Teses / dissertações sobre o tema "Transition mitose"

La différenciation sexuelle est un mécanisme complexe, où une gonade indifférenciée, va se développer en testicule chez les mâles ou en ovaire chez les femelles. Le sexe chromosomique est à l'origine de la détermination sexuelle, en activant des voies de signalisation sexe-spécifique. Découvert en 1990, le gène SRY, présent sur le chromosome Y des mâles, est un gène qui a longtemps été décrit comme le régisseur de toute la différenciation sexuelle. En sa présence, les embryons XY se différencient en mâles, mais son absence est suffisante pour induire la différenciation femelle, « par défaut ». Or, la détermination du sexe est bien plus complexe, impliquant l'expression de nombreux gènes, dont les niveaux d'expression équilibrés activent la voie ovarienne et répriment simultanément la voie testiculaire ou vice versa. Le développement d'un ovaire ou d'un testicule repose sur la présence des cellules somatiques ainsi que des cellules germinales, les seules cellules capables de réaliser la méiose.La méiose, découvert en 1883, est également un événement dépendant de la détermination du sexe, étant donné qu'elle se produit pendant le développement embryonnaire chez la femelle, et en post-natal chez les mâles. Encore une fois, de nombreux gènes doivent être finement régulés pour l'initiation et le déroulement correct de la méiose. En effet, les cellules germinales prolifèrent activement, puis doivent perdre leur pluripotence et entrer en méiose chez les femelles, tandis qu'elles restent pluripotentes et rentrent en quiescence chez les mâles. Cette transition s'opère par un changement de programme génétique, qui n'est pas encore totalement compris.L'étude des différents acteurs régulant la différenciation sexuelle, autant au niveau somatique que germinale, est alors une priorité de mon équipe, spécialiste du développement gonadique embryonnaire.La méthylation en position 6 de l'adénine des molécules d'adénosine de l'ARN (m6A) est un mécanisme émergent et encore peu compris de la régulation de l'expression des gènes. Pourtant elle est la modification de l'ARN la plus courante et la plus conservée chez les eucaryotes, et son importance est soulignée par différentes pathologies résultant des dysfonctionnements de cette méthylation. A l'heure actuelle, elle est connue pour réguler des processus très variés comme des processus de métaboliques, de développement, de différenciation cellulaire ou de réponse au stress.C'est alors que nous avons décidé d'étudier le rôle de Wtap, un acteur du complexe de méthylation m6A, dans la détermination du sexe et la méiose. Mes recherches ont permis de comprendre dans un premier temps que Wtap est bien exprimé dans les différents types cellulaire de la gonade, et ce, pendant la fenêtre critique de la différenciation sexuelle. Dans un second temps, grâce à un modèle murin perte de fonction pour Wtap spécifiquement dans les cellules somatiques, nous avons pu montrer que ce gène est crucial pour la différenciation des cellules somatiques mâles et femelles. En effet, les cellules de Sertoli et de la granulosa semblent pour la majeure partie, bloquées dans un stade pré-cellules de soutient. Enfin, dans un dernier temps, cette fois ci avec un modèle murin permettant l'inactivation de Wtap dans les cellules germinales uniquement, nous avons également analysé une diminution de leur différenciation. Les cellules germinales ne sont plus totalement en capacité d'induire la méiose chez les femelles, et de rentrer en quiescence chez les mâles.Ces résultats indiquent que Wtap, est un acteur clé pour la régulation de la différenciation des cellules somatiques et germinales, autant chez le mâle que chez la femelle
