Дисертації з теми "-57.08"

Актуальність дослідження: Під час розробки ультразвукової терапевтичної апаратури, виникають дві основні проблеми: перевірка наявності контакту перетворювача з біологічним об'єктом, а також можливість виникнення стоячих хвиль. Використовуючи ефект широкополосностi можна уникнути цих проблем. Метою дисертації: є дослідження механізми дії ультразвуку на біолгочні тканини, розрахунок широкосмугових перетворювачів, розрахунок схеми високочастотного збудження елементів. Об’єктом дослідження: є ультразвукові п’єзоелектричні перетворювачі та їх сучасне використання у медицині. Предметом дослідження: широкосмугові п’єзоелектричні перетворювачі та їх характеристки роботи за різних умов. Методи дослідження: проведені в роботі теоретичні та практичні дослідження ґрунтуються на аналізі роботи перетворювачів при взаємодії з біологічними тканинами. Результатом дослідження: є можливість уникнення стоячих хвиль під час взаємодії з біологічними тканинами та розширення діапазону широкосмугових перетворювачів. Новизна отриманих результатів: обґрунтовано необхідність і доцільність застосування використання широкосмугових п'єзоелектричний випромінювачів для терапевтичного апарата. Практичне значення одержаних результатів: результати роботи можуть бути використані при проектуванні терапевтичних апаратів.
Relevance of the research: During the development of ultrasonic therapeutic equipment, there are two main problems: checking the presence of contact of the transducer with a biological object, as well as the possibility of standing waves. These problems can be avoided by using the broadband effect. The purpose of the dissertation: there is a study of the mechanisms of action of ultrasound on biological tissues, the calculation of broadband transducers, the calculation of the scheme of high-frequency excitation of elements. The object of research: are ultrasonic piezoelectric transducers and their modern use in medicine. Subject of research: broadband piezoelectric transducers and their characteristics of operation under different conditions. Research methods: theoretical and practical research is based on the analysis of work of converters at interaction with biological fabrics. The result of the study: it is possible to avoid standing waves when interacting with biological tissues and expand the range of broadband transducers. The novelty of the obtained results: the necessity and expediency of using broadband piezoelectric emitters for the therapeutic apparatus are substantiated. Practical significance of the obtained results: the results of the work can be used in the design of therapeutic devices. Testing the results of the thesis: The results of the master's dissertation were made at the scientific seminar of the department of acoustic and multimedia electronic systems.

В роботі запропонована та розрахована система захисту інформації на основі мінюцій, що надає змогу зменшити ризики несанкціонованого доступу до наукової інформації. Запропонована система захисту дозволить зберегти інтелектуальний ресурс, що отримується зимівниками станції в більш поміркованій собіватрості у порівнянні з існуючими світовими аналогами.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук за спеціальністю 01.05.02 – математичне моделювання та обчислювальні методи. – Тернопільський національний технічний університет імені Івана Пулюя, Тернопіль, 2019 р. У дисертаційній роботі розв’язано актуальне наукове завдання –удосконалення математичної моделі та методів аналізу фонокардіосиґналу одночасно зареєстрованого з електрокардіосиґналом із врахуванням механізму породження його для підвищення достовірності ранньої діагностики стану серцево-судинної системи людини в автоматизованих діагностичних системах. Обґрунтовано нове застосування періодично корельованого випадкового процесу як математичної моделі фонокардіосиґналу одночасно зареєстрованого з електрокардіосиґналом, яка, на відміну від відомих, відображає механізм породження його (генезу), що дає змогу визначення характеристик моделі за результатами експериментів і враховує поєднання стохастичності із повторністю сигналу. Базуючись на обґрунтованій математичній моделі та на концепції «шунтування», модифіковано синфазний метод статистичного опрацювання фонокардіосиґналу одночасно зареєстрованого з електрокардіосиґналом у системах автоматизованої діагностики, з урахуванням механізму ґенезу фонокардіосиґналу. У результаті опрацювання отримано значення спектральних компонент фонокардіосиґналу, які є його інформативно-інваріантними ознаками та із визначеною достовірністю характеризують функціональний стан серцево-судинної системи людини. Розроблено метод імітаційного моделювання фонокардіосиґналу на основі періодично корельованої випадкової послідовності для верифікації результатів досліджень. Створено пакет комп’ютерних програм для автоматизованого опрацювання фонокардіосиґналу та проведення імітаційних експериментів для автоматизованих діагностичних систем.
Диссертация на соискание научной степени кандидата технических наук за специальностью 01.05.02 – математическое моделирование и вычислительные методы. – Тернопольский национальный технический университет имени Ивана Пулюя, Тернополь, 2019 г. В диссертационной работе решена актуальная научная задача – совершенствование математической модели и методов анализа фонокардиосигналапараллельно зарегистрированного с электрокардиосигналом с учетом механизма порождения его для повышения достоверности ранней диагностики состояния сердечно-сосудистой системы человека в автоматизированных диагностических системах. Обоснованно новое применение периодически коррелированного случайного процесса как математической модели фонокардиосигналапараллельно зарегистрированного в электрокардиосигналом, которая, в отличие от известных, отражает механизм порождения его (генеза), что дает возможность определения характеристик модели по результатам экспериментов и учитывает сочетание стохастичности с повторяемостью сигнала. Базируясь на обоснованной математической модели и на концепции «шунтирования», модифицировано синфазный метод статистической обработки фонокардиосигналапараллельно зарегистрированного в электрокардиосигналом в системах автоматизированной диагностики, с учетом механизма генеза фонокардиосигналу. В результате обработки получено значение спектральных компонент фонокардиосигнала, которые являются его информационно-инвариантными признаками и с определенной достоверностью характеризующих функциональное состояние сердечно-сосудистой системы человека. Разработан метод имитационного моделирования фонокардиосигнала на основе периодически коррелированных случайной последовательности для верификации результатов исследований. Создан пакет компьютерных программ для автоматизированной обработки фонокардиосигнала и проведения имитационных экспериментов для автоматизированных диагностических систем.
Dissertation on the receipt of scientific degree of candidate of engineering sciences after speciality 01.05.02 – mathematical design and calculable methods. – Ternopil Ivan Puluj national technical university, Ternopil, 2019. In dissertation the important scientific task is solved – the phonocardial signal synchronously registered with electrocardiosignal mathematical model and analyzing methods improvement taking into account the mechanism of its generation for the human SSS state early diagnosis in automated diagnostic systems reliability increasing. Modern diagnostic systems widely use the polycardiogram method based on the synchronously recorded electrocardio- (ECG) and phonocardiogram (PCG). Complete information about the cardiovascular system state (CVS) can be obtained only in case when several of pathologies diagnosing methods are used simultaneously. The advantages of a comprehensive approach were indicated in a number of scientific works, by: M. A. Kurshakov, P. E. Lukomsky, S. A. Lupenko, A. A. Selidovkina. The heart rate (HR) is determined by the sinus node automatism, which is modulated by feedback through the influence of vegetative, humoral, and local factors. Therefore, the heart work can be described as «modulation»– each of the action potential impulses sequence causes the response in the form of series of consecutive time-varying heart contractions/relaxation. The shape, duration and phase shifts of these impulses may vary, depending on the physical loadings, the emotional state and a whole set of other exogenous and endogenous influences. The responses wouldn’t have constant parameters depend on the factors such as: the conducting system state: the Gis beam right leg blockade, the effort of the blood flow through the heart structures (prolapse, stenosis, aneurysms), postinfarctional scarring, and many other factors, which has a great diagnostic value. Based on the considerations set in R. M. Baevsky, A. A. Talakov «Balistocardiography» work, the person`s cardiovascular system should be regarded as a closed hemodynamic one, where the primary information carrier about it is, among other things, is a phonocardiosignal generated by mechanical and acoustic processes in the system. It is used for obtaining additional (often critical) data to increase the researched object`s evaluation parameters reliability and the bimedia principle as the separation of the signal energy generated by one source, in space-time into two «flows» of different physical nature and (electric and mechanical) introduced the concept of «shunting». By shunting we understand the principle of obtaining complementary information about the object through «bypass»«short» way, in particular, getting of the certain informative parameters from the signal of another physical process nature (electrical, in contrast to the acoustic) of the same genesis in terms of the signal-system concept. Preprocessing was carried out according to the algorithm: signal detrending, smoothing, finding the repeatability period for the P-wave interval. A new application of the periodically correlated random process as a mathematical model of a phonocardiosignal synchronously registered with electrocardiosignal is obtained, which, unlike known ones, represents the mechanism of its genesis. Based on a previously grounded mathematical model and on the concept of «shunting», the synphase method of statistical processing of a phonocardiosignal synchronously registered with an electrocardiosignal in automated diagnostic systems was modified, taking into account a phonocardiosignal genesis mechanism. As the processing result, the value of the phonocardiosignal spectral components were obtained, which are its information-invariant features and with certain certainty characterizing the functional state of the human SSS. Since the synphase method is insensitive to the coherent components presented in the signal, therefore no need to use alien crosstalk effects minimization procedure. Since the developed algorithm is focused on its application in the patient’s СVS state remote monitoring systems, so in order to trend minimization, it is proposed to use the hardware implementation the high-pass Bessel filter (Sallen-Key topology) implementation, which has uniform (flat) amplitude–frequency response characteristics (AFR) (minimal equiripple in passband), linear phase-frequency characteristic (PFR), and the constant group delay, parameter variation resistance. Bessel Discrete Filters do not have this property. Therefore, to process the signal at the software level, the FIR-filtering (which provides linearity of the PFR) is applied by the overlap-add method (OLA), which gives significant advantage in using hardware and software resources, in comparison with time-domain filtering (convolution) As a result of processing, the phonocardiosignal spectral components, which are its informatively invariant features and with definite reliability characterize the functional state of the human cardiovascular system, is obtained.A method for simulating a phonocardiac signal based on periodically correlated random sequences has been developed to verify the results of studies. A package of computer programs has been created for the automated processing of phonocardiac signals and for carrying out simulation experiments for automated diagnostic systems.Key words: phonocardio-signal, electrocardiogram, genesis of phonocardial signal, periodically correlated random process, spectral components, reliability, verification, computer simulation.
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ ТА СКОРОЧЕНЬ …22 ВСТУП…24 РОЗДІЛ 1. СПЕЦИФІКА ЗАДАЧІ ТА СУЧАСНИЙ СТАН ПРОБЛЕМИ ДІАГНОСТИКИ СЕРЦЕВО-СУДИННОЇ СИСТЕМИ ЛЮДИНИ ЗА ДОПОМОГОЮ ФОНОКАРДІОГРАФІЇ...29 1.1. Сучасний стан проблеми та захворюваність серцевими недугами. Динаміка ситуації…29 1.2. Механізм породження серцевих скорочень…32 1.3. Способи реєстрації акустичних показників роботи серця…34 1.4. Обґрунтування необхідності використання фонокардіосиґналу з врахуванням механізму породження серцевих скорочень для своєчасного виявлення патологій…43 1.5. Висновки до розділу 1...46 РОЗДІЛ 2. МАТЕМАТИЧНЕ МОДЕЛЮВАННЯ ФОНОКАРДІОСИҐНАЛУ …48 2.1. Принципи ґенезу фонокардіосиґналу. Принципи бімедійності та шунтування…48 2.2. Методи аналізу фонокардіосигналу…61 2.3. Енергетична теорія стохастичних сиґналів та її засоби опрацювання кардіосигналів…64 2.4. Статистичне оцінювання станів серцево-судинної системи як стохастичної вібраційної системи. Принципи бімедійності та шунтування …75 2.5. Висновки до розділу 2...83 РОЗДІЛ 3. ОБҐРУНТУВАННЯ МЕТОДУ АНАЛІЗУ ФОНОКАРДІОСИҐНАЛУ …85 3.1. Обґрунтування способу виділення моментів прояву дії водія ритму для визначення інтервалу повторюваності фонокардіосиґналу …85 3.2. Опрацювання фонокардіосиґналу синфазним методом…99 3.3. Обгрунтування структури системи відбору фонокардіосигналу...102 3.4. Висновки до розділу 3...106 РОЗДІЛ 4. ВЕРИФІКАЦІЯ МОДЕЛІ ФОНОКАРДІОСИГНАЛУ У ВИГЛЯДІ ПЕРІОДИЧНО КОРЕЛЬОВАНОГО ВИПАДКОВОГО ПРОЦЕСУ ТА КОМП’ЮТЕРНЕ ІМІТАЦІЙНЕ МОДЕЛЮВАННЯ …107 4.1. Програмна реалізація алгоритму опрацювання фонокардіосигналу…107 4.2 Комп’ютерне імітаційне моделювання фонокардіосиґналу…111 4.3 Експериментальна верифікація математичної моделі фонокарідосиґналу …127 4.4. Розроблення програмного забезпечення опрацювання фонокардіосигналу…135 4.5. Висновки до розділу 4...137 ВИСНОВКИ…138 СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ…140 ДОДАТКИ…150

Dissertação de doutoramento em Química e Engenharia Biológica.
In this work four different studies were proposed with a common interest in image analysis meffiodologies and multivariable statistical techniques yet covering distinct objectives. In an activated sludge study, the aggregates and filamentous bacteria contents and morphology were surveyed by image analysis methodologies. The high Sludge Volume Index values denoted the existence of a severe bulking problem of non-zoogleal nature as pointed out by the predominance of normal flocs. Moreover, the high filamentous bacteria per suspended solids ratio values clearly indicated the existence of a filamentous bulking problem, and were able to follow, at some extent, the Sludge Volume Index behaviour. Furthermore, the Partial Least Squares analysis revealed a strong relationship between the Total Sus pended Solids and the Total Aggregates Arca, although it must be emphasized though that for a wastewater treatment plant working in good operating conditions this relationship may not stand frue. In a protozoa and metazoa identification work the main objective resided on the development of an image anaiysis programme to morphologicaily characterize the protozoa and metazoa and treat the coilected data by multivariable statistical techniques. The studied species attained a satisfactory overali recognition levei in terms of global recognition and misciassification performances, whereas for the main protozoa and metazoa groups as weil as for the ciliated protozoa groups, the results were quite good. Such was also the case for the plant conditions assessment as effluent quaiity, aeration, sludge age, and nitrification presence. However, the assessment of critical conditions such as low effluent quality, low aeration and fresh sludge, proved to be poorer. Comparing the two multivariable statistical techniques, the overall results were iower for the Neural Networks than for the Discriminant Analysis with the exception of the critical conditions assessment. Regarding the anaerobic granuiation process, image analysis methodologies were used to follow morphological changes in the granulation process. This survey allowed for the determination of an overall aggregates size and contents increase throughout the experiment as well as the establishment of the granulation time with the formation of granular structures. It was also possible to identify an initial stage involving the predominant growth of the filamentous bacteria followed by a second stage of aggregates growth using the filamentous bacteria as a backbone and a final stage of balanced filamentous bacteria and aggregates contents growth. Moreover, the strong Up-Flow Velocity and Organic Loading Rate increases led to disturbances within the reactor such as the liberation of filamentous bacteria and aggregates size changes. Concerning the granule deterioration triggered by oleic acid study, the results obtained for the outgoing effluent Volatile Sus pended Solids reflected a biomass wash-out phenomenon throughout the experiment. Furffiermore, the aggregates morphological survey allowed determining a decreasing trend in the aggregates size, as well as an aggregate stratification with the larger aggregates in the top section of the reactor. It could also be estabiished that the granule deterioration process triggered by oleic acid led to more freely dispersed structures in terms of filamentous bacteria and lighter aggregates which ultimately rose to the top of the reactor, where the lighter ones suffered a wash-out phenomenon.
Neste trabalho, foram propostos quatro estudos diferentes utilizando técnicas de análise de imagem e de estatística multivariável com objectivos distintos. Num estudo das lamas activadas foram examinados o conteúdo e morfologia de agregados e bactérias filamentosas por metodologias da análise de imagem. Os valores elevados do índice volumétrico de lamas denotaram a existência de um problema de “bulking” severo de natureza não-zoogleal como indicado pelo predomínio de flocos normais. Adicionalmente, os valores elevados da razão entre as bactérias filamentosas e os sólidos suspensos apontam claramente para a existência de um problema de “bulking” filamentoso, e mimetizaram, em certa medida, o comportamento do índice volumétrico de lamas. De referir ainda que uma análise dos mínimos dos quadrados parciais revelou uma correlação entre os sólidos suspensos totais e a área total dos agregados, devendo contudo ser referido que para estações de tratamento de águas residuais funcionando em boas condições a correlação obtida poderá não se manter válida. Num estudo de identificação dos protozoários e metazoários os objectivos do trabalho consistiram no desenvolvimento de um programa da análise de imagem para a sua caracterização morfológica e tratamento dos dados por técnicas de estatística multivariável. A identificação dos protozoários e metazoários revelou-se satisfatória em termos de reconhecimento global e da classificação errónea, enquanto que para os principais grupos de protozoários e metazoários bem como de ciliados foi bastante elevada. O mesmo se passou na aferição das condições de operação tais como a qualidade do efluente, arejamento, idade das lamas e nitrificação. Contudo, na determinação das condições críticas de funcionamento como baixa qualidade do efluente, arejamento insuficiente e lamas jovens os resultados foram apenas razoáveis. Comparando as duas técnicas de estatística multivariável utilizadas, os resultados globais foram inferiores para as redes neuronais do que para a análise discriminante com a excepção da determinação de condições críticas de funcionamento. Na monitorização do processo anaeróbio de granulação, foram usadas metodologias de análise de imagem para seguir as mudanças morfológicas. A aferição da morfologia dos agregados permitiu a determinação do aumento em tamanho e conteúdo dos agregados ao longo da experiência, bem como na determinação do tempo de granulação. Foi também possível identificar uma fase inicial de crescimento preferencial das bactérias filamentosas, seguida por uma segunda fase de crescimento dos agregados utilizando as bactérias filamentosas como espinha dorsal e uma fase final de crescimento balanceado entre as bactérias filamentosas e os agregados. De referir ainda que os fortes aumentos da velocidade ascencional e carga orgânica provocaram alterações no reactor como a libertação de bactérias filamentosas e modificação do tamanho dos agregados. Em relação ao processo de desgranulação devido a alimentação com oleato, os resultados obtidos para os sólidos suspensos voláteis reflectiram a lavagem da biomassa ao longo da experiência. Adicionalmente, a aferição da morfologia dos agregados permitiu distinguir uma tendência decrescente do tamanho dos mesmos ao longo da experiência bem como a sua estratificação com os maiores a situarem-se no topo do reactor. Foi ainda possível estabelecer que o processo de desgranulação resultou numa estrutura mais dispersa em termos das bactérias filamentosas e agregados mais leves que migraram para o topo do reactor onde os mais leves sofreram um fenómeno de lavagem.
Fundo Social Europeu (FSE) - III Quadro Comunitáriode Apoio.
Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - PRAXIS XXI/BD/20325/99.
Instituto para a Cooperação Científica e Tecnológica Internacional (ICCTI) - 203/B4.
Ambassade de France au Portugal - 203/B4.

Doctoral Dissertation for PhD degree in Chemical and Biological Engineering
The biotechnological production of γ-decalactone (a peach-like aroma compound) by biotransformation of ricinoleic acid carried out by microorganisms is an interesting process to produce the aroma with a “natural” label, which is valuable, considering the preference of consumers. Although there are many works described in the literature about this subject, several factors in the process remain to fully understand and, consequently, to optimize. One of these factors is the effect of oxygen in the overall process. Thus, this work initially aimed to study the oxygen mass transfer phenomenon from gas to the biotransformation medium, an oil-in-water emulsion stabilized by a non-ionic surfactant, Tween 80. The oil is simultaneously the substrate of the process and it works as an oxygen carrier, since the solubility of this compound is higher in the oil than in the aqueous phase. The influence of each operation parameter (aeration rate and presence and concentration of surfactant agent and organic phase) on the variables involved in the oxygen transfer (gas-liquid interfacial area, a; liquid-side mass transfer coefficient, kL; and volumetric mass transfer coefficient, kLa) was analyzed in a bubble column and in an airlift reactor. Results demonstrated that in the bubble column the increase of aeration rates is positive for both gas-liquid interfacial area and mass transfer due to the increase of turbulence and gas hold-up. The surfactant concentration had a positive effect on the interfacial area since it reduced the gas bubbles size and it had a negative effect upon kL because its molecules are located at the gas-liquid interface, obstructing the oxygen mass transfer. Regarding the oil concentration, it had a negative effect upon the interfacial area but it improved kL, since it causes a new distribution of surfactant in the medium, decreasing its concentration in the gas-liquid interface. The overall result was a negative effect of the organic phase upon kLa. In the airlift reactor, it was observed that the increase of the aeration rates had a negative effect on kL. This was attributed to differences in the liquid distribution inside the airlift reactor. Since the main goal of this work was to optimize the production of γ-decalactone, two different ricinoleic acid sources (methyl ricinoleate, MR, and castor oil, CO) were tested, in different concentrations, as substrates of the process. Moreover, different cell inoculation strategies were attempted, differing among each other in the washing or not of the cells. The results revealed that the use of non-washed cells is more beneficial for the aroma production, independently of the substrate used; and a concentration of 30 g L-1 MR was the most adequate among the range tested, since it allowed the highest γ-decalactone productivity (14.9 mg L-1 h-1). This substrate revealed also to be a lipase inducer. The use of CO as substrate of the process allowed to achieve almost 2 g L-1 of aroma but the process was rather slow, resulting in low productivities. It was then hypothesized an insufficient oil hydrolysis and an enzymatic hydrolysis was attempted with different commercial enzymes and operating conditions (temperature and pH). Lipozyme TL IM, pH 8 and 27 °C were selected as the most efficient lipase and operating conditions, respectively, to hydrolyze CO. The results obtained using CO previously hydrolyzed by the selected lipase were compared with the results obtained in experiments in which the enzymatic hydrolysis occurred during the biotransformation and in experiments without adding lipase, indicating that the process was faster when lipase was involved in any form, but the aroma concentrations were lower, resulting in similar productivities. The droplets size of both oils was characterized by laser granulometry in emulsions with different oil concentrations. The impact of the presence of cells on droplets size was also analyzed as well as the relevance of washing inoculum cells. The granulometry of emulsions was related with γ-decalactone production and it was observed that, in the presence of non-washed cells, the smaller droplets disappeared, with both oils, which increased γ-decalactone concentration, suggesting that the access of cells to the substrate occurs by their adhesion around larger oil droplets. Experiments in a stirred bioreactor using 30 g L-1 MR (concentration at which the highest aroma productivity was achieved) and different aeration and agitation rates demonstrated the direct influence of oxygen transfer rate on the production of γ-decalactone and of another compound, 3-hydroxy-γ-decalactone, that can also accumulate in the medium. The accumulation of this compound indicates a deviation in the metabolic pathway of γ-decalactone production, decreasing its yields. A response surface methodology was used to optimize pH (6.17) and dissolved oxygen concentration (44.4%) for the aroma production. These operating conditions were applied in two fed-batch strategies: with constant medium feeding rate and with intermittent feeding. Both strategies were compared with the traditional batch mode in terms of overall productivity and yield in respect to the substrate. Although the productivity was considerably higher in the batch mode, the level of substrate conversion to both lactones was greater in the intermittent fed-batch, allowing the accumulation of high aroma concentrations (6.8 g L-1 γ-decalactone and 10.0 g L-1 3-hydroxy-γ-decalactone). Finally, the production of aroma was attempted in an airlift bioreactor due to the advantages of this type of bioreactor, mainly in terms of high power economies, the non-mechanical agitation which avoids damage to cells and the higher mass transfer coefficients attained. The highest γ-decalactone production was obtained at an air flow-rate of 1 L min-1. The aeration rate increase of 5-fold lead to lower aroma concentrations. However, the time needed to reach the peak of production was also reduced, resulting in higher productivities.
A produção biotecnológica de γ-decalactona (composto com aroma a pêssego) através da biotransformação de ácido ricinoleico por microrganismos é um processo interessante para produzir o aroma com um rótulo de “natural”, o que é uma mais-valia, considerando as actuais preferências dos consumidores. Embora existam muitos trabalhos na literatura sobre este tema, vários factores do processo ainda permanecem por compreender totalmente e, consequentemente, por optimizar. Um desses factores é o efeito do oxigénio no processo global. Assim, este trabalho teve inicialmente como objectivo estudar o fenómeno de transferência de O2 do gás para o meio de biotransformação, uma emulsão do tipo óleo-em-água estabilizada pelo surfactante não-iónico Tween 80. O óleo é simultaneamente o substrato do processo e actua também como transportador de O2, uma vez que a solubilidade deste composto no óleo é maior do que na fase aquosa. A influência de cada parâmetro de operação (arejamento, presença e concentração de surfactante e fase orgânica) nas variáveis envolvidas na transferência de O2 (área interfacial gás-líquido, a; coeficiente de transferência de O2 na fase líquida, kL; e coeficiente volumétrico de transferência de massa, kLa) foi analisada numa coluna de bolhas e num reactor airlift. Os resultados demonstraram que na coluna de bolhas o aumento da taxa de arejamento é positivo tanto para a área interfacial como para a transferência de massa devido ao aumento da turbulência e do gás hold-up. A concentração de surfactante teve um efeito positivo na área interfacial, uma vez que reduziu o tamanho das bolhas de gás e teve um efeito negativo no kL porque as suas moléculas localizam-se na interface gás-líquido, dificultando a transferência de O2. Relativamente à concentração de óleo, esta teve um efeito negativo na área interfacial mas melhorou o kL, uma vez que provocou uma nova distribuição do surfactante no meio, diminuindo a sua concentração na interface gás-líquido. O resultado global foi um efeito negativo da fase orgânica no kLa. No reactor airlift, observou-se que o aumento do arejamento produziu um efeito negativo no kL. Este resultado foi atribuído às diferenças na distribuição do líquido dentro do reactor airlift. Como o principal objectivo deste trabalho era optimizar a produção O uso de OR como substrato do processo permitiu obter quase 2 g L-1 de aroma mas o processo foi bastante lento, resultando em baixas produtividades. Hipotetizou-se então uma insuficiente hidrólise do óleo e testou-se uma hidrólise enzimática com diferentes enzimas comerciais e condições operatórias (temperatura e pH). Lipozyme TL IM, pH 8 e 27 °C foram seleccionadas, respectivamente, como a enzima e as condições operatórias mais eficientes na hidrólise do OR. Os resultados obtidos usando OR previamente hidrolisado pela enzima seleccionada foram comparados com os resultados obtidos em ensaios em que a hidrólise enzimática ocorreu durante a biotransformação e em ensaios em que não se adicionou lipase, indicando que o processo foi mais rápido quando a lipase esteve envolvida de alguma forma, mas as concentrações de aroma foram inferiores, resultando em produtividades idênticas. O tamanho das gotas de ambos os óleos em emulsões com diferentes concentrações de óleo foi caracterizado por granulometria laser. O impacto da presença de células no tamanho das gotas também foi analisado, assim como a relevância de se lavarem as células do inóculo. A granulometria das emulsões foi relacionada com a produção de γ-decalactona e observou-se que, na presença de células não lavadas, as gotas mais pequenas desapareceram, com ambos os óleos, aumentando a produção do aroma e sugerindo que o acesso das células ao substrato ocorre pela sua adesão à volta das gotas de óleo de maior tamanho. Ensaios num bioreactor agitado com 30 g L-1 RM (concentração à qual se obteve a maior produção de aroma) e diferentes arejamentos e agitações demonstraram a directa influência da taxa de transferência de oxigénio na produção de γ-decalactona e de outro composto, a 3-hidroxi-γ-decalactona, que também pode acumular no meio. A acumulação deste composto indica um desvio na via metabólica de produção de γ- decalactona, diminuindo o rendimento. A metodologia de superfície de resposta foi utilizada para optimizar o pH (6.17) e a concentração de O2 dissolvida no meio (44.4%) na produção do aroma. Estas condições foram aplicadas em duas estratégias semi-contínuas: com alimentação contínua de meio e com alimentação intermitente. Ambas as estratégias foram comparadas com o modo descontínuo tradicional em termos de produtividade global e rendimento em relação ao substrato. Embora a produtividade fosse consideravelmente superior no modo descontínuo, o nível de conversão de substrato em lactonas foi superior na estratégia semi-contínua intermitente, acumulando-se elevadas concentrações de aroma (6.8 g L-1 γ-decalactona e 10.0 g L-1 3-OH-γ-decalactona). Por fim, a produção de aroma foi testada num bioreactor airlift devido às vantagens deste tipo de reactor, nomeadamente no que diz respeito à poupança energética, à agitação não mecânica que evita danos nas células e aos elevados coeficientes de transferência de massa que se obtêm. A maior produção de γ- decalactona foi obtida com um caudal de arejamento de 1 L min-1. O aumento do caudal de arejamento em 5 vezes resultou numa diminuição da concentração do aroma. Porém, o tempo necessário para se atingir o pico de produção também foi reduzido, resultando em produtividades mais elevadas.

