Дисертації з теми "Activité axonale"

Le glioblastome (GB), une tumeur cérébrale d'origine gliale, est la tumeur primaire du système nerveux central la plus fréquente et la plus agressive chez l'adulte, avec un taux de survie médian de moins de 18 mois après un traitement standard. Ce mauvais pronostic est principalement lié au caractère invasif des cellules tumorales gliales, responsable des échecs thérapeutiques. Les faisceaux de substance blanche constituent une voie majeure d'invasion des gliomes, mais les mécanismes impliqués dans l'invasion des gliomes sont encore mal compris. Dans ce travail de thèse, des cellules de GB humain U87 ont été injectées dans des souris adultes Nude immunodéficientes. Cette lignée présente une masse tumorale circonscrite avec des colonnes d'invasion collective dans le parenchyme sain. L’invasion tumorale est majoritairement périvasculaire mais les cellules U87 contactent également les axones au sein de la substance blanche. Des dommages spécifiques de la substance blanche incluant des dommages axonaux avec une démyélinisation, ainsi qu’une hyperexcitabilité axonale péritumorale ont été mis en évidence. La modulation de l’activité axonale par une approche optogénétique indique que l’augmentation de l’activité axonale favorise l’invasion tumorale. Pour conclure, les dommages tissulaires et fonctionnels des faisceaux de fibres de la substance blanche constitue un microenvironnement favorable à la progression tumorale
Glioblastoma (GB), a brain tumor of glial origin, is the most common and most aggressive primary tumor of the central nervous system in adults, with a median survival rate of less than 18 months after standard treatment. This poor prognosis is mainly due to the invasive nature of the glial tumor cells, which is responsible for treatment failures. White matter tracts are a major pathway of glioma invasion, but the mechanisms involved in this process are still poorly understood. In this thesis work, the human glioblastoma U87 cell line was injected into immunodeficient adult Nude mice. This lineage presents a circumscribed tumor mass with collective invasion into the healthy parenchyma. U87 cell display predominantly a perivascular migration, and U87 cells also contact axons within the white matter. Specific damages of the white matter have been demonstrated. They include axonal damages and associated demyelination as well as a peritumoral axonal hyperexcitability. Modulation of axonal activity using optogenetic indicates that increased axonal activity promotes tumor invasion. To conclude, structural and functional damages of the white matter bundles therefore constitute a microenvironment suitable for tumor progression

Au cours du développement du système nerveux, l'activité des cibles post-synaptiques permet le raffinement du nombre et de la force des connexions neuronales. En employant la jonction neuromusculaire de Caenorhabditis elegans comme système modèle, nous avons étudié deux aspects de la mise en place de ces connexions. D'une part, nous montrons que le nombre de récepteurs présents à la jonction neuromusculaire est contrôlé par l'activité musculaire : une augmentation de l'activation synaptique entraîne une régulation différentielle des trois types de récepteurs présents à la jonction neuromusculaire. D'autre part, nous avons étudié les changements de la morphologie de certains motoneurones de la tête du ver, appelés neurones SAB, en fonction de l’activité musculaire. Une diminution de l’activité musculaire durant une période critique du développement entraîne une surcroissance axonale des neurones SAB. À travers différentes approches, nous avons pu identifier la suppression de la surcroissance axonale dans des mutants où la biosynthèse des neuropeptides est perturbée. Enfin, nous avons mis en évidence que la surcroissance axonale apparait également lors de perturbations plus générales de la physiologie cellulaire, telles qu'un choc thermique ou la surexpression d'un transgène, ce qui suggère que le système SAB est plastique et particulièrement sensible au cours du développement
Throughout nervous system development, activity of the post-synaptic targets can regulate the connectivity of neural networks, affecting both the number and strength of synapses. Using the neuromuscular junction of Caenorhabditis elegans as a model system, we studied two processes displaying such plasticity. First, we show that the number of receptors present at the neuromuscular synapse is regulated by muscle activity: an increase in synaptic activity can lead to a differential regulation of the three types of receptors present at the neuromuscular junction. Second, we studied the activity-dependent morphological changes of one type of motor neurons in the worm’s head, called the SAB neurons. A decrease of muscle activity during a critical developmental phase leads to SAB axonal overgrowth. Using several approaches, we were able to observe suppression of SAB axonal overgrowth in mutants with a disruption of neuropeptides biosynthesis. Finally, we give evidence that axonal overgrowth also occurs following more general disruptions of cell physiology, such as a heat-shock or transgene overexpression, which suggest that the SAB system is plastic and sensitive during development