Sexual differentiation is a complex mechanism where an undifferentiated gonad develops into a testis in males or an ovary in females. Chromosomal sex is at the origin of sexual determination, by activating sex-specific signaling pathways. Discovered in 1990, the Sry gene, found on the Y chromosome of males, has long been described as the regulator of all sexual differentiation. In its presence, XY embryos differentiate into males, but its absence is sufficient to induce female differentiation, “by default”. However, sex determination is far more complex, involving the expression of numerous genes, whose balanced expression levels activate the ovarian pathway and simultaneously repress the testicular pathway, or vice versa. The development of an ovary or testis relies on the presence of somatic cells as well as germ cells, the only cells capable of meiosis.Meiosis, discovered in 1883, is also a sex-determining event, as it occurs during embryonic development in females, and post-natal in males. Once again, many genes must be finely regulated for meiosis for correct initiation and progressing. Germ cells proliferate actively, then lose their pluripotency and enter meiosis in females, while they remain pluripotent and enter quiescence in males. This transition takes place by a change in the genetic program, which is not yet fully understood.The study of the various actors regulating sexual differentiation, at both somatic and germline levels, is therefore a priority for my team, which specializes in embryonic gonadal development.N6-methyladenosine (m6A) is an emerging and still poorly understood mechanism of gene expression regulation. Yet it is the most common and most conserved RNA modification in eukaryotes, and its importance is underlined by various pathologies resulting from dysfunctions of this methylation. It is currently known to regulate a wide variety of processes, including metabolism, development, cell differentiation and stress response.We therefore decided to investigate the role of Wtap, an actor in the m6A methylation complex, in sex determination and meiosis. Firstly, my research showed that Wtap is well expressed in different gonadal cell types during the critical window of sexual differentiation. Secondly, using a loss-of-function mouse model for Wtap specifically in somatic cells, we were able to show that this gene is crucial for the differentiation of male and female somatic cells. Indeed, most Sertoli and granulosa cells appear to be blocked in a pre-supporting state. Finally, using a mouse model in which Wtap is inactivated in germ cells only, we also analyzed a decrease in germ cell differentiation. Germ cells are no longer fully able to induce meiosis in females, and enter quiescence in males.These results indicate that Wtap is a key player in the regulation of somatic and germ cell differentiation in both males and females

Régulation de la transition Métaphase-Anaphase au cours de la mitose chez la drosophile Le checkpoint de métaphase détecte la présence des kinétochores non attachés et génère un signal inhibiteur de l’anaphase afin de permettre à tous les chromosomes d’établir un attachement bipolaire avec le fuseau. Ce mécanisme fait intervenir les protéines Mad et Bub et un complexe appelé RZZ (Rod-Zw10-Zwilch) qui n’a pas d’homologue chez la levure et qui fait l’objet de ma thèse. L’analyse in vivo chez la drosophile, du comportement des protéines RFP-Rod et GFP-Mad2 dans les neuroblastes larvaires en division, a montré que RZZ et Mad2 sont associées pendant presque toute la mitose et que RZZ est nécessaire pour le recrutement normal de Mad2 sur les kinétochores. En outre, l’étude phénotypique d’un mutant mad2 nul chez la drosophile, qui de façon surprenante pour un mutant du checkpoint, est viable et ne présente pas de défauts mitotiques, a suggéré que Mad2 et le checkpoint de métaphase ne sont pas essentiels pour le déroulement normal de la mitose chez la drosophile
Le checkpoint de métaphase détecte la présence des kinétochores non attachés et génère un signal inhibiteur de l’anaphase afin de permettre à tous les chromosomes d’établir un attachement bipolaire avec le fuseau. Ce mécanisme fait intervenir les protéines Mad et Bub et un complexe appelé RZZ (Rod-Zw10-Zwilch) qui n’a pas d’homologue chez la levure et qui fait l’objet de ma thèse. L’analyse in vivo chez la drosophile, du comportement des protéines RFP-Rod et GFP-Mad2 dans les neuroblastes larvaires en division, a montré que RZZ et Mad2 sont associées pendant presque toute la mitose et que RZZ est nécessaire pour le recrutement normal de Mad2 sur les kinétochores. En outre, l’étude phénotypique d’un mutant mad2 nul chez la drosophile, qui de façon surprenante pour un mutant du checkpoint, est viable et ne présente pas de défauts mitotiques, a suggéré que Mad2 et le checkpoint de métaphase ne sont pas essentiels pour le déroulement normal de la mitose chez la drosophile

Thesis (Ph. D.)--Hong Kong University of Science and Technology, 2003.
