Добірка наукової літератури з теми "Biogenese de membrane externe"

AbstractMitochondrial energy conversion depends on an intricately folded membrane structure, generated by oligomerisation of ATP synthase dimers. However, morphology of cristae membranes varies greatly between different organisms. Recent studies have revealed the unique ATP synthase assemblies of the causative agents of toxoplasmosis and sleeping sickness, giving insight into the role of parasite-specific sub-units in complex assembly, mitochondrial function and parasite fitness.

Relevance. The process of production of outer membrane vesicles by bacteria is the main mechanism in intercellular communication and an intermediary in relationships of a very different nature (symbiosis, commensalism and parasitism), therefore, the study of the role of vesicles in the pathogenesis and immunogenesis of bacteria is an important and timely task.Aims. The purpose of this research was the analysis of scientific publications Russian and foreign journals for the period from 2002 to 2021 from the bibliographic databases of eLibrary.Ru, PubMed®, MEDLINE, dedicated to vesicles of outer membranes formed in various types of pathogenic and non-pathogenic bacteria.Conclusion. The study of the structure, factors of formation, functional significance of the mechanisms of action of bacterial vesicles, as well as the role of these structures in the pathogenesis and immunogenesis of various diseases, including especially dangerous ones, makes it possible to create new preventive drugs based on them. The use of vesicles as means of delivery of biological drugs and various antigens opens up new opportunities for improving the therapy and prevention of infections.

AbstractAt thylakoid membranes the light reactions of oxygenic photosynthesis take place, which are the source of virtually all life on earth. The VIPP1 protein is essential for the biogenesis and maintenance of thylakoid membranes. Recently, the cryo-EM structure of cyanobacterial VIPP1 has been solved and revealed that VIPP1 is a member of the ancient ESCRT-III family of membrane remodeling proteins. Here we discuss how VIPP1 structures relate to its multiple functions.

L’article anale congénitale est une affection rare, mais probablement sous-diagnostiquée chez le chien et le chat. Cette anomalie est due à une malformation embryologique et a été classée en quatre types anatomiques : - le type I désigne une ouverture incomplète de la membrane anale ; - le type II, une imperforation de la membrane anale avec un rectum se finissant au contact de la membrane ; - le type III, une imperforation de la membrane anale avec un rectum se finissant crânialement à la membrane anale ; - le type IV, une absence de continuité entre le rectum et le canal anal. Une fistule recto-vaginale est souvent rencontrée en association avec les anomalies de type II. Les symptômes sont en général observés entre l’âge de 2 semaines et le sevrage. Le traitement de ces malformations est chirurgical et consiste à rétablir un rectum et un anus fonctionnel. Le traitement doit être réalisé précocement pour éviter qu’un mégacôlon irréversible persiste après l’intervention. Lors de la correction chirurgicale, il est primordial de respecter le muscle sphincter anal externe et son innervation pour limiter les risques d’incontinence fécale. Le traitement chirurgical offre un pronostic en général favorable pour les anomalies les plus fréquemment rencontrées en clinique (atrésie de type I et de type II associées ou non à une fistule recto-vaginale).

Since 1998, nine bluetongue virus (BTV) strains from serotypes 1, 2, 4, 6, 8, 9 11, 16 and 25 have invaded Europe, killing more than two million animals (mainly sheep). Live attenuated vac­cines of BTV-2, 4, 9 and 16 have also been used in the region, in some cases causing further outbreaks of disease. Recent sequence analysis have shown that there have been cases of reassortment between field strains and live attenuated vaccine strains, hence the need for safer vaccines such as killed vaccines or recombi­nant protein-based subunit vaccines. The outer capsid protein VP2 of Culicoides-borne orbiviruses is the cell-attachment pro­tein, which carries sero-neutralization epitopes. We have cloned the open reading frame (ORF) (of segment 2) encoding VP2 and expressed the protein from BTV-4 in a bacterial expression sys­tem. The entire protein was found to be insoluble. Bioinformatic and evolutionary analysis showed that VP2 was composed of two ‘domains’, which were expressed separately using the same system. Optimization of expression conditions generated soluble proteins, indicating a correct fold of the expression products. These protein domains were used as antigens in mice experi­ments to raise antibodies against conformational epitopes. VP2 of BTV-4 was also expressed in a baculovirus system and was found to be soluble. The ORF encoding VP2 was cloned into a mammalian expression vector (pcDNA3.1) and is currently used (as a DNA vaccine) in animal experiments (using Chitosan as an adjuvant) to assess the antibody raising capacity of this formula­tion. One of the intended uses of this protein or its domains is to generate crystals for determination of the VP2 atomic structure using X-ray crystallography. VP5 of orbiviruses is a fusion pro­tein that is involved in membrane penetration during initiation of infection. The ORF (of genome segment 6) encoding VP5 of BTV-4 was cloned and expressed in the same bacterial system. Bioinformatic analysis also defined two domains of VP5. Only about 10% of the full length protein was soluble, while the two separated domains were over 90% soluble. Currently, VP5 and the two separate domains are being used in mice experiments to determine whether these can influence the immune response when concomitantly injected with the VP2 domains. VP5 was also cloned in pcDNA and used in mice experiments, formu­lated using Chitosan as an adjuvant. Antibodies collected from the mice reacted with the recombinant expressed VP5 showing high titres of antibodies. VP5 and its domains will also be used in X-ray crystallography. A plaque reduction assay was developed to determine whether the antibodies generated against VP2 domains or the VP2/VP5 mixture can neutralize virus infectivity in cell culture assays, opening the way for challenge assays in animals.

