Literatura científica selecionada sobre o tema "Β-lactamases – Résistance aux antibiotiques"

La résistance bactérienne aux antibiotiques est devenue une préoccupation mondiale de santé publique. En effet, un usage massif et parfois inadapté de ces médicaments a conduit à l’émergence de nombreuses bactéries multirésistantes (BMR) qui se sont diffusées à travers le monde. Ces bactéries, responsables d’épidémies et d’infections de gravité variable, entraînent des impasses thérapeutiques souvent associées à un taux élevé de morbi-mortalité. Parmi celles-ci, certaines font l’objet d’une surveillance accrue : Enterococcus faecium résistant à la vancomycine (EfRV), Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM), entérobactérales productrices de β-lactamases à spectre étendu (E-BLSE) ou de carbapénémases (EPC), Pseudomonas aeruginosa ultra-/pan-résistant et Acinetobacter baumannii résistant à l’imipenème (ABRI). L’épidémiologie de ces bactéries est extrêmement variable d’une région du monde à l’autre. Certaines tendances épidémiologiques sont rassurantes : ainsi, la prévalence du SARM tend diminuer et celle de P. aeruginosa ultra-/pan-résistant reste relativement stable dans de nombreux pays. À l’inverse, l’évolution de certaines espèces est inquiétante en raison de leur forte prévalence dans des pays en particulier (EfRV) ou mondialement (E-BLSE) ou de leur diffusion rapide et massive (EPC, ABRI).

Background: AmpC or class C or group 1 beta lactamases are class C cephalosporinases that hydrolyse a wide variety of beta-lactam antibiotics including alpha methoxy beta-lactams (cefoxitin), narrow and broad spectrum cephalosporins. This study was conducted to characterize plasmid-mediated AmpC producing enteric Gram- negative bacteria from patients with lower respiratory tract infections in Obafemi Awolowo University Teaching Hospital Complex (OAUTHC) Ile Ife, Osun State, NigeriaMethodology: A total of 149 patients with clinical features of lower respiratory tract infections (LRTI) were selected by simple random sampling for the study. All Gram-negative isolates recovered from standard microbiological cultures of respiratory specimens of these patients were tested against cefoxitin, third generation cephalosporins (3GCs), and other antibiotics using the disc diffusion AST method, and also screened for production of AmpC beta-lactamases phenotypically by the CLSI method. Plasmid DNA extraction was carried out on twenty-nine cefoxitin-resistant selected isolates using the Kado and Lin method, while genotypic detection of plasmid-mediated AmpC gene was carried out by the polymerase chain reaction (PCR) assay.Results: The results showed that 204 (43.3%) of 471 isolates recovered from the 149 selected patients were resistant to 3GC in the AST assay, among which 121 (59.3%) were resistant to cefoxitin, and 189 of the 471 isolates (40.1%) were AmpC producers. The AmpC producers concurrently showed multiple resistance pattern to other antibiotics tested in this study. Ninety six percent of the 29 selected isolates for plasmid analysis contained plasmids, 45% of which amplified positive on PCR for CMY, 38% for FOX, and 31% for ACC types of AmpC genes.Conclusion: This study showed a high degree of antibiotic resistance among enteric Gram-negative bacteria recovered from patients with LRTIs, as well as high degree of plasmid-encoded AmpC genes responsible for this high antibiotic resistance among the isolates. Proper antibiotic policy and regulation are required to limit the spread of plasmid mediated AmpC β-lactamase producing organisms because they can lead to therapeutic failure in infected patients in the nearest future. French title: Caractérisation phénotypique et génotypique des bêta-lactamases AmpC à médiation plasmidique dans les bactéries entériques Gram-négatives de patients atteints d'infections des voies respiratoires inférieures dans un hôpital tertiaire, sud-ouest du Nigéria Contexte: Les bêta-lactamases AmpC ou de classe C ou de groupe 1 sont des céphalosporinases de classe C qui hydrolysent une grande variété d'antibiotiques bêta-lactamines, y compris les alpha-méthoxy bêta-lactamines (céfoxitine), les céphalosporines à spectre étroit et large. Cette étude a été menée pour caractériser les bactéries à Gram négatif entériques produisant de l'AmpC à médiation plasmidique chez des patients atteints d'infections des voies respiratoires inférieures du complexe hospitalier universitaire d'Obafemi Awolowo (OAUTHC) Ile Ife, État d'Osun, NigériaMéthodologie: Un total de 149 patients présentant des caractéristiques cliniques d'infections des voies respiratoires inférieures (LRTI) ont été sélectionnés par échantillonnage aléatoire simple pour l'étude. Tous les isolats à Gram négatif récupérés à partir de cultures microbiologique standard d'échantillons respiratoires de ces patients ont été testés contre la céfoxitine, les céphalosporines de troisième génération (3GC) et d'autres antibiotiques en utilisant la méthode AST de diffusion sur disque, et également criblés pour la production de bêtalactamases AmpC phénotypiquement par le Méthode CLSI. L'extraction de l'ADN plasmidique a été réalisée sur 29 isolats sélectionnés résistants à la céfoxitine en utilisant la méthode Kado et Lin, tandis que la détection génotypique du gène AmpC à médiation plasmidique a été réalisée par le test de réaction en chaîne par polymérase (PCR).Résultats: Les résultats ont montré que 204 (43,3%) des 471 isolats récupérés des 149 patients sélectionnés étaient résistants à la 3GC dans le test AST, parmi lesquels 121 (59,3%) étaient résistants à la céfoxitine et 189 des 471 isolats (40,1%) étaient des producteurs d'AmpC. Les producteurs d'AmpC ont montré simultanément plusieurs profils de résistance à d'autres antibiotiques testés dans cette étude. Quatre-vingt-seize pour cent des 29 isolats sélectionnés pour l'analyse des plasmides contenaient des plasmides, dont 45% amplifiés positifs par PCR pour CMY, 38% pour FOX et 31% pour les types ACC des gènes AmpC.Conclusion: Cette étude a montré un degré élevé de résistance aux antibiotiques parmi les bactéries entériques Gram-négatives récupérées chez des patients atteints de LRTI, ainsi qu'un degré élevé de gènes AmpC codés par plasmide responsable de cette résistance élevée aux antibiotiques parmi les isolats. Une politique et une réglementation appropriées en matière d'antibiotiques sont nécessaires pour limiter la propagation des organismes producteurs β-lactamase d'AmpC à médiation plasmidique car ils peuvent conduire à un échec thérapeutique chez les patients infectés dans un avenir proche.