Includes bibliographical references (leaves 242-266). Also available in electronic version. Access restricted to campus users.

La proteina umana Yap è un co-fattore trascrizionale ed è stata di recente oggetto di molti studi per la sua capacità di interagire con molti fattori di trascrizione. Questa capacità ha condotto molti ricercatori a fornire diverse interpretazioni sulla sua funzione, descrivendola sia come una proteina con attività onco-soppressiva, e sia come un fattore oncogenico. Inoltre, recenti studi hanno indicato un suo ruolo nella differenziazione cellulare e nella regolazione della dimensione di organi, in particolare del fegato. Tuttavia, il ruolo di questa proteina nella regolazione del ciclo cellulare è rimasto finora elusivo. Con il lavoro svolto durante il periodo di dottorato e riportato di seguito, mostriamo che Yap viene fosforilata in mitosi e forniamo alcune indicazioni su un suo possibile ruolo in questa fase del ciclo. In particolare, abbiamo notato che la proteina viene de-fosforilata prima dell’uscita dalla mitosi suggerendo un suo ruolo come co-fattore nella trascrizione nell’imminente nuovo ciclo cellulare, e abbiamo quindi fornito le basi per un indagine più approfondita di tale evento.
Yap is a small protein that acts as a co-activator of transcription. It has been shown to interact with many and diverse transcription factors and as a result of these promiscuous interactions, Yap has been described to have a role in many cellular events, including apoptosis, proliferation, and differentiation. For this reason, it is described to have a role both in tumor suppression and transformation. However, the function of Yap in the regulation of the cell cycle has not been investigated so far. Here we demonstrate that Yap is phosphorylated at the G2/M, both in physiologic mitotic cells and in cells arrested in mitosis by microtubules-targeting drugs. We show that Yap is not recruited onto the chromatin during mitosis and does not localize to any mitotic organelles. In addition, we have noticed that de-phosphorylation of Yap occurs before the entry into G1. These data give an indication that Yap may have a role in the exit from mitosis, and place a solid foundation for characterizing the function(s) of Yap during this event.

Thesis (Ph. D.)--Case Western Reserve University, 2005.
[School of Medicine] Department of Environmental Health Sciences. Includes bibliographical references. Available online via OhioLINK's ETD Center.

Aperçu du contrôle de la dégradation des ARNm par les protéines YTHpendant la transition de la méiose à la mitose chez les levures.Le cycle cellulaire est contrôlé par des processus complexes et interconnectés. Un gène est transcrit en ARNm qui est traduit en protéines mais de nombreux processus de régulation travaillent pour contrôler chaque étape de ce processus apparemment simple. Parmi ces points de contrôle, la régulation post-transcriptionnelle est importante, et la formation d'un complexe protéine-ARN peut diriger le destin cellulaire. Parmi ces protéines de liaison à l'ARN, les protéines contenant des domaines YTH n’ont été découvertes qu’à la fin des années 90. Les protéines contenant des domaines YTH sont abondantes chez les eucaryotes et absentes chez les procaryotes. Elles constituent la majorité des protéines « readers » capables de reconnaître spécifiquement la modification m6A. L’Homme possède cinq protéines YTH, YTHDF1-3, YTHDC1,2 (Hazra, D., C. Chapat, et Graille, M. (2019). Destin de l'ARNm de m6A : enchaînés au rythme par les protéines contenant de la YTH. , 10 (1), 49.). Bien qu'il soit évident que ces protéines contrôlent le destin cellulaire, la fonction de chaque protéine et son réseau d’interaction restent à élucider. Chez les levures, une seule protéine YTH est présente: Pho92 chez Saccharomyces cerevisiae et Mmi1 chez Schizosaccharomyces pombe. Hormis le domaine YTH, il n'y a pas d'homologie de séquence entre ces deux protéines mais leur fonction cellulaire est similaire.Il est bien établi que Mmi1 est responsable de la dégradation des transcrits spécifiques de la méiose au cours de la croissance végétative des cellules chez la levure S. pombe. Mmi1 forme un complexe stable avec une petite protéine, Erh1 (complexe Erh1-Mmi1 ou EMC). Le complexe