Dans le but d’améliorer le diagnostic direct de la chlamydiose abortive des petits ruminants, 225 écouvillons vaginaux prélevés de brebis et de chèvres ayant avorté ont été testés pour la recherche d’ADN de Chlamydophila en utilisant deux types de PCR, une PCR (CTU/CTL) spécifique des Chlamydiales et une PCR (CPS/CPC) spécifique des espèces Chlamydophila abortus et Chlamydophila pecorum. Le gène omp1 codant pour la protéine majeure de la membrane externe des Chlamydiales a été détecté par la PCR (CTU/CTL) dans 65 échantillons (29 p. 100) des prélèvements analysés dont 80 p. 100 avaient été réalisés dans un délai inférieur à quatre semaines après l’avortement. La majorité des prélèvements positifs par la PCR (CTU/CTL) (69 p. 100) provenaient de troupeaux reconnus positifs par le test de fixation du complément. La PCR spécifique d’espèce appliquée aux prélèvements positifs par PCR (CTU/CTL) n’a permis de détecter les fragments attendus de Chlamydophila abortus (1 800 pb) et de Chlamydophila pecorum (580 pb) que dans quatre des 65 prélèvements testés. Les autres prélèvements ont été négatifs (63 p. 100) ou non concluants (31 p. 100) avec des bandes non spécifiques de tailles intermédiaires. La restriction enzymatique des produits d’amplification (PCR-CTU/CTL) a révélé une grande diversité génétique parmi les 65 prélèvements testés. Seuls 15 prélèvements ont montré un profil de digestion typique de Cp. abortus, mais le reste des prélèvements (77 p. 100) ont montré des profils de Cp. pecorum ou proches de cette espèce. La culture sur cellules McCoy de 26 écouvillons vaginaux et produits d’avortements provenant d’animaux avortant et confirmés positifs pour la chlamydiose (sérologie et PCR) a révélé la présence de Chlamydophila dans huit prélèvements dont sept ont été caractérisés de type Cp. abortus et un de type Cp. pecorum. Les prélèvements restants n’ont donné aucun effet cytopathogène après cinq passages successifs, ou ils étaient contaminés. D’autres études ont été menées sur la souche Cp. pecorum, désignée M14, isolée pour la première fois au Maroc, pour tester sa virulence chez la souris. Ces résultats ont suggéré une variabilité génétique des souches abortives et une association de Chlamydophila pecorum aux avortements chez les ovins et les caprins au Maroc. Cette diversité génétique mérite d’être étudiée davantage pour orienter les stratégies de vaccination contre la chlamydiose abortive au Maroc.

