Дисертації з теми "-002.77"

Магістерська дисертація викладена на 83 сторінках, літературних джерел 37, серед них 4 іноземних; рис. 2, табл. 11. Актуальність теми. Ревматоїдний артрит – є одним з найпоширеніших запальних хвороб суглобів, що завдає значну як фізичну, психічну та соціально-економічну шкоду хворим. На сьогоднішній день хвороби ревматоїдного походження залишаються найбільш поширеними патологіями в світі, в Україні зокрема. З кожним роком з’являється велика кількість сучасних засобів, які доцільно включати до програми фізичної терапії. Все викладене вище визначає актуальність та необхідність подальшого вивчення данного питання у відновленні пацієнтів при ревматоїдному артриті, що і стало підставою для виконання цієї магістерської дисертації. Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Магістерська дисертація виконана відповідно до наукової тематики кафедри біобезпеки і здоровя людини НТУУ «КПІ ім. Сікорського». Мета роботи: розробити програми фізичної терапії при ревматойдному артриті та оцінити її ефективність. Завдання: за даними спеціальної літератури вивчити сучасний стан і напрямки вдосконалення програми фізичної терапії при ревматойдному артриті; дослідити функціональний стан суглобів; розробити програму фізичної терапії при ревматойдному артриті та перевірити її ефективність. Об’єкт дослідження –хворі на ревматойдний артрит. Предмет дослідження – фізична реабілітація хворих на ревматойдний артрит. Методи дослідження: аналіз спеціальної науково-методичної літератури та інформаційних джерел; клінічні методи дослідження (контент-аналіз історій хвороби, огляд); візуально-аналогова шкала болю (VAS); інструментальні методи дослідження та методи математичної статистики. Наукова новизна одержаних результатів: вивчені функціональні особливості суглобів у хворих на ревматойдний артрит, що відкрило можливості для розробки програми фізичної терапії; визначені особливості змісту та спрямованості програми фізичної терапії, підібрані засоби відновлення з урахуванням ступеня функціональних порушень. Практичне значення отриманих результатів. Розроблена програма фізичної терапії при ревматойдному артриті, дозволила підвищити ефективність відновного лікування. Дані магістерської дисертації можуть бути використанні в роботі медичних закладів, реабілітаційних центрах, санаторіях та під час навчального процесу у вищих навчальних закладах з фізичного виховання і спорту, кафедрах фізичної терапії та ерготерапії. За результатами дослідження було опубліковано: 1 стаття в Международной научной интернет-конференции «Тенденции и перспективы развития науки и образования в условиях глобализации»; 1 тезиси в I Международная научно-практическая конференция “PRIORITY DIRECTIONS OF SCIENCE AND TECHNOLOGY DEVELOPMENT”, 27-29 сентября 2020 года Киев, Украина.
The master's dissertation is presented on 83 pages, literary sources 37, among them 4 foreign; Fig. 2, table. 11, Annex 1. Actuality of theme. Rheumatoid arthritis is one of the most common inflammatory diseases of the joints, which causes significant physical, mental and socio-economic damage to patients. Today, diseases of rheumatoid origin remain the most common pathologies in the world, in Ukraine in particular. Every year there are a large number of modern tools that should be included in the physical therapy program. All of the above determines the relevance and need for further study of this issue in the recovery of patients with rheumatoid arthritis, which became the basis for this master's thesis. Connection of work with scientific programs, plans, topics. The master's dissertation is made in accordance with the scientific theme of the Department of Biosafety and Human Health NTUU "KPI. Sikorsky ». Purpose: to develop physical therapy programs for rheumatoid arthritis and evaluate its effectiveness. Objectives: according to the special literature to study the current state and areas of improvement of physical therapy for rheumatoid arthritis; to investigate the functional state of the joints; develop a program of physical therapy for rheumatoid arthritis and test its effectiveness. The subject of the study is patients with rheumatoid arthritis. The subject of research - physical rehabilitation of patients with rheumatoid arthritis. Research methods: analysis of special scientific and methodical literature and information sources; clinical research methods (content analysis of case histories, review); visual-analog pain scale (VAS); instrumental research methods and methods of mathematical statistics. Scientific novelty of the obtained results: the functional features of the joints in patients with rheumatoid arthritis were studied, which opened opportunities for the development of a physical therapy program; the peculiarities of the content and direction of the physical therapy program are determined, the means of recovery are selected taking into account the degree of functional disorders. The practical significance of the results. Developed a program of physical therapy for rheumatoid arthritis, increased the effectiveness of rehabilitation treatment. The data of the master's dissertation can be used in the work of medical institutions, rehabilitation centers, sanatoriums and during the educational process in higher educational institutions of physical education and sports, departments of physical therapy and occupational therapy. According to the results of the study were published: 1 article in the Международной научной интернет-конференции «Тенденции и перспективы развития науки и образования в условиях глобализации»; 1 thesis in the I Международная научно-практическая конференция “PRIORITY DIRECTIONS OF SCIENCE AND TECHNOLOGY DEVELOPMENT”, 27-29 сентября 2020 года Киев, Украина.

У статті розглянуто визначення видо-типологічних характеристик довідкових видань та проаналізовано основні етапи становлення та розвитку довідкових видань. На основі вивчення та узагальнення широкого кола літературних джерел, визначені види довідкових видань за призначенням та характером оформлення.
The article considers the definition of species-typological characteristics of reference publications and analyzes the main stages of formation and development of reference publications. Based on the study and generalization of a wide range of literature sources, identified types of reference publications by purpose and nature of design.

1. Паспорт спеціальності 07.00.08 - книгознавство, бібліотекознавство, бібліографознавство. Постанова президії ВАК України від 21.05.1998 No 31-06/5. Архів оригіналу за 13.05.2008. 2. ДСТУ 3017-95 Видання. Основні види, терміни та визначення. – Введ. 1996-01-01. – Київ : Кн. палата України, 1995. – 34 с. 3. Фокеев В.А. Библиографическая наука и практика: терминол. слов. / В.А. Фокеев ; науч. ред. Г.В. Михеева. – СПб. : Профессия, 2008. – 272 с. 4. Швецова-Водка Г. М. Бібліографічні ресурси України : заг. характеристика : навч. посіб. / Г. М. Швецова-Водка ; Рівнен. держ. гуманітар. ун- т. – Рівне, 2000. – 205 c. – Про покажч.: с. 83.;
Розглянуті визначення видо-типологічних характеристик бібліографічного покажчика. Проаналізовані основні ознаки класифікацій видань. На основі вивчення та узагальнення широкого кола літературних джерел, визначені види покажчиків за призначенням та характером оформлення.
There are considered the definitions of typological characteristics of the bibliographic index. The main features of the classification of publications are analyzed. Based on the study and generalization of a wide range of literature sources, instructions on the purpose and nature of the design are determined.

Культурна політика в галузі організації та проведення експертизи культурних цінностей відображена у сформованому за роки незалежності України законодавстві. До основних засад державної політики у сфері культури Закон України «Про культуру» від 14 грудня 2010 року відносить захист і збереження культурної спадщини як основи національної культури. Попит на проведення експертизи виникає при оцінці надходжень предметів до бібліотеки, архіву чи музею щодо визначення їх культурного та історичного значення при прийомі до музейного, архівного чи бібліотечного фонду. Також вагомим є попит на проведення експертизи при необхідності вивозу культурних цінностей за кордон. Державна експертиза культурних цінностей проводиться з метою захисту культурної спадщини від несанкціонованого та небажаного вивезення і збереження у національному культурному фонді предметів, що мають важливе значення для культури.

1. Pereira, F. Universal multimedia experiences for tomorrow / F. Pereira, I. Burnett // IEEE Si6gnal Proc. Mag., Special Issue on Universal Multimedia Access. – 2003. – Vol.20. – No 2. p. 63-73. [Режим доступу] https://pdfs.semantics6cholar. org/56ef/40e813eb8b71be6aa4380fa4100edd42f49e.pdf. 2. Meleshko M., Loboda S., Rakitsky V. Application of the Shauder basic function system for 6the presentation and concentration of information. Norwegian Journal of development of the I66nternational Science No 42/2020. – p. 62 - 68.
Розглянуто варіант пошуку ефективних методів на суб’єктному та апаратно-програмному рівні комунікації в системі «Розробник ресурсу – Комп’ютерний засіб – Мережа – Користувач» на основі адаптації складових системи передачі мультимедійного контенту засобами мережних технологій. Для дослідження обраний наскрізний канал передачі аудіо інформації від оцифрування, сегментації цифрового масиву, вибору формату даних та файлу оброки з використанням прямих та зворотних швидких алгоритмів на основі системи неортогональних базисних функцій. Запропоновано здійснювати адаптацію на різних рівнях передачі інформації: на сервері мультимедійного контенту; на проміжних програмованих мережних вузлах; на терміналах користувачів з урахуванням сервісних запитів та різного апаратно-програмного забезпечення.
The option of finding effective methods at the subject and hardware-software level of communication in the system "Resource Developer - Computer - Network - User" based on the adaptation of the components of the system of multimedia content transmission by means of network technologies. The end-to-end channel of audio information transmission from digitization, digital array segmentation, data format selection and installment file using direct and inverse fast algorithms based on the system of non-orthogonal basic functions is chosen for the research. It is offered to carry out adaptation at different levels of information transfer: on the server of multimedia content; on intermediate programmable network nodes; on user terminals, taking into account service requests and various hardware and software.

Cette thèse traite des rapports noués entre le livre et la photographie en France au cours du dernier tiers du XIXe siècle. Elle dégage les enjeux recouverts par cette association pour les acteurs collaborant à sa réalisation, à la croisée desquels a été progressivement inventé un objet inédit : un livre dont le discours s’élabore à partir de la combinaison de textes et de photographies entre ses plats de couverture au moins, mais aussi sur ses pages si l’envie ou le besoin le commande. Pour cela, elle circonscrit les contours et les tendances de la production moyenne entre 1867 et 1897, en construisant un corpus qui en reflète l’étendue et les ambitions. De type systémique, son analyse démontre que le livre n’a été ni le berceau, ni le foyer, non plus que le vecteur de diffusion principal des images photographiques en France au XIXe siècle. En révélant l’extrême diversité de la production, elle prouve par contre que le livre a constitué un laboratoire d’expérimentations des modalités de l’association des textes et des images photographiques, dans le but de formaliser un discours pour le pérenniser. Par ce biais, les auteurs et les éditeurs ont progressivement défini les spécificités de la photographie dans le champ des moyens disponibles pour l’illustration. Permettant notamment aux imprimeurs-éditeurs de réaffirmer leur position dominante sur un monde de l’édition en mutation, les processus de cette appropriation se distinguent toutefois par la très faible implication de la communauté photographique. Dès lors, cette thèse propose une périodisation des liens des photographes au livre, lorsque celui-ci est utilisé comme un levier dans leurs réclamations statutaires
This thesis is about the relationship between books and photography in France during the last three decades of the 19th century. It reveals what was at stake in this specific association for the diverse actors involved in its creation. Articulating multiple issues, a new object was gradually invented: the photographically illustrated book, that is a book discursively produced through combining texts and photographic images between its covers, if not on the very pages themselves. To this end, the thesis charts the boundaries and tendencies of the average production of photographically illustrated books between 1867 and 1897, building a corpus that reflects its extent and its ambitions. Through a systemic analysis, it demonstrates that books were neither the breeding grounds nor the main sites nor the main vehicles for the dissemination of photographic images in 19th century France. By showing the extreme diversity of the production, it argues that books have constituted an experimental ground where modalities of texts’ and photographic images’ associations were tested. Through this process, authors and editors progressively defined what would become the specific characteristics of photographic images as means available for illustration. Allowing publishers and printers to reaffirm their dominant position in the world of publishing, the processes of this appropriation is particular because of the very low involvement of the photographic community itself. Therefore, the thesis proposes a periodization of the links of photographers to the book, analysing its role in the statutory claims they made through time