Les lésions du Système Nerveux Central, qu'elles soient accidentelles ou liées à une maladie, sont à l'origine de dégâts irréversibles. En effet, suite à la section des axones, il s'en suit un processus de cicatrisation. Cette « cicatrice gliale » constitue une barrière physique et chimique sollicitant de nombreux acteurs cellulaires et moléculaires. Les principales cellules la constituant sont les astrocytes, les oligodendrocytes, les microgliocytes et les fibroblastes. Ces cellules surexpriment les protéines de myéline et la sémaphorine 3A (Sema3A), des agents très inhibiteurs de la régénération nerveuse et de la croissance axonale. Par ailleurs, l'hyperactivité des microgliocytes est à l'origine de l'augmentation considérable de la quantité de radicaux libres oxygénés néfastes pour les neurones.
Une approche thérapeutique novatrice serait l'utilisation de composés hybrides portant deux activités distinctes. Une activité neurotrophique permettant la neuro-régénération et une activité antioxydante assurant la neuro-protection en piégeant les radicaux libres.
Dans cet objectif, cinq séries de molécules hybrides combinant une chaîne grasse Ω-hydroxylée et des noyaux quinol ont été synthétisés. Les alcools gras quinoliques (QFA) C-alkylés, comportant des noyaux quinol polyméthoxylés, ont été obtenu par couplage de Sonogashira entre des arylbromures et des alcynes vrais. Les homologues N- ou O-alkylés ont été obtenus par des réactions de type SN2.
Les molécules synthétisés possèdent de très bonnes activités antioxydantes sous leurs formes déméthylés dépassant d'un facteur 100 l'activité antioxydante du Trolox®. Par ailleurs, le QFA15 portant une chaîne latérale à 15 atomes de carbones, est capable de promouvoir une croissance axonale très importante, aussi bien sur substrat permissif que sur substrat inhibiteur tel les protéines de myéline ou la Sema3A. Des études préliminaires du mécanisme d'action ont permis de conclure que le QFA15 sollicite les nucléotides cycliques.

