Дисертації з теми "Biophysique membranaires"

Les phosphates de polyprényle ont été postulés comme étant des constituants "primitifs" membranaires et les polyprénols pourraient être leurs renforçateurs membranaires. Afin de vérifier si les polyprénols renforçent les membranes de phosphates de polyprényle, nous avons synthétisé différents phosphates de polyprényle avec des longueurs de chaîne comprises entre 15 et 45 atomes de carbones ainsi que des polyprénols, acycliques et cycliques. La synthèse des polyprénols cycliques a nécessité le développement d’une nouvelle voie de synthèse basée sur une cyclisation biomimétique d’allylsilanes au milieu d’une chaîne terpénique. Cette méthode nous a donné accès à la famille des bicyclopolyprénols. Ensuite, en utilisant la technique de microscopie par fluorescence, nous avons étudié l’impact de plusieurs paramètres (tels que la longueur de la chaîne isoprénique, le nombre de doubles liaisons, la présence ou l’absence d’un cycle et le pH), qui pourraient influencer la formation de vésicules dans l’eau des phosphates de polyprényle avec ou sans polyprénols. Nous avons trouvé que les phosphates de polyprényle ayant 15 ou 30 atomes de carbone forment des vésicules géantes dans une large gamme de pH. L’effet renforçateur des polyprénols sur les membranes de phosphates de polyprényle a été prouvé par la mesure de la cinétique de perméabilité à l’eau par diffusion de la lumière par flux à écoulement bloqué. Cette étude a également révélé que certains polyprénols réduisent plus efficacement la perméabilité à l’eau des membranes de phosphates de polyprényle que le cholestérol, le renforçateur membranaire des eucaryotes. Ces résultats appuient notre hypothèse que les polyprénols peuvent être les renforçateurs membranaires "primitifs" des phosphates de polyprényle
We have postulated that polyprenyl phosphates could be “primitive” membrane constituents and that polyprenyl alcohols might play the role of their membrane reinforcers. In order to check whether polyprenols reinforce membrane made of polyprenyl phosphates, we have synthesized polyprenyl phosphates bearing different isopentenyl units (between C15 and C45) and polyprenols with acyclic or cyclic chains. About the synthesis of cyclic polyprenols, we have developed a new method based on biomimetic cyclization of allylsilane in the middle of a terpenic chain. This method gave us an easy access of bicyclopolyprenols. Using fluorescence microscopy, we have studied different parameters (such as chain length, degree of unsaturation, acyclic or cyclic chain and pH), which might affect the formation of vesicles from the system: polyprenyl phosphate/H2O with or without polyprenyl alcohol. We have found that polyprenyl phosphates containing 15 to 30 C-atoms form giant vesicles in a wide pH range. Stopped-flow/light-scattering experiments, which evaluate the water permeability through the membrane of unilamellar vesicles prepared from polyprenyl phosphate/polyprenyl alcohol/H2O, revealed that some polyprenyl alcohols do reduce the water permeability even more efficiently than cholesterol, the ubiquitous reinforcer of eukaryotic membranes. These results give a favourable argument for the hypothesis that polyprenyl alcohols might have been reinforcers of “primitive” membranes made of polyprenyl phosphates

La mycosubtiline est un lipopeptide antimicrobien, produit par différentes souches de Bacillus subtilis et doté de propriétés hémolytiques et antifongiques. Ses activités biologiques sont dues à des interactions avec les membranes plasmiques des cellules cibles. Cependant, les mécanismes moléculaires exacts de ces interactions doivent être approfondis. Le but de ce travail est de déterminer les éléments structuraux importants qui sont impliqués dans l'activité biologique de la mycosubtiline. A cet effet, nous avons utilisé les systèmes biomimétiques membranaires, comme les monocouches de Langmuir ou les multicouches, et nous avons analysé les interactions de la mycosubtiline avec ceux-ci grâce à des outils biophysiques adaptés (tensiométrie de surface, PM-IRRAS, BAM, SHG, FT-IR, RMN). Nous avons démontré qu'il existe une interaction privilégiée du lipopeptide avec les membranes biomimétiques contenant du stérol. Ainsi le résidu tyrosyle de la mycosubtiline et la fonction alcool secondaire des stérols sont impliqués lors de ces interactions. Des modifications importantes de la morphologie de membranes biomimétiques induites par le lipopeptide ont été mises en évidence ; celles-ci sont plus marquées lorsque le système est ternaire, c'est-à dire quand il contient un glycérophospholipide, un stérol et de la sphingomyéline
Mycosubtilin is an antimicrobial lipopeptide, produced by different strains of Bacillus subtilis and possessing hemolytic and antifungal properties. Its biological activities are due to its interactions with the plasma membranes of the target cells. However, the precise molecular mechanisms of these interactions need to be further elucidated. The aim of this work is to determine the structure elements involved in the biological activities of mycosubtilin. For that purpose, we used membrane biomimetic systems, such as Langmuir monolayers or multilayers, and we analyzed the interactions of mycosubtilin with them by applying specific biophysical tools (surface tensiometry, PM-IRRAS, BAM, SHG, FT-IR and RMN). We determined that there is a preferential interaction of the lipopeptide with biomimetic membranes containing sterols. Thus the tyrosyle residue of mycosubtilin and the secondary alcohol group of the sterol are involved in these interactions. Significant changes in the morphology of the biomimetic membranes induced by the lipopeptide were highlighted; these modifications are more pronounced when the system is ternary, i.e. when it contains a glycerophospholipid, a sterol and sphingomyelin

Au cours de cette thèse, nous avons étudié la possibilité d’utiliser des cibles membranaires pour le développement de nouveaux médicaments antipaludiques. Nous avons également proposé un protocole original pour l’étude du mécanisme d’action de certaines molécules à activité antipaludique. Nos travaux reposent sur la caractérisation à l’échelle moléculaire et nanométrique des interactions entre les molécules antipaludiques et des modèles membranaires mimant les membranes parasitaires. En utilisant diverses techniques biophysiques, nous avons montré que la sphingomyéline des membranes du Plasmodium pourrait être une cible intéressante pour les molécules potentiellement antipaludiques comme la Cyclosporine A. De plus, nous avons mis en évidence l’importance des membranes lipidiques dans le mécanisme de détoxification de l’hématine que le parasite met en œuvre en incorporant ces molécules dans un cristal inerte : l’hémozoïne. Ainsi, les observations AFM ont permis de visualiser pour la première fois et en temps réel la formation de ce cristal dans une bicouche lipidique. Enfin, nous avons montré que l’association des molécules antipaludiques avec l’hématine pourrait inhiber la formation de l’hémozoïne en empêchant l’insertion de l’hématine dans les membranes (cas de la chloroquine) ou en augmentant le pouvoir membranotrope de cette molécule (cas des dérivés pipéraziniques de l’acide ursolique)
In this thesis, we have studied the possibility to use membrane targets for the development of new antimalarial drugs. Furthermore, we have proposed an original protocol to study the mechanism of action of certain antimalarial drugs. Our work is based on the characterization at the molecular and nanoscale levels of the interactions between antimalarial drugs and membrane models mimicking parasite membrane. Indeed, using various biophysical techniques, we have shown that sphingomyelin membranes of Plasmodium could be an attractive target for many potential antimalarial compounds such as Cyclosporin A. In addition, we have demonstrated the importance of lipid membranes in the hematin detoxification that is implementing carried out by the parasite by incorporating these molecules in an inert crystal inert called hemozoin. Thus, the AFM observations have allowed us to visualize for the first time and in real time the formation of this crystal in a lipid bilayer. Finally, we have showed that the combination of antimalarial drugs with hematin could inhibit the formation of hemozoin by inhibiting of the insertion of hematin in the membranes (e. G. As in chloroquine) or by the increasing of the membranotrope effect of hematin (for e. G. Derivatives of piperazine ursolic acid derivatives)

La protéine humaine hERG (human ether-à-go-go related gene) s’associe en homo-tétramère pour former le canal potassique voltage-dépendant Kv11.1. C’est un acteur majeur de la repolarisation du potentiel d’action cardiaque par sa capacité à externaliser le potassium du cardiomyocyte. L’altération de sa fonction induit le syndrome du QT long à l’origine d’arythmies cardiaques et pouvant conduire à un arrêt du cœur. Ce syndrome parfois génétique provient le plus souvent d’une inhibition pharmacologique. De nombreux médicaments ont montré leur capacité à inhiber hERG en se fixant dans la lumière du canal. L’étude des interactions moléculaires entre hERG et médicaments intéresse les scientifiques depuis de nombreuses années. Très récemment, la première structure atomique de hERG à l’état ouvert par cryo-microscopie électronique a permis une avancée majeure dans la compréhension de l’agencement du pore du canal. De nombreuses questions restent malgré tout non résolues concernant les mécanismes de liaison des ligands. Plus encore, le développement d’approches biophysiques à partir de canal purifié permettraient de caractériser et d’anticiper des interactions avec les médicaments. Dans cette perspective, nous avons testé plusieurs stratégies pour obtenir le canal hERG purifié dans une forme stable, homogène et fonctionnelle. Notre étude est basée sur une construction simplifiée et chimérique du canal hERG, la version hERG(S1-coil). Chaque étape permettant la production et la purification d’une protéine membranaire a été optimisée en testant différentes techniques proposées par la littérature. Nous avons comparé les rendements d’expression du canal dans différents systèmes recombinants procaryotes ou eucaryotes. La quantité de protéine totale et le pourcentage de protéine fonctionnelle dans les membranes ont été étudiés. Dans un deuxième temps, le canal a été solubilisé puis purifié. Nous avons comparé les rendements de solubilisation et la stabilité protéique en fonction du type de détergent. En parallèle, nous avons mis au point des moyens techniques pour évaluer la fonction du canal au fur et à mesure du processus de production et purification. Le canal hERG(S1-coil) tétramérique et fonctionnel a finalement été identifié dans la fraction purifiée. Cependant, des optimisations sont encore à apporter pour conserver l’agencement tétramérique et empêcher l’agrégation au cours du temps avant de pouvoir envisager des études biophysiques et structurales. A terme, ces travaux pourraient profiter à la production et à la purification d’autres protéines membranaires oligomériques
The human protein hERG (human ether-à-go-go related gene) assembles as homo-tetramer to form the voltage-gated potassium channel Kv11.1. This channel is involved in repolarization of the cardiac action potential by regulating the potassium release from cardiomyocytes. hERG malfunction was found to cause long QT syndrome, a disorder that predisposes affected patients to arrhythmias and sudden death. This can be due to congenital mutation in the hERG gene and, most frequently, it is caused by pharmacological agents. Several drugs are known to block the channel ion pathway, resulting in off-target inhibition of hERG. Consequently, understanding the molecular basis of drug binding to hERG has become a high priority. The recent determination of a near-atomic resolution structure of the opened channel, using cryo-electron microscopy, provides insights into how this channel work. But several questions are still unanswered to understand the mechanisms of hERG function and drug binding. Moreover, new biophysical protocols with the purified hERG channel would help scientists and industries to anticipate drug side effects. In this context, we investigated strategies to purify a stable, homogenous and functional hERG channel. Our study was based on a shorter and chimeric hERG channel, the hERG(S1-coil) version. We optimized each step from production to purification of membrane proteins by testing experimental protocols found in the literature. In this thesis project, we first compared production rates of the channel in several prokaryote and eukaryotes recombinant systems. Total protein produced and the percent of functional channel were investigated in membranes from each recombinant system. Then, the channel was extracted from membranes before purification. Solubilizing rates and channel stability were compared depending on detergents. In another hand, we also developed protocols to investigate the channel stability and function along production and purification. A tetrameric and functional channel was finally purified and identified by this strategy. More work however is still needed to improve channel homogeneity and stability before to be suitable for biophysical and structural studies. In the future, this work could also help investigations in production and purification of other oligomeric membrane proteins