Tese de doutoramento em Chemical and Biological Engineering
Providing an adequate oxygen supply is critical to the growth and maintenance of most aerobic microbial cultures used in biotechnological processes. Oxygen mass transfer from gas phase to the culture medium is often a major growth limiting factor because of oxygen´s low solubility in an aqueous solution. Thus, ensuring adequate oxygen supply to submerged cultures in bioreactors is not trivial. The use of increased air pressure as a way of improving oxygen mass transfer from gas phase to liquid phase has been developed by some authors. However, the effect of reactor pressurization must be considered on cellular growth and metabolism. The increase of oxygen partial pressure could result in reactive oxygen species (ROS) formation and lead to an oxidative environment to the cells. As the effect of increased air and oxygen pressure is strongly dependent of the cell type, species and strains, due to their different abilities of cellular response to possible oxidative stress that can arise, this thesis is focused on the study the behavior of non-conventional yeasts under hyperbaric air. In spite of the well-known importance of Yarrowia lipolytica and Pichia pastoris in several biotechnological processes, few studies are available on the application of air pressure increase for the cultivation of these yeasts. This work was started with the study of the oxygen mass transfer phenomenon from gas phase to the medium in a lab-scale pressurized bioreactor. The influence of operation parameters (aeration and stirring rates and increased air pressure up to 5 bar) on oxygen transfer rate (OTR) was analyzed. An empirical correlation for the prediction of the volumetric oxygen mass transfer coefficient (kLa) as a function of air pressure, power input and superficial gas velocity was attempted. The results demonstrated that the increased air pressure is valuable option for OTR enhancement in bioreactors, competing favorable with raising stirring and aeration rates, which can cause cell damage by shear stress. Yeast cells exposed to adverse conditions employ a number of defense mechanisms to respond effectively to the stress effects of reactive oxygen species. The cellular response of Y. lipolytica W29 and P. pastoris CBS 2612 to the exposure to the ROS-inducing agents paraquat (1 mM), hydrogen peroxide (50 mM) and increased air pressure (1 bar and 5 bar) was analyzed. For both strains the cellular viability loss and lipid peroxidation was lower for the cells exposed to increased air pressure than for those exposed to chemical oxidants. Under superoxide stress (paraquat and air pressure), the SOD induction was the main observed mechanism, whereas the hydrogen peroxide was the most efficient inducer of catalase. The results suggested that Y. lipolytica have a more potent antioxidant system than P. pastoris. Batch cultivations of Y. lipolytica W29 under air pressures up to 6 bar were performed to investigate whether increasing air pressure may lead to increasing biomass yields, without giving raise to oxidative stress. The levels of antioxidant enzymes induced were also monitored. Cell growth was strongly enhanced by the pressure raise, since 5- and 3.4-fold improvement in the biomass production and in specific growth rate, respectively, were observed under 6 bar. An increase of the SOD specific activity at 6 bar of 53.4-fold was obtained compared with the experiments under 1 bar. Moreover, the influence of a pre-adaptation phase of cells to hyperbaric conditions on the lipase production by Y. lipolytica cells was investigated. The extracellular lipase activity increased 96% using a 5 bar air pressure instead of air at 1 bar pressure during the enzyme production phase. These results demonstrated that air pressure increase in bioreactors is an effective way for the enhancement of cell mass and enzyme productivity in bioprocesses involving Y. lipolytica cultures. P. pastoris CBS 2612 behavior under air pressures of 1 bar, 3 bar and 5 bar in culture media of glycerol (pure and crude) and methanol was studied. Generally, an enhancement on cellular growth, for all carbon sources, was achieved with the raise of air pressure and for batch and fed-batch processes with different feeding rate strategies. In batch cultures, 1.4-, 1.2-, and 1.5-fold improvement in biomass production was obtained with the increase of air pressure up to 5 bar, using methanol, pure glycerol, and crude glycerol, respectively. The increase of air pressure up to 5 bar using exponential feeding rate led to a 1.4-fold improvement in biomass yield per glycerol mass consumed, for pure and crude glycerol. The results show the possibility of improving cell mass production of P. pastoris under moderate air pressure, using low cost carbon sources. P. pastoris GS115/pPICZ/lacZ (Mut+), expressing intracellular β-galactosidase, and P. pastoris KM71H/pPICZαA/frutalin (MutS), expressing extracellular frutalin, were used to investigate the effect of increased air pressure on yeast growth and heterologous protein expression. The increase of air pressure up to 5 bar had a small effect on biomass production, but led to a 9-fold improvement in β-galactosidase specific activity compared to 1 bar. The recombinant frutalin secretion was enhanced by the increased air pressure up to 5 bar and the protease specific activity reached was 2.4 times lower than that obtained at atmospheric pressure in baffled flasks.
Um dos pontos críticos de processos biotecnológicos consiste no fornecimento de oxigénio suficiente para o crescimento e manutenção das culturas microbianas aeróbias. A velocidade de transferência de oxigénio do gás para o meio de cultura é normalmente um fator limitante do crescimento, devido à baixa solubilidade do oxigénio em soluções aquosas. Assim, garantir o adequado aprovisionamento de oxigénio a culturas submersas num bioreator não é uma tarefa menosprezável. São poucos os investigadores que têm recorrido ao aumento da pressão de ar como forma de melhorar a transferência de oxigénio da fase gasosa para a fase líquida. Neste caso, o efeito da pressurização do reator no crescimento e metabolismo celular deve ser tido em consideração. Além disso, o aumento da pressão parcial do oxigénio pode resultar na formação de espécies reativas de oxigénio e originar um ambiente oxidativo para as células. Uma vez que o efeito do aumento da pressão de ar e de oxigénio depende das espécies e estirpes, devido à diferente capacidade de resposta ao stresse oxidativo, esta tese foca-se no estudo da resposta celular de leveduras não-convencionais ao ar hiperbárico. Apesar da reconhecida importância das espécies Yarrowia lipolytica e Pichia pastoris em muitos processos biotecnológicos, são poucos os estudos sobre a aplicação do aumento da pressão de ar na cultura destas leveduras. Este trabalho começou com o estudo da taxa de transferência de oxigénio da fase gasosa para o meio líquido num reator pressurizado, à escala laboratorial. Foi analisada a influência de parâmetros operacionais (taxa de arejamento e de agitação e aumento da pressão de ar até 5 bar) na taxa de transferência de oxigénio (OTR). Obteve-se uma correlação empírica do coeficiente volumétrico de transferência de oxigénio (kLa) em função da pressão de ar, da potência de agitação e da velocidade superficial do gás. Os resultados demonstraram que o aumento da pressão de ar é uma opção viável para o incremento de OTR nos bioreatores, em alternativa ao aumento da taxa de arejamento e de agitação, que podem causar stresse hidrodinâmico às células. As células de levedura, quando expostas a condições adversas, desenvolvem um sistema de defesa contra os efeitos causados pelas espécies reativas de oxigénio. Assim, foi analisada a resposta celular das estirpes Y. lipolytica W29 e P. pastoris CBS 2612 à exposição aos agentes indutores de espécies reativas de oxigénio paraquat (1 mM), peróxido de hidrogénio (50 mM) e pressão total de ar (1 bar e 5 bar). Em ambas as estirpes, a perda de viabilidade e a peroxidação lipídica foram menores nas células expostas ao aumento da pressão de ar do que nas expostas aos oxidantes químicos. Em ambiente de stresse provocado pelo ião superóxido (paraquat e pressão de ar), o mecanismo de defesa mais observado foi a indução de SOD, enquanto o peróxido de hidrogénio foi o maior indutor da catalase. Os resultados sugerem que a estirpe Y. lipolytica tem um sistema antioxidante mais eficaz que a estirpe P. pastoris. Com o objectivo de investigar se o aumento da pressão de ar podia conduzir a um incremento no rendimento em biomassa, sem originar stresse oxidativo, foram realizados ensaios em modo batch de Y. lipolytica W29 a valores de pressão total de ar até 6 bar. Foi igualmente avaliada a capacidade da levedura em induzir a expressão de enzimas antioxidantes. O crescimento celular foi consideravelmente beneficiado com o aumento da pressão de ar, uma vez que a produção de biomassa e a taxa específica de crescimento aumentaram 5 e 3.4 vezes, respectivamente, no ensaio realizado a 6 bar. A atividade específica da enzima SOD obtida no ensaio a 6 bar foi 53.4 vezes maior do que a alcançada a 1 bar. Foi também analisada a influência de uma fase de pré-adaptação das células às condições hiperbáricas na produção de lipase por Y. lipolytica. A atividade da lipase extracelular aumentou 96% com a aplicação de uma pressão de ar igual a 5 bar, comparativamente ao ensaio realizado a 1 bar, durante a fase de produção da enzima. Estes resultados demonstraram que o aumento da pressão total de ar é uma forma eficaz de aumentar a produtividade em biomassa e em enzima SOD em bioprocessos que utilizem a levedura Y. lipolytica. Foi estudado o comportamento da estirpe P. pastoris CBS 2612 em meios de glicerol (puro e bruto) e metanol, com valores de pressão iguais a 1 bar, 3 bar e 5 bar. De uma maneira geral, foi observado um incremento do crescimento celular com o aumento da pressão de ar, em todas as fontes de carbono e em processos em modo batch e fed-batch com 2 estratégias de alimentação diferentes. Nas culturas em modo batch usando metanol, glicerol puro e glicerol bruto, obtiveram-se aumentos de 1.4, 1.2 e 1.5 vezes, respectivamente, na produção de biomassa com a pressão de 5 bar. No processo fed-batch com alimentação exponencial, o rendimento em biomassa por massa de glicerol consumido (puro e bruto) aumentou 1.4 vezes com o uso de pressão de ar igual a 5 bar. Os resultados demonstram a possibilidade de aumentar a produção de biomassa de P. pastoris sob pressão de ar moderada, usando fontes de carbono de baixo custo. A estirpe P. pastoris GS115/pPICZ/lacZ (Mut+), que expressa β-galactosidase intracelular, e a estirpe KM71H/pPICZαA/frutalina (MutS), que expressa frutalina extracelular, foram usadas com o intuito de estudar o efeito do aumento da pressão de ar no crescimento destas estirpes e na expressão de proteínas heterólogas. O aumento da pressão total de ar até 5 bar não teve um efeito significativo no crescimento celular destas estirpes, mas conduziu a um incremento de 9 vezes na actividade específica da enzima β- galactosidase, comparativamente à obtida a 1 bar. A expressão de frutalina também aumentou a 5 bar e a actividade específica de protease obtida foi 2.4 vezes inferior à obtida nos ensaios em matraz (pressão atmosférica.

Dissertação de mestrado em Biotecnologia e Bio-empreendedorismo em Plantas Aromáticas e Medicinais
Ginkgo biloba L. possui uma ampla gama de actividades biológicas e o seu extracto padronizado comercial, EGb 761, tem sido um dos produtos medicinais mais vendidos em todo o mundo, devido à sua actividade antioxidante. Efeitos benéficos sobre o sistema nervoso central, incluindo efeitos nos pacientes da doença de Alzheimer, e regulação da expressão genética relacionam-se com os dois principais constituintes do extracto de G. biloba: ginkgolidos e bilobalida. Entre os genes modulados pelo EGb 761, existem vários envolvidos na regulação do ciclo celular, como o gene XPC de mamíferos. A regulação do ciclo celular pode ser crucial para a sobrevivência do organismo, uma vez que, danos de DNA não reparados antes do processo de replicação, podem provocar mutações prejudiciais para as células filhas. O objectivo do presente trabalho foi a investigação dos efeitos de extracto vegetal obtido a partir das folhas de G. biloba, no ciclo celular. Os ensaios envolveram incubações de células de Saccharomyces cerevisiae com o extracto de G. biloba antes da exposição ao choque oxidativo, provocado pelo peróxido de hidrogénio. A estimativa das proporções celulares em cada fase do ciclo celular foi efectuada através da contagem das células ao longo do tempo e da determinação dos índices de gemulação. Foram efectuadas ainda as medições de conteúdo de DNA nas células, através de citometria de fluxo. A capacidade de reparação de danos de DNA nas células com o ciclo celular parado e expostas ao choque oxidativo, também foi investigado. Os ensaios envolveram a incubação das células na presença da hidroxiurea, seguida de exposição a H2O2. Os danos e a reparação de DNA foram determinados através do ensaio cometa. Os resultados demonstraram o efeito protector do extracto de G. biloba contra os danos de DNA provocados pelo H2O2 nas células de levedura, promovendo o progressão do ciclo celular após o choque oxidativo. Além disso, as células sob stress replicativo são menos susceptíveis a danos oxidativos de DNA. No entanto, a hidroxyurea não provoca alterações na dinâmica de reparação de DNA.
Ginkgo biloba L. is a plant with a wide range of biological activities and its leaf extract (EGb 761) has been one of the best-selling medicinal products worldwide due to its antioxidant activity. Beneficial effects on the central nervous system, including in patients of Alzheimer's disease, and regulation of gene expression have been related to two main compounds of G. biloba extract: ginkgolides and bilobalide. Among EGb 761 modulated genes, are several involved in cell cycle regulation, like mammalian XPC gene. DNA lesions, which are not repaired before replication, may propagate harmful mutations to the daughter cells, thus, cell cycle control and regulation is crucial to the organism’s survival. DNA damage checkpoints temporarily block the cell cycle progression in G1 or G2 phases in response to genotoxic stress, that allow cells to repair damaged DNA. The aim of the present work was the investigation of G. biloba leaf extract effects on cell cycle. The experiments involved incubation of Saccharomyces cerevisiae cells with G. biloba leaf extract, before the oxidative shock by hydrogen peroxide. Subsequent estimation of cell proportions in each phase of cell cycle by the budding index approach was performed, as well as measurement of cells DNA content by flow cytometry. DNA damage repair ability in yeast cells under replicative stress, exposed to the oxidative shock, was also investigated. Typical experiments included incubation of cells in the presence of hydroxyurea, followed by exposure to hydrogen peroxide. Determination of DNA damage and repair was performed using the comet assay. The results indicate that G. biloba extract protects yeast cells against DNA damage imposed by hydrogen peroxide, promoting progression of the cell cycle after oxidative shock. This protective effect is probably related to a lower degree of DNA damage and higher repair ability. In addition, cells under replicative stress are less susceptible to oxidative DNA damage, however, hydroxyurea does not provoke changes in the dynamics of DNA damage repair ability.

Dissertação de mestrado em Ecologia
Lançada em 2005 e recorrendo à abordagem da técnica DNA barcoding, a campanha FISH-BOL, integrada na iniciativa Barcode of Life (BOLI), constitui uma iniciativa internacional que tem como objetivo criar uma ampla biblioteca de códigos de barras de DNA - DNA barcodes - para a identificação de qualquer espécie de peixe, examinando igualmente a diversidade molecular dos mesmos através de um esquema de múltiplas espécies/marcadores genéticos únicos. Dividido em duas partes distintas, este trabalho teve como objetivos alargar a biblioteca de referência de DNA barcodes de peixes marinhos da costa portuguesa devidamente validados com um sistema de classificação e investigar padrões filogeográficos da espécie Zeus faber, através da análise conjunta de segmentos de DNA mitocondrial (COI-5P) e de DNA nuclear (intrão do gene S7). Recorrendo às técnicas moleculares e aos protocolos da técnica DNA barcoding, a biblioteca de referência de DNA barcodes de peixes marinhos de Portugal contabiliza, até ao momento, 793 sequências distribuídas por 148 espécies, 120 géneros e 87 famílias. Salvo algumas exceções, os espécimes agruparam em clados monofiléticos da mesma espécie com valores de divergência inferiores a 2%. A aplicação do sistema de classificação à nossa biblioteca de referência resultou num total de 78% das sequências corretamente identificadas. Relativamente ao estudo da espécie Zeus faber, a análise das 87 sequências de COI-5P originou a formação de dois clados significativamente distintos, clado do hemisfério Norte e clado do hemisfério Sul. Igualmente, a análise às 24 sequências do intrão de S7 originou os mesmos resultados sugerindo, assim, que poderemos estar perante um caso de espécie críptica, facto este que merece uma maior atenção em estudos futuros. Para além de facilitar a identificação de espécies de peixes marinhos para profissionais que precisem de uma identificação rápida e objetiva no seu dia-a-dia, resolvendo também conflitos taxonómicos em espécies exploradas comercialmente e de grande importância económica, a compilação final deste trabalho possibilitará uma análise multi-específica de padrões genéticos globais para um conjunto significativo de espécies de peixes marinhas, compreendendo diferentes estratégias reprodutoras, comportamentais ecológicas, podendo ainda servir como base para estudos futuros de monitorização da diversidade aquática marinha.
Launched in 2005 and using the DNA barcoding technique, the FISH-BOL campaign, integrated in Barcode of Life (BOLI) initiative, is an international initiative whose primary objective is to create a large DNA barcodes library to identify any specie of fish, examining the molecular diversity of fish species using a scheme of multiple and unique genetic markers/species. Divided in two distinct parts, the aims of this work were to extend the reference library of DNA barcodes of marine species from Portugal coast properly validated with a ranking system, and to examine the phylogeographics patterns of the specie Zeus faber, by the analysis of the barcode region of the mitochondrial gene, cytochrome oxydase I (COI-5P) and nuclear DNA (S7 intron). Using the molecular approaches and the protocols of DNA barcoding technique, the reference library of DNA barcodes of marine fishes of Portugal reports, still the moment, 793 sequences distributed by 148 species, 120 genus and 87 families. With the exception of few specific cases, the specimens clustered into monophyletic clades of the same specie with intraspecific genetic distance lower than 2%. The application of the ranking system to our reference library has resulted in 78% of sequences correctly identified. Concerning the Zeus faber study, the analyses of the 87 sequences of COI-5P has originated the generation of two significantly distinct clades, hemisphere North clade and hemisphere South clade. In the same way, the analyze of the 24 sequences of S7 intron has originated the same results, suggesting, therefore, that we can be in the presence of a cryptic specie, deserving this case a particular interest in futures studies. Besides subserve the species identification of marine fishes to those who need a fast and objective identification, resolving also some taxonomic incongruences in species commercially explored and with a reasonable economic importance, the final compilation of this work will allow a multi-specific analyze of global genetic patterns to a vast number of marine fishes species, encompassing different strategies of reproduction, behavior and ecologic, that can be useful for futures studies of diversity and monitoring of the marine aquatic diversity.
Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Projetos FCOMP-01-0124-FEDER-010596 e PEst-C/BIA/UI4050/2011.
FEDER através do Programa Operacional de Factores de Competitividade - COMPETE

Tese de doutoramento em Química e Engenharia Biológica
Mediterranean countries are known to have favorable conditions for olive oil production. The three-phase extraction technology demands the addition of hot water to the process, and olive oil, olive cake and olive mill wastewater (OMW) are produced. An approach for using this waste as a renewable resource is of greater interest. Accordingly, the present investigation aims the OMW valorization, by producing high-value compounds (lipase and methane) while degrading this waste. Thus, the research work presented in this thesis essentially describes a study about an integrated process, where the effluents are firstly submitted to a lipase producing aerobic fermentation, followed by an anaerobic degradation process, to produce methane. This work is of great interest, since Portugal is one of the world leading producers of olive oil, with crescent production values from campaign to campaign, in the last years. This work was started with a study about the major problem attributed to the olive mill wastewaters (OMW), the phenolic compounds toxicity. These experiments showed that the nonconventional yeasts Y. lipolytica, C. rugosa and C. cylindracea are able to grow in different phenolic compounds, usually found in OMW. This was later confirmed in bioreactor batch experiments with OMW-based media, where the studied yeasts, not only were capable of achieving similar cell growth, to glucose synthetic media, but also to highly consume the existing and analyzed phenolic compounds. The experiments on batch fermentations, with OMW-based media, were then performed in Erlenmeyer baffled flasks, in order to study the effect of ammonium, cell and surfactant addition as well as to investigate the use of different yeast strains; Candida rugosa (PYCC 3238 and CBS 2275), Candida cylindracea CBS 7869 and Yarrowia lipolytica (CBS 2073, W29 ATCC 20460 and IMUFRJ 50682); and different non-diluted OMW. C. cylindracea was the best strain concerning the effluent degradation. After preliminary tests, a study of optimal batch and fed-batch conditions was performed in bioreactor, using Candida rugosa CBS 2275, Candida cylindracea CBS 7869 and Yarrowia lipolytica W29 ATCC 20460. It was confirmed that C. cylindracea CBS 7869 was the best lipase-producing yeast (6 U mL-1). However, using a fed-batch strategy, with cell pre-growth directly on the bioreactor, C. rugosa CBS 2275 was the strain that obtained the best values of lipase (17 U mL-1); achieving at the same time, a significant effluent degradation (64 % of COD, 27% of phenolics and 77% of total lipids). Anaerobic biodegradability tests showed that the aerobic treatment had a positive effect on the anaerobic degradation of the OMW. Best results were achieved for the initial concentration of 5 g COD-treated OMW L-1, where 78% of the COD added was recovered as methane. Furthermore, when the COD degradation in the aerobic step was higher, even better results were possible to achieve, with a faster conversion of COD to methane. The obtained results demonstrates that the olive mill wastewaters (OMW) are becoming a competitive and valuable growth medium in fermentation processes and also the potential application of non-conventional lipolytic yeasts for OMW valorization, for biomass and enzymes production. This treatment was successful to detoxify the effluent, having a very positive effect in the anaerobic digestion. The utilization of this valorization process will possibly have a positive impact on the environmental problem of OMW management.
Os países que envolvem o Mediterrâneo são conhecidos pelas suas condições favoráveis para a produção de azeite. A tecnologia de extracção de azeite com o sistema em contínuo de 3 fases exige a adição de água quente ao processo, o que dá origem à produção de azeite, águas ruças (OMW) e bagaço. A utilização deste efluente (águas ruças) como um recurso renovável apresenta-se como uma abordagem de elevado interesse, a este problema. Deste modo, o presente trabalho de investigação tem como finalidade a valorização das águas ruças, com produção de produtos de elevado interesse industrial (lipase e metano) enquanto se diminui a carga poluente do resíduo. Assim, o trabalho de investigação apresentado nesta tese descreve essencialmente o estudo de um processo integrado, onde os efluentes são primeiramente submetidos a uma fermentação aeróbia com produção de lipase, à qual se segue um processo de degradação anaeróbia com produção de metano. Este trabalho é de elevado interesse, dado que Portugal está entre os líderes mundiais de produção de azeite, com crescentes valores de produção de campanha para campanha, nos últimos anos. Assim, este trabalho foi iniciado com um estudo focado no problema mais importante associado às águas ruças, a toxicidade dos compostos fenólicos. Estes ensaios mostraram que as leveduras não-convencionais Y. lipolytica, C. rugosa e C. cylindracea são capazes de crescer nos diferentes compostos fenólicos, que frequentemente constituem as águas ruças. Estes resultados foram mais tarde confirmados em bioreactor, onde as referidas leveduras não só foram capazes de crescer, tanto ou até melhor ao que crescem em meio de glucose, como também foram capazes de consumir uma parte considerável de cada composto fenólico, acompanhado ao longo das fermentações. Foram então iniciados os ensaios em descontínuo em matrazes utilizando meio de águas ruças, de modo a fazer um estudo preliminar sobre o efeito da adição de amónio, surfactante e a da concentração de células, bem como o efeito do uso de diferentes leveduras, nomeadamente Candida rugosa (PYCC 3238 e CBS 2275), Candida cylindracea CBS 7869 e Yarrowia lipolytica (CBS 2073, W29 ATCC 20460 e IMUFRJ 50682) e diferentes amostras de águas ruças não diluídas. Foram seleccionadas algumas condições e a C. cylindracea foi a melhor levedura no que diz respeito à degradação do efluente. Depois destes testes preliminares, estudos sobre as condições óptimas a utilizar em descontínuo e semicontínuo foram efectuados em bioreactor, utilizando Candida rugosa CBS 2275, Candida cylindracea CBS 7869 e Yarrowia lipolytica W29 ATCC 20460. Concluiu-se que a C. cylindracea CBS 7869 é a melhor produtora de lipase em fermentações em descontínuo (6 U mL-1), no entanto, utilizando o modo semi-contínuo, com pré-crescimento das células directamente no reactor a C. rugosa CBS 2275 surge como a melhor levedura produtora de lipase, com 17 U mL-1, e com óptimos valores de degradação do efluente (64 % de CQO, 27% de compostos fenólicos totais e 77% dos lípidos totais). Os testes de biodegradabilidade anaeróbia demonstraram que a etapa de tratamento aeróbio que o antecede tem um efeito positivo. Em ensaios posteriores, foram obtidos melhores resultados para a concentração inicial de 5 g L-1 CQO de águas ruças tratadas, com 78 % de conversão do CQO em metano. Mais, verificou-se que quanto melhor é a degradação de CQO na etapa aeróbia do processo integrado, melhores foram os resultados na etapa seguinte, com uma conversão de CQO em metano mais rápida. Os resultados obtidos demonstram que as águas ruças se estão a tornar num meio de crescimento competitivo e importante, mas também o potencial das leveduras lipolíticas não convencionais nos processos fermentativos, para a valorização de águas ruças, com produção de enzimas e biomassa. O sucesso destes processos, na posterior etapa de digestão anaeróbia teve um efeito bastante positivo. A utilização deste processo integrado de valorização de águas ruças poderá assim ter um impacto benéfico para a resolução do problema relacionado com a gestão ambiental das águas ruças.

Dissertação de mestrado em Micro e Nano Tecnologias
There is an increasing public concern about the possible adverse consequences at both human health and wildlife, arising from the release of estrogens into the environment. These endocrine disrupting chemicals include a variety of chemical classes, such as natural and synthetic hormones, plant constituents (phytoestrogens), pesticides, compounds used in the plastics industry, among other industrial by-products and pollutants. They are frequently widely dispersed in the environment. Some can be persistent and can be transported through long distances. Others are rapidly degraded. For these reasons it is necessary to proceed to the environment monitoring of these compounds. Green Fluorescent Protein has been employed as a reporter protein in whole-cell sensing systems based on stress induction. This is a new developed method of reporting systems since it can substitute the assay that frequently has been used, the β-galactosidase as a reporter gene, which is a time-consuming procedure and since it requires cells disruption it increases the errors. Thus, this work aimed to construct a biosensor based on a genetically modified yeast cells expressing the Green Fluorescent Protein (GFP) upon exposition to estrogenic compounds on wastewater. In order to test the operation of the sensor it was measured the transmittance and fluorescence of slides with alginate and FluoSpheres plotted in three immobilization layouts: 'separated dots', 'dots together' and dip coated. The transmittance and the fluorescence signals were detected by a CMOS optical sensor. FluoSpheres beads were used instead of the yeast cells due to legal issues, it was not possible to bring the genetically modified yeast cells to Portugal The results showed that the transmittance is affected by the thickness of the alginate layer, which scatters the light, therefore the dip coated slides present lower transmittance values. The 'dots together' layout is the most effective in fluorescence detection. High concentrations of FluoSpheres beads presented lower values of fluorescence.
A preocupação pública tem vindo a aumentar relativamente às consequências adversas na sua saúde e nos habitats devido à libertação de compostos estrogénicos no ambiente. Estes disrutores endócrinos incluem uma diversidade de classes químicas como as hormonas naturais e sintéticas, fitoestrogénios (estrogénios presentes nas plantas), pesticidas, químicos usados na indústria dos plásticos, entre outros subprodutos industriais e poluentes. São facilmente dispersos no ambiente e enquanto uns podem ser persistentes e transportados até longas distâncias, outros são rapidamente degradados. Desta forma, é necessário proceder à monitorização ambiental destes compostos. A Proteína Verde Fluorescente (GFP) tem vindo a ser usada como uma proteína repórter em biosistemas através da indução de stresse. Este é um novo método desenvolvido para sistemas repórter uma vez que pode substituir o teste que tem sido usado frequentemente, o de β-galactosidase como gene repórter, que é um procedimento moroso e requerer a desintegração celular. Assim, este trabalho visa a construção de um biossensor baseado em células de leveduras geneticamente modificadas que expressam GFP aquando da exposição a compostos estrogénicos em água. De forma a testar o funcionamento do sensor foi medida a transmitância e a fluorescência usando-se lâminas com alginato e FluoSpheres imobilizados em três layouts diferentes: "separated dots", "dots together" e dip coated. Os sinais de transmitância e fluorescência foram detectados com um sensor óptico CMOS. Usaram-se as FluoSpheres em alternativa às células das leveduras devido a questões legais, uma vez que não era possível trazer as leveduras geneticamente modificadas para Portugal. Os resultados obtidos demonstraram que a transmitância é afectada pela espessura da camada de alginato que dispersa a luz. Por conseguinte as lâminas dip coated apresentaram menores valores. O layout "dots together" foi o mais efetivo na deteção de fluorescência. Elevadas concentrações de FluoSpheres apresentaram menores valores de fluorescência.

