Дисертації з теми "Analyses en cellules uniques"
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Laplatine, Loïc. "Résolution spatiale en microscopie par résonance de plasmon de surface à couplage par prisme." Thesis, Grenoble, 2014. http://www.theses.fr/2014GRENY044/document.
Анотація:
La microscopie par résonance de plasmon de surface (SPR) à couplage par prisme a vu le jour à la fin des années 60. Le principal avantage de cette technique d'imagerie optique réside dans sa très grande sensibilité à de faibles variations d'indice optique ou d'épaisseurs à la surface d'un métal. De ce fait, le suivi d'interactions biologiques peut se faire en temps réel sans avoir recours à l'utilisation de marqueurs fluorescents ou enzymatiques. Depuis plus de 30 ans, la microscopie SPR s'est imposée comme la technique de référence de biodétection sans marquage. Ses champs d'application vont de la détermination de constantes d'affinité à la détection de bactéries pathogènes, en passant par la biologie cellulaire. Jusqu'à présent, on pensait la résolution spatiale limitée par la longueur de propagation des plasmons de surface. Or, de nombreux exemples ne corroborent pas cette hypothèse. Dans cette thèse, nous montrons qu'à ce phénomène de propagation se rajoute des aberrations optiques induites par l'utilisation d'un prisme pour coupler la lumière et les plasmons de surface. Nous expliquons ainsi pourquoi les résolutions expérimentales étaient souvent bien moins bonnes que celles attendues. Par l'analyse de la formation des images et la quantification des aberrations, nous aboutissons à deux nouvelles configurations optiques optimisées pour la résolution. Nous analysons ensuite quel métal offre le meilleur compromis entre longueur de propagation et sensibilité. Expérimentalement, nous obtenons une résolution comprise entre 1,5 et 4 μm suivant la direction, sur des champs de vision de plusieurs mm2, et ce, avec une sensibilité standard en biodétection. Nous sommes ainsi en mesure d'observer simultanément plusieurs milliers de cellules individuelles, eucaryotes et procaryotes. Finalement, nous développons un prototype dédié au suivi en temps réel de sécrétions de protéines par des cellules immunitaires. Les limites de la microscopie SPR et les solutions qui permettraient de faire aboutir ce type d'étude sont examinées. Des études préliminaires sont aussi menées sur l'amélioration de la détection de bactériesPrism-based surface plasmon resonance (SPR) microscopy is an optical imaging technique invented in the late 60s'. Its main advantage lies in its high sensitivity to optical index or thickness variations at a metal surface. Therefore, the monitoring of biological reactions can be performed in real-time without labeling agent such as fluorescence or enzymes. Over the last 30 years, SPR microscopy has become the major technique in label-free biodetection. The field of application range from the determination of affinity constant in biochemistry to the detection of pathogenic bacteria via cellular biology. Until now, the propagation length of the surface plasmons has been considered as the spatial resolution limit. However, many examples do not support this statement. In this PhD thesis, we demonstrate that the resolution is also limited by optical aberrations induced by the prism used to couple light and surface plasmons. Thus, we are able to explain why the experimental resolution was usually worse than the predicted one. The analysis of the image formation and the quantification of aberrations lead us to suggest two new optical configurations optimized for resolution. We also analyze which metal exhibits the better trade-off between propagation length and sensitivity. Experimentally, we obtain a resolution between 1.5 and 4 μm depending on the direction, on field-of-view up to several mm2, and with a standard sensitivity for biodetection (monolayer of DNA). We are then able to observe simultaneously several thousands of individual eukaryote and prokaryote cells. Finally, we develop a prototype dedicated to the real-time monitoring of protein secretion by immune cells. The limits of SPR microscopy and the solutions which could allow this kind of study are discussed. Preliminary results on the improvement of bacterial detection are also presented
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Deprez, Marie. "Étude de l’hétérogénéité cellulaire et des dynamiques de régénération de l’épithélium respiratoire sain par analyses des signatures transcriptionnelles sur cellules uniques." Electronic Thesis or Diss., Université Côte d'Azur (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019AZUR6022.
Анотація:
Les progrès technologiques en séquençage haut débit et en manipulation cellulaire permettent d'analyser simultanément et indépendamment le contenu de nombreuses cellules (ARN, ADN,...). Cette révolution "omique" offre un nouveau cadre pour revisiter la "Théorie Cellulaire", essentiellement basée sur des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles. Les nombreuses modalités cellulaires désormais accessibles au niveau de la cellule unique, telles que leur transcriptome, leur localisation spatiale, leurs trajectoires développementales, enrichissent considérablement cette définition, et établissent un contexte totalement renouvelé pour réévaluer la définition de "types" ou d’"états" cellulaires ainsi que leurs interactions. \Mon travail de thèse a été de mettre en place des approches statistiques appropriées pour analyser ces données transcriptomiques sur cellule unique caractérisées par une forte variance, la présence d'un pourcentage élevé de valeurs nulles et un grand volume de données. Mon travail s’est focalisé sur le modèle expérimental central de mon laboratoire d’accueil, l'épithélium des voies respiratoires humaines. Les voies respiratoires humaines sont bordées d'un épithélium pseudo-stratifié composé principalement de cellules basales, sécrétrices, à gobelet et multiciliées. Les voies respiratoires constituent en outre un véritable écosystème cellulaire, dans lequel la couche épithéliale interagit étroitement avec les cellules immunitaires et mésenchymateuses. Cette coordination entre les cellules assure une bonne défense du système respiratoire et sa correcte régénération en cas d'agressions extérieures. Une meilleure compréhension des situations cellulaires normales et pathologiques peut améliorer les approches pour lutter contre des pathologies telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique, l'asthme ou la mucoviscidose.J'ai d'abord pu caractériser au niveau de la cellule unique la séquence précise et spécifique des événements conduisant à la régénération fonctionnelle de l'épithélium, en utilisant un modèle 3D de cellules humaines. J'ai identifié des hiérarchies de lignées cellulaires et j'ai pu reconstruire les différentes trajectoires possibles de différentiation cellulaire. J'ai confirmé des trajectoires cellulaires décrites précédemment, mais j'ai aussi découvert une nouvelle trajectoire reliant les cellules à gobelet aux cellules multiciliées, identifiant de nouvelles populations cellulaires et de nouvelles interactions moléculaires impliquées dans le processus de régénération de l'épithélium sain des voies aériennes humaines. J'ai ensuite construit un atlas des différents types cellulaires qui tapissent les voies respiratoires humaines saines, du nez jusqu’à la 12ième génération de bronches. Le profilage de 10 volontaires sains a généré un ensemble de données de 77 969 cellules, provenant de 35 emplacements distincts, qui comprend plus de 26 types cellulaires épithéliaux, immunitaires et mésenchymateuses. Cet atlas illustre l'hétérogénéité cellulaire présente dans les voies respiratoires. Son analyse révèle une différence d'expression des gènes entre le nez et les voies respiratoires pulmonaires que j’ai caractérisé dans les cellules suprabasales, sécrétrices et multiciliées. Mes travaux ont également permis d'améliorer la caractérisation de certaines populations de cellules rares, comme les cellules "hillock", déjà décrites chez la souris. En conclusion, mon travail contribue à une meilleure compréhension des dynamiques de différenciation et d'hétérogénéité cellulaire dans les voies respiratoires humaines saines. La ressource ainsi constituée sera extrêmement utile dans tout projet futur visant à analyser avec précision les conditions spécifiques des maladies respiratoiresImprovements made in nucleic acid sequencing and cell handling technologies now offer the opportunity to analyze simultaneously the content of numerous single cells (RNA, DNA, ...) by global and unbiased approaches. This single-cell ‘omics’ revolution provides a new framework to revisit the “Cell Theory”, elaborated over several centuries, and essentially based on morphological and functional features. The many cell modalities now accessible at single- cell level, such as their transcriptome, spatial localization, developmental trajectories, enrich considerably this definition, and set a renewed context to precisely reassess the definition of ‘cell types’, ‘cell states’ as well as their different interactions and fates.My thesis work initially set up ad hoc approaches and statistical framework to analyze appropriately these single-cell data, which deeply differ from standard bulk RNA-seq. High variance, presence of a huge percentage of null values, large volume of data are among the specific characteristics of these datasets. My work was centered on the main experimental model of my host laboratory, e.g. the human airway epithelium. Human airways are lined by a pseudostratified epithelium mainly composed of basal, secretory, goblet and multiciliated cells. Airways also constitute a true cellular ecosystem, in which the epithelial layer interacts closely with immune and mesenchymal cells. This coordination between cells ensures proper defense of the respiratory system and its correct regeneration in case of external aggression and injuries. A better understanding of the operating sequences in normal and physiopathological situations is relevant in pathologies such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma or cystic fibrosis.First, I characterized at a single cell level the precise and cell-specific sequence of events leading to functional regeneration of the epithelium, using a 3D model of human cells. I then built a single-cell atlas of the different cell types that are lining healthy human airways from the nose to the 12th generation of bronchi.By applying computational and statistical approaches, I have identified cell lineage hierarchies and was able to reconstruct a comprehensive cell trajectory roadmap in human airways. I not only confirmed previously described cell lineages, but I have also discovered a novel trajectory that links goblet cells to multiciliated cells, identifying novel cell populations and molecular interactors involved in the process of healthy human airway epithelium regeneration. The profiling of 12 healthy volunteers then generated a dataset of 77,969 cells, derived from 35 distinct locations. The resulting atlas is composed of more than 26 epithelial, immune and stromal cell types demonstrating the cellular heterogeneity present in the airways. Its analysis has revealed a strong proximo-distal gradient of expression in suprabasal, secretory, or multiciliated cells between the nose and lung airways. My work has also improved the characterization of rare cells, including “hillock” cells that have been previously described in mice.In conclusion, this work probably represents one of the first single-cell investigations in human airways. It brings original contributions to our understanding of differentiation’s dynamics and cellular heterogeneity in healthy human airways. The resulting resource will be extremely useful for any future single-cell investigators and also for establishing a very useful joint between clinical and biological works. As such, it will constitute a reference in any future project aiming to precisely analyze specific disease conditions
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Pagliaro, Sarah Beatriz De Oliveira. "Transcriptional control induced by bcr-abl and its role in leukemic stem cell heterogeneity. Single-Cell Transcriptome in Chronic Myeloid Leukemia: Pseudotime Analysis Reveals Evidence of Embryonic and Transitional Stem Cell States Single Cell Transcriptome in Chronic Myeloid Leukemia (CML): Pseudotime Analysis Reveals a Rare Population with Embryonic Stem Cell Features and Druggable Intricated Transitional Stem Cell States A novel neuronal organoid model mimicking glioblastoma (GBM) features from induced pluripotent stem cells (iPSC) Experimental and integrative analyses identify an ETS1 network downstream of BCR-ABL in chronic myeloid leukemia (CML)." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASQ032.
Анотація:
La leucémie myéloïde chronique est une hématopoïèse maligne clonale, caractérisée par l'acquisition de la translocation t (9;22) conduisant au chromosome Ph1 et à son homologue l'oncogène BCR-ABL, dans une cellule souche hématopoïétique très primitive. La LMC est un modèle de thérapies ciblées, car il a été démontré que la preuve de la faisabilité du ciblage de l'activité tyrosine kinase (TK) BCR-ABL à l'aide d'inhibiteurs de TK (TKI) entraîne des réponses et des rémissions majeures. Cependant, les problèmes actuels rencontrés dans ces thérapies sont la résistance des cellules souches leucémiques primitives et leur persistance qui serait liée à l'hétérogénéité des cellules souches au moment du diagnostic, ce qui conduit à la sélection clonale de cellules résistant aux thérapies TKI. J'ai appliqué la technologie de l'analyse du transcriptome des cellule uniques aux cellules de la LMC en utilisant un panel de gènes impliqués dans différentes voies, combinée à l'analyse d'inférence de trajectoire au modèle d'expression des gènes. Les résultats ont montré un état transitoire des cellules souches comprenant des gènes embryonnaires identifiés dans les cellules de la LMC au moment du diagnostic, ce qui pourrait contribuer à la résistance et à la persistance de la LSC. En outre, l'oncoprotéine Bcr-Abl est la tyrosine kinase constitutivement active produite par le gène chimérique BCR-ABL dans la leucémie myéloïde chronique (LMC). Les cibles transcriptionnelles de Bcr-Abl dans les cellules leucémiques n'ont pas été étudiées de manière approfondie. Une expérience de transcriptome utilisant la lignée cellulaire UT7 hématopoïétique exprimant BCR-ABL, a identifié la surexpression du facteur d'élongation eucaryote kinase 2 (eEF2K) qui joue un rôle majeur dans la survie des cellules en cas de privation de nutriments. Dans l'ensemble, les données suggèrent que la surexpression de eEF2K dans la LMC est associée à une sensibilité accrue à la privation de nutrimentsChronic myeloid leukemia is a clonal hematopoietic malignancy, characterized by the acquisition of the t (9;22) translocation leading to Ph1 chromosome and its counterpart BCR-ABL oncogene, in a very primitive hematopoietic stem cell. CML is a model of targeted therapies as the proof of concept of the feasibility of targeting the tyrosine kinase (TK) activity BCR-ABL using TK inhibitors (TKI) has been shown to lead to major responses and remissions. However, the current problems encountered in these therapies are primitive leukemic stem cells resistance and their persistence which is thought to be related to the heterogeneity of the stem cells at diagnosis leading to clonal selection of cells resisting to TKI therapies. I have applied the technology of single cell transcriptome analysis to CML cells using a panel of genes involved in different pathways combined with trajectory inference analysis to the gene expression pattern. The results showed a transitional stem cell states including embryonic genes identified in CML cells at diagnosis which could contribute to LSC resistance and persistence. Furthermore, the oncoprotein Bcr-Abl is the constitutively active tyrosine kinase produced by the chimeric BCR-ABL gene in chronic myeloid leukemia (CML). The transcriptional targets of Bcr-Abl in leukemic cells have not been extensively studied. A transcriptome experiment using the hematopoietic UT7 cell line expressing BCR-ABL, has identified the overexpression of eukaryotic elongation factor kinase 2 (eEF2K) which plays a major role in the survival of cells upon nutrient deprivation. Overall, the data suggest that overexpression of eEF2K in CML is associated with an increased sensitivity to nutrient-deprivation
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Labrunie, Antoine. "Matériaux « uniques » pour cellules solaires organiques mono-composant." Thesis, Angers, 2017. http://www.theses.fr/2017ANGE0044/document.
Анотація:
Au cours des dernières années, le développement des cellules organiques à réseaux interpénétrés a permis d’améliorer les rendements de conversion photovoltaïque (PV). Ces dispositifs incorporent une couche active constituée d’un mélange d’un matériau donneur d’électron (D) et d’un matériau accepteur d’électron (A). La réalisation de ces cellules requiert une optimisation minutieuse de ce mélange et de la morphologie de cette couche photo-active qui en résulte. Cette dernière peut cependant évoluer spontanément vers une ségrégation de phase, généralement délétère pour les performances PV. Une solution possible, et relativement peu étudiée, consiste à lier chimiquement le donneur D et l’accepteur A par un espaceur non-conjugué. Les travaux décrits dans ce manuscrit portent sur la synthèse et la caractérisation d’assemblages moléculaires de type D-σ-A ainsi que leur utilisation comme matériau dit « unique » pour la fabrication de cellules solaires organiques mono composant. Une première famille de dyades et triades à base d’un bloc donneur de type quaterthiophène a été étudiée. Cette partie décrit la méthodologie générale d’assemblage des blocs D et A via une réaction de cycloaddition de type Huisgen. Au cours des chapitres suivant, plusieurs dyades basées sur un bloc donneur « push-pull » ont été synthétisées puis caractérisées. Les performances PV de ces composés ont été évaluées au sein de cellules solaires mono-composant et les meilleurs rendements de conversion, atteignant 1.4 %, rivalisent avec l’état de l’artOver the last few years, the development of bulk heterojunction organic solar cells (BHJ OSCs) led to significant increase in photovoltaic (PV) efficiency. Such devices are based on interpenetrated networks of an electron-donor material (D) and an electron-acceptor material (A) constituting the active layer. Nevertheless a careful optimization of the morphology is required to reach high power conversion efficiency. Furthermore, this optimized morphology can evolve towards spontaneous phase segregation which can be detrimental for the PV performances. To circumvent these limitations, a relatively unexplored approach relies on the use of a material where the donor and the acceptor moieties are covalently linked to each other through a nonconjugated π-connector. In this context, the work reported herein describes the synthesis and characterization of various molecular D-σ-A assemblies, as well as their preliminary evaluation as “unique” material for the realisation of single component organic solar cells (SC-OSCs). A first family of dyads and triads, based on quaterthiophene moieties as donor block, was studied. A general methodology to assemble the two D and A blocks via a Huisgen-type click-chemistry is described. Then, in the next chapters, several dyads based on a “push-pull” donor block have been synthesized and characterized. The PV performances of these compounds have been evaluated in SC-OSCs leading to power conversion efficiency up to 1.4 %, a value close to the state of the art
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Geisler, Hubert. "Structuration d'hydrogels thermoactivables pour l'analyse de cellules uniques." Electronic Thesis or Diss., Université Paris sciences et lettres, 2020. http://www.theses.fr/2020UPSLS001.
Анотація:
Dans cette thèse est présentée une nouvelle technologie microfluidique de capture de cellules uniques basée sur l’utilisation d’hydrogels thermoactivables. Nous utilisons notamment le PolyNIPAM, un polymère dont le volume est augmenté dans l'eau de 400% lorsque la température est inférieure à 32°C et est dégonflé lorsque la température est supérieure à 34°C. Nous exploitons ce gonflement réversible pour ouvrir et fermer des compartiments intégrés dans une chambre microfluidique.Le greffage et la structuration de ces motifs d’hydrogel repose sur la chimie click thiol-ène, initiée par voie thermique ou par irradiation UV. Nous avons développé des méthodes et procédés de microfabrication dans le but de diversifier les substrats d’accroche (du verre vers le PDMS, COC, PMMA, etc), d’élargir la gamme des épaisseurs des structures réalisables (de quelques microns vers la dizaine de microns d’épaisseur) et de renforcer nos connaissances concernant l'incidence de la fabrication sur le comportement de l’hydrogel. Un protocole de photolithographie robuste est finalement obtenu permettant le design de toute sorte de motif 2D sur différents choix de substrat. Une application possible détaillée par la suite est le développement de ces puces microfluidiques capables de capturer des cellules uniques dans des compartiments en hydrogel. (confidentiel)We present in this work a new microfluidic technology aiming at isolating single cells by the use of thermoactuable polymers. One of the polymers we use is polyNIPAM, a polymer that can expand its volume by 400% in water when the temperature is set under 32°C and can shrink down when it is set over 34°C. We use this reversible swelling capability to open and close compartments embedded in a microfluidic chip.Grafting and structuring these hydrogel features relies on thiol-en click chemistry, initiated thermally or by UV irradiation. We have developed methods and microfabrication protocols in order to diversify the substrate materials (from glass to PDMS, COC, PMMA, etc), to expand the structures thickness range (from few microns to a tenth of microns) and to strengthen our knowledge regarding the fabrication impact on the hydrogel’s behavior. A robust protocol of photolithography has finally been worked on allowing the design of any type of 2D features on a large choice of substrates.One of the realistic applications detailed here is the development of microfluidic chips aiming at isolating single cells in hydrogel compartments. (confidential)
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Vianay, Benoit. "Adhérence de cellules uniques sur supports micro-structurés." Phd thesis, Grenoble 1, 2009. http://www.theses.fr/2009GRE10329.
