heures. (2) 130 tumeurs cérébraux (GBM = 79; grade II/III = 51) étaient obtenus directement de chirurgie et mise en suspension dans un tampon d’extraction d’ADN le jour même. Les échantillons d’U87 et de tissu tumoral ont subi les protocoles d’extraction et de digestion d’ADN. Le pourcentage par cytosine (%/C) était calculé par la quantification de 5mC, 5hmC, 5fC, 5-hydroxyméthyluracile (5hmU) et 5-formyluracile (5fU) en utilisant LC-MS/MS. (1) Les incubations d’U87 ont démontrées la possibilité augmenter les niveaux génomique de 5hmC, mais aussi une légère augmentation des niveaux de 5mC. Les niveaux de 5hmC ont accru de 1.9 fois après 96hrs. Par contre, aucune variation n’a été observée dans les niveaux de 5fC. Les incubations de 5hmC et 5fC ont été accompagnées par une élévation des niveaux de 5hmU et 5fU respectivement. L’addition de dTHU avec 5hmC avait diminué l’incorporation de 5hmU par 65%. (2) Dans les tumeurs cérébraux, les niveaux moyens de 5mC, 5hmC et 5fC étaient de 4.0, 0.15 et 0.021%/C respectivement. Les quantités de 5hmU et 5fU étaient grandement plus faible dans le GBMs que dans les tumeurs de bas grades. La présence de 5hmU et 5fU dans les tumeurs et leur augmentation durant l’incubation des U87 indiquent une activité de désamination, qui peut, en particulier, entraver les niveaux de 5hmC. En outre, malgré l’incubation avec 5mC, les niveaux de 5hmC et 5fC n’ont pas augmentés suggérant un dysfonctionnement de TET. L’activité de TET est maintenue dans GBM, mais altérée dans les tumeurs de bas grades à cause de mutation isocitrate dehydrogenase-1 (IDH1). Par conséquent, la forte activité de désamination et la déficience en TET peuvent conduire à une réduction épigénétique.

La déubiquitinase BAP1 (« BRCA1-Associated Protein1 ») a initialement été isolée pour sa capacité de promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 est muté de manière homozygote dans plusieurs cancers (tel que le cancer du rein, de la peau, de l’oeil et du sein) suggérant fortement que cette déubiquitinase est un suppresseur de tumeurs. Effectivement, la surexpression de BAP1 réduit la prolifération cellulaire et la croissance tumorale dans des modèles de xénogreffe de souris. Toutefois, la fonction biologique et le mécanisme d’action de cette déubiquitinase restent encore marginalement connus. Ainsi, les objectifs de cette thèse sont de caractériser la fonction biologique de BAP1 et de révéler les bases moléculaires de sa fonction suppressive de tumeurs. Pour déterminer la fonction biologique de BAP1, nous avons immuno-purifié et identifié les protéines associées à BAP1, qui s’avèrent être principalement des facteurs et co-facteurs de transcription. Ensuite, nous avons démontré que BAP1 est un régulateur de la transcription. Parallèlement, un autre groupe a montré que BAP1 chez la drosophile, Calypso, régule l’ubiquitination de H2A et la transcription génique. D’autre part, nos résultats d’analyse d’expression génique globale suggèrent que BAP1 jouerait un rôle important dans la réponse aux dommages à l’ADN. Effectivement, des expériences de gain et de perte de fonction (méthode de l’ARNi, modèle de cellules KO en BAP1 et de cellules déficientes en BAP1 re-exprimant BAP1) ont révélé que cette déubiquitinase régule la réponse aux bris double brin d’ADN par la recombinaison homologue. Nos résultats suggèrent que BAP1 exerce sa fonction suppressive de tumeurs en contrôlant la réparation sans erreur de l’ADN via la recombinaison homologue. En cas d’inactivation de BAP1, les cellules deviendront plus dépendantes du mécanisme de réparation par jonction d'extrémités non-homologues, qui est potentiellement mutagénique causant ainsi l’instabilité génomique. D’autres études seront nécessaires afin de déterminer le rôle exact de BAP1 dans la transcription et de comprendre comment la dérégulation de l’ubiquitination de H2A contribue au développement du cancer. Définir les mécanismes de suppression tumorale est de grand intérêt, non seulement pour comprendre la carcinogénèse mais également pour le développement de nouvelles thérapies contre cette maladie.