Dissertação de mestrado em Micro e Nanotecnologias
A constante aposta na melhoria da qualidade de vida humana, particularmente no ramo da Saúde e Medicina, tem proporcionado o desenvolvimento de técnicas e metodologias que permitam a geração de produtos mais eficientes, baratos e úteis. Um dos casos recentes de sucesso consiste na aplicação dos domínios da Física, Quimíca, Biologia, Ciências dos Materiais e Engenharia para o desenvolvimento de dispositivos portáteis de análise de fluídos biológicos. Estes dispositivos têm a capacidade de fornecer uma resposta in situ sobre o conteúdo a analisar, dispensando-se o transporte da amostra para um laboratório de análises, o que poderia demorar dias. Atualmente, existem inúmeros dispositivos de análises comercialmente disponíveis ou descritos na literatura. A maior parte destes dispositivos baseiam-se em (bio)sensores e muitos desses biossensores baseiam-se no efeito piezoelétrico. O objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de um biossensor piezoelétrico, sensível a variações de massa, cujo elemento transdutor é o Polifluoreto de vinilideno e trifluoroetileno, PVDF-TrFE, um polímero piezoelétrico de fabrico e implementação relativamente simples e com baixos custos de produção. Neste trabalho foram criados vários protótipos utilizando técnicas como Pulverização Catódica por Magnetrão para a deposição de Titânio como elemento condutor e Spincoating para a deposição de PVDF-TrFE. A polarização do elemento transdutor foi realizada recorrendo-se a métodos de Polarização por Pratos Paralelos e por Descarga Corona. As propriedades das amostras foram estudadas por Medidas Elétricas de 4 pontas, Microscopia Eletrónica de Varrimento, Perfilometria e Análise Vectorial de Circuitos. A possibilidade do desenvolvimento de um sensor piezoelétrico utilizando esses métodos e materiais foi demonstrada, embora o processo de fabrico necessite ainda de ser otimizado.
The constant efforts in the improvement of the human quality of life, particularly in Medicine and Health, have fostered the development of techniques and methodologies that allow the creation of more efficient, cheaper and useful products. One of the recent successes consists on the application of Physics, Chemistry, Biology, Material Science and Engineering for the development of portable analytical devices for biological fluids. These devices have the capability to offer an in situ evaluation of the product to be analyzed, thus not being necessary the sample transportation to an analysis laboratory, which could take days. Nowadays, several analytical devices exist, commercially available or described in the literature. Most of these sensors are based on bio(sensors) and many of these biosensors are based on the piezoeletric effect. The purpose of this work is the development of a piezoeletric biosensor based on PVDF-TrFE (copolymer of Polyvinylidene fluoride e trifluoroethylene), a piezoeletric polymer relatively easy to fabricate and with low production and implementation costs, as the transducer element. Various prototypes were fabricated using techniques such as Magnetron Sputtering, for the deposition of Titanium as the conductive element, and spin-coating for the deposition of PVDF-TrFE. The polarization of the transducer element was achieved by Corona Discharge and Parallel Plate Poling. The samples properties were studied by 4 point eletrical measurements, Scanning Eletron Microscopy, Profilometry and Vectorial Network Analysis. The feasibility of development of a piezoeletric sensor using these methods and materials was achieved, although the fabrication process still requires otimization.

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biológica
Os compostos aromáticos produzidos por processos biotecnológicos são cada vez mais aceites pelo mercado consumidor, por serem considerados naturais. Além disso, são processos de grande interesse devido aos elevados rendimentos que apresentam relativamente aos processos de extracção a partir de fontes naturais. A γ-decalactona é um composto aromático de interesse industrial, que resulta da β-oxidação peroxisomal do ácido ricinoleico. Este ácido gordo, maior constituinte do óleo de rícino, é o precursor mais vulgarmente utilizado na produção biotecnológica deste aroma. Para que o substrato (óleo de rícino) esteja mais disponível para as células o utilizarem na produção de γ-decalactona, pode utilizar-se óleo de rícino hidrolisado. Esta hidrólise pode ser promovida por acção enzimática, mais especificamente por lipases. O objectivo geral do presente trabalho consiste na avaliação do papel das lipases, comerciais e produzidas pela levedura, na hidrólise do óleo de rícino e consequente impacto na produção de γ-decalactona. Inicialmente foi feita a validação do método experimental utilizado para determinar a actividade lipolítica, tendo-se concluído que o método que utiliza como substrato o p-nitrofenil laurato não era preciso. Assim, nos ensaios posteriores de determinação da actividade lipolítica foi empregue o substrato p-nitrofenil butirato, que forneceu resultados mais precisos. Realizaram-se ensaios de caracterização da actividade de várias enzimas comerciais solúveis e imobilizadas. Os ensaios tiveram como finalidade avaliar a actividade lipolítica das diferentes enzimas e permitiram concluir que a lipase de C. rugosa (5.873 U*mg-1 enzima) apresenta uma actividade bastante superior à das outras enzimas analisadas, Lipozyme TL IM, Lipolase 100 T e Lipase CALB L. Com o intuito de estudar quais as condições que conduzem a um maior grau de hidrólise do óleo de rícino realizaram-se ensaios com as diferentes lipases comerciais estudadas, tendo-se variado as condições de temperatura, pH e concentração de óleo de rícino. A maior percentagem de hidrólise (95.37 %) foi obtida quando se utilizou a enzima Lipozyme TL IM, a pH 8 e 27 ºC, ao fim de 45 horas. Nos ensaios de produção de lipase por diferentes estirpes de Y. lipolytica observou-se que a produção de enzima é favorecida quando o meio de produção de lipase é adicionado ao meio de crescimento celular, sem ocorrer centrifugação das células na transferência entre meios. Foram comparados vários substratos na indução de lipase e verificou-se que, para a estirpe Yarrowia lipolytica W29, foi o ricinoleato de metilo que se revelou o melhor indutor para a produção de lipase, nas condições analisadas. Nos ensaios de biotransformação do óleo de rícino em γ-decalactona verificou-se que a etapa inicial de hidrólise do óleo não se revelou crucial para o aumento da produtividade. A maior produção de γ-decalactona (1600 mg*mL-1) foi obtida usando óleo de rícino não hidrolisado e sem adição de lipase extracelular, sendo que a produtividade foi melhorada pelo aumento da velocidade de agitação.
The aromatic compounds produced by biotechnological processes are increasingly accepted by consumers, because they are considered as natural compounds. In addition, they are of great interest due to the high yields obtained comparatively to chemical processes. γ-Decalactone is an aromatic compound of industrial interest, resulting from the peroxisomal β-oxidation of ricinoleic acid. This fatty acid, the major constituent of castor oil, is the precursor most commonly used in the biotechnological production of this aroma. In order to increase the availability of the substrate (castor oil) to the cells for the production of γ-decalactone, hydrolyzed castor oil can be used. This hydrolysis can be promoted by enzymatic action, more specifically by lipases. The main goal of the present work is to assess the role of lipases, both commercial and produced by the yeast, in the hydrolysis of castor oil and the consequent impact on the production of γ-decalactone. Initially, a validation of the experimental method used to determine the lipolytic activity was developed, and it was concluded that the method using the substrate p-nitrophenyl laurate was not accurate. Thus, in the subsequent experiments to determine the lipolytic activity, the substrate p- nitrophenyl butyrate was used, providing more accurate results. Experiments were performed in order to determine the activity of several commercial enzymes, soluble and immobilized. The aim of those essays was to evaluate the lipolytic activity of the different enzymes. The results allowed to conclude that, from all enzymes analyzed, the lipase of C. rugosa (5.873 U*mg-1 enzyme) presents the highest activity. It was also aim of this work to study the conditions that lead to a greater hydrolysis rate of castor oil. Thus, assays were performed with different commercial lipases previously studied, under different operating conditions, such as temperature, pH and castor oil concentration. The largest percentage of hydrolysis (95.37 %) was achieved when using the enzyme Lipozyme TL IM, at pH 8 and 27 ºC, after 45 hours. In lipase production essays, carried out by different strains of Y. lipolytica, lipase production was improved when the components of the production medium were added to the inoculum culture without harvesting and centrifuging cells in the transfer between both media.Different substrates were tested as lipase inducers and it was observed that, for the strain Yarrowia lipolytica W29, methyl ricinoleate revealed to be the best lipase inducer, for the conditions tested. The biotransformation of castor oil into γ-decalactone was not improved by the initial step of oil hydrolysis. The highest production of γ-decalactone (1600 mg*mL-1) was obtained using non-hydrolyzed castor oil and without adding extracellular lipase.Moreover, the productivity was improved by increased agitation rates.

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biológica (área de especialização em Tecnologia Química e Alimentar)
A celulose é o polímero mais abundante e importante existente na Terra, que quando obtido das plantas (Celulose Vegetal – CV) contêm impurezas que precisam ser removidas através de processos dispendiosos. No entanto, este polímero também pode ser produzido por algumas bactérias (Celulose Bacteriana – CB), nomeadamente por bactérias do género Glucanocetobacter xylinus. Este biopolímero é considerado um material de excelência devido às propriedades únicas que possui nomeadamente como superfície extremamente hidrofílica, elevada cristalinidade e capacidade de retenção de água, grande resistência mecânica e elevada área superficial, que permitem a sua aplicação em diversos domínios. Além disso, modificações na estrutura da celulose podem permitir alterações nas suas propriedades, obtendo-se um material com maiores aplicabilidades. O objetivo deste trabalho foi avaliar as alterações provocadas nas membranas de CB pela adição, in situ e ex situ, de um derivado da celulose, a carboximetilcelulose (CMC). Além disso, foi produzida celulose num meio tendo como fonte de carbono glucose pura (HS) e noutro melaço. A produção foi feita por duas estirpes da bactéria G. xylinus ATCC 53582 e ATCC 700178. O melaço foi utilizado sem sofrer qualquer tipo de pré-tratamento mostrando uma produção de celulose bacteriana baixa, para as duas estirpes, quando comparada com o meio HS. No entanto, o rendimento em celulose (expresso em gCB/gsubstrato) obtido com este resíduo (superior a 200%) foi superior ao obtido para o meio HS (inferior a 50%), mostrando que, industrialmente, a sua utilização pode ser mais favorável. Foi ainda possível concluir que a estirpe ATCC 700178 cresce mais rápido que a outra estirpe em estudo. Após modificação das membranas, todas elas foram caracterizadas. Neste trabalho verificou-se que a composição do meio de cultura influência determinadas propriedades da CB: as membranas produzidas em meio de melaço mostraram maior hidrofilicidade do que as produzidas no meio HS, de acordo com os resultados dos ensaios das medições dos ângulos de contacto. Na modificação ex situ, também as membranas produzidas em meio de melaço mostraram maior adsorção de CMC. No entanto, as análises por FTIR indicam que não existe incorporação de CMC nas membranas, nos dois métodos, in situ e ex situ.
Cellulose is the most abundant and important polymer existent on Earth, but when obtained from plants (Vegetable Cellulose-CV) contains impurities that need to be removed through expensive processes. However, this polymer can also be produced by some bactéria (bacterial cellulose-CB), specially by bacteria belonging to the Glucanocetobacter xylinus genus. This biopolymer is considered a biomaterial of excellence due to the unique properties that it has, such as extremely hydrophilic surface, high crystallinity and water-retention capacity, great mechanical strength and high surface área that allow his application in various fields. Furthermore, changing the structure of cellulose may allow changes in its properties, obtaining a material with larger applications. The purpose of this study was to evaluate the changes caused in the CB membranes by the addition, in situ and ex situ, of a derivative of cellulose, carboxymethyl cellulose (CMC). In addition, cellulose was produced on a medium having pure glucose as carbon source (HS) and molasses. The production was done by two strains of the G. xylinus bacterium: ATCC 53582 and ATCC 700178. The molasses was used without suffering any kind of pre-treatment showing a low bacterial cellulose production, for both strains, when compared with the HS medium. However, the yield in cellulose (expressed in gCB/gsubstrat) obtained with this residue (more than 200%) was higher than that obtained for the HS medium (less than 50%), showing that, industrially, its use can be more favourable. It was also possible to conclude that the strain ATCC 700178 grows faster than the other strain in study. After membranes modification, all of them were characterized. In this work it has found that the composition of the culture medium influences certain properties of the CB: the membranes produced in the molasses medium showed greater hydrophilicity than those produced in HS medium, according to the results of measurements of contact angles. In ex situ modification, also the membranes produced in medium supplemented with molasses showed greater adsorption of CMC. However, the FTIR analyses indicate that there is no addition of CMC membranes, in both methods, in situ and ex situ.

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Engenharia Clínica)
A produção biológica de nanopartículas metálicas foi estudada por muitos investigadores, devido a obtenção de pequenas partículas estabilizadas por proteínas. No entanto, o mecanismo envolvido nessa produção, ainda não foi esclarecido, embora existam diversos mecanismos hipotéticos propostos na literatura. As estipes dos fungos Aspergillus ibericus MUM 03.49, MUM 03.50 e MUM 03.51; Penicillium chrysogenum MUM 03.18, MUM 97.43 e MUM 92.11; e Neurospora crassa MUM 11.01 e MUM 92.08 foram testados como produtores de nanopartículas de prata (AgNPs) biogénicas. Através da análise das características físico-químicas de AgNPs produzidos por cada um dos filtrados de células fúngicas, a melhor estirpe produtora de cada espécie fúngica foi seleccionada. Deste modo, as estipes seleccionadas P. chrysogenum MUM 92.11 e N. crassa MUM 92.08 foram usadas para estudos posteriores da mutagénese e da modulação de mecanismos bioquímicos da produção de AgNPs. Os mutantes defeituosos no gene estrutural do nitrato reductase niaD- foram facilmente recuperados a partir do fungo filamentoso Penicillium chrysogenum MUM 92.11 a partir da sua resistência ao clorato. Apesar das várias tentativas realizadas para a estirpe N. crassa MUM 92.08, a mutagénese não foi bem-sucedida e consequentemente não houve nenhum crescimento de mutantes. O filtrado do tipo selvagem e o mutante foram ambos capazes de produzir nanopartículas de prata após a adição de nitrato de prata no filtrado. Por fim, para verificar se cada composto do filtrado identificado como influência fundamental na produção de nanopartículas foi desenvolvido um ensaio in-vitro. A síntese de AgNPs não ocorreu nos ensaios sem filtrado celular, no entanto, ocorreu nos ensaios com filtrado celular, mesmo após a desnaturação térmica das proteínas, indicando que os aminoácidos podem estar envolvidos na produção de nanopartículas de prata. Outras biomoléculas presentes no filtrado podem também desempenhar um papel-chave no mecanismo de biorredução dos iões de prata, em filtrados fúngicos, que exemplifica o entendimento do mecanismo de produção de AgNPs biogénicas fúngicas.
Biological production of metal nanoparticles has been studied by many researchers due to the convenience of the method that produces small particles stabilized by protein. However, the mechanism involved in this production has not yet been elucidated although hypothetical mechanisms have been proposed in the literature. The fungal strains Aspergillus ibericus MUM 03.49, MUM 03.50 and MUM 03.51; Penicillium chrysogenum MUM 03.18, MUM 97.43 and MUM 92.11; and Neurospora crassa MUM 11.01 and MUM 92.08 were tested as producers of biogenic silver nanoparticles (AgNPs). Through the characterisation of the physiochemical features of the AgNPs produced by each fungal cell filtrate the best producer strain from each fungal species was selected. Therefore, selected strains P. chrysogenum MUM 92.11 and the N. crassa MUM 92.08 were used to further studies of mutagenesis and modulation of biochemical mechanisms for the production of AgNPs. Defective mutants on the nitrate reductase structural gene niaD- were recovered easily from the filamentous fungi Penicillium chrysogenum MUM 92.11 by their resistance to chlorate medium. Although several attempts performed for the strain N. crassa MUM 92.08 the mutagenesis was not successful and none of the mutants grew. Wildtype and the mutant filtrate were both able to produce silver nanoparticles after the addition of silver nitrate in the filtrate. Finally, to verify if each filtrate compound identified as key-compound influence the production of nanoparticles an in-vitro assay was developed. The synthesis of AgNPs did not occur without cell filtrate, however it did occur in cell filtrate even after the heat denaturation of proteins, indicating that amino acids could be involved in the production of silver nanoparticles. Other biomolecules present in the filtrate are also believed to play a key-role in the bioreductive mechanism of silver ions in fungal filtrates, which exemplify understanding the production mechanism of fungal biogenic AgNPs.

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Engenharia Clínica)
Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer in women and killed more than half a million people in 2012. Classic treatments, namely chemotherapy, continue to be the backbone of cancer therapies. However, their non-specificity and non-selectivity is an open window to develop new targeted therapies that will eventually eliminate only cancer cells. The goal of this work was to develop a phage-based nanoparticle that can be used as a carrier for multiple anticarcinogenic drugs, targeting and eliminating breast cancer cells, without damaging healthy cells. Specifically, it was planned to genetically manipulate M13KE phage with encoding cell-penetrating peptides (CPPs) and specific peptides for breast cancer cells, which would allow phage internalization towards human cells. HIV-Tat and Penetratin CPPs, as wells as a specific peptide for human breast cancer cell receptors (so-called 231 peptide) were used. Moreover, coupling anticarcinogenic drugs to the phage major coat protein would result in a lower in situ drug concentration required to eliminate those cells. Doxorubicin (DOX) and PD98059 were used for that purpose owing to their synergistic effect on cancer cells death and proliferation. Several approaches herein implemented provided clear evidences that chemical conjugation of DOX to the phage was achieved. For instance, Fourier transform near-infrared spectroscopy (FT-NIRS) enabled the discrimination between free DOX or phage solutions from conjugated phages. PD98059 conjugation was not successfully accomplished mainly due to solubility issues. In vitro cytotoxicity of the phages (control and conjugated with DOX) and free DOX was assessed against tumorigenic MDA-MB-231 and non-tumorigenic MCF-10-2A cell lines. Conjugated DOX induced cytotoxicity in an independent phage-manner but, as expected, the treatment was not specific to the cancer cells. The phage genome manipulation with HIV-Tat, Penetratin and 231 peptides could not be accomplished, thus limiting the phage internalization by human cells. Parallel to this cytotoxic analysis, an image segmentation algorithm was developed, able to provide information on cell confluence, regardless of the cell morphology. As a result, the operator variability during cell culturing was reduced. In summary, the results highlight the clear need of targeted therapies for cancer treatment, as well as the potential of phages to be used as therapy platforms.
O cancro de mama é o mais frequentemente diagnosticado nas mulheres e matou mais do que meio milhão de pessoas em 2012. Os tratamentos clássicos, nomeadamente a quimioterapia, continuam a ser as terapias de eleição para o seu tratamento. Contudo, a falta de especificidade e seletividade destes tratamentos constituem uma “janela aberta” para o desenvolvimento de novas terapias que consigam, eventualmente, eliminar as células do cancro. O objetivo deste trabalho passou por desenvolver uma nanopartícula fágica, usada como vetor de fármacos anticancerígenos, capaz de reconhecer e eliminar apenas as células de cancro de mama, sem danificar as saudáveis. Especificamente, pretendia-se manipular geneticamente o fago M13KE com “cell-penetrating peptides” (CPPs), HIV-Tat e Penetratin, e também com péptidos específicos para receptores das células do cancro de mama (e.g. péptido 231), permitindo a internalização nas células humanas. A ligação de fármacos anticancerígenos à maior proteína da cápside do fago resultaria numa diminuição da concentração de fármaco in situ necessária à eliminação das células de cancro. Com essa finalidade, a doxorrubicina (DOX) e o PD98059 foram usados devido ao seu efeito sinergístico na morte e proliferação celular. Várias abordagens implementadas evidenciam que a conjugação química da DOX ao fago foi conseguida. Por exemplo, a espectroscopia FT-NIR permitiu a diferenciação entre DOX ou fagos livres e fagos conjugados. A conjugação com o PD98059 não foi realizada devido aos seus problemas de solubilidade. A citotoxicidade in vitro dos fagos (controlo e conjugados com DOX) e da DOX livre foi testada nas linhas celulares tumorais MDA-MB-231 e não tumorais MCF-10-2A. A DOX conjugada induziu citotoxicidade de uma forma não dependente do fago mas, como esperado, o tratamento não foi específico para as células de cancro. A manipulação genética do fago M13KE com os péptidos HIVTat, Penetratin e 231 não foi conseguida, limitando a sua internalização nas células humanas. Paralelamente à análise de citotoxicidade foi desenvolvido um algoritmo de segmentação de imagem capaz de fornecer informação acerca da confluência celular, independentemente da morfologia das células. Desta forma, a variabilidade relacionada com o operador na cultura de células é diminuída. Em suma, os resultados evidenciam a clara necessidade de terapias dirigidas para o tratamento do cancro, bem como o potencial dos fagos como plataformas para terapia.

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biológica (área de especialização em Tecnologia Química e Alimentar)
As proteínas desempenham um papel fundamental nos sistemas biológicos de todos os seres vivos, exercendo inúmeras funções que permitem o crescimento e desenvolvimento dos indivíduos. O desenvolvimento da biotecnologia nas últimas décadas expandiu o interesse da indústria para a produção de proteínas em áreas tão diversas como a farmacêutica, no diagnóstico e tratamento de doenças genéticas, a agricultura ou o ambiente. Numa indústria, cada vez mais rentável, procuram-se novos métodos que permitam maiores eficiências através da optimização de processos e redução de custos. Por outro lado, a produção e purificação de proteínas biologicamente activas, na sua conformação correcta e no estado solúvel são objectivos essenciais para uma produção eficaz que vise a implementação comercial destes compostos. Estudos anteriores demonstraram a capacidade da proteína Fh8 (8 kDa), uma proteína segregada pelo parasita Fasciola hepatica nas fases iniciais da infecção, como tag de expressão e de solubilidade em Escherichia coli. Assim se formou o novo sistema de fusão utilizado neste estudo (Hitag® - tag Fh8) que, pela conjugação do seu pequeno peso molecular com a capacidade de aumentar a expressão e melhorar a solubilidade proteica, se torna numa óptima opção para a produção de proteínas recombinantes se comparado com os outros fusion tags existentes actualmente. A proteína estudada neste sistema foi a hidrolase do molinato (MolA) que é codificada por um gene existente na bactéria Gulosibacter molinativorax ON4T. Este organismo pertence a um conjunto de cinco membros capazes de mineralizar o molinato, um herbicida sistémico que é amplamente aplicado nos campos de arroz para a eliminação de ervas daninhas e que provoca a contaminação dos aquíferos em todo o mundo. O presente trabalho teve por objectivo a produção da proteína recombinante MolA em E. coli, através do uso do tag de fusão Fh8, a avaliação e optimização das suas propriedades a nível da expressão e da solubilidade, bem como a sua purificação. No estudo aqui apresentado, foi possível clonar e expressar a proteína recombinante (Fh8MolA) com sucesso. A optimização das condições de expressão permitiu concluir que, de modo a reduzir custos de operação e obter melhores níveis de expressão e de solubilidade, a proteína deve ser induzida overnight à temperatura de 18°C, no momento em que a densidade óptica (OD600) da cultura se situe entre os 0,6 a 0,8 e com uma concentração de IPTG de 0,5mM. A mini-purificação realizada por cromatografia de afinidade por IMAC permitiu constatar que se conseguiu recuperar a proteína recombinante com maior grau de pureza.
Proteins play a fundamental role in biological systems of all living beings, exercising many functions that allow the growth and development of individuals. The development of biotechnology in last decades expanded the interest of industry for the production of proteins in such diverse areas as pharmaceuticals, diagnosis and treatment of genetic diseases, agriculture or the environment. In an industry, increasingly profitable, it seeks new methods allowing greater efficiency through process optimization and costs reduction. On the other hand, the production and purification of biologically active proteins, in their correct conformation and soluble state, are essential objectives for an efficient production aimed at commercial implementation of these compounds. Previous studies showed the ability of Fh8 protein (8 kDa), a protein secreted by Fasciola hepatica parasite in the early stages of infection, such as expression and solubility fusion tag in Escherichia coli. Therefore, the new fusion system used in this study (Hitag ® - Fh8 tag) was formed. The combination of their small molecular weight with the ability to increase expression and improve the protein solubility became it a great choice for production of recombinant proteins compared with other currently available fusion tags. The protein studied in this system was molinate hydrolase (MolA) which is encoded by a gene of the bacteria Gulosibacter molinativorax ON4T. This organism belongs to a five-membered mixed culture able to mineralize molinato, a systemic herbicide which is widely used in rice fields for the elimination of weeds and which causes contamination of aquifers throughout the world. The present work aimed the production of recombinant protein MolA in E. coli, through the use of Fh8 fusion tag, the evaluation and optimization of its expression and solubility properties, as well as its purification. In the study presented here, it was possible to clone and express the recombinant protein (Fh8MolA) successfully. The optimization of the expression conditions allowed to concluded that, in order to reduce operation costs and to obtain better expression and solubility yields, protein should be induced overnight at 18 °C when the culture optical density (OD600) is in a range of 0,6 to 0,8 and with a concentration of 0,5 mM IPTG. The mini-purification processed through affinity chromatography by IMAC pointed that was able to recover the protein with a greater state of purity.