Анотація:
L'adhérence cellulaire est un processus vital impliqué dans de nombreux phénomènes biologiques fondamentaux comme la diérenciation, la réparation tissulaire ou encore le développement cellulaire. Cette thèse porte sur une étude alliant expériences et modélisation de cellules uniques en adhérence sur des supports micro-structurés Les résultats montrent que la contrainte géomé- trique imposée par les supports à contraste adhésif limite l'adhérence. Au-delà de cette limitation, une organisation reproductible du cytosquelette d'actine est observée cela suggère l'existence de lois physiques simples régissant ce processus. Nous avons développé une méthode de classication des formes géométriques élémentaires observées expérimentalement nous permettant d'obtenir des statistiques robustes. En nous basant sur le modèle de Potts Cellulaire, nous avons pu reproduire les résultats expérimentaux. Ce modèle énergétique démontre que les formes élémentaires sont des états métastables utilisés par les cellules au cours de l'adhérence. Les paramètres du modèle sont reliés aux paramètres biologiques pertinents. Nous présentons des résultats qui relient la courbure des interfaces aux paramètres biologiques. Nous montrons que la mesure expérimentale de cette courbure est une représentation de la compétition entre la contractilité des bres de stress et l'élasticité du gel d'actine. Une correspondance entre les propriétés physiques issues du modèle et les processus biochimiques régulant et organisant l'adhérence cellulaire est ainsi possibleThe cell adhesion is a critical process involved in many fundamental biological phenomena as dierentiation, tissue repair or cell development. This thesis focuses on a study combining experiments and modelization of single cells spreading on micro-fabricated substrates. Experimental results show that the geometrical constraint imposed by the adhesiveness contrast limits the adhesion. Beyond this limitation, a reproducible organization of the actin cytoskeleton of cells spreading on micro-structured materials suggests that simple physical laws govern the process. We have developed a classication method of basic geometrical shapes observed experimentally to obtain robust statistics. Based on the Cellular Potts model, we reproduced experimental results. This energetical model shows that the basic shapes are metastable states used by cells during spreading. The model parameters are linked to relevant biological parameters. We present results that connect the curvature of interfaces to biological parameters. We show that the experimental measurement of this curvature represents the competition between the contractility of stress bers and the elasticity of the actin gel. A correspondence between the physical properties in the model and the biochemical processes that regulate and organize the cellular adhesion is possible
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Vianay, Benoit. "Adhérence de cellules uniques sur supports micro-structurés." Phd thesis, Grenoble 1, 2009. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00455350.
Анотація:
L'adhérence cellulaire est un processus vital impliqué dans de nombreux phénomènes biologiques fondamentaux comme la diérenciation, la réparation tissulaire ou encore le développement cellulaire. Cette thèse porte sur une étude alliant expériences et modélisation de cellules uniques en adhérence sur des supports micro-structurés Les résultats montrent que la contrainte géomé- trique imposée par les supports à contraste adhésif limite l'adhérence. Au-delà de cette limitation, une organisation reproductible du cytosquelette d'actine est observée cela suggère l'existence de lois physiques simples régissant ce processus. Nous avons développé une méthode de classication des formes géométriques élémentaires observées expérimentalement nous permettant d'obtenir des statistiques robustes. En nous basant sur le modèle de Potts Cellulaire, nous avons pu reproduire les résultats expérimentaux. Ce modèle énergétique démontre que les formes élémentaires sont des états métastables utilisés par les cellules au cours de l'adhérence. Les paramètres du modèle sont reliés aux paramètres biologiques pertinents. Nous présentons des résultats qui relient la courbure des interfaces aux paramètres biologiques. Nous montrons que la mesure expérimentale de cette courbure est une représentation de la compétition entre la contractilité des bres de stress et l'élasticité du gel d'actine. Une correspondance entre les propriétés physiques issues du modèle et les processus biochimiques régulant et organisant l'adhérence cellulaire est ainsi possible.
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Lu, Cong. "Analyse microélectrochimique du stress oxydant à l'échelle de la cellule unique : application aux cellules cancéreuses du sein." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00828217.
Анотація:
Les quantités et flux infinitésimaux de biomolécules électroactives émises par une cellule unique isolée en boite de Pétri peuvent être mesurés en temps réel par une ultramicroélectrode placée au contact de la cellule sécrétrice. Le travail présenté dans ce manuscrit a pour but d'étendre cette méthodologie analytique d'utilisation des microélectrodes de carbone platiné à l'étude du lien entre stress oxydant et l'effet de substances anti-cancéreuses (FcdiOH, DP1 et Fc-OH-TAM) sur des cellules tumorales du sein. Le signal ampérométrique est collecté par une microélectrode de carbone platiné positionnée à une centaine de nanomètres au-dessus d'une cellule tumorale du sein et incubée en présence d'espèces anticancéreuses de type ferrocifènes. La libération in situ des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et de l'azote (RNS), i.e., H2O2, ONOO-, NO et NO2-, par ces cellules (MCF7 et MDA-MB-231) est analysée. Les études morphologiques montrent que les produits FcdiOH, DP1 et Fc-OH-TAM présentent un effet anti-prolifératif significatif. Le traitement avec Fc-diOH et surtout DP1 augmente significativement la production de ROS. Par contre, Fc (témoin) et Fc-OH-TAM n'ont pas ou très peu d'effet. Cela est assez surprenant pour Fc-OH-TAM, qui a l'effet anti-prolifératif le plus fort parmi les ferrocifènes testés. Fc-diOH et DP1, quant à eux, semblent induire une surproduction de NO° et/ou de NO2-, ainsi que du peroxyde d'hydrogène. Cette comparaison inédite entre études morphologiques et électrochimiques tend à montrer que les ferrocifènes agissent par deux voies qui sont complémentaires, soit via la formation de quinone méthide (Fc-OH-TAM), soit par réaction directe (DP1, Fc-diOH).
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Woringer, Maxime. "Tools to analyze single-particle tracking data in mammalian cells." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS419.
Анотація:
Ce travail présente des outils pour analyser la régulation de la transcription dans les cellules eucaryotes, en particulier pour le suivi de facteurs de transcription (TF) individuels dans les cellules de mammifères. Un noyau de cellule eucaryote est complexe et contient de nombreuses molécules (ADN, ARN, protéines, ATP, etc). Ces molécules interagissent avec des TF et influencent la transcription. Certaines de ces interactions peuvent être étudiées par des techniques de biochimie. La plupart, en particulier les interactions faibles, non covalentes, sont invisibles par ces méthodes. La microscopie de cellules vivantes et le suivi de molécules uniques (SPT en anglais) sont de plus en plus utilisées pour étudier ces phénomènes. L'inférence des paramètres biophysiques d'un facteur de transcription, par exemple son coefficient de diffusion, son nombre de sous-populations ou son temps de résidence sur l'ADN sont cruciaux pour comprendre sa dynamique et son influence sur la transcription. Des outils validés et précis sont donc nécessaires pour analyser les données de SPT. Pour être utile, un outil de SPT doit être non seulement validé, mais aussi accessible à des non-programmeurs. Ils doivent aussi tenir compte des biais expérimentaux présents dans les données. Nous proposons un outil d'analyse de SPT, qui se fonde sur l'estimation du propagateur de la diffusion. Ce outil a été validé et est accessible par une interface web. Nous avons montré qu'il donne des résultats proches de l'état de l'art. Il a été testé dans deux cadres : (1) l'étude de la diffusion augmentée par la catalyse enzymatique in vitro et (2) l'analyse de la dynamique du TF c-Myc dans des cellules de mammifèresThis work aims at providing tools to dissect the regulation of transcription in eukaryotic cells, with a focus on single-particle tracking of transcription factors in mammalian cells. The nucleus of an eukeryotic cell is an extremely complex medium, that contains a high concentration of macromolecules (DNA, RNA, proteins) and other small molecules (ATP, etc). How these molecules interact with transcription factors, and thus influence transcription rates is an area of intense investigations. Although some of these interactions can be captured by regular biochemistry, many of them, including weak, non-covalent interactions remain undetected by these methods. Live-cell imaging and single-particle tracking (SPT) techniques are increasingly used to characterize such effects. The inference of biophysical parameters of a given transcription factor (TF), such as its diffusion constant, the number of subpopulations or its residence time on DNA, are crucial to understanding how TF dynamics and transcription intertwine. Accurate and validated SPT analysis tools are needed. To be used by the community, SPT tools should not only be carefully validated, but also be easily accessible to non-programmers. They should also be designed to take into account known biases of the imaging techniques. In this work, we first propose a tool, accessible through a web interface, based on the modeling of the diffusion propagator. We validate it extensively and show that it exhibits state-of-the art performance. We apply this tool to two experimental settings: (1) the study of catalysis-enhanced diffusion in-vitro and (2) the analysis of the dynamics of the c-Myc transcription factor in mammalian cells
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Foulon, Sophie. "Développement du séquençage ARN ciblé sur cellules uniques en microfluidique de gouttes et applications." Thesis, Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019PSLET037.
Анотація:
Les technologies d'analyse à l'échelle de la cellule unique ont vu le jour il y a quelques années et sont depuis en constante évolution. Ces technologies permettent de mieux comprendre le fonctionnement d'ensemble de cellules très hétérogènes. Elles permettent par exemple de découvrir et suivre des sous types cellulaires, avec des applications en cancérologie ou encore en neurobiologie. Nous avons développé une technologie pour étudier le profil d'expression de gènes d'intérêt au niveau d'une cellule unique, en utilisant la microfluidique en gouttes. En limitant le nombre de gènes étudiés comparé aux technologies commerciales de transcriptome entier, l’approche ciblée a plusieurs avantages potentiels : gagner en profondeur de séquençage, augmenter le nombre de cellules étudiées, optimiser la détection pour les bas niveaux d’expression, tout en réduisant la complexité des données et des coûts. Le ciblage est parfois indispensable, notamment lorsque les ARNs ne portent pas de séquence d’amorce générique, comme dans le cas des ARNs viraux. Deux applications sont présentées : l'analyse de l'inflammation des cellules immunitaires du cerveau aux premières étapes du développement, ainsi que l'étude de la recombinaison génétique chez le virusSingle cells technologies were introduced a few years ago and have been dramatically evolving ever since. These technologies have revolutionized biology, making it possible to better understand how heterogeneous cell systems works. For example, they permit to discover and follow cell subtypes, with applications in oncology or neurobiology. We have developed a technology to study the expression profile of genes of interest at the level of a single cell, using droplet-based microfluidics. By limiting the number of genes studied compared to commercial whole-transcriptome technologies, the targeted approach has several potential benefits: gaining deeper sequencing, increasing the number of cells studied, optimizing detection for low levels of expression, while reducing the complexity of data and costs. Targeting is sometimes essential, especially when the RNAs do not carry a generic primer sequence, as in the case of viral RNAs. Two applications are presented: the analysis of inflammation of the immune cells of the brain in the early stages of development, as well as the study of genetic recombination in the virus
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Bontoux, Nathalie. "Analyse du transcriptome d'une cellule unique à l'aide d'une puce microfluidique." Paris 6, 2006. http://www.theses.fr/2006PA066600.
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Tamra, Amar. "Spectroscopie diélectrique hyperfréquence de cellules individualisées sous électroporation." Thesis, Toulouse 3, 2017. http://www.theses.fr/2017TOU30011/document.
Анотація:
L'électroporation est un procédé physique qui consiste à appliquer des impulsions de champ électrique pour perméabiliser de manière transitoire ou permanente la membrane plasmique. Ce phénomène est d'un grand intérêt dans le domaine clinique ainsi que dans l'industrie en raison de ses diverses applications, notamment l'électrochimiothérapie qui combine les impulsions électriques à l'administration d'une molécule cytotoxique, dans le cadre du traitement des tumeurs. L'analyse de ce phénomène est traditionnellement réalisée à l'aide des méthodes optique et biochimique (microscopie, cytométrie en flux, test biochimique). Elles sont très efficaces mais nécessitent l'utilisation d'une large gamme de fluorochromes et de marqueurs dont la mise en œuvre peut être laborieuse et coûteuse tout en ayant un caractère invasif aux cellules. Durant ces dernières années, le développement de nouveaux outils biophysiques pour l'étude de l'électroporation a pris place, tels que la diélectrophorèse et la spectroscopie d'impédance (basse fréquence). Outre une facilité de mise en œuvre, ces méthodes représentent un intérêt dans l'étude des modifications membranaires de la cellule. De là vient l'intérêt d'opérer au-delà du GHz, dans la gamme des micro-ondes, pour laquelle la membrane cytoplasmique devient transparente et le contenu intracellulaire est exposé. L'extraction de la permittivité relative suite à l'interaction champ électromagnétique/cellules biologiques reflète alors l'état cellulaire. Cette technique, la spectroscopie diélectrique hyperfréquence, se présente comme une méthode pertinente pour analyser les effets de l'électroporation sur la viabilité cellulaire. De plus, elle ne nécessite aucune utilisation des molécules exogènes (non-invasivité) et les mesures sont directement réalisées dans le milieu de culture des cellules. Deux objectifs ont été définis lors de cette thèse dont les travaux se situent à l'interface entre trois domaines scientifiques : la biologie cellulaire, l'électronique hyperfréquence et les micro-technologies. Le premier objectif concerne la transposition de l'électroporation conventionnelle à l'échelle micrométrique, qui a montré une efficacité aussi performante que la première. La deuxième partie du travail concerne l'étude par spectroscopie diélectrique HyperFréquence de cellules soumises à différents traitements électriques (combinés ou non à une molécule cytotoxique). Ces travaux présentent une puissance statistique et montrent une très bonne corrélation (R2 >0 .94) avec des techniques standards utilisées en biologie, ce qui valide 'biologiquement' la méthode d'analyse HF dans le contexte d'électroporation. Ces travaux montrent en outre que la spectroscopie diélectrique hyperfréquence s'avère être une technique puissante, capable de révéler la viabilité cellulaire suite à un traitement chimique et/ou électrique. Ils ouvrent la voie à l'analyse 'non-invasive' par spectroscopie diélectrique HyperFréquence de cellules électroporées in-situElectroporation is a physical process that consists in applying electric field pulses to transiently or permanently permeabilize the plasma membrane. This phenomenon is of great interest in the clinical field as well as in the industry because of its various applications, in particular electrochemotherapy which combines electrical pulses with the administration of a cytotoxic molecule in the treatment of tumors. The evaluation of this phenomenon is raditionally carried out using optical and biochemical methods (microscopy, flow cytometry, biochemical test). They are very effective but require the use of a wide range of fluorochromes and markers, which can be laborious and costly to implement, while being invasive to the cells. In recent years, the development of new biophysical tools for the study of electroporation has taken place, such as dielectrophoresis and impedance spectroscopy (low frequency). In addition to the ease of implementation, these methods are of interest in the study of membrane modifications of the cell. Hence the advantage of operating beyond the GHz, in the range of microwaves, for which the cytoplasmic membrane becomes transparent and the intracellular content is exposed. The extraction of the relative permittivity as a result of the electromagnetic field / biological cell interaction then reflects the cell state. This technique, microwave dielectric spectroscopy, is a relevant method for analyzing the effects of electroporation on cell viability. Moreover, it does not require any use of the exogenous molecules (non-invasive) and the measurements are directly carried out in the culture medium of the cells. Two objectives were defined during this thesis whose work is located at the interface between three scientific fields: cellular biology, microwave electronics and micro-technologies. The first objective concerns the transposition of conventional electroporation to the micrometric scale, which has shown an efficiency as efficient as the first. The second part of the work concerns the study by HighFrequency dielectric spectroscopy of cells subjected to different electrical treatments (combined or not with a cytotoxic molecule). This work presents a statistical power and shows a very good correlation (R2> 0.94) with standard techniques used in biology, which biologically validates the HF analysis method in the context of electroporation. This work also shows that microwave dielectric spectroscopy proves to be a powerful technique capable of revealing cell viability following chemical and / or electrical treatment. They open the way to 'non-invasive' analysis by hyper-frequency dielectric spectroscopy of electroporated cells in situ
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Lombard, Alain. "QuanTI-FRET, un outil d'imagerie pour l'analyse de la mécanotransduction dans les cellules vivantes uniques." Thesis, Université Grenoble Alpes, 2020. http://www.theses.fr/2020GRALY055.
Анотація:
De nombreux processus cellulaires élémentaires (migration, différentiation, mort) sont contrôlés par des ensembles d'acteurs reliés entre eux par des réactions en cascade. Certains de ces réseaux de signalisation convertissent des signaux mécaniques extérieurs à la cellule en signaux biochimiques internes, processus appelé mécanotransduction. Nous cherchons à étudier ces réseaux dans une approche de traitement du signal, pour déterminer expérimentalement un analogue de la fonction de transfert en espace et temps pour la mécanotransduction.Le contrôle de la variable d'entrée mécanique est assuré par différents types de substrats 2D que nous avons mis en place, comme la simple surface de verre, des motifs géométriques d'adhérence, et des substrats magnéto-actifs (composés de micro-piliers insérés dans un élastomère) pouvant stimuler localement et dynamiquement les cellules.La mesure de la variable de sortie biochimique est assurée par des biosenseurs FRET. La fluorescence qu'ils émettent est collectée à travers un microscope de fluorescence en champ large inversé. Nous avons mis en place le calcul de l'efficacité de FRET quantitative à partir de cette fluorescence sans l'utilisation de standards de FRET. Elle donne accès à l'activité en espace et en temps de certaines molécules des réseaux de signalisation.Quelques outils sont enfin présentés comme potentiels candidats pour réaliser la fonction de transfert, parmi lesquels des combinaisons de méthodes de corrélations, et la décomposition en valeurs singulières utilisée en acousto-optique. La combinaison de ces outils et méthodes reste complexe, notamment pour mettre en évidence un comportement biologique à partir d'une grandeur quantitative. Les premiers usages de ces outils ne présentent pas de résultat biologique majeur, mais sont prometteurs pour étudier la mécanotransductionMany elementary cellular processes (migration, differentiation, death) are controled by a set of agents linked together by cascade reactions. Some of these signaling networks convert mechanical signals external to the cell into internal biochemical signals, a process called mechanotransduction. We seek to study these networks through a signal processing approach, in order to experimentally determine an analogous of the transfer function in time and space for mechanotransduction.Controlling the input variable is done by different type of 2D substrates which have been developped, from the simple glass surface, the adherent geometrical patterns, to the magneto-active substrates (composed of micro-pillars inserted into an elastomer) capable of stimulating locally and dynamically the cells.Measuring the biochemical output variable is done by FRET biosensors. The fluorescence emitted is collected through an inverted widefield fluorescence microscope. We set up the quantitative FRET efficiency calculus from this fluorescence without using FRET standards. It gives access to the activity in space and time of some molecules of network signalisation.Some tools are finally presented as potential candidates to perform the transfer function, among them are combination of correlation methods, and singular value decomposition used in acousto-optics. Combiantion of these tools and methods remains complex, particularly to highlight a biological behaviour from a quantitative quantity. The first use of these tools do not give any biological result, but are promising to study mechanotransduction
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Traboulsi, Abdel-Meneem. "Étude à moyen-débit de la localisation d'ARNm dans les cellules humaines." Thesis, Montpellier, 2017. http://www.theses.fr/2017MONTT117.