Background: The extended-spectrum β-lactamase (ESBL) producing Enterobacteriaceae are a major cause of nosocomial bacteraemia. The objectives of this study are to describe the antibiotic resistance pattern of ESBL producing Enterobacteriaceae responsible for bacteraemia and identify factors associated with these infections in a University Hospital in Madagascar.Methodology: This is a descriptive cross-sectional study of 300 randomly selected patients with clinical features of bacteraemia whose blood cultures were processed for isolation and identification of bacterial pathogens over a period of six months (October 2019 to March 2020) at the laboratory of the University Hospital of Befelatanana. Blood culture samples were processed by conventional microbiological method for isolation of Enterobacteriaceae, which were identified to species level using Analytical Profile Index (API) 20E® test system. Antibiotic susceptibility of each isolate was performed by the disk diffusion technique and ESBL production was detected by the ‘synergy’ method.Results: Of the 300 patients, 54 were positive for bacteria, giving a prevalence rate of 18% for microbiologically documented bacteraemia. Of the 54 bacterial pathogens, Enterobacteriaceae isolates constituted 37 (68.5%), with 23 (42.6%) being ESBL producing and 14 (25.9%) non-ESBL producing isolates, 14 (25.9%) were staphylococci and 3 (5.6%) were streptococci isolates. All 23 (100%) ESBL producing Enterobacteriaceae isolates were resistant to amoxicillin, amoxicillin-clavulanic acid and the third generation cephalosporins (3GC), 19 (82.6%) to gentamycin and 18 (78.3%) to cotrimoxazole. On the other hand, the non-ESBL producing isolates were more sensitive because only 10 (71%) were resistant to amoxicillin, 7 (50%)to cotrimoxazole, 2 (14%) to amoxicillin-clavulanic acid, 1 (7.1%) to gentamycin, and none (0%) was resistant to 3GC. All 54 Enterobacteriaceae isolates were sensitive to amikacin and imipenem. Age less than 20 years (93.8%) (p=0.001) and hospitalization in intensive care units (90.9%) (p=0.04) were significant risk factors associated with infection by ESBL producing Enterobacteriaceae.Conclusion: ESBL producing Enterobacteriaceae responsible for bacteraemia in University Hospital of Befelatanana, Madagascar, are resistant to many classes of antibiotics. Carbapenems and amikacin are the antibiotics of choice. Keywords: ESBL, Enterobacteriaceae, bacteraemia, antibiotic resistance French Title: Prévalence et facteurs associés à la bactériémie à entérobactéries productrices de β-lactamases à spectre étendu dans l'hôpital universitaire de Befelatanana, Madagascar Contexte: Les entérobactéries productrices de β-lactamases à spectre étendu (BLSE) sont une cause majeurede bactériémie nosocomiale. Les objectifs de cette étude sont de décrire le profil de résistance aux antibiotiques des entérobactéries productrices de BLSE responsables de bactériémie et d'identifier les facteurs associés à ces infections dans un hôpital universitaire de Madagascar.Méthodologie: Il s'agit d'une étude transversale descriptive de 300 patients sélectionnés au hasard présentantdes caractéristiques cliniques de bactériémie dont les hémocultures ont été traitées pour l'isolement etl'identification des bactéries pathogènes sur une période de six mois (octobre 2019 à mars 2020) au laboratoiredu Hôpital universitaire de Befelatanana. Les échantillons d'hémoculture ont été traités par une méthodemicrobiologique conventionnelle pour l'isolement des entérobactéries, qui ont été identifiées au niveau del'espèce à l'aide du système de test Analytical Profile Index (API) 20E®. La sensibilité aux antibiotiques dechaque isolat a été réalisée par la technique de diffusion sur disque et la production de BLSE a été détectée parla méthode «synergie».Résultats: Sur les 300 patients, 54 étaient positifs pour les bactéries, ce qui donne un taux de prévalence de18% pour une bactériémie microbiologiquement documentée. Parmi les 54 bactéries pathogènes, les isolatsd'entérobactéries constituaient 37 (68,5%), 23 (42,6%) produisant des BLSE et 14 (25,9%) isolats neproduisant pas de BLSE, 14 (25,9%) étaient des staphylocoques et 3 (5,6%) l'étaient isolats de streptocoques.Les 23 isolats (100%) de BLSE produisant des Enterobacteriaceae étaient tous résistants à l'amoxicilline, àl'amoxicilline-acide clavulanique et aux céphalosporines de troisième génération (3GC), 19 (82,6%) à lagentamycine et 18 (78,3%) au cotrimoxazole. En revanche, les isolats non producteurs de BLSE étaient plussensibles car seuls 10 (71%) étaient résistants à l'amoxicilline, 7 (50%) au cotrimoxazole, 2 (14%) àl'amoxicilline-acide clavulanique, 1 (7,1%) à la gentamycine, et aucun (0%) n'était résistant à la 3GC. Les 54isolats d'Enterobacteriaceae étaient tous sensibles à l'amikacine et à l'imipénème. L'âge de moins de 20 ans(93,8%) (p=0,001) et l'hospitalisation en unité de soins intensifs (90,9%) (p=0,04) étaient des facteurs derisque importants associés à l'infection par les entérobactéries productrices de BLSE.Conclusion: Les entérobactéries productrices de BLSE responsables de bactériémie à l'hôpital universitaire deBefelatanana, Madagascar, sont résistantes à de nombreuses classes d'antibiotiques. Les carbapénèmes etl'amikacine sont les antibiotiques de choix. Mots clés: BLSE, entérobactéries, bactériémie, résistance aux antibiotiques

Background: The family Enterobacteriaceae belongs to the order Enterobacterales, a large diverse group of Gramnegative, facultatively anaerobic bacteria that sometimes cause multidrug-resistant infections which treatment options are often challenging. They are the leading cause of nosocomial bloodstream infection (BSI) and urinary tract infections (UTI). The objective of the study was to carry out a point-prevalence survey of antimicrobial resistance and carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE) clinical isolates in two hospitals in Kuwait and Nigeria.Methodology: Clinically significant bacterial isolates of patients from Kuwait and Nigeria, identified by VITEK-2 and MALDI-TOF mass spectrometry analysis were studied. Susceptibility testing of selected antibiotics was performed using E-test and broth dilution methods. Genes encoding carbapenemase, β-lactamases, and extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) were detected by conventional PCR and sequencing, and whole genome sequencing (WGS) analyses.Results: Of 400 isolates from Kuwait and Nigeria, 188 (47.0%) and 218 (54.5%) were Escherichia coli and 124 (31.0%) and 116 (29.0%) Klebsiella pneumoniae, respectively. The prevalence of CRE was 14.0% in Kuwait and 8.0% in Nigeria. The resistance rates of CRE isolates against colistin and tigecycline in Kuwait were 6.6% versus 25.0%, and in Nigeria were 14.2% versus 14.2%, respectively. blaOXA-181 gene was the commonest in CRE isolates in Kuwait and blaNDM-7 in Nigeria. The commonest ESBL gene among the CRE isolates was blaCTX-M-15 in both countries. AmpC resistance genes were present in only Kuwait isolates and mediated by blaEBC, blaCIT and blaDHA. WGS analysis of 12 selected CRE isolates with carbapenem MICs>32μg/ml but no detectable genes from conventional PCR, revealed the presence of multidrug efflux pump genes such as major facilitator superfamily antibiotic efflux pump and resistance-nodulation-cell division antibiotic efflux pump groups.Conclusion: The prevalence of CRE was higher among isolates from Kuwait than Nigeria and the genes encoding resistance in CRE were different. The presence of efflux pump was a main mechanism of resistance in most of the Nigerian CRE isolates. Contexte: La famille des Entérobactéries appartient à l'ordre des Entérobactéries, un grand groupe diversifié de bactéries anaérobies facultatives à Gram négatif qui provoquent parfois des infections multirésistantes dont les options de traitement sont souvent difficiles. Ils sont la principale cause d'infections nosocomiales du sang (BSI) et d'infections des voies urinaires (UTI). L'objectif de l'étude était de mener une enquête sur la prévalence ponctuelle de la résistance aux antimicrobiens et des isolats cliniques d'entérobactéries résistantes aux carbapénèmes (CRE) dans deux hôpitaux au Koweït et au Nigeria.Méthodologie: Des isolats bactériens cliniquement significatifs de patients du Koweït et du Nigéria, identifiés par analyse par spectrométrie de masse VITEK-2 et MALDI-TOF, ont été étudiés. Les tests de sensibilité des antibiotiques sélectionnés ont été effectués à l'aide des méthodes de test E et de dilution en bouillon. Les gènes codant pour la carbapénémase, les β-lactamases et les β-lactamases à spectre étendu (BLSE) ont été détectés par PCR et séquençage conventionnels et analyses de séquençage du génome entier (WGS).Résultats: Sur 400 isolats du Koweït et du Nigéria, 188 (47,0%) et 218 (54,5%) étaient Escherichia coli et 124 (31,0%) et 116 (29,0%) Klebsiella pneumoniae, respectivement. La prévalence de la CRE était de 14,0% au Koweït et de 8,0% au Nigeria. Les taux de résistance des isolats CRE à la colistine et à la tigécycline au Koweït étaient de 6,6% contre 25,0%, et au Nigeria de 14,2% contre 14,2%, respectivement. Le gène blaOXA-181 était le plus courant dans les isolats CRE au Koweït et blaNDM-7 au Nigeria. Le gène BLSE le plus courant parmi les isolats CRE était blaCTX-M-15 dans les deux pays. Les gènes de résistance à l'AmpC étaient présents uniquement dans les isolats du Koweït et médiés par blaEBC, blaCIT et blaDHA. L'analyse WGS de 12 isolats CRE sélectionnés avec des CMI de carbapénème >32 μg/ml mais aucun gène détectable par PCR conventionnelle, a révélé la présence de gènes de pompe d'efflux multidrogues tels que la pompe d'efflux antibiotique de la superfamille facilitatrice majeure et les groupes de pompe d'efflux antibiotique de division cellulaire de résistance-nodulation.Conclusion: La prévalence de la CRE était plus élevée parmi les isolats du Koweït que du Nigeria et les gènes codant pour la résistance à la CRE étaient différents. La présence d'une pompe à efflux était un mécanisme principal de résistance dans la plupart des isolats CRE Nigérians.