Les rhamnolipides produits par Pseudomonas aeruginosa sont des glycolipides ayant des propriétés élicitrices des réactions de défense de la vigne et d'Arabidopsis thaliana dont le mode de perception est inconnu. En tant que composés amphiphiles, uneinteraction avec la membrane plasmique a été proposée. Au niveau fondamental, il est démontré ici par une approche de biophysique utilisant la RMN du solide et des simulations de dynamique moléculaire in silico, que le caractère amphiphile des RLs favorise leur insertion au sein de modèles lipidiques de membranes de plantes, qui ne sont pas déstabilisés par leur présence. De plus il a été observé, par la réalisation de puces à ADN sur A. thaliana, que la perception de ces composés induisait une reprogrammation transcriptionnelle précoce de grande ampleur. En vue de démontrer l'intérêt agronomique des RLs pour la protection d'une plante de grande culture, leur activité sur le colza (Brassica napus) a également été étudiée. Des marqueurs caractéristiques de la mise en place des réponses de défense ont été observés, ainsi qu'un effet de protection detissus foliaires contre le pathogène B. cinerea, ce qui renforce le potentiel des RLs comme agents de biocontrôle pour la protection des Brassicacées
Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids are glycolipids known to trigger defense responses in grapevine and Arabidopsis thaliana but their mode of perception by plants is still unknown. As amphiphilic compounds, rhamnolipids have been proposed to interactdirectly with plasma membrane lipids. Here we show, by a biophysical approach involving solid state NMR and in silico molecular dynamic simulations, that the insertion of rhamnolipids does not disturb the dynamic of plant plasma membrane models. Inorder to characterize early gene expression modifications triggered by rhamnolipids a micro-array study on A. thaliana was realized, revealing a large transcriptional change. The potential of rhamnolipids to protect the agronomical plant Brassica napus was also investigated. Rhamnolipid triggering of chemical and physical defenses associated with efficient protection against the opportunistic pathogenic fungus Botrytis cinerea, used as a model, was shown. Those results highlight a real potential of RLs as biocontrol agents for Brassicaceae protection

Le cancer colorectal pourrait représenter 3,1 millions de nouveaux cas et environ 1,6 million de décès d'ici 2040. Les traitements actuels incluent entre autres des protocoles de chimiothérapie faisant appel à des molécules comme le 5-fluorouracil (5-FU), responsable d’effets secondaires toxiques. De plus, au stade métastatique, environ 90 % des tumeurs deviennent résistantes à la chimiothérapie en raison de la mise en place de mécanismes favorisant l’efflux des molécules, ou encore la survie cellulaire. De tels phénomènes nécessitent la mise en place de nouvelles molécules ou d’alternatives thérapeutiques afin d’augmenter l’efficacité des traitements. Les propriétés biophysiques des membranes sont fortement influencées par leur composition, où le cholestérol joue un rôle important dans la fluidité. Des altérations lipidiques et biophysiques peuvent modifier la progression tumorale en affectant la signalisation cellulaire, la migration, l'invasion des cellules cancéreuses et leur réponse aux traitements. Depuis les années 1990 et la découverte du French Paradox, les polyphénols, tels que le resvératrol (RSV) et le xanthohumol (XN), ont montré des propriétés anticancéreuses in vitro et in vivo, avec un effet sensibilisant aux traitements, bien que les mécanismes précis soient mal connus. Dans ce projet, nous avons souhaité analyser l’impact de l’interaction du RSV et du XN, molécules à fort potentiel d’interaction avec les membranes, sur la biophysique cellulaire et les propriétés mécaniques, impliquées dans la carcinogenèse. Nous avons étudié l'effet de l'exposition au RSV et au XN sur trois lignées cellulaires d'adénocarcinome colorectal à des stades d’avancement différents (SW480, HT29, SW620) et une lignée contrôle non tumorale (CRL1831). Les mesures morphologiques et mécaniques réalisées par microscopie à force atomique (AFM) montrent sur cellules isolées qu’après 24 h d’exposition au RSV et XN, les lignées colorectales cancéreuses voient leur volume cellulaire diminuer ainsi que leur élasticité cellulaire augmenter, ce qui n’est pas observé pour la lignée non cancéreuse CRL1831. Ces paramètres sont associés à des remodelages du cytosquelette cortical ainsi qu’à des phénomènes d’initiation de l’apoptose, corroborés par l’augmentation de l’activité de la caspase-3. L'effet des molécules sur la fluidité membranaire a été évalué avec la sonde fluorescente Laurdan par microscopie confocale. Après exposition de 24 h au RSV ou XN, la fluidité de la membrane plasmique des cellules cancéreuses augmente spécifiquement avec l’agressivité de la lignée. Ces modifications ne sont pas retrouvées chez la lignée non tumorale CRL1831. Nous avons ensuite analysé l’impact du 5-FU en combinaison avec un pré-traitement de 24 h au RSV et XN sur la survie et la mécanique cellulaire, qui montrent que la préexposition des lignées cancéreuses au 5-FU augmente l’efficacité de celui-ci. Nous avons dans un second temps exploré l'impact du RSV et du XN sur la biophysique membranaire, par l’intermédiaire de modèles membranaires simples. L'objectif de ces travaux était d'analyser l'impact de la concentration en cholestérol sur la structure et la dynamique membranaire de même que la réponse à l'interaction par AFM ainsi que par modélisation moléculaire. Les résultats obtenus montrent que le RSV tend à induire une augmentation de l’élasticité membranaire, quelle que soit la teneur en cholestérol. Globalement, nos résultats démontrent l'importance des techniques biophysiques telles que l’AFM pour étudier les altérations des propriétés biophysiques des membranes induites par le RSV et XN. Ces altérations pourraient moduler la réponse aux traitements anticancéreux et influencer la progression de la maladie, ce qui souligne la nécessité d'une approche multidisciplinaire intégrant des méthodes d'analyse biologiques et biophysiques pour évaluer leur potentiel thérapeutique dans le cadre du cancer colorectal
Colorectal cancer is projected to reach 3.1 million new cases and approximately 1.6 million deaths by 2040. Current treatments include chemotherapy regimens using agents like 5-fluorouracil (5-FU), known for their significant toxicity. Moreover, at the metastatic stage, around 90% of tumors develop resistance to chemotherapy due to mechanisms that enhance molecule efflux or promote cell survival. Addressing these challenges requires the development of novel molecules or molecular combinations to enhance chemotherapy efficiency. The biophysical properties of membranes are profoundly influenced by their composition, particularly cholesterol, which affects membrane fluidity. Alterations in lipid composition and membrane biophysical properties can modify tumor progression by impacting cellular signaling, migration, invasion, and response to therapies. Since the 1990s, polyphenols such as resveratrol (RSV) and xanthohumol (XN) have shown promising anticancer activity in both in vitro and animal studies, often enhancing treatment effectiveness, although their precise action mechanisms remain unclear. In this study, we aimed to investigate how RSV and XN, both potent membrane-interacting compounds, affect cellular biophysics and mechanical properties involved in cancer development. We conducted experiments using three stages of colorectal adenocarcinoma cell lines (SW480, HT29, SW620) and a control non-tumor cell line (CRL1831). Atomic force microscopy (AFM) revealed that after 24 hours of exposure to RSV and XN, cancerous colorectal cells exhibited reduced volume and increased cellular elasticity, changes not observed in the control cells. These alterations were associated with cortical cytoskeleton remodeling and initiation of apoptosis, supported by increased caspase-3 activity. Using Laurdan fluorescent probe and confocal microscopy, we found that RSV and XN increased plasma membrane fluidity in cancer cells in a manner dependent on cell line aggressiveness, with no significant effects observed in CRL1831 cells. Furthermore, pre-treatment with RSV and XN for 24 hours enhanced the effectiveness of subsequent 5-FU treatment in cancer cell lines. Once again, control cells were not affected, suggesting a cancer-specific effect. Additionally, we explored the impact of RSV and XN on membrane biophysics using simple model membranes. Our aim was to analyze the impact of cholesterol concentration on membrane structure, as well as the membrane response to interaction with RSV and XN, using AFM and molecular modeling. Our results show that RSV tends to induce an increase in membrane elasticity, irrespective of cholesterol content, providing insights into their therapeutic potential in colorectal cancer. Overall, our results demonstrate the importance of biophysical techniques such as AFM in studying alterations in membrane biophysical properties induced by RSV and XN. These alterations could modulate the response to anticancer treatments and influence disease progression, underscoring the need for a multidisciplinary approach integrating biological and biophysical analysis methods to explore their therapeutic potential in colorectal cancer