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Mecânica
Esse trabalho vem no seguimento do projeto “Sence4me – Sistema de monitorização e controlo de desconforto em deficientes físicos motores, acamados e pacientes cirúrgicos”, representando mais uma etapa em todo o trabalho realizado ao longo dos anos. Numa primeira fase, realizou-se um estudo sobre úlceras de pressão. Este estudo visou, não só o conhecimento sobre o que é esta patologia mas também, as circunstâncias e principais locais onde este tipo de feridas é mais comum. Com isto, foi-nos permitido observar quais os comportamentos a obedecer para evitar o seu aparecimento. Da mesma forma e como a energia pneumática seria a base para todo o projeto, relembraram-se alguns conceitos e alguns elementos que dependem deste tipo energia para posteriormente a empregar. Juntamente com este estudo, partiu-se para a análise dos estudos anteriormente apresentados ao abrigo do projeto “Sence4me”, analisando o que de bom ele possui e o que seria desejável melhorar. Foi possível estabelecer o ponto de partida para o trabalho a desenvolver, aferir quais os materiais que se poderiam aproveitar e os que se teriam mudar em termos tecnológicos e, de uma forma mais específica, começar a projetar o colchão inteligente. Após estas fases mais preliminares, iniciou-se a fase de projeto do protótipo. Definiram-se os princípios bases a obedecer por forma a proceder à escolha de materiais que pudessem responder de forma afirmativa às premissas lançadas. No seu término conseguimos ter definidos todos os materiais, peças e instrumentos que necessitaríamos para obtenção de um projeto o mais próximo possível do pretendido. Por forma a dotar o protótipo de mais funções em relação aos projetos anteriores utilizou-se o programa informático Labview para elaborar um software que permitiria o controlo da pressão ao longo do tempo nas células pneumáticas do protótipo. Numa última fase, testou-se o protótipo em laboratório. Com estes testes pretendeu-se aferir da funcionalidade do software e da importância que algumas variáveis podem ter para o processo de enchimento e esvaziamento das células. A interpretação destes resultados possibilitou não só apresentar os resultados deste trabalho mas também possíveis melhorias a implementar em trabalhos futuros.
This work follows on from the project "Sence4me - System monitoring and control discomfort engines disabled, bedridden and surgical patients", representing another step in all the work done over the years. Initially, we carried out a study on pressure ulcers. This study aimed, not only the knowledge about this disease but it is also the circumstances and main places where this type of wound is most common. With this, we were allowed to observe which behaviours to conform to prevent its onset. Likewise, and as pneumatic power would be the basis for the entire project, recalled certain concepts and elements that make this form of energy to be able to use later in this paper. Along with this study, broke for the analysis of previously published studies under the project "Sence4me", analysing the good that he has and it would be desirable to improve. It was possible to establish the starting point for the work to develop, assess what materials could be enjoy and that would change in terms of technology and, in a more specific start designing the mattress intelligent. After these preliminary stages, it moved to the stage of prototype design. Defined the principles bases to obey in order to proceed to the choice of materials that could answer in the affirmative to the assumptions launched. At its end we managed to have all materials, parts and tools we would need to obtain a project as close to the desired. In order to provide more functions of the prototype compared to previous designs used the computer program to produce a Labview software which enables control of the pressure over time in cells pneumatic prototype. In the last phase, the prototype was tested in the laboratory. With these tests intended to verify the functionality of the software and the importance that some variables can have on the process of filling and emptying of the cells. Interpretation of these results has led not only to present the results of this work but also possible to implement improvements in future work.

Tese de doutoramento em Ciências da Saúde
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), one of the most successful human pathogens in the world, is initially sensed in the lung by pathogen recognition receptors such as TLRs, localized in macrophages, dendritic cells, and monocytes recruited from the bloodstream. This recognition via TLRs initiates a signal transduction pathway in the host cell that culminates with the induction of cytokines and chemokines that are critical for initiation of the innate immune response and the subsequent activation of adaptive immune defence against the pathogen. TLR2, TLR4 and TLR9 have been implicated as the main TLRs in the recognition of Mtb. However, the specific role of these receptors during Mtb infection remains unclear despite several studies that have been done. These studies have shown conflicting results regarding the role of individual TLRs or even in their cooperative work. One of the most important and intriguing characteristics of tuberculosis (TB) is the wide spectrum of the disease. After infection the variety of possible outcomes is undetermined and seems to depend on the particular genetic interplay between host and pathogen. Individual characteristics of each one could influence in a positive or negative way the final result of the infection. The variability in the immune response induced by different strains of Mtb, the distinct interaction with innate immune cells and their heterogeneous responses are other related issues, which could also impact the pathogenesis of the infection. This work was focused on understanding the molecular bases that determine the heterogeneity of the immune response induced by different strains of Mtb and to provide new insights on how the Mtb/host interaction can impact the immune response and pathogenesis. To achieve this, we selected Beijing (Bj) strains, a group of conserved genotypes of Mtb strains, included in the East- Asian lineage which have been associated with multidrug resistance and have been suggested to be more virulent and to elicit non-protective immune responses.Initially we confirmed the wide heterogeneity of the immune response induced by a panel of Bj strains using an in vitro model. We also hypothesized that TLRs may play an important role in the process. Using Mtb Bj strains and a mice model of infection we showed a differential recognition by the host to strains that belong to the same phylogenetic family. Depending on the infecting strain, recognition can occur preferentially via either TLR2 or TLR4, with a differential impact on the progression and outcome of the infection. Moreover, we showed that TLR4 has a critical role in the recognition of certain strains, namely 02-171 Bj strain. Our analysis showed a strong dependency on TLR4 recognition, inducing a particularly robust profile of cytokines in vitro and in vivo, with a prominent induction of IFN-β, which was not observed in strains preferentially recognized by TLR2. Moreover, in the absence of TLR4 we observed a higher bacterial burden in the lungs of mice infected with the 02-171 Bj strain as well a notable decrease of almost all measured cytokines, supporting a protective role for TLR4. Subsequently, differential activation of TLR by Mtb Bj strains has impact in the induction of molecules related with microbicidal activity such as a NO and LRG-47. An important differential role of TLR4 was detected during activation of these microbicidal mechanisms in macrophages. Importantly, this differential recognition was observed also in strains that belong to other phylogenetic families. Altogether, data presented throughout this work provide relevant input to better understand the molecular basis of the host immune innate cells during infection with Mtb strains, particularly how the Mtb/host interaction can impact on the heterogeneity of pathogenesis of TB.
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), um dos agentes patogénicos com maior impacto em humanos, é inicialmente detectado nos pulmões por receptores específicos, como TLRs, localizados em macrófagos, células dendríticas e monócitos recrutados da corrente sanguínea. O reconhecimento via TLRs inicia uma via de transdução de sinal intracelular na célula hospedeira que conduz a uma indução da produção de citocinas e quimiocinas, moléculas cruciais para iniciar a resposta imune inata e subsequente ativação da resposta imune adaptativa contra o agente infeccioso. Dentro dos TLRs, TLR2, TLR4 e TLR9 são moléculas chave no reconhecimento de Mtb. No entanto, o papel específico desses receptores durante a infecção por Mtb permanece incerto uma vez que estudos recentes têm presentado resultados contraditórios, quer sobre o papel individual destes TLRs quer sobre a sua ação conjunta durante a infecção. Uma das características mais importantes e mais intrigantes da tuberculose (TB) é o amplo espectro da doença. De facto, após a infecção a grande diversidade de presentação de TB parece estar ligado à interação específica entre o hospedeiro e Mtb, sendo que características individuais podem influenciar de forma positiva ou negativa o resultado final da infecção. A variabilidade na resposta imune induzida por diferentes estirpes de Mtb, a interação com diferentes células imunes inatas e as suas respostas heterogéneas são outros factos que podem influenciar o processo patogénico. O objetivo deste trabalho era estudar as bases moleculares que determinam a heterogeneidade da resposta imune induzida por diferentes estirpes de Mtb e, assim, elevar o nível de conhecimento sobre a interação Mtb/hospedeiro e o impacto que esta relação tem sobre a resposta imune e a patogénese. De modo a atingir este objetivo, foram selecionada estirpes Beijing (Bj), um grupo de genótipos conservados de estirpes de Mtb que pertencem à linhagem Este-Asiática e foram previamente associados a fenómenos de multirresistência, virulência aumentada e induzir respostas imunes não protetoras. Os resultados iniciais, utilizando um modelo in vitro de infeção, confirmaram a grande heterogeneidade da resposta imune induzida por diferentes estirpes Bj. Adicionalmente, colocamos a hipótese de que os TLRs poderiam despenhar um papel importante durante este processo. Utilizando um modelo animal de infeção, verificámos a existência de um reconhecimento diferencial pelo hospedeiro a estirpes que pertencem à mesma família filogenética. De facto, dependendo da estirpe o reconhecimento pode ocorrer preferencialmente via TLR2 ou TLR4 com um impacto diferente na progressão e resultado final da infeção. Adicionalmente, demonstrámos que TLR4 tem um papel crucial no reconhecimento de estirpes específicas, nomeadamente a estirpe Bj 02-171. A nossa análise revelou uma forte dependência no reconhecimento via TLR4, induzindo um perfil de produção de citocinas, tanto in vitro como in vivo, com particular relevo para a produção de IFN-β, um fenómeno não observado em infeções por estirpes preferencialmente reconhecidas por TLR2. Além disso, observámos, na ausência de TLR4, uma maior carga bacteriana nos pulmões de ratinhos infectados com a estirpe 02-171 Bj assim como uma diminuição acentuada dos níveis de citocinas medidos, sugerindo um papel protetor para TLR4 durante a infeção. A ativação diferencial de TLR por estirpes Mtb Bj também tem um impacto na indução de produção moléculas com atividade microbicida como NO e LRG-47. De facto, foi detectado um papel diferencial de TLR4 durante a ativação destes mecanismos microbicidas em macrófagos, facto também observado em estirpes que pertencem a outras famílias filogenéticas. Ao longo deste trabalho foram presentados dados importantes que contribuem para compreender melhor as bases moleculares da resposta imune inata a infeções com Mtb, particularmente no que diz respeito à interação Mtb/hospedeiro o seu impacto na heterogeneidade da patogénese de TB.