Анотація:
La localisation d’ARNm a été découverte en 1983 dans les ovocytes et les embryons des ascidies. Depuis, plusieurs exemples d'ARN localisés ont été trouvés dans de nombreux organismes, y compris les plantes, les levures, les champignons, les insectes, les poissons et les mammifères. Les ARNm localisés contribuent à de nombreuses fonctions biologiques, telles que le développement embryonnaire, la division cellulaire asymétrique, la migration cellulaire, la signalisation, la plasticité neuronale et plein d’autres ...Jusqu'à présent, quelques études ont analysé la localisation d’ARNm de manière systématique. Trois d'entre eux ont été effectués chez la drosophile pendant l'embryogenèse, l'oogenèse ou le stade larvaire et ont analysé environ 16000 ARN au total. Les deux autres études ont été réalisées dans des cellules de mammifères et ont analysé près de 1000 ARNm chacune. Ces études ont montré l'importance de la localisation d’ARNm dans les cellules humaines et son implication dans différents processus biologiques. L'objectif de ma thèse était donc d'augmenter le débit des techniques FISH à l’échelle de molécule unique (smFISH) et d'étudier la localisation d’ARNm dans les cellules HeLa de manière systématique.Une limitation de smFISH est le coût de sondes fluorescentes, qui limite le nombre d'ARNm qui peut être analysé. Par conséquent, j'ai développé un protocole alternatif dans lequel des sondes pour de nombreux gènes ont été synthétisées comme un pool d'oligonucléotides (40 par gène en moyenne, plus de 12000 au total). Les sondes spécifiques d’un ARNm donné ont ensuite été amplifiées par PCR et converties en simple brin par transcription in vitro. J'ai généré un protocole complet, à partir de la conception de la sonde et jusqu'à l'acquisition de l'image. Je me suis intéressé à l’étude des ARNm du cycle cellulaire. En effet, les gènes du cycle cellulaire ont été largement étudiés au niveau de la protéine, mais on sait peu de choses sur la localisation de leurs ARNm. Pendant la mitose, les cellules subissent d'importantes modifications morphologiques et la traduction locale pourrait être un moyen d'atteindre la localisation des protéines. Le screening sur ces ARNm est en cours.Parallèlement à ces expériences, j'ai réalisé des expériences de smFISH sur 100 gènes choisis au hasard et 50 régulateurs de la transition G2/M du cycle cellulaire, en utilisant un protocole de smFISH classique. Dans cette configuration, on disposait d'une collection de lignées cellulaires HeLa, dans laquelle chaque cellule contient un chromosome artificiel bactérien avec le gène d'intérêt marqué au GFP. Par conséquent, en utilisant des sondes qui s'hybridaient à la séquence GFP, je pourrais utiliser le même ensemble de sondes marquées pour étudier la localisation de tous les ARNm. Un autre avantage est que la localisation des protéines pourrait être évaluée simultanément. Mes résultats indiquent que 4 ARNm ont montré une localisation spécifique lors du screening de 100 gènes choisis d’une manière aléatoire et 15 ARNm parmi les 54 régulateurs de la transition G2 / M. Ces ARNm appartiennent à cinq classes de localisation: "blobs", qui sont des agrégats d'ARNm cytoplasmiques; «clusters», qui sont des zones de concentration locale élevée d'ARNm, mais où une molécule unique d’ARNm peut encore être résolu; «nuclear membrane », où les ARNm se concentrent autour de l'enveloppe nucléaire; "spindle", qui sont des ARNm accumulés sur l'appareil de division mitotique, “spots" qui sont des agrégats d'ARNm cytoplasmiques où une molécule unique d’ARNm ne peut pas être résolu, et qui sont plus grands que les blobs. La colocalisation entre l'ARNm et la GFP, qui suggère une traduction locale, n'a été trouvée que pour 1 ARNm.Ces screenings aléatoires et ciblés effectués à petite échelle montrent une fréquence et une diversité inattendues dans les modèles de localisation d’ARNm. Cela ouvre la voie pour effectuer des screenings à plus grande échelleMRNA localization was discovered in 1983 in ascidian oocytes and early embryos. Since then many examples of localized RNAs have been found in many organisms, including plants, yeast, fungi, insects, fish and mammals. Localized mRNAs contribute to many biological functions, such as embryonic patterning, asymmetric cell division, cell migration, signaling, neuronal plasticity and others…Until now, only few studies analyzed RNA localization in a systematic manner. Three of them were done in Drosophila, during embryogenesis, oogenesis or larval stage and analyzed around 16000 mRNAs in total. The two other studies were done in mammalian cells and analyzed nearly 1000 mRNAs each. These studies opened a door and raised questions regarding the importance of mRNA localization in human cells and its implication in different biological processes. The goal of my thesis was thus to increase the throughput of single molecule FISH techniques (smFISH) and to study mRNA localization in HeLa cells in a systematic manner.One limitation in smFISH is the cost of the fluorescent oligonucleotide probes, which limits the number of mRNAs that can be analyzed. Therefore, I developed an alternative protocol in which probes for many genes were synthesized as a pool of oligonucleotides (40 per gene in average, more than 12000 in total). Gene-specific probes were then amplified by PCR and converted into single strand by in vitro transcription. I generated a complete protocol, starting from probe design and up to image acquisition. I was interested in studying cell cycle genes. Indeed, cell cycle genes have been extensively studied at the protein level but little is known concerning the localization of their mRNAs. During mitosis, cells go through important morphological modifications and local translation could be a mean of achieving protein localization. This screen is ongoing.In parallel to these experiments, I performed a smFISH based screen on 100 randomly chosen genes and 50 regulators of the G2/M transition of the cell cycle, using a traditional smFISH protocol. In this set-up, I took advantage of a library of HeLa cell lines, in which each cell line contains a bacterial artificial chromosome with the gene of interest tagged with GFP. Therefore, using oligonucleotides hybridizing to the GFP sequence, I could use the same probe set to study the localization of all the tagged mRNAs. A further advantage is that protein localization could be assessed simultaneously. My results indicate that two mRNAs showed a specific localization when screening 100 random genes, and 16 mRNAs among the 50 regulators of the G2/M transition. These mRNAs belong to five localization classes: "blobs", which are cytoplasmic mRNA aggregates; "clusters", which are areas of high local mRNA concentration but where individual mRNA can still be resolved; "nuclear envelope", where mRNAs concentrate around the nuclear envelope; "spindle", which are mRNAs accumulating on the cell division apparatus during mitosis, “spots" which are cytoplasmic mRNA aggregates where individual mRNA can’t be resolved and are bigger than blobs. Interestingly, colocalization between mRNA and GFP, which suggests local translation, was only found for 1 mRNA.These random and targeted screens performed at small-scale show an unexpected frequency and diversity in mRNA localization patterns, therefore pointing to new functions related to this process. This will stimulate future studies aiming at performing screenings at a higher scale
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Meistermann, Dimitri. "Modélisation du développement préimplantatoire humain à partir de données de transcriptome de cellule unique." Thesis, Nantes, 2020. http://www.theses.fr/2020NANT1019.
Анотація:
Le développement préimplantatoire humain s'étend de la fécondation à la nidation de l'embryon dans la paroi utérine. C'est au cours de cette période que les cellules embryonnaires font leur premier choix de destin cellulaire, passant d'une cellule à un embryon stratifié par trois types cellulaires. Cependant, la séquence d'événements au cours de ces toutes premières spécifications reste inconnu. Pour la comprendre, nous avons tout d'abord établi des lignées induites de cellules souches pluripotente naïves humaines. Grâce à des analyses transcriptomiques, nous avons montré que ces lignées in vitro étaient un modèle représentatif de l'épiblaste humain préimplantatoire. Nous avons ensuite construit des modèles in silica du développement préimplantatoire humain et murin à partir de données transcriptomiques en cellules uniques. Le coeur de l'analyse consiste en une inférence des trajectoires cellulaires par un algorithme de pseudo-temps. Nous montrons que la première spécification chez l'homme n'est achevée qu'à partir du stade blastocyste, et non au stade morula comme chez la souris. Enfin le partitionnement du transcriptome en modules de gènes couplé au pseudo-temps permet de décrire les vagues d'expression qui rythment le développement préimplantatoire. Ceci nous a permis de démontrer que le trophectoderme polaire évolue plus rapidement que le trophectoderme mural. Ces approches ont contribué de manière significative à notre compréhension du développement préimplantatoire, ouvrant de nouvelles voies de recherche dans les domaines de l'assistance à la procréation et de la médecine régénérativeCe travail de thèse est consacré à l’étude de nouveaux mélanges gazeux pour la gravure plasma du CdHgTe, à savoir : CH₃NO₂/H₂/Ar, CH₃OH/H₂/Ar et CH₄/NO₂/H₂/Ar. L’objectif est de graver sans polarisation du substrat pour limiter l’énergie déposée sur les surfaces gravées. Une première partie portant sur l’analyse de ces plasmas par sondes électrostatiques et spectroscopie d’émission optique a permis de montrer que la substitution de nitrométhane ou méthanol au méthane a un effet sur la composante chimique de la gravure. Pour ces nouveaux mélanges hydrocarbonés, l’apparition de molécules telles que CO et CN est corrélée à l’annihilation du dépôt spontané de polymère. La seconde partie, consacrée à la gravure du CdHgTe avec ces nouveaux précurseurs a prouvé la faculté de graver sans polarisation du substrat avec les mélanges CH₃NO₂/H₂/Ar et CH₄/N₂O/H₂/Ar et ainsi réduire les dommages engendrés au matériau, notamment la rugosité en surface. Une étude plus poussée de la gravure en mélange CH₄/N₂O/H₂/Ar montre notamment une augmentation de la vitesse de gravure pour les faibles polarisations jusqu’à un certain seuil, avant qu’elle ne stagne, correspondant au passage d’une gravure à dominance chimique à une gravure à dominance physique. De plus, la rugosité est indépendante de la puissance d’excitation du plasma, de la température du substrat ainsi que de la durée de gravure. Enfin, la gravure de tranchées a permis de mettre en évidence la gravure chimique et isotrope à faible polarisation avec les mélanges CH₄/N₂O/H₂/Ar et CH₃NO₂/H₂/Ar mais qui, à plus forte polarisation présente une meilleure passivation latérale que les gravures en plasma CH₄/H₂/Ar
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Ben, Meriem Zacchari. "Memory of stress response in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2018. http://www.theses.fr/2018USPCC311.
Анотація:
La mémoire cellulaire est une capacité critique dont font preuve les micro-organismes pour s'adapter aux fluctuations environnementales potentiellement néfastes. Chez l'eucaryote unicellulaire S. cerevisiae, il a été montré à l’échelle d’une population que la mémoire cellulaire peut prendre la forme d'une réponse plus rapide ou moins prononcée suite à des stress répétés. Nous présentons ici une étude sur la façon dont les levures réagissent à des stress hyperosmotiques de courte durée à l’échelle de la cellule unique. Nous avons analysé le comportement dynamique du promoteur STL1, exprimé en condition de stress osmotique, et fusionné à un rapporteur fluorescent en faisant usage de microfluidique et de microscopie à fluorescence. Nous avons établi que pSTL1 présente une variabilité dynamique dans ses activations successives après deux stress courts. Malgré cette variabilité, la plupart des cellules présentent une mémoire des stress passés caractérisée par une diminution de l'activité de pSTL1. Nous avons montré que cette mémoire ne nécessite pas de nouvelle synthèse de protéines. L'emplacement génomique est important pour cette mémoire puisque le déplacement du promoteur vers un domaine chromatinien péricentromérique entraîne une diminution de sa force transcriptionnelle ainsi que la perte de la mémoire. Nos résultats indiquent aussi une implication non rapportée du complexe SIR sur l'activité de pSTL1 lorsqu'il est déplacé dans le domaine péricentromérique, dans nos conditions expérimentales. Cette étude fournit une description quantitative d'une mémoire cellulaire qui inclut la variabilité cellulaire et prend en compte la contribution de la structure de la chromatine sur la mémoire du stress. Nos travaux pourraient servir de base à des études plus larges sur le positionnement des gènes de réponse au stress en positions subtélomériques dans la levure, tant d'un point de vue génétique qu'évolutifCellular memory is a critical ability displayed by micro-organisms in order to adapt to potentially detrimental environmental fluctuations. In the unicellular eukaryote S. cerevisiae, it has been shown at the population level that cellular memory can take the form of a faster or a decreased response following repeated stresses. We here present a study on how yeasts respond to short, pulsed hyperosmotic stresses at the single-cell level. We analyzed the dynamical behavior of the stress responsive STL1 promoter fused to a fluorescent reporter using microfluidics and fluorescence time-lapse microscopy. We established that pSTL1 displays a dynamical variability in its successive activations following two short and repeated stresses. Despite this variability, most cells displayed a memory of past stresses through a decreased activity of pSTL1 upon repeated stresses. We showed that this memory does not require do novo protein synthesis. Rather, the genomic location is important for the memory since promoter displacement to a pericentromeric chromatin domain leads to its decreased transcriptional strength and to the loss of the memory. Interestingly, our results points towards an unreported involvement of the SIR complex on the activity of pSTL1 only when displaced to the pericentromeric domain in our experimental conditions. This study provides a quantitative description of a cellular memory that includes single-cell variability and points towards the contribution of the chromatin structure in stress memory. Our work could serve as a basis to broader studies on the positioning of stress response genes at subtelomeric positions in the budding yeast, from a genetic point of view as well as an evolutionary one
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Nattes, Tristan de. "Rejet humoral d'allogreffe rénale et allo-immunisation HLA." Electronic Thesis or Diss., Normandie, 2023. http://www.theses.fr/2023NORMR053.
Анотація:
La transplantation rénale est le meilleur traitement de l’insuffisance rénale chronique terminale, que ce soit en termes d’espérance ou de qualité de vie. Malgré les progrès réalisés en immunologie de la transplantation et dans la gestion globale des patients transplantés, la principale étiologie de perte de greffon reste le rejet, et en particulier le rejet humoral.L’évaluation du risque de rejet humoral repose principalement sur le dosage des anticorps anti-HLA dirigés contre le greffon. Pourtant, il apparait que ces anticorps ont un faible pouvoir prédictif de l’incidence et du pronostic du rejet, ce qui pourrait être expliqué par une hétérogénéité de leurs caractéristiques intrinsèques. Ces caractéristiques dépendent des cellules responsables de leur sécrétion, plasmocytes à courte et longue durée de vie, et donc indirectement des cellules responsables du maintien du pool de ces cellules sécrétrices d’anticorps : les lymphocytes B mémoires. Il a été montré en pathologies infectieuses que ces lymphocytes B mémoires sont hétérogènes en termes de phénotype, de fonction, de degré de clonalité et de diversification de leur BCR (B-cell receptor). Néanmoins, ceci n’a pas encore été analysé en transplantation rénale. Un des objectifs de cette thèse était d’étudier le degré d’hétérogénéité des lymphocytes B mémoires HLA-spécifiques chez des patients immunisés en attente de transplantation rénale. Pour ce faire, une analyse en cellule unique de lymphocytes B mémoires HLA-spécifiques de patients présentant différents contextes et degré d’immunisation a été réalisée, dans le but d’identifier leurs caractéristiques phénotypiques et transcriptomiques et la diversification de leur répertoire BCR.La deuxième partie des travaux s’est concentrée sur les modalités diagnostiques du rejet de greffe rénale. Depuis quelques années, des outils de biologie moléculaire sont disponibles, permettant d’évaluer des centaines de transcrits exprimés dans le tissu de biopsie. Ces outils donnent la possibilité de décrire de nouvelles voies physiopathologiques, et potentiellement d’améliorer le diagnostic du rejet, en particulier le rejet humoral. Néanmoins, leur utilisation en pratique courante est restreinte du fait de leur faible disponibilité, des difficultés à interpréter les données produites, et de leur coût. De plus, du fait de cette sous-utilisation en pratique clinique, leur impact exact dans la prise en charge des patients n’est pas déterminé. Au cours de cette thèse, un outil de diagnostic moléculaire ayant des caractéristiques compatibles avec une utilisation en pratique clinique a été développé. Celui-ci permet de diagnostiquer le rejet et de le classer en rejet humoral ou cellulaire. Dans un second temps, cet outil a été confronté à des situations cliniques litigieuses, afin d’évaluer son intérêt en pratique courante.À travers ces travaux, cette thèse vise d’une part à améliorer la compréhension de la réponse humorale en transplantation rénale, afin de contribuer à terme à mieux stratifier le risque immunologique en transplantation, et d’autre part à améliorer les modalités diagnostiques du rejet en aidant à la généralisation des outils de biologie moléculaire appliqués aux biopsies de greffons rénauxKidney transplantation is the best treatment of end-stage renal disease, improving life quality and quantity. Despite advances in pathophysiological knowledge of kidney transplant immunology, kidney transplant rejection remains the major cause of allograft dysfunction, especially antibody-mediated rejection.Antibody-mediated rejection risk assessment is based on the evaluation of donor-specific anti-HLA antibodies. However, these antibodies have a poor predictive value for incidence and prognosis of rejection. This could be explained by the heterogeneity of their intrinsic characteristics. These characteristics depend on cells responsible for their secretion, which include short- and long- lived plasma cells. Consequently, they indirectly depend on the cells responsible for maintaining the pool of these antibody-secreting cells, such as memory B cells. In infectious diseases, it is known that memory B cells are heterogeneous in terms of phenotype, function, degree of clonality, and diversification of their B-cell receptor (BCR). However, this heterogeneity has not been examined in the context of kidney transplantation.The aim of the first part of this thesis was to study the heterogeneity of HLA-specific memory B cells in sensitised patients on kidney transplant waiting list. To this end, single-cell analysis of HLA-specific memory B cells from patients with various aetiologies and degrees of immunisation was performed. This led to their phenotypic and transcriptomic characterisation and to the assessment of their BCR repertoire.The second part of this thesis was dedicated to the diagnosis of kidney transplant rejection.In recent years, biopsy-based transcriptomics has emerged, enabling the assessment of hundreds of transcripts in kidney biopsy tissue. These tools provide the opportunity to elucidate new physiopathological pathways and potentially enhance the diagnosis of rejection, especially humoral rejection. However, their application in clinical practice is still limited due to their restricted availability, required expertise for data processing and interpretation, and cost. Furthermore, their exact impact on patient management remains undetermined. Here, a molecular diagnostic tool with characteristics suitable for clinical use was developed. This tool enables the diagnosis of rejection and its classification between antibody-mediated and T-cell mediated rejection. Subsequently, this tool was assessed in ambiguous clinical situations to evaluate its impact in clinical practice.Through these studies, this thesis focused on enhancing our understanding of the humoral response in renal transplantation, which could help improving immunological risk stratification in transplantation. Additionally, it aimed to improve biopsy-based transcriptomics in the diagnosis of kidney transplant rejection
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Calvez, Vincent. "Modèles et analyses mathématiques pour les mouvements collectifs de cellules." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00255811.
Анотація:
Cette thèse est consacrée à certains modèles mathématiques décrivant le mouvement d'une population de cellules, qui interagissent via un signal chimique. L'accent est mis sur le modèle parabolique de Patlak-Keller-Segel, et dans une moindre mesure, sur le modèle cinétique d'Othmer-Dunbar-Alt.Dans une première partie nous étudions plusieurs variantes du modèle PKS classique, incluant notamment une diffusion non-linéaire des cellules, ou bien une loi de diffusion chimique à noyau de Green logarithmique. Puis nous montrons l'existence globale pour une masse sous-critique du modèle PKS classique dans tout l'espace $\mathbb{R}^2$.
On complexifie ensuite le modèle de base en ajoutant un intermédiaire chimique réactionnel, ce qui modifie l'homogénéité du système. Enfin les conditions d'existence globale pour le modèle cinétique ODA avec effets délocalisants sont affaiblies par rapport aux travaux précédents.
Dans une deuxième partie nous appliquons le modèle phénoménologique de PKS, et son principe de masse critique, à un processus d'auto-organisation remarquable dans le cerveau: la sclérose concentrique de Baló. Un couplage adéquat entre un front de propagation et une instabilité de PKS décrit raisonnablement les motifs en anneaux de la maladie.