Les protéines membranaires sont particulièrement riches en acides aminés aromatiques, tels que le tryptophane (W). On retrouve cette originalité dans beaucoup de peptides antimicrobiens et dans les protéines de fusion virales. La glycoprotéine de l'enveloppe de HIV-1, gp41, en est un exemple. Manifestement, les résidus W sont impliqués dans la perturbation des membranes et la formation des pores. L'objectif de ce travail est d'étudier le rôle des résidus W dans de telles activités en utilisant l'optique non linéaire. Pour cela, nous avons préalablement déterminé l'hyperpolarisabilité (le potentiel non linéaire) du W par la diffusion Hyper Raleigh (HRS). Puis nous avons montré une évolution de la réponse non linéaire de petits peptides synthétiques en fonction du nombre croissant de leurs résidus W. Ces résultats ont permis de suivre l'implication des tryptophanes de deux peptides K3W et gp41W, lors de leurs interactions avec des monocouches lipidiques à l'interface air-eau par la génération de second harmonique (SHG). D'autre part, l'influence de telles interactions sur la structure secondaire et l'orientation des peptides a été déterminée par le PM-IRRAS. Nous avons ainsi montré la cohérence entre les modifications du signal SHG, liées à des changements d'orientation des tryptophanes et celles des spectres de PM-IRRAS, dues à des changements d'orientation de la structure secondaire de gp41W
Membrane proteins are extremely rich in aromatic amino acids, like tryptophan (W). This particularity is found in many antimicrobial peptides and in several virus fusion proteins. An example of these fusion proteins is the HIV-1 envelop glycoprotein, the gp41. It is clear that the W residues are implicated in membrane perturbation and pore formation. The aim of this work was the investigation of the W residue role in such activities, using the nonlinear optic. First, we determined the W hyperpolarizabilité (nonlinear potential) by the Hyper Rayleigh Scattering (HRS). Then, the evolution of the nonlinear signal of small synthetic peptides, as function of the increasing number of their W residues, was demonstrated. These results allowed us to follow the W residue involvement of two peptides, K3W4 and gp41W, in the interaction with lipids monolayer at the air-water interface, using the second harmonic generation (SHG). The influence of such interaction in the peptide structure and orientation was determined using the PM-IRRAS. In conclusion, we showed the coherence between the SHG signal variation, due to the W orientation changes, and the PMIRRAS spectra modification, due to the gp41W helix orientation changes

L’utilisation de détergents est inévitable pour les études structurales des protéines membranaires. Dodecylphosphocholine (DPC) est un des détergents les plus utilisés pour ce type d’études employant la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) en solution. L’effet des détergents sur la structure et la dynamique des macromolécules est une problématique importante, mais peu étudiée à ce jour. Dans cette étude nous avons caractérisé la dynamique à l’échelle de la milliseconde, la liaison des substrats ainsi que des propriétés structurales de trois protéines membranaires différentes solubilisées dans des micelles de DPC. Ces protéines font partie de la famille des transporteurs mitochondriaux et nous avons choisi les séquences de la levure (ORC1, GGC1, AAC3). Nous avons détecté de la dynamique à l’échelle de la milliseconde qui est distribuée d’une manière asymétrique à travers la structure. En contradiction avec des propos de la littérature, nous montrons que cette dynamique n’est pas corrélée à la fonction, puisqu’elle n’est pas modifiée par des mutations qui inhibent le transport effectué par ces protéines quand elles sont reconstituées dans des liposomes. En plus, nous avons pu montrer que leur spécificité par rapport aux substrats, n’est pas conservée quand ces transporteurs sont reconstitués dans du DPC, mettant en question leur fonctionnalité dans ce détergent. La RMN a aussi permis de démontrer que les structures tertiaire et secondaire sont perturbées dans les micelles avec quelques hélices transmembranaires apparaissant exposées au solvant. Nous avons donc conclu que la présence du détergent a un effet fort sur les trois transporteurs mitochondriaux de notre étude et probablement d’autres protéines similaires, en les rendant très flexible. Nos résultats indiquent un probable effet général de ce détergent sur les protéines membranaires, comme nous le discutons dans une analyse détaillée de quelques études de protéines membranaires décrites dans la littérature. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons adressé une question fondamentale de la dynamique des protéines: comment se comportent les protéines dans des cristaux ? Nous avons étudié la dynamique de l’ubiquitine cristalline à l’échelle de la milliseconde afin de comprendre l’influence de la maille cristalline sur ce type de mouvement. Pour ce faire, nous avons employé la RMN à l’état solide et des simulations de dynamique moléculaire de la protéine dans différents réseaux cristallins distincts. Il est intéressant à noter que dans ces cristaux on détecte toujours des processus locaux d’échange dynamique sur une échelle de temps de la milliseconde. Cependant, en comparant les résultats obtenus avec différentes formes cristallines, nous constatons que les paramètres thermodynamiques des différents états en échange et les vitesses d’interconversion entre ces dernières sont significativement modifiés par les contacts cristallins. De plus, nous avons détecté des mouvements globaux de type «rocking» des ces molécules à l’état cristallin qui surviennent également à l’échelle de la milliseconde. Ceci suggère que les mouvements globaux et locaux sont corrélés. Cette observation ouvre la discussion de l’importance de ce type de mouvements pour la qualité et l’interprétation des données des expériences de diffraction des rayons-X
The use of detergents is often unavoidable in the structural studies of membrane proteins. Dodecylphosphocholine (DPC) is one of the most commonly used detergents for such studies in solution state NMR spectroscopy. The effect of detergent on structure and dynamics remains an important and poorly understood question. In this study we have investigated millisecond dynamics, substrate binding and structural features of three different yeast proteins from mitochondrial carrier family (GGC1, ORC1 and AAC3) in DPC micelles. We have detected millisecond dynamics, which are asymmetrically distributed across the structure. Contrary to previous claims, we show that these dynamics are unrelated to function, as they are not affected by the substitutions which abolish mitochondrial carrier transport in proteoliposomes. Furthermore, we could show that the very well-defined substrate specificity of these proteins in membranes is abolished when they are reconstituted in DPC, questioning their functionality. Structural investigations have revealed that both tertiary and secondary structures of these carriers are perturbed in DPC micelles, with some TM helices showing substantial solvent exposure. We have concluded from these observations that DPC detergent strongly perturbs these, and likely other mitochondrial carriers by rendering them very flexible. Our findings point to a possibly general effect of this detergent on membrane proteins, as we discuss with examples of previously studied membrane proteins. In the second part we have addressed a fundamental question of protein dynamics: how do proteins move inside crystals? We have investigated ms dynamics in a crystalline ubiquitin to gain the insight on the impact of the crystalline lattice on such motions, using solid-state NMR and ms long MD simulations of explicit crystal arrangements. Interestingly a local dynamic exchange process on a ms time scale is still present in crystals. However, by comparing different crystal forms we establish that the thermodynamics of the exchanging states and their interconversion rate constants are significantly altered by the crystal contacts. Furthermore, we detect overall "rocking" motion of molecules in the crystal, occurring on a tens-of-ms time scale, and provide evidence that overall and local motion are coupled. We discuss the implications of ms dynamics on the data quality in X-ray diffraction experiments

Des forces intermoléculaires sur lesquelles nous avons peu de connaissances préalables sont souvent essentielles à la stabilité et à l'évolution des assemblages biologiques. Dans cette thèse, nous nous concentrons sur deux de ces forces qui sont impliquées de façon critique dans la déformation soit des biopolymères, soit des membranes. Nous déduisons ces forces en conciliant la géométrie d'une telle déformation avec des modèles mécaniques simples. Dans la première partie de la thèse, nous examinons la force d'attraction entre les molécules d'ADN médiées par des cations multivalents. Cette attraction est nécessaire pour compenser la rigidité de l'ADN lors du confinement de grandes quantités d'ADN dans des environnements relativement petits, tels que les noyaux des spermatozoïdes. In vitro, les cations multivalents causent la condensation de l'ADN en faisceaux toroïdaux denses. Grâce à des données sur la géométrie de ces faisceaux, nous pouvons étudier la compétition entre les forces attractives et la rigidité de l'ADN. Nous inférons telles forces et proposons que la courbure toroïdale affaiblisse l'adhésion entre les molécules d'ADN. Dans la deuxième partie de la thèse, nous nous intéressons à la force de liaison d'un complexe protéique de remodelage membranaire, ESCRT-III, aux membranes cellulaires. Les protéines ESCRT-III s'assemblent en polymères qui remodèlent la membrane au cours de nombreux processus cellulaires, allant du bourgeonnement du VIH à la cytokinèse. Le mécanisme par lequel les polymères ESCRT-III déforment les membranes n'est toujours pas clair. In vitro, les polymères ESCRT-III peuvent transformer des vésicules membranaires sphériques en tubes hélicoïdaux. Nous proposons que les tubes hélicoïdaux résultent du positionnement particulier des sites de liaison membranaire sur la surface des polymères ESCRT-III. De plus, nous déduisons la force de liaison entre les monomères ESCRT-III et la membrane à partir de la géométrie des tubes hélicoïdaux
Inter-molecular forces on which we have poor prior knowledge are often essential for the stability and evolution of biological assemblies. In this thesis, we focus on two such forces that are critically involved in the deformation of either biopolymers or membranes. We infer these forces by reconciling the geometry of such deformation with simple mechanical models. In the first part of the thesis, we consider the attractive force between DNA molecules mediated by multivalent cations. This attraction is required to compensate DNA bending rigidity when packaging large quantities of DNA in comparatively small environments, such as the nuclei of sperm cells. In vitro, multivalent cations drive DNA condensation into dense toroidal bundles. Geometrical data on DNA toroidal bundles give access to the competition between inter-helical attraction and DNA bending rigidity. From these data, we infer inter-helical forces and argue that the toroid curvature weakens the adhesion between DNA molecules. In the second part of the thesis, we turn to the binding force of a membrane remodeling protein complex, ESCRT-III, to cellular membranes. ESCRT-III proteins assemble into membrane-remodeling polymers during many cellular processes, ranging from HIV budding to cytokinesis. The mechanism by which ESCRT-III polymers deform membranes is still unclear. In vitro, ESCRT-III polymers can reshape spherical membrane vesicles into helical tubes. We argue that helical tubes result from the peculiar positioning of membrane-binding sites on the surface of ESCRT-III polymers. Furthermore, we infer the binding force between ESCRT-III and membrane from the geometry of helical tubes