Tese de doutoramento em Ciências da Saúde
Despite significant advances in drug discovery and vaccination strategies during the last decades, infectious diseases are still a major health problem worldwide. Among these, infections by mycobacteria are particularly deadly, and Mycobacterium tuberculosis alone – the causative agent of tuberculosis – is estimated to infect a third of the world population and is responsible for 9 million new cases and 1.5 million deaths every year. Interestingly, most people do not develop active disease following infection, but instead are capable of controlling infection and remain in an asymptomatic state termed latent infection. Although how the immune system controls infection is unclear, it is clear that T cells are a key component of a successful response against mycobacteria, since infection with human immunodeficiency virus (HIV) greatly increases susceptibility to infection. Because T cells play such an important role in controlling mycobacterial infections, there is considerable interest in understanding which subsets are necessary for protection, which mechanisms are employed by these cells to limit bacterial growth, and whether such cells can be elicited by vaccination strategies. To clarify the role of T cells during immunity to tuberculosis, we addressed two aspects of T cell biology: how infection impacts the thymus, the organ where T cells differentiate; and how CD8+ T cells mediate protection during tuberculosis. Our lab had previously shown that mycobacteria could disseminate to the thymus and interfere with thymic function. However, it was unclear whether the immune system could control thymic infection and halt bacterial growth in this organ. Here we show that an immune response is recruited to the infected thymus and controls infection. This response involves the production of pro-inflammatory cytokines by antigen-specific CD4+ and CD8+ T cells, which stimulate infected cells and leads to control of bacterial replication. Interestingly, these T cells are not cells undergoing differentiation in the thymus, but rather are activated cells that recirculate from infected peripheral organs to the thymus to fight infection. This recruitment is associated with the production of the chemokines CXCL9 and CXCL10 in the infected thymus, and recirculating antigen-specific T cells that express CXCR3 and preferentially traffic to the thymus. In a second set of studies, we investigate how CD8+ T cells contribute to immunity against M. tuberculosis infection. Although CD8+ T cells are essential for optimal immunity during tuberculosis, how they exert protection is unclear. Here we describe the generation of a new mouse model, the first carrying T cells expressing a recombinant T cell receptor (TCR) specific for a M. tuberculosis antigen recognized by CD8+ T cells – TB10. By combining single cell sorting of antigen-specific cells with PCR amplification of their TCRs, we selected 4 TCR candidates specific for TB10. These TCRs were cloned into retroviral vectors and used in retrovirus-mediated stem cell gene transfer to generate retrogenic mice. These mice express CD8+ T cells that recognize and respond to their cognate peptide. More importantly, adoptive transfer of retrogenic cells provides protection against aerosol infection with M. tuberculosis. We then use these mice to investigate the mechanism by which CD8+ T cells mediate protection. By using retrogenic mice that are deficient in the production of interferon-γ or perforin, we show that protection mediated by CD8+ T cells requires cytokine production but is independent of their cytotoxic capacity. Collectively, the studies presented in this thesis clarify different aspects of T cell-mediated immunity to mycobacteria; they reinforce that the thymus is not an immune privileged organ and should be studied in the context of infection, and strengthen the notion that CD8+ T cells are protective after M. tuberculosis infection
Nas últimas décadas observamos incríveis avanços tanto no desenvolvimento de vacinas como de antibióticos. No entanto, as doenças infecciosas continuam a ser um problema de saúde global. Entre estas, as infecções por micobactérias são particularmente mortiferas, e é estimado que um terço da população mundial esteja infectada com Mycobacterium tuberculosis – a bacteria responsável pela tuberculose. Esta doença causa 9 milhões de novos casos todos os anos, resultando em cerca de 1.5 milhões de mortes anuais. No entanto, a maioria dos indivíduos infectados não desenvolve a doença, e permanence num estadio clinico assimptomatico designado por infecção latente. Apesar de ainda não ser claro como é que o sistema imunitário controla estas infecções, as células T são um componente essencial neste processo, já que infecção com o virus de imunodeficiencia humana (VIH) aumenta significativamente a susceptibilidade à infecção com micobactérias. Devido à importância das células T nestes casos, é importante clarificar que subconjuntos destas células são necessários para controlar a infecção, como é que essas células são protectoras, e se é possível gerá-las por intermédio de vacinas. Para melhor entender qual o papel das células T durante infecções por micobactérias, focamo-nos em dois pontos: qual o impacto destas infecções no timo, o orgão em que as células T se diferienciam; e qual o papel das células T CD8+ durante a tuberculose. Quando iniciamos estes estudos, era sabido que micobactérias são capazes de disseminar para o timo e interferir com a função deste orgão. No entanto não era claro se o timo consegue controlar estas infecções, e como o faz. Nos estudos aqui apresentados demonstramos que o timo controla a infecção, num processo dependente do recrutamento de uma resposta imunitária adquirida para este orgão. Esta resposta envolve a produção de citocinas pró-inflamatórias por parte de células T, tanto CD4+ como CD8+. Estas citocinas activam as células infectadas, resultando no controlo do crescimento bacteriano no timo. Apesar do timo ser o orgão em que as células T se diferenciam, os nossos estudos revelam que as células responsáveis pelo controlo bacteriano neste orgão não são células que se encontram neste orgão no processo de diferenciação, mas antes células T activadas que recirculam dos orgãos periféricos para o timo para controlar a infecção. Este processo depende da produção das quimoquinas CXCL9 e CXCL10 no timo infectado, e da expressão do receptor CXCR3 por parte das células que recirculam. Num conjunto de estudos diferentes debruçamo-nos sobre a contribuição das células T CD8+ durante a tuberculose. Apesar de ser aceite que estas células são importantes durante a infecção com M. tuberculosis, o mecanismo pelo qual elas protegem indivíduos infectados é ainda desconhecido. Para investigar esta questão criamos um novo modelo animal, o primeiro ratinho que expressa células T CD8+ específicas para um antigénio de M. tuberculosis, o antigénio TB10. Para tal, células específicas para TB10 foram isoladas individualmente por citometria de fluxo, os seus receptores de células T (TCR) amplificados por reacção em cadeia de polimerase (PCR) e sequenciados. Das sequências detectadas, 4 foram seleccionadas e clonadas em vectores retrovirais, que foram depois usados para gerar animais retrogénicos, via transferência adoptiva de células estaminais infectadas com os retrovirus. Estes animais expressam células T CD8+ que reconhecem o antigénio de interesse, e transferência adoptiva de células retrogénicas é suficiente para proteger significativamente animais de infecção aerogénica com M. tuberculosis. Para investigar qual o mecanismo responsável pela protecção observada, geramos animais retrogénicos incapazes de produzir interferão-γ ou perforina, e demonstramos que as células T CD8+ precisam de produzir citocinas, mas não de ser citotóxicas, para proteger animais contra infecção por tuberculose. Em conjunto os estudos apresentados nesta tese clarificam diferentes aspectos acerca da imunidade mediada por células T durante infecções com micobactérias: re-enforçam a ideia de que o timo não é um orgão imuno-priveligiado e deve ser estudado no contexto de doenças infecciosas; e que as células T CD8+ são protectoras no contexto de tuberculose.

Tese de Doutoramento Ciências da Saúde – Ciências Biológicas e Biomédicas
Worldwide, Mycobacterium tuberculosis infections are responsible for approximately 2 million deaths each year and the control of tuberculosis remains one of the most important challenges in the fight against infectious disease. The struggle against this mycobacterial infection has been performed using the vaccine M. bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) and the administration of anti-mycobacterial drugs. However it is clear that vaccination has to be improved for the following reasons: i) the efficacy of BCG vaccination is not satisfactory, ranging from 0-80%, ii) there has been an increase of mycobacterial strains resistant to the most common drugs actually used. The development of new vaccines requires however that significant effort be put into the study of the host-parasite interactions in this infection. It is with this in mind that I have investigated the cellular response to the vaccine BCG. It is known that interferon (IFN)-γ, associated with the development of acquired immune responses mediated by T helper (Th)1 lymphocytes, plays an essential role in the control of infection by mycobacteria. IFN-γ-gene-deficient ( ifn2-/-) mice are highly susceptible to mycobacterial infection and exhibit enhanced accumulation of activated effector T cells and neutrophils within granulomatous lesions. Nevertheless these T cells are not associated with control of bacterial growth and are associated with the development of pathology. Recently a new phenotype of T lymphocytes (Th17), which is associated with the development of inflammatory type of responses and pathology, has been described. Th17 cells produce mainly interleukin (IL)- 17, IL-6 and tumour necrosis factor (TNF). IL-17 can act on macrophages inducing the expression of TNF, granulocyte macrophage colony stimulatin factor (GM-CSF) and IL-8, resulting in the maturation and recruitment of neutrophils. The dynamics and regulation of these cells following infection by bacteria are poorly understood. I have therefore examined the kinetics of Th1 and Th17 cellular response following infection by BCG. My data show that in C57BL/6 mice infected with BCG, both IFN-γ and IL-17-producing T cells develop early after infection, however only IFN-γ-producing T cells expand as infection progresses. In contrast, in ifn2-/- mice infected with BCG the number of IL-17-producing T cells increases dramatically. These observations point to a regulatory role of IFN-γ on the differentiation of Th17 cells. To elucidate the mechanism underlying this observation, CD4 T cells from OT II transgenic mice were cultured in the presence of bone marrow derived dendritic cells (BMDC) infected with BCG and the cognate antigen. I observed that in these conditions a significant number of Th17 cells differentiate and that the differentiation of these cells can be inhibited by the presence of IFN-γ. Furthermore IFN-γ, by increasing the production of IL-12 and decreasing the synthesis of IL-23 (a cytokine important for the differentiation of Th17 cells), modulates the differentiation of Th1 and Th17 cells. These data reinforce the necessity to perform further studies to understand the dynamics of Th1/Th17 cells following infection by mycobacteria as well as the regulatory role of IFN-γ. Although IL-17 is induced soon after mycobacterial infection, the effect of IL-17 on the bactericidal activity of macrophages was not known. To address this question bone marrow derived macrophages (BMDM) were infected with M. tuberculosis or M. bovis BCG, and treated with IFN-γ, IL-17 or both. I have shown that IL-17 increases the susceptibility of macrophages to the intracellular infection with mycobacteria and that it inhibits the macrophage bactericidal activity induced by IFN-γ. This effect of IL-17 is not dependent on the macrophage effector mechanisms related with nitric oxide production or phagosome maturation. Surprisingly, IL-17 alone but not in the presence of IFN-γ, increases macrophage survival which is related to an increased expression of IL-6, a cytokine known to induce cell survival. These data illustrate the potential for IL-17 to have an impact on disease progression and support the necessity to elucidate the role of IL-17 on mycobacterially-infected macrophages. The differentiation and persistence of Th17 cells has been considered responsible for several pathologies, including those associated with autoimmune and chronic infectious diseases. This is of interest as a well-known phenomenon of mycobacterial infection is the Koch reaction. This reaction occurs in mycobacterially-infected hosts re-exposed to mycobacterial antigens and is characterized by a massive influx of neutrophils and damaging pathologic consequences. As a result of the low level of protection afforded by BCG vaccination, and because protection is not long-lived, it has been proposed that re-vaccination should be considered. In view of the potential for Koch reaction in response to re-vaccination it is therefore essential that we have a better understanding of the molecular mechanisms leading to the Koch reaction; specifically whether Th17 cells play a role. To address this question, C57BL/6 mice were infected with M. tuberculosis. Fifteen days after infection mice were vaccinated sub-cutaneously once, twice or three-times with BCG, with an interval of fifteen days between each vaccination. Importantly I determined that the number of Th17 cells increases with the number of M. bovis BCG revaccinations. Since the presence of Th17 cells has been associated with the induction of cytokines and chemokines responsible for the differentiation and recruitment of neutrophils, I postulate that neutrophils are responsible for the pathology and tissue damage associated to the Koch reaction. In summary, my work has identified potential new mechanisms into the complex network of immune responses, occurring in response to infection and vaccination with mycobacteria. Specifically, I have demonstrated a role for IFN-γ in the regulation of Th17 cells differentiation, and the relevance of IL-23 in the sustained differentiation of Th17 cells. I have also shown that IL- 17 inhibits the bactericidal activity of infected macrophages. This has the potential to be important and of biological relevance but the role of this molecule in bacterial control must be clarified. Finally, my data support a role for IL-17 in the pathology associated to the Koch reaction and this is important for the understanding of this unique reaction. Altogether my results point to the fact that the dynamics and effector function of Th17 cells have to be taken into consideration for a better understanding of the mechanisms leading to resistance and/or pathology following infection by M. tuberculosis, as well as for the design of new vaccines.
As infecções por Mycobacterium tuberculosis constituem um grave problema de saúde pública a nível mundial, sendo responsáveis por cerca de 2 milhões de mortes por ano. O controlo da infecção por M. tuberculosis tem vindo a ser feito pelo recurso à vacinação com M. bovis Bacilo Calmette-Guérin (BCG) e pela administração de fármacos anti-micobacterianos. Contudo é cada vez mais evidente que o desenvolvimento de novas vacinas é fundamental tendo em consideração: i) que a eficácia da vacinação por BCG é muito variável, com um grau de protecção que varia entre 0-80%, dependendo de factores genéticos das populações e também de factores ambientais, ii) que se tem assistido nas últimas décadas a um aparecimento cada vez mais acentuado de estirpes de M. tuberculosis multi-resistentes aos fármacos disponíveis. Neste contexto, um conhecimento mais profundo das interacções parasita-hospedeiro é necessário para que se possam desenvolver estratégias preventivas e terapêuticas mais eficazes. Tendo por base este conhecimento, fui estudar a resposta celular à vacinação por BCG. A produção de interferão (IFN)-γ, associada ao desenvolvimento de respostas imunes adquiridas do tipo de linfócitos T de ajuda (Th)1, desempenha um papel fundamental no controlo das infecções por micobactérias, pelo seu papel na potenciação dos mecanismos efectores dos macrófagos e na formação de granulomas. A formação de granulomas também ocorre em ratinhos deficientes em IFN-γ infectados por micobactérias. No entanto, estas estruturas exibem uma acumulação de neutrófilos e células T efectoras. Apesar da presença destas células no local da infecção, não se verifica o controlo do crescimento bacteriano, observando-se o desenvolvimento de patologia. Recentemente, foi descrito um novo fenótipo de linfócitos T designado por Th17. Estas células produzem essencialmente interleucina (IL)-17, IL-6 e factor de necrose tumoral (TNF) e estão associadas ao desenvolvimento de respostas inflamatórias. A acção da IL-17 sobre os macrófagos induz a expressão de TNF, factor estimulador de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e IL-8. Contudo, a dinâmica, regulação e função efectora destas células após uma infecção por micobactérias não são conhecidas. Neste sentido, decidimos estudar a dinâmica das células Th1 e Th17 após uma infecção por BCG. Os resultados mostram que a infecção de ratinhos selvagens por BCG induz a diferenciação de células T produtoras de IFN-γ e de células T produtoras de IL-17. No entanto, apenas o número de células T produtoras de IFN-γ expande durante o curso da infecção. Pelo contrário, a infecção por BCG em ratinhos deficientes em IFN-γ resulta numa expansão do número das células T produtoras de IL-17. Esta observação sugere que o IFN-γ regula negativamente a diferenciação de células Th17. Para elucidar o mecanismo por detrás desta observação, células T CD4+ de ratinhos transgénicos (OT II) foram cultivadas com células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC) infectadas com BCG e antigénio. Nestas condições, observou-se a diferenciação de um elevado número de células Th17, sendo esta diferenciação inibida pela presença de IFN- γ. Observou-se, ainda, que o IFN-γ, aumentando a produção de IL-12 e inibindo a produção da IL-23 (uma citocina importante para a diferenciação de células Th17), modela a diferenciação de células Th1 e Th17. Os meus resultados mostram, pela primeira vez, que a IL-17 pode estar envolvida na patologia associada a infecções por micobactérias e que as células Th17 são reguladas pelo IFN-γ. Estes resultados realçam a importância de estudar a dinâmica das células Th1/Th17, assim como o papel regulador do IFN-γ. No decurso das infecções experimentais por micobactérias a IL-17 é induzida numa fase precoce, no entanto, o seu papel na actividade bactericida dos macrófagos não é conhecido. Para avaliar o efeito da IL-17 na actividade dos fagócitos, macrófagos derivados da medula óssea (BMDM) foram infectados com M. tuberculosis ou M. bovis BCG e tratados com IFN-γ ou IL-17. Os resultados mostram que a IL-17 aumenta a susceptibilidade dos macrófagos a infecções por micobactérias e que, adicionalmente, inibe a acção bactericida induzida pelo IFN-γ. Observei ainda que estes efeitos não são dependentes da produção de óxido nítrico nem da maturação do fagosoma, dois mecanismos efectores do macrófago descritos como intervindo no controlo das infecções por micobactérias. Verificou-se, ainda, que a IL-17 aumentava a sobrevivência in vitro dos macrófagos infectados. Dada a capacidade da IL-17 induzir nos macrófagos um aumento da expressão de IL-6, uma citoquina conhecida pelo seu efeito na sobrevivência de várias populações de células, podemos especular que o aumento da sobrevida dos macrófagos induzido pela IL-17 estará relacionado com o aumento da expressão de IL-6. Estudos adicionais serão necessários para elucidar o papel da IL-17 na progressão da infecção por micobactérias em macrófagos. A diferenciação e persistência de células Th17 estão associadas à patologia observada em algumas doenças auto-imunes e infecções crónicas. A exposição a antigénios micobacterianos em hospedeiros previamente infectados por M. tuberculosis resulta no desenvolvimento de uma patologia severa associada a um influxo massivo de neutrófilos, fenómeno designado por reacção de Koch. Como a protecção conferida pela vacinação por BCG é variável e tem, segundo alguns autores, uma duração de apenas 10 a 20 anos, tem-se vindo a sugerir que a re-vacinação pelo BCG seria uma estratégia para o controlo da tuberculose. Neste sentido, é necessário um conhecimento mais profundo dos mecanismos moleculares e celulares associados ao desenvolvimento da reacção de Koch. Para elucidar esta questão, ratinhos selvagens foram infectados com M. tuberculosis. Quinze dias depois, foram vacinados uma, duas ou três vezes com M. bovis BCG, com um intervalo de quinze dias entre cada vacinação. Os meus resultados mostram que o número de células Th17 aumentava com o aumento do número de revacinações. Uma vez que a presença de células Th17 está relacionada com o recrutamento massivo de neutrófilos, é de esperar que estes possam ser responsáveis pela patologia associada ao desenvolvimento da reacção de Koch. Em resumo, este trabalho introduz novos mecanismos na já complexa rede do desenvolvimento e regulação de respostas imunológicas, nomeadamente a regulação das células Th17 pelo IFN-γ, e a relevância da IL-23 na diferenciação das células Th17. Mostrei ainda que a IL-17, actuando nos macrófagos, inibe a sua actividade bactericida. Contudo, a relevância biológica desta observação tem que ser clarificada. Os meus resultados sugerem adicionalmente que a IL-17, associada a um recrutamento massivo de neutrófilos, poderá ser responsável pelo desenvolvimento da patologia associada à reacção de Koch. Os resultados apresentados nesta tese abrem novas perspectivas sobre a importância do estudo da dinâmica e função das células Th17 nas infecções por micobactérias, nomeadamente nos mecanismos envolvidos na resistência e desenvolvimento de patologia, tendo implicações para o desenvolvimento de novas estratégias preventivas.
Fundação para a Ciência e Tecnologia - SFRH/BD/9624/2002; POCTI 2010.