L'enveloppe bactérienne est essentielle à de nombreuses fonctions cellulaires, comme le maintien de l'intégrité structurelle, la division cellulaire, la motilité, l'absorption des nutriments et la communication. Elle joue également un rôle crucial dans la pathogénicité bactérienne, faisant de son assemblage et de son maintien un domaine de recherche clé pour le développement de nouveaux antimicrobiens. Les enveloppes bactériennes présentent une dichotomie unique entre les structures monodermes (membrane unique) et didermes (double membrane). Traditionnellement, cette distinction correspond aux bactéries à Gram-positif (monodermes) et à Gram-négatif (didermes). On considérait initialement que les bactéries didermes avaient évolué à partir des monodermes par complexification progressive. Cependant, des études phylogénomiques récentes montrent que le dernier ancêtre commun bactérien (LBCA) était probablement déjà un diderme, et que la transition vers une structure monoderme s'est produite via des pertes indépendantes de la membrane externe (ME). Ces transitions ont principalement eu lieu chez les Terrabacteries, un sous-domaine regroupant des phylums comme les Cyanobactéries, Firmicutes et Actinobactéries. Les raisons de ces pertes d'ME chez les Terrabacteries restent floues, mais pourraient être liées à des mécanismes de biogenèse de la ME encore inconnus. Dans ma thèse, j'ai étudié la biogenèse de la ME sur deux modèles de Terrabacteries. Le premier est Veillonella parvula, une bactérie diderme du microbiome humain appartenant aux Firmicutes, mieux connus pour leurs modèles monodermes (Bacillus, Staphylococcus). J'ai caractérisé deux gènes (lap1 et lap2), associés aux didermes dans une analyses bioinformatique précédemment réalisée par le laboratoire, et montré leur rôle dans la biogenèse de la ME. J'ai montré que Lap1 et Lap2 sont localisés respectivement à la membrane cytoplasmique et à la ME. De manière surprenante, les mutations de Lap1-2 ont été compensées par des gènes de biosynthèse des lipides, y compris PlsA, une enzyme récemment découverte de synthèse d'étherlipides. Bien que je n'aie pas pu établir un lien direct entre plsA et la biogenèse de la ME, j'ai pu démontrer son rôle dans la résistance au stress oxydatif chez les bactéries. J'ai aussi développé un système CRISPR/Cas9 ciblant PlsA en profitant d'un test colorimétrique différentiel pour le WT et mutant de délétion plsA. De plus, j'ai identifié un nouveau transporteur putatif de glycérophospholipides et montré qu'il devenait essentiel en absence des protéines AsmA-like, suggérant un rôle dans le transport de ces lipides. J'ai également constaté que les Terrabacteria possédaient souvent une seule copie des protéines AsmA-like, tandis que les Gracilicutes en avaient plusieurs, suggérant l'existence d'autres transporteurs de glycérophospholipides. Le second modèle que j'ai étudié est Deinococcus radiodurans, une bactérie appartenant au phylum Deinococcota, dont l'enveloppe se distingue des modèles didermes classiques. J'ai retracé l'évolution du transporteur Lpt chez les Deinococcota, montrant qu'il s'est dupliqué avec un complexe prédit pour être impliqué dans le transport du lipopolysaccharide (LPS), et l'autre possédant un substrat encore inconnu. J'ai également montré que les Deinococcota ont perdu le LPS trois fois indépendamment. En étudiant les transporteurs Lpt chez D. radiodurans, j'ai découvert que le complexe impliqué autrefois dans le transport des LPS n'était pas important pour cette bactérie, tandis que la suppression du second complexe entraînait des défauts sévères. J'ai proposé que ce dernier soit impliqué dans l'exportation des lipoprotéines, basé sur des analyses de mutations compensatoires, la cryo-EM et la spectrométrie de masse
The bacterial envelope is essential for numerous cellular functions, including maintaining structural integrity, cell division, motility, nutrient uptake, and communication. It also plays a key role in bacterial pathogenicity, making its assembly and maintenance a critical area of research for new antimicrobial development. Bacterial envelopes exhibit a significant dichotomy, unique to the bacterial domain, between monoderm (single membrane) and diderm (double membrane) structures. Traditionally, this divide has been classified as 'Gram-positive' (monoderm) and 'Gram-negative' (diderm). Historically, it was thought that diderm bacteria evolved from monoderms through a gradual increase in complexity. However, recent phylogenomic studies challenge this view, suggesting that the last bacterial common ancestor (LBCA) was already a diderm, and that the shift to a monoderm architecture occurred through multiple independent losses of the outer membrane (OM). Interestingly, all these diderm-to-monoderm transitions are confined to the Terrabacteria subdomain, which includes phyla such as Cyanobacteria, Firmicutes, and Actinobacteria. The reasons for these OM losses specifically in Terrabacteria remain unknown but may be linked to unknown mechanisms unique to the OM biogenesis in this group. In my thesis, I studied the outer membrane biogenesis of two Terrabacteria model. The first model is Veillonella parvula, a diderm from the human microbiome that belongs to the Firmicutes which are better known for their monoderm models (Bacillus, Staphylococcus). I characterized two genes of unknown function (lap1 and lap2) which were previously associated to diderms in a bioinformatical analyses and found that they were involved in OM biogenesis and localized at the cytoplasmic membrane and OM respectively. Surprisingly, the deletions mutant of Lap1-2 was suppressed by lipid biosynthesis genes including a recently identified ether-lipid synthesis enzyme PlsA. While I could not associate the function of plsA in OM biogenesis, I could demonstrate its function in oxidative stress resistance for the first time in Bacteria. I also used a differential colorimetric assay between the WT and plsA deletion mutants to develop CRISPR/Cas9 using plsA as a target. I also identified a putative a new type of glycerophospholipid transporter and obtained preliminary data suggesting it becomes essential in a genomic background devoid of all copies of the recently discovered glycerophospholipid transporter family AsmA-like supporting its putative role. I also showed that AsmA-like proteins have higher copy numbers in Gracilicutes while Terrabacteria often have a single copy or none suggesting the existence of more glycerophospholipid transporters than previously known. Interestingly the newly identified putative transporter was more abundant in Terrabacteria. The second model I studied is Deinococcus radiodurans, a bacterium belonging to the phylum Deinococcota and whose envelope differs significantly from classical diderm models. I was able to retrace the evolutionary history of the lipopolysaccharide transporter Lpt in Deinococcota as I showed that it duplicated in this phylum with one complex predicted to be involved in LPS transport while the other was predicted to possess an unknown substrate. I showed that Deinococcota have lost LPS three times independently and studied the function of both Lpt transporters in D. radiodurans which has lost LPS. I found that the complex which used to be involved in LPS transport was not crucial to the physiology of D. radiodurans while the other complex led to grave defects in the bacterium when deleted. I suggested that this second complex is involved in lipoprotein export to the surface based on suppressor assays, cryo-EM and mass spectrometry