La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) s'est révélée particulièrement efficace dans l'étude des macromolécules biologiques in situ (et in vivo). Les premières applications ont d'abord porté sur l'étude de petites molécules en solution puis, rapidement, l'intérêt s'est déplacé vers l'analyse des protéines en solution. Depuis quelques années, la RMN du solide en rotation à l'angle magique (MAS) est apparue comme une technique adaptée dans l'étude structurale des protéines membranaires dans leurs membranes natives. Il est en effet établi que les deux constituants majeurs des membranes biologiques (lipides et protéines membranaires) sont intimement liés, et l'étude de leurs influences réciproques permettrait d'obtenir une vision plus complète de celles-ci. Afin d'apporter certaines d'informations à cette question, nous avons choisi un modèle particulier : la souche C43(TDE3) et son réseau membranaire formé suite à la sur-expression de la sous-unité b de l'ATP synthase FoFi d'E. Co/i. L'étude de la formation de ce réseau, de l'implication de la sous-unité b (RMN MAS 13C/15N) et des lipides (spectrométrie de masse et RMN 31P), a permis d'obtenir certaines données quant à l'importance de ces deux composants dans la mise en place et stabilisation de ce réseau. De plus, au cours de ce projet, l'utilisation combinée de la RMN 'H et du MAS s'est révélée particulièrement adaptée dans l'étude de la dynamique des membranes de cellules entières selon diverses conditions de croissance. De fait, les différentes méthodes développées et utilisées au cours de projet pourraient s'avérer utiles dans l'étude de diverses membranes biologiques, que ce soit du point de vue protéique ou lipidique
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy has revealed efficient for in situ (and in vivo) structural studies of biological macro-molecules. The first studies focused on small soluble molecules, and quickly, the interest shifted toward the study of soluble proteins. For few years now, magie-angle spinning (MAS) solid-state NMR has appeared as a technique of choice to obtain structural information about membrane proteins in their native environment (biological membranes). It is now well established that the two major components of biological membranes, that is to say: lipids and membrane proteins, are intimately connected, and the study of their mutual influences constitute a crucial step in die comprehension of biological membranes as a whole. In order to bring some dues regarding this question we have chosen a particular system: the strain C43(70E3) and its network of proliferating membranes, formed after the over-expression of the b subunit of the ATP synthase F1F0 of E. Coli. The analysis of the organisation of this network, and the involvement of the b subunit (via MAS NMR 13C/15N) and lipids (via mass spectrometry and MAS NMR 31P) allowed us to obtain some information regarding the importance of these two components in the establishment and stabilisation of this membrane network. Moreover, during this project, the combination of 2H NMR and MAS appeared as a technique particularly suited for die study of biological membranes of whole cells (alive) under various growth conditions. Also, the methods used and developed during this project could prove beneficial in the study of various biological membranes, from a proteic and lipidic stand point

Quelques régions stables ont été découvertes sur les gp d’env du VIH-1 contre lesquelles des patients produisent des anticorps neutralisants. Les épitopes les plus prometteurs se trouvent dans la MPER et sont probablement exposés durant la fusion. Alors que les peptides isolés à partir de cette région ne sont pas parvenus à induire une réaction immunogène neutralisante, des études antérieures suggèrent que la membrane lipidique joue un rôle dans la structuration des antigènes et dans la réponse immunogénique.C’est pourquoi nous étudions la structure de ces épitopes. Cela nécessite leur surexpression, leur purification et leur reconstitution dans des liposomes. Une étude de CD montre qu’ils pourraient changer de conformation, cela sera confirmé par RMN. En outre, leur immunogénicité sera vérifiée par vaccination des souris. En plus, nous trouvons que le cholestérol peut modifier l’orientation des peptides englobant le motif CRAC de la gp41
A few stable regions have been discovered on the HIV-1 env gp against which some patients produce neutralizing antibodies. The most promising ones are located in the MPER and are probably exposed transiently during the fusion. Whereas the peptides isolated from this region failed to induce immunogenic response, previous studies suggest the lipid membrane plays a role in antigens structure and in the immunogenic response.That is why we investigate the structure of these épitopes in membrane models. This requires the production of these épitopes by bacterial overexpression, their purification and their reconstitution in liposomes. A CD study shows that they could undergo a conformational change; this will be confirmed by NMR. Also their immunogenicity will be checked by mice immunization. In addition, we find that cholesterol could change the orientation of peptides encompassing a gp41 CRAC motif

Le nombre de proteines membranaires dont la structure est connue est tres faible en regard du nombre de structures resolues, ceci en raison des difficultes a obtenir des cristaux de qualite suffisante pour les etudes par diffraction des rayons x. La finalite de ce travail est de comprendre l'implication du detergent, utilise pour solubiliser puis cristalliser les proteines membranaires, dans le processus de cristallisation et dans la qualite des cristaux obtenus. En particulier, on s'est interesse a l'organisation prise par le detergent dans les cristaux, et aux differentes interactions auxquelles il participe. Les structures du detergent dans les cristaux ont ete resolues par cristallographie des neutrons a basse resolution. Les micelles de detergent, pures ou complexees avec les proteines, ont elles aussi ete etudiees, en solution, par diffusion neutronique aux petits angles. Ces deux techniques sont utilisees en combinaison avec la methode de variation de contraste. Les structures formees par le detergent dans deux cristaux de porine (de rhodobacter capsulatus et de escherichia coli) de groupes d'espace differents ont ete modelisees, ainsi que les micelles de detergent presentes dans la solution de cristallisation de l'une de ces porines. On a essaye d'en tirer une analyse generale du role du detergent, dans l'optique d'optimiser la formation de cristaux de proteines membranaires de bonne qualite. En outre les interactions entre la membrane et la proteine, mises en lumiere par la localisation du detergent au niveau de la zone transmembranaire de la proteine, ont ete abordees.

La recherche de nouveaux composés antimicrobiens naturels est un enjeu important pour répondre d’une part à la problématique des bactéries multirésistantes et d’autre part à la demande croissante de conservateurs naturels. Les protéines et peptides antimicrobiens agissant sur les membranes bactériennes semblent de bons candidats. Une des premières protéines antimicrobiennes découvertes est le lysozyme, connu depuis longtemps pour son activité muramidase contre les bactéries à coloration de Gram positive. Récemment, le lysozyme s’est avéré également actif contre les bactéries à coloration de Gram négative. L’activité membranaire du lysozyme est considérée comme un des mécanismes possibles responsables de cette activité. Dans ce travail, l’activité du lysozyme vis-à-vis des membranes d’E. Coli a été évaluée. Le lysozyme affecte l’intégrité des deux membranes : des pores et des canaux ioniques sont formés respectivement dans les membranes externe et cytoplasmique. Des monocouches de LPS et de phospholipides ont été utilisées pour mimer respectivement les membranes externe et cytoplasmique. Le lysozyme peut s’adsorber à, s’insérer dans et réorganiser les deux monocouches de manière dose-dépendante. Ces résultats obtenus sur membranes modèles sont cohérents avec les observations de perturbations membranaires in vivo. Le lysozyme chauffé à sec, plus flexible, hydrophobe et basique que la protéine native, a une activité antimicrobienne accrue par rapport au lysozyme natif. Cette activité peut être reliée à sa plus grande capacité de perturbation des membranes in vivo. De même, le lysozyme chauffé à sec induit une réorganisation des monocouches plus drastique que le lysozyme natif. En fait, le lysozyme chauffé à sec se révèle être un mélange efficace d’isoformes agissant différemment et de manière complémentaire sur les membranes d’E. Coli. Leur distribution, et un vecteur spécifique des moyennes des variables. A partir du nouveau générateur de porcs virtuels et de ce patron de variance-covariance, une population virtuelle de 2000 porcs a été générée pour simuler l’effet de la stratégie alimentaire et du contexte de prix des matières premières sur les performances moyennes et leur variabilité, et sur les rejets azotés. Notre étude montre notamment qu’en alimentation biphase, une restriction alimentaire maîtrisée permet d’améliorer l'hétérogénéité du poids, la marge par porc et les rejets. Un essai zootechnique a permis de confirmer la pertinence de certains résultats de simulation. L’ensemble de ce travail permet d’envisager à terme l’intégration d’une dimension populationnelle dans les modèles et outils d'aide à la décision qui en sont issus
Research for novel natural antimicrobial compounds is highly stimulated because of the growing number of multi-resistant bacteria on the one hand and the growing consumer demand for natural conservatives on the other hand. Antimicrobial peptides or protein acting on the bacterial membranes could answer this demand. One of the first discovered antimicrobial proteins is lysozyme, is widely known for its muramidase activity against several Gram positive bacteria. Recently, lysozyme was also shown active against Gram negative bacteria. Membrane activity of lysozyme is suggested as one of the possible mechanisms involved. In this work, lysozyme activity on both the outer and cytoplasmic membranes of Escherichia coli is evaluated in vivo and in vitro. Lysozyme has been shown to affect the integrity of both membranes ; pores and ion channels are formed in the outer and cytoplasmic membranes, respectively. LPS and phospholipid monolayers have been used to mimic the E. Coli outer and cytoplasmic membranes, respectively. Lysozyme is able to adsorb onto, to insert into and to reorganize LPS and phospholipid monolayers in a dose-dependent manner. These findings on lipid membrane models are consistent with the membrane disruption observed in vivo. Dry-heated lysozyme, more flexible, hydrophobic and basic than the native protein, has here been shown to exhibit an increased antimicrobial activity compared to native lysozyme. This activity could be related to its increased membrane disruption capacity in vivo. As well dry-heated lysozyme is able to reorganize LPS and phospholipid monolayers in a larger extent than native lysozyme. Actually, dry-heated lysozyme appears to be a efficient, mixture of complementary lysozyme isoforms acting differently on the E. Coli membranes