Pendant le développement, les projections axonales à longue distance se ramifient pour se connecter à leurs cibles. L’établissement et le remodelage de ces connexions est notamment régulé par l’activité neuronale. L’adaptation de la morphologie de l’axone nécessite alors des quantités importantes de matériel sécrétoire et de facteur trophiques comme le BDNF (brain derived neurotrophic factor). Ce matériel est transporté dans des vésicules le long de l’axone depuis le corps cellulaire où il est synthétisé, vers les sites actifs à l’extrémité de l’axone. Si le relargage de vésicules sécrétoires à la synapse est bien étudié, les mécanismes régulant le transport axonal par l’activité sont encore méconnus.Dans ce travail de thèse, nous avons dans un premier temps développé des outils permettant d’étudier les dynamiques intracellulaires dans des réseaux neuronaux. Nous avons ainsi développé une chambre microfluidique permettant de reconstruire in vitro des réseaux neuronaux physiologiques et compatibles avec de la vidéomicroscopie à haute résolution. Nous avons caractérisé l’établissement et la maturation du réseau et validé l’intérêt de ce dispositif microfluidique dans le contexte de la maladie de Huntington. Nous avons ensuite étudié l’évolution des dynamiques intracellulaires avec la maturation du réseau. Nous avons notamment observé une augmentation du transport axonal de vésicules sécrétoires en fonction de l'état de maturation du réseau neuronal. Ces premières observations ont renforcé l’hypothèse d’une régulation directe du transport axonal de vésicules sécrétoires par l’activité neuronale au cours du développement du réseau.Nous avons ainsi fait évoluer la plateforme microfluidique par l’ajout d’un réseau d’électrodes (MEA) qui permet d'étudier les dynamiques intracellulaires tout en contrôlant l’activité neuronale. A l’aide de ce système, nous avons identifié un groupe de vésicules sécrétoires ancré le long de l’axone et recruté en réponse à une haute activité neuronale en direction des sites présynaptiques actifs. Nous avons alors identifié les acteurs impliqués dans ce mécanisme dépendant de l’activité. Nous avons montré que la myosine Va permettait l’attachement des vésicules le long de l’axone dans des structures d’actine dynamique. L’activité neuronale induit une augmentation de calcium le long de l’axone, via l’activation des canaux calciques dépendant du voltage, qui régule la myosine Va et entraine le recrutement des vésicules stockées dans l’axone sur les microtubules. Une fois les acteurs identifiés, nous avons pu mettre en évidence le rôle de ce mécanisme dépendant de l’activité dans la formation de branches axonales pendant le développement. Enfin, nous avons confirmé l’existence de ce groupe de vésicules dépendant de l’activité et résidant dans l’axone in vivo grâce à la mise au point d'un système d’étude du transport axonal sur tranches aigües de cerveau en microscopie biphotonique.L’ensemble de ce travail propose de nouveaux outils in vitro et in vivo pour comprendre les régulations des dynamiques intracellulaires dans des réseaux neuronaux physiologiques. Grâce à ces outils, nous avons identifié un mécanisme de régulation local qui permet l'adressage rapide de facteurs trophiques vers les branches en développement en réponse à l’activité neuronale
During postnatal development, long-distance axonal projections form branches to connect with their targets. Establishment and remodeling of these projections are tightly regulated by neuronal activity and require a large amount of secretory material and trophic factors, such as brain derived neurotrophic factor (BDNF). Axonal transport is responsible for addressing trophic factors packed into vesicles to high demand sites where mechanisms of secretion are well-known. However, mechanisms controlling the preferential targeting of axonal vesicles to active sites in response to neuronal activity are unknown.In this work, we first developed tools to study intracellular dynamics in neuronal networks. We thus developed a microfluidic chamber to reconstruct physiologically-relevant networks in vitro which is compatible with high resolution videomicroscopy. We characterized the formation and maturation of reconstructed networks and we validated the relevance of the microfluidic platform in the context of Huntington’s disease. We then studied the evolution of intracellular dynamics with the maturation of reconstructed neuronal networks in microfluidic chambers. We observed an increase of anterograde axonal transport of secretory vesicles during maturation. These first results lead us to think that neuronal activity could regulate axonal transport of secretory vesicles over maturation of the network.Therefore, we improved the in vitro microfluidic system with a designed microelectrode array (MEA) substrate allowing us to record intracellular dynamics while controlling neuronal activity. Using this system, we identified an axon-resident reserve pool of secretory vesicles recruited upon neuronal activity to rapidly distribute secretory materials to presynaptic sites. We identified the activity-dependent mechanism of recruitment of this axonal pool of vesicles along the axon shaft. We showed that Myosin Va ensures the tethering of vesicles in the axon shaft in axonal actin structures. Specifically, neuronal activity induces a calcium increase after activation of Voltage Gated Calcium Channels along the axon, which regulates Myosin Va and triggers the recruitment of tethered vesicles on microtubules. We then showed the involvement of this activity-dependent pool for axon branches formation during axon development. By developing 2-photon live microscopy of axonal transport in acute slices, we finally confirmed that a pool of axon-resident static vesicles is recruited by neuronal activity in vivo with a similar kinetic.Altogether, this work provides new in vitro and in vivo tools to study intracellular dynamics in physiological networks. Using these tools, we identified the existence of a local mechanism of axonal transport regulation along the axon shaft, allowing rapid supply of trophic factors to developing branches

Thesis (Ph. D.)--University of California, San Diego, 2008.
Title from first page of PDF file (viewed Nov. 5, 2008). Available via ProQuest Digital Dissertations. Vita. Includes bibliographical references.