EMC peut physiquement interagir avec la sous-unité Not1 du complexe CCR4-Not et la recruter pour la dégradation des ARNm contenant des motifs DSR (déterminant de l'élimination sélective). L'action de Mmi1 est à son tour régulée par une protéine possédant un domaine RRM, Mei2. Au cours de la méiose, Mei2, avec l’aide d’un lncRNA meiRNA, séquestre Mmi1 dans un point nucléaire, le rendant inactif et assurant la continuité de la méiose. Ces trois protéines, Mmi1-Erh1-Mei2, jouent un rôle clé dans la transition de la mitose vers la méiose.Chez S. cerevisiae, Pho92 est impliquée dans la dégradation des transcrits de PHO4, contribuant à la voie du métabolisme du phosphate, pendant la privation en phosphate et participe également à la dégradation des ARNm contenant les marques épitranscriptomiques de N6-méthyladénosine (m6A). Comme pour S. pombe Mmi1, Pho92 recrute le complexe CCR4-Not via une interaction physique avec Not1.Au cours de ma thèse, j'ai tenté d'élucider le rôle de ces deux protéines du domaine YTH de deux organismes modèles, S. cerevisiae et S. pombe, dans la dégradation de l'ARNm et la régulation du cycle cellulaire par des approches biochimiques et structurales.Pho92 de S. cerevisiae interagit physiquement avec Not1 du complexe CCR4-Not, nous avons pu déterminer les limites des domaines impliqués dans cette interaction. L’interaction entre ces deux protéines a été étudiée par anisotropie de fluorescence. Le complexe protéique a été purifié avec succès et des essais de cristallisation sont en cours.Chez S. pombe, la structure de Mei2-RRM3 a été résolue avec et sans ARN. Les propriétés de liaison à l'ARN de Mei2-RRM3 ont été étudiées par ITC. La structure de Erh1 a également été résolue révélant une organisation en homodimere. Nous avons montré que la formation de cet homodimere est important pour la fonction biologique de Mmi1. Des essais de co-cristallisation ont été réalisés avec de l'ARN et les protéines Mmi1 et Mei2, mais sans succès et nous avons obtenu des cristaux de Mmi1
Insights into the control of mRNA decay by YTH proteinsduring the transition from meiosis to mitosis in yeasts.Keywords: Epitranscriptomics, mRNA decay, meiosis, multi-protein complexes, YTH domainCell cycle is controlled by multi-layered processes. A gene is transcribed in mRNA which is translated in proteins but innumerable regulation processes are working to control every step of this apparently simple process. Among these regulatory check points, post-transcriptional regulation is an important one, where formation of a protein-RNA complex may direct the cellular fate. Among these RNA binding proteins, YTH domain proteins are most novel, discovered in late 90s. YTH domain proteins are abundant in eukaryotes and absent in prokaryotes. YTH domain proteins constitute the majority of reader proteins that can specifically identify m6A modification. Human beings have five YTH domain proteins YTHDF1-3, YTHDC1-2 (Hazra, D., Chapat, C., & Graille, M. (2019). m6A mRNA Destiny: Chained to the rhYTHm by the YTH-Containing Proteins. Genes, 10(1), 49.). Although it is evident that these proteins are controlling cellular fate, the function of each protein and their network is yet to be elucidated. In yeast, there is only one YTH domain protein present: Pho92 in Saccharomyces cerevisiae and Mmi1 in Schizosaccharomyces pombe. Apart from the YTH domain there is no sequence homology between these two proteins but their cellular function is similar.It is well established that Mmi1 is responsible for degradation of meiosis specific transcripts during vegetative growth of the cell. Mmi1 forms a tight complex with a small protein, Erh1 (Erh1-Mmi1 complex or EMC). EMC can physically interact with Not1 of CCR4-Not complex and recruit it for degradation of DSR (determinant of selective removal) containing RNAs. The action of Mmi1 is in turn regulated by an RRM domain protein, Mei2. During meiosis, Mei2, along with a lncRNA meiRNA sequesters Mmi1 in a nuclear dot, rendering it inactive and ensuring smooth continuance of meiosis. These three proteins, Mmi1-Erh1-Mei2 play a key role in mitosis to meiosis switch.In S. cerevisiae, Pho92 is involved in the degradation of PHO4 transcripts contributing to phosphate metabolism pathway, during phosphate starvation and