Les espèces réactives de l’oxygène (EROs) sont essentielles à la survie des cellules car elles interviennent dans divers processus physiologiques comme la défense immunitaire ou encore la régulation de voies de signalisation cellulaires. Cependant, un excès d’EROs peut créer un déséquilibre de la balance EROs/antioxydants appelé « stress oxydant ». Le stress oxydant étant impliqué dans l’étiologie de plus de 200 pathologies, l’action des antioxydants est cruciale pour limiter les effets délétères des EROs. Les antioxydants utilisés par les cellules peuvent être de nature chimique. Parmi ceux-ci, l’α-phenyl-N-tert-butyl nitrone (PBN) est particulièrement efficace en milieu biologique pour piéger les radicaux. Cependant, comme cette molécule présente le désavantage majeur de mal cibler les membranes, des nitrones amphiphiles dérivées de la PBN ont été synthétisées. Le premier chapitre décrit l’étude des interactions de nitrones dérivées du cholestérol avec les lipides membranaires. Ces travaux ont souligné l’influence du groupement polaire sur la nature des interactions avec les lipides membranaires. Aussi, l’étude des propriétés antioxydantes a permis de mettre en évidence l’importance de la localisation membranaire et l’influence de l’orientation du groupement PBN sur l’activité protectrice des dérivés. Le second chapitre décrit les résultats des expériences menées avec une deuxième série de dérivés amphiphiles, présentant la particularité d’avoir une chaîne perfluorée comme groupement hydrophobe. Bien que la localisation membranaire de ces dérivés soit nécessaire pour obtenir un effet protecteur significatif, la nature de l’antioxydant semble être ici le paramètre le plus important. Enfin, la combinaison d’antioxydants de nature différente sur une même molécule semble être une stratégie prometteuse pour améliorer l’efficacité antioxydante et créer un effet de synergie. En outre, pour se défendre, les cellules utilisent aussi des antioxydants issus de l’alimentation, en particulier des fruits et légumes. Parmi ces derniers, les composés phénoliques sont reconnus pour leurs effets bénéfiques sur la santé. Les flavonoïdes, les acides phénoliques, les stilbènes et les lignanes constituent les 4 classes principales de composés phénoliques. Les lignanes sont particulièrement présents dans les graines de lin (Linum usitatissimum). Le lin est la plante qui contient le plus de secoisolaricirésinol diglucoside. Afin de mieux comprendre leur fonctionnement et leurs interactions avec les lipides membranaires, plusieurs molécules appartenant à cette classe de composés ainsi que des acides hydroxycinnamiques ont été purifiées à partir du lin. Le troisième chapitre décrit les résultats des expériences menées avec les composés phénoliques extraits du lin. De manière générale, les composés testés se sont avérés efficaces pour protéger les lipides membranaires de l’oxydation. L’étude de leurs interactions avec les lipides membranaires a permis de montrer que le mode d’action des lignanes, qui pénètrent les membranes, est plus efficace que celui des acides hydroxycinnamiques
Reactive oxygen species (ROS) are essential in living cells as they intervene in several physiological processes like the immune system and signaling pathways. However, an excess of the production of ROS can alter the equilibrium with antioxidants. This imbalance is called oxidative stress. As oxidative stress has been reported to be implicated in more than 200 diseases, the action of antioxidants to limit the deleterious effects of ROS is crucial. The antioxidants used by the cells can be chemical. Among them, α-phenyl-N-tert-butyl nitrone (PBN) is widely used in biological systems to neutralize ROS. Because this molecule possesses a poor ability to target membranes, our collaborators synthesized amphiphilic nitrones bearing a PBN moiety. The first chapter describes the interactions of cholesterol derived PBN derivatives with the membrane. Results underlined the influence of the polar moiety on the nature of their interactions with membrane lipids. In addition, the evaluation of the antioxidant properties revealed the importance of the membrane localization of the nitrone moiety on the protective activity of the derivatives. The second chapter deals with a second set of amphiphilic nitrones that have the particularity of bearing a perfluorinated chain that constitutes the hydrophobic moiety. We noticed the membrane localization is important for the antioxidant efficiency; however the nature of the antioxidant moiety remains the most important parameter in this case. Finally, the strategy of grafting two different antioxidants on the same carrier seems to be promising to enhance the protective effect and create a synergistic antioxidant effect. However, cells also use natural antioxidants to defend themselves. These antioxidants come from food, especially from vegetables and fruits. Among them, phenolic compounds are known for their beneficial effects on health. Flavonoïds, phenolic acids, stilbenes and lignans constitute the 4 main classes of phenolic compounds. Lignans are particularly present in flaxseed (Linum usitatissimum). Flaxseed is the plant that possesses the highest quantity of secoisolariciresinol diglucoside. In order to understand their mechanisms of action and their interactions with membranes, lignans as well as hydroxycinnamic acids were purified from flaxseed. The third chapter describes the results obtained on model membranes. Generally speaking, both classes of compounds are efficient against lipid oxidation. Studying their interactions with membrane lipids allowed us to show that the mechanism of lignans, that penetrate membranes, is more efficient than the mechanism of hydroxycinnamic acids

Les membranes biologiques sont impliquées dans divers mécanismes comme la reconnaissance moléculaire ou encore la fusion membranaire. Les lipides, principaux composants des membranes, sont inhérents à ces processus cellulaires, mais leur organisation et leur rôle fonctionnel au sein de ces systèmes sont très complexes. Dans ce travail, nous avons utilisé des modèles membranaires mimant ces systèmes biologiques pour identifier les interactions mises en jeu avec divers agents exogènes (AEs), en utilisant la microscopie à force atomique (AFM). Nous avons donc travaillé sur deux AEs différents qui interagissent potentiellement avec ces membranes. Le premier intervient directement dans le cadre de l'étude du paludisme. Le mécanisme moléculaire de cette maladie (impliquant probablement des structures lipidiques) n'étant pas clair, la compréhension de celui-ci faciliterait le développement de nouvelles molécules antipaludiques et/ou cibles thérapeutiques. Parallèlement notre étude s'est portée sur l'interaction des nanoparticules (NPs) de TiO2, notre second AE, avec les membranes. Très utilisées dans l'industrie, ces NPs de TiO2 pourraient avoir un impact sur la santé humaine, en interagissant notamment avec les membranes cellulaires. Des techniques biophysiques classiques ont tout d'abord été utilisées pour évaluer l'interaction de l'AE avec des systèmes biomimétiques. Ensuite, lorsque celle-ci est prouvée, l'AFM est utilisée pour visualiser les changements morphologiques des modèles membranaires en présence de ces AEs. Ainsi, pour chaque AE, nous avons finalement suggéré un mécanisme d'interaction afin de répondre aux problématiques soulevées.

La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) permet d’étudier la dynamique d’objets fluorescents. En particulier, elle est parfaitement adaptée à l’étude de la diffusion moléculaire. Ainsi, elle s’est avérée efficace pour étudier la diffusion de la Rhodamine-6G au voisinage d’une interface dont l’hydrophobicité est contrôlée. L’utilisation de surface possédant des degrés d’hydrophobicité croissants nous a permis de montrer que la rhodamine-6G est fortement attirée par les surfaces hydrophobes. Une étude de la fluidité de la membrane plasmique de cellules vivantes a également été menée. Elle a porté sur le phénomène de résistance multiple des traitements anticancéreux. La fluidité membranaire d’une lignée cellulaire résistante apparaît plus hétérogène que celle de la lignée sensible. L’effet d’un fluidifiant ainsi que de deux révertants nous ont permis de révéler l’existence de « domaine » membranaire corrélé à la présence d’une protéine à l’origine de la résistance. Enfin, un développement instrumental basé sur le FRET a été proposé afin de réduire fortement l’élongation axiale du volume d’observation. Grâce à une fonctionnalisation de la surface et un marquage membranaire spécifique, les points d’adhésion cellulaire ont été mis en évidence par imagerie, nous permettant de réaliser des premières mesures locales de FCS
Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is used to probe the dynamic of molecular dyes. In particular, FCS is well adapted to investigate diffusion processes. Thus, such spectroscopic approach was suitable to study the diffusion of rhodamine-6G near a controlled interface in term of hydrophobicity degree. Finally, we have shown that rhodamin-6G is strongly attracted by hydrophobic surfaces. A study of membrane fluidity in living cells has also been conducted. It related to the multidrugs resistance (MDR) phenomena in cancer research. So, we clearly reveal the higher heterogeneity of plasma membrane in MDR cells in comparison with the sensitive ones. The effect of specific and non specific membrane agents allowed us to display the presence of distinct membrane “domain” linked to the resistance. Finally, an instrumental development based on FRET was proposed in order to strongly reduce the axial elongation of the confocal volume. Through a surface functionalization and an appropiate plasma membrane labelling, we have highlighted cell adhesion on surfaces, which enabled us to perform first local FCS measurements on cells

La Spectroscopie de Corrélation de Fluorescence (FCS) est une technique de molécules uniques particulièrement bien adaptée aux études en milieu biologique. Elle est ici mise en œuvre pour analyser localement la membrane plasmique de cellules vivantes. Dans un premier temps, la distribution de la microfluidité membranaire de cellules vivantes a été caractérisée grâce à des mesures de temps de diffusion par FCS. Nous avons ainsi pu établir la loi de distribution de la fluidité membranaire à l’échelle de la cellule unique pour différentes lignées cellulaires (LR73, MCF7, KB3. 1, MESSA et MDCKII). Une simulation Monte-Carlo montre qu’un modèle simple de diffusion à deux dimensions dans une matrice contenant des microdomaines visqueux peut rendre compte de l’allure asymétrique typique des distributions obtenues. Ce résultat a été utilisé pour évaluer les modifications membranaires liées à la surexpression de la P-glycoprotéine, protéine responsable d'un phénomène de résistance à la chimiothérapie. Nous avons également comparé la structuration membranaire de diverses lignées cancéreuses, chacune se déclinant en une version sensible et une version résistante à un médicament : la Doxorubicine. Dans un second temps, nous proposons une nouvelle méthode d’illumination locale basée sur un transfert d’énergie non radiatif. Cette méthode permet de réduire la profondeur de champ du microscope à l’échelle nanométrique. Nous en démontrons ici le potentiel pour l'utilisation de la FCS dans des solutions micromolaires ainsi que pour l'imagerie de l'adhésion cellulaire
Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a single molecule technique very well suited for in vivo studies. We have used FCS to explore plasma membrane microfluidity of living cells. Measurements were conducted at the single cell level, which enabled us to get a detailed over-view of the typical plasma membrane microviscosity distribution of each cell line studied (LR73, MCF7, KB3. 1, MESSA and MDCKII). A Monte Carlo simulation based on a 2D diffusion model enables us to link the asymetric fluidity distribution profile with the plasma membrane micro-organization. This result was used to determine the membrane organisation related to the surexpression of the P-glycoprotein (Pgp), a protein implicated in multidrug resistance. We also compare the membrane structuration of various cancer cell lines, each comes in two versions, a sensitive one and a resistant one to a chemotherapeutic drug: the Doxorubicin. Secondly, we propose a new excitation scheme based on a nonradiative energy transfert. This approach allow us to reduce the illumination depth of the microscope at the nanometric scale. We demonstrate its potential through two applications: FCS in micromolar solutions and fluorescence imaging on cells adhesion areas