L'activité constitutive est une propriété pharmacologique que possèdent de nombreuxrécepteurs couplés aux protéines G. Cependant, son rôle biologique reste largement inconnu.Nous avons étudié les relations entre la pharmacologie et le trafic intracellulaire du récepteurcannabinoïque CB1, un récepteur abondamment exprimé dans le cerveau qui possède uneactivité constitutive avérée. Exprimé dans les cellules HEK-293, l'activité constitutive durécepteur CB1 provoque un cycle continu d'endocytose et de recyclage du récepteur entre lamembrane plasmique et les endosomes intracellulaires : à l'équilibre, le récepteur CB1 estmajoritairement présent dans les endosomes. Le cycle fait intervenir une endocytose par puitsrecouverts de clathrine et un trafic intracellulaire dépendant de Rab5 et de Rab4, mais pas deRab11. Dans les neurones d'hippocampe en culture, ce cycle d'endocytose/recyclage durécepteur CB1 est limité au compartiment somatodendritique, et le récepteur est stable à lasurface de l'axone. Ce cycle dépend de l'activité constitutive du récepteur CB1 etl'endocytose sélective du récepteur dirige l'établissement de l'expression axonale durécepteur CB1 à la surface du neurone.

The complex wiring of the mammalian brain is established by accurate axonal guidance and synaptogenesis. These developmental processes are highly regulated by ligands and their corresponding cell surface receptors expressed on neurons. Unfortunately, the mature central nervous system (CNS) severely restricts neurite outgrowth following injury in part due to the presence of inhibitory ligands and receptors. The Nogo66 receptor (NgR1) is expressed by mature neurons and inhibits the regrowth of injured CNS neurons by binding to multiple inhibitory ligands. Further, NgR1 is highly expressed in synaptogenic areas such as the cortex and hippocampus where it regulates synaptic plasticity and restricts experience-dependent plasticity. Interestingly, NgR1 levels in neurons can be altered by proteolytic activity termed shedding, which is mediated by metalloproteinases. This process reduces cell surface full length NgR1 and generates a soluble dominant negative fragment, which has the potential to impact NgR1 function in the brain. My thesis focused on studying the impact of metalloproteinase induced shedding on NgR1 function. Herein I provide evidence that membrane anchored metalloproteinases can cleave NgR1 from neurons and attenuate responses to inhibitory cues. Membrane type metalloproteinases are expressed in the adult mouse brain and promote NgR1 shedding until late adulthood. NgR1 is shed from synaptosomes suggesting that this mechanism may regulate NgR1 function at the synapse. These results prompted us to investigate whether metalloproteinase activity can regulate axonal outgrowth through other cell surface proteins. We determined that membrane anchored metalloproteinases promote axonal outgrowth from CNS and PNS neurons. We identified several candidate targets by mass spectroscopy, which include the adhesive protein family IgLONs that are known to regulate axonal outgrowth. Together, the data presented here extends our understanding of metalloproteinase-dependent regulation of neurite outgrowth during development. In addition, our observations with NgR1 shedding by metalloproteinases suggest that this process is conserved in neurite outgrowth inhibition and restriction of synaptic plasticity.
La complexité du circuit du cerveau des mammifères est établie par le guidage axonal et la synaptogenèse. Ces processus de développement sont réglementés par des ligands et leurs récepteurs localisés à la surface cellulaire des neurones. Malheureusement, suite à une lésion, le système nerveux central (SNC) de mammifères adultes restreint sévèrement la croissance des neurites en partie par la présence de ligands et récepteurs inhibiteurs. Le récepteur de Nogo66 (NgR1), exprimé par les neurones matures, inhibe la repousse des neurones du SNC lésés par sa liaison à de multiples ligands inhibiteurs. En outre, NgR1 est fortement exprimé dans les zones synaptogeniques comme le cortex et l'hippocampe où il régule la plasticité synaptique et limite la plasticité dépendante d'expérience sensorielle. Les niveaux de NgR1 dans les neurones peuvent être altérés par l'activité protéolytique des métalloprotéinases. Celle-ci réduit les niveaux de NgR1 à la surface neuronale en générant un fragment soluble dominant négatif, qui peut avoir un impact sur la fonction de NgR1 dans le cerveau. Mon mémoire porte sur l'étude de l'impact de la protéolyse de NgR1 par les métalloprotéinases sur sa fonction dans le SNC. Ici, je présenterai des preuves que les métalloprotéinases membranaires peuvent cliver NgR1 à la surface neuronale et atténuer les réponses aux signaux inhibiteurs. Ces métalloprotéinases sont exprimées dans le cerveau de souris et peuvent promouvoir la protéolyse de NgR1 jusqu'à l'âge adulte. NgR1 est aussi clivé dans les synaptosomes suggérant que ce mécanisme peut réguler la fonction de NgR1 à la synapse. Ces résultats nous ont incités à rechercher si l'activité des métalloprotéinases peut réguler la croissance axonale par d'autres protéines de surface cellulaire. Nous avons déterminé que les métalloprotéinases membranaires peuvent promouvoir la croissance axonale du SNC et du système nerveux périphérique (SNP). Pour élucider le mécanisme sous-tendant ce phénotype, nous avons identifié des protéines candidates par spectrométrie de masse, qui comprennent les protéines adhésives IgLONs, une famille de protéines connues pour réguler la croissance axonale. Ensemble, les données présentées ici accroissent notre compréhension de la régulation par métalloprotéinases sur la croissance des neurites au cours du développement. En outre, nos observations avec la protéolyse de NgR1 par les métalloprotéinases suggèrent que ce processus est conservé dans l'inhibition de la croissance des neurites et la restriction de la plasticité synaptique.