Background: The escalating issue of bacterial resistance is a profound universal peril. This looming crisis has evolved from a mere forecast to a tangible reality globally. Urinary tract infections (UTIs) significantly influence antibiotic prescriptions in primary care, thus crucially impacting the selective pressure and the emergence of antibiotic-resistant bacteria. A profound comprehension of the microorganisms involved in UTIs and their resistance patterns is crucial, particularly in Daloa city, Côte d’Ivoire. This research aims to review the antibiotic resistance profiles of uropathogens isolated from patients in the Regional Hospital Center (CHR) of Daloa, Côte d’Ivoire from January 2019 to December 2022. Methodology: This was a descriptive cross-sectional study of 1,513 patients whose voided urine samples were received at the Bacteriology-Virology Laboratory of CHR for cyto-bacteriological examination and aerobic culture using standard microbiological protocols over a period of 4 years. Bacterial isolates were routinely identified by colony morphology, Gram staining reaction and conventional biochemical tests. The antibiotic susceptibility of the bacterial isolates was determined by the agar diffusion method and interpreted following the Antibiogram Committee of the French Society of Microbiology (CASFM) guidelines. Results: Of the 1,513 patient urine samples examined, 246 (16.3%) were positive for microbial organisms, 216 (14.3%) were positive for significant bacterial isolates, 9 (0.6%) were positive for fungi, and 21 (1.4%) were positive for ova of Schistosoma haematobium. Among the samples with significant bacteriuria, 91.2% were due to Gram-negative bacilli, 5.9% to Gram-positive cocci, and 2.9% to Gram-negative cocci. Escherichia coli was the most predominant bacterial pathogen, accounting for 73.2% of the isolates. Antibiotic susceptibility testing showed high in vitro resistance of the bacterial isolates to tested antibiotics, with Enterobacteriaceae exhibiting resistance rate between 56.0% for nalidixic acid (NAL) and 67.0% for amoxicillin/clavulanic acid (AMC). Pseudomonas aeruginosa isolates exhibited 50.0% resistance rate to ceftazidime (CAZ), ciprofloxacin (CIP), and ticarcillin (TIC) while Staphylococcus isolates demonstrated 100.0% resistance rate to ofloxacin (OFX), clindamycin (CMN), erythromycin, trimethoprim/sulfamethoxazole (SXT), and fusidic acid (FA). The extendedspectrum beta-lactamase (ESBL)-producing isolates were identified in 15.1% of the Enterobacteriaceae. Conclusion: The high prevalence of antibiotic resistant bacterial isolates from significant bacteriuria in our study highlights the pressing need for the formulation and implementation of strategies to address this potential public health menace. The findings of our study may be useful for healthcare authorities to plan strategic interventions that will assist in optimizing the management of bacteriuria and UTI in the city of Daloa. French title: Profils de résistance aux antibiotiques des isolats bactériens uropathogènes dans la région du Haut-Sassandra, Côte d’Ivoire de janvier 2019 à décembre 2022 Contexte: Le problème croissant de la résistance bactérienne constitue un grave péril universel. Cette crise imminente est passée d’une simple prévision à une réalité tangible à l’échelle mondiale. Les infections des voies urinaires (IVU) influencent considérablement les prescriptions d'antibiotiques en soins primaires, ayant ainsi un impact crucial sur la pression sélective et l'émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques. Une compréhension approfondie des micro-organismes impliqués dans les infections urinaires et de leurs modèles de résistance est cruciale, en particulier dans la ville de Daloa, en Côte d’Ivoire. Cette recherche vise à examiner les profils de résistance aux antibiotiques des uropathogènes isolés chez les patients du Centre Hospitalier Régional (CHR) de Daloa, Côte d’Ivoire de janvier 2019 à décembre 2022. Méthodologie: Il s'agit d'une étude transversale descriptive portant sur 1513 patients dont les échantillons d'urine vidés ont été reçus au Laboratoire de Bactériologie-Virologie du CHR pour examen cyto-bactériologique et culture aérobie selon des protocoles microbiologiques standards sur une période de 4 ans. Les isolats bactériens ont été systématiquement identifiés par la morphologie des colonies, la réaction de coloration de Gram et les tests biochimiques conventionnels. La sensibilité aux antibiotiques des isolats bactériens a été déterminée par la méthode de diffusion sur gélose et interprétée selon les directives du Comité Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CASFM). Résultats: Sur les 1513 échantillons d'urine de patients examinés, 246 (16,3%) étaient positifs pour les organismes microbiens, 216 (14,3%) étaient positifs pour des isolats bactériens significatifs, 9 (0,6%) étaient positifs pour des champignons et 21 (1,4%) étaient positifs pour ovules de Schistosoma haematobium. Parmi les échantillons présentant une bactériurie significative, 91,2% étaient dus à des bacilles à Gram négatif, 5,9% à des coques à Gram positif et 2,9% à des coques à Gram négatif. Escherichia coli était le pathogène bactérien le plus prédominant, représentant 73,2% des isolats. Les tests de sensibilité aux antibiotiques ont montré une résistance in vitro élevée des isolats bactériens aux antibiotiques testés, les Enterobacteriaceae présentant un taux de résistance compris entre 56,0% pour l'acide nalidixique (NAL) et 67,0% pour l'amoxicilline/acide clavulanique (AMC). Les isolats de Pseudomonas aeruginosa présentaient un taux de résistance de 50,0% à la ceftazidime (CAZ), à la ciprofloxacine (CIP) et à la ticarcilline (TIC), tandis que les isolats de Staphylococcus présentaient un taux de résistance de 100,0% à l'ofloxacine (OFX), la clindamycine (CMN), l'érythromycine, le triméthoprime/ sulfaméthoxazole (SXT) et l'acide fusidique (FA). Les isolats producteurs de bêta- lactamases à spectre étendu (BLSE) ont été identifiés chez 15,1% des Enterobacteriaceae. Conclusion: La forte prévalence d'isolats bactériens résistants aux antibiotiques provenant d'une bactériurie importante dans notre étude souligne le besoin urgent de formuler et de mettre en œuvre des stratégies pour faire face à cette menace potentielle pour la santé publique. Les résultats de notre étude pourraient être utiles aux autorités sanitaires pour planifier des interventions stratégiques qui contribueront à optimiser la gestion de la bactériurie et des infections urinaires dans la ville de Daloa.