Les bactéries à Gram négatif comprennent un certain nombre d'agents pathogènes animaux redoutables qui sont particulièrement résistants aux thérapies antibiotiques grâce à la fonction protectrice de leur enveloppe bactérienne. L'enveloppe des bactéries à Gram négatif est composée d'une membrane interne (MI) et d'une membrane externe (ME), séparées par un espace, le périplasme, contenant le peptidoglycane (PG). Le feuillet externe de la bicouche de la ME contient des lipopolysaccharides (LPS) qui forment une barrière imperméable à certaines molécules toxiques, tels que les détergents ou des petites molécules hydrophobes. Les nutriments sont transportés par les protéines (OMP) de la ME. D'autres OMP remplissent des fonctions de biogenèse de l'enveloppe, notamment l'assemblage des OMP et des LPS. Les OMP sont assemblées dans la ME par le complexe d'assemblage en tonneau bêta (BAM), un hétéro-pentamère contenant l'OMP essentielle BamA et quatre lipoprotéines BamBCDE. L'assemblage du LPS nécessite une autre OMP essentielle, LptD, qui s'associe de manière stable avec la lipoprotéine LptE. Un assemblage défectueux des OMP provoque un stress de l'enveloppe et rend les bactéries Gram-négatives sensibles aux antibiotiques et aux détergents. Le complexe BAM représente donc une cible prometteuse pour le développement de nouveaux antibiotiques. La fonction moléculaire du complexe BAM dans la biogénèse des ME est mal comprise. En utilisant une stratégie de spectrométrie de masse quantitative, le laboratoire d'accueil a récemment identifié deux nouveaux interacteurs putatifs du complexe BAM, les lipoprotéines DolP (anciennement YraP) et YifL, toutes deux de fonctions inconnues. L'objectif de ce travail de thèse était de caractériser les rôles respectifs de DolP et YifL au sein du complexe BAM. DolP est une lipoprotéine de la ME de 20 kDa. L’accumulation d’OMP mal repliées dans le périplasme induit un stress de l’enveloppe qui, à son tour, stimule la production à la fois de BamA et de DolP. Cependant, le rôle de cette dernière dans la biogenèse des OMP n’est pas connu. Dans cette étude, en utilisant un crible génétique, nous avons montré que DolP est critique pour la croissance des cellules qui subissent un stress d'enveloppe. Nous avons montré que l’accumulation de BamA dans la ME est toxique pour les cellules mais que DolP est capable de contrecarrer cette toxicité en favorisant le bon repliement de BamA (Ranavaco-first; Yangco-first; Orenday-Tapiaco-first, et al., 2021). En parallèle, la caractérisation de l'interaction BAM-YifL a permis de montrer que YifL interagit avec BamA et BamD. De manière intéressante, nous avons découvert que YifL interagit également avec la machinerie de sécrétion des LPS, LptDE, qui est assemblée par le complexe BAM dans la ME. Ce processus nécessite également la machinerie de repliement oxydatif DsbA pour oxyder les 4 résidus de cystéine dans LptD de façon séquentielle. Une analyse génétique a montré que la délétion de yifL exacerbe la sensibilité des cellules bamB ou dsbA au SDS, un détergent normalement exclu par la couche de LPS. Nous avons constaté qu'en l'absence de YifL, LptD se fixe transitoirement au complexe BAM sous une forme intermédiaire partiellement oxydée. L'oxydation efficace de LptD pour former une protéine mature et fonctionnelle nécessite YifL. Nos résultats révèlent pour la première fois que YifL est critique pour la biogenèse efficace du complexe LptDE
Gram-negative bacteria include a number of dreadful animal pathogens that are particularly resistant to antibiotic therapies thanks to the sheltering function of their bacterial envelope. The envelope is composed of an inner and an outer membrane (IM and OM), and the separating periplasm containing the peptidoglycan (PG). The outer leaflet of the OM bilayer largely consists of lipopolysaccharide (LPS) that forms a permeability barrier against toxic molecules, including detergents and small hydrophobic molecules. Nutrients are transported via OM-spanning proteins (OMPs). Other OMPs perform envelope biogenesis functions, including the assembly of OMPs and LPS. OMPs are assembled into the OM by the beta-barrel assembly machinery (BAM), a heteropentamer containing the essential OMP BamA and four lipoproteins BamBCDE. The assembly of LPS requires another essential OMP, LptD, which stably associates with the lipoprotein LptE. Defective assembly of OMPs causes envelope stress and renders Gram-negative bacteria sensitive to antibiotics and detergents. Hence, the BAM complex represents a promising target for the development of new therapies. The mechanistic details of how the BAM complex functions ensuring efficient OM biogenesis are only marginally understood. By using a quantitative mass-spectrometry strategy the hosting lab has recently identified two novel putative interactors of the BAM complex of Escherichia coli, the lipoproteins DolP (formerly YraP) and YifL, both of unknown functions. The aim of this PhD thesis work was to characterize the roles of DolP and YifL at the BAM complex. DolP is a ~20 kDa OM lipoprotein that localizes in the periphery of E. coli cells and accumulates at the mid-cell specifically during a late step of cell division. DolP is upregulated during envelope stress caused by the accumulation of unfolded OMPs in the periplasm. Whether DolP plays any role in OMP biogenesis, however, was unknown. In this study, by using a genetic screen, we have shown that DolP is critical for the fitness of cells that undergo envelope stress. We have demonstrated that an increment of BamA in the OM, which is also upregulated during envelope stress, is potentially toxic for the cells. We provide evidence that DolP promotes proper folding and function of BamA thereby counteracting its toxicity. The mid-cell recruitment of DolP had been linked to regulation of septal peptidoglycan hydrolysis by an unknown mechanism. Our study reveals that during envelope stress DolP loses its association with the mid-cell, thus revealing a mechanistic link between impaired OMP biogenesis and a late step of cell division (Ranavaco-first; Yangco-first; Orenday-Tapiaco-first, et al., 2021). Next the BAM-YifL interaction was characterized. We showed that the ~7 kDa YifL interacts with BamA and BamD. Interestingly, we have found that YifL also interacts with the LPS secretory machinery LptDE, which is assembled by the BAM complex into the OM