Tese de doutoramento em Ciências (área de especialização em Química)
Neste trabalho foi feita a síntese e caracterização de novos compostos que, na maioria, incorporam na sua estrutura uma ou mais unidades de hidrazida. Foram sintetizados derivados de (Z)-N-Aril e alquil-N-(2-amino-1,2-dicianovinil) formimidamidas e (Z)-N-(2-amino-1,2-dicianovinil)formamidrazonas que, por ciclização intramolecular, geraram 5-aminoimidazoles, contendo em C4 um grupo nitrilo ou um grupo cianoformimidoilo. As (Z)-N-(2-amino-1,2-dicianovinil)formamidrazonas, após tratamento com base reagiram com nucleófilos de azoto e de carbono para dar origem a 4-carbamohidrazonoil-1H-imidazoles, 4H-1,2,4-triazolo-1H-imidazoles, 5-amino-6,7-diciano-3H-imidazo[4,5-b]piridinas, 5-amino-4-(1- amino-2,2-dicianovinil)-1H-imidazoles e 5,7-diamino-6-ciano-3H-imidazo[4,5-b]piridinas. Da reação de N1-aril ou alquil-5-amino-4-cianoformimidoilimidazoles com orto-ésteres foi possível obter 6-cianopurinas. As 6-cianopurinas contendo em N9 uma unidade de amida foram geradas a partir de (Z)-N-(2-amino-1,2-dicianovinil)formamidrazonas por reação com ortoformiato de etilo.A reação de N1-aril e alquil-5-amino-4-cianoformimidoilimidazoles com paraformaldeído permitiu isolar os intermediários 5-amino-2,5-dihidro-1,3-oxazol-4-il-1H-imidazole, que por oxidação formaram as N1-aril e alquil-6-carbamoilpurinas. Por reação com acetilacetona geraramse novos derivados de 6-carbamoilpurina. A reação de (Z)-N-(2-amino-1,2- dicianovinil)formamidrazona com aldeídos aromáticos (fenólicos e não fenólicos) permitiu gerar, dependendo das condições experimentais, 1-imino-2,3-dihidro-1H-imidazo[1,5-c]imidazole-7- carboxamidas e novas 6-carbamoilpurinas. O estudo de reatividade de 6-carbamoilpurinas e 6-cianopurinas, em meio básico, permitiu gerar, eficientemente, várias estruturas de pirimido[5,4-d]pirimidin-4(3H)-ona, 9H-purina-6- carboximidoato e 3,4-dihidropirimido[5,4-d]pirimidina. Estas últimas, por ciclização intramolecular geraram as [4,5-e][1,2,4]triazolo[1,5-c]pirimidina-7-amina que, por sua vez, deram origem, na presença de ácido, às 6-(4H-1,2,4-triazolo)-9H-purinas.A reação de 9H-purina-6-carboximidoato com hidrazidas permitiu gerar 9H-purina-6- carbohidrazonamidas, que, na presença de um nucleófilo formaram pirimido[5,4-d]pirimidinas. A atividade antimicobacteriana de 125 compostos novos foi avaliada no Mycobacterium tuberculosis estirpe H37Rv, pelo Tuberculosis Antimicrobial Acquisition and Coordinating Facility – TAACF no National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID). Dos compostos testados, 66 apresentaram atividade.
In this work is described the synthesis and characterization of new compounds that mostly incorporate in its structure one or more hydrazide units. Were synthetized (Z)-N-aryl and alkyl-N-(2-amino-1,2-dicyanovinyl)formimidamides and (Z)-N-(2-amino-1,2-dicyanovinyl)formamidrazones derivatives, that in presence of base cyclized to generate 5-aminoimidazole, with a cyano or cyanoformimidoil group in 4 position. The reaction between N1-aryl or alkyl-5-amino-4-cyanoformimidoilimidazoles and orthoesters gave 6-cyanopurines. The 9-amide-6-cyanopurines were obtained from (Z)-N-(2- amino-1,2-dicyanovinil)formamidrazones by reaction with ethylorthoformate. The (Z)-N-(2-amino-1,2-dicyanovinyl)formamidrazones, were cyclized in basic medium and reacted with nitrogen and carbon nucleophiles to generate 4-carbamohydrazonoyl-1H-imidazoles, 4-(4H-1,2,4-triazol-2-yl)-1H-imidazoles, 5-amino-6,7-dicyano-3H-imidazo[4,5-b]pyridines, 5- amino-4-(1-amino-2,2-dicyanovinil)-1H-imidazoles and 5,7-diamino-6-cyano-3H-imidazo[4,5- b]pyridines.The reaction between N1-aryl or alkyl-5-amino-cyanoformimidoilimidazoles and paraformaldehyde gave 5-amino-2,5-dihydro-1,3-oxazol-4-yl-1H-imidazole, that evolved to N1- aryl or alkyl-6-carbamoylpurines and by reaction with acetilacetone generated new 6- carbamoylpurines. The reaction of (Z)-N-(2-amino-1,2-dicyanovinyl)formamidrazone with aromatic aldehydes (phenolic and non phenolic) leds to formation of 1-imino-2,3-dihydro-1Himidazo[ 1,5-c]imidazole-7-carboxamides and new 6-carbamoylpurines, depending on the experimental reaction conditions. The reactivity of 6-carbamoylpurines and 6-cyanopurines with nucleophiles leads to formation of pyrimido[5,4-d]pyrimidin-4(3H)-one, 9H-purine-6-carboximidoate e 4- iminopyrimido[5,4-d]pyrimidines. The last ones cyclized intramolecularly to generate [4,5-e] [1,2,4]triazolo[1,5-c]pyrimidin-7-amine, which originated, in presence of acid, 6-(4H-1,2,4-triazol- 3-yl)-9H-purines.The reaction between 9H-purine-6-carboximidoate with hidrazides leads to formation of 9Hpurine- 6-carbohydrazonamides, that in presence of a convenient nucleophile generates pyrimido[5,4-d]pyrimidines. The antimycobacterial activity of 125 new synthetized compounds was evaluated on Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv, by Tuberculosis Antimicrobial Acquisition and Coordinating Facility – TAACF, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), USA. From the tested compounds, 66 showed activity.
Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) e ao Fundo Social Europeu, Programa Operacional Potencial Humano (POHP) do QREN pelo apoio financeiro que me foi concedido através do financiamento da bolsa de doutoramento SFRH/2005/24959/2005.