Tese de doutoramento em Sciences Biology
Pheno-metabolomics is a bioinformatic field of study related with the establishment of links between metabolic data, genotype and phenotype, generated using high-throughput methods. The knowledge obtained in this field has been a major contribution towards the understanding of the vast genetic diversity of Saccharomyces cerevisiae strains that adapted to different ecological niches and are used for most distinct biotechnological applications. Only a holistic approach covering molecular biology, phenotypic characterisation, analytical chemistry, signal processing and bioinformatics could provide detailed information on the vast and dynamical relationships between genomics, phenomics and metabolomics. The main objectives of this thesis are the exploration of genetic, phenotypic and metabolic diversity of a S. cerevisiae strain collection and the assessment of the available bioinformatic and computational approaches for subsequent data fusion. We have constituted a strain collection comprising 172 S. cerevisiae strains of worldwide geographical origins and technological uses (winemaking – commercial and natural isolates –, brewing, bakery, distillery – sake, cachaça –, laboratorial strains and strains from particular environments – pathogenic, isolates from fruits, soil and oak exudates). Their phenotype was screened by considering 30 physiological traits that are important from an oenological point of view. Growth in the presence of potassium bisulphite, growth at 40 °C and resistance to ethanol were the phenotypes that contributed the most to strain variability, as revealed by principal component analysis (PCA). Mann-Whitney test exposed significant associations between phenotypic results and strains technological group. Naïve Bayesian classifier identified three of the 30 phenotypic tests – growth in iprodion (0.05 mg/mL), cycloheximide (0.1 μg/mL) and potassium bisulphite (150 mg/L) –, that provided more information for the assignment of an isolate to the group of commercial strains. Results show the usefulness of computational approaches to simplify strain selection procedures. For subsequent genetic analysis, the usefulness of interdelta sequence amplification for the characterisation of our strain collection was evaluated. Experiments were carried out in two laboratories, using varying combinations of Taq DNA polymerase and thermal cyclers for the analysis of 12 S. cerevisiae strains. Data were obtained by microfluidic electrophoresis and the reproducibility of the technique was evaluated by non-parametric statistical tests. We showed that the source of Taq DNA polymerase and the technical differences between laboratories had the highest impact on reproducibility. We also concluded that the comparative analysis of interdelta patterns was more reliable and reproducible when fragment sizes were compared and when was based on a smaller fraction of bands with intermediate sizes between 100 and 1000 bp. To obtain most reproducible genetic data, 11 polymorphic microsatellites were then used for the characterisation of the 172 S. cerevisiae strains of our collection. Data were computationally related with the previously obtained results of 30 phenotypic tests. We found 280 alleles, whereas microsatellite ScAAT1 contributed the most to intra-strain variability, together with the alleles 20, 9 and 16, from microsatellites ScAAT4, ScAAT5 and ScAAT6, respectively. Computational models were developed and cross-validated to predict the strain’s technological group from the microsatellite allelic profile. Associations between microsatellites and specific phenotypes were scored using information gain ratio, and significant findings were confirmed by permutation tests and estimation of false discovery rates. The phenotypes associated with higher number of alleles were the capacity to resist to sulphur dioxide and the galactosidase activity. Our results demonstrated the capacity of computational modelling to estimate, from microsatellite allelic combinations, both the phenotype and the belonging of a strain to a certain technological group. The genomic constitution of S. cerevisiae was shaped through the action of multiple independent rounds of domestication and microevolutionary changes for the adaptation to environmental conditions. We evaluated genome variations among four isolates of the commercial winemaking strain S. cerevisiae Zymaflore VL1. These isolates were obtained in vineyards surrounding wineries where this strain was applied during several years, and the experiments were accomplished in comparison to the commercial reference strain. Comparative genome hybridization showed amplification of 14 genes among the recovered isolates that were related with mitosis, meiosis, lysine biosynthesis, galactose and asparagine catabolism. The occurrence of microevolutionary changes was supported by DNA sequencing due to the finding of 1198 SNPs and 113 InDels. Phenotypic screening revealed 14 traits that distinguished the recovered isolates from the reference strain which was unable to grow at 18 °C, but evidenced some growth in the presence of CuSO4 (5mM) and SDS 0.01% (v/v). The metabolite profiles revealed differences in the production of succinic acid, benzene ethanol, 2-methyl-1-butanol and isobutanol. Our approaches were then expanded to include also metabolic analysis. Individual must fermentations were performed with the 172 strains and from the combined data of fiber optics spectroscopy, physiological and molecular results, a sub-group of 24 strains was chosen. High-performance liquid chromatography analysis revealed variable results, with glucose, fructose and acetic acid contributing the most for inter-strain variability. Metabolites relevant to aromatic profiles were determined by gas chromatography-mass spectrometry and PCA showed substantial variance between the amounts of alcohols and esters produced. Partial least squares regression (PLS-R) was used in pairwise comparison approaches to predict strains’ metabolic profiles, using phenotypic and genetic data, and relevant associations were identified for 9 of the 24 metabolites. Data were then projected onto a common system of coordinates, revealing a sub-set of 17 statistical relevant multi-dimensional modules (md-modules), combining sets of most-correlated features of noteworthy biological importance. The combination of PLS-R and md-modules identification revealed to be a successful approach for a better understanding of the S. cerevisiae pheno-metabolome.
A feno-metabolómica é uma área da bioinformática que estuda as relações entre dados metabólicos, genótipo e fenótipo, gerados por métodos de alto débito. O conhecimento obtido neste campo tem dado um grande contributo para a compreensão da vasta diversidade genética entre estirpes de Saccharomyces cerevisiae que estão adaptadas a diferentes nichos ecológicos e que são usadas para distintas aplicações biotecnológicas. Apenas uma abordagem holística englobando biologia molecular, caracterização fenotípica, química analítica, processamento de sinal e bioinformática pode fornecer informação detalhada sobre as vastas e dinâmicas relações entre genómica, fenómica e metabolómica. Os principais objetivos desta tese são a exploração da diversidade genética, fenotípica e metabólica de uma coleção de estirpes de S. cerevisiae e a avaliação das abordagens bioinformáticas e computacionais disponíveis para subsequente fusão de dados. Uma coleção de 172 estirpes de S. cerevisiae foi constituída, contendo isolados de distintas localizações geográficas e usos tecnológicos (vínicas – comerciais e isolados naturais –, cerveja, pão, bebidas destiladas – saké, cachaça –, estirpes de laboratório e estirpes de ambientes particulares – patogénicas, isoladas de frutos, solo e carvalho). O seu fenótipo foi avaliado considerando 30 testes fenotípicos que são importantes de um ponto de vista enológico. Crescimento na presença de bissulfito de potássio, crescimento a 40 °C e resistência ao etanol foram os fenótipos que mais contribuíram para a variabilidade entre estirpes, como revelado pela análise de componentes principais (PCA). O teste Mann-Whitney revelou associações significativas entre os resultados fenotípicos e o grupo tecnológico das estirpes. O classificador naïve Bayesian identificou 3 entre 30 testes fenotípicos – crescimento em iprodiona (0.05 mg/mL), cicloheximida (0.1 μg/mL) e bissulfito de potássio (150 mg/L) –, que contribuíram com mais informação para a atribuição de um isolado ao grupo de estirpes comerciais. Os resultados mostram a utilidade das abordagens computacionais para simplificar métodos de seleção de estirpes. Para a subsequente análise genética, a utilidade da amplificação de sequências interdelta para a caracterização da nossa coleção de estirpes, foi avaliada. As experiências foram realizadas em dois laboratórios, usando combinações diferentes de Taq ADN polimerase e termocicladores para a análise de 12 estirpes de S. cerevisiae. Os dados foram obtidos por eletroforese microfluídica e a reprodutibilidade da técnica foi avaliada usando métodos estatísticos não paramétricos. Mostramos que a origem da Taq ADN polimerase e as diferenças técnicas entre laboratórios apresentaram o maior impacto na reprodutibilidade. Concluiu-se também que a análise comparativa entre padrões de interdelta é mais fiável e reprodutível quando se comparam tamanhos de fragmentos, e quando nos baseamos numa fração mais pequena de bandas com tamanhos intermédios entre 100 e 1000 pares de base. De modo a obter dados genéticos reprodutíveis, 11 microssatélites polimórficos foram usados para a caracterização da nossa coleção de 172 estirpes de S. cerevisiae. Os resultados foram relacionados computacionalmente com os de 30 testes fenotípicos obtidos anteriormente. A caracterização genética identificou 280 alelos, sendo o microssatélite ScAAT1 o que mais contribuiu para a variabilidade entre estirpes, em conjunto com os alelos 20, 9 e 16 dos microssatélites ScAAT4, ScAAT5 e ScAAT6, respetivamente. Foram criados e validados modelos computacionais de modo a prever o grupo tecnológico de uma estirpe a partir do seu perfil alélico de microssatélites. As associações entre microssatélites e fenótipos foram avaliadas usando o rácio information gain ratio, e os resultados significativos foram confirmados por permutações e cálculo da taxa false discovery rate. Os fenótipos associados a um maior número de alelos foram a capacidade de resistir ao dióxido de enxofre e a atividade de galactosidase. Os resultados demonstram a capacidade da modelação computacional para prever, a partir das combinações alélicas, tanto o fenótipo como a atribuição de uma estirpe a um determinado grupo tecnológico. A constituição genómica de S. cerevisiae foi moldada pela ação de várias rondas independentes de domesticação e por alterações microevolutivas, para adaptação a condições ambientais. Avaliamos variações genómicas entre quatro isolados da estirpe vínica comercial S. cerevisiae Zymaflore VL1. Estes isolados foram obtidos em quintas nos arredores de adegas onde esta estirpe foi usada durante vários anos, e as experiências foram realizadas em comparação com a estirpe comercial de referência. Hibridização genómica comparativa mostrou amplificação de 14 genes entre os isolados recuperados da natureza relacionados com mitose, meiose, biossíntese da lisina, galactose e catabolismo da asparagina. A existência de alterações microevolutivas foi fortificada por sequenciação de ADN devido à identificação de 1198 SNPs e 113 inserções/deleções. A avaliação fenotípica revelou 14 características que distinguiram os isolados recuperados da natureza, da estirpe de referência que não cresceu a 18 °C, mas mostrou algum crescimento na presença de CuSO4 (5mM) e SDS 0.01% (v/v). Os perfis metabólicos revelaram diferenças na produção de ácido succínico, benzeno-etanol, 2-metil-1- butanol e isobutanol. A nossa abordagem anterior foi expandida de modo a incluir também análises metabólicas. Fermentações em mosto foram realizadas individualmente com as 172 estirpes, e da análise combinada de dados de espectroscopia de fibra ótica, resultados fisiológicos e moleculares, um subgrupo de 24 estirpes foi escolhido. A análise por HPLC (high-performance liquid chromatography) revelou resultados variáveis em que glucose, frutose e ácido acético contribuíram mais para a variabilidade entre estirpes. Os metabolitos relevantes para os perfis aromáticos foram determinados por GC-MS (gas chromatography-mass spectrometry) e a análise por componentes principais mostrou variância substancial entre as quantidades de álcoois e esteres produzidos. A regressão por mínimos quadrados parciais (PLS-R) foi usada numa abordagem par-a-par para prever o perfil metabólico das estirpes, usando dados fenotípicos e genéticos e identificou associações relevantes com 9 dos 24 metabolitos. Os resultados foram depois projetados num sistema de coordenadas comuns, revelando um subconjunto de 17 módulos multidimensionais com importância estatística (módulos md), que combinam conjuntos de características mais relacionadas e com interesse biológico. A combinação da PLS-R com a identificação de módulos md revelou ser uma abordagem adequada para uma melhor compreensão do feno-metaboloma de S. cerevisiae.
FCT for funding this PHD Project

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Engenharia Clínica)
As feridas crónicas são lesões na pele que apresentam grande dificuldade de cicatrização, persistindo por longos períodos de tempo e que causam dor, stresse emocional e físico. Estas feridas afetam principalmente as pessoas que sofrem de doenças como, diabetes e obesidade e também idosos com limitações de movimento. A dificuldade de cicatrização deste tipo de feridas é devido à presença de comunidades polimicrobianas altamente persistentes e resistentes a antibióticos que causam graves infeções e que subsistem nas feridas em forma de biofilmes. Assim, torna-se premente o desenvolvimento de novas estratégias, alternativas aos antibióticos, que sejam eficazes no tratamento de feridas crónicas. A terapia fágica constitui numa abordagem muito promissora no controlo de populações microbianas. No trabalho descrito nesta dissertação foram utilizados bacteriófagos (fagos) pertencentes à coleção do Grupo de Biotecnologia de Bacteriófagos da Universidade do Minho e isolados novos fagos com o intuito de serem usados para controlo bacteriano de espécies que predominam em feridas crónicas. Os ensaios de caracterização da eficácia dos fagos foram realizados em biofilmes formados in vitro (em microplacas de poliestireno) e ex vivo (em pele de porco) tratados com fagos individualizados e em cocktail (2 a 3 fagos), durante 2 períodos de incubação (4 e 24 h). Os biofilmes formados nas diferentes superfícies foram inspecionados por microscopia de epifluorescência recorrendo à técnica de FISH utilizando sondas de LNA e PNA para a marcação das diferentes espécies bacterianas. De todos os fagos estudados, apenas os fagos Aba2 de Acinetobacter baumannii e EC7a de Escherichia coli foram capazes de lisar com eficácia (3 log) os respetivos hospedeiros presentes em biofilmes formados na pele de porco, no entanto, foram menos eficazes no controlo de biofilmes formados em superfícies de poliestireno (redução inferior a 1 log). Após um período de infeção mais alargado observou-se uma menor redução no número de células viáveis (1 log em A. baumannii e 1,5 log em E. coli) podendo este facto estar relacionado com a aquisição de resistência das bactérias aos respetivos fagos ou a características de replicação dos fagos às condições testadas. É no entanto importante realçar, que os fagos específicos para A. baumannii e um dos fagos de E. coli utilizados no cocktail possuem enzimas estruturais com atividade de depolimerase que tem a função de destruir a matriz dos biofilmes e assim obter acesso às células. Em suma, este trabalho evidencia que o sucesso da terapia fágica depende muito do tipo de fago, não sendo clara a vantagem da utilização de cocktails específicos para uma espécie no controlo de biofilmes de monoespécie em relação a fagos individualizados. Por outro lado, o modelo de formação do biofilme condiciona muito o resultado final, pelo que é necessário a utilização de modelos padronizados que mimetizam de forma adequada o consórcio microbiano de uma ferida crónica. Apesar da maioria dos fagos não ter sido eficaz, os fagos de A. baumannii e E. coli poderão, no futuro, ser bons agentes alternativos ou mesmo complementares à terapia antibiótica para controlar biofilmes causadores de feridas crónicas. De notar também que, o modelo ex vivo de pele de porco mostrou ser uma boa ferramenta para estudar o desenvolvimento de biofilmes, bem como as estratégias de tratamento.
Chronic wounds are injuries on the skin that have great difficulty in healing and persist for long periods of time and which cause pain, and emotional and physical stress. These injuries affect mainly people which suffer from diseases such as diabetes and obesity and also elderly patients with movement limitations. The difficulty of this type of wounds to heal is due to the presence of persistent and highly antibiotic-resistant communities that cause severe infections. These polymicrobial communities persist in wounds in the form of biofilms. The development of alternatives effective strategies to antibiotics for the treatment of chronic wounds is highly desired. Phage therapy constitutes a very promising approach in the control of microbial populations. In the work described herein phages from the collection of the Group of Biotechnology of Bacteriophage University of Minho and newly isolated phages were tested for their efficacy to control bacterial species that predominate in chronic wounds. The effectiveness characterization tests of the phages were performed on biofilms in vitro (in polystyrene microplates) and ex vivo (in pig skin) treated with phage cocktails and individual phage during two incubation periods (4 and 24 h). Biofilms formed on different surfaces were inspected by epifluorescence microscopy using the technique of FISH using PNA and LNA probes for marking different bacterial species. Only the Aba2 phage of A. baumannii and the EC7a phage of E. coli were able to efficiently lyse (3 log) the respective hosts from biofilms formed on pig skin. However, they were less effective in controlling biofilms formed on the surfaces of polystyrene (less than 1 log reduction). After a longer period of infection, there was observed a lower reduction in the number of viable cells (in 1 log A. baumannii and 1.5 log E. coli). This may be related to the acquired resistance of bacteria to the respective phages or due to the phage replication parameters under the conditions tested. It is important to note however, that the specific phages for A. baumannii and one of the E. coli phage cocktail used in enzymes have structural depolymerase activity which destroy the polysaccharide matrix of the biofilm and allow phages to gain access to the cells. The results showed that the efficacy of treatment using individual phage or phage cocktails is strongly dependent on the type of phage used and also the formed biofilm itself. In short, this study shows that the success of phage therapy depends on the type of phage, and it is also not clear if the use of cocktails targeting a specific species is advantageous for monospecies biofilms control in relation to individual phage is advantageous. Moreover, the model of biofilm formation used conditions the final result, and the use of standard models, which mimic appropriately microbial consortium of a chronic wound, would be is clearly necessary. Although most phages were not effective, the A. baumannii, and E. coli phages may in the future be good alternatives or complementary treatment options to antibiotic agents to control biofilms on chronic wounds. Also it is worthy of noting that the ex vivo pig skin model proved to be a good tool to study the development of biofilms and their control.

Relatório de estágio de mestrado em Ensino em Biologia e Geologia no 3º Ciclo do Ensino Básico e no Ensino Secundário
A Biotecnologia e Produção de Alimentos correspondem a temas que habitualmente motivam os alunos e por vezes influenciam as suas escolhas vocacionais. O ensino destes temas está intimamente associado à utilização de atividades laboratoriais. De entre as várias formas de realizar as atividades laboratoriais, as atividades do tipo Prevê-Observa-Explica-Reflete são os mais adequadas para promover a mudança concetual dos alunos. Assim, a investigação associada à intervenção didática realizada teve como objetivos principais analisar o contributo das atividades laboratoriais do tipo Prevê-Observa-Explica-Reflete, na aprendizagem de Processos biotecnológicos na Produção de alimentos e sustentabilidade, na promoção da mudança concetual, bem como fazer o levantamento das opiniões dos alunos sobre a implementação das mesmas. Para verificar a evolução dos alunos com a implementação desta temática optámos por implementar questionários, pré e pós-teste, que consistia num teste de conhecimentos relacionados com o tema em causa, bem como a implementação de um questionário de opinião, para avaliar o impacto que a metodologia de ensino utilizada provocou nos alunos da turma. A amostra foi constituída por uma turma do 12º ano de escolaridade, com 23 alunos. Foram implementadas três atividades laboratoriais do tipo P.O.E.R. relativas à temática em causa. A análise dos resultados obtidos demonstraram que, inicialmente, o número de respostas consideras erradas e a existência de conceções alternativas, em certos temas, era muito elevado. Após ao ensino notou-se uma progressão no que respeita ao ganho de respostas consideradas cientificamente aceites, havendo um número muito reduzido de respostas erradas, e deixou-se de ter respostas contendo conceções alternativas. Quanto à utilização das atividades laboratoriais implementadas, os alunos foram unânimes ao dizerem que a sua implementação é importante no ensino das ciências.
Biotechnology and food production are subjects that often motivate students and sometimes influence their vocational choices. Teaching these subjects will invariably require resorting to laboratorial activities. Out of all of the different ways to conduct laboratorial activities, the Predict- Observe-Explain-Reflect type is the most appropriate one to promote the conceptual change of students. For this reason, the main purpose of the didactic intervention associated research that was carried out was to analyse the contribution of the Predict-Observe-Explain-Reflect type of laboratorial activities to the learning of biotechnological processes in food production and sustainability and the promotion of conceptual change, as well as to conduct a survey of students’ thoughts on their implementation. In order to demonstrate the students’ learning progress stemming from the implementation of this method we have chosen to conduct a questionnaire, pre and post-test, which consisted of a knowledge test about the subject matter, and an opinion questionnaire, formulated to evaluate the impact that the teaching methodology had had in the class’ students. The sample consisted of a 12th grade class, totalling 23 students. Three P.O.E.R laboratorial activities relating to the subject at hand were implemented. The analysis of the obtained results showed that, in the beginning, the number of wrong answers and the existence of alternative conceptions, in certain subject areas, were very high. After the teaching, we recognized a substantial increase of scientifically accepted answers, accompanied by only a very small number of wrong ones, and none providing alternative conceptions. Concerning to the laboratorial activities carried out, students were unanimous in saying that their implementation is important to science education.

Dissertação de mestrado em Bioinformática
Cell behavior differs even under identical micro-environmental conditions, resulting in cell heterogeneity. This phenomenon can transform a well producing bacterial population which is exposed to production-like stress conditions into subpopulations with reduced or even stopped product formation properties. As a step towards understanding population heterogeneity it is necessary to apply sophisticated techniques, such as a combination of fluorescence activated cell sorting (FACS) and mass spectrometry (MS) resulting in proteomic information on the subpopulation level rather than on the whole population level. The proteome of Pseudomonas putida KT2440 subpopulations were analysed in standard conditions (μ=0.2 h-1) using R and Bioconductor that will serve as basis for comparison of non-stressed to stressed conditions to find optimization targets to reduce cell-to-cell variability and improved productivity. Here, the differences in subpopulations at different growth rates (μ=0.1 h-1, μ=0.2 h-1 and μ=0.7 h-1) were investigated. The second part of the thesis included the investigation of tolerance levels of P. putida to biofuels precursors, for a successful establishment of the experimental set-up of stress conditions on P. putida cultures. Flow cytometry analysis showed the existence of a two subpopulations at each growth rate: a one chromosome equivalent (C1n) and a two chromosome equivalent (C2n) subpopulation at μ=0.1 h-1 and μ=0.2 h-1 and at μ=0.7 h-1it was possible to see a subpopulation with two chromosome equivalent (C2n) and an additional subpopulation with multiple chromosome equivalents (CXn). The statistical analysis on proteomic data and the experiments on phase two showed that P. putida KT2440 is very stable metabolically and it can tolerate solvents better than other industrial host systems. Therefore it can be concluded that P. putida KT2440 could be a promising candidate for a microbial cell factory chassis for industrial processes involving solvent production or 2 phase cultivation systems.
O comportamento das células pode variar até com pequenas alterações no microambiente, podendo originar heterogeneidade celular. Este fenómeno pode converter populações bacterianas com elevada capacidade de produção em subpopulações onde a taxa de produtividade pode diminuir drasticamente ou até parar por completo. Para esclarecer a heterogeneidade a nível bacteriano é necessário utilizar técnicas sofisticadas como a combinação da seleção de células ativadas por fluorescência (FACS) e espectrometria de massa (MS) originando dados de proteómica a nível das subpopulações bacterianas, e não apenas ao nível da população. O proteoma das subpopulações de Pseudomonas putida KT2440 foi analisado em condições padrão (μ=0.2 h-1) usando o R e o Bioconductor que servirá como base para a comparação dos resultados das condições padrão e as condições de stresse para encontrar novas metas de otimização para reduzir a variabilidade entre subpopulações e melhorar a produtividade a nível industrial. Desta forma, diferentes taxas de crescimento foram testadas (μ=0.1 h-1, μ=0.2 h-1 and μ=0.7 h-1) nas diferentes subpopulações. A segunda parte da tese inclui a investigação de níveis de tolerância de P. putida a precursores para a produção de biocombustíveis, para ajudar a estabelecer as condições de stresse. A análise da citometria de fluxo mostrou a existência de duas subpopulações em cada taxa de crescimento testada: subpopulação com um cromossoma equivalente (C1n) e uma subpopulação com dois cromossomas equivalente (C2n) foram encontradas nas taxas de crescimento de μ=0.1 h-1 e μ=0.2 h-1. Na taxa de crescimento de μ=0.7 h-1 foi possível ver uma subpopulação com dois cromossomas equivalente (C2n) e uma subpopulação adicional com vários cromossomos equivalente (CXn). A análise estatística dos dados de proteómica bem como os resultados da fase dois mostraram que P. putida KT2440 é muito estável metabolicamente e pode tolerar solventes melhor que outras bactérias. Portanto, pode concluir-se que P. putida KT2440 pode ser um candidato promissor para processos industriais que envolvem a produção de solventes.

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Mecânica
Devido à elevada prevalência de patologias associadas ao stress nos seres humanos, a indução de stress crónico em animais é um modelo muito utilizado em investigação biomédica, para compreender os seus mecanismos e desenvolver estratégias terapêuticas e para curar e prevenir os malefícios induzidos e provocados pelo stress. Existem dois modelos de exposição ao stress: o stress crónico imprevisível, que implica a exposição diária, durante 1 hora, a estímulos agressivos, e o stress crónico moderado, que implica uma exposição permanente a estímulos aversivos, por períodos que normalmente variam entre as 3 as 9 semanas. No âmbito de projectos de investigação desenvolvidos no Instituto de Investigação em Ciências da Vida e Saúde da Universidade do Minho, são efectuadas com bastante frequência e regularidade ensaios de stress induzidos em roedores, mas através de meios bastante rudimentares e morosos, que envolvem bastantes recursos humanos, com muitos erros e pouco controlo, fiabilidade e repetibilidade. Desta forma, o objectivo deste trabalho é a automatização do processo de indução destes modelos de stress em roedores, de forma a padronizar o mais possível a exposição aos diferentes stressores e, ao mesmo tempo, reduzir a necessidade e utilização de tempo e recursos. Assim, pretende-se desenvolver um equipamento onde os animais fiquem alojados e possam ser sujeitos aos stressores de forma automática, diminuindo o factor humano, de forma a alcançar um elevado grau de repetibilidade e fiabilidade.
Due to the high prevalence of diseases associated with stress in humans, the induction of chronic stress in animals is a model widely used in biomedical research, to understand their mechanisms and develop therapeutic strategies to cure and prevent the problems caused by stress. There are two models of exposure to stress: the Chronic Unpredictable Stress, which involves daily exposure for 1 hour, to aggressive stimuli, and the Chronic Mild Stress, which implies a continuous exposure to aversive stimuli, for periods usually ranging between 3 to 9 weeks. Within the framework of research projects developed at the Research Institute in Life and Health Sciences at University of Minho, induced stress in rodents tests are applied quite frequently and regularly, but through means quite rudimentary and cumbersome, involving too much manpower and time, with many errors and little control , reliability and repeatability. Thus, the aim of this project is to automate the process of these stress models induction in rodents, in order to save time and resources, and especially standardize as much as possible the exposure to various stressors. For this, it is intend to develop a product where the animals are housed and can be subjected to stressors automatically, reducing the human factor , to achieve a high degree of repeatability and reliability .

Tese de doutoramento em Engenharia de Tecidos, Medicina Regenerativa e Células Estaminais
Bone tissue engineering has emerged as a promising alternative in cases of bone loss, overcoming problems of rejection and donor scarcity associated to the clinical used bone grafts (autografts, allografts and xenografts). By combining threedimensional structures (3D) – scaffolds, autologous cells and growth factors, bone tissue engineering seeks to achieve a long lasting and fully functional regeneration of bone. The selected scaffold should be biodegradable, allowing cells to adhere, proliferate and differentiate into the osteogenic phenotype, producing a mineralized extracellular matrix (ECM), to be later implanted into the bone defect. The rate of degradation of the scaffold should, therefore, be compatible to the rate of neo-tissue ingrowth. The rationale of the experimental work of this thesis was designed to study a bone tissue engineering strategy by combining chitosan based scaffolds and human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs), aiming bone tissue regeneration. Blends of chitosan with different types aliphatic polyesters were produced by extrusion. Afterwards, scaffolds were produced by compression molding followed by salt leaching. Several scaffolds formulations were produced and subjected to cytotoxicity and cytocompatibility tests, allowing selecting the most suitable formulation in terms of biological response. From the results obtained, the chitosanpoly( butylene succinate) (PBS) formulation presented the most promising results in in vitro cell studies with relevant cell lines. To understand why this formulation has enhanced cell performance, several formulations using different percentages of chitosan (0, 25 and 50%) and PBS (100, 75 and 50%) were used to produce scaffolds. The influence of chitosan content was evaluated with hBMSCs in vitro. All in vitro results evidenced a better performance for the highest chitosan containing scaffolds, as for cell adhesion and proliferation, as for osteogenic differentiation. Scaffolds containing chitosan (50% chitosan-50% PBS) and without chitosan (100% PBS) were implanted in different anatomic regions (cranial defect, auricular pocket and submuscular) of rats. The tissue response was evaluated by studying the inflammatory response to the implanted scaffolds. Again, scaffolds with higher chitosan amounts evidenced superior results, with a mild inflammatory response without cell necrosis, in vivo, as compared to PBS scaffolds, that evidenced tissue necrosis in all implantation regions. A different morphology of chitosan-PBS scaffolds was developed by fiber bonding to improve the porous structure. These scaffolds were clearly non-cytotoxic and cytocompatible. Furthermore, chitosan-PBS scaffolds seeded and cultured with hBMSCs in osteogenic conditions, showed an excellent cell performance. The biodegradation of chitosan-PBS scaffolds was assessed in vitro using enzymes responsible for the degradation of chitosan (lysozyme) and PBS (lipase), in similar concentrations to the ones found in human body. The cocktail of both enzymes induced a superior effect on the scaffolds biodegradation. The in vivo biodegradation and biocompatibility of the scaffolds were evaluated. The in vivo model applied to this study was the rat subcutaneous model. Results showed that the in vivo degradation was much slower than in vitro. The host tissue response was the typically associated with biomaterialsʼ implantation, with the presence of foreign body giant cells and an inflammatory response that progressed over time. The in vivo response was similar to those observed for biodegradable fixation devices or bioresorbable sutures. The final study included in this thesis was performed to confirm the tissue engineering strategy followed in this work. The potential of chitosan-PBS scaffolds combined with hBMSCs, as previously demonstrated, was studied in a relevant animal model. A critical size cranial defect in nude mice was used. This model allowed evaluating the in vivo matured construct using human cells. The results showed that constructs were able to promote bone regeneration in a superior level than scaffolds without cells. The strategy followed under the scope of this PhD thesis was successfully validated in this small animal model, using a combination of chitosan-poly(butylene succinate) scaffolds with hBMSCs.
A área de engenharia de tecidos ósseos surgiu como uma alternativa de tratamento em casos clínicos de perdas ósseas, evitando problemas de rejeição e morbidez associada a enxertos ósseos obtidos do próprio paciente. Combinando estruturas tridimensionais (3D) porosas, células autólogas e factores de crescimento, a engenharia de tecidos ósseos visa encontrar soluções para a regeneração de osso neste tipo de pacientes. O suporte 3D seleccionado deverá ser biodegradável, permitindo a adesão, proliferação e diferenciação osteogénica das células, de forma a produzir uma matriz extracelular mineralizada, sendo posteriormente implantada no defeito ósseo. A taxa de degradação do suporte 3D poroso deverá ser compatível com a taxa de regeneração do tecido ósseo O objectivo do trabalho experimental desenvolvido nesta tese foi planeado de forma validar uma estratégia de engenharia de tecidos ósseos, através da combinação de suportes 3D porosos biodegradáveis à base de quitosano e células estaminais adultas de origem humana obtidas a partir de medula óssea. Neste trabalho foram produzidas várias misturas de quitosano com diferentes tipos de poliésteres alifáticos usando a técnica de extrusão. Usando estas misturas desenvolveram-se suportes tridimensionais que foram processados por moldação por compressão com partículas de sacrifício de sal. As misturas produzidas foram avaliadas em termos de citotoxicidade e citocompatibilidade. Desta forma, foi possível seleccionar a formulação mais adequada em termos de resposta biológica. A formulação de quitosano e polibutileno succinato (PBS) foi a formulação seleccionada para posterior desenvolvimento da estratégia de engenharia de tecidos. Por ter tido consistentemente os melhores resultados biológicos in vitro, a mistura seleccionada foi usada para produzir suportes porosos contendo diferentes percentagens de quitosano (0, 25 and 50%) e PBS, de forma a estudar a importância do quitosano nas formulações. A influência da percentagem de quitosano nos suportes porosos foi avaliada através de estudos in vitro com culturas primárias de células estaminais mesenquimais de origem humana. Os resultados celulares obtidos mostraram um melhor desempenho em termos de adesão e proliferação, assim como na diferenciação osteogénica das células nos suportes 3D com maior percentagem de quitosano. Tendo-se observado uma maior eficácia no desempenho biológico dos suportes porosos contendo quitosano, interessava confirmar estes resultados in vivo, tendo como controlo suportes sem quitosano, só com PBS. Suportes porosos sem quitosano e com quitosano (50%), uma vez que foram aqueles para os quais se obteve o pior e o melhor comportamento celular in vivo respectivamente, foram implantados em diferentes regiões anatómicas (defeito craniano, implantação auricular e submuscular) em ratos. A resposta inflamatória foi avaliada, tendo os suportes porosos com quitosano evidenciado uma resposta inflamatória moderada, não se observando necrose celular. Suportes porosos com apenas PBS na sua constituição, mostraram necrose celular em todos os locais anatómicos implantados.O passo seguinte passou por optimizar a morfologia dos suportes, tendo sido neste caso desenvolvida uma estrutura porosa de malha de fibras de quitosano e PBS, por compressão a quente. Estes suportes porosos foram avaliados e confirmou-se também que não eram citotóxicos e que eram citocompatíveis. Adicionalmente, foram cultivadas células primárias humanas de medula óssea nestas estruturas tridimensionais, em condições de diferenciação osteogénica, mostrando um excelente desempenho in vitro. A biodegradação destes suportes porosos de quitosano-PBS foi estudada usando enzimas responsáveis pela degradação do quitosano (lisozima) e PBS (lipase) em concentrações idênticas às encontradas no corpo humano. Os resultados obtidos mostraram que um cocktail das duas enzimas teve um efeito pronunciado no que respeita à taxa de degradação dos suportes porosos. O estudo foi complementado pela análise da biodegradação e biocompatibilidade dos suportes tridimensionais in vivo. O modelo in vivo escolhido para este estudo foi o implante subcutâneo em ratos. Os resultados obtidos mostraram que a taxa de degradação in vivo foi consideravelmente menor comparativamente com os estudos efectuados in vitro. A resposta in vivo foi semelhante à observada em implantes de placas de fixação óssea biodegradáveis ou em suturas bioabsorvíveis. O último estudo incluído nesta tese foi realizado para confirmar a estratégia de engenharia de tecidos proposta neste trabalho: a associação de suportes porosos biodegradáveis de quitosano e PBS e células estaminais humanas de medula óssea diferenciadas para a linhagem osteogénica. O potencial desta estratégia foi estudado num modelo animal relevante: um defeito craniano de tamanho crítico em ratinhos imunocomprometidos. Este modelo permitiu avaliar o efeito da implantação dos suportes porosos cultivados com células humanas naqueles defeitos ósseos. Os resultados obtidos mostraram que esta associação de suportes porosos de quitosano-PBS com células humanas pré-cultivados in vitro em condições osteogénicas, promoveram regeneração óssea de uma forma mais significativa quando comparados com suportes porosos implantados sem células. A estratégia de engenharia de tecidos seguida no âmbito desta tese de doutoramento, através da combinação de suportes porosos de quitosano-PBS e células estaminais humanas de medula óssea foi validada com sucesso neste modelo animal de pequeno porte.