La protéine BamB est une lipoprotéine de membrane externe appartenant au complexe BAM (β-Barrel Assembly Machinery) et impliquée dans l’assemblage des protéines de membrane externe (PME), la sensibilité aux antibiotiques, le contrôle de l’expression des trois systèmes de sécrétion de type III (T3SS) et la virulence de Salmonella. Chez E. coli, au sein du complexe BAM, elle interagit directement avec la protéine BamA. De plus, chez cette bactérie, BamB présente une activité sérine-thréonine kinase. Afin de mieux caractériser le rôle de BamB, nos objectifs ont été d’étudier (1) l’impact de l’altération de l’interaction de BamB avec le complexe BAM ou de sa séquestration dans le cytoplasme sur l’ensemble des rôles décrits de BamB et (2) l’activité kinase putative de BamB chez Salmonella. Nos résultats montrent que certains rôles de BamB sont dissociables entre eux et que l’interaction BamA/BamB n’est pas requise pour le rôle de BamB dans le contrôle de l’expression des T3SS, la virulence de Salmonella et l’assemblage des PME à la membrane externe. Aucune activité kinase ni aucune activité cytoplasmique de la protéine n’a pu être formellement démontrée
BamB is an outer-membrane lipoprotein belonging to the BAM complex (β-Barrel Assembly Machinery). In Salmonella, it is involved in the assembly of outer membrane proteins (OMP), in antibiotic susceptibility, in the transcriptional control of the three Type-Three-Secretion-Systems (T3SS) related genes and also in virulence. In E. coli, BamB interacts directly with the BamA protein. Moreover, BamB has been shown to have a serine-threonin kinase activity in this bacterium. In order to better characterize the roles of the BamB protein, our purposes were to study (1) the impact of the alteration of the interaction of BamB with the BAM complex or of its cytoplasmic sequestration and (2) its putative kinase activity in Salmonella. Our results show that some of the BamB roles are dissociable and that the BamA/BamB interaction is not required for T3SS expression, Salmonella virulence or OMP assembly in the outer membrane. Currently, neither a kinase activity nor a cytoplasmic activity has been clearly demonstrated for this protein

Les salmonelles, responsables de fièvres typhoïdes et gastro-entérites, sont un problème majeur de santé publique. Les systèmes de sécrétion de type III (TTSS) sont des facteurs de virulence cruciaux de Salmonella. Nos travaux ont montré que délétion du cadre ouvert de lecture yfgL conduit à une faible transcription des gènes codant les 3 TTSS conduisant à une baisse importante de la virulence de Salmonella Enteritidis. Or, la délétion de ce gène, dont la protéine chez E.coli est en complexe avec les protéines YaeT, YfiO, NlpB et SmpA, conduit à une altération de la membrane externe. Chez S. Enteritidis, nous avons montré que le rôle du complexe « YaeT » dans l’assemblage des protéines de membrane externe est conservé. Or, seule l’inactivation d’yfiO, conduit une diminution de l’expression des TTSS. Nos travaux ont toutefois suggéré que le défaut d’assemblage des protéines de membrane externe n’est pas la cause de ce défaut d’expression des TTSS observés chez les mutants yfgL et yfiO
Salmonella, responsible for typhoid fever and gastroenteritis, is a worldwide health problem. Type three secretion system (TTSS) are crucial virulence factors in Salmonella. Our work showed that deletion of the open reading frame yfgL led to a transcriptional down-regulation of the genes encoding the proteins involved in the biosynthesis of the 3 TTSS in Salmonella Enteritidis. It was shown that inactivation of yfgL whose encoded protein is in complex with YaeT, YfiO, NlpB and SmpA in E. coli, causes an outer membrane alteration. In S. Enteritidis, we observed that the role of the “YaeT” complex in outer membrane protein assembly is conserved in S. Enteritidis. In addition, only yfiO inactivation resulted in a down-expression of the TTSS. However, we presented elements suggesting that the outer membrane protein targeting defect was not responsible for the TTSS down-expression observed in the yfgL and yfiO mutants