Background: Klebsiella pneumoniae is a bacterial pathogen commonly associated with severe nosocomial and community acquired infections especially through the acquisition of extended spectrum β-lactamases (ESβL) and biofilm formation capacity. The objectives of this study are to determine the prevalence of K. pneumoniae ESβL (KP-ESβL)-producing isolates in the Regional Military University Hospital of Oran (HMRUO) Algeria,characterize their antibiotic resistance profile, genetically detect blaTEM and blaCTX-M genes, and evaluate their biofilm formation capacity.Methodology: Different clinical specimens including blood, cerebrospinal fluids, urine and catheter, pus, perirectal abscess, and surgical wounds were collected from patients with suspected clinical infections in different units and departments of the hospital. The specimens were cultured on Blood, MacConkey and CLED agar (for urine only) plates and incubated aerobically for 24 hours at 37°C for preliminary identification of bacteria using conventional colony morphology, Gram stain reaction, and disk diffusion test for antibiotic susceptibility testing (AST). Confirmation of isolates, antibiogram, minimum inhibitory concentration (MIC) and detection of resistance phenotypes, were carried out by the automated Vitek 2 (BioMérieux) identification and susceptibility method. ESβL production was confirmed by the synergy and combination disk tests. ESβL genes were detected by conventional simplex PCR and biofilm formation was detected by the tissue culture plate (TCP) method.Results: A total of 630 patients’ clinical samples (one sample per patient) were processed. Klebsiella pneumoniae was isolated in 40 (6.3%) samples, and 15 of these (37.5%) produced ESβL. In the disk diffusion AST assay, all 40 K. pneumoniae isolates were resistant to ampicillin and ticarcillin while all 40 isolates were sensitive to cefoxitin, imipenem and ertapenem. KP-ESβL producing isolates were more frequently recovered from intensive care unit (33.3%) and from urine (46.7%) samples. Group 1 blaCTX-M genes were detected in 13 of the 15 (86.7%) KP-ESβL isolates, and 46.7% of these isolates were moderate biofilm producers.Conclusion: There is need for health departments to put in place preventative measures through regular surveillance of these resistant pathogens and initiating appropriate infection prevention and control strategies to limit their spread in Algerian hospitals and worldwide. Keywords: Klebsiella pneumoniae, ESβL, biofilm, PCR, antibacterial resistance French title: Klebsiella pneumoniae productrice de-lactamase spectre tendu dans l'hôpital universitaire militaire régional d'Oran, Algérie: résistance aux antibiotiques, formation de biofilm et détection desgènes blaCTX-M et blaTEM Contexte: Klebsiella pneumoniae est un pathogène bactérien communément associé aux infectionsnosocomiales et communautaires sévères, en particulier par l'acquisition de β-lactamases à spectre étendu(ESβL) et la capacité de formation de biofilm. Les objectifs de cette étude sont de déterminer la prévalence desisolats de K. pneumoniae producteurs de βLSE (KP-βLSE) au CHU d'Oran (HMRUO) Algérie, caractériser leurprofil de résistance aux antibiotiques, détecter génétiquement les gènes blaTEM et blaCTX-M, et évaluer leurcapacité de formation de biofilm.Méthodologie: Différents échantillons cliniques, y compris du sang, des liquides céphalo-rachidiens, de l'urinemictionnelle et du cathéter, du pus, des abcès périrectal et des plaies chirurgicales ont été prélevés despatients suspectés d'infections cliniques dans différentes unités et départements de l'hôpital. Les échantillonsont été cultivés sur des milieu de culture: deglose au sang, MacConkey et CLED (pour l'urine uniquement) etincubés en aérobie pendant 24heures à 37°C pour l'identification préliminaire des bactéries en utilisant lamorphologie conventionnelle des colonies, la coloration de Gram et le test de diffusion sur disque pour les testsde sensibilité aux antibiotiques (AST). La confirmation des isolats, l'antibiogramme, la concentration minimaleinhibitrice (CMI) et la détection des phénotypes de résistance ont été réalisés par la méthode automatiséed'identification et de sensibilité sur Vitek 2 (BioMérieux). La production de βLSE a été confirmée par les tests desynergie et de double disques. Les gènes de βLSE ont été détectés par PCR simplex conventionnelle et laformation de biofilm a été détectée par la méthode de la plaque de culture tissulaire (TCP).Résultats: Un total de 630 échantillons cliniques de patients (un échantillon par patient) ont été traités.Klebsiella pneumoniae a été isolé dans 40 échantillons (6,3%) et 15 d'entre eux (37,5%) ont produit des βLSE.Dans le test AST à diffusion sur disque, tous les 40 isolats de K. pneumoniae étaient résistants à l'ampicilline età la ticarcilline, tandis que les 40 isolats étaient sensibles à la céfoxitine, à l'imipénème et à l'ertapénème. Lesisolats producteurs de KP-βLSE ont été plus fréquemment récupérés dans les unités de soins intensifs (33,3%)et dans les échantillons d'urine (46,7%). Les gènes blaCTX-M du groupe 1 ont été détectés dans 13 des 15 isolatsde KP-βLSE (86,7%), et 46,7% de ces isolats étaient des producteurs de biofilm modérés.Conclusion: Il est nécessaire que les services de santé mettent en place des mesures préventives grâce à unesurveillance régulière de ces pathogènes résistants et à la mise en place de stratégies appropriées deprévention et de contrôle des infections pour limiter leur propagation dans les hôpitaux algériens et dans lemonde. Mots clés: Klebsiella pneumoniae, βLSE, biofilm, PCR, résistance antibactérienne