Taking into consideration the complex biology of bone tissue it is quite clear that the understanding of the cellular interactions that regulate the homeostasis and regeneration of this remarkable tissue is essential for a successful Tissue Engineering strategy. The in vitro study of these cellular interactions relies on co-culture systems, a tremendously useful methodology where two or more cell types are cultured at the same time. Such strategy increases the complexity of typical monoculture systems, allowing the in vitro settings to closely mimic the in vivo environment. Moreover, 2D coculture systems have been extensively used by cell biologists to study cell interactions as an attempt to understand specific cellular mechanisms and signalling pathways. The interaction between osteoblasts/ osteoprogenitor cells and different cell types relevant within the bone Tissue Engineering context, namely mononuclear cells from peripheral blood and umbilical cord blood and fibroblasts, has been addressed in the first part of this thesis. The different co-cultures showed that mononuclear cells from peripheral blood were capable of accelerating the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by producing BMP-2. On the other hand, osteoblasts cultured on carrageenan membranes were capable of supporting the culture of endothelial progenitors cells present in the mononuclear fraction of umbilical cord blood that contributed to the in vivo angiogenesis after implantation in an inflammatory setting. Furthermore, fibroblasts, which are key players in the formation of fibrotic tissue after a biomaterial implantation, were shown to decrease the osteogenic activity of osteoblasts through gap junctional communication. A serious limitation of the paradigmatic use of scaffolds for bone Tissue Engineering is the lack of oxygen and nutrient supply to the cells in the core of the engineered construct leading to cell necrosis at the bulk of the constructs. Furthermore, foreign body response to the implanted biomaterial is a frequent reaction of the host and has as a consequence the formation of fibrotic tissue surrounding the implant. The use of cell sheet engineering for bone Tissue Engineering can potentially avoid those shortcomings. One of the explored strategies comprised the production of osteogenic cell sheets using this technology. Its potential for in vivo bone formation was analyzed and the formation of vascularized bone tissue with a marrow was originally demonstrated by implanting a single osteogenic cell sheet in a nude mice model. Furthermore, in order to promote vascularization, co-cultured osteogenic cell sheets with endothelial cells were also created. Endothelial cells, stacked in between osteogenic cell sheets, were proven to contribute to new vessel formation and increased bone formation in vivo This thesis demonstrates that monocytes/macrophages from peripheral blood can accelerate the osteogenic differentiation of osteoprogenitor cells while fibroblasts, have a deleterious effect on the osteogenic phenotype of osteoblasts. In addition, within an inflammatory host reaction, cells from the mononuclear fraction of umbilical cord blood were capable of contributing to new blood vessel formation after co-culture with osteoblasts. Moreover, when using the cell sheet technology to fabricate a bone tissue engineering construct, endothelial cells were also shown to improve in vivo bone formation.
Considerando a complexa biologia do tecido ósseo torna-se claro que compreender as interacções celulares que regulam a homeostasia e regeneração deste tecido notável, é de extrema importância numa estratégia de Engenharia de Tecidos. O estudo in vitro destas interacções celulares baseia-se em sistemas de co-cultura, uma metodologia de grande utilidade onde dois ou mais tipos de células diferentes são cultivados simultaneamente e no mesmo espaço. Estes sistemas representam um aumento de complexidade, em relação aos sistemas de monocultura, que permite que as condições in vitro mimetizem melhor o ambiente in vivo. Além disso, sistemas de cultura 2D têm sido muito utilizados por biólogos no estudo de interacções celulares numa tentativa de compreender os mecanismos e vias de sinalização envolvidas. A interacção entre osteoblastos ou células osteoprogenitoras com células mononucleares do sangue periférico e do cordão umbilical, e com fibroblastos para aplicações em Engenharia de Tecido Ósseo foi estudada na primeira parte desta tese. As diferentes co-culturas permitiram mostrar que as células mononucleares do sangue periférico são capazes de acelerar a diferenciação osteogénica de células do estroma de medula óssea humana através da produção de proteína morfogenética do osso 2 (BMP-2). Por outro lado, foi também demonstrado que osteoblastos cultivados em membranas de carragenano suportam a cultura de células progenitoras endoteliais presentes na fracção mononuclear de sangue do cordão umbilical humano e que estas, por sua vez, contribuem para a angiogénese in vivo e em condições inflamatórias. Além disso, foi mostrado que fibroblastos, células-chave na deposição de tecido fibrótico após a implantação de um biomaterial, inibem a actividade osteogénica de osteoblastos através da comunicação por Gap Junctions. A utilização paradigmática de matrizes de suporte para a Engenharia de Tecido Óssea tem como limitação grave a falha de fornecimento de oxigénio e nutrientes às células no interior da matriz construída levando à necrose dessas mesmas células. Além disso, a resposta do hospedeiro à implantação de corpos estranhos, como matrizes tridimensionais, tem como consequência frequente a formação de tecido fibrótico à volta do implante. A aplicação da Engenharia de cell sheets na Engenharia de Tecido ósseo tem a expectativa de ultrapassar estas limitações. Uma das estratégias exploradas teve como base a produção de cell sheets osteogénicas utilizando esta tecnologia. O potencial destas cell sheets para induzir a formação de osso foi analisada in vivo tendo sido demonstrada a formação de osso vascularizado com uma estrutura medular organizada após a implantação de uma única cell sheet num modelo de ratinho nude. Além disso, numa tentativa de promover a vascularização, foram criadas cell sheets osteogénicas co-cultivadas com células endoteliais. Estas, quando cultivadas entre cell sheets osteogénicas sobrepostas, contribuíram para a formação de novos vasos in vivo bem como para o aumento da formação de novo osso. Esta tese demonstra que monócitos/macrófagos do sangue periférico podem acelerar a diferenciação osteogénica de progenitores osteogénicos enquanto os fibroblastos exercem um efeito negativo no fenótipo osteogénico de osteoblastos. Mais ainda, no contexto de uma reacção inflamatória do hospedeiro, ficou comprovado que células da fracção mononuclear do sangue do cordão umbilical participam na formação de novos vasos após co-cultura com osteoblastos. Além disso, as células endoteliais adultas, quando combinadas com cell sheets osteogénicas, promovem a formação de osso in vivo.
Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - SFRH / BD / 44893 / 2008.

Tese de doutoramento Programa Doutoral em Engenharia Química e Biológica
Food- and waterborne illnesses are a serious public health concern worldwide and have stimulated research aiming at a rapid and accurate detection of pathogens by applying biosensing technologies. Salmonella, Campylobacter and E. coli are some examples of pathogens that have an enormous impact on public health. Many publications have mentioned different type of biosensors for a broad range of bacteria. These methods may circumvent the limitations that conventional microbiological techniques have. Pathogens of interest need culture enrichment steps to reach the detection limit, a process that requires time, as well as laboratory technicians with expertise skills. Detection of pathogens at a very early stage is not as easy as it seems, due to the necessity to unite a set of characteristics that enable the development of an inexpensive and robust biosensor. The ideal biosensing system should be rapid and accurate and should combine specificity and sensitivity, leading to a marginal amount of false positive or negative results. As the biosensor is composed of two parts, a biological and a sensor element, the biorecognition element of choice plays a crucial role when creating the perfect biosensor. Bacteriophages (or simply phages) are viruses that specifically recognize bacteria and this characteristic can be used as a potential "key" to solve problems related with bacterial detection. Moreover, the easy and low cost production of these viruses combined with their stability in harsh environmental conditions make them excellent competitors with other biological elements (e.g. antibodies, enzymes). The use of phages as a therapeutic agent and as an interface in detection systems has gained special interest of the research community. In many laboratories, phage-based platforms have been developed; however only a few have broken the barrier and went to the market as a clinical diagnostic tool. Nowadays, the food sector still uses conventional methods to detect Salmonella in food stuff that, as mentioned before, take times and requires expert skills. Notwithstanding the great improvements in the detection area, biosensing systems still lack sensitivity and give erroneous results. Furthermore, problems related to the detection of bacteria in a viable but nonculturable (VBNC) state is one of the concerns that can give false negatives. VBNC bacteria are not able to grow on standard bacteriological media, but are metabolically active, albeit very low, maintaining the capacity to cause diseases and therefore remain a potential risk in several health facilities and the food industry. The use of standard microbiological methods to detect if the bacterium is dead or alive is no practicable, since the presence of VBNC state is not detectable. Therefore, novel technologies that can overcome this barrier are imperative. The prevalence of this problem and the necessity of finding a detection technology that can fulfill the Salmonella detection needs, led to the proposal of the present work that explores phages as an interface in a magnetoresistive and magnetoelastic biosensor. The work presented herein describes the characterization of a broad host range lytic phage. PVP-SE1, is able to discriminate between cell viability states, including the VBNC condition. This phage was combined with highly sensitive magnetoresistive sensors originating a powerful detection system with highstandard performance at the accuracy, specificity but also sensitivity level, detecting bacteria concentrations in the order of 100 cells/μL (3-4 cells/sensor). Another strategy followed, aiming at circumventing the limitations of using whole phages in a biosensing interface, was the utilization of recognition peptides of phage origin, responsible for the identification of the hosts. The proof-of-concept was demonstrated with a model phage selected from landscape library as a streptavidin binder. The results showed that the streptavidin binding peptides extracted from the phage bind to streptavidin with the same or better affinity than the native phage. The same was demonstrated with the tail fibre proteins of phage PVP-SE1, heterologously expressed, which showed equal binding affinities compared to their parental phage. This work demonstrates how phages can be explored in the development of a biosensor, opening the possibility of using an accurate, sensitive, specific and cheaper device that can be applied to an emergent concern: foodborne pathogens.
As doenças transmitidas através de alimentos e água contaminada são uma preocupação mundial e têm estimulado o desenvolvimento de métodos rápidos e precisos na área dos biossensores para a deteção de agentes patogénicos. Salmonela, Campylobacter e a E. coli são exemplos de espécies bacterianas patogénicos que tem um enorme impacto na saúde pública. Atualmente já existem diferentes tipos de biossensores desenvolvidos para uma ampla variedade de bactérias, que contornam as limitações das técnicas convencionais, tais como tempo de medida, devido à amplificação do microrganismo de interesse no seu adequado meio de cultura, e pela necessidade de técnicos com competências específicas. No entanto, a deteção de agentes patogénicos não é assim tão fácil como parece devido à necessidade de combinar um conjunto de características que permita o desenvolvimento de um biossensor robusto e pouco dispendioso. Um sistema de deteção ideal deve ser rápido, preciso e combinar características como especificidade e sensibilidade, de forma a conduzir a resultados livres de falsos positivos/negativos. Como o biossensor é composto por duas partes, i.e. um elemento biológico e um sensor, o elemento biológico escolhido tem um papel crucial no momento da criação de um biossensor perfeito. Bacteriófagos (ou simplesmente fagos) são vírus que infetam especificamente bactérias podendo essa característica ser utilizada como uma “chave” para solucionar problemas relacionados com a deteção de bactérias. Para além disso, a produção simples e económica destes vírus juntamente com a sua estabilidade em condições ambientais adversas, torna-os excelentes ferramentas de deteção, podendo competir com outros elementos biológicos (e.g. anticorpos, enzimas). A sua utilização como agentes terapêuticos e como interface em sistemas de deteção tem recebido uma atenção especial por parte da comunidade científica. Muitos laboratórios têm desenvolvido plataformas de deteção à base de fagos, no entanto, somente algumas conseguiram quebrar a barreira e entrar no mercado para serem usadas como ferramenta deteção para uso clinico. Hoje em dia, indústrias alimentares ainda usam métodos convencionais para detetar Salmonela na alimentação que, tal como previamente referido, são morosas e exigem mão de obra especializada. Mesmo utilizando diversas estratégias de deteção com diferentes plataformas e bio recetores, problemas com resultados falsos positivos e negativos permanecem difíceis de resolver. Bactérias viáveis, mas não cultiváveis são uma preocupação, porque estão relacionadas com resultados falsos negativos. Bactérias viáveis, mas não cultiváveis, não têm capacidade de crescer em meios de cultura convencional, mas encontram-se metabolicamente ativas, conservando a sua capacidade de causar doenças e de serem um potencial perigo em várias setores da saúde e na industria alimentar. Assim, a utilização de métodos de cultura padronizados para detetar se a bactéria está viva ou morta torna-se inviável, já que a presença de bactérias num estado viável, mas não cultivável não é detetada. Portanto, novas tecnologias que possam ultrapassar essa barreira são fundamentais. A prevalência deste problema e a necessidade de encontrar uma tecnologia de deteção que possa satisfazer as necessidades de deteção da Salmonela conduziu à proposta deste trabalho que explora os fagos como uma possível interface a usar em biossensores magneto-resistivos e magneto-elásticos. O trabalho presentado aqui descreve a caracterização de um fago lítico com um amplo espectro lítico, PVP-SE1. Este fago provou capacidade em discriminar os estados de viabilidade celular incluindo o estado viável, mas não cultivável. O fago foi combinado com sensores magneto-resistivos, que têm mostrado uma elevada sensibilidade. Esta combinação originou um poderoso sistema de deteção com um padrão de desempenho elevado, quer em termos de precisão e especificidade, quer em termos de sensibilidade, detetando concentrações de bactérias na ordem de 100 células/μL (3-4 células/sensor). Uma outra estratégia adotada, tendo por objetivo contornar as limitações da utilização dos fagos inteiros numa interface de um biossensor, passou pela utilização dos recetores dos fagos responsáveis pela identificação dos hospedeiros. Como prova de conceito um fago com especificidade de ligação à streptavidin foi selecionado a partir de uma biblioteca de fagos e usado como modelo. Os resultados demonstraram que os recetores do fago ligam-se à streptavidin com a mesma ou melhor afinidade do que o fago inteiro (original). O mesmo foi demonstrado com os recetores do fago PVP-SE1, demonstrando igualmente afinidades de ligação, comparativamente, com o seu fago parental. Este trabalho demonstrou como os fagos podem ser explorados no desenvolvimento de um biossensor abrindo a possibilidade de desenvolver um dispositivo preciso, sensível, específico e económico que possa ser aplicado a uma preocupação emergente: os patogénicos de origem alimentar.

Dissertação de mestrado em Biotecnologia e Bioempreendedorismo em Plantas Aromáticas e Medicinais
Cancer is one of the leading causes of death worldwide, being the colorectal cancer the third most occurring cancer in developed countries. The search for promising natural anticancer compounds is exponentially increasing, with the exploitation of new sources that were disregarded. Eucalyptus nitens crops are used in Portugal mainly by the pulp and paper industries, which produce substantial bark residues with no add-value use. They can, however, be an interesting source of triterpenic compounds. In this study, the potential anticancer effect of a lipophilic crude extract (CE) of E. nitens, a fraction of this more enriched in triterpenoids (F2), as well as their main isolated compounds, betulinic acid (BiA) and betulonic acid (BoA), was studied in the colorectal cancer cells. All test extracts/compounds showed potent anticancer effects based on cell viability, colony forming and migration assays. The F2 extract was shown to be two times more potent than the CE (IC50s of 1.3 μg/ml and 2.2 μg/ml, respectively), whereas BoA was about four times more potent than BiA (IC50s of 0.8 μM and 3.9 μM, respectively). The anticancer effects of the extracts/compounds were shown to be dependent both on inhibition of cell proliferation, as shown by the induction of cell cycle arrest assessed by flow cytometry, and on induction of cell death, as measures by the PI staining. At the higher concentrations tested, apoptosis was a contributor to the cell death. Interestingly, contrarily to their IC50s, BiA was a more potent inducer of apoptosis than BoA. Apoptosis was triggered by the intrinsic mitochondria pathway, probably through JNK activation but not through p53, since its levels were remarkably decreased by all the extracts/compounds. At lower doses of E. nitens extracts and tested triterpenoids, a non-apoptotic cell death was present, which could be mediated through a metabolic crisis, due to the significant activation of the AMPK energy-sensing regulator. This work shows the potential use of the wasted bark of E. nitens as an interesting source of potent natural anticancer triterpenoids against colorectal cancer cells.
O cancro é uma das maiores causas de morte mundial, sendo o cancro colorectal o terceiro tipo de cancro com maior ocorrência nos países desenvolvidos. A procura de compostos anticancerígenos naturais promissores está a aumentar exponencialmente, com a exploração de novas fontes que eram desconsideradas. Em Portugal as plantações de eucalipto são sobretudo utilizadas pelas indústrias de polpa e papel, e uma vez que a casca desta árvore não é utilizada no processo, produzem-se quantidades substanciais de resíduos que não são utilizados para fins com alto valor económico. Estes resíduos podem, no entanto, ser uma fonte interessante de compostos triterpénicos. Neste estudo, o potencial efeito anticancerígeno de extratos lipofílicos de Eucalyptus nitens, um bruto (CE) e um fraccionado (F2) mais enriquecido em triterpenóides, bem como os seus compostos principais ácido betulínico (BiA) e ácido betulónico (BoA), foram estudados nas células HCT116 do carcinoma colorectal. Todos os extratos/compostos testados demonstraram possuir efeitos anticancerígenos potentes, tal como observado nos ensaios de viabilidade celular, de formação de colónias e de migração celular. Foi demonstrado que o extrato F2 é duas vezes mais potente que o CE (IC50s de 1.3 μg/ml e 2.2 μg/ml, respectivamente), enquanto que o BoA foi cerca de quatro vezes mais potente que o BiA (IC50s de 0.8 μM e 3.9 μM, respectivamente). Também se verificou que os efeitos anticancerígenos dos extratos/compostos são dependentes quer da inibição da proliferação celular, como demonstrado pela indução de interrupção no ciclo celular avaliado por citometria de fluxo, quer da indução da morte celular, medido pela marcação por iodeto de propídio. Nas concentrações mais altas testadas, houve uma contribuição da apoptose para a morte celular encontrada. Contrariamente aos valores de IC50s, o BiA foi um indutor de apoptose mais potente que o BoA. A apoptose foi desencadeada pela via de sinalização intrínseca mitocondrial, provavelmente através da ativação da via JNK mas não através do p53, visto que os seus níveis foram marcadamente diminuídos pelos extratos/compostos. A doses mais baixas dos extratos de E. nitens e dos triterpenóides testados, também ocorreu morte celular mas de uma forma independente de apoptose, a qual pode ter sido mediada por uma crise metabólica, em virtude da ativação significativa observada da via AMPK. Os resultados deste trabalho sugerem uma potencial utilização valorizada da casca de E. nitens como uma fonte de potentes triterpenóides naturais com atividade anticancerígena contra células do carcinoma colorectal.

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial
A glândula tiróide produz as hormonas tiroxina (T4) e triiodotironina (T3) sob estimulação pela hormona tirotropina (TSH). Existem situações de disfunção tiroideia (hipotiroidismo e hipertiroidismo) cujo diagnóstico e monitorização dependem dos exames laboratoriais efetuados, além da avaliação clínica. O objetivo deste estudo foi proceder ao doseamento das hormonas TSH e T4 livre (FT4) em 111 doentes com patologia tiroideia já diagnosticada, utilizando dois equipamentos com metodologias semelhantes (Abbott ARCHITECT® i2000 - Quimioluminescência e Roche Cobas® 6000 – Eletroquimioluminescência) baseadas respetivamente, em reações químicas e reações elétricas, ambas geradoras de luminescência. Obteve-se concordância para as duas metodologias no doseamento da hormona TSH e inexistência de concordância para o doseamento de FT4.
Thyroid gland produces thyroxine (T4) and triiodothyronine (T3) hormones upon stimulation by thyrotropin (TSH) hormone. There are situations of thyroid dysfunction (hypothyroidism and hyperthyroidism) which diagnosis and monitoring rely on laboratory tests performed beyond clinic evaluation. The objective of this study was to proceed to the measurement of TSH and free T4 (FT4) hormones in 111 patients with thyroid disease already diagnosed, using two equipments with similar methodologies (Abbott ARCHITECT® i2000 - Chemiluminescence and Roche Cobas® 6000 - Electrochemiluminescence) based respectively, in chemical reactions and electrical reactions, both giving rise to luminescence. It was obtained agreement for the two methodologies in the determination of TSH hormone and no agreement for the determination of FT4.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica
O cancro é uma doença que afeta milhares de pessoas em todo o mundo. O papilomavírus humano (HPV) é uma das etiologias de cancro. Muitos pacientes de cancro apresentam inflamação sistémica para o qual existem reduzidas opções terapêuticas. Os polifenóis da dieta têm sido propostos para o seu tratamento, mas o seu potencial contra inflamação sistémica associada com o HPV é desconhecido. Assim, este trabalho tem como principal objetivo avaliar a eficácia a longo-prazo da suplementação oral da curcumina e da rutina em animais transgénicos para o HPV16 (K14HPV16). Neste estudo foram usados 50 murganhos fêmea, dos quais 38 transgénicos (K14HPV16) e 12 wild-type. Às 6 semanas de idade, iniciou-se a administração oral na comida dos compostos, curcumina e rutina Os animais foram sacrificados às 30 semanas, sendo recolhido o sangue, órgãos, e pele. Foram avaliadas as alterações inflamatórias nas lesões cutâneas induzidas pelos transgenes víricos, no sangue, fígado e baço através de análises hematológicas e histopatológicas. Foi também avaliado o stresse oxidativo a nível hepático. A carcinogénese cutânea induzida pelos transgenes do HPV16 esteve associada a progressiva, severa, inflamação sistémica (leucocitose, hepatite e esplenite) e mortalidade significativa. A administração oral de curcumina e rutina suprimiram totalmente a mortalidade enquanto reduziam os leucócitos e a incidência de esplenite e hepatite. Estes resultados levam-nos a concluir que os animais K14HPV16 são um modelo animal útil para estudar a inflamação sistémica associada a cancros induzidos pelo HPV. A administração de polifenóis na dieta podem ser uteis para o tratamento, com a consequente diminuição da inflamação sistémica.
Cancer is a disease that affects millions of people worldwide. Human papillomavirus (HPV) is a possible cause of cancer. Many cancer patients have systemic inflammation for which therapeutic options are reduced. The dietary polyphenols have been proposed for its treatment, but its potential against systemic inflammation associated with HPV is unknown. Curcumin and rutin are compounds that are thought to have therapeutic capabilities against HPV. However, there are few studies where the role of these compounds in HPV-associated tumors is shown. The main objective of this work is to study the human papilloma virus type 16 (HPV16), in transgenic animals (K14HPV16), specifically, a study of systemic inflammation induced by HPV 16, and its effects in the liver, as well as the effects of two compounds with potential therapeutic effects, curcumin and rutin. In this study were used 50 female mice, of which 38 are transgenic (K14HPV16) and 12 wild-type. After 6 weeks, it began the study with the compounds, curcumin and rutin which were added to the food. The animals were sacrificed at 30 weeks, the blood, the organs, and the skin tissue, were collected, to evaluate the activity of the compounds, as well as to proceed to the histopathological and biochemical analysis. The skin carcinogenesis induced by transgenes of HPV16 was associated with progressive, severe, systemic inflammation (leukocytosis, hepatitis and splenitis) and significant mortality. Oral administration of curcumin and rutin totally suppressed while reducing the mortality and incidence of leukocytes splenitis and hepatitis. These results lead us to conclude that the K14HPV16 Animals are a useful animal model to study the systemic inflammation associated with cancers induced by HPV. The administration of polyphenols in the diet may be useful for the treatment, with the consequent reduction of systemic inflammation.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde
A indústria cosmética está em constante crescimento, com produtos aliados a propriedades farmacêuticas, que surgem rapidamente. O Celuvein® é uma loção cosmética com propriedades farmacêuticas (cosmecêutico) para o tratamento e melhoramento da celulite e varizes, dois dos problemas mais preocupantes principalmente para mulheres. Os seus ingredientes incluem o Liporeductyl® (uma formulação com cafeína), Algisium® (silanol, sílica orgânica) e dióxido de titânio (TiO2), um pigmento branco com efeito protetor de raios ultravioleta (UV), sendo um dos mais usados. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos destes três componentes do Celuvein®, tanto in vivo como in vitro, principalmente o seu potencial citotóxico e genotóxico. Para os estudos in vivo foi usado como modelo animal a Drosophila melanogaster, uma vez que tem várias vantagens para estudos de toxicidade. Foram testados os efeitos na longevidade e prolificidade da Drosophila, bem como o potencial genotóxico, com o teste de mutação e recombinação somática (SMART). Para os estudos in vitro, os efeitos foram estudados em quatro linhas celulares: Caco-2, HaCaT, HepG2 e Raw264.7. A citotoxicidade foi avaliada com base no teste de viabilidade com Alamar Blue, e as células foram expostas durante 24 e 48 h aos compostos. Para determinar a genotoxicidade, foi realizado o ensaio de cometa em ambos os estudos, com neuroblastos de Drosophila nos estudos in vivo, e nas células HepG2 (com e sem FPG) para os estudos in vitro. Os resultados in vivo mostraram que o Liporeductyl® (acima de 1%) é tóxico para as Drosophila, diminuindo o seu tempo de vida e prolificidade, e os resultados do SMART também sugerem que este composto tem efeitos mutagénicos neste modelo animal. No entanto, não foram observados danos no DNA. No geral, o Algisium® e o TiO2 parecem melhorar a longevidade e prolificidade da Drosophila, contudo os resultados da mutagenicidade foram inconclusivos. Os resultados in vitro, semelhante ao observado in vivo, sugerem que o Liporeductyl® é citotóxico em todas as linhas celulares estudadas de um modo dependente da dose, no entanto, nas concentrações testadas no ensaio do cometa em HepG2, não houve qualquer aumento significativo de danos no DNA ou danos oxidativos. O Algisium® foi citotóxico nas células HaCaT, HepG2 e Raw264.7, com recuperação da viabilidade celular quando a exposição por 24 h foi comparada com as 48 h. Os resultados do ensaio do cometa sugerem que a diminuição de viabilidade às 24 h de exposição está relacionada com danos de DNA e danos oxidativos, uma vez que houve um aumento significativo de ambos. O TiO2 foi citotóxico nas células HaCaT e Raw264.7 de um modo dependente da dose. Não houve qualquer dano oxidativo, mas houve um aumento de dano no DNA na concentração mais elevada. Estes resultados demonstram a importância dos testes de cosméticos e cosmecêuticos, não só para comprovar a sua eficácia, mas para o seu potencial citotóxico e genotóxico. É importante considerar que as concentrações testadas não refletem as concentrações dos componentes no Celuvein®, logo não se devem fazer extrapolações diretas. São necessários mais testes para determinar os potenciais efeitos destes componentes no corpo humano.
The cosmetic industry is a growing field, with cosmetics starting to emerge with pharmaceutical properties at a fast rate. Celuvein® is a cosmetic lotion with pharmaceutical properties (cosmeceutical) for the treatment and improvement of cellulite and varicose veins, two of the most concerning problems especially for women. Its ingredients include Liporeductyl® (a formulation with caffeine), Algisium® (an organic silicium) and titanium dioxide (TiO2), one of the most vastly used white pigments and UV protectors. The aim of this study was to evaluate the in vivo and in vitro effects of these three components of Celuvein®, especially their cytotoxic and genotoxic potential. For the in vivo studies the Drosophila melanogaster animal model was used, as it has a lot of advantages for toxicity studies. Effects on longevity and prolificacy of Drosophila were tested, as well as the mutagenic potential, with the Somatic Mutation and Recombination Test (SMART). For the in vitro studies, the effects were studied in four different cell lines: Caco-2, HaCaT, HepG2 and Raw264.7. Cytotoxicity was evaluated based on the Alamar Blue viability assay, and cells were exposed to the components for 24 and 48 h. To assess the genotoxic potential of the components, the comet assay was performed in both studies, with Drosophila neuroblasts for the in vivo effects and with HepG2 cells (with and without FPG) for the in vitro effects. The in vivo results showed that Liporeductyl® was toxic for Drosophila, decreasing its lifespan and prolificacy (concentrations above 1%), and the SMART results also suggest that this component has mutagenic effects in this animal model. However, no DNA damage was observed. Algisium® and TiO2, generally, seemed to improve the longevity and prolificacy of Drosophila, and the results of the mutagenicity tested were mainly inconclusive. The in vitro results, similarly to what was observed in vivo, suggest that Liporeductyl® is cytotoxic in all tested cell lines in a dose-dependent mode, though, in the tested concentrations in the HepG2 comet assay, there wasn’t a statistically significant increase in DNA or oxidative damage. Algisium® was cytotoxic in HaCaT, HepG2 and Raw264.7 cells, with a recovery in cell viability when the 24 h of exposure were compared with the 48 h. The comet assay results suggest that the decrease in cell viability at the 24 h of exposure are related to DNA and oxidative damage, being that there was a statistically significant increase in both. TiO2 was cytotoxic to HaCaT and Raw264.7 cells in a dose-dependent way. No significant oxidative damage was present, but there was an increase in DNA damage at the highest tested concentration. These results show the importance of testing cosmetics and cosmeceuticals, not only for their efficacy but also for their cytotoxic and genotoxic potential. It’s important to consider that the tested concentrations don’t reflect the concentrations of the components in Celuvein®, so no direct extrapolation should be done. More tests are necessary to fully assess the potential effects of these components on the human body.