La souche de P. aeruginosa PA14 est un isolat humain hautement virulent. PA14 possède deux îlots de pathogénicité. L'îlot de pathogénicité PAPI-1 de 108 kb est un élément intégratif et conjugatif (ICE), capable de s'auto-transférer à des souches de Pseudomonas par un mécanisme de conjugaison. Le mécanisme de transfert fait intervenir un pilus de Type IVb, encodé dans l'îlot PAPI-1. Mon travail de doctorat a eu pour but de caractériser à un niveau moléculaire le pilus de Type IVb (Pil-PAPI-1). J'ai d'abord, inséré un promoteur constitutif en place du promoteur endogène pour activer l'expression du locus pil2. J'ai démontré que 9 des 10 gènes sont requis pour le transfert d'ADN. J'ai ensuite initié la caractérisation de composants formant la machine de conjugaison. J'ai caractérisé le produit des gènes pilL2 et pilN2. J'ai démontré que PilL2 est une protéine de membrane externe (ME) et exposée dans le périplasme. Cette protéine est essentielle pour la fonctionnalité (transfert d'ADN) de la machinerie de conjugaison. Malgré ses caractéristiques prédites de lipoprotéine, aucune des mutations réalisées n'a pu modifier la localisation de ME de PilL2. J'ai aussi démontré que PilL2 forme un sous complexe de ME avec PilN2, la sécrétine du système. PilN2 forme des multimères stable, et présente les caractéristiques d'une liposécretine, capable d'auto-insertion et d'auto-multimérisation dans la ME. J'ai démontré que le N-ter de PilN2 mature est critique pour la formation d'un pore fonctionnel, mais n'est pas impliqué dans l'interaction avec PilL2. Ces résultats suggèrent que PilL2 et PilN2 forment un nouveau type de sous complexe de ME dans la famille des TFPb
The P. aeruginosa PA14 strain is a highly virulent human isolate. PA14 possesses two pathogenicity islands. The 108-kb pathogenicity island PAPI-1 is an integrative and conjugative element (ICE), capable of self-transferring to any recipient Pseudomonas strain, by a conjugative mechanism. The transfer mechanism is mediated by a Type IVb pilus, encoded within the PAPI-1 Island. My PhD work aimed to characterize this Type IVb pilus (Pil-PAPI-1) at a molecular level. The pil2 locus is poorly expressed under laboratory condition. I, first, introduced a constitutive promoter to turn on expression of the pil2 locus. I demonstrated that 9 of the 10 genes are required for DNA transfer. Then, I initiated the characterization of components forming the conjugation machinery. I characterized the products of pilL2 and pilN2 genes. I demonstrated that PilL2 is an OM protein and protruding in the periplasm. This protein is essential for the functionality (DNA transfer) of the conjugative TFPb machinery. Despite its predicted lipoprotein-hallmarks, none of the mutations engineered were able to abrogate the OM-localization of PilL2. We also demonstrated that PilL2 forms an OM sub-complex with PilN2, the secretin of the system. We provide evidence that PilN2 forms stable multimers, which presents the features of a liposecretin, capable of self-insertion and self-multimerization in the OM. We demonstrated that while the N-terminus of the mature PilN2 is required for the formation of a functional pore, it is not involved in interaction with PilL2. These results suggest that PilL2 and PilN2 could form new type of OM sub-complex in the TFPb family

Les protéines de la membrane externe de Leqionella pneumophila sérogroupes 1 à 8 ont été préparées, à partir d'un lysat bactérien, par solubilisation sélective au lauryl sarcosinate de sodium. Les protéines ainsi obtenues ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE) et transférées sur des feuilles de nitrocellulose. Des antisérums de lapin dirigés contre chacun des 8 sérogroupes de L. pneumophila ont été obtenus en immunisant chaque animal avec des bactéries vivantes. Les protéines tranfé- rées ont été révélées avec ces antisérums et des immunoglobulines de porc anti-immunoglobulines de lapins marquées à la peroxidase. Des déterminants antigéniques communs aux 8 sérogroupes ont été trouvés dans au moins 2 antigènes de la membrane externe (29 Kd et 45 Kd). Cependant, des expériences d'absorptions croisées ont révélé que ces antigènes auraient des déterminants antigéniques différents selon le sérogroupe. Ces résultats ne sont pas incompatibles avec ce que l'on connaît des protéines de la membrane externe des autres bactéries. Toutefois, certains indices nous laissent croire que notre préparation de protéines a pu être contaminée avec du lipopolysaccharide. Ceci expliquerait pourquoi les relations antigéniques observées avec les bandes de 29 et 45 Kd correspondent bien avec celles observées par immunofluorescence.
Montréal Trigonix inc. 2018