Background: The rising global emergence of Gram-negative bacteria (GNB) producing β-lactam hydrolysing enzymes in clinical infections constitutes a growing public health threat. This study investigated the occurrence of co-production of extended spectrum β-lactamase (ESβL), AmpC β-lactamases, and carbapenemases among GNB isolated from HIVinfected patients in two tertiary healthcare facilities in southwest Nigeria.Methodology: A total of 115 GNB isolates previously recovered from HIV-infected patients at the Obafemi Awolowo University Teaching Hospitals Complex, Ile-Ife, and the State Specialist Hospital, Akure, were investigated. The isolates were characterized to species level with the Microbact 24E kit and screened for ESβL production using the double-disc test (DDT) and combination disc methods, AmpC using modified Hodge test (MHT) and AmpC EDTA disc, and carbapenemase production using the MHT and EDTA disc test. Antibiotic susceptibility testing (AST) was performed by the Kirby-Bauer disc diffusion method.Results: A total of 15 species of GNB were characterized. The AST profile of the isolates revealed high resistance rates to ampicillin (94.5%), tetracycline (74.5%), sulphamethoxazole-trimethoprim (66.3%), and lowest resistance to imipenem (10.9%). Multi-drug resistance (MDR) was observed in 93.6% while 98.8% of ESβL, AmpC, and carbapenemase-producing isolates had multiple antibiotic resistance (MAR) indices ≥ 0.2. ESβL production was detected in 53.9%, AmpC in 20.9% and carbapenemase in 25.2% of the isolates. ESβL, AmpC or carbapenemase or co-production of two or all three enzymes was detected in 80 (69.6%) isolates, while only 10.0% produced all three enzymes.Conclusion: The isolation of MDR bacteria and isolates co-producing β-lactam hydrolysing enzymes in immunocompromised individuals portend grave consequences. Routine screening for these enzymes in MDR bacteria will be highly essential to guide the institution of appropriate antibiotic therapy and infection control measures. Keywords: ESβL, AmpC, carbapenemase, HIV, MDR, clinical isolates, MHT, DDST French Title: Coproduction d'ESβL, AmpC et carbapénémase dans des bactéries Gram-négatives multirésistantes de patients infectés par le VIH dans le sud-ouest du Nigéria Contexte: L'émergence mondiale croissante de bactéries à Gram négatif (GNB) produisant des enzymes d'hydrolyse de β-lactame dans les infections cliniques constitue une menace croissante pour la santé publique. Cette étude a examiné l'occurrence de la coproduction de β-lactamases à spectre étendu (ESβL), de β-lactamases AmpC et de carbapénémases parmi les GNB isolés de patients infectés par le VIH dans deux établissements de santé tertiaires du sud-ouest du Nigéria. Méthodologie: Un total de 115 isolats de GNB précédemment récupérés de patients infectés par le VIH au complexe hospitalier universitaire Obafemi Awolowo, Ile-Ife, et au State Specialist Hospital, Akure, ont été étudiés. Les isolats ont été caractérisés au niveau des espèces avec le kit Microbact 24E et criblés pour la production d'ESβL en utilisant le test à double disque (DDT) et les méthodes de disques combinés, AmpC en utilisant le test Hodge modifié (MHT) et le disque AmpC EDTA, et la production de carbapénémase en utilisant le MHT et test de disque EDTA. Le test de sensibilité aux antibiotiques (AST) a été effectué par la méthode de diffusion de disque de Kirby-Bauer Résultats: Un total de 15 espèces de GNB ont été caractérisées. Le profil AST des isolats a révélé des taux derésistance élevés à l'ampicilline (94,5%), à la tétracycline (74,5%), au sulfaméthoxazole-triméthoprime (66,3%) età la plus faible résistance à l'imipénème (10,9%). Une résistance à plusieurs médicaments (MDR) a été observéedans 93,6% tandis que 98,8% des isolats producteurs d'ESβL, AmpC et carbapénémase avaient de multiples indices de résistance aux antibiotiques (MAR) ≥ 0,2. La production d'ESβL a été détectée dans 53,9%, AmpC dans 20,9% et carbapénémase dans 25,2% des isolats. ESβL, AmpC ou carbapénémase ou la coproduction de deux ou des trois enzymes a été détectée dans 80 isolats (69,6%), tandis que seulement 10,0% ont produit les trois enzymes. Conclusion: L'isolement des bactéries MDR et des isolats co-producteurs d'enzymes d'hydrolyse des β-lactamines chez les individus immunodéprimés laisse présager de graves conséquences. Le dépistage systématique de ces enzymes dans les bactéries MDR sera très essentiel pour guider la mise en place d'une antibiothérapie appropriée et de mesures de contrôle des infections. Mots-clés: ESβL, AmpC, carbapénémase, VIH, MDR, isolats cliniques, MHT, DDST

Les ß-lactamines et les fluoroquinolones sont les principaux antibiotiques prescrits en thérapeutique. Récemment, deux nouveaux mécanismes de résistance ont été décrits : le gène plasmidique qnrA, qui code pour une protéine réduisant la fixation des fluoroquinolones sur leurs cibles et les céphalosporinases à spectre étendu qui hydrolysent davantage les oxyiminocéphalosporines. Au cours de ce travail, nous avons caractérisé plusieurs nouvelles céphalosporinases à spectre étendu, ce qui nous a permis d'identifier de nouvelles modifications structurales responsables de l'élargissement du spectre d'hydrolyse et de mettre en évidence la diversité génétique des gènes ampC dans l'espèce E. Coli. Nous avons également décrit l'émergence du gène qnrA en Europe, le rôle de son environnement génétique dans son expression, l'absence d'effet de QnrA sur l'activité bactéricide des fluoroquinolones, et l'origine de ce gène plasmidique présent naturellement dans le chromosome de Shewanella algae
ß-Lactams and fluoroquinolones constitute the most prescribed antibiotics used in therapeutics. Recently, two novel acquired mechanisms of resistance were described : the plasmid-borne qnrA gene, encoding a pentapeptide that prevents binding of fluoroquinolones on their targets, and the extended-spectrum AmpC ß-lactamases, which display an increased hydrolysis activity toward oxyiminocephalosporins. During this work, we have characterized several novel extended-spectrum cephalosporinases, mainly produced by Escherichia coli isolates, identified new structural modifications responsable for the extension of the hydrolysis spectrum and revealed the genetic diversity of the ampC genes in E. Coli. We have also described the emergence of the qnrA gene in Europe, the involvement of its genetic environment in its expression, the absence of effect of QnrA on the bactericidal activity of fluoroquinolones, and the origin of qnrA naturally present on the chromosome of Shewanella algae