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial
O hemograma é um procedimento laboratorial amplamente utilizado na Medicina Veterinária. No entanto não existe informação sobre os valores de referência hematológicos para algumas raças de cães, nomeadamente para a raça Cão Serra da Estrela. Assim, os objetivos deste estudo são estabelecer os intervalos de referência dos vários parâmetros hematológicos para a raça Cão Serra da Estrela, das variedades pelo comprido e curto, e avaliar os efeitos do género e da idade nos intervalos de referência para os diferentes analitos do hemograma. Neste trabalho foram utilizados 105 cães (67 fêmeas e 38 machos) entre os 4 e os 108 meses de idade, inteiros, da raça Cão Serra da Estrela. Os animais utilizados no estudo foram provenientes de 12 distritos diferentes de Portugal continental. O hemograma foi realizado num analisador quantitativo do buffy coat (QBC Vet Autoread, IDEXX). Os resultados obtidos para os valores do hematócrito, da hemoglobina, da concentração de hemoglobina corpuscular média e da relação monócitos/linfócitos foram comparáveis aos intervalos de referência já estabelecidos neste aparelho para o cão adulto. No entanto, os valores dos limites superiores dos intervalos de referência para a contagem total de leucócitos e para o número absoluto de neutrófilos e de eosinófilos foram mais altos do que os já estabelecidos para o QBC. Também se observou que tanto os valores do limite inferior como os do limite superior do intervalo de referência para a contagem total de plaquetas são mais altos do que os do QBC. Neste estudo observou-se que o género, não teve um efeito estatisticamente significativo para nenhum dos analitos estudados. No entanto, a idade teve um efeito estatisticamente significativo sobre o valor do hematócrito (p=0,002), da hemoglobina (p=0,0001) e da relação linfócitos/monócitos (p=0,016). Os intervalos de referência obtidos neste trabalho podem ser adotados pelos laboratórios e Médicos Veterinários que tiverem um analisador quantitativo do buffy coat (QBC Vet Autoread, IDEXX).
The hemogram is one of the most frequently solicited exams in the clinical practice. It is indicated always there is the suspect of disease, to help in the diagnosis, to monitor the evolution of disease and response to the therapy. Ideally, the hematological values should be compared with the reference values specific for each population. However, these values are characterized for few breeds of dogs. In addition to review the bibliography related to the hemograma in healthy dogs, this dissertation aimed to contribute to the characterization of the hemograma in dogs Serra da Estrela, proposing an interval of reference values for this breed. The hematological values were determined in a sample of 105 Serra da Estrela adult dogs, entire and clinically healthy, using the apparatus of the laboratory of clinical analysis and evaluation of one blood smear from each animal. It was proposed a set of hematological reference values and it was reported that for each analysed sample, the hematocrit value and the mean corpuscular volume and platelets tend to be decreased.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde
A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença progressiva, caraterizada pela elevação da pressão arterial pulmonar e pela remodelação vascular pulmonar, conduzindo à hipertrofia do ventrículo direito (VD), insuficiência cardíaca e morte. Apesar da disfunção do VD estar intimamente relacionada com a sobrevida, pouco se sabe acerca da adaptação e insuficiência do VD no contexto da HAP. A adenosina é um importante modulador da função cardiovascular, atuando através da ativação dos seus recetores, A1, A2A, A2B e A3. Estudos recentes sugerem o envolvimento da adenosina na HAP, devido ao seu papel na regulação do tónus vascular pulmonar. Contudo, desconhece-se o papel que este nucleósido desempenha na disfunção do VD que ocorre nesta doença. Neste contexto, o principal objetivo deste estudo foi investigar o papel da sinalização da adenosina na disfunção ventricular associada à HAP. Para tal, usou-se um modelo animal de HAP induzida pela monocrotalina. Ratazanas Wistar machos receberam aleatoriamente uma injeção subcutânea de monocrotalina (grupo MCT) ou veículo (grupo CTRL). Os estudos hemodinâmicos, miográficos e a colheita de amostras para análise morfométrica, histológica e para os estudos de imunofluorescência e moleculares foram realizados 21 a 25 dias após a indução do modelo. A avaliação hemodinâmica confirmou a presença de HAP nos animais MCT, traduzida no aumento da pressão sistólica do VD. Além disso, a morfometria cardíaca e pulmonar, bem como a presença de hipertrofia dos cardiomiócitos ventriculares e da camada média das arteríolas pulmonares nestes animais permitiram a validação do modelo. Os estudos funcionais in vitro foram realizados em aurículas a contrair espontaneamente e em tiras de ventrículo direito estimuladas eletricamente, de modo a avaliar o papel dos recetores A1 e A2 da adenosina na função cardíaca. Os resultados obtidos com a R-PIA (0,001-1 μM) agonista seletivo dos recetores A1, e com a NECA (0,01-100 μM), agonista não seletivo, mostraram que os recetores A1 diminuem a frequência (cronotropismo negativo) e a força de contração (inotropismo negativo) auricular, tanto em animais CTRL como MCT. Tanto a ativação dos recetores A2A com o CGS 21680 (0,003-1 μM), como dos recetores A2AB com o BAY 60-6583 (0,01-10 μM) não alteraram a função auricular. No tecido ventricular a ativação dos recetores A1 pela R-PIA e pela NECA não modificou a contratilidade ventricular, apesar de se ter comprovado a presença destes recetores no miocárdio ventricular por experiências de imunofluorescência analisadas por microscopia confocal. De igual forma, a ativação dos recetores A2A pelo CGS 21680 também não alterou a contratilidade ventricular. Por outro lado, o bloqueio dos recetores A2B com o PSB 603 (100 nM) evidenciou um efeito inotrópico positivo da NECA nos animais MCT, sugerindo nestes animais o envolvimento destes recetores num efeito inotrópico negativo. As experiências de imunofluorescência analisadas por microscopia confocal permitiram verificar uma presença ligeira dos recetores A2B no miocárdio de animais CTRL e MCT. Contudo, nos animais com HAP, verificou-se uma presença marcada do recetor A2B em agrupamentos de células existentes no espaço intersticial do VD. Em conclusão, a adenosina parece modular a atividade cardíaca na HAP por intermédio dos seus recetores A1 e A2B, sendo que no futuro importa avaliar a relevância funcional das células intersticiais que expressam recetores A2B.
Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a progressive disease characterized by increases in pulmonary arterial pressure and pulmonary vascular remodelling, leading to right ventricle (RV) hypertrophy, heart failure and death. Despite RV dysfunction is closely tied to survival in PAH, little is known about RV adaptation and failure within the context of PAH. Adenosine is an important modulator of cardiovascular function, via the activation of A1, A2A, A2B and A3 receptors. Recent studies have implicated adenosine in PAH, due to its role on the regulation of pulmonary vascular tonus. Nevertheless, the role of this nucleoside in RV dysfunction secondary to this pathology is still unknown. In this context, our main goal was to study the role of adenosine in ventricular dysfunction associated to PAH. To carry out the study, an animal model of monocrotaline-induced PAH was used. Male Wistar rats randomly received monocrotaline (MCT group) or vehicle (CTRL group). Hemodynamic, myographic and sample collection for morphometric, histological, immunofluorescence, and molecular studies were performed 21 to 25 days after monocrotaline administration. Hemodynamic evaluation confirmed the presence of PAH in MCT animals, as demonstrated by the elevation of systolic pressure of RV. Also, cardiac and pulmonary morphometric, and the presence of cardiomyocytes hypertrophy and pulmonary media hypertrophy allowed the validation of the PAH model. In vitro functional studies were performed in spontaneously beating atria and RV strips electrically stimulated to evaluate the role of adenosine A1 and A2 receptors on cardiac function. The results obtained with R-PIA (0,001-1 μM), a selective A1 receptor agonist, and NECA (0,01-100 μM), a non-selective agonist, demonstrated that A1 receptors decrease auricular frequency (negative chronotropic effect) and force of contraction (negative inotropic effect) in both groups. The activation of A2A receptors with CGS 21680 (0,003-1 μM), and A2AB receptors with BAY 60-6583 (0,01-10 μM) did not change the auricular function. At the ventricular level, the activation of A1 receptors with R-PIA and NECA did not change ventricular contractility, in spite of the presence of these receptors in RV myocardium as demonstrated by confocal microscopy. Likewise, the activation of A2A receptors with CGS 21680 had no effect on ventricular contractility. On the other hand, in MCT animals, A2B receptor blockade with PSB 603 (100 nM) resulted in a positive inotropic effect promoted by NECA, suggesting that these receptors could be involved in a negative inotropic effect. Immunolocalization studies confirmed the presence of small amounts of A2B receptors staining in the RV myocardium of both CTRL and MCT animals. However, we only observed in PAH rats a marked expression of this receptor in cells present in the interstitial spaces of RV. In conclusion, adenosine seems to modulate cardiac function in PAH through the activation of A1 and A2B receptors. The functional significance of A2B positive interstitial cells should be evaluated in the near future.
Fundação para a Ciência e Tecnologia, e da Unidade Multidisciplinar de Investigação Biomédica - UMIB

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde
A diabetes mellitus é uma patologia heterogénea, caracterizada por alterações endócrino-metabólicas da homeostasia da glicose plasmática. A associação entre esta doença metabólica e a afeção do metabolismo do tecido ósseo tem sido alvo de estudo aprofundado na literatura científica. Apesar das evidências obtidas em diversos estudos experimentais e clínicos, o conhecimento da influência desta condição no processo de regeneração óssea é ainda escasso. Este trabalho teve como objetivo avaliar a influência da diabetes mellitus experimental, induzida pela estreptozotocina, no processo de regeneração de defeitos ósseos subcríticos, na tíbia de rato. Simultaneamente avaliou-se o efeito da implantação de uma membrana de colagénio tipo I, reabsorvível, no processo de regeneração óssea guiada. Foram utilizados 34 Rattus norvegicus, os quais foram divididos em quatro grupos: Diabetes 2 semanas (D2S), Controlo 2 semanas (C2S), Diabetes 6 semanas (D6S) e Controlo 6 semanas (C6S), de acordo com o tempo de regeneração do defeito criado cirurgicamente. A condição diabética foi induzida pela administração intraperitonial de estreptozotocina (STZ), na dose de 60mg/Kg. Duas semanas após a indução da diabetes experimental, e confirmação do estado diabético, foi efetuado um defeito ósseo monocortical subcrítico de 1,4mm de diâmetro nas tíbias de todos os animais. Nas tíbias esquerdas foi aplicada uma membrana reabsorvível de colagénio tipo I, de forma a avaliar o processo de regeneração óssea guiada. Durante toda a atividade experimental foram avaliados o consumo de água e alimento, bem como os pesos corporais dos animais de todos os grupos. No final de cada período experimental, 2 e 6 semanas após a realização dos defeitos ósseos, os animais foram sacrificados, os órgãos internos foram pesados e as tíbias foram recolhidas para análise radiográfica, microtomográfica e histológica. Neste trabalho verificou-se que a administração de STZ induziu a condição diabética em todos os animais dos grupos D6S e D2S. Estes grupos consumiram muito mais água e alimento, relativamente aos seus controlos. Observou-se também que estes grupos apresentaram uma perda de peso estatisticamente significativa. Relativamente aos pesos dos órgãos, verificou-se que, nos grupos diabéticos, o fígado, coração e baço apresentaram peso inferior e os rins um peso superior aos controlos respetivos. Os animais diabéticos manifestaram também alterações da microestrutura óssea: redução de densidade e volume ósseo e maior separação entre trabéculas, ao nível do osso trabeculado da tíbia. Relativamente à avaliação do processo de regeneração óssea verificou-se que, ao longo do tempo, o defeito foi progressivamente regenerado em ambos os grupos experimentais – atingindo a regeneração completa às 6 semanas. No entanto, os animais diabéticos apresentaram um processo regenerativo mais lento que o verificado nos animais controlo, mesmo com a aplicação de técnicas de regeneração óssea guiada – implantação cirúrgica da membrana. Nos locais em que a membranas foi implantada verificou-se um crescimento exofítico de tecido ósseo, não só na região do defeito mas também na superfície do osso adjacente, nos animais do grupo controlo e do grupo diabético. Este tecido apresentava características morfológicas de osso imaturo, com elevada densidade de trabéculas e porosidade. A condição diabética parece afetar significativamente o processo de regeneração óssea, mesmo na presença de técnicas de regeneração óssea guiada, atrasando a regeneração do defeito criado.
Diabetes mellitus is a heterogeneous disorder characterized by endocrine-metabolic changes of the homeostasis of plasma glucose. The association between this metabolic disease and the metabolic condition of the osseous tissue has been the subject of extensive scientific studies. Despite evidence obtained in several experimental and clinical studies, knowledge of the influence of this condition in the process of bone regeneration is still scarce. This study had the objective of evaluate the influence of experimental diabetes induced by streptozotocin (STZ) in the process of regeneration of subcritical bone defects of the tibiae in rats. Simultaneously, the effect of the implantation of type I collagen reabsorbable membrane, in the process of guided bone regeneration, has been evaluated. In this study, 34 Rattus norvegicus were used, which were divided into four groups: Diabetes 2 Weeks (D2W), Control 2 Weeks (C2W), Diabetes 6 Weeks (D6W) and Control 6 Weeks (C6W) according with the regeneration time of the surgically created defect. The diabetic state was induced by the intraperitoneal administration of STZ at a 60mg/kg dose. Two weeks after the induction of experimental diabetes and diabetic status confirmation, a subcritical monocortical bone defect of 1.4 mm of diameter was made on the tibiae of all animals. In the left tibiae a reabsorbable type I collagen membrane was applied, in order to evaluate the process of guided bone regeneration. Throughout the experiment the consumption of food and water and the body weights of the animals of all groups were assessed. At the end of each experimental period, 2 and 6 weeks after the execution of bone defects, the animals were sacrificed, the internal organs were weighed and the tibiae were harvested for radiographic, histological and micro tomographic studies. In this study it was verified that the administration of STZ induced the diabetic condition in all animals from groups D2W and D6W. The animals from these groups consumed more food and water than the animals from their control groups. It was also observed that the animals from these groups showed a statistically significant weight loss. With regard to the weights of the organs it was found that, in animals from diabetic groups, liver, heart and spleen showed a lower weight than the ones from control animals and kidneys showed a higher weight than the ones from respective control animals. Diabetic animals also showed bone microstructure changes: decrease of the density and bone volume and a higher separation between trabeculae at the level of the trabecular bone of the tibia. Regarding the evaluation of the process of bone regeneration was found that, over time, the defect was gradually regenerated in both experimental groups - achieving complete regeneration at 6 weeks. However, diabetic animals showed a regenerative process slower than the observed in control animals, even with the application of guided bone regeneration techniques - surgical implantation of the membrane. In places where the membrane has been deployed, an exophytic growth of bone tissue was observed, not only at the region of the defect but also on the surface of the adjacent bone on both control and diabetic animals groups. This tissue showed morphological characteristics of immature bone, with high density of trabeculae and porosity. The diabetic condition seems to affect significantly the process of bone regeneration, even in the presence of techniques for guided bone regeneration, delaying the regeneration of the created defect.

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial
Patologias do tecido ósseo, originárias de várias causas, nomeadamente traumas, infeções ou doenças ósseas, são muito comuns na nossa sociedade. Na situação de diabetes mellitus, estes defeitos ósseo estão agravados e o seu tratamento apresenta uma maior dificuldade para os clínicos. Nos últimos anos a nanotecnologia tem fornecido variadíssimos benefícios no campo da engenharia do tecido ósseo, no entanto nenhuma das soluções tem resolvido totalmente os diversos desafios que pressupõem a reparação óssea. Desta forma, têm sido estudadas novas soluções terapêuticas para resolver este problema, e o desenvolvimento de novos biomateriais fabricados com nanopartículas que simulem a estrutura e composição do osso, favorecendo a sua regeneração, têm sido equacionados. Assim este trabalho tem como principal objetivo o estudo da biocompatibilidade de uma preparação de nanopartículas de hidroxiapatite (NanoXIM•HAp102®) na condição de diabetes, usando para tal um modelo de implante subcutâneo em ratos Wistar. Neste estudo foram usados 16 ratos machos da estirpe Wistar, dos quais 10 foram submetidos à indução da diabetes, por via intraperitonial, com uma única administração de 55 mg/Kg de estreptozotocina (STZ), sendo os restantes injetados com soro tampão citrato (grupo controlo). Duas semanas após a indução da diabetes, implantou-se subcutaneamente em todos os animais 0,5 ml de suspensão de nanopartículas de hidroxiapatite (nano-HAp). Os animais foram sacrificados às 48h e 3 semanas, sendo recolhido o sangue, órgãos, e tecido subcutâneo com a nano-HAp, para avaliar a atividade e expressão de variados marcadores séricos, assim como proceder à análise histopatológica. Os animais diabéticos apresentaram uma diminuição do peso corporal e um aumento do peso relativo dos rins e do fígado quando comparado com os respetivos grupos controlo. Os valores dos marcadores de função renal, ureia e creatinina, e das enzimas hepáticas ALT e FA, encontraram-se elevados nos animais diabéticos comparativamente com os controlos. Às 48h, verificou-se a existência de uma resposta inflamatória aguda, com presença de neutrófilos e linfócitos, e uma resposta inflamatória crónica caracterizada pela presença de macrófagos e células gigantes, às 3 semanas. Tanto a resposta inflamatória, como a reabsorção das nanopartículas encontraram-se diminuídas nos grupos diabéticos comparativamente com o respetivo grupo controlo. Constatou-se a presença de uma cápsula fibrosa nos grupos experimentais das 3 semanas, sendo que esta foi menor no grupo diabético comparativamente com o respetivo grupo controlo. Observou-se ainda alguma agregação de nano-HAp, tendo esta sido mais intensa em ambos os grupos diabéticos, e dentro destes maior às 3 semanas. Uma vez que não se verificou uma reação exacerbada e que ocorreu reabsorção do biomaterial, sem sinal de toxicidade hepática ou renal, na quantidade testada, podemos concluir que as nano-HAp não apresentam toxicidade. Embora se tenha observado reabsorção das nano-HAp ao longo do período experimental, constatou-se que este processo era bastante mais lento nas condições diabéticas.
Pathologies of bone tissue, that are provided from different causes, including trauma, infections or bone diseases, are very common in our society. In the specific case of diabetes mellitus, the bone defects are intensified and its treatment presents a major difficulty for clinicians. Actually, nanotechnology provides many different benefits in the field of bone tissue engineering, however, any solutions have completely solved the challenges that require bone repair. In this way, it has been studied new therapeutic solutions to solve this problem, the development of new biomaterials made from nanoparticles that acquire a similar structure and composition of the original bone, promoting regeneration, have been solved. The main objective of this work is the study of the biocompatibility, of hydroxyapatite nanoparticles (NanoXIM • HAp102 ®) in diabetic conditions, using for such a model of subcutaneous implantation in Wistar rats. This study used 16 male rats of the Wistar strain, 10 of which were subjected to induction of diabetes with single intraperitoneally administration of 55 mg / kg streptozotocin (STZ), and the remaining were injected with physiological serum (the control group). After the induction of diabetes, was subcutaneously implanted 0,5 ml hydroxyapatite nanoparticles (nano-HAp). The animals were sacrificed at 48 hours and 3 weeks, being collected the blood, organs, and subcutaneous tissue, with nano-Hap, to evaluate the expression and the activity of various serum markers, as well as the histopathology. Diabetic animals showed a decrease in body weight and an increase in the relative weight of the liver and kidneys when compared with the respective control groups. The values of markers of renal function, urea and creatinine, and liver enzymes ALT and FA, were also higher in diabetic animals compared with control. At 48 h, it was found a several inflammatory response with neutrophils and lymphocytes, and a chronic inflammatory response characterized by the presence of macrophages and giant cells, at 3 weeks. The inflammatory response and the reabsorption of the nanoparticles were found decreased in diabetic group compared with the respective control group. It was observed the presence of a fibrous capsule in the experimental groups of the 3 weeks, but it was lower in the diabetic group as compared to the respective control group. There was also some aggregation of nano-Hap, that was more intense in both diabetic groups, and within these higher at 3 weeks. With the quantity tested, there has not been observed an overreaction and the biomaterial reabsorption occurred without signs of hepatic or renal toxicity. Although we observed a progressive reabsorption of nano-HAp throughout the experimental period, this process was significantly slower in diabetic conditions.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, Ciências Veterinárias
A doença periodontal é um processo inflamatório prevalente tanto em canídeos como em humanos e que pode resultar em esfoliação dentária bem como em implicações de saúde sistémicas. Como os tratamentos atuais são por vezes ineficazes, a Engenharia de Tecidos pode fornecer estratégias para o desenvolvimento de novas terapias. O objetivo deste projeto consistiu no desenvolvimento uma nova matriz com propriedades osteocondutoras para a regeneração óssea e periodontal. Propusemos uma matriz de dupla camada que compreende uma membrana de amido poli-ɛ-caprolactona (SPCL) obtido por evaporação de solvente, a qual sustenta o princípio da regeneração tecidular guiada, e uma malha de fibra de SPCL funcionalizada com grupos silanol osteocondutores. O potencial deste biomaterial para servir como um veículo de células estaminais e como matriz osteocondutora foi previamente avaliado por cultura com células estaminais adiposas caninas. Neste estudo, o desempenho da matriz de dupla camada SPCL-Si foi avaliado no modelo mandibular de rato sendo comparado com defeitos vazios (controlo negativo) e com membranas comerciais de colagénio (controlo positivo). Após 8 semanas de implantação, através de microtomografia computadorizada e análise histomorfométrica (amostras processadas pela técnica de Donath), foi concluído que a matriz de dupla camada SPCL-Si conduziu a formação de osso novo em maior quantidade, quando comparado com os defeitos vazios e com o colagénio. Esta matriz bioativa de dupla camada mostrou ter um grande potencial para ser usado na regeneração do osso alveolar e do periodonto.
Periodontal disease is an inflammatory pathology prevalent in dogs and humans that can result in tooth loss as well in systemic health implications. As the current treatments are sometimes ineffective, Tissue Engineering strategies have paved for new therapies. The purpose of this project was to develop a new scaffold with osteoconductive properties for use in bone and periodontal regeneration. We proposed a double layer scaffold comprising a starch poly-ɛ-caprolactone (SPCL) membrane obtained by solvent casting, which sustains the guided tissue regeneration principle, and a SPCL wet-spun fiber mesh functionalized with osteoconductive silanol groups. The potential of this biomaterial as vehicle of stem cells and as an osteoconductive matrix was previously assessed by culturing it with canine adipose stem cells. In this study, the performance of the SPCL-Si double layer scaffold was assessed in the mandibular rodent model, and compared with empty defects (negative control) and collagen commercial membranes (positive control). After 8 weeks of implantation, micro-computed tomography and histomorphometrical analysis (samples processed by the Donath technique), revealed that the SPCL-Si double layer scaffold conduced higher new bone formation, compared to empty defects and collagen. This bioactive double layer scaffold was shown to have large potential for use in alveolar bone and periodontal regeneration.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica
A diabetes mellitus é uma doença complexa e potencialmente debilitante, que afeta milhões de indivíduos em todo o mundo e é já considerada um problema de saúde pública pela Organização Mundial de Saúde (OMS). A diabetes tipo 1 é caraterizada pela destruição autoimune das células β pancreáticas dos ilhéus de Langerhans e a diabetes tipo 2 pela resistência periférica à insulina levando ao desenvolvimento da hiperglicemia. A hiperglicemia crónica afeta negativamente a regeneração e remodelação óssea, atrasando assim, a cicatrização óssea e aumentando a suscetibilidade de doenças periodontais. Deste modo, na regeneração guiada de tecidos, é necessária a utilização de um biomaterial adequado que promova a regeneração tecidular em condições diabéticas. Neste estudo, avaliou-se a biocompatibilidade in vivo de uma membrana de colagénio num modelo animal diabético, particularmente, a reação inflamatória aguda (48 h) e crónica (3 semanas) após implantação subcutânea. Neste trabalho foram utilizados 14 ratos machos da estirpe Wistar, divididos em 4 grupos: Controlo (n=3) e Diabetes (n=3) 48h e Controlo (n=3) e Diabetes (n=5) 3 semanas. A condição diabética foi introduzida através da administração intraperitoneal de 50 mg/kg de estreptozotocina (STZ). Foi realizada uma cirurgia no dorso dos animais onde foi efetuada a implantação subcutânea de membranas de colagénio. Um grupo controlo e um grupo com animais diabéticos foram sacrificados 48 horas após a implantação do biomaterial, e os animais dos restantes grupos foram sacrificados 3 semanas após a implantação. Foram recolhidas amostras de pele dos locais de implantação que foram avaliadas por histopatologia, com contagem total e diferencial das células inflamatórias, através da coloração de hematoxilina e eosina (H&E). Para caracterizar o infiltrado inflamatório linfocitário, foi efetuada a técnica de imunohistoquímica (IHQ) com os anticorpos CD3, BLA e CD79. Observamos que o número total de células inflamatórias foi superior nos animais controlo, sendo esta diferença mais acentuada às 48h após implantação. Relativamente à contagem diferencial, verificou-se que às 48h se observa uma maior percentagem de neutrófilos, enquanto nos grupos sacrificados às 3 semanas se obteve uma percentagem superior de linfócitos e macrófagos. Relativamente aos resultados obtidos na IHQ, os animais controlo apresentaram maior percentagem de linfócitos marcados com CD3 (linfócitos T) e menor percentagem de linfócitos marcados com BLA e CD79 (linfócitos B), do que os animais diabéticos. A membrana de colagénio demonstrou ser bastante biocompatível, apresentando uma resposta inflamatória moderada às 3 semanas. Os grupos diabéticos (48h e 3 semanas) apresentaram diferenças na resposta inflamatória em relação aos grupos controlo, nomeadamente no que se refere ao número de células e à sua tipologia. O STZ administrado para induzir a diabetes possui um efeito imunossupressor que pode estar na origem do menor número de células inflamatórias nos animais diabéticos. Ainda não são claros os mecanismos subjacentes ao tipo celular presente no infiltrado inflamatório após implantação da membrana de colagénio em condições diabéticas. No entanto, é possível que a hiperglicemia possa estar na origem do menor número de linfócitos T observado na condição diabética, não afetando a presença de linfócitos B. Deste modo, a diminuição da resposta imune em condições diabéticas pode estar associada fundamentalmente a uma diminuição dos linfócitos T.
Diabetes mellitus is a complex and potentially debilitating disease that affects millions of individuals worldwide and it is considered a public health problem by the World Health Organization (WHO). Type 1 diabetes is characterized by autoimmune destruction of pancreatic β cells of the islets of Langerhans, and type 2 diabetes by peripheral insulin resistance leading to the development of hyperglycemia. Chronic hyperglycemia negatively affects bone remodeling and regeneration, delaying bone healing and increasing the susceptibility of periodontal diseases. Therefore, in guided tissue regeneration, the use of a suitable material that promotes tissue regeneration in diabetic conditions is required. In this study, we evaluated the in vivo biocompatibility of a collagen membrane in a diabetic animal model, particularly the acute (48 hours) and chronic (3 weeks) inflammatory reaction after subcutaneous implantation. In this study, 14 male Wistar rats were used, divided into four groups: Control (n=3) and Diabetes (n=3) 48h and Control (n=3) and Diabetes (n=5) 3 weeks. The diabetic condition was introduced via intraperitoneal administration of 50 mg/kg of streptozotocin (STZ). A surgery was performed on the back of the animals, where the implantation of collagen membranes was subcutaneously performed. A control group and one group of diabetic animals were sacrificed 48 hours after the implantation of the biomaterial and the other two groups were sacrificed 3 weeks after implantation. Skin samples of the implantation sites were collected and evaluated by histopathology, with total and differential counts of inflammatory cells, after staining with hematoxylin and eosin (H&E). To characterize the lymphocytic inflammatory infiltrate, immunohistochemistry (IHC) was performed with CD3, CD79 and BLA antibodies. The total number of inflammatory cells was higher in the control animals, with a more evident difference at 48h after implantation. Regarding the differential counts, it was found that at 48h a higher percentage of neutrophils was present, while in the animals sacrificed at 3 weeks, a higher percentage of lymphocytes and macrophages was observed. Regarding the results obtained in IHC, control animals showed a higher percentage of CD3-positive lymphocytes (T lymphocytes) and a lower percentage of BLA and CD79-positive lymphocytes (B lymphocytes) than diabetic animals. The collagen membrane was shown to be highly biocompatible, having a moderate inflammatory response at 3 weeks post implantation. The diabetic groups (48 hours and 3 weeks) showed differences in the inflammatory response compared to control groups, in particular regarding the number of inflammatory cells and their type. STZ has an immunosuppressive effect that may be associated with fewer inflammatory cells in the diabetic animals. The mechanisms underlying cell type presence in the inflammatory infiltrate in diabetic conditions are not yet clear. However, it is possible that hyperglycemia can cause the smaller number of T lymphocytes observed in the diabetic condition, without affecting the presence of B lymphocytes. Therefore, the decrease of the immune response in diabetic conditions might be mainly associated with a decrease in T lymphocytes.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde
A medula óssea é um tecido de consistência gelatinosa que preenche a cavidade interna de vários ossos do esqueleto, podendo ser classificada em dois tipos principais: medula óssea vermelha (também designada medula óssea ativa) e medula óssea amarela. Vários estudos têm sugerido a subdivisão da medula óssea em nichos com microambientes específicos. Microscopicamente, a medula óssea é constituída, em proporções diferentes, por células hematopoiéticas e suas correspondentes células tronco hematopoiéticas e células progenitoras, células tronco mesenquimais, células do estroma, adipócitos, mastócitos (células do tecido conjuntivo) e células plasmáticas. As células tronco hematopoiéticas têm a capacidade de se diferenciarem em linfócitos (células hematopoiéticas envolvidas na resposta imune), em granulócitos (células hematopoiéticas que defendem o organismo contra bactérias), em trombócitos ou plaquetas (células hematopoiéticas responsáveis pela prevenção da hemorragia) e em eritrócitos (células hematopoiéticas vulgarmente conhecidas como glóbulos vermelhos ou hemácias, que são responsáveis pelo transporte de gases pelo sangue). Atualmente sabe-se que as células hematopoiéticas são positivas para os seguintes marcadores celulares de superfície: CD45, CD14 e CD34, os quais foram utilizados no presente estudo. As células tronco mesenquimais constituem o maior tipo de células tronco mesenquimais multipotentes, as quais podem provir de várias fontes: medula óssea, tecido adiposo, sangue periférico, pulmão ou coração. Estas células tronco são capazes de se diferenciar em várias linhagens celulares in vitro: osteoblastos, condrócitos, adipócitos, mioblastos, hepatócitos e possivelmente em células do tecido neural. As células tronco mesenquimais da medula óssea expressam os marcadores celulares de superfície CD29, CD73, CD90, CD105, CD106, CD140b e CD166, mas não expressam os marcadores CD31, CD45, CD34 e CD133. A citometria de fluxo tem vindo a tornar-se a maior ferramenta para a caracterização fenotípica de células. Como ferramenta analítica, a sua capacidade única para discriminar, quantificar e classificar um elevado número de células é incomparável. Esta tecnologia quantifica e analisa em simultâneo características físicas de partículas únicas, tais como o tamanho relativo das partículas, a granularidade relativa ou complexidade interna, e a intensidade relativa de fluorescência emitida por anticorpos ou corantes, permitindo a distinção das células e o seu agrupamento em populações com características semelhantes. Nas últimas décadas, os pequenos ruminantes (ovelha e cabra) têm sido amplamente utilizados como modelos animais reconhecidos em vários projetos de investigação biomédicos, destacando-se na investigação em ortopedia. No presente estudo foram utilizadas seis cabras autóctones de raça Serrana (Capra aegagrus hircus), devidamente identificadas. Foram realizados aspirados de medula óssea e colheitas de sangue aos referidos animais, e as amostras seguiram para a realização de hemogramas, esfregaços, cultura de células, imunocitoquímica e citometrias de fluxo. Para a realização das técnicas de imunocitoquímica e citometria de fluxo foram utilizados os seguintes marcadores celulares de superfície: CD14, CD45 e CD34. Os resultados obtidos na técnica de imunocitoquímica vieram confirmar a marcação positiva dos marcadores utilizados neste estudo nas células da medula óssea da cabra. Os resultados obtidos nas citometrias de fluxo de medula óssea de cabra estavam em concordância com o descrito na literatura existente para o Homem e para a ovelha, no entanto, surgiram algumas dúvidas na interpretação dos resultados e a marcação com CD34 não foi validada para cinco dos animais em estudo. Deste estudo pudemos concluir que a cabra deverá ser um bom modelo animal para estudos de medula óssea pela técnica de citometria de fluxo, visto que houve uma boa correlação dos resultados obtidos com os resultados da citometria de fluxo de medula óssea humana. Assim, será de todo o interesse prolongar os estudos de caracterização da medula óssea da cabra com vista a aumentar o seu conhecimento para que num futuro próximo possam ser estudadas várias doenças e distúrbios, nomeadamente do sistema esquelético, e os seus resultados extrapolados para o Homem.
The bone marrow is a tissue with gelatinous consistency that fills the internal cavity of several bones throughout the skeleton. Bone marrow is classified into two basic types: red bone marrow (also called active bone marrow) and yellow bone marrow. Many studies have suggested the subdivision of bone marrow in niches with specific microenvironments. Microscopically, bone marrow is formed, in different proportions, by hematopoietic cells, and their stem cells and progenitor cells, mesenchymal stem cells, stromal cells, adipocytes, mast cells (conjunctive tissue cells) and plasma cells. Hematopoietic stem cells have the capacity to differentiate into lymphocytes (hematopoietic cells involved in immune response), in granulocytes (hematopoietic cells that defend the body against bacteria), in platelets (hematopoietic cells responsible for preventing the bleeding) and erythrocytes (hematopoietic cells commonly known as red blood cells that are responsible for transporting gases through the blood). Currently it is known that hematopoietic cells are positive for the following cell surface markers: CD45, CD14 and CD34, which have been used in this research study. Mesenchymal stem cells are the largest type of multipotent mesenchymal stem cells, which may come from several sources: bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, lung or heart. These stem cells are able to differentiate into several cell lines in vitro: osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, myoblasts, hepatocytes and possibly in neural tissue. The bone marrow MSCs express cell surface markers CD29, CD73, CD90, CD105, CD106, CD166 and CD140b, but do not express the markers CD31, CD45, CD34 and CD133. Flow cytometry has become a major tool for phenotypic characterization of cells. As an analytical tool, its unique ability to discriminate, quantify and classify a large number of cells is incomparable. This technology simultaneously analyzes and quantifies the physical characteristics of single particles, such as the relative size of the particles, relative granularity or internal complexity, and the relative intensity of fluorescence emitted by antibodies or dyes, and allowing the differentiation of the cells in clustered populations with similar characteristics. In recent decades, small ruminants (sheep and goat) have been widely used as animal models for various experimental biomedical research projects, in particular in orthopedic studies. In the present study we used six Portuguese Serrana goats (Capra hircus aegagrus), properly identified. We performed bone marrow aspirates and blood samples to these animals, the samples followed for conducting blood counts, smears, cell culture, immunocytochemistry and flow cytometry. For flow cytometry and immunocytochemistry, the following cell surface markers have been used: CD14, CD45 and CD34. The results from the immunocytochemistry confirmed the positive staining of markers used in this study on goat bone marrow cells. The results obtained in flow cytometry of goat bone marrow cells match those reported in literature for humans and sheep, however the interpretation of the final results raised a few reservations and the staining with CD34 could not be validated for five of the animals in study. From this study we conclude that goat could represent a good animal model for bone marrow studies using flow cytometry technique, since there was a good correlation of our results with the results of flow cytometry of human bone marrow. Therefore, it would be interesting to extend the studies on goat bone marrow to increase the knowledge so that in the near future some pathologies can be studied and the results extrapolated to humans.