Les neurones commissuraux assurent la coordination des informations motrices et somatosensorielles entre les deux moitiés du système nerveux central. Dans la partie caudale du SNC, les axones commissuraux migrent d'abord vers la ligne médiane ventrale, la plaque du plancher, pour la traverser et puis atteindre leur cible finale. Les mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent le croisement de la ligne médiane ont fait l'objet d'Etudes approfondies. Ramón y Cajal, dans sa théorie neurotrophique, a suggéré que les cellules de la plaque de plancher pourraient libérer des facteurs diffusibles qui attirent les axones commissuraux vers la ligne médiane ventrale. La nétrine-1, une protéine découverte il y a plus de deux décennies, est une protéine secrétée exprimée à la fois par les cellules de la plaque de plancher et les progéniteurs de la zone ventriculaire et possède une activité chimioattractive à longue distance in vitro. Aujourd'hui, la nétrine-1 est largement acceptée comme l'exemple parfait de la chimioattraction à longue distance. Cependant, nos résultats remettent en question ce modèle, proposant un mécanisme d'action à courte portée de nétrine-1 pendant le guidage des axones commissuraux. En effet, nous avons déterminé que la nÉtrine-1 dérivée de la plaque du plancher n'est pas nécessaire pour le guidage des axones commissuraux. C’est la nétrine-1 dérivée de la zone ventriculaire qui est nécessaire et suffisante pour induire la migration dorso-ventrale des axones commissuraux du cerveau postérieur et leur croisement de la ligne médiane. Nous avons Également confirmé que les progéniteurs de la zone ventriculaire sont la principale source de Netrin-1 pour la migration ventrale des neurones précérébelleux. De plus, nous observons qu'en l'absence de nétrine-1 dérivée de la zone ventriculaire, les axones commissuraux et les neurones précérébelleux envahissent plusieurs nerfs crâniens. Il s’agit d'un procès autonome et dépendant de Dcc. A différence du tronc cérébral, dans la moelle épinière, les deux sources de nétrine-1 agissent en synergie pour assurer le guidage des axones commissuraux et le croisement des lignes médianes. Les neurones commissuraux sont une population diverse distribuée tout au long du système nerveux. Pour analyser la diversité moléculaire des neurones commissuraux du cerveau postérieur et de la moelle épinière, nous avons utilisé des approches combinant la génétique de la souris et la transcriptomique. Nous travaillons actuellement sur de nouveaux facteurs de transcription qui pourraient jouer un rôle dans le développement des neurones commissuraux du tronc et de la moelle épinière
Commissural neurons ensure the coordination of motor and somatosensory information between halves of the central nervous system. In the caudal part of the CNS, commissural axons, first grow toward the ventral midline, the floor plate, to cross it and reach their final target. The cellular and molecular mechanisms controlling midline crossing have been extensively studied. Ram—n y Cajal, in his neurotropic theory, suggested that floor plate cells could release diffusible factors chemo-attracting commissural axons to the ventral midline. Netrin-1, a protein discovered more than 2 decades ago, is a secreted protein expressed both by floor plate cells and ventricular zone progenitors and with long-range chemoattractive activity in vitro. Today, Netrin-1 is widely accepted as the textbook example of long-range chemoattractive guidance cue. However, our results, challenge this model by proposing a short-range mechanism of action for Netrin-1 during commissural axon guidance. Indeed, we determined that floor plate-derived netrin-1 is dispensable for commissural axon guidance. Instead, ventricular zone-derived netrin-1 is necessary and sufficient to promote the dorso-ventral extension of hindbrain commissural axons and midline crossing. We also confirmed that ventricular zone progenitors are the main Netrin-1 source for ventrally migrating precerebellar neurons. In addition, we observe that in absence of ventricular zone-derived netrin-1, commissural axons and precerebellar neurons cell bodies invade several cranial nerves. This appears to be a cell- autonomous and Dcc-dependent process. This mechanism is not conserved in the spinal cord, where both netrin-1 sources act synergistically to ensure commissural axon guidance and midline crossing. Commissural neurons are diverse and found throughout the nervous system. To analyse the molecular diversity of hindbrain and spinal cord commissural neurons, we used approaches combining mouse genetics and transcriptomics. We are currently working on some novel transcription factors that might play a role in the development of hindbrain and spinal cord commissural neurons