Dissertação mestrado Ciências (ramo de conhecimento em Genética Molecular)
Tuberculosis, caused by Mycobacterium tuberculosis, remains one of the main threats to mankind. Despite the intense research on the immune response to tuberculosis, major questions remain unsolved, one of which relates to the fact that the efficacy of the current vaccine, Mycobacterium Bovis BCG, is variable. However, no other experimental vaccines against tuberculosis developed in the last 100 years were proven to be better than BCG. Therefore BCG remains the only vaccine available to date to prevent tuberculosis. A possible explanation for the variability of BCG efficacy relies on the fact that the immune response triggered by BCG and M. tuberculosis is different. Nevertheless, M. tuberculosis-based experimental vaccines tend not to protect better than BCG. We therefore hypothesized that the basic protective response triggered by BCG must be appropriate, although it needs to be improved in order to confer higher and longer lasting protection. In this work, we performed a comparative study of M. tuberculosis versus BCG infection on dendritic cells (DCs) and macrophages to better understand how these pathogens interact with cells of the innate immune system and how that might translate into an effective, or not, T helper (Th) cell response. We found that macrophages and DCs respond differently to M. tuberculosis or BCG stimulation in what concerns cytokine expression. The expression of IL-12p40, TNF and IL-6 is significantly higher in DCs than in macrophages stimulated with either mycobacteria. Nevertheless, the expression of IL-12p35 and IL-10 was similar in both cell types. We also found that the same cell type respond differently to M. tuberculosis or BCG. M. tuberculosis-stimulated DCs induced higher levels of p40 and p19 monomers and of the bioactive cytokines IL-12 and IL-23, respectively. BCGstimulated DCs produced higher amounts of TNF. The amounts of IL-6 and IL-10 secreted upon stimulation of DCs with M. tuberculosis or BCG were similar. The differential expression of IL-12 and IL-23 might be correlated in part to a higher activation of the MAP kinase ERK1/2 in DCs in response to M. tuberculosis than to BCG. Although macrophages were in general poorly induced to produce cytokines, when compared to DCs, the threshold of ERK1/2 activation was higher in stimulated macrophages. A consequence of the differential activation of DCs was reflected on the distinct type of Th responses developed when M. tuberculosis- or BCG-infected DCs presented OVA peptide to TCRtransgenic CD4+ T cells. M. tuberculosis-infected DCs were able to induce the development of both Th1 and Th17 responses, whereas BCG-infected DCs presented a shift towards Th17 responses. These differences are of interest considering the importance of Th1/Th17 balance during vaccination. Further understanding the molecular mechanisms dictating this differential Th response will be used for the development of new vaccines.
A tuberculose é causada pelo Mycobacterium tuberculosis e constitui um grave problema a nível mundial. Apesar de todo o esforço dedicado ao estudo desta infecção, questões como a variabilidade da eficácia da corrente vacina em uso, M. bovis BCG, permanecem inexplicáveis. No entanto, nos últimos 100 anos, não foi experimentalmente desenhada outra vacina mais eficiente do que o BCG. Sendo assim, a única vacina disponível até ao momento para combater a tuberculose é o BCG. Uma possivel explicação para a variabilidade da vacina consiste no facto de o M. tuberculosis e o M. bovis BCG desencadearem uma resposta imunológica diferente.Contudo, vacinas experimentais baseadas no M. tuberculosis não conferem maior protecção do que o BCG. A nossa hipótese, é que a resposta desencadeada pelo BCG deve ser adequada, embora necessite de ser melhorada de modo a conferir uma protecção maior e mais prolongada. Neste trabalho foram comparadas as infecções por M. tuberculosis versus BCG em células dendríticas (DCs) e em macrófagos, com os objectivos de compreender melhor a interacção entre estes agentes patogénicos e o sistema imunológico inato, e como é que isso se traduz, ou não, numa reposta T de ajuda (Th) eficaz. Os nossos resultados mostram que as respostas induzidas pelos macrófagos e pelas DCs estimulados por M. tuberculosis ou por BCG, em termos de expressão de citocinas, são diferentes. A expressão de IL-12p40, TNF e IL-6 induzida por ambas as micobactérias foi significativamente maior em DCs do que em macrófagos. Contudo, a expressão de IL-12p35 e IL-10 foi semelhante em ambos os tipos celulares. Observamos, também, que o mesmo tipo celular responde de modo diferente ao M. tuberculosis ou ao BCG. As DCs estimuladas pelo M. tuberculosis induziram níveis elevados de p40 e p19, bem como das respectivas citocinas bioactivas IL-12 e IL-23. As DCs estimuladas pelo BCG produziram elevados níveis de TNF. A produção de IL-6 e IL-10 foi semelhante quer nas DCs estimuladas pelo M. tuberculosis quer pelo BCG. A expressão diferencial de IL-12 e de IL-23 poderá estar correlacionada, em parte, com uma maior activação da MAP cinase ERK1/2 pelas DCs em resposta ao M. tuberculosis relactivamente ao BCG. Embora a indução de citocinas pelos macrófagos fosse menor do que pelas DCs, o threshold de activação do ERK1/2 induzido pelos macrófagos foi maior. A diferente activação induzida pelo M. tuberculosis ou BCG em DCs reflectiu-se no tipo de resposta Th diferenciada. Em DCs estimuladas com M. tuberculosis ou BCG, que apresentam o péptido OVA a células T CD4+ cujo TCR é transgénico, observamos que as DCs estimuladas com M. tuberculosis induziram o desenvolvimento de respostas Th1 e Th17, enquanto que DCs estimuladas com BCG induziram uma resposta Th17 superior à observada com M. tuberculosis. Considerando a importância do balanço Th1/Th17 durante a vaccinação, as diferenças observadas são de extrema relevância, dado que a compreensão dos mecanismos moleculares que ditam esta resposta diferencial consiste numa estratégia para o desenvolvimento de novas vacinas contra a tuberculose.

Tese de doutoramento em Psicologia Social
Os Estudos de gênero têm contribuído com diversas áreas de saberes e de intervenção para o processo de transformação social, direcionando seu foco de interesse para as marcas patriarcais impingidas no corpo social. A saúde constitui uma dessas áreas e o fenômeno do adoecer é concebido à luz do complexus, como uma totalidade biopsicosocial. A análise do adoecer feminino se constrói dialogando com diversos campos do conhecimento; com o corpo sendo concebido como um dispositivo de poder (biopoder) e as patologias femininas como relacionadas a situações de conflito. Diante dos padrões de feminilidade impostos, as mulheres reagem de modo diferenciado e uma das formas de reação é pela via do adoecimento. A investigação sobre as patologias femininas, diante dos traços conscientes e inconscientes constituintes da psyché, privilegia os sintomas inconscientemente produzidos pelo sujeito. Considerando a incidência predominante de Lúpus em mulheres, a presente investigação objetiva examinar as implicações da construção discursiva da subjetividade feminina no adoecer, a partir da posição de sujeito no discurso. Conforme a Análise Foucaultiana do Discurso, se busca como os saberes são discursivamente construídos e o funcionamento discursivo produz sentidos, estabelecendo relações entre práticas discursivas e os discursos constitutivos dessas práticas. Os dados foram coletados por meio de entrevistas com mulheres portadoras de Lúpus em Maceió (AL) – Brasil. Foram realizadas dezessete entrevistas, gravadas e posteriormente transcritas para análise, resultando num texto; a partir deste, foi selecionado um corpus de enunciados e montado um quadro temático com os seguintes discursos: feminilidade, psicossomático (médico, psicanalítico), patriarcal (religioso, familiar), feminista espontâneo. Um dos aspectos relevantes desse estudo consiste em conhecer os mecanismos que produzem efeitos de sentido androcêntrico no adoecer feminino. O procedimento operacional contou com um roteiro de questões em torno de três eixos temáticos. O primeiro – trajetória pessoal e familiar – apontou para a construção discursiva patriarcal e suas repercussões sobre o controle da sexualidade, pela submissão feminina à lei do pai. O segundo – surgimento da doença – remeteu para a construção discursiva da culpabilidade feminina veiculada pelo discurso patriarcal religioso que sedimenta nas mulheres o histórico sentimento de culpa feminina. Enfim, o terceiro – percepção de si e da doença – direcionou para o discurso psicossomático como construtivo do sentido do adoecer, trazendo à tona a influência dos fatores emocionais (estresse, perdas, separação) no desencadeamento do Lúpus. Na divisão de poder entre os espaços público e privado que tende a demarcar os limites do masculino e do feminino, o poder dos afetos é percebido como intrinsecamente vinculado ao corpo feminino que adoece. O resultado da análise aponta para a presença nas práticas discursivas de traços similares às patologias femininas, funcionando o adoecer como uma inscrição dos afetos no corpo. Esse resultado, uma leitura possível entre outras, sugere a necessidade de se incorporar o olhar de gênero aos estudos médicos sobre o adoecer, bem como às suas práticas profissionais, tendo em vista um novo olhar sobre a relação saúde e doença.
The gender studies have been contributing with several areas of knowledge and of intervention for the process of social transformation, addressing its focus of interest for the marks patriarchal impish in the social body. The health constitutes one of those areas and in her the phenomenon of getting sick is conceived to the light of the complexus, as a totality biopychosocial. The analysis of getting sick feminine she builds dialoguing with several fields of the knowledge; with the body being conceived as a device of power (biopower) and the feminine pathologies as related the conflict situations. Before the patterns of femininity obliged, the women react in a differentiated way and one in the reaction ways is for the road of the sickening. The investigation on the feminine pathologies, before the conscious lines and unconscious representatives of the psyche, privileges the symptoms unconsciously produced by the subject. Considering the predominant incidence of Lupus in women, to present investigation objectifies to examine the implications of the discursive construction of the feminine subjectivity in getting sick, starting from subject's position in the speech. As the Analyses of the speech by Foucault is looked for as you know them they are built in a discursive way and the discursive operation produces senses, establishing relationships among practice discursive and the constituent speeches of those you practice. The data were collected by means of interviews with women carriers of Lupus in Maceió (AL) – Brazil. Seventeen interviews were accomplished, recorded and later on transcribed for analysis, resulting in a text; starting from this, a corpus of statements was selected and mounted a thematic picture with the following speeches: femininity, psychosomatic (medical, psychoanalyses), patriarchal (religious person, family), spontaneous feminist. One of the important aspects of that study consists of knowing the mechanisms that produce effects of andocentric sense in getting sick feminine. The operational procedure counted with a route of subjects around three thematic axes. The first – personal and family course – it pointed for the patriarchal discursive construction and its repercussions on the sexuality control, for the feminine submission to the father's law. The second – appearance of the disease – it sent for the discursive construction of the feminine guilt transmitted by the religious patriarchal speech that forms sediment in the women the historical feeling of feminine blame. Finally, the third – perception of itself and of the disease – it addressed for the psychosomatic speech as constructive of the sense of getting sick, bringing to the tunes the influence of the emotional factors (stress, losses, separation) in the in the breaking out of Lúpus. In the division of power among the public and private spaces that it tends to demarcate the limits of the masculine and of the feminine, the power of the affections is noticed as intrinsically linked to the feminine body that gets sick. The result of the analysis points for the presence in the discursive practices of similar lines to the feminine pathologies, working getting sick as a registration of the affections in the body. That result, a possible reading among other, suggests the need to incorporate the gender glance to the medical studies on getting sick, as well as to its professional practices, tends in view a new one to look at about the relationship health and disease.