The deubiquitinase BAP1 (BRCA1-Associated Protein1) is a nuclear member of the ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH) family, previously isolated for promoting the function of the tumor suppressor BRCA1. Importantly, homozygous inactivating mutations of BAP1 have been found in mesothelioma, renal, melanoma and breast cancers strongly suggesting that this deubiquitinase is a tumor suppressor. Indeed BAP1 overexpression reduces cell proliferation and tumor growth in xenograft models. Nonetheless, the biological function and the mechanism of action of this deubiquitinase remain poorly defined. The goals of this thesis are to characterize the biological function of BAP1 and to reveal the molecular basis of its tumor suppressive function. To provide insights into BAP1 biological function, we conducted a tandem affinity immunopurification of BAP1-associated proteins and found that most interacting partners are transcription factors and cofactors. Next, we demonstrated that BAP1 is indeed a transcription regulator. Concomitantly, another group showed that the drosophila BAP1, Calypso, is a Polycomb Group protein that regulates the ubiquitination levels of H2A and gene expression. Indeed, our global gene expression analysis suggests that BAP1 plays important role in DNA damage response. Consistently, loss- and gain- of function experiments (RNAi approach, DT40 chicken B cells KO model and re-introduction of BAP1 in BAP1 null-cells) revealed that BAP1 promotes homologous recombination-mediated DNA double strand break repair. Our data suggest that BAP1 exerts its tumor suppressor function by controlling error-free DNA repair by homologous recombination. Thus, in a situation of BAP1 inactivation, cells might become more reliant on non-homologous end joining, an error-prone DNA repair mechanism, which would result in the accumulation of mutations and chromosomal aberrations, causing genomic instability. Further studies are required to delineate the exact role of BAP1 in transcription and to define how deregulation of H2A ubiquitination pathway contributes to cancer. Defining the mechanisms of tumor suppression is of great interest, not only for understanding cancer development, but also for designing rational cancer therapies.

Les protéines du groupe Polycomb (PcG) sont des protéines essentielles et conservées, qui forment deux complexes principaux, PRC1 et PRC2, qui sont recrutés au niveau de la chromatine et qui répriment stablement l’expression génique. Chez Drosophila melanogaster, les complexes Polycomb sont recrutés à des éléments d’ADN appelés éléments de réponse Polycomb (PREs) pour réprimer la transcription. PREs sont des éléments mémoires permutables qui peuvent maintenir la répression ou l’expression génique. Malgré des dizaines d’années d’étude, des questions fondamentales sur le fonctionnement du système PcG subsistent. 1) Comment les protéines PcG sont recrutées aux PREs uniquement lors du contexte développemental approprié, et comment les PREs peuvent conduire à la fois à l’activation et à la répression stable. 2) Comment les complexes PcG répriment la transcription, et si cela implique de nouvelles activités biochimiques et interactions. 3) Comment la répression dépendante des PcG peut-elle être propagé à travers le cycle cellulaire. La recherche de nouvelles activités biochimiques pour les complexes PcG pouvant répondre à ces questions fait l’objet de cette thèse. Les PREs sont transcrits en ARN qui pourraient donner la spécificité de contexte pour recruter les protéines PcG. Nous avons supposé que des R-loops puissent se former aux PREs, et être reconnues par les complexes Polycomb, ce que vous avons testé dans le chapitre 2. Nous avons identifié les séquences formant des R-loops dans des embryons et une lignée cellulaire de Drosophila melanogaster, et nous avons trouvé que ~30% des PREs forment des R-loops. Nous avons découvert que les PREs ayant formé des R-loops ont une plus forte probabilité d’être liés par les protéines PcG in vivo et in vitro. PRC2 lie des milliers d’ARN in vivo, mais aucune fonction claire n’y a été associée. En utilisant des expériences in vitro, nous avons identifié une activité d’invasion de brins pour PRC2 qui induit la formation d’hybride ARN-ADN, la partie principale d’une R-loop. Dans ce chapitre, nous avons trouvé que les PREs forment des R-loops, et sont impliquées dans le recrutement des protéines PcG qui induisent la répression génique stable. Nous avons découvert une activité d’invasion de brins pour PRC2 qui pourrait impliquer ce complexe Polycomb dans la formation de R-loops in vivo. Dans le chapitre 3, nous avons identifié une