La proteine de la membrane externe, p64k (64 kda), du meningocoque neisseria meningitidis est une des proteines vaccinantes potentielles, envisagees dans la preparation d'un vaccin anti-meningite contre le serogroupe b. Cette proteine (599 residus) appartient a la famille des flavoproteines : elle possede un domaine dihydrolipoamide deshydrogenase (dldh, 482 residus) relie par un segment flexible (81 residus) a un domaine lipoique (86 residus) du cote de son extremite n-terminale. La p64k est l'une des premieres dldh caracterisee avec un domaine lipoique. La connaissance de sa structure tridimensionnelle, par la diffraction des rayons x, doit permettre de localiser les regions impliquees dans la reponse immunitaire. Les methodes du remplacement moleculaire et du remplacement isomorphe ont ete employees parallelement pour parvenir a la resolution de la structure. Un premier modele partiel du domaine dldh a ete determine par remplacement moleculaire. Le probleme des phases a ete resolu par la methode du remplacement isomorphe en utilisant le tamm (compose a 4 atomes de mercure) a 0,6 mm et le xenon a l'etat gazeux (13 bar) pour obtenir des derives lourds. Ces donnees ont valide le premier modele du domaine dldh obtenu remplacement moleculaire, puis ont permis de l'ameliorer et d'achever sa construction. Ce modele a ete affine a 2,7 a de resolution. Les donnees de diffraction enregistrees sur un cristal congele a une temperature de 140\c ont permis d'affiner le modele du domaine dldh a 2,23 a de resolution. Le domaine dldh adopte un repliement similaire a celui des dldh de structures connues. Le centre catalytique, situe a l'interface de l'homodimere, est forme par le fad, un pont disulfure intrahelical (cys161-cys166) et un residu histidine (his572*). La structure du domaine dldh en presence du nad + a ete determine a une resolution de 2,6 a. Le determinant antigenique majeur du domaine dldh a ete localise dans ce modele. Il est situe a la surface de la proteine et est constitue d'une boucle de 10 residus flanquee de deux brins. Un complexe de type antigene-anticorps entre le fragment fab d'un anticorps monoclonal et le domaine lipoique a ete prepare pour etendre l'etude structurale au domaine lipoique de la p64k. Les premiers essais de cristallisation de ce complexe antigene-anticorps ont ete debutes.

Nous avons etudie un canal localise sur la membrane externe mitochondriale et distinct de la porine mitochondriale. Ce canal, le peptide sensitive channel (psc), est bloque par deux classes distinctes de peptides basiques: des peptides issus de presequences et des peptides issus de proteines physiologiquement non reliees a la mitochondrie. Les caracteristiques electrophysiologiques de ce blocage sont compatibles avec un passage des peptides basiques a travers le canal. Ceci a conduit a proposer un role du psc dans la translocation des proteines mitochondriales. Nous avons etabli que les peptides issus des presequences sont importes in vitro dans la matrice mitochondriale et interferent avec la voie d'importation d'un precurseur chimere (preb2dhfr). En revanche, les autres peptides basiques actifs sur le psc sont importes dans l'espace intermembranaire et n'interferent pas avec cette voie. Nous avons montre que la dynorphine b (1-13), un peptide non mitochondrial actif sur le psc, etait transloque au sein de la membrane externe a travers ce canal confirmant ainsi ses proprietes de pore a peptides suggerees par l'electrophysiologie. Des experiences de reticulation chimique de la dynorphine b (1-13) avec des mitochondries de levure montrent que le psc est compose d'au moins un element du complexe d'importation des proteines mitochondriales, isp42. Nous avons confirme cette observation en montrant que l'immunodepletion de l'isp42 entrainait specifiquement une baisse de l'activite electrique du psc. L'implication du psc dans la translocation des proteines est verifiee par des experiences d'importation d'une proteine chimerique composee de la sequence de la dynorphine b (1-13) fusionnee en l'extremite n-terminale d'une proteine cytosolique. L'inhibition de cette importation par le peptide dynorphine b (1-13) montre l'implication du psc dans la translocation de cette proteine. Des experiences de proteolyse menagee de la surface mitochondriale montrent que des recepteurs de la membrane externe sont les elements qui discriminent les presequences mitochondriales des autres peptides basiques actifs sur le psc. Cette etape de reconnaissance specifique est suivie par une translocation au sein du meme pore aqueux qui presente les caracteristiques du psc. Le travail presente dans cette these montre que le psc est un authentique pore a proteines constitue d'isp42