Les protéines membranaires (PMs) sont habituellement maintenues solubles en solution aqueuse à l'aide de détergents. Or, le caractère dissociant de ces derniers, combiné à la nécessité de les employer en excès, entraîne souvent une dénaturation de la protéine étudiée au cours du temps. Pour pallier cet inconvénient, des structures macromoléculaires baptisées « amphipols » (APols) ont été proposées. Les APols qui ont fait l'objet des études les plus poussées à ce jour sont des polyanions, propriété qui interdit leur emploi dans divers systèmes analytiques (isoélectrofocalisation) ou de séparation (chromatographie sur colonne échangeuse d'ions) et qui n'est pas favorable à la cristallisation des complexes PM/APol. Ces limitations ont suscité la création d'amphipols entièrement non-ioniques (NAPols) à base de glucose. La capacité des NAPols à maintenir les protéines membranaires solubles en l'absence de détergent a été établie. La caractérisation des propriétés et des utilisations des NAPols a suivi la même démarche que celle adoptée pour le développement des APols anioniques, qui comprend deux étapes. Tout d'abord, la composition et les propriétés en solution des particules PM/NAPol ont été établies par DLS,SEC, AUC, SANS, et mesures de tension de surface. L'utilité de ces nouveaux APols pour l'étude biochimique et biophysique des PMs a ensuite été explorée, en particulier pour l'isoélectrofocalisation, le repliement des PMs à partir d'un état dénaturé, leur synthèse in vitro, et la préservation de la fonctionnalité de PMs piégées en APols, toutes applications où les NAPols peuvent remplacer avantageusement les APols anioniques
Membrane proteins (MPs) are usually kept soluble in aqueous solutions thanks to the use of detergents. The dissociating character of detergents, associated to the need to work at suprami- cellar concentrations, often leads to a rapid inactivation of the proteins. To avoid such a problem, macromolecular structures called "amphipols" (APols) have been proposed. The most thoroughly studied APol to date, A8-35, is an anionic polymer. Its charge prevents its use in various analytical Systems (isoelectrofocusing) or separation techniques (ion exchange chromatography) and is not a favourable factor for the crystallization of MP/APol complexes. This has prompted the design and development of completely non-ionic amphipols (NAPols), which carry glucose moieties. The ability of NAPols to maintain membrane proteins soluble in aqueous solution in the absence of detergent has been established. Examination of the properties and uses of NAPols took the course followed earlier for the development of A8-35, which comprises two main branches. First, the composition and solution properties of MP/NAPol particles are established by DLS, SEC, AUC, SANS, and surface-tension measurements. Second, we have explored the usefulness of these new APols in membrane biochemistry and biophysics, particulariy for those applications, such as IEF, folding of MPs from a denatured state, cell-free synthesis, and biochemical stabilization of NAPol-trapped MPs? where they can advantageously substitute to the current anionic APols

L'objectif général de ces travaux a été de contribuer à élucider les mécanismes moléculaire qui régissent les interactions protéine-ligand dans la membrane. La première protéine concernée est le récepteur périphérique des benzodiazépines (PBR) le ligand d'intérêt, le cholestérol. PBR est impliquée dans la biosynthèse des stéroïdes, participant à la translocation du cholestérol de la membrane externe de la mitochondrie à membrane interne. Ne disposant d'aucune information structurale sur PBR, nous nous sommes d'abord intéressés à la structure de PBR en déterminant par RMN la conformation des fragments synthétiques recouvrant les domaines transmembranaires prédits puis en étudiant la protéine recombinante entière par RMN et dichroïsme circulaire. Différentes études couplant mutations modélisations ont ensuite été effectuées, qui ont permis de caractériser l'interaction PB cholestérol et le rôle de résidus clés dans cette interaction. La deuxième partie de la thèse concerne l'interaction du domaine extracellulaire de VPAC un récepteur couplé aux protéines G, avec le neuropeptide vasointestinal (VIP), qui joue un rôle important en physiopathologie humaine. Cette étude est basée sur la construction d'un mode structural par homologie du domaine de VPAC1. En utilisant la conformation du VIP obtenue par RMN et des données expérimentales de photoaffinité, nous avons pu proposer un mode d'interaction VIP-VPAC1 par docking, et caractériser cette interaction par simulation de dynamique moléculaire. Ce travail s'intègre dans la caractérisation des bases moléculaires de reconnaissance du VIP par son récepteur et plus généralement dans la compréhension d processus d'interaction ligand-récepteur dans la famille des RCPG de classe B
The main goal of this work has been to contribute to elucidate the molecular mechanism underlying protein-ligand interaction within the membrane. The first protein studied is the peripheral benzodiazepine receptor (PBR) and its ligand interest, cholesterol. PBR is involved in steroid biosynthesis, through the cholesterol translocation from the outer to the inner membrane of mitochondria. In the absence of any available structural information on PBR, our first work has been to focus on the PBR structure, by determining from NMR data the conformation of synthetic fragments encompassing the predicted transmembrane domains and then by studying the entire recombinant protein by NMR and circular dichroism. In second step, several studies combining mutagenesis and molecular modeling have be performed which allow to characterize PBR-cholesterol interaction, and the role of key residues this interaction. The second part of our work is devoted to study the interaction of the extracellular domain VPAC1, a G-protein coupled receptor, with the vasointestinal neuropeptide (VIP), which plays important role in human physiopathology. From the VIP conformation obtained by NMR a photoaffinity data, we were able to propose a molecular model of the VIP-VPAC1 interaction using docking protocols and to characterize this interaction using molecular dynamics simulation. Our result contributes to elucidate the molecular basis of VIP recognition and more generally understand the ligand-receptor interaction process of the class B family of GPCRs

Le complexe protéique ESCRT-III conduit au remodelage membranaire dans de nombreux contextes cellulaires. Les ESCRTs ont été largement étudiés in vivo et partiellement reconstitués in vitro sur des protéines de levure. Chez l’Homo Sapiens, il existe au moins 12 protéines ESCRT-III appelées Charged Multivesicular Body Protein (CHMP 1-7). Malgré que la fonction principale de ces assemblages de protéines soit d’induire la scission membrane par constriction du cou des membranes, le mécanisme biophysique reste incertain et les propriétés mécaniques des polymères CHMPs faiblement caractérisées. Par ailleurs, la séquence de recrutement à la membrane généralement considérée pour les composantes principales est CHMP4-CHMP3-CHMP2A. Mais, les cellules mammifères incluent aussi CHMP2B, considérée comme isoforme de CHMP2A et, dont le rôle est méconnu. Nous avons utilisé des systèmes biomimétiques de membranes modèles et des protéines CHMPs purifiées pour étudier in vitro leur affinité et leurs effets sur la membrane par différentes techniques. Nous avons établi que seule CHMP2B a une affinité spécifique aux lipides PI(4,5)P2. Nous montrons qu’en présence de CHMP2B, les membranes deviennent rigides en contraste avec les autres CHMPs et suggérant que CHMP2A et CHMP2B ont des propriétés distinctes. En fin, nous montrons en désaccord avec les modèles proposés, que CHMP4 seule ne peut pas déformer les membranes. Elle requiert l’interaction avec CHMP2B ou CHMP2A+3 pour former des assemblages de polymères qui stabilisent des structures tubulaires de la membrane. Ces observations offrent une nouvelle base pour proposer un mécanisme possible pour la constriction membranaire avec l’ATPase Vps4
The ESCRT-III protein complex mediates membrane remodeling in many cellular contexts. The ESCRT pathway has been extensively studied in vivo and partially reconstituted in vitro using yeast proteins. In Homo Sapiens, at least 12 ESCRT-III proteins exist, called Charged Multivesicular Body Protein (CHMP 1-7). Although, the main function of the ESCRT-III protein assemblies is to induce membrane scission by constricting membrane necks, the biophysical mechanism remains unclear and the mechanical properties of the CHMP polymers still poorly characterized. Moreover, the usually accepted sequence of recruitment of the major ESCRT components to the membrane prior to scission is CHMP4-CHMP3-CHMP2A but mammalian cells also have CHMP2B considered to be a CHMP2A isoform; so far, its role remains elusive. We have used biomimetic model systems and purified CHMP proteins to study in vitro protein affinity and effects on membrane by several techniques. We established that CHMP2B binding is enhanced with PI(4,5)P2 lipids, whereas the other human core components have no lipid specificity besides their negative charge. We showed that in the presence of CHMP2B, membranes become rigidified in contrast to CMHP2A as well as CHMP4 and CHMP3, suggesting that CHMP2A and CHMP2B have very distinctive properties. Finally, we show in disagreement with the proposed models, that CHMP4 alone cannot deform membranes. In fact, it requires the interaction with CHMP2B or CHMP2A+3 proteins to do so, forming polymer assemblies that stabilizes tubular membrane structures. These observations provide a novel basis for proposing possible mechanism for membrane constriction in the presence of the ATPase Vps4

Les étapes d'adhésion et de fusion entre l'ovocyte et le spermatozoïde sont des étapes cruciales dans le processus de fécondation. Cependant, de nombreuses questions sont posées aujourd'hui à propos des processus moléculaires qui sous-tendent la réussite de ces étapes. Ces dernières années, un nombre important de molécules clés ont été identifiées comme ayant un rôle majeur dans l'interaction gamétique. A ce jour, la seule protéine membranaire connue dont l'absence cause un échec total de la fécondation est la protéine spermatique Izumo1.
Izumo1 est une protéine transmembranaire, membre de la famille des protéines Izumo et de la superfamille des Immunoglobulines. Malgré son rôle clé dans l'interaction gamétique, ses propriétés fonctionnelles en tant que protéine d'adhésion, de fusion ou ayant la capacité d'organiser des réseaux comprenant des protéines de fusion n'est pas encore élucidé.
Dans cette étude nous nous sommes intéressés au rôle d'Izumo1 dans l'interaction gamétique.
Pour cela, nous avons généré deux variantes exogènes de la protéine Izumo1et les avons surexprimées à la membrane de plusieurs lignées cellulaires. L'interaction entre ces cellules exprimant la protéine et l'ovocyte a été analysée au moyen d'une technique de micromanipulation de cellules couplée à l'imagerie confocale. Nous avons ainsi mis en évidence une forte adhésion entre les cellules exprimant Izumo1 et les ovocytes et nous avons quantifié sa cinétique. Nous avons également généré le domaine extracellulaire recombinant afin de déterminer si Izumo1 seule était capable de se lier directement à l'ovocyte et comment. Nous avons sondé au moyen d'une technique fine de mesure de forces, le biomembrane force probe, l'interaction entre un Izumo1 unique et l'ovocyte. Ces expériences permettent de confirmer que c'est bien Izumo1 et non un partenaire qui est responsable de la forte adhésion entre cellules et ovocytes. Par observation en microscopie confocale d'un ovocyte interagissant avec des cellules surexprimant Izumo1-GFP, nous avons observé l'accumulation d'Izumo1-GFP dans la zone d'adhésion. Le fait que ce processus se reproduise lorsque plusieurs cellules adhèrent à l'ovocyte suggère qu'Izumo1 possède une molécule partenaire largement exprimée à la membrane de l'ovocyte avec laquelle il interagit pour créer de l'adhésion.

La caractérisation de l'interaction de différentes biomolécules avec les lipides constitue une étape cruciale pour la compréhension du comportement et du mode d'action de ces molécules avec les membranes cellulaires. Nous présentons ici des études biomimétiques d'une protéine musculaire. Des modèles membranaires et des méthodes biophysiques ont été utilisées. La dystrophine est une protéine filamenteuse essentielle pour le fonctionnement musculaire. Son absence ou sa modification suite à des mutations ont responsables de myopathies. Dans cette étude, nous avons analysé les propriétés de certaines répétitions homologues à la spectrine du domaine central de la dystrophine. Nous caractérisons les interactions spécifiques de deux sous domaines constitués des répétitions 1 à 3 et 20 à 24 avec les lipides. Nous montrons d'autre part, que l'interaction et l'organisation des répétitions 11 à 15 avec des membranes anioniques et zwitterioniques sont modulées par la courbure membranaire et le packing lipidique. L'analyse de propriétés rhéologiques de surface montre que les répétitions 11 à 15 forment un lien fonctionnel entre la membrane et les filaments d'actine du cytosquelette. Cette liaison mécanique contribuerait in vivo au rôle d'amortisseur de chocs attribué à la dystrophine lors des cycles de contractions-relaxations musculaires. Dans une dernière partie de ce travail, nous avons étudié la relation structure-activité d'un "de novo" peptide antimicrobien, K4. Nous identifions un mécanisme d'action de type detergent-like, conférant l'activité antimicrobienne.