This thesis deals with machine learning techniques for the extraction of structure and the analysis of the vertebrate olfactory pathway based on related methods. Some of its main contributions are summarized below. We have performed a systematic investigation for classification in biomedical images with the goal of recognizing a material in these images by its texture. This investigation included (i) different measures for evaluating the importance of image descriptors (features), (ii) methods to select a feature set based on these evaluations, and (iii) classification algorithms. Image features were evaluated according to their estimated relevance for the classification task and their redundancy with other features. For this purpose, we proposed a framework for relevance and redundancy measures and, within this framework, we proposed two new measures. These were the value difference metric and the fit criterion. Both measures performed well in comparison with other previously used ones for evaluating features. We also proposed a Hopfield network as a method for feature selection, which in experiments gave one of the best results relative to other previously used approaches. We proposed a genetic algorithm for clustering and tested it on several realworld datasets. This genetic algorithm was novel in several ways, including (i) the use of intra-cluster distance as additional optimization criterion, (ii) an annealing procedure, and (iii) adaptation of mutation rates. As opposed to many conventional clustering algorithms, our optimization framework allowed us to use different cluster validation measures including those which do not rely on cluster centroids. We demonstrated the use of the clustering algorithm experimentally with several cluster validity measures as optimization criteria. We compared the performance of our clustering algorithm to that of the often-used fuzzy c-means algorithm on several standard machine learning datasets from the University of California/Urvine (UCI) and obtained good results. The organization of representations in the brain has been observed at several stages of processing to spatially decompose input from the environment into features that are somehow relevant from a behavioral or perceptual standpoint. For the perception of smells, the analysis of such an organization, however, is not as straightforward because of the missing metric. Some studies report spatial clusters for several combinations of physico-chemical properties in the olfactory bulb at the level of the glomeruli. We performed a systematic study of representations based on a dataset of activity-related images comprising more than 350 odorants and covering the whole spatial array of the first synaptic level in the olfactory system. We found clustered representations for several physico-chemical properties. We compared the relevance of these properties to activations and estimated the size of the coding zones. The results confirmed and extended previous studies on olfactory coding for physico-chemical properties. Particularly of interest was the spatial progression by carbon chain that we found. We discussed our estimates of relevance and coding size in the context of processing strategies. We think that the results obtained in this study could guide the search into olfactory coding primitives and the understanding of the stimulus space. In a second study on representations in the olfactory bulb, we grouped odorants together by perceptual categories, such as floral and fruity. By the application of the same statistical methods as in the previous study, we found clustered zones for these categories. Furthermore, we found that distances between spatial representations were related to perceptual differences in humans as reported in the literature. This was possibly the first time that such an analysis had been done. Apart from pointing towards a spatial decomposition by perceptual dimensions, results indicate that distance relationships between representations could be perceptually meaningful. In a third study, we modeled axon convergence from olfactory receptor neurons to the olfactory bulb. Sensory neurons were stimulated by a set of biologically-relevant odors, which were described by a set of physico-chemical properties that covaried with the neural and glomerular population activity in the olfactory bulb. Convergence was mediated by the covariance between olfactory neurons. In our model, we could replicate the formation of glomeruli and concentration coding as reported in the literature, and further, we found that the spatial relationships between representational zones resulting from our model correlated with reported perceptual differences between odor categories. This shows that natural statistics, including similarity of physico-chemical structure of odorants, can give rise to an ordered arrangement of representations at the olfactory bulb level where the distances between representations are perceptually relevant.