Extracellular vesicles (EVs) are carriers of various biomolecules including bioactive enzymes, lipids, proteins, nucleic acids, and metabolites. EVs are classified into three main types based on their size, biogenesis, and cargo. Exosomes originate from endosomal membranes and are the smallest type of EV. Microvesicles (MVs) or microparticles are larger in size, and like apoptotic bodies which represent the largest type of EVs, both of these vesicles originate from outward budding of the plasma membrane. As discussed in this chapter, cargo loading of EVs and their release into the extracellular space where they can be taken up by neighboring or distant cells plays an important role in physiology and pathophysiology. This chapter will outline specific mechanisms involved in the loading and enrichment of miRNAs, proteins, and lipids within EVs. As explained here, various external and biological stimuli play a role in EV release. Finally, recent studies have shown that the biogenesis, cargo loading, and release of EVs are governed by circadian rhythms. Although EVs were once thought to serve as garbage disposals of cells, the numerous roles they serve in physiology and pathophysiology are now being appreciated.

Extracellular vesicles are molecules secreted by cells, wrapped in phospholipids and carrying some types of RNA, DNA and protein in their inner region. Extracellular vesicles are classified as apoptotic bodies, microvesicles, and exosomes based on their extent and formation process. Exosomes, which have the smallest structure, have received more attention than other extracellular vesicles. Exosomes contain different types of molecules in their structures. Cell membranes comprise a lipid bilayer and contain different cargo molecules and different surface receptors, depending on the cells of origin where biogenesis takes place. The biogenesis of exosomes begins within the endosomal system. Then they mature and are released out of the cell. The biogenesis of exosomes may be associated with the ESCRT complex and may depend on many molecules other than the ESCRT complex. Exosomes excreted by the origin cells are taken up by the target cells in different ways and show their effects. The effects of exosomes on their target cells may vary according to the cargo molecules they carry. They participate in cell-to-cell communication by sending different signals to distant or nearby target cells. Exosomes have a variety of pathological and physiological effects on disease and health. They have different effects on many diseases, especially cancer. They play an active role in cancer development, tumor microenvironment, angiogenesis, drug resistance and immune system. There are many diseases that can be used as a biomarker due to increased secretion from cells of origin in pathological conditions. In addition, exosomes can be utilized as drug transportation systems due to their natural structure. In addition, they are potential candidates as effective vaccines because of their effects on immune system cells or the effects of exosomes secreted from immune system cells.

Abstract Genetically determined peroxisomal disorders are divided into two major categories: (1) disorders of peroxisome biogenesis, in which the organelle is not normally formed, and (2) disorders that involve a single peroxisomal enzyme. The biochemical and gene defects in each of these disorders have been defined. A list of the disorders with pertinent references follows: X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is the most common peroxisomal disorder. Its frequency is estimated to be 1:17,000 and approaches that of phenylketonuria. The gene defect involves ABCD1, a gene that has been mapped to chromosome Xq28 and codes for a peroxisomal membrane protein, ALDP. The principal biochemical abnormality is the accumulation of saturated very long chain fatty acids (VLCFA), mainly hexacosanoic (C26:0) and tetracosanoic (C24:0), in tissues and also in plasma. X-linked adrenoleukodystrophy leads to progressive neurological disability. Approximately 70% of patients also have adrenal insufficiency (Addison disease), which responds well to adrenal hormone replacement therapy. X-linked adrenoleukodystrophy involves the X chromosome. Men, who have only one X chromosome, are thus more severely affected. Women, who have one abnormal X chromosome, are referred to as heterozygotes and are protected to a varying extent by their other X chromosome, which is nearly always normal. Early neurological and mental development is entirely normal in both boys and girls.

The vacuolar H+-ATPase (V-ATPase) is one of the most fundamental enzymes in nature. It pumps protons into the vacuolar system of eukaryotic cells and provides the energy for numerous transport systems. Through our BARD grant we discovered a novel family of membrane chaperones that modulate the amount of membrane proteins. We also elucidated the mechanism by which assembly factors guide the membrane sector of V-ATPase from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus. The major goal of the research was to understand the mechanism of action and biogenesis of V-ATPase in higher plants and fungi. The fundamental question of the extent of acidification in organelles of the vacuolar system was addressed by studying the V-ATPase of lemon fruit, constructing lemon cDNAs libraries and study their expression in mutant yeast cells. The biogenesis of the enzyme and its function in the Golgi apparatus was studied in yeast utilizing a gallery of secretory mutants available in our laboratories. One of the goals of this project is to determine biochemically and genetically how V-ATPase is assembled into the different membranes of a wide variety of organelles and what is the mechanism of its action.The results of this project advanced out knowledge along these lines.