Dissertação de mestrado em Ecologia
Os invertebrados bentónicos, como os poliquetas, são importantes indicadores de qualidade ambiental sendo também um elo relevante nas cadeias tróficas. A taxonomia, com base nos caracteres morfológicos desta classe é difícil, demorada, e muitas vezes requer um conhecimento especializado que nem sempre está disponível. Este trabalho pretende contribuir para a implementação de uma biblioteca de referência de DNA barcodes (citocromo oxidase I (COI)) de poliquetas de modo a melhorar e facilitar futuras identificações taxonómicas, podendo mais tarde, em conjunto com bibliotecas de outros organismos bentónicos, ser usada em estudos de monitorização, utilizando a sequenciação de segunda geração. Com recurso a DNA barcodes não publicados e gerados por equipas de projectos de investigação LusoMarBoL e BestBarcode, foram compiladas bibliotecas de poliquetas de duas comunidades distintas, nomeadamente de estuários e zonas costeiras de Portugal e do mar profundo da Península Ibérica. Em conjunto com os 26 DNA barcodes de poliquetas de estuários obtidos no âmbito deste estudo, a primeira biblioteca totalizou 31 espécies e 71 sequências, enquanto a segunda englobou 37 espécies e 66 DNA barcodes. Aos alinhamentos das sequências destas duas bibliotecas foram adicionadas sequências homólogas da mesma família ou género disponíveis em bases de dados públicas, por forma a permitir a sua análise conjunta. Os valores médios das divergências intra-específicas e congenéricas do conjunto dos DNA barcodes dos poliquetas de estuários foi de 0,52% (0 a 2,82%) e 20,53% (12,03 a 27,58%) respectivamente, enquanto para os poliquetas do mar profundo foram de 0,61% (0 a 2,63%) e 20,10% (7,36 a 31,77%) respectivamente. Estes valores estão dentro da gama de variação reportada em outros estudos de DNA barcodes de poliquetas. Nas árvores construídas pelo método Neighbour-joining, 79% e 73% das espécies agruparam-se em clados monofiléticos de baixa divergência, no caso dos poliquetas de estuário e do mar profundo, respectivamente. Paralelamente foram detectadas várias incongruências taxonómicas relevantes, bem como divergências intra-específicas relativamente elevadas, evidenciando a necessidade de uma revisão taxonómica em vários taxa.
Marine benthic invertebrates, such as the polychaetes, are important environmental indicators and an important link in the marine trophic chains. The taxonomy based on morphological characteristics for this class is difficult, time consuming and often requires specialized knowledge that is not always available. This work aims to contribute to the implementation of a reference library of DNA barcodes (cytochrome c oxidase (COI)) of polychaetes in order to improve and facilitate future taxonomic identifications, and latter to be used in monitoring studies using the next generation sequencing., together with other benthic organisms libraries. Using the unpublished DNA barcodes, generated by the research teams from the projects LusoMarBoL and BestBarcode, libraries for two distinct polychaete communities were compiled, including estuaries and coastal areas of Portugal and the deep sea of the Iberian Peninsula. Together with the 26 DNA barcodes from estuarine polychaetes obtained in this study, the first library had 31 species and 71 sequences, while the second comprised 37 species and 66 DNA barcodes. Homologous sequences of the same family or genus searched in public databases were added to the sequence alignments of these two libraries, in order to enable their joint analysis. The average values of intraspecific and congeneric divergences for the estuarine polychaetes were 0,52% (0 to 2,82%) and 20,53% (12,03 to 27,58%) respectively, whereas for deep sea polychaetes were 0,61% (0 to 2,63%) and 20,10% (7,36 to 31,77%) respectively. These values are within the range of variation reported in other studies examining DNA barcodes of polychaetes. In the Neighbor-joining trees, 79% and 73% of the species grouped in monophyletic taxonomic congruent clades with low divergence, in the case of estuarine and deep sea polychaetes respectively. Concurrently, were also detected several relevant taxonomic ambiguities, as well as considerable genetic divergence, indicating the need for a taxonomic revision in several of the studied taxa.
Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Projetos FCOMP-01-0124-FEDER-007381 e PEst-C/BIA/UI4050/2011.
FEDER através do Programa Operacional de Factores de Competitividade - COMPETE.
A sequenciação no BIO (Biodiversity Institute of Ontario) foi financiado pelo iBOL (International Barcode of Life Project) através do Canadian Centre for DNA Barcoding, a partir do Ontario Genomics Institute (2008-OGI-ICI-03), Genome Canada, Ontario Ministry of Research and Innovation e pelo Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada.

Dissertação de Mestrado em Engenharia Zootécnica
Os rotíferos são largamente utilizados em aquacultura como o primeiro alimento para os estágios larvares de peixes e crustáceos, em especial devido ao seu tamanho reduzido (130-320 μm), à baixa mobilidade, ao valor energético e à possibilidade de manipular artificialmente o seu valor nutricional. Estes invertebrados alimentam-se por filtração de vários organismos e partículas, tais como microalgas, protozoários, bactérias, matéria orgânica morta e dietas comerciais. Para a sua utilização em aquacultura, a sua principal fonte de alimento são as microalgas. Estas podem ser fornecidas em fresco, concentradas, liofilizadas ou congeladas. Uma outra forma de os alimentar consiste no fornecimento de alimentos comerciais, tais como o Easy DHA Selco®, em cuja composição estão presentes nutrientes essenciais para o crescimento de larvas de peixe marinhos. Este ensaio teve como objetivo verificar em que condições de temperatura (20 e 25°C), salinidade (16 e 32 ppm) e alimento (microalgas Nannochloropsis e Isochrysis e o alimento comercial Easy DHA Selco®) a cultura de rotíferos (Brachionus plicatilis) se desenvolveria de forma mais favorável. Os melhores resultados foram obtidos com a microalga Nannochloropsis (P<0,0001), à temperatura de 25°C (P<0,0001) e com uma salinidade de 16 ppm (P<0,0001). Em termos de interações, ambas as microalgas apresentam melhores crescimentos a uma temperatura 25°C, ao contrário do alimento artificial, que apresentou os melhores resultados de desenvolvimento da cultura a 20°C (P<0,0001). Relativamente ao efeito da salinidade, os melhores resultados foram obtidos a 16 ppm, com ambas as microalgas, enquanto que os piores resultados foram obtidos com o alimento artificial, a qualquer uma das salinidades (P<0,0001). Entre os parâmetros temperatura e salinidade foi também verificada uma interação significativa, na qual o crescimento da população à temperatura de 25°C foi superior à temperatura de 20°C, independentemente da salinidade do meio (P<0,01). Neste ensaio foi possível verificar que o melhor crescimento da cultura de rotíferos foi conseguido com o fornecimento de Nannochloropsis, a uma temperatura de 25°C e salinidade de 16 ppm, sendo que os piores resultados foram observados com a utilização de Easy DHA Selco®, a 25°C e salinidade 16 ppm (P<0,0001).
Rotifers are widely used in aquaculture as the first feed for fish and crustacean larval stages, especially due to their small size (130-320 μm), low mobility, energetic value and the possibility of artificial manipulation of their dietary value. These invertebrates feed by filtration of several organisms and particles, such as microalgae, protozoa, bacteria, dead organic matter and artificial diets. For its use in aquaculture, their main food source is usually microalgae. These can be supplied fresh, concentrated, dried and dried-frozen. Another way of feeding rotifers consists on the supply of artificial diets, such as Easy DHA Selco®, which contains several essential nutrients for the right development of the marine fish larvae. Experiments were conducted in order to evaluate in which conditions of temperature (20 and 25ºC), salinity (16 and 32 ppm) and food (microalgae Nannochloropsis and Isochrysis, and artificial diet Easy DHA Selco®) the culture of rotifers (Brachionus plicatilis) would develop in the most favorable way. The best results were obtained with the microalgae Nannochloropsis (P<0.0001), the temperature of 25ºC (P<0.0001) and with the salinity of 16 ppm (P<0.0001). Regarding the interactions, both microalgae present better growths at 25ºC, contrary to the artificial diet, which presented better results at 20ºC (P<0.0001). Concerning the effect of the salinity, the best results were obtained at 16 ppm for both microalgae, whereas the worst results were seen with the artificial feed, regardless of the salinity (P<0.0001). Between the temperature and the salinity was observed a highly significant interaction also, in which the population growth at 25 ºC was superior to the growth at 20ºC, regardless the salinity of the solution (P<0.01). The results show that the best development of this culture was obtained with the supply of Nannochloropsis at the temperature of 25ºC and 16 ppm of salinity, being that the worst development of this culture was due to the use of Easy DHA Selco® at 25ºC and 16 ppm (P<0.0001).

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias
O cancro é uma doença que afeta milhões de pessoas em todo mundo. De acordo com a Organização Mundial de Saúde uma em cada oito mortes é provocada por cancro. Numa escala global, esta doença provoca mais mortes do que a combinação de doenças como a síndrome de imunodeficiência adquirida, a tuberculose e a malária. O cancro da bexiga é o sétimo tumor mais comum no homem e o segundo quando nos concentramos no trato urogenital, sendo precedido apenas pelo cancro da próstata. Exibe predisposição sexual, sendo o homem cerca de quatro vezes mais afetado do que a mulher. Em termos histológicos, a maioria dos tumores da bexiga são superficiais, limitados à mucosa, submucosa ou lâmina própria. O carcinoma invasivo é menos frequente, no entanto assume uma grande importância clínica, dado o seu difícil tratamento, a elevada possibilidade de metastização e em consequência, ter um prognóstico reservado. O modelo animal de carcinoma invasivo da bexiga induzido pela administração prolongada na água de bebida da N-butil-N-(4-hidroxibutil)nitrosamina (BBN) a murganhos é excelente para a investigação em oncologia urológica, porque permite avaliar a ação de novos agentes terapêuticos ou profiláticos e estudar os mecanismos biopatológicos associados ao crescimento, invasão e metastização dos tumores. Foram objetivos desta tese de doutoramento avaliar o efeito terapêutico de alguns fármacos, isolados ou combinados (gencitabina, sirolimus, everolimus), no modelo invasivo do cancro da bexiga em murganhos; avaliar a ação in vitro do everolimus em linhas celulares humanas de tumores de bexiga (T24; HT1376; 5637); avaliar o stresse oxidativo hepático e mitocondrial induzido pela BBN e ainda estudar a expressão da caderina E e da β catenina nas lesões uroteliais induzidas pela BBN. Para a realização da componente prática foram utilizados 106 murganhos macho da estirpe ICR, 86 dos quais foram expostos à BBN durante 12 semanas. Destes, 60 foram divididos em 4 grupos de 15 animais, para avaliar o efeito terapêutico dos fármacos acima mencionados. Os restantes 26 animais fizeram parte do grupo controlo. A gencitabina e o sirolimus foram administrados por via intraperitoneal e o everolimus foi administrado por via oral. Todos os animais foram sacrificados no final do trabalho experimental e submetidos a necrópsia. Os resultados obtidos permitem-nos afirmar que o uso isolado da gencitabina e do sirolimus diminui a incidência das lesões uroteliais quimicamente induzidas, no entanto, a sua associação, no mesmo modelo, não teve qualquer efeito. O everolimus não teve efeito significativo na diminuição da incidência das lesões uroteliais quimicamente induzidas pela BBN. Os resultados do ensaio in vitro obtidos com o everolimus foram variáveis, havendo resultados promissores apenas na linha celular 5637. No que diz respeito às alterações hepáticas induzidas pela BBN podemos afirmar que histologicamente não foram observadas lesões, no entanto, foi detetado um aumento do stresse oxidativo mitocondrial que poderá favorecer a hepatotoxicidade quando a BBN é associada a fármacos sujeitos a biotransformação hepática. Neste modelo, as informações relativas à expressividade da caderina E e β catenina, moléculas de adesão celular, são escassas. Nesse sentido, ambas as moléculas foram avaliadas em cortes histológicos do urotélio normal, de lesões préneoplásicas e neoplásicas. Na hiperplasia simples e nodular, predominou o padrão identificado no urotélio normal (marcação membranar). Nas lesões displásicas predominou o padrão citoplasmático. Nos carcinomas invasivos observámos um padrão heterogéneo, com a coexistência de marcação citoplasmática e nuclear e por vezes também membranar. A análise da expressividade destas moléculas permitiunos concluir que, à semelhança do que está descrito no Homem, também em murganhos estas podem ser consideradas como indicadoras do grau de agressividade e da evolução do tumor.
Cancer is a devastating disease affecting millions of people all over the world. According with World Health Association, worldwide one in eight deaths is due to cancer. In a global scale, cancer causes more deaths than acquired immunodeficiency syndrome, tuberculosis, and malaria combined. Bladder cancer is the seventh most common tumour in man, and the second most common tumour of the genitourinary system, being preceded only for prostate cancer. It has sexual predisposition, with males being up to four times more affected than females. Histologically, the majority of bladder tumours are superficial, confined to mucosa, submucosa or lamina propria. Invasive carcinoma is less frequent, however it assumes great clinical importance, since it is difficult to treat, metastasis is a strong possibility and the prognosis is less favourable. Mice model of invasive bladder cancer, induced by oral administration of Nbutyl- N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine (BBN) in drinking water, is a good and widely used research model for urologic oncology. It allows the evaluation of new therapeutic or prophylactic agents and also to study the basic mechanisms of tumour growth, invasion and metastasis. In this thesis we evaluate the therapeutic efficiency of several drugs (gemcitabine, sirolimus, everolimus) alone or in combination in chemically induced bladder cancer in male mice. Everolimus was also analysed in vitro, in three different bladder cancer cell lines, two invasive (T24; HT1376) and one superficial (5637). Hepatic and mitochondrial oxidative stress induced by BBN and the analysis of Ecadherin and β-catenin were also executed. 106 male ICR mice were used during experimental work. 86 of them were exposed to BBN for 12 weeks, and from these, 60 were divided into four groups of 15 animals each, to analyse the therapeutic effects of drugs. The remaining 26 mice were used as control animals. Gemcitabine and sirolimus were administered by intraperitoneal route. Everolimus was administered by gavage. All animals were euthanized at the end of the experimental work and submitted to a complete necropsy. According to our results, gemcitabine and sirolimus used as single agents, reduce the incidence of chemically induced urothelial lesions in mice. However, their combination did not add any improvement regarding urothelial incidence. Everolimus showed no significant effect in decreasing urothelial lesions incidence. In vitro, its effect on proliferation and apoptosis across different bladder cancer cell lines was heterogeneous. Promissory results were seen only in cell-line 5637. BBN is metabolized mainly in liver. Regarding hepatic changes induced by BBN, we can say that liver histological evaluation did not show any microscopic changes compatible with liver stress, however mitochondrial oxidative stress was detected. This can lead to hepatotoxicity, when BBN is combined with drugs with liver biotransformation. E-cadherin and β–catenin are adhesion molecules that were evaluated in control mice and in mice exposed to BBN. In simple and nodular hyperplasia, membrane staining was dominant. In dysplasia, cytoplasmic pattern was prevalent and in invasive carcinomas a heterogeneous staining was observed (cytoplasmic, nuclear and membrane staining). Like in man, also in mice these adhesion molecules can be considered as indicators of tumour aggressiveness and evolution.

В роботі проаналізовано проблему дезінфекції та консервації питної води та встановлено, що застосування методу іонізації води сріблом є оптимальним способом вирішення цієї проблеми. Проаналізовано принцип роботи та основні параметри промислових іонізаторів, які є присутні на ринку медичної техніки та розроблено структуру іонізатора, запропоновано шляхи його модернізації та розроблено конструкцію модернізованого іонізатора води сріблом, який є значно меншим за аналоги і володіє більшою кількістю функцій із можливістю налаштування нових шляхом перепрограмування використаного в основі іонізатора мікроконтролера. Розроблено конструкцію модернізованого іонізатора води сріблом
The paper analyzes the problem of disinfection and conservation of drinking water and found that the use of the method of ionization of water with silver is the best way to solve this problem. The principle of operation and basic parameters of industrial ionizers present in the market of medical equipment are analyzed and the structure of the ionizer is developed, the ways of its modernization are offered and the design of the modernized water ionizer with silver is developed, which is much smaller than analogues and has more functions with the ability to configure new ones by reprogramming the microcontroller used in the ionizer. The design of an modernized silver ionizer of water has been developed