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Engenharia Clínica)
As feridas crónicas são lesões na pele que apresentam grande dificuldade de cicatrização, persistindo por longos períodos de tempo e que causam dor, stresse emocional e físico. Estas feridas afetam principalmente as pessoas que sofrem de doenças como, diabetes e obesidade e também idosos com limitações de movimento. A dificuldade de cicatrização deste tipo de feridas é devido à presença de comunidades polimicrobianas altamente persistentes e resistentes a antibióticos que causam graves infeções e que subsistem nas feridas em forma de biofilmes. Assim, torna-se premente o desenvolvimento de novas estratégias, alternativas aos antibióticos, que sejam eficazes no tratamento de feridas crónicas. A terapia fágica constitui numa abordagem muito promissora no controlo de populações microbianas. No trabalho descrito nesta dissertação foram utilizados bacteriófagos (fagos) pertencentes à coleção do Grupo de Biotecnologia de Bacteriófagos da Universidade do Minho e isolados novos fagos com o intuito de serem usados para controlo bacteriano de espécies que predominam em feridas crónicas. Os ensaios de caracterização da eficácia dos fagos foram realizados em biofilmes formados in vitro (em microplacas de poliestireno) e ex vivo (em pele de porco) tratados com fagos individualizados e em cocktail (2 a 3 fagos), durante 2 períodos de incubação (4 e 24 h). Os biofilmes formados nas diferentes superfícies foram inspecionados por microscopia de epifluorescência recorrendo à técnica de FISH utilizando sondas de LNA e PNA para a marcação das diferentes espécies bacterianas. De todos os fagos estudados, apenas os fagos Aba2 de Acinetobacter baumannii e EC7a de Escherichia coli foram capazes de lisar com eficácia (3 log) os respetivos hospedeiros presentes em biofilmes formados na pele de porco, no entanto, foram menos eficazes no controlo de biofilmes formados em superfícies de poliestireno (redução inferior a 1 log). Após um período de infeção mais alargado observou-se uma menor redução no número de células viáveis (1 log em A. baumannii e 1,5 log em E. coli) podendo este facto estar relacionado com a aquisição de resistência das bactérias aos respetivos fagos ou a características de replicação dos fagos às condições testadas. É no entanto importante realçar, que os fagos específicos para A. baumannii e um dos fagos de E. coli utilizados no cocktail possuem enzimas estruturais com atividade de depolimerase que tem a função de destruir a matriz dos biofilmes e assim obter acesso às células. Em suma, este trabalho evidencia que o sucesso da terapia fágica depende muito do tipo de fago, não sendo clara a vantagem da utilização de cocktails específicos para uma espécie no controlo de biofilmes de monoespécie em relação a fagos individualizados. Por outro lado, o modelo de formação do biofilme condiciona muito o resultado final, pelo que é necessário a utilização de modelos padronizados que mimetizam de forma adequada o consórcio microbiano de uma ferida crónica. Apesar da maioria dos fagos não ter sido eficaz, os fagos de A. baumannii e E. coli poderão, no futuro, ser bons agentes alternativos ou mesmo complementares à terapia antibiótica para controlar biofilmes causadores de feridas crónicas. De notar também que, o modelo ex vivo de pele de porco mostrou ser uma boa ferramenta para estudar o desenvolvimento de biofilmes, bem como as estratégias de tratamento.
Chronic wounds are injuries on the skin that have great difficulty in healing and persist for long periods of time and which cause pain, and emotional and physical stress. These injuries affect mainly people which suffer from diseases such as diabetes and obesity and also elderly patients with movement limitations. The difficulty of this type of wounds to heal is due to the presence of persistent and highly antibiotic-resistant communities that cause severe infections. These polymicrobial communities persist in wounds in the form of biofilms. The development of alternatives effective strategies to antibiotics for the treatment of chronic wounds is highly desired. Phage therapy constitutes a very promising approach in the control of microbial populations. In the work described herein phages from the collection of the Group of Biotechnology of Bacteriophage University of Minho and newly isolated phages were tested for their efficacy to control bacterial species that predominate in chronic wounds. The effectiveness characterization tests of the phages were performed on biofilms in vitro (in polystyrene microplates) and ex vivo (in pig skin) treated with phage cocktails and individual phage during two incubation periods (4 and 24 h). Biofilms formed on different surfaces were inspected by epifluorescence microscopy using the technique of FISH using PNA and LNA probes for marking different bacterial species. Only the Aba2 phage of A. baumannii and the EC7a phage of E. coli were able to efficiently lyse (3 log) the respective hosts from biofilms formed on pig skin. However, they were less effective in controlling biofilms formed on the surfaces of polystyrene (less than 1 log reduction). After a longer period of infection, there was observed a lower reduction in the number of viable cells (in 1 log A. baumannii and 1.5 log E. coli). This may be related to the acquired resistance of bacteria to the respective phages or due to the phage replication parameters under the conditions tested. It is important to note however, that the specific phages for A. baumannii and one of the E. coli phage cocktail used in enzymes have structural depolymerase activity which destroy the polysaccharide matrix of the biofilm and allow phages to gain access to the cells. The results showed that the efficacy of treatment using individual phage or phage cocktails is strongly dependent on the type of phage used and also the formed biofilm itself. In short, this study shows that the success of phage therapy depends on the type of phage, and it is also not clear if the use of cocktails targeting a specific species is advantageous for monospecies biofilms control in relation to individual phage is advantageous. Moreover, the model of biofilm formation used conditions the final result, and the use of standard models, which mimic appropriately microbial consortium of a chronic wound, would be is clearly necessary. Although most phages were not effective, the A. baumannii, and E. coli phages may in the future be good alternatives or complementary treatment options to antibiotic agents to control biofilms on chronic wounds. Also it is worthy of noting that the ex vivo pig skin model proved to be a good tool to study the development of biofilms and their control.

Tese de doutoramento em Ciências da Saúde
Buruli ulcer (BU) is a tropical neglected, necrotizing skin disease caused by Mycobacterium ulcerans infection. The tissue damage that characterizes the disease is driven by the lipidic exotoxin mycolactone, which is known to play a central role in the pathogenesis of BU. However, the mechanisms by which mycolactone exerts its cytotoxicity are still unknown. Uncovering these mechanisms could lead to new forms of BU treatment, based on the neutralization of the mycolactone cytotoxic effects. The research conducted in the scope of this thesis aimed at increasing our understanding of the molecular cytopathogenicity of mycolactone, focusing on its potent cytotoxicity. To this end, two complementary experimental approaches were followed: in vitro studies on L929 mouse fibroblasts incubated with purified mycolactone and; in vivo studies in an experimental model of BU disease, the mouse footpad infection with M. ulcerans. Using two-dimensional gel electrophoresis, we found several regulators and constituents of both actin- and tubulin-cytoskeleton (Dync1i2, Cfl1, Crmp2, Actg1, Stmn1) altered in mycolactone-exposed L929 cells, providing new molecular evidences for the impact of mycolactone upon cytoskeleton, which present conformational disarrangements, as observed by immunofluorescence. Consistently, our study of autophagy showed that autophagosomelysosome fusion, a process dependent on microtubule and dynein-driven transport, is inhibited by mycolactone. In agreement with the impairment of cytoskeleton dynamics and functions in mycolactone-exposed cells, we found that both cytoskeleton-associated BH3-only proteins (BIM and BMF) are responsive to the cellular stress induced by mycolactone, being up-regulated in L929 cells exposed to purified toxin, as well as in mycolactone-producing M. ulcerans-infected mouse footpads. Importantly, the knockdown of Bim protected L929 cells from mycolactoneinduced cytotoxicity, demonstrating that the toxin triggers an intrinsic apoptotic pathway mediated by BIM. The second larger group of proteins found down-regulated in mycolactone-exposed L929 cells comprises collagen-modifying enzymes (Plod1, Plod3, P4ha1) essential for the formation and stabilization of collagen fibers. Consistent with a mycolactone impact upon the collagen fibers stability, in vivo analyses in the BU mouse model revealed a mycolactone-dependent degeneration of dermal collagen fibers upon infection with M. ulcerans.VII Overall, this work provides new insights on the cytotoxic mechanisms of mycolactone, the key pathogenic factor of M. ulcerans. We propose that mycolactone induces nonfunctional cytoskeletal alterations, affecting cytoskeleton-dependent functions and, consequently, cellular homeostasis, triggering a BIM-mediated apoptosis. Moreover, we unveil the action of the M. ulcerans toxin on collagen biosynthesis. Our findings provide new perspectives on BU pathogenesis and pave the way for future therapeutic approaches
A úlcera do Buruli (UB) é uma doença tropical negligenciada necrotizante da pele, causada pela infeção por Mycobacterium ulcerans. O dano tecidular que caracteriza a doença é causado pela exotoxina lipídica micolactona, que se sabe desempenhar um papel central na patogénese da UB. Contudo, os mecanismos pelos quais a micolactona exerce a sua citotoxicidade são ainda desconhecidos. A elucidação destes mecanismos reveste-se da máxima importância pois poderá levar a novas formas de tratamento da UB, baseadas na neutralização dos efeitos citotóxicos da micolactona. O trabalho experimental realizado no âmbito desta tese teve como objetivo contribuir para a compreensão da citopatogenicidade molecular da micolactona, focando-se na sua potente citotoxicidade. Para este fim, foram seguidas duas abordagens experimentais complementares: estudos in vitro em fibroblastos L929 de ratinho incubados com micolactona purificada e; estudos in vivo com um modelo experimental de UB, a infeção da almofada plantar de ratinho com M. ulcerans. Usando electroforese bidimensional, observámos alterações em vários reguladores e componentes do citoesqueleto, quer de actina quer de tubulina (Dync1i2, Cfl1, Crmp2, Actg1, Stmn1), em células L929 expostas à micolactona, fornecendo novas evidências moleculares para o impacto da micolactona sobre o citoesqueleto, que apresenta desarranjos de conformação, observados por imunofluorescência. Consistentemente, o nosso estudo da autofagia mostrou que a fusão autofagossoma-lisossoma, um processo dependente dos microtúbulos e do transporte mediado pela dineína, é inibida pela micolactona. Em concordância com a deficiência da dinâmica e funções do citoesqueleto em células expostas à micolactona, demonstrámos que ambas as proteínas BH3-only associadas ao citoesqueleto (BIM e BMF) são responsivas ao stress celular induzido pela micolactona, estando aumentadas em células L929 expostas à toxina purificada, bem como em almofadas plantares de ratinhos infectados com estirpe de M. ulcerans produtora de micolactona. Para além disso, o knockdown de Bim protege as células L929 da citotoxicidade induzida pela micolactona, demonstrando que a toxina desencadeia uma via apoptótica intrínseca mediada por BIM. O segundo maior grupo de proteínas com expressão diminuída em células L929 expostas à micolactona compreende enzimas modificadoras do colagénio (Plod1, Plod3, P4ha1) essenciais para a formação e estabilização das fibras de colagénio. Consistentes com um impacto da IX micolactona sobre a estabilidade das fibras de colagénio, análises in vivo no modelo murino de UB revelaram uma degeneração, dependente da micolactona, das fibras de colagénio na derme após a infecção com M. ulcerans. Globalmente, este trabalho fornece novos dados sobre o mecanismo citotóxico da micolactona, o fator chave da patogenicidade de M. ulcerans. Propomos, assim, que a micolactona induz alterações não funcionais do citoesqueleto, afetando as funções dependentes deste e, consequentemente, a homeostasia celular, desencadeando uma apoptose mediada por BIM. Para além disso, revelámos a ação da toxina do M. ulcerans sobre a biossíntese de colagénio. Os nossos resultados fornecem novas perspectivas sobre a patogénese da UB e abrem caminho para futuras abordagens terapêuticas.

Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde
Differential susceptibility to infection is dependent on the interaction between environmental and host genetic factors. Indeed, functional genetic diversity in the immune response has long been considered as having a dominant role in this inter-individual variation in susceptibility to infectious diseases, namely to mycobacterioses. Regarding Buruli Ulcer (BU), a necrotizing disease of the skin and subcutaneous tissue caused by Mycobacterium ulcerans infection, there is evidence supporting the role of host genetic variation in disease susceptibility. BU is a complex infectious disease, with several forms of phenotypic presentation. In endemic regions, where BU affects a high number of individuals, it is possible to indentify people that never developed disease, although it is believed that they have been in contact with M. ulcerans similarly to the affected individuals. Moreover, epidemiological data indicates that family history of BU is a risk factor for developing disease. Nevertheless, most of the studies on risk factors for BU have focused on the habits of individuals living in endemic environments, neglecting the influence of host genetics. In fact, only one study has evaluated the association of human genetic variability with susceptibility to BU development. Similarly to other mycobacterioses, the investigation of immune-related genetic polymorphisms may help to predict susceptibility to M. ulcerans infection. Therefore, we used a population-based candidate-gene approach, selecting mainly single nucleotide polymorphisms (SNPs) previously associated with other mycobacterioses, namely tuberculosis and leprosy. We genotyped 42 SNPs in 208 BU patients and 300 unrelated age/gender/water contact matched controls from Benin, of which 34 were in Hardy-Weinberg equilibrium. We observed that one SNP in the TNFA gene and another in PACRG gene were associated to an increased risk of BU development. Moreover, we evaluated the role of the 34 SNPs in the disease progression/severity within the affected population. One SNP in the IL12RB1 gene and two in the BCL2L11 gene, were shown to be associated with non-ulcerative types of lesion. In addition, we found that one SNP in the VDR gene was related with less severe forms of disease, while three other SNPs in the TLR4, NOD2 and IL10 genes were associated with the most severe types of lesion. Finally, two SNPs in the NOD2 gene were related with the presence of multiple lesions. Collectively, the results obtained with this study provided insights into mechanisms of pathogenesis and immune protection in BU and will ultimately help to develop more appropriate preventive strategies for individuals with an increased risk of developing BU.
A interação entre fatores ambientais e fatores associados ao hospedeiro determina a diversidade de suscetibilidade à infeção. De facto, a variabilidade genética na resposta imunológica tem sido considerada importante para esta diversidade interindividual de suscetibilidade a doenças infeciosas, nomeadamente micobacterioses. Em relação à Úlcera de Buruli (UB), uma doença necrotizante da pele e do tecido subcutâneo causada por Mycobacterium ulcerans, existem evidências do papel da genética do hospedeiro na suscetibilidade à doença. UB é uma doença infeciosa complexa, com diversas apresentações clínicas. Em regiões endémicas, onde os níveis da UB são elevados, é possível encontrar indivíduos que nunca desenvolveram a doença, apesar de contactarem com M. ulcerans da mesma forma que os indivíduos afetados. Além disso, dados epidemiológicos indicam que historia familiar de UB é um fator de risco para o desenvolvimento da doença. No entanto, a maioria dos estudos tem-se focado apenas nos hábitos das populações das regiões endémicas, negligenciando a influência da genética do hospedeiro como fator de risco. De facto, apenas um estudo avaliou a associação da variabilidade genética humana com a suscetibilidade a UB. Assim, a investigação de polimorfismos em genes do sistema imunológico poderá ajudar a prever a suscetibilidade à infeção por M. ulcerans. Para tal, utilizámos uma abordagem de genes candidatos com base populacional, selecionando SNPs (single nucleotide polymorphisms) anteriormente associados com outras micobacterioses, como tuberculose e lepra. Numa população Beninense composta por 208 casos de UB e 300 controlos, genotipámos 42 SNPs, dos quais apenas 34 estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Observámos que um SNP no gene TNFA e outro no gene PACRG estavam associados com suscetibilidade a UB. Avaliámos também o papel destes 34 SNPs no progresso da UB no decurso da infeção, constatando que um SNP no gene IL12RB1 e dois no gene BCL2L11 associavam com lesões não ulcerativas. E, enquanto um SNP no gene VDR se relacionava com lesões menos severas, outros três SNPs nos genes TLR4, NOD2 e IL10 associavam-se com o desenvolvimento de lesões mais severas. Por fim, observámos que a presença de lesões múltiplas estava relacionada com dois SNPs no gene NOD2. Em conjunto, os resultados obtidos neste estudo fornecem informação sobre os mecanismos de patogenicidade e proteção imunológica em UB, e poderão ainda ajudar a criar estratégias de prevenção mais apropriadas para os grupos com maior risco de desenvolver UB.
The financial support was given by a grant from the Health Services of Fundação Calouste Gulbenkian and by the European Community's Seventh Framework Program (FP7/2007-2013) under grant agreement N° 241500 (BuruliVac).