La troisième partie adopte le point de vue du transport optimal de masse pour analyser le modèle de PKS unidimensionnel modifié auparavant (afin de partager les caractéristiques de PKS 2D). Bien que la fonctionnelle d'énergie ne soit pas convexe par déplacement, nous démontrons la convergence vers un unique état d'équilibre, lorsqu'il existe. Ces nouvelles idées sont mises en oeuvre numériquement~: un flot gradient discret pour la distance de Wasserstein est analysé, puis simulé en dimension un d'espace.
Plusieurs annexes viennent compléter ce travail, dont une annexe qui regroupe tous les aspects numériques de la thèse.
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Parutto, Pierre. "Statistical analysis of single particle trajectories reveals sub-cellular nanodomain organisation and function." Thesis, Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019PSLEE055.
Анотація:
Les trajectoires de molécules individuelles obtenues par microscopie super-résolution permettent de suivre des protéines avec une précision nanométrique dans des cellules vivantes. Dans cette thèse, j’ai étudié les régions de hautes densités présentes dans ces trajectoires, dont un modèle possible est celui des puits de potentiel. Pour les caractériser à partir de trajectoires, j’ai développé une nouvelle méthode hybride basée sur la densité de points et le champ de force local puis je l’ai comparé aux méthodes d’état de l’art. Ensuite, j’ai utilisé celle-ci pour caractériser les puits maintenant les canaux calciques Cav au niveau des zones actives des terminaux présynaptiques ce qui a permis de mieux comprendre le rôle des variantes d’épissage de ces canaux dans la transmission synaptique. Dans une autre étude, j’ai analysé des trajectoires de protéines résidant dans le lumen du Réticulum Endoplasmique (RE). J’ai créé une méthode pour reconstruire le réseau du RE à partir des trajectoires que j’ai utilisé pour caractériser le mouvement de ces molécules par un modèle de saut-diffusion qui a pour conséquence une meilleure redistribution du contenu luminal par rapport à un mouvement diffusif. Enfin, je discute d’autres analyses de trajectoires pour les intéractions lysosome-ER, les canaux Cav à la jonction neuro-musculaire de la drosophile et les protéines composant le complexe NuRDSingle-Particle Trajectories (SPTs) obtained from super-resolution microscopy allow to track proteins with nanometer precision in living cells and are used in neuroscience and cellular biology. In this thesis, I was interested in the high-density nanodomains found in these trajectories that can be modeled as potential wells. To characterize them, I developed a new hybrid method based on the point density and local drift field and compared it to the other state-of-the-art methods. Then, I used it to identify transient potential wells in SPTs of voltage-gated calcium channels (CaV) contributing to a better understanding of the role of the different CaV splice variants in synaptic transmission. In another study, I looked at SPTs from Endoplasmic Reticulum (ER) luminal resident proteins where I developed a method to reconstruct the network from trajectories and used it to characterize the luminal motion as a jump-diffusion process, which allows for a better redistribution of the luminal content than the previously assumed diffusive model. Finally, I discuss other analyses of motions for lysosome-ER interactions, CaV2.1 channels at drosophila’s neuromuscular junctions and the description of the motion of the constituent proteins of the NuRD chromatin remodeling complex
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Dufour, Adrien. "Déchiffrer le réseau moléculaire contrôlant la pluripotence du porc." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASL035.
Анотація:
Les changements globaux actuels nous obligent à repenser nos systèmes de production et la manière dont nous sélectionnons et phénotypons les animaux. L'utilisation des cellules souches pluripotentes capables de s'autorenouveler et de se différencier en une multiplicité de types cellulaires est un atout qui permettra de mieux évaluer des phénotypes difficilement mesurables en élevage. Pour améliorer nos connaissances sur la biologie des cellules pluripotentes porcines, j'ai réalisé une analyse du transcriptome à l'échelle de la cellule-unique sur des embryons porcins. Cette analyse m'a permis d'identifier de nouvelles sous-populations cellulaires dans les tissus extra-embryonnaires, de mettre en évidence des voies de signalisation et des interactions cellulaires propres à chaque population et de les relier à des modules de régulation génique. À partir de ces données et de la bibliographie, nous avons pu dériver et amplifier des lignées cellules souches embryonnaires porcines (pESC). J'ai ensuite réalisé une analyse du transcriptome et de l'épigénome à l'échelle de la cellule sur des embryons porcins et nos lignées pESC, me permettant de faire le lien entre les différences épigénétiques et transcriptionnelles des populations embryonnaires et d'étudier leur évolution au cours du développement. J'ai également pu comparer le phénotype des pESC à l'épiblaste de l'embryon porcin, ce qui m'a permis d'identifier leurs différences et similarités pour les voies de signalisation et les modules de régulation génique. J'ai également mis en évidence dans les lignées ESCs deux sous-populations présentant des signatures épigénétiques et des modules de régulation génique spécifiques. L'ensemble de ces résultats a permis de mettre en évidence l'importance des interactions cellulaires pour le développement de l'embryon et pour la biologie des cellules pluripotentes et d'identifier de nouveaux modules de régulation génique associés à la pluripotence. Enfin, l'identification de deux sous-populations cellulaires pluripotentes dans nos cultures soulèvent la question de l'hétérogénéité de ces lignées et des conséquences possibles sur leur devenir et leur potentielCurrent global changes are forcing us to rethink our production systems and the way we select and phenotype animals. The use of pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into a multiplicity of cell types is an asset that will make it easier to assess phenotypes that are difficult to measure in livestock farming. To improve our knowledge of the biology of porcine pluripotent cells, I carried out a transcriptome analysis at the single-cell level on porcine embryos. This analysis enabled me to identify new cellular subpopulations in extra-embryonic tissues, to highlight signalling pathways and cellular interactions specific to each population, and to link them to gene regulation modules. Based on these data and the literature, we were able to develop a culture medium for the amplification and maintenance of porcine embryonic stem cells (pESC). I then carried out a transcriptome and epigenome analysis at cell level on porcine embryos and our pESC lines, enabling me to establish the link between epigenetic and transcriptional differences between embryonic populations and to study their evolution during development. I was also able to compare the phenotype of pESCs with the epiblast of the porcine embryo, which enabled me to identify their differences and similarities in terms of signalling pathways and gene regulation modules. I also identified two subpopulations in the ESC lines with specific epigenetic signatures and gene regulatory modules. Taken together, these results highlighted the importance of cell-cell interactions for embryo development and pluripotent cell biology, and identified new gene regulatory modules associated with pluripotency. Finally, the identification of two pluripotent cell subpopulations in our cultures raises the question of the heterogeneity of these cell lines and the possible consequences for their fate and potential
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Martineau, Eugénie. "Linking single cell directionality to dynamic multicellular transitions in Myxococcus xanthus : a multiscale analysis." Thesis, Aix-Marseille, 2018. http://www.theses.fr/2018AIXM0089.
Анотація:
La δ-proteobactérie Myxococcus xanthus est étudiée depuis des décennies pour sa capacité à s’auto-organiser en réponse à des stimuli environnementaux. Cette bactérie colonise des niches écologiques favorables grâce à sa capacité à se mouvoir sur des surfaces. Cette motilité lui permet d’avoir un comportement prédateur envers des organismes proies, alors qu’en absence de nutriments, elle met en place un processus développemental permettant la formation de corps fructifères contenant des myxospores résistant aux stress environnementaux. Tous ces comportements multicellulaires requièrent un contrôle dynamique de la polarité de la cellule, établi par trois protéines polaires : MglA, MglB et RomR. Ensemble, elles définissent la direction de la cellule, qui peut être rapidement inversée sous l’action du système chimiotactique Frz (réversion). Dans ce travail de thèse, à travers une approche expérimentale et computationnelle, nous avons mis en évidence que le système de régulation forme un nouveau type d’oscillateur protéique, contrôlé par deux protéines RomR et FrzX, qui agissent ensemble et de manière complémentaire pour déclencher la réversion à l’arrière des cellules. L’architecture unique de ce système permet une réponse très large à différents stimuli, essentielle pour de nombreux comportements multicellulaires. Afin de comprendre l’importance de ces transitions, nous avons mis au point un outil à haute résolution spatiale et temporelle afin de connecter les cellules individuelles aux comportements multicellulaires, et ainsi comprendre le rôle du système Frz dans un modèle multicellulaire de prédationThe δ-proteobacteria Myxococcus xanthus has been a model of study for decades for its self-organized behavior as a response of environmental stimuli. It colonizes favorable ecological niches by using surface motility. In particular, this motility allows M.xanthus to predate collectively over prey microorganisms, while under starvation they start a developmental process to form macroscopic fruiting bodies, filled with environmental resistant myxospores. All these multicellular behaviors require a dynamic control of the cell polarity established by the polarity proteins MglA, MglB and RomR. Together, they define the direction of movement of the cell, which can be rapidly inverted by the Frz chemosensory system (reversion). In this thesis work, through combined computational/experimental approaches, we highlight that the regulation system forms a new type of biochemical oscillator, controlled by two proteins RomR and FrzX, which act together through complementary action to trigger the reversion at the lagging pole. The unique architecture of this system allows a wide response to various stimuli, which could be very beneficial for collective cell behaviors. To understand the importance of these transitions, we have developed a new high-resolution single cell assay linking single cMARTINEAU EUGENIE 2018AIXM0089/016ED62 2018/03/21 62 SCES SCHell behaviors to multicellular structures at unprecedented spatial and temporal resolutions. This way, we have investigated the role of the newly identified biochemical oscillator in the multicellular model of predation
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Bost, Pierre. "Decoding cellular communications and interactions between immune cells by using single-cell approaches." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2020. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2020SORUS020.pdf.
Анотація:
Les communications cellulaires sont indispensables au bon fonctionnement des organismes multicellulaires, notamment pour s’adapter à un environnement changeant en permanence. Les cellules du système immunitaire n’échappent pas à cette règle mais les interactions entre cellules immunitaires restent peu connues et compliquée à étudier. La récente apparition des technologies de séquençage dites ‘cellules uniques’ représente une opportunité unique pour étudier ces communications. Dans cette thèse, différentes approches expérimentales et analytiques ont été développées pour étudier ces communications à une échelle de cellules uniques. Ces stratégies ont ensuite été appliquées à différents contextes pathologiques, incluant le COVID-19, la maladie d’Alzheimer ou une immunisation par des pathogènes inactivés, et ont permis d’identifier des voies de communications cellulaires jusqu’ici inconnues ou mal comprises. Néanmoins, l’efficacité de ces approches est limitée par l’absence d’informations sur la localisation des cellules et des travaux supplémentaires intégrant ce genre de données est essentiel pour aller plus loin dans la dissection des communications entre cellules immunitairesCellular communications are essential to the proper functioning of multi-cellular organisms, particularly in order to adapt to a constantly changing environment. The cells of the immune system are no exception to this rule, but the interactions between immune cells remain little known and complicated to study. The recent emergence of 'single cell' sequencing technologies represents a unique opportunity to study these communications. In this thesis, different experimental and analytical approaches have been developed to study these communications on a single cell scale. These strategies were then applied to different disease contexts, including COVID-19, Alzheimer's disease or immunisation with inactivated pathogens, and identified previously unknown or poorly understood cellular communication pathways. However, the effectiveness of these approaches is limited by the lack of information on cell location and further work integrating such data will be essential to go further in the dissection of immune cell communications
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Crozatier, Cécile. "Contrôle et analyse électrochimique de la réactivité biologique à l'échelle de la cellule unique dans un dispositif microfluidique." Phd thesis, Université Paris-Diderot - Paris VII, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00178656.
Анотація:
Les systèmes d'analyse miniaturisés sont particulièrement adaptés pour les analyses de cellules en faible nombre ou de cellules isolées. Une telle diminution du volume d'analyse permet une augmentation de la concentration locale et par conséquent une augmentation de la sensibilité des mesures effectuées. Les travaux présentés dans cette thèse se positionnent dans ce cadre en proposant un outil analytique novateur, couplant le contrôle dynamique des micro-environnements de la cellule par la microfluidique et l'analyse instantanée et locale des espèces en solution par l'électrochimie.Grâce au développement d'outils modulables de culture cellulaire et de manipulation de cellules vivantes dans des dispositifs microfluidiques, nous avons mis en place le contrôle dynamique stable de stimulations chimiques sur une population de cellules souches mésenchymateuses (CSM) en culture et poursuivons cette étude dans le but d'induire la réactivité cellulaire des CSM vers la voie de différenciation neuronale.
Le développement d'un microsystème intégré de détection électrochimique du stress oxydant sur cellules uniques est mis en oeuvre à travers la réalisation d'un dispositif microfluidique intégré consistant en un réseau de chambres de mesures, contenant des microélectrodes fonctionnelles, et permettant d'isoler des macrophages uniques et de les maintenir en survie pendant plusieurs dizaines de minutes, durée suffisante pour réaliser nos mesures électrochimiques. En faisant varier les conditions de mesure, comme le nombre de cellules sondées dans le même micro-environnement, la nature du stimulus ou la présence ou non de communication cellulaire avec une population voisine, nous posons les bases d'une analyse originale jamais réalisée jusqu'à présent.
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Robert, Michèle. "Etude quantitative des constituants épithéliaux et mésenchymateux dans l'hypertrophie bénigne de la prostate : comparaison des résultats obtenus sur pièces d'adénomectomie et biopsies uniques et multiples." Montpellier 1, 1995. http://www.theses.fr/1995MON1T038.
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Eisele, Almut. "La cinétique de différentiation des cellules souches hématopoïétiques uniques après transplantation : l´état d´équilibre et l´effet de la cytokine érythropoïétine." Thesis, Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2019. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-03028817.
Анотація:
La majorité des cellules de notre corps sont des cellules hématopoïétiques. Un petit nombre de cellules souches hématopoïétiques produit toutes ces cellules par divisions de maintenance and différentiation. Il a longtemps été considéré que ces cellules souches étaient une population homogène et que chaque cellule produit le même nombre et type de cellule hématopoïétique mature. Cette idée a été réfutée quand il est devenu possible de suivre la différentiation de cellules uniques. Ainsi les cellules hématopoïétiques souches individuelles produisent différents types et quantités relatives de cellules hématopoïétiques matures, amenant la reconstitution après transplantation des cellules souches peut être hétérogène. Quelques cellules qui expriment les marqueurs de cellules souche hématopoïétique survivent uniquement pour une courte durée après transplantation, d’autres pour des années.Dans cette thèse, nous avons utilisé la technique de traçage de lignée des codes-barres cellulaires pour comprendre comment les différents types de cellules souches hématopoïétiques se comportent dans les six premières semaines après transplantation et l’influence de la cytokine érythropoïétine sur ce processus. Les codes-barres cellulaires sont des fragments artificiels d’ADN qui sont introduit dans les cellules souches hématopoïétiques murines par transfection virale. Après transplantation de cellules souche hématopoïétique barcodées de cette manière, chaque division cellulaire va transmettre le code-barre aux cellules filles. Par l’analyse des codes-barres dans les cellules hématopoïétiques matures on peut ainsi comprendre quels types et quelles quantités relatives de cellules matures les cellules souches hématopoïétiques ont produites. Nous avons observé que certaines cellules souches contribuaient de manière stable dans les premières semaines après transplantation, ainsi qu’une succession clonale. Des différences au niveau de la production de différents types de cellules hématopoïétiques matures a aussi été observées. Les globules rouges sont produits par des clones de vie courte et les cellules myéloïdes par des clones stables sur 6 semaines. Le traitement des cellules souches hématopoïétiques avec l’érythropoïétine avant leur transplantation, ne change pas ces phénomènes généraux. Cependant en réponse à l’érythropoïétine, deux types de clones deviennent prépondérants : des clones produisant beaucoup plus de globules rouges et myéloïdes que lymphoïdes, et des clones produisant beaucoup de cellules lymphoïdes et myéloïdes et très peu de globules rouges, suggérant une compensation clonale entre les cellules souches hématopoïétiques. Cet effet était transitoire et disparaît 4 mois après transplantation. Cet effet est dose dépendant en fonction de la concentration d’érythropoïétine.Nous espérons que l’étude détaillée de la différentiation de cellules souches hématopoïétiques uniques wt ou traitées avec l’érythropoïétine après transplantation ait un impact pour notre compréhension pour l’hématopoïèse fondamentale, mais aussi pour des applications cliniques. L’érythropoïétine est utilisée couramment comme médicament. La description détaillée de son effet sur les cellules souches hématopoïétiques est importante pour garantir la sécurité de telles utilisations. De plus, elle peut aider à comprendre les principes généraux de l’actions de cytokines sur les cellules souches hématopoïétiques. La transplantation de cellules souches est utilisée comme traitement dans de nombreuses pathologies. Une phase importante pour le succès d’une transplantation sont les premières semaines quand les niveaux de cellules sanguines ne sont pas encore normalisés. Comprendre quelles cellules produisent quels types de cellules dans cette phase peut servir de base pour le développement de nouvelles stratégies pour raccourcir cette phase critique pour le patientHematopoietic cells are the most numerous cells in our body, and their overall short half-life requires their steady production. At the apex of the hematopoietic system resides a small number of hematopoietic stem cells (HSC) which give rise to all mature hematopoietic cell types through self-renewal and differentiation divisions. For long it was assumed that these HSC are a homogeneous population of multipotent cells. Technical advancements, which allowed to trace HSC at the single cell level, revealed however that single HSC behave differently with respect to the number of lineages and the relative amounts of different lineages they produce and are heterogeneous with respect to their long-term engraftment capacity. Notably different lineage restricted and biased cells, as well as cells with long-term and short-term engraftment potential have been identified in the HSC gate. One technique allowing the lineage tracing of single HSC is cellular barcoding, which relies on the introduction of an artificially created DNA fragment, the barcode, in the genome of HSCs through viral transfection. As these barcodes are transmitted to all daughter cells, the analysis of the barcode identity of progeny cells reveals which lineages and how much of each is produced by each individual HSCs.In this thesis we used a new cellular barcoding library to analyze how the different HSC subsets previously described interact and behave in the first six weeks after bulk transplantation, as well as the influence of erythropoietin (EPO) on this process. More in detail, we described the reconstitution kinetics of HSC in the myeloid (M; macrophage, monocytes, neutrophils, eosinophils), lymphoid (B-cells), dendritic cells, megakaryocyte and erythroid lineage (E; erythroblasts) at the single cell level. For the analysis of HSC differentiation towards the erythroid lineage we established the detection of cellular barcodes from RNA. We discovered that HSC clonal succession and clonal stability co-occur in the first weeks after transplantation, but are not evenly distributed over the different hematopoietic lineages. Notably the production of erythroid cells 2-weeks after transplantation was maintained by distinct short-lived HSC clones, while high myeloid cell production after transplantation was guaranteed by long-lived multi-outcome HSCs. In vitro EPO exposure of HSC before transplantation, did not change the overall lineage output of transplanted HSC, or HSC differentiation kinetics, lineage restrictions, and biases at the single cell level in the first six weeks after transplantation. However, after transplantation of EPO-exposed HSC long-lived unbiased multi-outcome HSCs lost preponderance with respect to cellular output. Rather, changing clones of two types of highly biased HSCs, myeloid-erythroid (ME)-biased and myeloid B-cell (MB)-biased HSC, produced now the majority (>60%) of erythroid, myeloid and B-cells. This effect was transient but stable over different EPO concentrations and after in vivo EPO treatment during transplantation. It suggests a functional compensation mechanism at work.We hope the detailed description of the engraftment kinetics of single control and EPO-exposed HSC after bulk transplantation will have relevance both for fundamental research and the clinics
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Chabert, Max. "MICROFLUIDIQUE DE GOUTTES POUR LES ANALYSES BIOLOGIQUES." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00180994.