Les béta-lactamines sont les antibiotiques préférentiellement utilisés contre les bactéries Gram négatif responsables d’infections. La dissémination mondiale d’organismes produisant des béta-lactamases à spectre élargi (BLSE) ou des carbapénémases est une préoccupation générale ainsi qu’une menace économique.Parmi ces organismes, les Entérobactéries jouent un rôle important dans les infections nosocomiales (ainsi que les infections communautaires pour E. coli). L’émergence et la dissémination d’Entérobactéries productrices de BLSE (E-BLSE), exprimant principalement des béta-lactamases de la famille des CTX-Ms, et dans une mesure plus inquiétante de carbapénémases (EPC), principalement les enzymes NDM, KPC, IMP, VIM et OXA-48, sont sans le moindre doute un problème de santé publique majeur.Les CTX-Ms hydrolysent les céphalosporines à large spectre et sont les BLSEs principalement rencontrées chez les Entérobactéries lors d’infections urinaires communautaires, mais aussi les bactériémies à E. coli qui peuvent en découler. Ces infections sévères sont traitées avec des carbapénèmes, considérés comme les antibiotiques de dernier recours. Malheureusement, leur utilisation croissante à soumis les entérobactéries à une pression de sélection conduisant à de plus en plus de souches montrant une sensibilité réduite aux carbapénèmes pouvant aboutir à un échec thérapeutique.Si l’on considère les possibilités de traitement limitées pour les E-BLSEs, que les EPCs sont souvent résistantes à plusieurs si ce n’est toutes les classes d’antibiotiques, et que pour certaines peu ou pas de traitements antibiotiques sont disponibles, leur rapide détection et identification sont essentielles. Des tests fiables sont nécessaires pour aider les cliniciens à, rapidement mettre en place des mesures de contrôle de ces infections, adapter les traitements antibiotiques et optimiser les stratégies de soins et leur issue favorable.Lors de la détection des E-BLSEs et des EPCs, il est aussi crucial d’identifier la béta-lactamase impliquée pour la mise en place d’une thérapie adaptée. Les méthodes basées sur la spécificité des anticorps sont sans aucun doute parmi les plus appropriées pour atteindre cet objectif.Pour répondre aux besoins actuels, les méthodes de détection des résistances ont antibiotiques doivent être peu coûteuses (coûts réduits des consommables et des équipements) et facile à mettre en place (technicité faible) pour l’utilisateur. C’est pourquoi nous avons décidé de développer des tests immunochromatographiques qui répondent parfaitement à ce cahier des charges. Pour atteindre cet objectif, nous avons produit des anticorps monoclonaux dirigés contre les CTX-Ms, et les familles de carbapénémases NDM, KPC, et OXA-48. Les tests immuno-chromatographiques correspondants ont été développés et validés. Nos tests sont robustes, facilement transférables dans une version commerciale et stables pour 24 mois sans réfrigération. Ils sont conviviaux, performants en termes de spécificité et sensibilité, et peu couteux, de 7€ (pour un mono-test) à moins de 15€ (pour un multiplex). De plus les résultats sont obtenus dans un court délai sans la nécessité d’un équipement particulier pour la lecture. Nous avons validé un mono-test pour la détection des CTX-Ms du groupe 1, et évalué la détection des groupes 1, 2, 8 et 9 directement dans des échantillons cliniques comme les hémocultures ou l’urine. Des mono-tests pour la détection des NDMs, KPCs et des OXA-48 et un multiplex pour la détection simultanée des cinq principales carbapénémases ont également été validés. Pour ce faire, nous avons utilisés 180 souches isolées sur boites, provenant du Centre National de Référence pour la résistance aux carbapénémases chez les Entérobactéries, dont le contenu en béta-lactamase est caractérisé
Beta-lactams are antibiotics preferentially used against gram-negative bacilli infections. The worldwide spread of extended spectrum beta-lactamases (ESBL) or carbapenemase-producing organisms is a global concern and also an economic threat.Within those organisms, Enterobacteriaceae have a major role as causes of nosocomial infections (and, for E. coli, also of community-acquired infections). The emergence and dissemination of ESBL-producing Enterobacteriaceae (ESBL-E), mainly expressing beta-lactamases from the CTX-M family, and in a worrier aspect of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae (CPE), mainly NDM, KPC, IMP, VIM and OXA-48 like enzymes, are undoubtedly a matter of great public health concern.CTX-Ms hydrolyze broad-spectrum cephalosporins and are the most encountered BLSE in Enterobacteriaceae, and CTX-Ms producers have been reported as the most prevalent ESBL producers in community-onset urinary tract infections (UTIs). Moreover, CTX-M-producing E.coli are a major cause of bloodstream infections that are often secondary to UTIs. These severe infections are treated with carbapenems, considered as last resort antibiotics. Unfortunately, their increasing use put a selective pressure on Enterobacteriaceae, leading to more and more strains showing decreased susceptibility to carbapenems and potentially leading to therapeutic failure.Considering the limited treatment options for ESBL-E and that CPE are often resistant to several if not all classes of antibiotics, and for which very few (or no) antibiotic options remain available, their rapid detection and identification are essential. Reliable tests are needed to help physicians, to quickly provide appropriate infection control measures, to adapt rapidly antibiotic treatment and optimize care strategies and outcomes.While detecting ESBL-Es or EPCs, it is also crucial to identify the implicated beta-lactamase for accurate therapy implementation. To do so, the antibody-specificity based methods are undoubtedly appropriate. To respond to the current needs, antimicrobial drug resistance detection methods must be cheap (reduced costs of consumables and equipment) and easy to use (reduced technical complexity) for the end user, and LFIAs respond to this requirements. Our objective was to develop such tests, and this led us to produce monoclonal antibodies against CTX-Ms, NDM, KPC, IMP, VIM and OXA-48 carbapenemase families and to develop and validate the corresponding LFIAs. Our tests are robust assays, easily transferable in a commercialized version, stable for more than 24 months without refrigeration, user-friendly (no requirement of trained staff), high performance (sensitive and specific), low cost, from 7€ (monotest) to less than 15€ (multiplex). Moreover, the detection results are obtained in short delay without the need for highly technical equipment for the readout.Here, we validated a LFIA for the detection of CTX-Ms (from group 1) and to a wider extent evaluated the direct detection of CTX-Ms from groups 1, 2, 8 and 9 in clinical samples such as blood culture and urine. Mono-tests to detect NDMs and OXA-48-like, and a multiplex for the simultaneous detection of the five main carbapenemases were also validated. These validations were conducted using 180 well characterized isolates in terms of their -lactamase content from the French National Reference Centre for carbapenem-resistant Enterobacteriaceae

Le phénomène de résistance des bactéries à Gram négatif aux antibiotiques est aujourd’hui un problème sanitaire mondial majeur. La production de β-lactamases, et plus particulièrement de carbapénémases, enzymes capables d’hydrolyser la plupart des agents antibactériens de la classe des β-lactames, est le mécanisme de résistance le plus répandu. Dans ce mémoire, nous décrivons la conception et la synthèse de nouveaux inhibiteurs fluorés de carbapénémases. Notre objectif a été la synthèse de monobactames trifluorométhylés en position C4.Nous avons développé une nouvelle voie de synthèse diastéréosélective par expansion de cycle d’aziridines pour l’accès à des 3-bromo-4-CF3-azétidin-2-ones. Ces composés ont été fonctionnalisés par substitution nucléophile, réactions radicalaires et organométalliques en position C3. Dans une seconde partie, des essais de cyclisation de β-hydroxyaminoesters et acides ainsi que de β-hydroxy-hydroxamates ont été entrepris. Pour obtenir ces intermédiaires β-hydroxyaminoesters et acides, nous avons étudié la réactivité des hydroxylamines sur des accepteurs de Michael trifluorométhylés.Enfin, l’évaluation biologique des composés a été réalisée par des tests enzymatiques en suivi par spectroscopie UV. L’évaluation par RMN 19F a également été entreprise, et a permis le développement d’outil de diagnostique et de screening, toujours en cours d’optimisation
Multidrug resistant gram-negative pathogens are emerging worldwide. β-lactamases production, especially carbapenemases, enzymes with broad hydrolytic capabilities towards β-lactams, is a global spread mechanism of resistance among gram-negative bacteria. We report here the design and the synthesis of new fluorinated inhibitors of carbapenemases. Our aim was to synthesize trifluoromethylated monobactams in C4 position. We have developed a new diastereoselective pathway by ring expansion of aziridines to access to 3-bromo-4-CF3-azetidin-2-ones. These compounds have been successfully functionalized in C3 position via nucleophilic substitution, radical and organometallic reactions.In a second part, cyclisation attempts of β-hydroxyaminoesters and acids, as well as β-hydroxy-hydroxamates have been conducted. A study of Michael addition of hydroxylamines on trifluoromethylated Michael acceptors have been achieved in order to obtain the β-hydroxyaminoesters and acids derivatives.Finally, biological evaluations of synthesized compounds have been realized through enzymatic tests. 19F NMR evaluation have been accomplished and led to development of diagnostic and screening tools, and it is still in under optimisation