Dissertação de Mestrado em Saúde Comunitária
O envelhecimento acelerado em Portugal levanta inúmeras questões acerca do impacto sobre o sistema de saúde. As úlceras por pressão ainda constituem um importante desafio para os profissionais da saúde. Muito se tem discutido sobre as estratégias de prevenção e tratamento, nas populações de maior risco. Contudo, a informação ainda contínua escassa no âmbito do Cuidados de Saúde Primários. O presente estudo tem como objetivo determinar a natureza das relações entre o foco de atenção de enfermagem úlceras por pressão e outras variáveis, dos utentes associados ao programa de saúde dependentes, inscritos na Unidade de Cuidados de Saúde Personalizados de Murça. Optamos por um estudo com uma parte descritiva e uma parte correlacional, transversal e de abordagem quantitativa, no qual participaram 247 utentes dependentes. Para a colheita dos dados elaboramos um formulário, que foi preenchido com base na documentação do Sistema de Apoio à Prática de Enfermagem. Para o tratamento de dados recorremos ao programa estatístico Statistical Package for the Social Science (SPSS, versão 20.0). A maioria dos utentes dependentes (64,9%) é do sexo feminino, pertence à classe etária dos 85 e mais anos (42,1%), é viúvo (53,0%), o maior grupo reside na área geográfica de Murça (26,6%) e a maioria encontra-se não institucionalizado (73,3%), possuindo prestador de cuidados (64,4%). Quanto aos prestadores de cuidados, a maioria é do sexo feminino (83,0%), pertence à classe etária dos 20-64 anos (59,7%), é filho ou filha (36,5%) em termos de parentesco, é escolarizada (87,4%) e pertence à população não ativa (72,0%). A maioria dos dependentes está associada ao programa de saúde do Idoso (68,0%). O enunciado do diagnóstico de enfermagem Risco de úlcera por pressão foi identificado em 98,6% dos dependentes com foco de atenção de enfermagem úlceras por pressão. A prevalência de úlceras por pressão é de 4,0%. Verificamos ainda que em 39,5% dos dependentes foi prescrita a intervenção de enfermagem “Monitorizar risco de úlceras por pressão através da Escala de Braden. Quanto ao risco de úlceras por pressão 33,0% dos dependentes enquadra-se na classe de alto risco e 67,0% na classe de baixo risco. Constataram-se diferenças estatísticas significativas quanto ao grau de risco segundo a Escala de Braden, em que os dependentes com mais de 85anos apresentam maior proporção de alto risco, que os dependentes mais novos (2:p=0,048); os prestadores de cuidados, da classe etária dos 20 aos 64 anos, cuidam de dependentes que se enquadram mais na classe de alto risco da Escala de Braden (2:p=0,000), assim como os prestadores de cuidados escolarizados (2:p=0,032), pertencentes à população ativa (2:p=0,002) e os prestadores de cuidados que são filhos (2: p= 0,007). A subescala com maior % da variância explicada da pontuação total da Escala de Braden (74,5%) é a atividade e a menor é a nutrição (6,3%). Existe relação entre a idade e a pontuação total da Escala de Braden (Correlação de Pearson=-0,209; p=0,03). Os resultados obtidos permitem-nos afirmar que não existe integridade referencial de dados e que é possível melhorar o processo de documentação e a qualidade de cuidados prestados a estes utentes. Nesse sentido propusemos um guia orientador da condição clínica e decisão terapêutica na prevenção das úlceras por pressão.
The increasing aging in Portugal leads to many questions about the way it afects the health servisse. Pressure ulcers (PU) are a challenge to health professionals. Many things have been discussed in regards to prevent and treat them but the information needs to be shared within primary care. The objective of this study is to determine the nature of the relation between the nursing point of attention ‘Pressure ulcer’ and other variants of patients associated to the dependant health program in Murças’s Personalised Healthcare Unit. The study is divided in a descriptive and correlational part, transversal and quantitative involving 247 dependant patients. To collect information we put in place a form made by us and it was filled with data from Sistema de Apoio à Prática de Enfermagem. To process the collected data, we used the Statistical Package for the Social Science (SPSS, version 20.0). The majority of dependant patients (64.9%) is female, aged 85+ (42.1%), is widowed (53.0%), the largest group lives in Murça (26.6%) and the majority is not in a care home (73.3%) but has a carer (64.4%)- Regarding carers, most of them are females (83.0%), aged 20-64years old (59.7%), related to patient as son/daughter (36.5%), educated (87.4%) and not active (72.0%). The majority of the dependants is associated to the elderly health program (68.8%). The head of the nursing diagnosis ‘Risk of PU’ was acknoledged in 98.6% of the dependants with the nursing point of attention ‘PU’. The prevalence of PU is 4%. We have identified that 39,5% of the dependants had the nursing intervention ‘To monitor risk of PU’ with Braden Score (BS). 33.0% of the dependants are in high risk and 67.0% are in low risk of developing PU. There are significant statistic differences regarding the risk when using the BS, in which the +85 years old dependants present the bigger rate of high risk than the younger dependants (2:p=0,048); the carers aged 20-64years old take care of dependants that score high risk on the BS (2:p=0,000); the educated carers (2:p=0,032) belong to the active population (2:p0,002) and the carers that are related to the dependants (2: p= 0,007). The subscale with major % variance of the pontuation scored in the BS is ‘activity’ and the minor is ‘nutrition’. There is a relation between age and total pontuation of BS (Pearson Correlation). The results allow us to confirm that there is no referential integrity of data and that i tis possible to improve the documentation process and the quality of care. As such, we advise the use of an orientation guide of the clinical condition and therapeutical decison to prevent PU.