Анотація:
Cette thèse présente divers dispositifs fonctionnant sur le principe de la microfluidique diphasique et dédiés aux analyses biologiques.Dans une première partie, nous décrivons la conception d'un système permettant d'effectuer en flux et sans contamination la réaction de PCR dans des microgouttes transportées par une huile immiscible. Cette étude a débouché sur une plateforme automatisée au débit théorique de 3000 échantillons par jour, égalant les systèmes actuels avec une consommation 50 fois moindre en réactifs.
Dans les parties suivantes, nous présentons deux nouvelles idées pour la manipulation d'objets en microfluidique digitale : l'utilisation de phénomènes hydrodynamiques pour encapsuler des cellules uniques dans des microgouttes et les trier, et l'application de champs électriques pour induire mélange et coalescence de gouttes aqueuses. La combinaison de ces deux méthodes au sein d'une même puce est le premier pas vers un système intégré d'analyse de cellules uniques.
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Chen, Wenli. "Spectroscopie diélectrique hyperfréquence de cellules uniques cancéreuses : de l'optimisation du capteur en sensibilité et répétabilité jusqu'au suivi en temps réel de stimuli chimiques." Thesis, Toulouse 3, 2016. http://www.theses.fr/2016TOU30219/document.
Анотація:
La mesure de cellules biologiques constitue une étape de routine dans de nombreuses investigations en biologie. Les techniques actuelles utilisées par les biologistes sont principalement basées sur l'utilisation marqueurs optiques de coloration ou fluorescents, qui fournissent des observations moléculaires et cellulaires très précises et efficaces. Dans ce contexte, la spectroscopie diélectrique micro-ondes pour analyse cellulaire constitue une méthode nouvelle et attrayante, en raison du manque de préparation et manipulation des cellules, sans besoin d'ajout de produits chimiques, qui pourraient interférer avec d'autres constituants cellulaires. Sa compatibilité avec l'analyse de cellules uniques, potentiellement en temps réel, constitue également deux atouts importants de la technique d'analyse. Les travaux de cette thèse ont donc porté sur l'optimisation d'un biocapteur hyperfréquence microfluidique, dédié à la spectroscopie diélectrique de cellules biologiques uniques, et au développement de sa métrologie pour accéder au comportement diélectrique de cellule soumise à des stimuli chimique. Après un état de l'art sur les techniques courantes d'analyse de cellule individuelle, nous nous sommes attachés à optimiser le biocapteur hyperfréquence pour en améliorer les performances en sensibilité et en répétabilité. Ces optimisations ont porté sur le procédé de micro-fabrication, l'architecture du composant, que ce soit au niveau mécanique vis à vis de l'efficacité de blocage d'une cellule unique, mais aussi d'un point de vue électromagnétique avec une étude paramétrique. Ces études ont été validées dans un premier temps expérimentalement par la mesure de billes de polystyrène, modèle diélectrique simplifié par rapport à la complexité d'une cellule biologique, puis sur cellules individuelles vivantes dans leur milieu de culture. Le banc de caractérisation a également été optimisé afin de permettre la mesure diélectrique de cellules au cours du temps, et notamment en réaction à un stimulus d'ordre chimique. La cinétique de réaction d'une cellule unique soumise à de la saponine a été enregistrée automatiquement pour différentes cellules. Ces travaux ouvrent ainsi la voie à l'analyse à l'échelle cellulaire par spectroscopie diélectrique micro-onde de processus biologiques complexes en temps réelThe measurement of biological cells is a routine step in many biological investigations. Current techniques used by biologists are mainly based on staining or fluorescent labelings, which provide very precise and effective molecular and cellular observations. Within this context, the microwave dielectric spectroscopy for cell analysis represents a new and attractive method, due to the lack of cells preparation and manipulation, without adding chemicals that could interfere with other cellular constituents. Its compatibility with the analysis of single-cells, potentially in real-time monitoring, constitute also two major assets of the analysis technique. This PhD thesis therefore focused on the optimization of a microfluidic and microwave based biosensor, which is dedicated to the dielectric spectroscopy of individual biological cells, and the development of its metrology to assess the dielectric behavior of cells subjected to chemical stimuli. After a state of the art on the current techniques available to analyze single cells, we focused on the optimization of the microwave biosensor to improve its performances in terms of sensitivity and repeatability. These optimizations dealt with the microfabrication process, the component architecture through the investigation of single cell loading efficacy as well as an electromagnetic parametric study. These developments were validated first experimentally with the measurement of polystyrene beads, which present a simplified dielectric model compared to the complexity of a biological cell, followed then by living individual cells in their culture medium. The test bench was also optimized to allow the dielectric measurement of cells over time, and especially in response to a chemical stimulus. The reaction kinetics of a single-cell subjected to saponin was recorded automatically for different cells. This work opens the door to single-cell analysis with microwave dielectric spectroscopy of complex biological processes in real-time
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Uwizeye, Clarisse. "Approches quantitatives d’imagerie pour explorer les cellules photosynthétiques." Thesis, Université Grenoble Alpes, 2020. http://www.theses.fr/2020GRALV043.
Анотація:
Le phytoplancton est le groupe de micro-organismes photosynthétiques (microalgues et cyanobactéries) vivant en suspension dans les eaux marines et douces. Grâce à la photosynthèse, le phytoplancton produit de grandes quantités d'oxygène indispensable à la vie marine et terrestre. Les microalgues marines sont également des organismes prometteurs pour les applications biotechnologiques (alimentation humaine et animale, biocarburants). En raison de leur importance écologique et économique, l'étude des réponses du phytoplancton aux défis environnementaux (y compris ceux induits par l'activité humaine et le réchauffement climatique) est un domaine de recherche en plein développement. L'activité du phytoplancton est influencée par les changements dans la stratification verticale de la colonne d'eau qui module, en fonction de la température, la disponibilité de l'énergie lumineuse ainsi que l'apport de nutriments aux cellules du phytoplancton. En raison de la disponibilité de la lumière et des nutriments, les cellules du phytoplancton ont évolué vers différents modes de vie : autotrophie (activité photosynthétique), mixotrophie (utilisation simultanée de la photosynthèse et de l’utilisation ? de sources de carbone extérieures pour la croissance) et photosymbiose (interactions symbiotiques avec des cellules animales).Dans cette thèse, j'ai étudié les réponses physiologiques des cellules du phytoplancton aux changements environnementaux au niveau cellulaire et sous-cellulaire. Pour atteindre cet objectif, j'ai mis au point un processus d'imagerie complet permettant d'effectuer des analyses morphométriques quantitatives de cellules entières d'algues représentatives à la fois d'espèces à succès écologique et de modèles de laboratoire. Le protocole commence avec l’acquisition de séries d’images hautes résolutions soit par FIB-SEM (Focused Ion Beam - Scanning Electron Microscopy) ou SBF-SEM (Serial Block Facing – Scanning Electron Microscopy). Le protocole d'analyse d'images 3D développé dans ce travail permet d'obtenir des modèles tridimensionnels à haute résolution de cellules entières permettant la réalisation d'analyses quantitatives. Grâce à ces outils, j'ai pu imager l'adaptation du phytoplancton à diverses conditions environnementales révélant ainsi : 1) le changement de taille et de morphologie des plastes et des mitochondries lors de l'acclimatation à la lumière dans les diatomées, 2) le changement dans l'interaction des organites chez Nannochloropsis lors de l'acclimatation aux nutriments, 3) les changements morphologiques qui surviennent lors de la photosymbiose dans l’algue Phaeocystis.Ces travaux révèlent plusieurs scénarios d'acclimatation du phytoplancton au niveau cellulaire et subcellulaire. J'ai également pu valider l'utilisation de ce protocole chez les plantes dans une étude sur la biogenèse des chloroplastes lors de la dé-étiolation des cotylédons d’ArabidopsisPhytoplankton is the group of photosynthetic microorganisms (microalgae and cyanobacteria) living in suspension in marine and fresh waters. Through photosynthesis, phytoplankton produce large amounts of the oxygen essential for marine and terrestrial life. Marine microalgae are also promising organisms for biotechnological applications (human and animal food, biofuels). Because of their ecological and economic importance, the study of the phytoplankton responses to environmental challenged (including the ones induced by human activity and global warming) is a developing field of research. Phytoplankton activity is influenced by changes in the vertical stratification of the water column, which modulate light energy availability as well as nutrient supply to phytoplankton cells in a temperature-dependent manner. Based on light and nutrient availability, phytoplankton cells have evolved different lifestyles: autotrophy (photosynthetic activity), mixotrophy (simultaneous use of photosynthesis and respiration of exogenous carbon sources for growth) and photosymbiosis (symbiotic interactions with animal cells).In this thesis, I have studied the physiological responses of phytoplankton cells to environmental changes at the cellular and subcellular levels. To achieve this goal, I have developed a complete imaging workflow to perform quantitative morphometric analyses of entire algal cells, representatives of ecologically-successful and laboratory-model microalgal species. The protocol starts with FIB-SEM (Focused Ion Beam - Scanning Electron Microscopy) or SBF-SEM (Serial Block Facing – Scanning Electron Microscopy), to acquire high-resolution images. By implementing the 3D image analysis protocol, it is possible to obtained high-resolution whole cells models in three dimensions, suitable to perform quantitative analyses. Thanks to these tools, I have been able to image the adaptation of phytoplankton to various environmental conditions: i. changes in the size and morphology of plastids and mitochondria during light acclimation in diatoms, ii. changes in organelles interaction during nutrient acclimation in Nannochloropsis, iii. morphological changes occurring during photosymbiosis in Phaeocystis.Overall, this work reveals several scenarios of phytoplankton acclimation at both the cellular and subcellular levels. I have also validated the use of this protocol in plants in a study on chloroplast biogenesis during de-etiolation in Arabidopsis. of plastids
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Soule, Pierre. "Etude des mécanismes de translocation des peptides pénétrateurs de cellules (cpp) à l'aide de techniques biophysiques." Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066563/document.
Анотація:
La nécessité de délivrer des médicaments directement dans les cellules est grandissante avec le développement des thérapies géniques. Les peptides pénétrants (Cell Penetrating Peptides : CPP) représentent une possibilité pour administrer ces médicaments dans les cellules sans effet délétère sur la membrane. Ce sont des peptides d’une dizaine d’acides aminés, généralement cationiques. Ils sont capables de traverser la membrane cellulaire, et conservent cette propriété lorsqu’une cargaison leur est attachée. Cependant, leurs mécanismes d’entrée ne sont toujours pas tous connus. Nous avons caractérisé quelques aspects des mécanismes permettant aux CPP de traverser directement la membrane plasmique à l’aide de trois techniques biophysiques. i) Nous avons ainsi pu mettre en évidence le rôle des sulfates d’héparane comme partenaire d’adhésion forte du CPP pénétratine, à l’aide d’un outil de mesure de force : le Biomembrane Force Probe. ii) Nous avons montré la possibilité pour la pénétratine de franchir la bicouche lipidique (sans mécanisme cellulaire actif) si celle-ci est suffisamment riche en lipides chargés négativement. Ce passage a été étudié sur bicouches modèles, formées à l’interface entre gouttelettes obtenues par émulsion inverse dans de l’huile en présence de lipides. iii) Pour visualiser la translocation de CPP à l’échelle de la molécule unique nous avons développé un montage original de microscopie à onde évanescente sur bicouche suspendueGene therapy relies on an efficient and specific delivery of drugs into targeted cells. For this purpose, the use of carriers that will help the drugs to cross the membrane, without introducing deleterious effect due to the membrane disruption, are promising. A family of such carriers is known as Cell Penetrating Peptides (CPPs). These peptides are short, about ten amino acids, and often cationic. They are able to translocate through the membrane with different cargos and deliver them into the cytosol. However the mechanisms are still, to a great extent, unknown. We used three biophysical techniques to gain insights into the mechanisms leading to the translocation of a CPP. i) We found the heparan sulfates to be the strongest partner of the CPP penetratin at the cell surface. This adhesion has been pointed out using the Biomembrane Force Probe, a force measuring tool. ii) We evidenced the translocation of penetratin through the lipid bilayer (without any cell mechanism) as long as it contains enough negatively charged lipids. This has been carried out using model bilayers formed at the interface between droplets generated by an inverted emulsion: water in an oil and lipid mixture. iii) To view the translocation of CPPs at the single molecule level we developed a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM) on a suspended bilayer
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Koh, Alaric C. W. "Analyses électrochimiques d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote produites par un macrophage immunostimulé." Paris 6, 2009. http://www.theses.fr/2009PA066465.
Анотація:
La libération des espèces réactives de l’oxygène de l’azote (ROS/RNS) par des macrophages immunostimulés a été suivie en temps réel avec des microélectrodes de carbone platiné. Les mesures à potentiels constants ont montré que des macrophages activés par IFN-γ/LPS et/ou PMA produisent principalement le ONOO−, NO•, NO2− et/ou H2O2. Sous activation par IFN-γ/LPS, la majorité de ces espèces semblait être dérivée d’une co-production de NO• et d’O2•− par la NOS inductible. Ce travail a fourni la première preuve directe de la libération d’ONOO− par les macrophages immunostimulés. De plus, des mesures chronoampérométriques à triple saut de potentiel ont montré des variations temporelles de la libération de chaque espèce. Une augmentation d’H2O2 en présence de [MnII(pyane)Cl2] a été observée, démontrant son rôle comme mimique de SOD. Cependant, des atténuations d’ONOO− et de NO• ont aussi été observées, accompagné par une augmentation de NO2−. Ceci démontre une activité NO• dismutase de ce complexe, aussi que sa réactivité envers l’ONOO−, ce que nous avons ensuite confirmé par des études électrochimiques in vitro.
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Bonnaffoux, Arnaud. "Inférence de réseaux de régulation de gènes à partir de données dynamiques multi-échelles." Thesis, Lyon, 2018. http://www.theses.fr/2018LYSEN054/document.
Анотація:
L'inférence des réseaux de régulation de gènes (RRG) à partir de données d'expression est un défi majeur en biologie. L’arrivée des technologies de mesure de transcriptomique à l’échelle de la cellule a suscité de nombreux espoirs, mais paradoxalement elles montrent une nouvelle complexité du problème d’inférence des RRG qui limite encore les approches existantes. Nous avons commencé par montrer, à partir de données d'expression en cellules uniques acquises sur un modèle aviaire de différenciation érythrocytaire, que les RRG sont des systèmes stochastiques à l'échelle de la cellule et qu'il y a une évolution dynamique de cette stochasticité au cours du processus de différenciation (Richard et al, PLOS Comp.Biol., 2016). C'est pourquoi nous avons développé par la suite un modèle de RRG mécaniste qui inclus cette stochasticité afin d'exploiter au maximum l'information des données expérimentales à l'échelle de la cellule (Herbach et al, BMC Sys.Biol., 2017). Ce modèle décrit les interactions entre gènes comme un couplage de processus de Markov déterministes par morceaux. En régime stationnaire une formule explicite de la distribution jointe est dérivée du modèle et peut servir à inférer des réseaux simples. Afin d'exploiter l'information dynamique et d'intégrer d'autres données expérimentales (protéomique, demi-vie des ARN), j’ai développé à partir du modèle précédent une approche itérative, intégrative et parallèle, baptisée WASABI qui est basé sur le concept de vague d'expression (Bonnaffoux et al, en révision, 2018). Cette approche originale a été validée sur des modèles in-silico de RRG, puis sur nos données in-vitro. Les RRG inférés affichent une structure de réseau originale au regard de la littérature, avec un rôle central du stimulus et une topologie très distribuée et limitée. Les résultats montrent que WASABI surmonte certaines limitations des approches existantes et sera certainement utile pour aider les biologistes dans l’analyse et l’intégration de leurs donnéesInference of gene regulatory networks from gene expression data has been a long-standing and notoriously difficult task in systems biology. Recently, single-cell transcriptomic data have been massively used for gene regulatory network inference, with both successes and limitations.In the present work we propose an iterative algorithm called WASABI, dedicated to inferring a causal dynamical network from timestamped single-cell data, which tackles some of the limitations associated with current approaches. We first introduce the concept of waves, which posits that the information provided by an external stimulus will affect genes one-byone through a cascade, like waves spreading through a network. This concept allows us to infer the network one gene at a time, after genes have been ordered regarding their time of regulation. We then demonstrate the ability of WASABI to correctly infer small networks, which have been simulated in-silico using a mechanistic model consisting of coupled piecewise-deterministic Markov processes for the proper description of gene expression at the single-cell level. We finally apply WASABI on in-vitro generated data on an avian model of erythroid differentiation. The structure of the resulting gene regulatory network sheds a fascinating new light on the molecular mechanisms controlling this process. In particular, we find no evidence for hub genes and a much more distributed network structure than expected. Interestingly, we find that a majority of genes are under the direct control of the differentiation-inducing stimulus. Together, these results demonstrate WASABI versatility and ability to tackle some general gene regulatory networks inference issues. It is our hope that WASABI will prove useful in helping biologists to fully exploit the power of time-stamped single-cell data
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Contreras, Vanessa. "Les cellules dendritiques de la lymphe pseudo-afférente cutanée chez le mouton : analyses fonctionnelles et transcriptomiques." Versailles-St Quentin en Yvelines, 2010. http://www.theses.fr/2010VERS0002.
Анотація:
Chez la souris, 2 populations de CD (CD8a+ et CD8a-) ont été définies. Les CD CD8a+ sont spécialisées dans la prise de corps apoptotiques, la synthèse d’IL-12 et dans la présentation croisée d’antigènes exogènes aux cellules T CD8+, faisant d’elles les candidates cibles idéales des vaccins. Nous avons montré que les CD ovines CD26+ partagent une signature transcriptomique et de nombreuses fonctions, associées à la présentation antigénique, communes avec les CD CD8a+. Les CD CD26+ transportent des débris de cellules épithéliales, ce qui se traduit par la présence d’un peptide dérivé de la cytokératine sur le CMH II des CD de la lymphe. Enfin lors de l’activation par un adénovirus recombinant, les CD CD26+ produisent des cytokines distinctes de celles produites par les CD CD26-. Au total, ce travail démontre que l’organisation des populations de CD présente un certain degré de conservation entre les mammifères, et révèle des pistes moléculaires pour le développement de nouveaux vaccinsMouse spleen contains two DC subsets (CD8a+ and CD8a-). CD8a+ DC appear to be specialized in the uptake of dying cells, the IL-12 production, and the cross-presentation of exogenous antigens. Thus CD8a+ DC are targets for vaccine improvement. We showed that sheep CD26+ DC share a common transcriptomic signature and several common functions with the mouse CD8a+ DC. Moreover, CD26+ DC transport epithelium-derived cell remnants. As we could elute a cytokeratin peptide from the lymph DC MHC class II molecules, we suggest that the CD26+ DC can present self antigens from skin in the process of self tolerance. Finally, CD26+SIRP- and CD26- DC expressed different cytokine mRNA after activation with a recombinant adenovirus. In these studies, we showed that the DC subset organisation is conserved between several mammal species and we generated molecular data for the development of new vaccines, based on more efficient DC targeting
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Duran, Nathalie. "La protéine EB2 du virus d'Epstein-Barr : activateur post-transcriptionnel : analyses structurales et fonctionnelles." Lyon 1, 1995. http://www.theses.fr/1995LYO1T173.