Les β-lactamases de type AmpC (céphalosporinases) semblent fréquemment responsables de la résistance aux carbapénèmes chez les entérobactéries, ce que permettent d’évoquer de nombreuses descriptions cliniques. L’objectif de cette thèse était d’effectuer une caractérisation phénotypique, biochimique et moléculaire de l’activité carbapénémase des AmpC. Tout d’abord, les gènes des cinq principales céphalosporinases plasmidiques ont été clonés puis transformés dans la souche imperméable Escherichia coli HB4. Les comparaisons phénotypiques et structurales des clones recombinants ont montré que les céphalosporinases CMY-2, ACT-1, et DHA-1 se distinguent des autres enzymes par leur capacité à conférer une résistance aux carbapénèmes et par la présence d’une asparagine en position 346 (Asn 346), située à proximité du site catalytique. Des expériences de mutagénèse dirigée, consistant à substituer l'Asn 346 par des résidus de taille, de charge et de polarité différentes dans la céphalosporinase CMY-2, ont démontré le rôle de cet acide aminé dans l’activité carbapénémase des céphalosporinases. La caractérisation biochimique de trois variants a révélé que l'Asn 346 contribue à l’affinité de CMY-2 pour l'imipénème. L'étude de l’activité carbapénémase des AmpC chromosomiques à spectre étendu (ACSE) a constitué le second volet de la thèse. Le séquençage, le clonage et la caractérisation biochimique d'une nouvelle ACSE produite par une souche clinique de E. Coli résistante à l'ertapénème ont démontré que l'extension du spectre d'hydrolyse des céphalosporinases, qui est due à une augmentation de leur affinité, peut être aussi responsable d'une résistance aux carbapénèmes
Owing to several clinical reports, it appears that AmpC-type β-lactamases (cephalosporinases) account frequently for carbapenem resistance in Enterobacteriaceae. The aim of this study was to perform a phenotypic, biochemical, and molecular characterization of the carbapenem-hydrolyzing activity of AmpC-type β-lactamases. First of all, the genes encoding the five main plasmid-mediated AmpC β-lactamases were cloned and transferred into the porin-deficient Escherichia coli HB4 strain. Phenotypic and molecular comparison of the recombinant strains revealed that only CMY-2, ACT-1, and DHA-1 conferred resistance to carbapenems and had an asparagine residue at position 346 (Asn 346), located in the vicinity of the active site. Site-directed mutagenesis experiments were performed to replace the Asn 346 residue of CMY-2 β-lactamase by amino acids differing in size, charge, and polarity. It confirmed the contribution of Asn 346 to the carbapenem-hydrolysing activity of cephalosporinases. Biochemical characterization of three variants revealed that Asn 346 assisted the binding of imipenem. The analysis of the carbapenem-hydrolyzing activity of chromosomal extended-spectrum AmpC β-lactamases (ESAC) constitutes the second part of this thesis. Sequencing, cloning and biochemical characterization of a novel ESAC produced by an ertapenem-resistant E. Coli clinical isolate demonstrated that the extension of the hydrolysis spectrum of cephalosporinases, which was due to increased affinity, may also contribute to carbapenem resistance

La propagation de bactéries à Gram négatif multirésistantes aux antibiotiques représente un problème de santé publique majeur urgent à résoudre car le risque d’un retour à l’ère pré-antibiotique est réel. Parmi les modes de résistance existant, la production de métallo-B-lactamases (MBLs) responsables de l’inactivation des B-lactamines, la famille d’antibiotiques la plus utilisée, représente un challenge thérapeutique.Les travaux décrits dans ce manuscrit concernent la synthèse, la caractérisation et l’évaluation biologique de composés construits autour d’un cœur 2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazole-3-thione substitués en deux positions. En se basant sur des études de criblage in silico et des études cristallographiques ayant permis d’identifier ce noyau comme un bon candidat dans le développement d’inhibiteurs de MBLs, la synthèse de différentes séries d’analogues a été entreprise afin d’identifier de nouveaux inhibiteurs pouvant potentiellement atteindre les tests cliniques.Dans un premier temps, une série de composés 4-amino-1,2,4-triazole-3-thione substitués en position 5 a été préparée en suivant des voies de synthèse classiques. Différentes séries ont ensuite été développées en introduisant une diversité structurale et fonctionnelle en position 4. Ces composés ont ensuite été testés sur des enzymes représentatives des 3 sous-classes de MBLs et les plus intéressants ont été évalués sur bactéries résistantes recombinantes.Afin de réaliser une évaluation rapide des produits synthétisés au sein du laboratoire, une méthode de criblage à moyen débit en plaque 96 puits sur cinq MBLs représentatives a été mise au point et validée grâce à l’appui de nos collaborateurs spécialistes des MBLs
The spread of multiresistant Gram negative bacteria is a growing threat to public health and the risk of return to the pre-antibiotic era is real. Among existing resistance modes, the production of metallo-B-lactamases (MBLs) responsible of the inactivation of B-lactams, the most used family of antibiotics, represents a therapeutical challenge.This manuscript describes the synthesis, characterization and biological evaluation of compounds built on a 2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazole-3-thione scaffold substituted on two positions. Based on previous in silico screening and crystallographic studies, which identified this structure as a good candidate for MBLs inhibition, several series have been developed to found new inhibitors that could potentially be amenable to clinical development.First, 1,2,4-triazole-3-thione compounds substituted at position 5 have been prepared following classical pathways. Then, several series have been developed where the structural and functional diversity was introduced at position 4. Compounds have been tested on representative MBLs of the three sub-classes and the most interesting ones on recombinant resistant bacteria.To perform a rapid screening of compounds in the laboratory, a method of medium throughput screening inhibition tests on five MBLs performed in 96-wells plate has also been developed and validated during this study with the help of our collaborators specialists of MBLs

Les beta-lactamines (penicillines et cephalosporines) representent soixante pour-cent des antibiotiques administres. Le mecanisme majeur de resistance a ces antibiotiques est la production d'enzymes periplasmiques, les beta-lactamases, inactivant les antibiotiques par hydrolyse du cycle beta-lactame. La beta-lactamase tem-1 est tres largement repandue dans les differentes especes bacteriennes. Elle hydrolyse tres efficacement les penicillines, mais pas les cephalosporines de troisieme generation, et elle est sensible a l'inhibition par l'acide clavulanique. Cependant, elle evolue rapidement. La substitution d'un petit nombre d'acides amines peut lui permettre d'hydrolyser les cephalosporines, ou de devenir resistante aux inhibiteurs. Le mecanisme d'hydrolyse des substrats comprend une etape d'acylation de la serine catalytique par le cycle beta-lactame, puis une etape de deacylation liberant l'enzyme native et l'antibiotique degrade. Dans un premier temps, une methode de determination des constantes de vitesses elementaires d'acylation et de deacylation a ete mise au point, en couplant la spectrophotometrie et la spectrometrie de masse par ionisation electrospray. Dans un deuxieme temps, cette methode, combinee a l'etude cinetique classique, a permis la comparaison des vitesses d'hydrolyse des penicillines et des cephalosporines par l'enzyme sauvage et des mutants naturels. Cette demarche combinee a la determination cristallographique de la structure tridimensionnelle de mutants, et a la modelisation moleculaire, a partir de la structure de tem-1, a permis de mettre en evidence le role essentiel de la boucle omega, formant un cote du site actif, dans l'evolution de tem-1 vers l'hydrolyse des cephalosporines de troisieme generation. D'une facon similaire, l'etude cinetique de tem-1 et de mutants resistants a l'inhibition, la spectrometrie de masse, la modelisation moleculaire et le calcul electrostatique, ont ete combines afin de confirmer differentes hypotheses sur le mecanisme d'inhibition de tem-1, puis d'expliquer le mecanisme d'evolution de tem-1 vers la resistance a l'inhibition