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias
O periodonto é o órgão que envolve e sustenta o dente, sendo constituído pelo osso alveolar que forma o alvéolo dentário, o cemento que envolve a raiz do dente, o ligamento periodontal que estabelece a ligação entre os dois tecidos anteriores formando uma articulação e a gengiva. A periodontite é uma doença inflamatória de elevada prevalência em cães e seres humanos e que, quando não tratada, pode conduzir à esfoliação dentária e colocar em risco a vida do doente devido às manifestações sistémicas decorrentes pela dispersão sanguínea de mediadores inflamatórios e microrganismos patogénicos. Os tratamentos que atualmente se usam para tratar esta patologia revelam-se muitas vezes ineficazes. A Engenharia de Tecidos emergiu, recentemente, como uma potencial terapia alternativa. Esta abordagem consiste no fornecimento de um biomaterial de suporte semeado com células estaminais que visa a regeneração ad integrum da arquitetura e da função biológica do tecido afetado. As células estaminais mesenquimatosas de origem oral e dentária têm a capacidade de regenerar os tecidos periodontais. No entanto, as células provenientes destes locais pressupõem uma morbilidade significativa associada ao local da colheita e possuem um baixo rendimento celular em comparação com fontes não-orais, como por exemplo o tecido adiposo. As células estaminais derivadas do tecido adiposo (ASCs) possuem um grande potencial de aplicação em terapias celulares devido à sua facilidade de colheita e baixa morbidade associada, ao alto rendimento de células isoladas e à capacidade demonstrada para se diferenciarem em inúmeras linhagens celulares. O principal objetivo da presente Tese consistiu no desenvolvimento de uma nova abordagem de Engenharia de Tecidos para o tratamento de defeitos periodontais com base numa matriz biodegradável combinada com ASCs. Partindo do conhecimento de que o cão é o modelo animal mais relevante para estudar a doença periodontal em humanos, pretende validar-se esta estratégia de Engenharia de Tecidos em modelo canino antes da aplicação translacional para a Medicina Humana, sem descuidar nunca que esta doença assume também grande importância na Medicina Veterinária. Tendo isto em consideração, o trabalho desenvolvido nesta Tese teve como principais objetivos:  Otimizar a colheita e o isolamento de ASCs caninas (cASCs) provenientes de diferentes regiões anatómicas e caracterizar a sua estaminalidade e o seu potencial osteogénico em diferentes passagens;  Avaliar a resposta à implantação de cASCs em modelo subcutâneo de murganho saudável;  Desenvolver e caracterizar um material de suporte (scaffold) biodegradável de dupla camada que vise a regeneração de defeitos periodontais;  Avaliar o potencial in vitro do scaffold de dupla camada desenvolvido para uso em Engenharia de Tecidos através da sua cultura com cASCs;  Avaliar a funcionalidade in vivo do scaffold para a regeneração óssea, utilizando um modelo de defeito mandibular em rato. A fim de alcançar os objetivos propostos, numa primeira etapa, as amostras de tecido adiposo canino foram colhidas a partir de duas localizações anatómicas diferentes, a saber, tecido subcutâneo e tecido omental, e o isolamento das cASCs foi posteriormente otimizado. A estaminalidade destas células e o potencial de diferenciação osteogénica foram analisadas ao longo das diferentes passagens através de RT-PCR em tempo real e histologia. Posteriormente, as mesmas cASCs foram xenotransplantadas em murganho, a fim de avaliar a resposta xenogénica do hospedeiro contra as mesmas. Concomitantemente, desenvolveu-se um scaffold composto por uma mistura de amido e poli-ε-caprolactona e compreendendo duas camadas: uma malha tridimensional de fibras (“fiber mesh”) funcionalizadas com grupos silanol para promover a osteogénese ao nível do osso alveolar, e uma membrana obtida por evaporação de solvente com o intuito de atuar como barreira contra a migração de epitélio gengival para o interior do defeito periodontal. Os scaffolds obtidos foram extensivamente caracterizados quanto às suas propriedades mecânicas, ao comportamento de degradação e à eficácia da técnica de funcionalização. De seguida, os scaffolds foram semeados com cASCs a fim de avaliar a funcionalidade in vitro das construções obtidas. Como forma de avaliar a capacidade dos scaffolds desenvolvidos para promover a regeneração óssea, estes foram implantados num defeito circular de tamanho crítico induzido na mandíbula do rato, e a formação de novo osso foi determinada após oito semanas de implantação. Em geral, a estaminalidade e o potencial de diferenciação osteogénica das cASCs decresceu ao longo de passagens. Além disso, demonstrou-se também que a origem anatómica do tecido adiposo tem um efeito significativo nas duas características analisadas. Após a injeção de cASCs num hospedeiro xenogénico (murganho), não foi observada nenhuma resposta inflamatória local exuberante contra as mesmas. A caracterização físico-química do scaffold desenvolvido demostrou que esta matriz apresenta uma morfologia, composição da superfície, comportamento de degradação e propriedades mecânicas adequadas para auxiliar a regeneração periodontal. Os estudos biológicos com cASCs revelaram o potencial que ambas as camadas têm de permitir a adesão e proliferação celular, bem como de promover a diferenciação osteogénica na malha funcionalizada. Nos defeitos mandibulares experimentais, o scaffold funcionalizado com grupos silanol induziu uma maior formação de osso novo em comparação com a membrana comercial de colagénio e com os defeitos vazios. Além disso, a face composta pela membrana evitou o crescimento do tecido epitelial e conjuntivo para o interior do defeito, o qual é um dos requisitos para o sucesso da regeneração guiada de tecidos. Em resumo, este trabalho demonstrou que o tecido adiposo canino fornece uma fonte alternativa de células estaminais com capacidade de diferenciação osteogénica e que estas não induzem uma resposta inflamatória exuberante no hospedeiro xenogénico. Estes resultados, juntamente com o potencial observado do scaffold desenvolvido para acomodar a proliferação e diferenciação das cASCs cultivadas e para promover a regeneração de osso in vivo, permite propor esta construção como uma alternativa às técnicas atualmente utilizadas na regeneração periodontal, tanto no homem como no cão.
Periodontium is the organ which involves and sustains the tooth and it is constituted by the alveolar bone which forms the dental alveolus, the cementum which surrounds the tooth root, the periodontal ligament, which connects them and form a joint, and the gingiva. Periodontitis is an inflammatory pathology highly prevalent in both dogs and humans that, when not treated, can lead to tooth exfoliation and also to life threatening systemic implications due to the blood dispersion of inflammatory mediators and pathogenic microorganisms. The routine clinical therapies currently used to treat periodontal defects are often ineffective. Tissue Engineering has emerged as a valuable alternative approach aiming to regenerate ad integrum the architecture and the biological function of the damaged tissue by providing the repair site with a suitable supportive biomaterial seeded with stem cells. Mesenchymal stem cells from oral and dental origin have the ability to regenerate the periodontium; however, harvesting cells from these sites implies significant local tissue morbidity and low cell yield, as compared to non-oral sources, such as the adipose tissue. Adipose-derived stem cells (ASCs) hold a great potential in cell based therapies for their easiness of harvesting with low morbidity, generating high yields of cells with capacity to differentiate into several lineages. The main goal of this Thesis was to develop a new Tissue Engineering approach for the treatment of periodontal defects, based on an innovative biodegradable supportive matrix combined with ASCs. As the dog is the most relevant animal model to study human periodontal disease and, simultaneously, an important subject in Veterinary Medicine, we envisioned to validate this Tissue Engineering strategy in a canine model prior to the translation of this strategy for human application. With this in mind, the work aimed to achieve the following distinct objectives:  Optimize harvesting and isolation of canine ASCs (cASCs) from different anatomical regions and characterize their stemness and osteogenic potential at different passages;  Evaluate the response to the implantation of cASCs in a healthy mice subcutaneous model;  Develop and characterize a double layer biodegradable scaffold meeting the requirements to achieve different functionalities, targeting regeneration of periodontal defects;  Evaluate the potential of the developed double layer scaffold for Tissue Engineering by culturing it with cASCs,  Assess the in vivo functionality of the scaffold for bone regeneration, using a rat mandibular defect model. In order to achieve the proposed objectives, in a first stage, canine adipose tissue samples were harvested from two different anatomical sites, namely subcutaneous and omental adipose tissue, and the isolation of cASCs was optimized. The stemness and the osteogenic differentiation potential of these cells were analyzed along passages using real time RT-PCR and staining procedures. Subsequently, the same stem cells were xenotransplanted (into a mouse model) in order to evaluate the response of the xenogenic host against the cASCs. Concomitantly, a double layer scaffold made of a blend of starch and poly (ε-caprolactone) was designed, comprising a 3D fiber mesh functionalized with silanol groups to promote osteogenesis and a solvent casting membrane aiming to act as a barrier against the migration of gingival epithelium into the periodontal defect. The obtained scaffolds were extensively characterized regarding their mechanical properties, degradation behaviour and effectiveness of the functionalization. Ultimately, the scaffolds were seeded/cultured with cASCs to assess the in vitro functionality of the obtained constructs. Finally, to assess the ability of the developed scaffold to promote bone regeneration, these were implanted in a circular critical size defected induced in rat mandible, and the formation of new bone was quantified after 8 weeks of implantation. In general, the stemness and osteogenic differentiation potential of the cASCs was found to decrease along increasing passages. Additionally, it was shown that the anatomical origin of the adipose tissue has a significant effect in the osteogenic differentiation ability of these cells. After the injection of cASCs in a xenogenic host (mouse), it was proved that no significant local immunogenic response was detected against them. The physicochemical characterization of the newly developed double layer scaffold showed that this matrix presents a morphology, surface composition, degradation behaviour and mechanical properties suitable for assisting periodontal regeneration. The biological studies with cASCs revealed the potential of both layers to allow cellular adhesion and proliferation, and also to promote the osteogenic differentiation on the functionalized fiber mesh. In the induced mandibular defect, the functionalized scaffold with silanol groups was shown to enhance higher new bone formation in comparison to a collagen commercial membrane and to empty defects. Moreover, the membrane layer was observed to avoid the epithelial and connective tissue ingrowth, which is one of the main requirements for guided tissue regeneration. In summary, this work demonstrated that the canine adipose tissue provides an alternative source of stem cells with the ability to differentiate into different cellular lineages and which do not induce an in vivo inflammatory response in the xenogeneic host. These findings together with the observed potential of the developed scaffold to accommodate the proliferation and differentiation of the cultured cASCs and to enhance in vivo bone regeneration allows to propose this tissue-engineered matrix for periodontal regeneration as an alternative to the techniques currently used in the dentistry field, both in human and in veterinary medical practice.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, Biomedicina
O cancro da bexiga é um problema de saúde pública mundial extremamente relevante. Apesar dos avanços registados no seu tratamento, as taxas de morbilidade e mortalidade continuam elevadas, tornando premente a necessidade de novas abordagens terapêuticas. O mammalian target of rapamycin (mTOR) é considerado uma nova e promissora terapia alvo essencialmente devido à sua interferência no desenvolvimento do cancro. O objetivo deste estudo foi analisar a atividade antineoplásica de três inibidores do mTOR (sirolimus, everolimus e temsirolimus), assim como a sua capacidade em aumentar a ação da gemcitabina e da cisplatina, em três linhas celulares tumorais da bexiga humana: 5637(não invasiva), T24 e HT1376 (invasivas). Para atingir os objetivos propostos foi fundamental proceder a uma caracterização mais completa destas linhas celulares por citogenética convencional, hibridação in situ fluorescente, hibridação genómica comparativa por array e multiplex ligation-dependent probe amplification. O efeito do fármaco sirolimus foi testado na linha celular T24; o efeito dos fármacos everolimus, temsirolimus, gemcitabina e cisplatina, isolados e combinados, foram avaliados nas três linhas celulares. Após 72 horas de exposição aos fármacos a proliferação celular, a morfologia celular, os danos no DNA, a distribuição das células pelo ciclo celular, a apoptose e a autofagia foram analisados utilizando o 3-(4,5-dimetiltiazol- 2-il)-2,5 difenil-tetrazólio e a expressão do Ki-67, a coloração Leishman, o terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling e a técnica dos cometas, a citometria de fluxo, o M30CytoDEATH anticorpo e a monodansilcadaverina, respetivamente. Além disso, a expressão do mTOR, do AKT e das suas formas fosforiladas foram analisadas por western blot nas três linhas celulares, após o tratamento com o everolimus e o temsirolimus. In vivo as investigações preliminares com everolimus foram realizadas utilizando o modelo de cancro da bexiga de murganho quimicamente induzido pela N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina. As linhas celulares utilizadas neste estudo representam os dois subtipos mais comuns de cancro da bexiga: a linha celular T24 representa um subtipo FGFR3/CCND1, enquanto as linhas celulares 5637 e HT1376 representam o outro subtipo com o perfil mutacional E2F3/RB1. A linha celular 5637 tem um fenótipo menos agressivo enquanto a HT1376 é ilustrativa de um perfil mais invasivo. No que concerne ao efeito dos fármacos testados, o sirolimus foi eficaz em reduzir a proliferação celular da linha T24. O everolimus induziu uma inibição ligeira da proliferação celular apenas na linha 5637, bem como uma moderada indução de apoptose, danos no DNA e acumulação na fase G0/G1 do ciclo celular. No modelo in vivo o everolimus não interferiu no desenvolvimento das lesões uroteliais. O temsirolimus isolado reduziu significativamente a proliferação celular, provocou uma acumulação das células na fase G0/G1 do ciclo celular, aumentou a apoptose e a autofagia. Estes efeitos ocorreram nas três linhas celulares. Não houve diferenças significativas na expressão do mTOR, AKT e nas suas formas fosforiladas em todas as linhas celulares após a exposição ao everolimus e ao temsirolimus. Em relação à associação de fármacos, o everolimus melhorou significativamente os efeitos da gemcitabina e da cisplatina. Nas três linhas a proliferação celular foi reduzida, ocorrendo a paragem do ciclo celular na fase G0/G1 e o aumento da apoptose e danos no DNA. As linhas celulares 5637 e T24 foram as mais sensíveis à combinação do everolimus e da gemcitabina. Por sua vez, no tratamento combinado do everolimus e da cisplatina, as linhas celulares 5637 e a HT1376 apresentaram os melhores resultados. A resposta foi mais evidente na combinação do temsirolimus, quer com a gemcitabina quer com a cisplatina, do que com o temsirolimus isolado. Ocorreu uma menor proliferação celular, uma paragem do ciclo celular na fase G0/G1 mais evidente e um aumento da apoptose e da autofagia. Observou-se um padrão semelhante ao obtido na conjugação da gemcitabina e da cisplatina com o everolimus, sendo a 5637 e a T24 as linhas celulares mais sensíveis à conjugação do temsirolimus com gemcitabina e as linhas 5637 e HT1376 as que melhor responderam à conjugação do temsirolimus com cisplatina. Verificou-se que a linha celular não invasiva 5637 foi sempre a mais sensível a todos os fármacos. Observou-se igualmente que as combinações com a cisplatina (everolimus mais cisplatina ou temsirolimus mais cisplatina) foram sempre mais eficazes. Em conclusão, demonstrou-se que as linhas celulares utilizadas neste estudo são representativas do cancro da bexiga humana, sendo, portanto, uma ferramenta importante e muito útil na investigação terapêutica destes tumores. O uso individual dos inibidores do mTOR revelou-se pouco eficaz, particularmente nas linhas celulares invasivas T24 e HT1376. Os resultados obtidos na linha não invasiva 5637 sugerem o everolimus e o temsirolimus como terapias alternativas a estudar, em particular nos tumores não invasivos que não respondem às terapêuticas disponíveis. Quando usados em combinação com os fármacos atualmente utilizados (cisplatina e gemcitabina) no tratamento do carcinoma da bexiga, o resultado obtido nas três linhas tumorais foi nitidamente superior. O presente estudo mostra que, dependendo do perfil genético do tumor, as conjugações dos inibidores do mTOR (everolimus e temsirolimus) com a gemcitabina e com a cisplatina podem no futuro ser potenciais regimes terapêuticos no carcinoma da bexiga.
Urinary bladder cancer is a relevant worldwide public health problem. Despite treatment advances, morbidity and mortality rates remain high and new approaches are needed. The mammalian target of rapamycin (mTOR) is considered a new promising targeted therapy primarily due to its interference in the development of cancer. The aim of this study was to analyze the antineoplastic effect of three mTOR inhibitors (sirolimus, everolimus and temsirolimus), and their ability to enhance gemcitabine and cisplatin activity, on three human urinary bladder cancer cell lines: 5637 (non-muscle-invasive), T24 and HT1376 (muscle-invasive). To achieve the proposed objectives it was essential to further characterize these cell lines by conventional cytogenetic, fluorescence in situ hybridization, array comparative genomic hybridization and multiplex ligation-dependent probe amplification. The effect of the sirolimus drug was tested on the T24 cell line; the effect of the everolimus, temsirolimus, gemcitabine and cisplatin drugs, alone and in combination, were evaluated in all three cell lines. After 72 hours of drug exposure cell proliferation, cell morphology, DNA damage, cell cycle distribution, apoptosis and autophagy were analysed using the 3-[4,5- dimethyl-2-thiazolyl]-2,5-diphenyltetrazolium and Ki-67 expression, Leishman staining, terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling and comet assay, flow cytometry, M30CytoDEATH antibody and monodansylcadaverine, respectively. Furthermore, the expression of mTOR, AKT and their phosphorylated forms were investigated by western blot on the three cell lines, after everolimus and temsirolimus treatment. In vivo, preliminary investigations with everolimus were also performed using the urinary bladder mouse cancer of chemically induced by N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine model. We found that the cell lines used in this study cover the two most common subtypes of urinary bladder cancer: the T24 cell line represents a FGFR3/CCND1 subtype, while the 5637 and the HT1376 represents the E2F3/RB1 pathway mutational profile. The 5637 cell line is representative of a less aggressive phenotype, whereas the HT1376 is illustrative of a more invasive profile. Regarding the effect of the drugs tested, sirolimus was effective in reducing cell proliferation on the T24 cell line. Everolimus induced a slight inhibition of cell proliferation only on the 5637 cell line, and a moderate induction of apoptosis, DNA damage and accumulation in the G0/G1 phase of the cell cycle. In in vivo experiment everolimus did not interfered with the development of urothelial lesions. Temsirolimus, isolated, induced a significant decrease of cell proliferation, caused an accumulation of cells in G0/G1 phase, increased apoptosis and autophagy. These effects occurred on the three cell lines. No significant differences in the expression of mTOR, AKT and their phosphorylated forms were found in all cell lines after everolimus and temsirolimus exposure. Regarding the association of drugs, everolimus significantly improved the effects of gemcitabine and cisplatin: in all cell lines a reduced cell proliferation was observed, with arrest of cell cycle at G0/G1 phase with increased apoptosis and DNA damage. The 5637 and the T24 cell lines were more sensitive to the combination of everolimus and gemcitabine. In turn, for the combined treatment of cisplatin and everolimus, the 5637 and the HT1376 cell lines showed the best results. A more evident response was obtained with temsirolimus in combination with either gemcitabine or cisplatin than with temsirolimus isolated. There was less cell proliferation, a more apparent cell cycle arrest in G0/G1 phase and an increase in apoptosis and autophagy. We observed a pattern similar to that obtained on the combination of everolimus with gemcitabine and cisplatin: the 5637 and the T24 cell lines were more sensitive to the combination temsirolimus with gemcitabine and the cell lines 5637 and HT1376 presented a better response to temsirolimus combination with cisplatin. It was found that the non-muscle-invasive 5637 cell line was always the most susceptible to all drugs. Furthermore, it was also observed that the combined treatments that used cisplatin (everolimus plus cisplatin, or temsirolimus plus cisplatin), were always more effective. In conclusion, it was demonstrated that the cell lines used in this study are representative of human bladder cancer and are therefore an important and useful tool in the research therapy of such tumours. On these cell lines, the mTOR inhibitors used isolated were not highly effective drugs, especially on the muscle-invasive T24 and HT1376. The results obtained on the 5637 non-muscle-invasive cell line suggest everolimus and temsirolimus as alternative therapies to study, particularly in non-invasive tumours that do not respond to available therapies. When used in combination with drugs currently used (cisplatin and gemcitabine) on the treatment of urinary bladder cancer, the results obtained on the three tumour cell lines were clearly superior. The present study shows that, depending on the tumour’s genetic profile, the combinations of mTOR inhibitors (everolimus and temsirolimus) with gemcitabine and cisplatin may be in the future potential therapeutic regimens in bladder carcinoma.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, Ramo Biomedicina
O carcinoma da bexiga constitui uma doença frequente com elevado impacto sócioeconómico em todo o mundo, pelo que o uso de modelos pré-clínicos é fundamental na pesquisa de novos tratamentos mais eficazes. Através da utilização de três linhas celulares comerciais humanas (T24, 5637, HT1376) de carcinoma da bexiga e do modelo animal de indução química de lesões uroteliais com recurso à exposição de murganhos ICR à N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (BBN), foram estabelecidos como objetivos para esta tese: estudar os efeitos in vitro de várias concentrações de cisplatina, malato de sunitinibe e meloxicam; analisar in vitro os efeitos da associação de várias concentrações de malato de sunitinibe com a cisplatina e com o meloxicam; estudar in vivo os efeitos do meloxicam e da infusão do chá verde nas lesões uroteliais do murganho induzidos pela administração da BBN; caracterizar citogeneticamente um carcinoma papilar urotelial de baixo grau de murganho induzido pela BBN. As linhas celulares T24, 5637 e HT1376 foram expostas à cisplatina, ao malato de sunitinibe e ao meloxicam, como drogas isoladas e em diferentes combinações. A proliferação celular, o ciclo celular, a apoptose, os danos no DNA e a autofagia foram avaliados pelos seguintes métodos: 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio, citometria de fluxo, anticorpo M30 CytoDEATH, ensaio do cometa, e colorações monodansilcadaverina e laranja de acridina. Para o estudo da associação de dois fármacos foi calculado o índice de combinação com recurso ao método de Chou e Talalay. No estudo in vivo para a avaliação do efeito do meloxicam, murganhos machos foram expostos à BBN na água de bebida durante 12 semanas, sendo depois administrado durante 6 semanas por via intraperitoneal este fármaco. As lesões uroteliais foram avaliadas pela coloração convencional de hematoxilina e eosina (H&E). Foi estudado o efeito do meloxicam sobre a função hepática e renal. No estudo in vivo do efeito da exposição contínua ao chá verde durante 20 semanas, a administração da BBN foi feita por entubação gástrica durante 10 semanas, sendo caracterizadas, após sacrifício dos animais, as lesões uroteliais por H&E. A constituição cromossómica do carcinoma papilar urotelial de baixo grau do murganho, foi analisada por citogenética convencional e por hibridização in situ por fluorescência. Isoladamente, a exposição aos três fármacos diminuiu significativamente a proliferação celular das linhas celulares de carcinoma da bexiga (p<0.05). A cisplatina induziu a acumulação de células na fase S do ciclo celular, em contrapartida o malato de sunitinibe e o meloxicam induziram a acumulação de células na fase G0/G1. A percentagem de células na fracção sub-G0/G1 aumentou após a exposição das mesmas aos três fármacos. O meloxicam provocou um ligeiro, mas significativo, aumento da apoptose nas linhas celulares T24 (p=0.006) e 5637 (p<0.001). O malato de sunitinibe e o meloxicam induziram danos no DNA quando aplicados sobre as linhas celulares em separado. Os três fármacos isoladamente induziram autofagia. Após a exposição conjunta à cisplatina e ao malato de sunitinibe, assim como do malato de sunitinibe e ao meloxicam, observamos um índice de combinação inferior a 1 nas células T24, 5637 e HT1376, o que se traduz num efeito sinérgico; identificamos também uma redução na proliferação celular, um aumento da apoptose, danos no DNA e autofagia. In vivo, a incidência das lesões pré-neoplásicas induzidas pela BBN não foi afetada pelo tratamento com o meloxicam. No entanto, apesar de não ser estatisticamente significativo, o desenvolvimento de lesões uroteliais de características malignas foi menor nos animais tratados com o meloxicam, sem alterações significativas dos parâmetros renais e hepáticos. No estudo do chá verde, os animais expostos à BBN e ao chá verde não desenvolveram lesões neoplásicas. A análise citogenética convencional e molecular do carcinoma papilar urotelial de baixo grau do murganho revelou a presença de células normais e de células tetraplóides. Em 42% das células tetraplóides, foi detetada uma translocação recíproca envolvendo os cromossomas 4 e 14 (onde estão localizados os genes humanos CDKN2A e RB1, respetivamente). No Homem, estes genes estão localizados nos cromossomas 9 e 13, os quais estão associados ao carcinoma da bexiga.
Urinary bladder carcinoma is a public health issue around the world. The use of preclinical models of urinary bladder carcinoma is an important tool in the search for new and more efficient treatments. Using three human urinary bladder-cancer cell lines and the mouse model of urinary bladder tumours chemically induced by N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN), this thesis had as purposes: to evaluate the in vitro effects of cisplatin, sunitinib malate and meloxicam, as single drugs; to evaluate the ability of sunitinib malate to potentiate cisplatin effect and to evaluate the ability of meloxicam to enhance the sunitinib malate activity; to determine the in vivo effects of meloxicam and green tea infusion, as well as to characterize cytogenetically a mouse low-grade papillary urothelial carcinoma induced by BBN. T24, 5637 and HT1376 cell lines were exposed to cisplatin, sunitinib malate and meloxicam as single drugs and in different combinations. Cell proliferation, cell cycle, apoptosis, DNA damage and autophagy were assessed by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide, flow cytometry, M30 CytoDEATH antibody, comet assay, monodansylcadaverine and acridine orange staining. In the combined approaches, the combination index was calculated based on the Chou and Talalay method. In in vivo studies and in order to evaluate the effects of meloxicam, male mice were exposed to BBN in drinking water, over the course of 12 weeks. Meloxicam was administrated by intraperitoneal route and for 6 consecutively weeks. Tumour development was assessed by haematoxylin and eosin staining (H&E). Renal and hepatic functions were also analyzed. To determine the effects of green tea on male and female mice urinary bladder lesions, BBN was administrated by oral gavage during 10 weeks and green tea was provided ad libitum, over the course of 20 weeks. Urinary bladder lesions were analyzed by H&E staining. The chromosomal constitution of the mouse low-grade papillary urothelial carcinoma was analyzed by conventional cytogenetics and fluorescent in situ hybridization. In isolation, the three drugs decreased the cell proliferation (p<0.05) of urinary bladdercancer cell lines. Cisplatin induced a cell cycle arrest in early S phase, while sunitinib malate and meloxicam induced a cell cycle arrest in G0/G1 phase. The percentage of cells in the sub- G0/G1 fraction increased after treatment with the three drugs. Meloxicam showed a slight, but significant, increase of apoptosis on T24 (p=0.006) and 5637 (p<0.001) cell lines. DNA damage was also induced by sunitinib malate and meloxicam used as single drugs. Autophagy was detected after treatment with the three drugs in isolation. Concerning the simultaneous exposure of cisplatin and sunitinib malate, as well as sunitinib malate and meloxicam, a synergistic effect was observed, with a combination index less than 1 in T24, 5637 and HT1376 cells; we also observed an improved decrease cell proliferation, increase apoptosis, DNA damage and autophagy. In vivo, the incidence of pre-neoplastic lesions induced by BBN was not affected by meloxicam treatment. However, although not statistically significant, the development of neoplastic lesions was inhibited by meloxicam treatment, without significant alterations of renal and hepatic parameters. In the green tea study, animals exposed to BBN and green tea did not develop urinary bladder neoplastic lesions. The conventional and molecular cytogenetic analysis of the mouse low-grade papillary urothelial carcinoma revealed the presence of normal and tetraploid cells. In 42% of the tetraploid cells, a reciprocal translocation involving chromosomes 4 and 14 (where are located the CDKN2A and the RB1 human genes, respectively) was detected. In humans, these genes map to chromosomes 9 and 13, which are associated with urinary bladder cancer.

Dissertação de mestrado em Biomedical Engineering
Monoclonal antibodies (mAbs), with their unique high specificity, are the most successful product of biopharmaceutical industry, with application in a number of diseases. Due to the high doses typically required, the industry is constantly pressured to develop processes of production that obtain high product yields at reduced costs. Many progresses have been made in this field, mainly due to the emergence of mammalian cell culture technology, and to developments on culture media, production systems, monitoring and scale-up techniques. Currently, the processes of mAb-production mostly rely on suspended mammalian cell culture under fully-defined conditions. These defined conditions are required by the regulatory agencies due to safety concerns over the presence of animal-components (e.g. serum) which may transmit diseases to humans. Furthermore, the preference for suspension over adherent cultures is mostly related to a higher surface-to-volume ratio that improves cell and product yields. However, alternative systems for highyield adherent cultures are now available, such as the microcarrier technology that allows cell growth in small carriers kept in suspension by gentle rocking. These systems can be advantageous by protecting cells from the shear-stress caused by rocking, a limiting factor in suspended cultures. Although different approaches are available for mammalian cell culture in production systems, there are many issues that still need to be addressed to reach an optimal process of production. In this context, the main goal of the present thesis was to increase the current knowhow about the application of less-explored technologies for mAb production. For this purpose, a mAb-producing Chinese hamster ovary cell line (CHO-K1) was used, and in a first stage adapted to grow in serum-free conditions to evaluate the impact on mAb production. The adaptation was performed using a gradual methodology and proved to be time-consuming (280 days), particularly at the stage of 0.31 % serum, due to a shift of cell growth from adherent to suspended. Also at this stage, major differences were obtained among the different combinations of supplements (trace elements) tested to support cells during adaptation. Only one of five combinations was successful, proving that the selection of supplement combination is critical. Additionally, this study has shown the importance of avoiding culture procedures that are too aggressive for cells during adaptation (e.g. centrifugation, trypsinization). Concerning mAb production (assessed by enzyme-linked immunosorbent assay), the adaptation to serum-free medium was favorable, showing 2-fold improvement over serum-supplemented culture, due to the shift from the common DMEM medium to the chemically-defined EX-CELL CHO DHFR- medium. Indeed, media selection is crucial for the success of production, so another aim of this work was to compare seven serum-free media for CHO-K1 cell growth (assessed by cell counting) and mAb production. Concerning both parameters, EX-CELL CHO DHFR- and CDM4CHO were the best media, further evidencing a tendency to improve performances over time, which favors their use in extended processes of production. This thesis also explored microcarrier technology for mAb production using adherent cells. Thus, two types of microcarriers were evaluated in different culture conditions, both providing productions superior to typical adherent and suspended cultures, particularly the microporous Cytodex 3. This carrier had cell proliferation, mAb production (2-fold), and culture longevity higher than the macroporous CultiSpher-S. The culture parameters divergently affected the microcarriers, with the most critical being rocking mechanism for Cytodex 3 and cell inoculum for CultiSpher-S. The viability of using CultiSpher-S for culturing suspended mAb-producing CHO-K1 cells in serum-free medium was also assessed and compared to common suspension cultures. The porous structure of these carriers allows the entrapment of the suspended cells and provides a potential advantage over suspension cultures by protecting cells from the shear stresses of rocking. The microcarrier culture had mAb productions similar to suspension cultures, but with a tendency to improve over time, being a good alternative for extended processes. Additionally, it was shown that the use of rocking significantly reduces mAb production, particularly using the CDM4CHO medium, which benefited by microcarrier culturing due to the protection conferred against shear stress. In opposition, the EX-CELL CHO DHFR- medium favored cell growth in common suspension cultures. In the context of shear stress, the disposable Wave bioreactor has emerged for mammalian cell culture performed under low shear conditions due to an innovative mechanism of rocking based on an undulation movement. However, mixing and flow inside this reactor still need to be characterized, motivating a study of residence time distribution under the flow conditions applied in mammalian cell culture. The Wave behavior deviated from ideal models, with no correlation to the rocking mechanism, suggesting the need to develop new models to describe its performance. In summary, the present thesis compiles important data that increase the know-how about different technologies for mAb production, contributing to the evolution into a more sustained and structured optimization that will replace the current empirical and trial-and-error practices.
Os anticorpos monoclonais (AcMs), com a sua elevada especificidade, são o produto de maior sucesso da indústria biofarmacêutica. As elevadas doses exigidas levam a uma constante pressão para desenvolver processos de produção com rendimentos elevados, a custos reduzidos. Neste sentido, têm-se observado avanços na tecnologia de células animais, desenvolvimento de meios de cultura, sistemas de produção e técnicas de monitorização e aumento de escala. Atualmente, os processos de produção de AcM baseiam-se na cultura de células animais em suspensão, sob condições definidas, como exigido pelos órgãos reguladores devido a preocupações de segurança sobre a presença de componentes de origem animal que podem transmitir doenças aos humanos. Já a preferência pela cultura em suspensão sobre a aderente deve-se à maior relação superfície-volume que permite obter maior concentração celular e de produto. No entanto, já estão disponíveis sistemas alternativos que permitem a cultura aderente com elevado rendimento, tal como a tecnologia de suportes microporosos que possibilita o crescimento de células em pequenos suportes mantidos em suspensão através de agitação suave. Estes sistemas têm a vantagem de proteger as células das possíveis tensões de corte provocadas pela agitação, fator limitante da cultura em suspensão. Embora estejam disponíveis diversos sistemas produtivos para cultura de células animais, existem muitas questões que ainda precisam de ser abordadas a fim de se atingir um processo de produção ótimo. Neste sentido, a presente tese teve como principal objetivo melhorar o atual conhecimento sobre a aplicação de tecnologias menos exploradas para a produção de AcM. Para este propósito, células do ovário de hamster chinês (CHO-K1) produtoras de AcM foram adaptadas a crescimento em meio sem soro, avaliando-se o impacto deste processo na produção de AcM. A adaptação foi realizada gradualmente, provando ser morosa (280 dias), especialmente na fase de 0,31 % soro, devido à alteração do crescimento das células do estado aderente para suspensão. Verificou-se ainda a importância de usar suplementos (oligoelementos) adequados no meio de cultura e de evitar procedimentos agressivos para as células (p.e. centrifugação, tripsinização). Relativamente à produção de AcM (avaliada por ensaio imunoenzimático), a adaptação permitiu duplicar a produção na passagem do meio DMEM suplementado com soro para o meio sem soro quimicamente definido EX-CELL CHO DHFR-. A seleção do meio de cultura é crucial num processo produtivo, tendo-se por isso comparado o efeito de sete meios sem soro no crescimento celular (contagem celular em hematocitómetro) e produção de AcM. Os meios EX-CELL CHO DHFR- e CDM4CHO proporcionaram os melhores resultados, com tendência de melhoria ao longo do tempo, sendo favoráveis para processos de produção longos. A tecnologia de suportes microporosos foi também explorada para a produção de AcM com células aderidas, tendo-se avaliado dois tipos de suportes em diferentes condições de cultura. Os suportes microporosos permitiram obter produções superiores às culturas tradicionais aderentes e em suspensão, particularmente com o Cytodex 3 microporoso. Este proporcionou proliferação celular, produção de AcM (2x maior) e longevidade da cultura superiores ao CultiSpher-S. Os resultados obtidos divergem com os parâmetros de cultura, sendo o mecanismo de agitação mais crítico no Cytodex 3 e a concentração de inóculo no CultiSpher-S. A viabilidade do uso de CultiSpher-S na cultura de CHO-K1 em suspensão e meio sem soro foi avaliada e comparada com culturas em suspensão comuns. A estrutura porosa do CultiSpher-S permite o encapsulamento das células em suspensão, podendo protege-las das tensões de corte provocadas pela agitação. Estas culturas permitiram produções de AcM semelhantes às culturas em suspensão comuns, mas com tendência de melhoria ao longo do tempo, tornando-se uma boa alternativa para processos extensos. Verificou-se ainda que a agitação diminuiu significativamente a produção, particularmente nas culturas em CDM4CHO que beneficiaram com o uso dos suportes. Já o meio EX-CELL CHO DHFR- favoreceu o crescimento celular nas culturas em suspensão comuns. No contexto das tensões de corte, o bioreator descartável Wave surgiu com um mecanismo de agitação inovador para a cultura de células animais com tensões reduzidas. No entanto, a mistura e o fluxo no seu interior ainda carecem de caracterização, motivando o estudo da distribuição do tempo de residência com fluxos da cultura de células animais. O desempenho do reator Wave afastou-se dos modelos ideais, sem correlação com o mecanismo de agitação, sugerindo a necessidade de desenvolver novos modelos para descrever o seu comportamento. Em suma, a presente tese compila uma série de dados que aumentam o conhecimento sobre diferentes tecnologias para a produção de AcM, encaminhando para um processo otimizado mais sustentado e estruturado, que irá substituir as atuais práticas empíricas e de tentativa-erro.