also participates in the degradation of mRNAs containing the N6-methyladenosine (m6A) epitranscriptomics marks. Similarly, to S. pombe Mmi1, Pho92 recruits CCR4-Not complex by physical interaction with Not1.During my PhD, I have tried to elucidate the role of these two YTH domain proteins from two model organisms, S. cerevisiae and S. pombe, in mRNA degradation and cell cycle regulation using biochemical and structural approaches.Pho92 of S. cerevisiae physically interacts with Not1 of CCR4-Not complex, we were able to determine the boundaries of this interaction. The interaction between these two proteins was studied by Fluorescence anisotropy. The protein complex was successfully purified and crystallization trials are ongoing.From S. pombe, structure of Mei2-RRM3 was solved with and without an RNA. RNA binding properties of Mei2-RRM3 was studied by ITC. The structure of Erh1 was also solved and we tried to elucidate its importance for biological function of Mmi1. A co-crystallization trial was performed with Mmi1-Mei2-RNA but it was unsuccessful and we ended up with Mmi1 crystals

Lors de la transition G2/M des ovocytes de Xénope, la voie p39Mos-MEK1-MAPK présente des propriétés dynamiques et physiques particulières telles que l’ultrasensibilité, la bistabilité, l’irréversibilité et un caractère ‘tout-ou-rien’. Ces propriétés sont considérées dans le contexte de la boucle de rétroaction positive qui existe au sein de cette voie. L’objectif de cette thèse s’est focalisé sur le rôle de l’oncoprotéine p39Mos et le recrutement des motifs de régulation qui permettent l’apparition de ces propriétés. Des approches expérimentales et in silico ont été menées pour réaliser une modélisation physiquement et biologiquement réaliste de ce réseau. Le modèle développé tient compte de l’influence du MPF sur l’accumulation de p39Mos et ajuste le rôle de la boucle de rétrocontrôle positif. Par ailleurs, nous avons pu mettre en évidence que p90Rsk, cible des MAPK, est dégradée. La voie MAPK a été activée en absence de p39Mos. Nos résultats montrent que la 1,10 Phénanthroline monohydrate (1,10-PA) active les MAPK suivant une réponse graduelle et ultrasensible. L’action de la 1,10-PA s’exerce en absence de synthèse protéique et de toute boucle de rétrocontrôle, et nous avons émis l’hypothèse que la 1,10 PA agit via l’inactivation d’une MEK-phosphatase. Dans ce contexte, un modèle de pro-action est discuté et des inhibiteurs de phosphatases ont été utilisés pour activer les MAPK en absence de p39Mos. Nos résultats discutent du rôle de la boucle de rétroaction positive dans l’activation des MAPK et montrent que l’ultrasensibilité de réponse des MAPK peut être générée par des motifs de régulation de type pro-action
During G2/M transition in Xenopus oocyte, p39Mos-MEK1-MAPK cascacade harbors specific dynamic and physical properties, such as ultrasensitivity, bistability, irreversibility, and all-or-none responses. These properties are generally considered in the context of the positive feedback loop that embeds the p39Mos-MEK1-MAPK pathway architecture. The objective of this work was focused onto p39Mos oncoprotein and regulation motifs recruitment enabling together the generation of such properties. Both experimental and in silico approaches were undertaken in order to yield a realistic modelisation, physically and biologically relevant for this network. We developed a model that takes into account the influence of MPF onto p39Mos accumulation, and adjusts the role of the positive feedback loop. Also, we were able to show that p90Rsk, target of MAPK, was degraded. This signaling pathway was activated in the absence of p39Mos. Our results show that 1,10 Phénanthroline monohydrate (1,10-PA) is able to induce gradual and ultrasensitive MAPK activation. 1,10-PA action is then exerted in the absence of protein synthesis and positive feedback loop. In this context, a feed forward loop model can be considered, and phosphatase inhibitors were used for MAPK activation in the absence of p39Mos. Our results confront the role attributed to the positive feedback loop in MAPK activation, and show that this ultrasensitive response may be generated in vivo through feed forward regulation motifs

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2005.