Дисертація присвячена вивченню клініко-генетичних аспектів одного з найпоширеніших стоматологічних захворювань – генералізованого пародонтиту (ГП). Результати обстеження хворих дозволили в залежності від наявності чи відсутності спадкової схильності встановити два варіанти клінічного перебігу даного захворювання: несприятливого та сприятливого. Різниця в клінічних варіантах даної патології підтверджена мікробіологічними та імунологічними дослідженнями. У роботі обгрунтовано роль генетичних факторів у виникненні і розвитку ГП. Доведено, що при даному захворюванні спостерігається сімейна агрегація захворювання із накопиченням ознак ГП серед родичів І ступеня спорідненості та переважною визначеністю його у осіб жіночої статі. Підтверджено мультифакторіальну модель успадкування ГП, у формуванні якої питома вага належить спадковим чинникам. Відмічені особливості розподілу імуногенетичних (антигенів систем АВО, HLA І класу) і дерматогліфічних показників у хворих на ГП та в залежності від спадкової обтяженості. На основі генетичних показників створено алгоритми прогнозування можливості виникнення та характеру перебігу ГП, визначено високу ефективність запропонованих критеріїв прогнозу захворювання. Розроблені та апробовані в клініці методи лікування ГП, який перебігає на тлі спадкової обтяженості. Встановлено, що використання вдосконалених діагностичного та лікувального комплексів знижує кількість рецидивів та дозволяє підвищити загальну ефективність терапії.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária
A presente dissertação faz uma abordagem parasitológica e terapêutica da habronemose cutânea (HC), também designada vulgarmente por “ferida de verão”. Esta doença é causada por nemátodes das espécies Draschia megastoma, Habronema muscae e H. microstoma. A prevalência destes parasitas no nosso país é elevada, e todos têm capacidade de causar doença nos equinos, podendo manifestar-se de distintas formas: gástrica, pulmonar, cutânea e conjuntival. Estes são parasitas de ciclo indireto que utilizam como hospedeiros intermediários ou vetores os muscídeos das espécies Musca domestica e Stomoxys calcitrans. Neste trabalho, pretendeu-se aprofundar na revisão bibliográfica, a etiologia da doença, epidemiologia e biologia dos parasitas, a patogenia nos equídeos, sinais clínicos e lesões mais frequentes, métodos de diagnóstico passíveis de serem utilizados, diferentes métodos de tratamento, profilaxia e controlo da afeção. Na componente experimental foram realizados inquéritos “online”, diferentes, a criadores e médicos veterinários, com o objetivo de perceber a importância e prevalência da doença no nosso país, descobrir quais os princípios ativos/associações mais utilizadas na desparasitação e definir quais as zonas corporais mais atingidas pelas lesões de HC. De acordo com os 26 resultados obtidos, concluiu-se que apenas 35% dos inquiridos admitem o aparecimento de feridas de verão anualmente, embora estudos recentes realizados em Portugal relatem o aparecimento frequente de parasitas do género Habronema no estômago de equinos. No entanto, de acordo com os inquéritos realizados, foi possível entender que esta realidade não é percebida por todos da mesma forma. Por parte dos criadores, 92% faz controlo de vetores nos estábulos, mas nos cavalos, apenas 67% utilizam medidas de controlo de muscídeos. No que respeita aos médicos veterinários, apenas 64% toma medidas para controlar os vetores nos estábulos e nos animais. A maior parte dos clínicos veterinários não utiliza os métodos adequados de diagnóstico da HC, nem realiza qualquer tipo de rastreio de forma a avaliar a eficácia dos anti-helmínticos utilizados na desparasitação dos animais. Os princípios ativos mais utilizados são a associação de ivermectina e praziquantel, e a ivermectina isolada. Dos clínicos, 71% faz rotação de fármacos, mas apenas 7% faz rastreio de resistência aos mesmos. Descrevem-se ainda dois casos clínicos. No primeiro, de um asinino acometido por HC, realça-se a importância da história clínica, a sua evolução ao longo de sete meses e o tratamento médico realizado. No segundo caso, de um cavalo com uma ferida de verão na região prepucial, aborda-se o tratamento cirúrgico deste tipo de lesões. Com os dados obtidos no inquérito e nos casos clínicos, considera-se que a HC continua a ser pouco conhecida ou considerada nos programas de controlo parasitário nas explorações, para além de promover um grande desconforto e redução de bem-estar animal, atendendo à gravidade e dificuldade da sua terapêutica. A consciencialização para esta parasitose de proprietários e médicos veterinários é imperativa, sendo de extrema importância realçar as formas de prevenção, tratamento e controlo da HC.
The present dissertation makes a parasitological and therapeutic approach of the horse cutaneous habronemosis (CH), usually called “summer sore”. This disease is caused by nematodes of the species Draschia megastoma, Habronema muscae and H. microstoma. The prevalence of these parasites is extremely high in Portugal and all are capable of causing disease in horses, with different locations: gastric, pulmonary, cutaneous and in conjunctive tissues. These parasites are of indirect life cycle, using flies of the species Musca domestica and Stomoxys calcitrans as intermediate hosts or vectors. In this work, it was intended to study, in the literature review, the etiology of the disease, the parasite’s epidemiology and biology, the equine’s pathogens, the clinical evidences and most commonly found lesions, methods of diagnosis and different forms of treatment, prophylaxis and control that can be used. In the experimental component we applied different online surveys to breeders and veterinarian doctors, in order to realize the importance and prevalence of the disease in Portugal, aiming to find out which drug or combination of drugs are mostly used in deworming and defining which parts of the horses’ body are largely hit by CH lesions. According to the 26 results obtained, we concluded that only 35% of the respondents admit the appearance of “Summer sores” every year, although recent studies conducted in Portugal report the frequent appearance of parasites of the genus Habronema in horse stomachs. However, according to the survey data, it was possible to understand that this reality is not perceived by everybody in the same way. Among the breeders, 92% make control of vectors in the stables but in horses, only 67% use measures of control for flies. With regard to veterinarians, only 64% take measures to control the vectors in the stables and animals. Most veterinarians used neither the appropriate diagnostic methods in the detection of CH, nor any kind of screening in order to evaluate the efficacy of anthelminthics used to deworm the animals. The most widely used active principles are associations of ivermectin and praziquantel, and isolated ivermectin.Among the veterinarians, 71% make rotation of drugs, but only 7% do any trace resistance to them. We also describe two clinical cases. In the first one, a donkey showing a chronic case of CH, we highlight the importance of the clinical history, the evolution of the process over a time span of seven months and the medical treatment carried out. In the second case, a horse with a “Summer sore” in the preputial region, the surgical treatment of these lesions is approached. With the data obtained in the surveys and the analysis of the clinical cases, it is considered that CH continues to be hardly known or considered in parasite control programs of the horse stud farms, and in addition it promotes great discomfort and reduction of animal welfare, due to its severity and difficulty of therapeutic. Awareness of this parasitic disease by breeders and veterinarians is imperative, being of utmost importance to emphasize ways of prevention, treatment and control of CH.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária
A pancreatite aguda é uma doença bastante frequente no cão (retirei o resto da frase). Apesar disso, vários aspetos desta doença continuam desconhecidos, nomeadamente alguns relacionados com a sua etiologia e fisiopatologia. A sua apresentação clínica é muito inespecífica e o diagnóstico é difícil. O tratamento é distinto para cada apresentação clínica e o prognóstico é muito variável. Assim, o objetivo deste trabalho foi o de consolidar e aprofundar os conhecimentos sobre a pancreatite no cão. Neste trabalho, foram acompanhados seis casos clínicos de pancreatite aguda no Hospital Veterinário do Baixo Vouga, durante o período de estágio curricular de 5 meses. Os animais foram acompanhados desde a primeira consulta, ao longo de todo o período de internamento e alta, tendo ainda sido monitorizados nos dias seguintes. Em todos os casos o motivo principal da consulta foi a anorexia, a presença de vómitos e/ou diarreia. A alimentação revelou ser um dado muito importante recolhido na anamnese, já que em todos os animais não era adequada, podendo ser o fator de risco e/ou etiológico da doença. Ao exame físico, o desconforto abdominal era evidente em todos os animais. Os resultados do hemograma e da bioquímica sérica não revelaram grandes alterações. Os únicos parâmetros bioquímicos que estavam aumentados em todos os animais foram as enzimas hepáticas. Também, todos os animais apresentaram a atividade sérica da lipase pancreática específica muito aumentada e em todos foram observadas alterações ecográficas sugestivas de pancreatite aguda (aumento de tamanho do pâncreas com bordos irregulares, parênquima pancreático hipoecogénico). A medição da atividade sérica da lipase pancreática específica, a realização de ecografia abdominal, revelaram ser fundamentais para a realização do diagnóstico. O tratamento, de um modo geral, foi semelhante em todos os animais, estando de acordo com o descrito na bibliografia.
Acute pancreatitis is a fairly common disease in dogs. However, several aspects of the disease remain unknown, including some related to the etiology and pathophysiology. Its clinical presentation is very nonspecific and the diagnosis is difficult. Treatment is different for each clinical presentation and prognosis varies widely. Thus, the aim of this study was to consolidate and deepen the knowledge of pancreatitis in dogs. In this study, six cases of acute pancreatitis were followed in Hospital Veterinário do Baixo Vouga during the internship period of 5 months. The animals were followed from the first appointment and throughout their hospital internment and discharge, as well as the following days. In all cases the main reason for consultation was anorexia, presence of vomiting and / or diarrhea. Diet was found to be a very important factor in the collected history, as in all animals was not appropriate, and may be a risk and/or etiological factor to the disease. On physical examination, abdominal discomfort was evident in all animals. The results of blood count and serum chemistries were inconclusive. The only biochemical parameters showed increased in all the animals were liver enzymes. Also, all animals showed an increased specific pancreatic lipase activity, and suggestive findings of acute pancreatitis (pancreatic size increased with irregular edges, hypoechoic pancreatic parenchyma) were observed in all ultrasounds. The measurement of serum activity of specific pancreatic lipase and fulfillment of abdominal ultrasound revealed to be essential to the diagnosis. Treatment was generally similar in all animals, according to the procedures described in the literature.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária
No presente estudo, investigou-se a ocorrência de dermatofitose em cães e gatos assintomáticos e sintomáticos. Este rastreio teve lugar nos dois locais de estágio e a colheita de amostras foi efetuada entre Dezembro 2016 e Maio de 2017. As amostras foram colhidas, através do método de Mackenzie, em dois locais diferentes (Portugal e Espanha) mas com clima muito semelhante em termos de pluviosidade e temperatura. Numa segunda fase foram registadas as frequências dos fungos saprófitas. O primeiro local de colheita foi o Hospital Veterinário do Baixo Vouga, concelho de Águeda e distrito de Aveiro, onde foram colhidas 29 amostras. No segundo local de colheita, o Hospital Veterinário Abros, concelho de Ourense, no Norte de Espanha, foram colhidas as restantes 71 amostras. Todos os cães e gatos até aos 3 anos de idade ou com sintomatologia clínica compatível com dermatofitose foram alvo do estudo, tendo sido escolhidos aleatoriamente. As amostras de pelos e escamas colhidas foram posteriormente inoculadas em meio DTM®, durante 4 semanas em condições de temperatura e humidade indicadas para este meio de cultura, e sujeitos a identificação macro e microscópica. Os dados relativos a cada animal foram registados através do preenchimento de um formulário. Dos 100 animais, 53 eram cães e 47 eram gatos, com predominância do sexo feminino (56%) e da faixa etária até ao 1 ano de idade (64%). 5% dos animais foram diagnosticados com dermatofitose subclínica, através do resultado positivo em meio DTM® e visualização microscópica das macroconídias. Quatro dos cinco animais positivos eram gatos, com idade inferior a 2 anos, e as espécies de dermatófitos encontradas foram: M. nanum em 2 gatos; M. canis em 1 gato e Trichophyton spp. em 1 cão e 1 gato. Das espécies de fungos saprófitas isoladas, 34% pertenciam ao género Penicillium; 16,5% ao género Acremonium; 15,3% ao género Mucor; 11,8% ao género Fusarium; 10,6% ao género Aspergillus; 2,4% ao género Trichoderma. Este estudo permitiu concluir que o método de Mackenzie parece ser uma ferramenta bastante útil no diagnóstico de animais assintomáticos.
In the present study, an occurrence of dermatophytosis in asymptomatic and symptomatic dogs and cats was investigated. This screening took place at two training places and sampling was performed between December 2016 and May 2017. The samples were collected using the Mackenzie method, in two different locations (Portugal and Spain) but with a very similar climate in terms of rainfall and temperature. In a second phasis, it was registered saprophytic fungi frequency. The first collection site was at the Hospital Veterinário do Baixo Vouga, municipality of Águeda and district of Aveiro, where 29 samples were collected. At the second collection site, Hospital Veterinario Abros, in the county of Ourense, northern Spain, the remaining 71 samples were collected. All the dogs and cats up to 3 years of age or with clinical symptoms compatible with dermatophytosis were the target of the study and were randomly selected. The samples of hair and scaling were then inoculated in DTM® medium for 4 weeks under conditions of temperature and humidity indicated for this culture medium and subjected to macro and microscopic identification. Data for each animal were recorded by completing a formulary. Of the 100 animals, 53 were dogs and 47 were cats, predominantly female (56%) and predominantly with a year-old of age (64%). 5% of the animals were diagnosed with subclinical dermatophytosis, through the positive result in DTM® medium and microscopic search of macroconidia. Four of the five positive animals were cats, with age less than 2 years, and the species of dermatophytes found were: M. nanum in 2 cats; M. canis in 1 cat and Trichophyton spp. in 1 dog and 1 cat. Of the species of isolated saprophytic fungi, 34% belonged to the genus Penicillium; 16.5% to the genus Acremonium; 15.3% to the genus Mucor; 11.8% to the genus Fusarium; 10.6% to the genus Aspergillus; 2.4% to the genus Trichoderma. This study allowed to conclude that the Mackenzie method seems to be a very useful tool in the diagnosis of asymptomatic animals.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária
A paratuberculose é uma infeção crónica causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map). As principais espécies afetadas são os ruminantes, provocando diarreia crónica e perda de condição corporal. Ao nível da exploração traduz-se em redução da produção leiteira e abate prematuro com redução do valor da carcaça. A principal via de infeção é a via feco-oral, estando mais suscetíveis a infeção os animais com menos de um ano de idade. Esta dissertação focou-se no diagnóstico e identificação fatores de risco da paratuberculose em explorações de bovinos da ilha de São Miguel no arquipélago dos Açores. Realizou-se o estudo de três casos, dois sobre o diagnóstico laboratorial de paratuberculose por métodos diretos e indiretos, e um de identificação de fatores de risco em explorações com casos confirmados de paratuberculose. A identificação de fatores de risco da paratuberculose foi feita através da aplicação de um inquérito. Foram inquiridas 11 explorações e foi avaliada a presença de 4 fatores de risco. “Contacto com fezes de adultos no pós-parto” foi identificado em 11 explorações. “Contacto com fezes de adultos antes do desmame” foi identificado em 3 explorações. “Contacto com fezes de adultos após o desmame” foi identificado numa exploração. “Movimento de animais entre explorações” foi identificado em 6 explorações. O diagnóstico laboratorial por métodos diretos foi feito através de cultura e PCR em tempo real IS900 sobre 72 amostras de fezes colhidas no matadouro e explorações da ilha. Por PCR todas as amostras tiveram resultado positivo. O método de cultura obteve isolamento de Map em 27 amostras, confirmadas posteriormente por PCR em tempo real f57. O diagnóstico laboratorial por métodos indiretos foi feito através de ELISA em amostras de sangue colhidas durante um rastreio a uma unidade epidemiológica. Foram rastreados 71 animais, dos quais 11 obtiveram resultado positivo. Calculou-se a seropositividade em 16% e a prevalência real em 27%. Foi diagnosticada paratuberculose e identificados fatores de risco em explorações espalhadas por toda a ilha. Esta continua, portanto, a ser uma problemática que requer a atenção do proprietário e veterinário responsável de forma a ser possível o seu controlo.
Paratuberculosis is a chronical infection caused by Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map). The main species affected by this disease are ruminants. It causes chronic diarrhea and loss of body weight. It produces loss of revenue in the form of reduced milk production and premature culling, with decreased culled cow weight. Transmission occurs mainly through the fecal-oral route, being more susceptible to infection animals less than a year old. This dissertation focused on diagnosis and identification of risk factors of paratuberculosis in bovine herds located in the island of São Miguel in the Azores. Three case studies were carried out, two on laboratory assisted diagnosis of paratuberculosis through direct and indirect methods, and one on the identification of risk factors in herds with confirmed cases of paratuberculosis. The identification of risk factors for paratuberculosis was done through a survey. Eleven herds were surveyed and it was evaluated the presence of four risk factors. “Contact with adult feces in the postpartum” was identified in 11 herds. “Contact with adult feces of pre-weaning animals” was identified in 3 herds. “Contact with adult feces of post-weaning animals” was identified in one herd. “Movement of animals between herds” was identified in 6 herds. Laboratory assisted diagnosis by direct methods was achieved through culture and real time PCR IS900 of 72 samples of feces collected in the slaughterhouse and herds of the island. In the PCR method, all samples had positive result. In the culture method, there was isolation of Map in 27 samples, confirmed afterwards by real time PCR f57. Laboratory assisted diagnosis by indirect methods was achieved through ELISA. The blood samples were collected during a screening of an epidemiological unit. Seventy-one animals were screened, of which 11 were positive to paratuberculosis. Seropositivity was 16% and the calculated real prevalence was 27%. Paratuberculosis was diagnosed and risk factors were found in herds from all around the island. This remains a problem requiring attention from the herd owner and veterinary responsible for it, so there can be a better control of the disease.