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Cisbani, Giulia. "Cell replacement therapy for Huntington's disease : what we have learned from post-mortem analyses of grafted patients and mice models." Doctoral thesis, Université Laval, 2014. http://hdl.handle.net/20.500.11794/25302.
Анотація:
La maladie d’Huntington (HD) est un désordre neurodégénératif autosomal dominant qui se manifeste suite à une mutation du gène huntingtin. La maladie est caractérisée par une panoplie de signes cliniques qui incluent des problèmes psychiatriques, cognitifs ainsi que des incapacités motrices, en grande partie des mouvements choréiformes. D’un point vue neuropathologique, les cerveaux des patients touchés par la maladie présentent une atrophie majeure du cortex et du striatum où des pertes cellulaires massives sont observées. Il n’existe aucune cure ni traitements efficaces pour cette maladie, et pour ces raisons, plusieurs efforts sont actuellement déployés afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques telle, entre autre, la transplantation cellulaire. Ma thèse de Doctorat a donc porté, en grande partie, sur l’analyse de cerveaux de patients huntingtoniens recrutés pour l’essai clinique de l’University of South Florida. Ces patients, décédés entre 9 et 12 ans post-transplantation, ont reçus des greffes de tissu dérivé de l’éminence ganglionic latérale de fœtus humains âgés entre 8 et 9 semaines post-conception. Des travaux antérieurs menés dans le laboratoire du Dre Ciccheti ont montré que la survie des greffes est compromise à long terme chez ces patients. L’objectif de mon projet était de mieux comprendre les mécanismes responsables de la survie suboptimale des greffes. Nous avons donc formulé l’hypothèse que 1) la faible vascularisation des greffes, 2) la méthode de transplantation (des morceaux de tissu entier vs. des cellules mécaniquement dissociées) ainsi que 3) la présence de la protéine huntingtin mutée (mHtt) au sein du tissu greffé pouvaient contribuer à la dégénérescence des greffes. En effet, nous avons observé que les éléments de l’unité neurovasculaire étaient largement absents au sein des greffes. Les greffes présentaient une plus faible densité de capillaires et l’absence de larges vaisseaux sanguins, comparativement au cerveau hôte. Nous avons de plus observé un nombre réduit d’astrocytes au sein des greffes et une interaction limitée de ces cellules avec les vaisseaux sanguins, suggérant une défaillance des éléments de la barrière hémato-encéphalique. L’absence d’astrocytes était accompagnée par une carence de la sous-unité connexin 43 des gap junctions, importante pour les interactions greffe-hôte. Nous avons ensuite démontré que lorsque des cellules dissociées étaient transplantées dans le striatum de souris YAC128, un modèle murin de la maladie d’Huntington, la survie de la greffe était excellente et ni la vascularisation ou ni l’interaction entre les astrocytes et les vaisseaux était altérée. Finalement, nous avons fait l’extraordinaire découverte d’agrégats de la mHtt au sein du tissu greffé. Nous avons observé ces agrégats exclusivement dans la matrice extracellulaire de la greffe dans les tissus humains tandis qu’ils étaient présents au sein des neurones, de leurs dendrites, de la lame basale des vaisseaux sanguins et de la matrice extracellulaire dans le cerveau du patient. Dans son ensemble, cette thèse met en lumière de nouveaux mécanismes pouvant contribuer à la faible survie des greffes chez les patients souffrant de HD à long-terme. Ces résultats seront fort utiles afin d’améliorer cette approche thérapeutique et aideront à une meilleure compréhension des processus pathologiques de la maladie d’Huntington.Huntington’s disease (HD) is a devastating autosomal dominant neurodegenerative disorder which manifests because of a mutation in the huntingtin gene. It is characterized by a variety of clinical signs which include psychiatric and cognitive problems as well as motor disabilities, in large part choreiform movements. Neuropathologically, the brains of patients afflicted with this disease present with a major atrophy of the cortex and striatum where massive cell losses are observed. To this day, cures remain unavailable and for this reason, an enormous amount of energy has been put into the development of experimental approaches, and for example into embryonic neuronal cell transplantation, which aims to replace lost cells. A few clinical trials have thus been initiated to evaluate whether such methodologies would be beneficial to patients. My PhD thesis focused, in large part, on the analysis of a number of brains from patients recruited for the University of South Florida trial and who eventually came to autopsy. These patients (4 analyzed post-mortem) received solid pieces of fetal striatal tissue and died between 9 and 12 years post-transplantation. Previous work carried out in Dr. Cicchetti’s laboratory has shown that graft survival is compromised in these patients long-term. The aim of my project was to further understand the mechanisms underlying this suboptimal graft survival. We hypothesized that 1) poor vascularization of the graft, 2) the method of transplantation (solid tissue vs. suspension cells) and 3) the potential presence of mutant huntingtin (mHtt) within the grafted tissue may all contribute to graft demise. Indeed, elements of the neurovascular unit were largely absent within the solid grafts. Grafts presented a lower density of capillaries and absence of large blood vessels compared to the host brain. Moreover, we observed a reduced number of astrocytes within the grafts and a limited interaction of these cells with blood vessels, suggesting impairment in blood brain barrier elements. The absence of astrocytes was accompanied by the lack of the gap junction subunit connexin 43, important for graft-host integration. Interestingly, when dissociated cells were transplanted in the striatum of YAC128 mice, a murine model of HD graft survival was excellent and neither the graft vascularization nor the interaction between astrocytes and vessels was altered. Finally, we describe for the first time the presence of mHtt inclusions within the grafted tissue. In the HD transplanted cases, aggregates were detected only in the extracellular matrix of the graft while in the host brain they co-localized with neurons or other cellular elements, such as the basal lamina of blood vessels. Taken together, this thesis sheds new light onto potential mechanisms contributing to poor long-term graft survival in HD patients. These results will help improve such therapies as well as to better understand disease process in HD.
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Aquino, Yann. "Bases génétiques et évolutives de la variabilité interpopulationnelle de la réponse immunitaire au SARS-CoV-2." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2023. http://www.theses.fr/2023SORUS488.
Анотація:
Tous les humains ne sont pas égaux face au SARS-CoV-2. Les bases génétiques et immunologiques de ces différences inter-individuelles commencent à être déchiffrées, mais les prédicteurs de différences immunitaires face au SARS-CoV-2 entre populations restent méconnus. Dans ce contexte, nous rapportons des données de séquençage d'ARN en résolution cellule unique sur des cellules mononucléaires du sang périphérique provenant de 222 donneurs sains de diverses origines, qui ont été stimulées par le SARS-CoV-2 ou le virus de la grippe. Nous montrons que le SARS-CoV-2 induit une activité moins forte, mais plus hétérogène, des gènes stimulés par l'interféron par rapport au virus de la grippe, ainsi qu'une signature pro-inflammatoire unique dans les cellules myéloïdes. Les réponses transcriptionnelles aux virus présentent des différences marquées entre populations, principalement dues à des changements dans la composition cellulaire, y compris une différenciation lymphoïde accrue associée à une infection latente par le cytomégalovirus. Les loci associés à des traits quantitatifs d’expression (eQTLs), ainsi que les analyses de médiation, révèlent un large effet de la composition cellulaire sur les disparités de réponses immunitaires entre populations, avec des variants génétiques exerçant un fort effet sur des loci spécifiques. De plus, nous montrons que la sélection naturelle a accru les différences de réponse immunitaire entre populations, en particulier pour les variants associés à la réponse au SARSCoV-2 chez les populations d’Asie de l’Est, et nous montrons les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l'introgression néandertalienne a modifié les fonctions immunitaires, telles que la réponse des cellules myéloïdes aux virus. Enfin, les analyses de colocalisation et d'association transcriptomique à l'échelle du génome révèlent un chevauchement entre la base génétique des réponses immunitaires au SARS-CoV-2 et la gravité de la COVID-19, fournissant des informations sur les facteurs contribuant aux disparités actuelles dans le risque de COVID-19Humans display substantial interindividual clinical variability after SARS-CoV-2 infection, the genetic and immunological basis of which has begun to be deciphered. However, the extent and drivers of population differences in immune responses to SARS-CoV-2 remain unclear. Here we report single-cell RNA-sequencing data for peripheral blood mononuclear cells—from 222 healthy donors of diverse ancestries—that were stimulated with SARS-CoV-2 or influenza A virus. We show that SARS-CoV-2 induces weaker, but more heterogeneous, interferon-stimulated gene activity compared with influenza A virus, and a unique pro-inflammatory signature in myeloid cells. Transcriptional responses to viruses display marked population differences, primarily driven by changes in cell abundance including increased lymphoid differentiation associated with latent cytomegalovirus infection. Expression quantitative trait loci and mediation analyses reveal a broad effect of cell composition on population disparities in immune responses, with genetic variants exerting a strong effect on specific loci. Furthermore, we show that natural selection has increased population differences in immune responses, particularly for variants associated with SARS-CoV-2 response in East Asians, and document the cellular and molecular mechanisms by which Neanderthal introgression has altered immune functions, such as the response of myeloid cells to viruses. Finally, colocalization and transcriptome-wide association analyses reveal an overlap between the genetic basis of immune responses to SARS-CoV-2 and COVID-19 severity, providing insights into the factors contributing to current disparities in COVID-19 risk
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Bertin, Benjamin. "Analyses moléculaires et fonctionnelles de la diversification musculaire par de nouvelles approches génomiques cellules-spécifiques chez la drosophile." Thesis, Université Clermont Auvergne (2017-2020), 2017. http://www.theses.fr/2017CLFAS002/document.
Анотація:
Les muscles squelettiques présentent des propriétés individuelles de taille, forme, orientation, site d’attachement, nombre de noyaux, déterminées par l’expression d’une combinaison de facteurs d’identité. Les processus par lesquels ces gènes déterminent les caractéristiques finales du muscle ne sont pas pleinement compris. Découvrir comment ces régulateurs de l’identité sont connectés entre eux, à travers un réseau de gènes spécifiant le destin cellulaire de chaque type de muscle, reste un enjeu majeur. Pour identifier de nouveaux acteurs qui déterminent les caractéristiques individuelles du muscle au cours de l’embryogenèse chez la drosophile, nous avons optimisé l’approche cellule-spécifique TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification) permettant l’isolation des ARNs messagers en cours de traduction. Cette méthode a été utilisée sur deux populations restreintes de muscles (Lms- et Slou-positives) et sur la population musculaire globale (Dufpositive) à trois fenêtres de temps ciblant des processus clés de la myogenèse tels que la spécification de cellules fondatrices, la fusion des myoblastes, l’attachement aux cellules de tendon et l’innervation par les motoneurones. Pour avoir une vue d’ensemble de l’expression des gènes dans ces différentes conditions, des analyses transcriptomiques à l’aide de puces ADNc ont été réalisées. Une étude spatiale nous a permis d’identifier de nouveaux acteurs potentiels du code d’identité nécessaires à la diversification de la population Slou ainsi que l’implication de la protéine de liaison à l’ARN, Boule, dans l’organisation des filaments d’actine au sein des fibres musculaires. Dans un second temps une analyse temporelle des données a révélé un ensemble de gènes codant pour des protéines de liaison à l’actine avec un enrichissemen tspécifique dans la population Lms positive. L’étude plus approfondie des gènes gel et dCryABa permis de déterminer leur rôle au cours de la myogenèse. Ces deux protéines participent de manière importante à la régulation de la croissance des muscles Lms positifs en régulant le nombre d’évènement de fusion, l’élongation et l’attachement des myotubes.A travers ce projet nous avons identifié de nouveaux acteurs potentiels du code d’identité, impliqués dans l’acquisition des propriétés distinctes des sous populations musculaires Slou et Lms au cours de l’embryogenèse en participant soit au contrôle de l’expression des gènes soit à l’acquisition des caractéristiques morphologiques finales. Nous espérons que les données générées permettront dans le futur d’acquérir de nouvelles connaissances sur les fonctions des orthologues de ces gènes au cours de la myogenèse desvertébrés et que cela aura un impact sur la compréhension de certaines myopathiesSkeletal muscles display specific features (size, shape, orientation, attachment site,number of nuclei), which are tightly controlled by the combinatorial expression of identity factors. Currently, process by which identity genes determine muscle characteristics is not fully understood. Uncovering how identity factors are interconnected and how they control network of genes specifying muscle cell fate remains a major challenge. To discover new actors of the identity code allowing the acquisition of individual muscle characteristics during Drosophila embryogenesis we optimised a genome wide cell specific approach called TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification), which allows the isolation of mRNA engaged in translation. This method has been used on two restricted populations of muscle cells (Slou and Lms positive) and on the global musculature (Dufpositive) at three time windows covering key muscle developmental steps such as founder cell specification, myoblast fusion, attachment to the epidermis via tendon cells and the innervation by motoneurons.To assess gene expression at a global level in these muscle subsets, we performed transcriptomic analyses at targeted developmental windows by using microarray. First, a comparison of spatial gene expression allowed us to identify new potential actors of the identity code for Slou-positive muscles and the involvement of the RNA binding protein Bol in the structural organisation of muscle fibers. We also performed analyses of temporal transition profiles of genes differentially expressed in Slou- and Lms-positive muscles and identified cluster of genes enriched preferentially in the Lms population and encoding actin interacting proteins. We focused on two genes from this cluster, gel and dCryAB and determined their functions during myogenesis. These two proteins control a coordinated growth of the Lms-positive muscles by fine-tuning of both the number of fusion events and the elongation of myotubes to tendon cells. With this project, we have identified new potential actors of the identity code that govern the acquisition of individual properties of Slou and Lms muscle subsets during Drosophila embryogenesis. We hope that the newly generated data will enable to gain further knowledge on the corresponding orthologues during vertebrate myogenesis and will help to understand why particular muscles are affected in some myopathies
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Ozier-Lafontaine, Anthony. "Kernel-based testing and their application to single-cell data." Electronic Thesis or Diss., Ecole centrale de Nantes, 2023. http://www.theses.fr/2023ECDN0025.
Анотація:
Les technologies de sequençage en cellule unique mesurent des informations à l’échelle de chaque cellule d’une population. Les données issues de ces technologies présentent de nombreux défis : beaucoup d’observations en grande dimension et souvent parcimonieuses. De nombreuses expériences de biologie consistent à comparer des conditions.L’objet de la thèse est de développer un ensemble d’outils qui compare des échantillons de données issues des technologies de séquençage en cellule unique afin de détecter et décrire les différences qui existent. Pour cela, nous proposons d’appliquer les tests de comparaison de deux échantillons basés sur les méthodes à noyaux existants. Nous proposons de généraliser ces tests à noyaux pour les designs expérimentaux quelconques, ce test s’inspire du test de la trace de Hotelling- Lawley. Nous implémentons pour la première fois ces tests à noyaux dans un packageR et Python nommé ktest, et nos applications sur données simulées et issues d’expériences démontrent leurs performances. L’application de ces méthodes à des données expérimentales permet d’identifier les observations qui expliquent les différences détectées. Enfin, nous proposons une implémentation efficace de ces tests basée sur des factorisations matricielles de type Nyström, ainsi qu’un ensemble d’outils de diagnostic et d’interprétation des résultats pour rendre ces méthodes accessibles et compréhensibles par des nonspécialistesSingle-cell technologies generate data at the single-cell level. They are coumposed of hundreds to thousands of observations (i.e. cells) and tens of thousands of variables (i.e. genes). New methodological challenges arose to fully exploit the potentialities of these complex data. A major statistical challenge is to distinguish biological informationfrom technical noise in order to compare conditions or tissues. This thesis explores the application of kernel testing on single-cell datasets in order to detect and describe the potential differences between compared conditions.To overcome the limitations of existing kernel two-sample tests, we propose a kernel test inspired from the Hotelling-Lawley test that can apply to any experimental design. We implemented these tests in a R and Python package called ktest that is their first useroriented implementation. We demonstrate the performances of kernel testing on simulateddatasets and on various experimental singlecell datasets. The geometrical interpretations of these methods allows to identify the observations leading a detected difference. Finally, we propose a Nyström-based efficient implementationof these kernel tests as well as a range of diagnostic and interpretation tools
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Rolland, Delphine. "Apport des analyses globales dans les lymphomes B : recherche d'anomalies moléculaires pour un ciblage thérapeutique." Lyon 1, 2008. http://www.theses.fr/2008LYO10216.
Анотація:
Les lymphomes sont des pathologies incurables, notamment les lymphomes à cellules du manteau (LCM), de la zone marginale (LZM), et lymphocytiques (LL). Au cours de ce travail, nous avons recherché de nouvelles cibles thérapeutiques selon 2 approches. Nous avons d’abord évalué l’inhibition de 2 cibles surexprimées dans les LCM : GST-π et FTase. In vitro, l’inhibition du transfert nucléaire de la GST-π a potentialisé les effets cytotoxiques de cytoréducteurs. L’inhibition in vitro de la FTase par le tipifarnib a induit un arrêt de la croissance cellulaire, une apoptose, et a potentialisé les effets cytotoxiques d’autres molécules. Le tipifarnib a induit un effet cytostatique chez des souris xénogreffées. Ces résultats ont abouti un essai de phase II multicentrique, dans lequel 1 des 11 patients atteints de LCM réfractaire a présenté une rémission complète (RC), avec une prédiction moléculaire possible rétrospectivement sur la biopsie initiale. Nous avons ensuite réalisé une analyse protéomique différentielle des LCM, LZM et LL pour mettre en évidence d’autres cibles thérapeutiques. Les profils protéomiques de 58 lysats tumoraux (18 LCM, 20 LZM et 20 LL) obtenus par SELDI-TOF ont été analysés par regroupement hiérarchique. Des profils protéomiques spécifiques ont été mis en évidence, basés sur l’expression de 37 pics protéiques. La purification assistée par SELDI couplée à l’identification par LC-MS/MS a identifié 2 histones (H2B et H4) dans les LCM et la SRP9 dans les LL. Nous avons mis en évidence des cibles thérapeutiques dans des LNH B par approches focalisée et globale. Ce ciblage peut permettre d’obtenir des RC en situation réfractaire, prédictibles sur biopsie initialeLymphomas are incurable neoplasia, especially mantle cell lymphoma (MCL), marginal zone lymphoma (MZL) and small lymphocytic lymphoma (SLL). In our study, we tried to identify new therapeutic targets using 2 different approaches. First, based on the overexpression of their transcripts, two molecular abnormalities were evaluated as potential therapeutic targets in MCL: GST-π and FTase. In vitro, the GST-π nuclear transfer inhibition increased the cytotoxic activities of several drugs. In vitro, the FTase inhibition by tipifarnib induced cell growth arrest, apoptosis and displayed synergistic effects with drugs used in MCL therapies. In MCL xenograffed mice tipifarnib has shown cytostatic activity. In a multicentric clinical phase II study, 1 of 11 patients with refractory MCL displayed complete remission (CR) which was retrospectively predicted by molecular abnormalities highlighted in the initial biopsy. In a second part, a differential proteomic analysis was realized using SELDI-TOF technology in order to discover therapeutic targets in MCL, MZL and SLL. Tissue protein profiles of 58 fresh frozen biopsies (18 MCL, 20 MZL and 20 SLL) were acquired and then analysed by hierarchical clustering. Specific lymphoma proteomic signatures were identified based on the expression of 37 protein peaks. SELDI-assisted protein purification followed by LC-MS/MS allowed us to identify proteins overexpressed in both MCL and SLL tumors. Among them 2 histones, H2B and H4 were identified in MCL and SRP9 in SLL. We described therapeutic targets in B-cell NHL using focalized and global approaches. This targeting can lead to CR even in refractory NHL and are predictable in initial biopsies
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Léonard, Guillaume. "Analyses rhéologiques des systèmes granulaires appliquées à l'étude des effets des forces électrostatiques." Thèse, Université de Sherbrooke, 2011. http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/1948.