Le calcium libere hors du reticulum sarcoplasmique en reponse a une depolarisation de la membrane plasmique permet la contraction des cellules musculaires. Ce mouvement de calcium implique la participation d'un complexe multi-proteiques : le complexe de mobilisation du calcium. Ce dernier est organise autour de deux canaux calciques principaux, le recepteur des dihydropyridines dans la membrane plasmique et le recepteur de la ryanodine dans la membrane du reticulum. D'autres proteines participent a ce complexe. Parmi elles, la triadine, une glycoproteine membranaire de 95 kda (trisk 95), co-localise avec le recepteur de la ryanodine. Seule sa courte extremite amino-terminale (47 acides amines) est accessible dans le cytoplasme, l'essentiel de la proteine est luminal. L'objet de ce travail est de mieux comprendre le role de cette proteine dans la physiologie du muscle squelettique. Cette etude a ete initiee in vitro en combinant des approches biochimiques et biophysiques. Une premiere fonction de la triadine a ete mise en evidence. Elle regule les relachements de calcium via le ryr. C'est precisement son site cytoplasmique (acides amines 18 a 46) qui remplit cette fonction. En interagissant directement avec le ryr, la triadine bloque partiellement le canal quand les cellules musculaires sont au repos. Lors de l'activation du relachement de calcium, le ryr est libere de cette inhibition. Une seconde isoforme de la triadine (trisk 51) a ete clonee au laboratoire. Trisk 51 a ete caracterisee : proprietes biochimiques, modifications post-traductionnelles et localisation cellulaire. J'ai ensuite recherche les partenaires moleculaires specifiques de trisk 51 et de trisk 95. Les premiers resultats indiquent que les deux isoformes

La cryopréservation engendre des dégradations variables de l’activité biologique et des fonctionnalités des bactéries lactiques, notamment chez Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, un starter de l’industrie laitière. Le but de ce travail a été d’identifier les marqueurs cellulaires de cryorésitance et de cryosensibilité afin de mieux comprendre les mécanismes de dégradation sous-jacents et d’améliorer les performances industrielles des bactéries lactiques. La cryopresérvation a ici été considérée comme une combination de deux stress majoritaires : froid et osmotique. Une attention particulière a été portée à l’analyse de la membrane cellulaire, un site majeur de dégradation lié à la congélation, mais également à la paroi cellulaire et aux protéines. De plus, les cellules ont été analysées à différentes échelles d’observation, de la population jusqu’à la cellule unique, afin de quantifier l’hétérogénéité des propriétés cellulaires existant au sein de populations. Dans une première partie de ce travail, des conditions de culture ont été comparées pour identifier deux souches de L. bulgaricus présentant des résistances contrastées vis-à-vis de la congélation. Une analyse génomique comparative des souches a également été menée dans le but de fournir des pistes de compréhension de ces comportements différents. Dans une seconde partie, des propriétés membranaires des cellules ont été évaluées en réponse aux stress froid et osmotique : composition en acides gras, organisation au niveau des chaînes d’acides gras et des têtes phospholipidiques, et fluidité.Leur fluidité membranaire a également été caractérisée à une échelle subcellulaire par microscopie de fluorescence au moyen du rayonnement synchrotron, permettant la quantification des hétérogénéités inter- et intra-cellulaires. Enfin, un développement technique et méthodologique a été entrepris afin de permettre l’analyse de bactéries individuelles en milieu aqueux par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, et ainsi leur signature biochimique en conditions natives. Ces approches complémentaires et multidisciplinaires ont révélé l’existence de propriétés et d’organisation différentes de la membrane des deux souches de L. bulgaricus. Différents types d’interaction entre les molécules cryoprotectrices du milieu extracellulaire et la membrane des deux souches a été proposé, pouvant être à l’origine des dommages causés à la souche sensible. De plus, une hétérogénéité plus importante au sein de la population sensible a été identifiée, attribuée à des différences en termes de composition biochimique et d’organisation au niveau de la membrane et de la paroi. Finalement, ce travail suggère quelques marqueurs cellulaires d’évaluation de la cryorésistance des bactéries lactiques, et fournit des méthodes de caractérisation de l’hétérogénéité biochimique au sein des populations. Ceux-ci pourraient être appliqués à l’étude de toute autre étape critique du procédé de production des bactéries lactiques, et pourraient être utiles pour aller vers la production de ferments homogènes au niveau de leur résistance
Cryopreservation leads to variable degradation of the biological activity and functionality among lactic acid bacteria (LAB), particularly Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, a dairy starter of industrial relevance. The aim of this work was to identify cellular markers of cryoresistance or cryosensitivity for better understanding the mechanisms of cell cryoinjury and increasing LAB industrial performances. Cryopreservation was here considered as a combination of cold and osmotic stresses. A particular focus was given to the analysis of the cell membrane, recognised as a primary site of cryoinjury, but also of the cell wall and proteins. Moreover, cells were analysed from the population level down to the single-cell level to quantify the heterogeneity of cell properties within populations. In the first part of this work, bacterial cultivation conditions were compared to identify two L. bulgaricus strains with markedly different cell cryoresistance. Moreover, a comparative genomic analysis of the strains was performed to provide some clues for the explanation of their different behaviours. In the second part of this work, the membrane properties were evaluated in response to the cold and osmotic stresses: fatty acid composition, organisation of fatty acyl and phospholipid headgroups, and fluidity.Subcellular membrane fluidity was also characterised by fluorescence microscopy using synchrotron radiation, enabling the quantification of inter- and intra-cellular heterogeneities. Finally, original methodological and technical developments were undertaken to achieve the analysis of individual bacterial cells in an aqueous environment by Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, for the analysis of the biochemical signature of cells under native conditions. These complementary multidisciplinary approaches revealed different properties and organisation of the membrane of both L. bulgaricus strains. It was proposed that different types of interaction between cryoprotectants of the extracellular matrix and the membrane of both strains could be at the origin of cryoinjury for the sensitive strain. Moreover, a high population heterogeneity characterised the cryosensitive strain, ascribed to differences in terms of biochemical composition and organisation of the membrane and cell wall. Altogether, this work suggests some cellular markers to evaluate LAB cryoresistance and provides methods to characterize population biochemical heterogeneity. These could be applied to any other stressful step of their production process, and should be useful for future production of homogeneous populations of resistant LAB

La plupart des toxines de Bacillus thuringiensis perméabilisent la membrane intestinale des insectes sensibles en formant des pores qui abolissent le potentiel électrique et les gradients ioniques. Plusieurs toxines ont été étudiées avec des vésicules purifiées de la bordure en brosse intestinale des insectes. Malheureusement, la membrane intestinale de beaucoup d’insectes ne forme pas des vésicules suffisamment étanches pour les expériences de perméabilisation. Une nouvelle technique utilisant des liposomes géants et une sonde de perméabilité membranaire a été développée pour caractériser deux nouvelles toxines particulièrement prometteuses pour le biocontrôle d’un des principaux ravageurs du maïs, la chrysomèle des racines du maïs (Diabrotica virgifera virgifera LeConte), Cry6Aa1 et la toxine binaire DS10/DS11. Les deux toxines perméabilisent efficacement les liposomes. La toxine binaire forme des pores qui sont légèrement sélectifs pour les cations, comme la plupart des toxines de B. thuringiensis. Bien que la Cry6Aa1 puisse former des pores sélectifs pour les anions, les résultats suggèrent aussi qu’elle pourrait, contrairement aux autres toxines de cette bactérie, ne former des pores qu’en présence d’une force ionique élevée. La formation des pores par ces deux toxines semble être sensible à la courbure de la membrane cible étant donné qu’elle est beaucoup plus efficace dans des liposomes géants que dans des liposomes de même composition, mais plus petits. Ce travail jette les bases de la mise au point d’une technique qui permettrait l’étude des toxines dans des liposomes géants enrichis avec des protéines et des lipides provenant de la membrane intestinale des insectes cibles.
Most Bacillus thuringiensis toxins permeabilize the intestinal membrane of susceptible insects by forming pores that abolish transmembrane electrical potentials and ionic gradients. Several toxins have been studied using brush border membrane vesicles purified from the insect midgut. Unfortunately, the intestinal membrane from many insects does not form vesicles that are tight enough to be used in permeabilisation experiments. A new technique using giant liposomes and a membrane permeability probe was developed to evaluate the pore-forming ability of two particularly promising toxins for the biocontrol of a major corn pest, the Western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte), Cry6Aa1 and the binary toxin DS10/DS11. Both toxins permeabilized the liposomes efficiently. However, analysis of the permeabilisation rates under different experimental conditions indicates that these toxins differ in their biophysical properties. The binary toxin forms pores which are slightly selective for cations, like most B. thuringiensis toxins. On the other hand, although the results suggest that Cry6Aa1 could form anion-selective pores, they could also indicate that, in contrast with other toxins produced by this bacterium, it could form pores only under high ionic strength conditions. Pore formation by both toxins appears to be sensitive to membrane curvature since it is much more efficient in giant liposomes than in liposomes with identical composition, but smaller in size. This study sets the bases for the development of a technique that would allow the toxins to be studied in giant liposomes enriched with proteins and lipids from the intestinal membrane of target insects.