activité similaire à celle de la topoisomérase I associée avec PRC1 et la région C-terminale de sa sous-unité PSC (PSC-CTR). PRC1 et PSC-CTR peuvent relaxer un plasmide surenroulé négativement et ajouter des supertours négatifs à un plasmide relaxé en absence de topoisomérase. Cette activité suggère que la régulation de la topologie de l’ADN puisse être un nouveau mécanisme utilisé par les complexes PcG. PRC1 peut résoudre les R-loops formées sur un ADN négativement surenroulé in vitro. Une fonction possible pour cette activité de topoisomérase peut être la régulation des R-loops, dont la stabilité dépend à la fois de la séquence d’ADN et de la topologie de l’ADN environnant, in vivo. Dans cette thèse, nous avons identifié de nouvelles activités chez les complexes PcG : une activité d’invasion de brins pour PRC2 et une activité similaire à celle des topoisomérases pour PRC1. Ces deux activités impliquent les complexes PcG dans la formation et la résolution de R-loops. De plus, ces deux complexes peuvent reconnaitre les R-loops et sont recrutés aux PREs ayant formé ces structures. En conclusion, nous avons identifié de nouvelles activités pour les complexes Polycomb PRC1 et PRC2 qui les lient à la formation, la reconnaissance et la résolution de R-loops.
Polycomb group (PcG) proteins are conserved, essential proteins, which assemble in two main complexes, PRC1 and PRC2, which are targeted to chromatin and stably repress gene expression. In Drosophila melanogaster, Polycomb complexes are targeted to DNA elements called Polycomb response elements (PREs) to repress transcription. PREs are switchable memory elements that can maintain either gene repression or gene activation. Despite decades of study, fundamental questions about how the PcG system functions remain. These include: 1) how PcG proteins are targeted to PREs only in the appropriate developmental context, and how PREs can mediate both stable activation and repression; 2) how PcG complexes repress transcription, and whether it involves novel biochemical mechanisms and interactions; 3) how PcG repression can be propagated through cell cycles. The search for new biochemical activities for PcG complexes that may answer these questions is the topic of this thesis. PREs are transcribed into RNAs which may give the context specificity to recruit PcG proteins. We hypothesized that R-loops may form at PREs, and be recognized by PcG complexes, which we tested in Chapter 2. We identified R-loop forming sequences in Drosophila melanogaster embryos and tissue culture cells, and found that ~30% of the PREs form R-loops. We found that PREs which have formed R-loops are more likely to be bound by PcG proteins both in vivo and in vitro. PRC2 binds to thousand RNA in vivo but no clear activity has been associated with it. Using in vitro assays, we identified a strand exchange activity for PRC2 which induces the formation of RNA-DNA hybrid, the main part of an R-loop. In this chapter, we have found that PREs form R-loops and are involved in the targeting of PcG proteins which induce stable gene repression. We have discovered an RNA strand exchange activity for PRC2 which may involve this Polycomb complex in the formation of R-loops in vivo. In Chapter 3, we identified a type I topoisomerase-like activity associated with PRC1 and the C-terminal region of its subunit PSC (PSC-CTR). PRC1 and PSC-CTR can relax a negatively supercoiled plasmid and add negative coils to a relaxed plasmid in absence of topoisomerase. This activity suggests regulation of DNA topology may be a novel mechanism used by PcG complexes. PRC1 can resolve R-loops formed on negatively supercoiled DNA in vitro. One role for the topoisomerase-like activity may be to regulate R-loops, whose stability of depends on both the DNA sequence and the topology of the surrounding DNA, in vivo. In this thesis, we identified new activities for Polycomb group complexes: an RNA strand exchange activity for PRC2 and a topoisomerase-like activity for PRC1. Both activities link PcG complexes to the formation and resolution of R-loops. In addition, both complexes can recognize R-loops and are recruited to PREs which have formed these structures. In conclusion, we have identified new nucleic acid-based activities for the Polycomb complexes PRC1 and PRC2, which link them to the formation, recognition and resolution of R-loops.

Les virus à ARN à brin négatif constituent un groupe important et diversifié. Par définition, leurs génomes d’ARN doivent être transcrits en ARNm pour que l’expression des protéines virales puisse avoir lieu. L’étude de ces virus a connu deux avancées majeures au cours des dernières années.