Анотація:
This doctoral research aims to deepen knowledge on the impact of electrostatic forces on powder rheology. The initial focus of this thesis was to answer the following question:"Does the presence of electrostatic charges on a pharmaceutical powder carrier have an influence on the spatial lubricant distribution over the carrier particles and thus on the granular rheology?". After the development of an electrification setup and many experiments, the answer to this question turns out to be negative. However, this question led us to discover several phenomena, such as deformation mechanisms of powder columns during shear tests with the FT4 rheometer; and the formation of self-assemblies after the imposition of electrostatic charges on pharmaceutical excipients. These phenomena are explored in this thesis. Therefore, we demonstrate the inability of a FT4 rheometer to conduct shear tests when pharmaceutical formulations are lubricated with magnesium stearate. Indeed,"monolithic cake" behaviour appears. Two numerical models (method of characteristics and analysis of Janssen) are used to assess the stress state and explain this particular case. In addition, a characterization of the shape and particle size distribution of the electrostatic self-assemblies is presented in this thesis. Finally, the previous parts of this thesis showed the importance of wall friction effects during shear tests. Thus, a final part of this thesis focuses on the mechanism of wall lubrication.This latest effort brings us back to the study of the influence of electrostatic forces on powder rheology. Indeed, a high variability with the wall friction results is obtained with unlubricated powders at a relative humidity of 20%. The presence of magnesium stearate and/or higher humidity conditions reduces this variability. However, some tests indicate that electrostatic phenomena are part of the explanation.
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Roussel, Olivier. "Les interfaces semiconductrices dans les cellules photovoltaïques à base de CuIn(S,Se)2." Paris 6, 2007. http://www.theses.fr/2007PA066717.
Анотація:
Ces travaux portent sur les dispositifs photovoltaïques en couches minces à base d’alliages Cu(In,Ga)(S,Se)2. Le matériau, de type CuIn(S,Se)2, est ici élaboré par électrodépôt et recuit. Dans le procédé de réalisation des dispositifs, une étape chimique de préparation de surface est nécessaire. Les objectifs sont de comprendre le mécanisme d’action du décapage dans une solution de cyanure et, du fait de la toxicité de ce dernier, de déterminer l’influence d’autres traitements chimiques en vue de le remplacer. A cet effet, la couche de chalcogénure est étudiée en utilisant la microscopie électronique à balayage et en transmission, la diffraction des rayons X, la microsonde de Castaing et la spectroscopie de photoélectrons induits par rayons X. Par ailleurs, des dispositifs photovoltaïques complets sont préparés et caractérisés. Dans ce travail, les différentes phases constitutives des couches de CuIn(S,Se)2 sont identifiées et leur localisation relative mise en évidence. La cinétique de décapage des phases secondaires dans une solution d’ions cyanure est également présentée. La synthèse de cellules photovoltaïques a permis de comprendre l’impact de ces phases sur les performances électriques des dispositifs. Le mécanisme d’action d’un traitement alternatif d’oxydation chimique sur des composés chalcopyrites à base de soufre est étudié et comparé au cas des séléniures.
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Claireaux, Mathieu. "Analyses phénotypique et fonctionnelle des cellules T CD4+ spécifiques du VIH chez les patients contrôlant spontanément l’infection à VIH." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2017. http://www.theses.fr/2017USPCC264/document.
Анотація:
Les Contrôleurs du VIH sont de rares individus capables de contrôler spontanément la réplication virale en l’absence de traitement. De nombreuses études montrent que les Contrôleurs développent des réponses T antivirales remarquablement efficaces. Les cellules T CD4+ spécifiques de Gag pourraient jouer un rôle particulier car cette population est préservée en comparaison aux patients traités et corrèle négativement avec la charge virale. Afin d’étudier cette population, nous avons réalisé une analyse transcriptionnelle et protéique multiplexée sur cellule unique, à partir de cellules T CD4+ détectées ex vivo par marquage tétramère de CMH-II contre le peptide Gag293 (Tet+). Nous avons comparé l’expression de 44 gènes et 6 protéines membranaires chez 9 patients Contrôleurs et 9 patients traités. Nous avons d’une part validé la forte fréquence de cellules T CD4+ Tet+ chez les Contrôleurs en comparaison aux patients traités et, d’autre part, montré que les cellules T CD4+ Tet+ des Contrôleurs, étaient activées et engagées dans une différenciation Th1 avancée et présentant un profil cytotoxique. De plus, les cellules T CD4+ Tet+ de Contrôleurs ont montré un état d’épuisement limité, reflété par une expression faible de PD-1, qui pourrait être l’une des raisons du maintien de leur fréquence et de leurs fonctions. Dans une deuxième étude, nous avons étudié les cellules T folliculaires « helper » (Tfh) dans la population T CD4+ spécifique de Gag chez les Contrôleurs du VIH. Les Tfh jouent un rôle essentiel dans la maturation d’affinité des anticorps en aidant les cellules B. Afin de déterminer si ce sous-type cellulaire joue un rôle dans le contrôle de l’infection à VIH, nous avons analysé le phénotype et la fonction des Tfh circulantes (cTfh) : cellules T CD4+ CD45RA- CXCR5+). Nous avons utilisé un marquage tétramère de CMH-II contre le peptide Gag293, pour détecter les cTfh spécifiques du VIH (cTfh Tet+), et nous avons montré que cette population est préférentiellement maintenue chez les Contrôleurs du VIH. L’analyse phénotypique de la population cTfh Tet+ a montré une intensité d’expression (MFI) de PD-1 plus importante dans le groupe de patients traités, suggérant une activation immune anormale chez ces patients. La fonction des cTfh, analysée pour leur capacité à induire la sécrétion d’IgG en coculture avec des cellules B mémoires autologues, n’a pas montré de différences majeures entre les groupes en terme de production d’IgG totales. Cependant, la production d’IgG spécifiques anti-VIH est significativement plus efficace chez les Contrôleurs, en particulier pour la réponse anti-Env qui est plus de 30 fois supérieure à celle des patients traités. Enfin, la fréquence des cTfh Tet+ a corrélé positivement avec la production d’IgG spécifiques, supportant l'idée d'un rôle important de la fonction Tfh dans la réponse humorale anti-VIH. L’ensemble de ces résultats indique que la population T CD4+ spécifique de Gag supporte chez les Contrôleurs les deux bras de la réponse immunitaire antivirale : d’une part, une réponse de type cellulaire Th1 montrant un profil cytotoxique et, d’autre part, une réponse de type humorale, reflétée par des interactions cTfh/B préservées, résultant en une réponse B mémoire vigoureuse. Le maintien de la fonction et de la fréquence de ces cellules spécifiques de Gag pourrait donc jouer un rôle important dans le contrôle du VIHHIV Controllers are rare individuals able to spontaneously control viral replication in the absence of treatment. Several studies showed that controllers develop effective anti-viral T cell responses. Gag-specific CD4+ T cells could play a particular role in HIV control, because this population is preserved in comparison with the treated patients and correlates negatively with the viral load. In order to study this population, we performed a multiplexed single cell transcriptional and protein analysis from CD4+ T cells detected ex vivo by MHC-II tetramer labeling against the Gag293 peptide (Tet+). We compared the expression of 44 genes and 6 surface proteins in 9 Controllers patients and 9 treated patients. Firstly, we validated the high frequency of Tet+ CD4+ T cells in controllers compared to the treated patients, then we showed that Tet+ CD4+ T cells from controllers were activated and engaged in advanced Th1 differentiation with a cytotoxic profile. In addition, Tet+ CD4+ T cells from controllers showed a limited state of exhaustion, reflected by a lower expression of PD-1, which could be one of the reasons for maintaining their frequency and functions. In a second study, we studied follicular helper T cells (Tfh) among the Gag-specific CD4+ T cell population of HIV controllers. Tfh plays an essential role in the affinity maturation of the antibody response by providing help to B cells. To determine whether this CD4+ T cell subset may contribute to the spontaneous control of HIV infection, we analyzed the phenotype and function of circulating Tfh (cTfh: T cells CD4+ CD45RA- CXCR5+). We performed a MHC-II tetramer labeling against Gag293 peptide to detect HIV-specific cTfh (cTfh Tet +), and showed that this population is preferentially maintained in HIV controllers. Phenotypic analysis of Tet+ cTfh population showed a higher intensity of PD-1 expression (MFI) in the treated group suggesting abnormal immune activation in these patients. The function of cTfh, analyzed by the capacity to promote IgG secretion in cocultures with autologous memory B cells, did not show major differences between groups in terms of total IgG production. However, the production of HIV-specific IgG is significantly more efficient in the controller group, especially for the anti-Env response that is more than 30-fold greater than those of the treated patients. Finally, the frequency of Tet+ cTfh correlated positively with the production of specific IgG, supporting the idea of an important role of Tfh function in the humoral antiHIV response. Taken together, these results indicate that Gag-specific CD4+ T cell population supports the two arms of the antiviral immune response in HIV controllers: the cell-mediated response through a preferential differentiation toward Th1 cell type showing a cytotoxic profile, and the humoral response, reflected by preserved cTfh / B interactions, resulting in a vigorous memory response. Maintaining the function and frequency of these Gag-specific CD4+ T cells could therefore play an important role in HIV control
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Ouedraogo, Marion. "Identification de gènes co-exprimés et co-localisés par des analyses multivariées : analyse des groupes de gènes co-exprimés en fonction des interactions physiques à l’échelle du génome." Rennes, Agrocampus Ouest, 2013. http://www.theses.fr/2013NSARB234.
Анотація:
De nombreuses études ont montré que l’architecture des génomes et les interactions entre les chromosomes jouent un rôle majeur dans la régulation de l’expression des gènes. Par exemple chez les eucaryotes, les chromosomes sont organisés en territoires chromosomiques à l’interface desquels des interactions physiques activent ou inhibent l’expression des gènes. De plus, les gènes sont fortement transcrits dans des zones particulières du noyau appelées usines de transcription. Récemment, de nouvelles méthodes de biologie moléculaire ont permis de cartographier les interactions physiques d’un génome et d’apporter de nouvelles informations sur l’organisation des génomes. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse était d’apporter de nouveaux éléments de compréhension de la régulation de l’expression des gènes en regard de l’organisation du génome. Pour cela, nous avons entrepris une approche in silico basée sur l'hypothèse suivante : l’organisation du génome dans le noyau affectant l’expression des gènes, l’expression des gènes doit refléter au moins en partie cette organisation. Nous avons alors développé une méthode, appelée « CoCoMap » pour Co-expression and Co-location Mapping, basée sur les statistiques multivariées et permettant d'explorer la co-expression entre gènes en prenant en compte la dimension spatiale par leur localisation chromosomique. Cette méthode nécessite des données d’expressions associées à la localisation génomique des gènes exprimés. Elle renvoie un ensemble de groupes de gènes voisins et co-exprimés ainsi que les liens de co-expressions entre l’ensemble des groupes identifiés. L’analyse des groupes identifiés par notre méthode par rapport à des données d’interaction physique a conforté notre hypothèse en identifiant de possibles relations entre organisation du génome et co-expression des gènes. De plus, cette méthode permet d’analyser sous un nouvel angle les données biologiques associées à l’expression des gènes en prenant en compte l’aspect spatial de la régulation de leur expressionMany analyses showed that the genome architecture and physical interactions between chromosomes play a major role in the regulation of gene expression. For example, , the chromosomes in eukaryotic genomes are arranged in chromosomal territories. At the interface of these territories, some physical interactions enhance or silence gene expression. Furthermore, genes are highly expressed in some hot spots in the nucleus called transcription factories. Recently, new methods of molecular biology revealed physical interactions among the genome. The main objective of this project was to bring new insight concerning the impact of genome organisation on the regulation of gene expression. To this aim, we have chosen a Bioinformatics approach based on the following hypothesis: as the genome organisation in the nucleus affects gene expression, gene expression could in some part reveal the genome organisation. We have developed a method based on multivariate analysis and called Co-expression and Co- location Mapping that identifies the groups of co-expressed and neighbouring (co-located) genes. The method requires expression data and genomic locations of the genes. It retrieves the list of groups of co-expressed and co-located genes and the relation of co-expression between the groups. We have compared the groups identified by CoCoMap with data of physical interaction within the genome. A large proportion of the groups was associated with physical interaction, consolidating our original hypothesis. CoCoMap is a new way to analyse expression data by taking into account the importance of the location of the genes among their expression
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Gosselin, Pauline. "Analyses structurales et fonctionnelles des interactions entre elF4E et ses partenaires." Phd thesis, Paris 6, 2012. http://hal.upmc.fr/tel-00829452.
Анотація:
Le contrôle traductionnel est une étape critique de la régulation de l’expression des gènes impliqués dans le développement embryonnaire et de nombreux processus cellulaires. Au cours de l'initiation de la traduction chez les eucaryotes, le facteur eIF4E (eukaryotic Initiation Factor 4E) fixe la coiffe des ARNm et recrute la protéine eIF4G pour former le complexe d'initiation. L' interaction eIF4E/eIF4G est une étape clé de la régulation traductionnelle, faisant du site de liaison à eIF4E un lieu de compétition entre eIF4G, le répresseur général de la traduction 4E-BP et d'autres régulateurs appelés 4E-IPs (4E-interacting partners), qui partagent avec eIF4G un motif consensus de liaison à eIF4E. Longtemps considérée comme une protéine désordonnée, nous avons montré au cours de cette thèse que 4E-BP adopte en réalité une conformation repliée lorsqu'il se lie à eIF4E, impliquant une surface d'interaction plus importante. Ces résultats ont apporté un nouveau regard sur les interactions qui s'établissent entre eIF4E et ses partenaires, et ont fourni des informations cruciales pour l'établissement de nouvelles thérapies, notamment celles développées dans le cadre des cancers. Mon travail de thèse a également permis l'établissement d'un criblage de nouvelles 4E-IPs, basé sur une approche alliant analyses structurales, bioinformatiques et biochimiques. Parmi les 4E-IPs détectées, nous avons caractérisé la protéine Angel1, membre d'une famille de déadénylases. Ces résultats ont ouvert de nombreuses perspectives pour la compréhension du métabolisme des ARNm mais aussi celle des régulations traductionnelles spécifiques prenant pour cible moléculaire eIF4EThe control of mRNA translation is a complex process that is critical for gene expression during development and many physiological processes. During translation initiation in eukaryotes, the Initiation Factor 4E (eIF4E) binds the cap structure of the mRNA and recruits the large scaffolding protein eIF4G to form the initiation complex, step that is often the major site of protein synthesis control. Interaction between eIF4E and eIF4G is targeted by the small translational repressor 4E-BP and other specific eIF4E-interacting partners (4E-IPs), which share with eIF4G a similar eIF4E-binding motif and compete for eIF4E to modulate its functions at different levels. Commonly, the repressor 4E-BP is described as a completely disordered protein, even in its eIF4E-bound state. In the present work, we showed that 4E-BP adopts in fact a folded structure when it interacts with eIF4E, establishing fuzzy and dynamic contacts that involve a larger binding footprint of 4E-BP on eIF4E. These results brought new insight into the mechanisms involved in the interaction between eIF4E and its partners, and emphasized the role of structural studies to develop new therapies, particularly in cancer treatments. During my thesis, we also developed a new approach that combines structural, in silico and biochemical analyses to find novel 4E-IPs. Among the new putative 4E-IPs, we characterized Angel1, a protein related to a family of deadenylases. All together, these results have opened up new perspectives in term of mRNA metabolism and specific regulations that target eIF4E
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Gosselin, Pauline. "Analyses structurales et fonctionnelles des interactions entre elF4E et ses partenaires." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00829452.
Анотація:
Le contrôle traductionnel est une étape critique de la régulation de l'expression des gènes impliqués dans le développement embryonnaire et de nombreux processus cellulaires. Au cours de l'initiation de la traduction chez les eucaryotes, le facteur eIF4E (eukaryotic Initiation Factor 4E) fixe la coiffe des ARNm et recrute la protéine eIF4G pour former le complexe d'initiation. L' interaction eIF4E/eIF4G est une étape clé de la régulation traductionnelle, faisant du site de liaison à eIF4E un lieu de compétition entre eIF4G, le répresseur général de la traduction 4E-BP et d'autres régulateurs appelés 4E-IPs (4E-interacting partners), qui partagent avec eIF4G un motif consensus de liaison à eIF4E. Longtemps considérée comme une protéine désordonnée, nous avons montré au cours de cette thèse que 4E-BP adopte en réalité une conformation repliée lorsqu'il se lie à eIF4E, impliquant une surface d'interaction plus importante. Ces résultats ont apporté un nouveau regard sur les interactions qui s'établissent entre eIF4E et ses partenaires, et ont fourni des informations cruciales pour l'établissement de nouvelles thérapies, notamment celles développées dans le cadre des cancers. Mon travail de thèse a également permis l'établissement d'un criblage de nouvelles 4E-IPs, basé sur une approche alliant analyses structurales, bioinformatiques et biochimiques. Parmi les 4E-IPs détectées, nous avons caractérisé la protéine Angel1, membre d'une famille de déadénylases. Ces résultats ont ouvert de nombreuses perspectives pour la compréhension du métabolisme des ARNm mais aussi celle des régulations traductionnelles spécifiques prenant pour cible moléculaire eIF4E
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Mascalchi, Patrice. "Analyse par suivi de particule unique à la surface de lymphocytes vivants de l'organisation dynamique des récepteurs CD4 et CCR5 impliqués dans l'infection par le VIH." Toulouse 3, 2012. http://thesesups.ups-tlse.fr/1560/.
Анотація:
L'infection de lymphocytes T CD4+ par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) débute par l'interaction séquentielle de la protéine d'enveloppe du virus gp120 avec le récepteur primaire CD4 puis avec un corécepteur, CCR5 dans la majorité des cas de primo-infection. La nécessité de cette double interaction suggère que l'efficacité du mécanisme d'entrée du VIH pourrait dépendre de l'organisation membranaire dynamique de ces deux récepteurs. Pour étudier cette organisation à la surface de lymphocytes vivants, nous avons utilisé une technique non invasive de microscopie à haute résolution : le suivi de particule unique (SPT). Dans un premier temps, nous avons validé le choix des quantum dots (QD) pour nos expériences de SPT en réalisant une étude systématique de l'influence de la particule sur la mesure de coefficient de diffusion. Ensuite, notre travail a consisté à suivre et analyser le mouvement des récepteurs CD4 et CCR5 marqués avec des QD, à la surface de lymphocytes vivants. Nous avons montré qu'il existe, pour chaque récepteur, des sous-populations ayant des modes de diffusion distincts : aléatoire, confiné de manière permanente ou de manière transitoire. L'ajout de molécules déstabilisant l'interaction CD4-CCR5 (CD4 soluble, maraviroc) a ensuite révélé que celle-ci est partiellement à l'origine de leur confinement. L'ensemble de nos observations nous permet de poser les bases d'un modèle d'organisation membranaire dynamique de CD4 et CCR5 à la surface de lymphocytes vivants. Ces données constituent un point de départ vers la compréhension du lien présumé entre l'organisation dynamique des récepteurs et les premières étapes du processus d'infection par le VIHInfection of CD4+ T lymphocytes by the human immunodeficiency virus (HIV) is initiated by the sequential interaction of the viral envelope protein gp120 with the primary receptor CD4 and then a coreceptor, CCR5 in most cases of primo-infection. The necessity of this double interaction suggests that the efficiency of the HIV entry process could depend on the dynamic membrane organization of these two receptors. To study this organization at the surface of living lymphocytes, we used single particle tracking (SPT), a high resolution and non-invasive microscopy approach. Firstly, we validated the choice of Quantum dots (QD) for SPT experiments based on the results of a systematic study that evaluated the influence of the particle on the measured diffusion coefficient. Secondly, we determined and analyzed the movement of CD4 and CCR5 receptors labeled with QD, at the surface of lymphocytes immobilized on glass coverslips. These experiments showed that both receptors exhibit three different diffusion modes: random, permanently or transiently confined diffusion. Addition of molecules that destabilize the CD4-CCR5 interaction (soluble CD4, maraviroc) revealed that it is partially responsible for their confinement. All these observations allow us to establish the basis for a model of the dynamic membrane organization of CD4 and CCR5 at the surface of living lymphocytes. These data represent a starting-point for the understanding of the presumed relationship between the dynamic organization of the receptors and the first steps of the HIV infection process
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Bachy, Charles. "Phylogénie, diversité et dynamique temporelle chez les ciliés tintinnidés marins." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00769949.