QC 20120224

Eukaryotic flagella and cilia are long rod-like extensions of cells, which play a fundamental role in single cell movement, as well as in fluid transport. Flagella and cilia contain a highly evolutionary conserved mechanical structure called the axoneme. The motion of the flagellum is generated by dynein motor proteins, located all along the length of the axonemal structure. Fluorescent ATP analogs have been a useful tool to study ATPase activity of various motor proteins. \acrfull{mant} has been previously used to probe the activity of various ATPases, including dynein. It has been shown by various authors, that MANT-ATP supports dynein activity as well as the axonemal beat. However, direct observations of binding to the axonemal structure were not previously reported. Using highly sensitive fluorescent microscopy to monitor the binding of the fluorescent ATP analog, I probed dynein activity directly in the immobilized intact axoneme for the first time. To understand these kinetics a kinetic model was developed. By fitting this model to experimental data I was able to identify ATP-binding sites with distinct kinetic properties in the axoneme. I report a turnover rate of k = 0.02 s−1 at 1μM mant-ATP for dynein. Moreover, I discovered that there is binding of the ATP analog to the axoneme with a much higher rate of k = 11 s−1 at 1μM mant-ATP. By the application of this method to axonemes with reduced dyneins, it has been identified that the slow rate belongs to dynein.

Trabalho Final do Mestrado Integrado em Medicina apresentado à Faculdade de Medicina
Alzheimer’s disease is the most common neurodegenerative disorder in the world, characterized by cognitive deficits and dementia. Amyloid-beta peptide and tau protein aggregate are the two disease hallmarks, forming plaques and neurofibrillary tangles, respectively. These insoluble structures have been recognized to cause synaptic and neuronal dysfunction, progressively leading to neurodegeneration. This review aims to describe the processing of these proteins and their modifications leading to aggregation, as well as synaptic-based mechanisms that result in behavioral changes and memory loss in AD. Part of these mechanisms include modifications in axonal transport and dendritic activity, due to hyperphosphorylation of tau protein, as well as activation of glutamate receptors preceding excitotoxic events, which involve calcium dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction, closely linked to synaptic dysfunction. Understanding how these processes intricately work is expected to bring about new therapeutic strategies worth to be explored in the near future .
A doença de Alzheimer é a doença neurodegenerativa mais comum no mundo e é caraterizada por defeitos cognitivos e demência. As agregações de amilóide-beta e proteína tau são caraterísticas da doença e conduzem à formação de placas e estruturas insolúveis de tau, respetivamente. Estes depósitos foram reconhecidos como causadores de disfunção sinática e neuronal, conduzindo a neurodegeneração. Esta revisão tem como objetivo descrever os processos que estas proteínas sofrem até se tornarem agregados e os mecanismos que causam disfunção sinática até ao aparecimento de alterações no comportamento e perda de memória. Alguns destes processos patológicos, incluem modificações no transporte axonal e actividade dendrítica, devido à excessiva fosforilação da proteína tau e ativação dos recetores glutamatérgicos, que culminam em eventos excitotóxicos, que envolvem desregulação no balanço de cálcio no neurónio e disfunção mitocondrial. Perceber como estes mecanismos se relacionam é a base do desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que possam ser exploradas num futuro próximo .

Axon degeneration is a selective elimination of axons, which plays a crucial role during development, injury, and maintenance of neuronal connections. The p75 neurotrophin receptor (NTR) is responsible for maintaining the specificity of neuronal connectivity in parts of the adult brain by inducing the degeneration of aberrantly growing axons into myelinated tracts. The objective of this study is to identify and characterize the signaling pathways used by p75NTR to mediate axon degeneration on myelin. Since p75NTR signals via JNK/Bax/caspase pathway to cause apoptosis, I asked whether this pathway might also be involved in axon degeneration. I observed that inhibition of JNK or Bax significantly decreased myelin-induced axonal degeneration, while depolarization of axons with potassium chloride prevented axonal degeneration on myelin. Together, these results suggest that p75NTR-dependent, myelin-mediated axon degeneration occurs via JNK/BAX signaling, and that neural activity is important for the prevention of myelin-induced axonal degeneration.