Les espèces de Raoultella (anciennement Klebsiella). R. Planticola (Rp), R. Ornithinolytica (Ro) et R. Terrigena (Rt) sont difficilement différentiables phénotypiquement des espèces de Klebsiella en routine. Après avoir (i) clone les p-Iactamases des Raoultella (PLA, ORN et TER), (ii) déterminé le niveau d'identité entre elles (94% entre PLA et ORN et 78 % avec TER) et avec les autres p-lactamases de la classe A (70% avec TEM-1, 68% avec SHV-1 et 38% avec KOXY) et (iii) démontré des différences notables entre les activités enzymatiques de PLA et de TER tant entre elles qu'avec TEM-1, la place du gène bla pour l'identification de Rp et Ro a été évaluée sur une large collection d'isolats en comparaison aux gènes rpoB et ADNr 16S. Cette approche diagnostique a permis de découvrir que 70% des isolats Ro sont négatifs pour le test sur lequel a été fondé l'espèce Ro à savoir l'ornithine décarboxylase et que le gène bla via son analyse par RFLP permet de distinguer Ro de Rp sans ambiguïté
The three species of Raouliellu (formerly Klebsiella). R. Planticola (Rp), R. Ornithinolytica (Ro) and R. Terrigena (Rt) cannot be distinguished from the species of Klebsiella spp. By the tests used in the routine by microbiological laboratories. After having (i) cloned the p-lactamases of the 3 Raoultella species (PLA, ORN and TER), (ii) evaluated the percentage of identity between each other (94% between PLA and ORN, and 78% with TER) and with other class A P-lactamases (70% with TEM-1, 68% with SHV-1 and 38% with KOXY), and (iii) studied the p-lactamase activity of PLA and TER, the reliability of the bla gene for Rp and Ro identification was determined in comparison with that of the 16S rDNA and rpoB genes in 35 Raoultella spp. Isolates. This study allowed us to discover that 70% of the isolates identified as Ro were negative for the ornithine decarboxylase test, meaning negative for the biochemical character on which Ro definition was based, and to develop a new test, bla RFLP. To unambiguously identify Ro and Rp

L’augmentation des bactéries multirésistantes (BMR) aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique. Le premier objectif de la thèse a été de rechercher la présence, peu documentée, de BMR dans la communauté en Tunisie. Pour la première fois, nous isolons une Klebsiella pneumoniae de séquence type ST147 productrice de la carbapénèmase NDM-1 dans ce milieu, à Sfax. Nos données indiquent aussi une proportion inhabituellement élevée (47%) d’Escherichia coli produisant deux ß-lactamases à spectre élargi. Quatre d’entre eux, avec CTX-M-15 et CTX-M-27, se divisent en 2 souches clonales de type A-ST617 (2 isolats) et B2-ST131 subclade C2 (2 isolats). Toutes contiennent un plasmide avec la même combinaison allélique, F31:A4:B1 ; suggérant une possible dissémination de ce réplicon. Lors d’une autre étude (milieu communautaire, Djerba), une souche clonale Eh22 d’Enterobacter hormaechei multirésistante, contenant un plasmide conjugatif IncHI2 de 300 kpb, a été isolée chez 2 patients sans lien épidémiologique apparent. Le plasmide a été séquencé et montre la présence de différents gènes de résistance incluant 4 gènes codant pour des ß-lactamases (blaTEM-1, blaDHA-1, blaCTX-M-3 et blaSHV-12). Dans une seconde partie, nous avons étudié chez Eh22 la résistance à la colistine (CS), antibiotique de dernier recours. Après avoir sélectionné un mutant in vitro, nous avons montré pour la première fois, chez Enterobacter spp, que cette résistance pouvait être due à une mutation dans le gène codant pour MgrB, un régulateur négatif du système à 2 composants PhoQP qui permet la synthèse de groupements cationiques sur le lipopolysaccharide, cible de la CS. Dans une dernière partie, des molécules de type bactériocines actives sur les BMR ont été recherchées à partir d’une collection de Bacillus thurengiensis. L’une d’elle, BUPM103, inhibe la croissance de BMR. Une analyse in silico a permis d’identifier le gène d’une potentielle bacthuricine F103 (11 kDa) qui a été produite dans E. coli. Le surnageant de sécrétion filtré a montré une activité d’inhibition de la croissance de K. pneumoniae multirésistante, contrairement au contrôle (sans sécrétion). Cette bacthuricine recombinante pourrait constituer une alternative thérapeutique pour le traitement des BMR
The increase of multidrug-resistant bacteria (BMR) to antibiotics is a major public health problem. The first objective of the thesis was to search for the presence of BMR, poorly documented in the community in Tunisia. For the first time, we isolate a Klebsiella pneumoniae belonging to the sequence type ST147 producing carbapenemase NDM-1 in this setting, at Sfax. Our data also indicate an unusually high proportion (47%) of Escherichia coli producing committally two extended-spectrum ß-lactamases. Four of them, with CTX-M-15 and CTX-M-27, are divided into 2 clonal strains of type A-ST617 (2 isolates) and B2-ST131 subclade C2 (2 isolates). All contain a plasmid with the same allelic combination, F31: A4: B1; suggesting a possible dissemination of this replicon. In another study (community-based, Djerba), a multiresistant clonal strain Eh22 of Enterobacter hormaechei, containing a 300 kbp conjugative plasmid of IncHI2, was isolated from 2 patients without apparent epidemiological relationship. The plasmid was sequenced and shows the presence of different resistance genes including 4 genes encoding β-lactamases (blaTEM-1, blaDHA-1, blaCTX-M-3 and blaSHV-12). In a second part, we studied in Eh22, the resistance to colistin (CS), antibiotic of last resort. After selection of an in vitro mutant, we showed for the first time, in Enterobacter spp, that this resistance can be due to a mutation in the gene encoding MgrB, a negative regulator of the 2-component PhoQP system that allows the synthesis of cationic residues on lipopolysaccharide, target of CS. In the last part, bacteriocins-like molecules active on BMR were searched in a collection of Bacillus thurengiensis. One of them, BUPM103, inhibits the growth of BMR. The gene for a potential bacthuricin F103 (11 kDa) was identified by an in silico analysis and it was produced in E. coli. The filtered supernatant secretion showed a growth inhibitory activity against a multiresistant K. pneumoniae, in contrast to control (without secretion). This recombinant bacthuricine could constitute a therapeutic alternative for the BMR treatment