Анотація:
La diversité des protistes marins planctoniques, après avoir été historiquement étudiée sur des critères morphologiques, est depuis récemment sujette à une intense recherche à l'aide d'approches moléculaires. Notamment, les études basées sur l'amplification directe de marqueurs moléculaires à partir d'ADN environnemental ont révélées une exceptionnelle diversité. L'objectif central de ce travail est d'améliorer notre compréhension sur le lien existant entre la connaissance classique des eucaryotes unicellulaires et leur diversité estimée à partir des données moléculaires, en particulier pour une meilleure interprétation des processus évolutifs et écologiques. Pour cela, nous avons utilisé comme système modèle l'ordre des ciliés tintinnidés (Tintinnida) qui constituent un groupe riche en espèces, aisément identifiables au microscope grâce à leur coquille externe (lorica) et communément rencontrés dans l'ensemble des eaux marines et lacustres du monde. Un suivi approfondi sur deux ans des tintinnidés de la Baie de Villefranche-sur-Mer (Mer Méditerrannée, France), couplant des analyses moléculaires de la diversité à partir de cellules individuelles et à partir d'ADN environnemental, a permis de caractériser la composition de ces communautés et leur dynamique temporelle aux échelles macro- et micro-évolutives. La première partie de ce travail a été destinée à la réalisation d'une phylogénie moléculaire de référence pour les tintinnidés en incorporant les séquences de 62 individus de morphologies diverses pour lesquelles des données moléculaires n'étaient pas disponibles. Nous avons amplifié et séquencé les gènes codant pour les ARN ribosomiques (ARNr 18S, 5.8S et 28S) et les espaces intergéniques correspondants (ITS1 et ITS2). La classification taxonomique a été réévaluée d'après les données moléculaires. Dans un deuxième temps, nous avons testé l'efficacité des approches moléculaires conventionnelles (amplification, clonage et séquençage Sanger du gène de l'ARNr 18S) et plus récentes (amplification et pyroséquençage de régions de l'ARNr 18S et de l'ITS), pour décrire la composition des communautés des tintinnidés dans des échantillons environnementaux en les comparant avec des estimations de la diversité par observation morphologique sur les mêmes échantillons. Si il existe de légères incongruences entre les approches et/ou les différents marqueurs employés, les approches cultureindépendantes s'avèrent efficaces pour décrire la diversité morphologique. En revanche, afin de ne pas surévaluer artificiellement le nombre d'espèces estimées à partir des données de pyroséquençage, il faut que des méthodes de débruitage et de regroupement en unités taxonomiques opérationnelles (UTOs) contraignantes soient appliquées. La troisième partie de ce travail a été dédiée au suivi temporel des communautés de tintinnidés à différentes profondeurs dans la baie de Villefranche, basé sur le clonage et le séquençage du gène de l'ARNr 18S et des régions ITS. Il apparaît des différences de distribution au cours de l'année à une même profondeur, en particulier en termes d'abondance de séquences pour une UTO donnée. Malgré un cadre phylogénétique solide et assez enrichi, l'approche moléculaire révèle des séquences éloignées des espèces déjà séquencées. La découverte de ces clades environnementaux souligne potentiellement l'importance écologique d'espèces encore mal connues. Enfin, le séquençage direct du gène de l'ARNr 18S et de l'ITS2 à partir des cellules individuelles de l'espèce a offert l'opportunité d'une étude populationnelle sur une période de deux ans. La diversité intra-spécifique mesurée met à jour des phénomènes d'hybridation entre variantes génétiques. Une structuration génétique temporelle a également été observée pour le gène de l'ARNr 18S. Les implications de ces différentes recherches sont discutées dans le cadre de l'étude de la diversité et de l'écologie des tintinnidés, et plus largement, des protistes marins.
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Sapay, Nicolas. "Les peptides d'ancrage à l'interface membranaire : analyses structurales par RMN et dynamique moléculaire et développement d'une méthode de prédiction bioinformatique." Lyon 1, 2006. http://www.theses.fr/2006LYO10003.
Анотація:
Les protéines membranaires représentent environ 25% des séquences codantes dans les génomes. On distingue deux catégories de protéines membranaires : les protéines polytopiques, traversant une ou plusieurs fois la membrane, et les protéines monotopiques, interagissant avec un seul côté de la membrane. Dans ce cas, l'ancrage membranaire peut être constitué d'une ou plusieurs hélices amphipathiques localisées à l'interface de la membrane, parallèlement au plan de la bicouche phospholipidique. Ce mode d'ancrage membranaire, aussi appelé ancrage "IPM" pour "in-plane membrane anchor", est mal compris et aucune méthode de prédiction n'est disponible. Dans ce contexte, ce travail de thèse a eu deux objectifs : (1) l'étude de l'ancrage membranaire de la protéine NS5A présente chez le virus de l'hépatite C, les GB virus et les pestivirus et (2) le développement d'une méthode bioinformatique de prédiction des ancrages IPM. Le premier objectif a abouti à la caractérisation structurale du domaine membranaire de NS5A chez le virus de la diarrhée bovine, un pestivirus, par RMN en milieux mimétiques de membranes (détergent, solvant organique). Son étude par dynamique moléculaire à l'interface eau-dodecane et en bicouche de phospholipides a permis de comprendre la façon dont il s'adapte à une interface hydrophobe-hydrophile. Le second objectif a abouti à l'élaboration de la méthode AmphipaSeeK, permettant de prédire les ancrages IPM dans les séquences protéiques. Cette méthode est basée sur un lot de 21 protéines membranaires monotopiques possédant un ancrage IPM caractérisé expérimentalement. Elle utilise une machine à vecteurs-supports comme système de classificiation, et s'est montrée très spécifique. AmphipaSeek a été implémentée sur NPS@, le serveur Web d'analyse de séquence du laboratoire (http://npsa-pbil. Ibcp. Fr). L'ensemble de ces travaux a permis de mieux caractériser les propriétés structurales des ancrages IPM des protéines NS5A
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Colin, Camille. "Développement de nouvelles méthodes de microscopie et d’électrochimie pour des analyses multi-paramétriques de mitochondries individuelles cardiaques." Thesis, Bordeaux, 2020. http://www.theses.fr/2020BORD0149.
Анотація:
L’importance de la mitochondrie dans la gestion de l’énergie cellulaire, d’un point de vue physiologique (contraction cardiaque, etc) ou pathologique (cancer, Alzheimer, etc) n’est plus à démontrer. Dans le contexte de la contraction cardiaque, qui est un processus fortement ATP-dépendant, l’intervention exacte de la mitochondrie reste aujourd’hui sujet à débat. Une hypothèse avance que la mitochondrie ne voit qu’un faible pourcentage (1%) du flux calcique nécessaire à la contraction, une autre hypothèse propose que la mitochondrie, qui produit 90% de l’ATP cellulaire, est activée par ce flux calcique à chaque contraction pour répondre à la demande énergétique. Un élément de réponse pourrait être l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondrial (mPTP), qui est principalement activé par le calcium. Si ce pore non spécifique est principalement connu pour son ouverture pathologique, notamment dans l’ischémie-reperfusion en déclenchant l’apoptose, c’est son mode d’ouverture physiologique qui serait important dans ce contexte cardiaque en jouant un rôle crucial dans la gestion des flux calciques mitochondriaux. Cependant, ce mode d’ouverture est encore peu caractérisé, notamment car les techniques utilisées reposent bien souvent sur le suivi moyen de large population mitochondriales, or de plus en plus d’études montrent l’existence de sous populations mitochondriales au sein d’une même cellule, présentant des différences d’activités entre elles. L’objectif de cette étude était de développer des nouvelles méthodes d’analyse, afin de pouvoir suivre les variations d’activités des populations mais surtout, de pouvoir analyser les mitochondries individuellement. En utilisant ces méthodes, des études des ouvertures physio-pathologiques du mPTP dans le contexte de contraction cardiaque peuvent être menées.La première approche que j’ai développée est basée sur la microscopie optique, elle se compose de trois grandes étapes : 1) traitement des images de microscopie, 2) identification des mitochondries et leur suivi dans le temps, 3) analyses informatiques. La deuxième approche a été basée sur l’électrochimie, elle repose sur une détection simultanée de la consommation d’oxygène mitochondriale et du taux de réduction des quinones de la chaine respiratoire. Pour caractériser ces méthodes, nous avons dans un premier temps suivi les états bioénergétiques mitochondriaux classiques. Nous avons ainsi montré une grande variété de réponses avec l’observation de deux sous-populations mitochondriales de tailles distinctes. Puis, dans un deuxième temps nous avons utilisé la microscopie de fluorescence pour suivre sur mitochondrie unique, des variations transitoires du potentiel de membrane que l’on relie aux ouvertures du mPTP. Nous avons ainsi confirmé que l’activation du mode d’ouverture pathologique peut être induit par un front de concentration de calcium, et est inhibé par la cyclosporine A (CsA). Surtout, nous avons observé des ouvertures transitoires du mPTP, activé également par le calcium mais également par la photo-illumination, en revanche dans notre étude ce mode d’ouverture n’est pas inhibé par la CsA ce qui suggère d’un mécanisme différentThe importance of mitochondria in the regulation of cellular metabolism, from physiological (cardiac contraction, etc.) or pathological (cancer, Alzheimer's, etc.) processus are well established. In the context of heart contraction, which is a highly ATP-dependent process, the exact intervention of the mitochondrion remains a subject of debate today. One hypothesis suggests that the mitochondria see only a small percentage (1%) of the calcium flow necessary for contraction, while another hypothesis suggests that the mitochondria, which produce 90% of cellular ATP, are activated by this calcium flow at each contraction to supply energy demand. Part of the answer may be in the opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), which is mainly activated by calcium. If this non-specific pore is well described for its pathological opening, notably in ischemia-reperfusion by triggering apoptosis, this is its physiological opening mode which would be important in the cardiac context by playing a crucial role in the control of mitochondrial calcium flows. However, this mode of opening is still weakly characterized, in particular because the techniques used are often based on the average monitoring of large mitochondrial populations. However, more and more studies show the existence of mitochondrial subpopulations within a cell, with differences in activities between them. The objective of this study was to develop new methods of analysis, in order to be able to follow the variations of activities of the populations but especially, to be able to analyze individual mitochondria. By Based on these methods, we could study the patho-physiological openings of mPTP in the context of heart contraction was conducted.The first approach that I developed is based on optical microscopy, it consists of three main steps: 1) processing of microscopy images, 2) identification of mitochondria and their monitoring them over time, 3) data analyses. The second approach was based on electrochemistry, we performed a simultaneous detection of mitochondrial oxygen consumption and the reduction rate of quinones of the respiratory chain. To characterize these methods, we first followed the classical mitochondrial bioenergetic states. We have thus shown a wide variety of responses with the observation of two mitochondrial subpopulations of distinct sizes. Then, in a second step, we used fluorescence microscopy to follow, at the single mitochondrion level, transient variations in the membrane potential that we connect to the openings of the mPTP. We have thus confirmed that the activation of the pathological opening mode can be induced by a calcium concentration transient, and is inhibited by cyclosporin A (CsA). Strikingly, we observed transient openings of mPTP, activated also by calcium and by photo-illumination as well, however in our study this mode of opening is not inhibited by CsA which suggests a different mechanism
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Carabana, Garcia Claudia. "Defining cell fate specification of mouse Mammary Stem Cells in 4D." Electronic Thesis or Diss., Université Paris sciences et lettres, 2022. http://www.theses.fr/2022UPSLS055.
Анотація:
SPÉCIFICATION DU DESTIN CELLULAIRE DES CELLULES SOUCHES MAMMAIRES EN 4DAu cours du développement, une coordination entre la spécification du destin cellulaire et la morphogenèse tissulaire est nécessaire à la formation des organes. Par conséquent, la façon dont différents types de cellules se différencient dans le temps et l'espace reste une question majeure en biologie du développement.La glande mammaire est constituée d'un épithélium ramifié composé d'une couche externe de cellules basales (BCs) et d'un compartiment interne de cellules luminales (LCs). Dans ce tissu, l'homéostasie adulte est exclusivement maintenue par des progéniteurs unipotents, alors que des cellules souches mammaires multipotentes (MaSC) ne se trouvent que dans la glande embryonnaire, ce qui en fait un paradigme tissulaire idéal pour étudier leur comportement dynamique et leur contribution à la morphogenèse tissulaire.HYPOTHÈSE DE TRAVAILNous avons récemment montré que les cellules souches mammaires deviennent unipotentes lors de la tubulogenèse de la glande, suggérant un lien étroit entre spécification cellulaire et morphogenèse. Notre hypothèse implique que la perte de multipotence soit liée aux remaniements cellulaires qui guident la morphogenèse. Cependant, le moment exact et les mécanismes responsables du passage de la multipotence à l'unipotence sont encore inconnus.OBJECTIF ET MÉTHODOLOGIEL'objectif principal de ce projet était d'intégrer les circuits transcriptionnels définissant le potentiel de différenciation des cellules souches à l'analyse de la morphogenèse cellulaire et tissulaire en temps réel, afin de déchiffrer les mécanismes qui sous-tendent l'acquisition de l'identité cellulaire et d'étudier la coordination entre spécification des cellules souches et morphogenèse. Nous avons abordé cet objectif ambitieux en combinant deux approches : 1) des analyses transcriptomiques en cellule unique intégrées dans l’espace, au cours du développement mammaire, et 2) une approche de suivi du lignage en temps réel dans des cultures mammaires embryonnaires ex vivo, afin d'étudier les comportements et réarrangements cellulaires au cours des premières phases de la croissance mammaire.RÉSULTATSNous avons constaté que la restriction du potentiel des cellules souches est progressive pendant le développement embryonnaire. Par transcriptomique sur cellules uniques, nous avons pu distinguer trois types cellulaires distincts très tôt (E15). L'intégration dans l’espace de ces données transcriptomiques nous a révélé que des cellules de type BC et LC sont positionnées différemment dans le bourgeon mammaire très précocement. Cette analyse a donc révélé de nouveaux marqueurs moléculaires des LC et BC embryonnaires, qui ne peuvent pas être distingués avec les marqueurs mammaires adultes connus.De plus, nous avons défini les signatures transcriptionnelles qui distinguent deux populations de cellules stromales mammaires embryonnaires délimitées dans l'espace. Nous avons aussi montré qu’une signalisation paracrine du mésenchyme aux cellules épithéliales, via Fgf10-Fgfr2, influence la morphogenèse de la glande mammaire.Nous avons ensuite développé une approche d’analyse d’images semi-automatique aux niveaux cellulaire et tissulaire dans nos explants mammaires analysés par microscopie time-lapse. Nous montrons que les étapes initiales de la morphogenèse sont caractérisées par des réarrangements cellulaires très dynamiques. De plus, l'activation épithéliale de la beta-catenin empêche la formation de branches, indiquant que Wnt est un régulateur essentiel de la morphogenèse mammaire.Ces travaux mettent en lumière les circuits transcriptionnels qui régissent le branchement mammaire et qui lient la différenciation des cellules souches à leur dynamique cellulaire pendant la morphogenèse. Les mécanismes ainsi dévoilés nous fournissent des biomarqueurs potentiels du cancer du sein, qui résulte souvent de la réactivation de programmes de multipotence embryonnairesDEFINING CELL FATE SPECIFICATION OF MOUSE MAMMARY STEM CELLS IN 4DCoordination of cell fate specification and branching morphogenesis is necessary to generate an organ with its specialized final structure and function. Accordingly, how different cell types are specified in a tightly regulated manner in time and space, in order to drive the morphogenesis of a complex tissue, remains a major question in the field of developmental biology.The mammary gland (MG) consists in a branched bi-layered epithelium composed of an outer layer of basal cells (BCs) and an inner compartment of polarised luminal cells (LCs). In this tissue, adult homeostasis is exclusively maintained by lineage-restricted unipotent progenitors, whereas multipotent mammary stem cells (MaSCs) are only found in the embryonic gland, making it an ideal tissue paradigm to study stem cell dynamics and lineage specification, as well as their contribution to tissue morphogenesis.WORKING HYPOTHESISOur recent results showed that multipotent MaSCs become lineage-restricted around embryonic day E15.5, coinciding with the first morphogenetic events that establish the mammary ductal network. We thus hypothesized that loss of multipotency in the mammary gland was linked to cell rearrangements, leading to the branching of embryonic mammary buds. However, the exact timing and the mechanisms responsible for the switch from multipotency to unipotency during embryonic MG are still unknown.AIM AND METHODOLOGYThe overarching aim of this project was to characterise the stem cell dynamics underlying MaSCs differentiation during MG development, and to define the transcriptional signals underpinning this process. We have approached this ambitious objective combining two approaches: 1) single-cell RNA sequencing analysis at different embryonic times, to discover which signals determine cell identity during mammary development, and 2) a live lineage tracing approach in ex vivo embryonic mammary cultures to study dynamic cell behaviours and rearrangements during the earliest phases of mammary growth.RESULTSWe found that lineage restriction is a progressive developmental process. By single cell transcriptomics, we identified a single population of mammary epithelial cells at E13.5, but we could distinguish three transcriptionally distinct cell subsets at E15.5, which included luminal-like, basal-like and hybrid cells co-expressing luminal and basal genes. Spatial transcriptomic analysis revealed that the basal-like and luminal-like clusters were indeed already spatially restricted in the embryonic mammary bud, being positioned either in close proximity to the basement membrane or in the inner bud region, respectively. Importantly, this analysis revealed novel molecular markers of committing LCs and BCs, that cannot be distinguished with known adult MG markers.Additionally, we report the transcriptional signatures distinguishing two spatially restricted embryonic mammary mesenchymal cell populations, representing sub-epithelial and dermal mesenchyme. Long-term live-imaging revealed that paracrine signalling from embryonic mesenchyme to epithelial cells, via Fgf10-Fgfr2, influences epithelial branching.We then developed a deep learning-based pipeline to semi-automatically track individual cells and tissue branches in embryonic mammary explants analysed by time-lapse microscopy. We show that the initial steps of morphogenesis are characterized by highly dynamic cell rearrangements in the growing branch tips. However, forced activation of the Wnt/b-catenin pathway in the embryonic mammary epithelium precluded branching in vivo and ex vivo, indicating that epithelial Wnt signalling is an essential regulator of mammary branching morphogenesis.This work sheds light on the timing and mechanisms governing mammary cell fate decisions, providing potential biomarkers of breast cancer, which often arises from reactivation of embryonic multipotency programs
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Aupérin, Anne. "Carcinomes broncho-pulmonaires non à petites cellules localement avancées : évaluation de la chimiothérapie associée à la radiothérapie par les méta-analyses sur données individuelles." Paris 11, 2010. http://www.theses.fr/2010PA11T017.