Cette thèse porte sur l’étude de la relation entre la structure et la fonction chez les cotransporteurs Na+/glucose (SGLTs). Les SGLTs sont des protéines membranaires qui se servent du gradient électrochimique transmembranaire du Na+ afin d’accumuler leurs substrats dans la cellule. Une mise en contexte présentera d’abord un bref résumé des connaissances actuelles dans le domaine, suivi par un survol des différentes techniques expérimentales utilisées dans le cadre de mes travaux. Ces travaux peuvent être divisés en trois projets. Un premier projet a porté sur les bases structurelles de la perméation de l’eau au travers des SGLTs. En utilisant à la fois des techniques de modélisation moléculaire, mais aussi la volumétrie en voltage imposé, nous avons identifié les bases structurelles de cette perméation. Ainsi, nous avons pu identifier in silico la présence d’une voie de perméation passive à l’eau traversant le cotransporteur, pour ensuite corroborer ces résultats à l’aide de mesures faites sur le cotransporteur Na/glucose humain (hSGLT1) exprimé dans les ovocytes. Un second projet a permis d’élucider certaines caractéristiques structurelles de hSGLT1 de par l’utilisation de la dipicrylamine (DPA), un accepteur de fluorescence dont la répartition dans la membrane lipidique dépend du potentiel membranaire. L’utilisation de la DPA, conjuguée aux techniques de fluorescence en voltage imposé et de FRET (fluorescence resonance energy transfer), a permis de démontrer la position extracellulaire d’une partie de la boucle 12-13 et le fait que hSGLT1 forme des dimères dont les sous-unités sont unies par un pont disulfure. Un dernier projet a eu pour but de caractériser les courants stationnaires et pré-stationaires d’un membre de la famille des SGLTs, soit le cotransporteur Na+/myo-inositol humain hSMIT2 afin de proposer un modèle cinétique qui décrit son fonctionnement. Nous avons démontré que la phlorizine inhibe mal les courants préstationnaires suite à une dépolarisation, et la présence de courants de fuite qui varient en fonction du temps, du potentiel membranaire et des substrats. Un algorithme de recuit simulé a été mis au point afin de permettre la détermination objective de la connectivité et des différents paramètres associés à la modélisation cinétique.
This thesis is about the structure/function relationship in Na+/glucose cotransporters (SGLTs). SGLTs are membrane proteins which use the Na+ transmembrane electrochemical gradient to accumulate their substrates within the cell. As an introduction, a short review of the current state of the field will be followed by a presentation of the different technics used in this work. This work can be divided in three main projects. In the first project, we investigated the structural basis of water permeation through SGLTs. By using molecular modeling technics, we have identified, in silico, a passive permeation pathway used by water to go through the cotransporter across the membrane. Using voltage-clamp volumetric measurement, we were able to corroborate these findings for hSGLT1 expressed in oocytes. A second project allowed elucidation of some of hSGLT1 structural characteristics through the use of dipicrylamine (DPA), a fluorescence acceptor whose repartition in the lipid membrane is voltage-dependant. Use of DPA concomitantly with voltage-clamp fluorescence and FRET (fluorescence resonance energy transfer) has clearly demonstrated the extracellular localisation of part of the 12-13 loop which was previously assumed to be intracellular. In addition, we have shown that hSGLT1 forms a dimeric structure where the subunits are linked by a disulfide bridge. A last project aimed at characterizing the steady-state and pre-steadystate currents of a member of the SGLT family named hSMIT2 (human Na/myo-inositol transporter 2). We showed that phlorizin is a poor inhibitor of pre-steady state currents following depolarisation, and the presence of a time, membrane potential and substrate dependent leak current. A simulated annealing algorithm was developed in order to allow objective determination of both the connectivity and the parameters associated with the optimal kinetic model.

L’ATP est bien connue pour son rôle de transporteur d'énergie à l’intérieur des cellules, mais en dehors de la cellule, elle agit en tant que molécule de signalisation extracellulaire. En se liant aux récepteurs purinergiques, l’ATP extracellulaire amorce la signalisation purinergique afin de réguler certains processus physiologiques et pathophysiologiques. Dans les poumons, l’ATP stimule la sécrétion de surfactant et promeut la clairance mucociliaire. Compte tenu du rôle critique de l’ATP extracellulaire dans les poumons, il est important de comprendre le mécanisme du relargage d’ATP cellulaire — la première étape de la signalisation purinergique. Parce que les forces mécaniques constituent le déclencheur principal du relargage d’ATP, cette thèse a pour but d’investiguer le(s) mécanisme(s) physiologique(s) et les sources cellulaires d’un tel relargage d’ATP mécanosensible. Cet ouvrage est divisé en trois parties : 1) Pour étudier les caractéristiques spatiales et temporelles du relargage d’ATP, j’ai développé une technique d’imagerie hautement sensible basée sur la bioluminescence de la luciférine-luciférase couplée avec un système de lentilles à grand champ de vision (WFOV, wide field of view) optimisant l’apport de lumière. Pour évaluer notre approche d’imagerie, j’ai soumis des cellules A549, dérivées d’un adénocarcinome pulmonaire humain, à un étirement ou un choc hypotonique de 50% pour déclencher un relargage d’ATP. J’ai démontré que notre technique nous permet de quantifier précisément la quantité et le taux (ou l’efflux) d’ATP s’échappant des cellules. Le WFOV constitue un outil essentiel utilisé dans les études décrites dans cette thèse pour déterminer le mécanisme et la source cellulaire du relargage d’ATP dans l’alvéole. 2) Afin d’examiner le mécanisme physiologique du relargage d’ATP induit par l’étirement dans les cellulaires alvéolaires primaires, j’ai déterminé les contributions individuelles des cellules alvéolaires de type 1 (AT1) en comparaison des cellules alvéolaires de type 2 (AT2). Pour ce faire, des cellules AT2 fraîchement isolées de poumons de rats ont été ensemencées sur une chambre flexible en silicone et cultivées jusqu’à sept jours, ce qui permettait aux cellules AT2 de se transdifférencier progressivement en cellules semblables aux cellules AT1. Le ratio des cellules alvéolaires (AT2:AT1), étant de 4:1 au jour 3, est devenu 1:4 au jour 7. La quantité d'ATP libérée diminuait avec le nombre décroissant de cellules AT2, les impliquant en tant que principale source pour le relargage d’ATP en réponse à un étirement. Alors que les modulateurs pharmacologiques des canaux d’ATP, carbenoxolone et probénécide, ne diminuaient pas la quantité d’ATP libérée, le BAPTA, un chélateur de calcium intracellulaire ([Ca2+]i), l’a significativement réduite. De même, ces trois modulateurs exercent des effets similaires sur les réponses calciques intracellulaires mesurées par le Fura-2, suggérant une connexion entre le relargage d’ATP et les niveaux de [Ca2+]i. 3) Pour explorer le rôle qu’ont les propriétés viscoélastiques de la membrane dans le relargage d’ATP mécanosensible, j’ai démontré qu’une déformation de 30% induisait un relargage d’ATP transitoire qui était accompagné d’une absorption d’iodure de propidium (PI, propidium iodide) chez des cellules AT2. Ceci est cohérent avec une rupture membranaire transitoire induite par une déformation, assez large pour le passage d’ATP et de PI. L’efflux d’ATP augmente aussi selon le taux de déformation, et la durée de déformation prolonge la demi-vie du relargage d’ATP. Donc, ces résultats fournissent des indices sur la manière dont l’étirement de la membrane viscoélastique peut mener au relargage d’ATP par un mécanisme alternatif impliquant une mécanoporation de la membrane cellulaire. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent que le relargage d’ATP ne se produit pas à travers les canaux conduisant l’ATP mais plutôt par une mécanoporation transitoire de la membrane. D’autres études sur les dommages membranaires sont nécessaires pour mieux comprendre sa contribution dans le relargage d’ATP mécanosensible et les signaux de [Ca2+]i. De telles études élucideront la signalisation purinergique dans les organes qui sont constamment exposés à des contraintes physiques. Ceci pourrait suggérer des cibles/approches thérapeutiques pour moduler les impacts négatifs d’un relargage d’ATP excessif observés lors de certaines conditions pathologiques, telles que les lésions pulmonaires induites par la ventilation mécanique.
ATP is widely known to be an energy carrier within cells, but outside of the cell, it acts as an extracellular signaling molecule. Upon binding to purinergic receptors, extracellular ATP initiates the purinergic signaling to regulate certain physiological and pathophysiological processes. In the lungs, ATP stimulates surfactant secretion and promotes mucociliary clearance. Given the critical role of extracellular ATP in the lungs, it is important to understand the mechanism of cellular ATP release — the first step of purinergic signaling. Because mechanical forces constitute the primary trigger of ATP release, this thesis aims to investigate the physiological mechanism(s) and cellular sources of such mechanosensitive ATP release. This work is divided into three parts: 1) To study the spatial and temporal characteristics of ATP release, I developed a highly sensitive imaging technique based on luciferin-luciferase bioluminescence coupled with a custom-designed lens system, which combined a wide field of view (WFOV) and high light-gathering power. To evaluate our imaging approach, I subjected A549 cells, derived from human lung adenocarcinoma, to stretch or 50% hypotonic shock to trigger ATP release. I demonstrated that our technique allows us to precisely quantify the amount and the rate (or efflux) of ATP escaping from cells. The WFOV constitutes an essential tool used in the studies described in this thesis to determine the mechanism and cellular source of ATP release in the alveolus. 2) To examine the physiological mechanism of stretch-induced ATP release in primary alveolar cells, I determined the individual contributions of alveolar type 1 (AT1) in comparison with alveolar type 2 (AT2) cells. To this end, freshly isolated AT2 cells from rat lungs were seeded on a flexible silicone chamber and were cultured for up to seven days, which allowed AT2 cells to progressively transdifferentiate into AT1-like cells. The ratio of alveolar cells (AT2:AT1), being 4:1 on day 3, became 1:4 on day 7. The quantity of released ATP decreased with the decreasing numbers of AT2 cells, implicating them as the main source of ATP release in response to stretch. While pharmacological ATP channel modulators, carbenoxolone and probenecid, did not diminish the amount of ATP release, BAPTA, an intracellular calcium ([Ca2+]i) chelator, significantly reduced it. Likewise, these three modulators had similar effects on intracellular calcium responses measured by Fura-2, suggesting a connection between ATP release and [Ca2+]i levels. 3) To explore the role of membrane viscoelastic properties in mechanosensitive ATP release, I demonstrated that a 30% strain induced transient ATP release that was accompanied by uptake of propidium iodide (PI) in AT2 cells. This is consistent with a strain-induced transient membrane rupture, big enough for the passage of ATP and PI. ATP efflux also increases with strain rate, and hold time prolongs the half-life of ATP release. Thus, these results provide clues on how stretching of the viscoelastic membrane may lead to ATP release via an alternate mechanism involving transient mechanoporation of the cell membrane. Overall, these findings demonstrate that stretch-induced ATP release does not occur through ATP-conducting channels but rather a transient membrane mechanoporation. Further studies on membrane injury induced by strain are needed to better understand its contribution to mechanosensitive ATP release and [Ca2+]i signaling. Such studies will elucidate purinergic signaling in organs that are constantly exposed to physical stresses. This could suggest novel therapeutic targets/approach to modulate the negative impacts of excessive ATP release observed under certain pathological conditions, such as ventilator-induced lung injury.