Title from first page of PDF file. Document formatted into pages; contains xi, 196 p.; also includes graphics. Includes bibliographical references (p. 195-196). Available online via OhioLINK's ETD Center

STAUFEN1 (STAU1) est une protéine de liaison à l’acide ribonucléique (ARN) double brin jouant un rôle important dans le contrôle post-transcriptionnel de nombreux ARN messager (ARNm). Sa déplétion diminue la prolifération des cellules non cancéreuses en altérant les transitions G1/S et G2/M. En revanche, Ceci n’a aucun impact sur la prolifération des cellules tumorales. La déplétion de STAU1 module le niveau d’expression des transcrits et/ou des protéines impliquées dans la régulation des points de contrôle des transitions de phase. Notamment, STAU1 module le niveau d’expression de la protéine CDK4 ainsi que l’abondance de l’ARNm E2F1, deux régulateurs indispensables de la transition G1/S. Le transcrit de ces deux gènes possède un site de liaison à STAU1 ou STAU1 binding site (SBS) dans la région codante ou coding sequence (CDS) et dans la région non codante en 3’ (3’UTR), respectivement. Cependant, l’importance de la liaison de STAU1 à ces transcrits n’a pas encore été étudiée. Étonnamment, la sensibilité des cellules non tumorales et tumorales à l’expression de STAU1 est inversée lors de la surexpression de STAU1. En effet, sa surexpression altère l’entrée en mitose des cellules cancéreuses et diminue leur prolifération, alors qu’elle n’a aucun effet sur la prolifération des cellules non tumorales. Lors de la mitose, STAU1 s’associe au fuseau mitotique (FM), ce qui lui permet de localiser des ARNm et de contrôler leur séquestration et/ou leur traduction locale. Cependant, le mécanisme qui permet à STAU1 de lier le FM est encore inconnu. Pour ce mémoire, nous avons donc poursuivi deux objectifs. Le premier but est de comprendre la régulation post-transcriptionnelle médiée par STAU1 des transcrits essentiels à la transition G1/S chez les cellules non tumorales. Notre hypothèse est que STAU1 par sa liaison directe à ses transcrits cibles via le SBS module leur expression. Pour ce faire, des cellules de type sauvage ou déplétées en STAU1 étaient transfectées par des plasmides exprimant les transcrits de CDK4 et d’E2F1 contenant un SBS endogène ou muté de telle sorte qu’il ne reconnait plus STAU1. L’expression des protéines CDK4 et E2F1 est dosée par un essai luciférase ou un immunobuvardage de type western ou western blot (WB). Nous avons observé que STAU1 régule négativement et positivement l’expression endogène de CDK4 et d’E2F1, respectivement, ce qui contribue au passage de la transition G1/S, donc à la prolifération cellulaire non tumorale. Les essais luciférases ont confirmé le rôle de STAU1 dans la régulation positive d’E2F1 lorsque liée au SBS dans le 3’UTR du transcrit E2F1. Malheureusement, les plasmides utilisés pour l’expression de CDK4 se sont avérés non fonctionnels, ce qui nous a forcés à mettre de côté cette expérience. Le deuxième but est d’étudier les déterminants qui régulent la localisation de STAU1 au FM chez les cellules tumorales. Pour ce faire, la localisation de STAU1 ou des mutants au FM est détectée par WB à partir de préparations des FM purifiés. Nos données montrent que le déterminant est composé de plusieurs acides aminés (aa) situés entre le 26ème et 37ème aa du côté N-terminal de la protéine STAU1. En somme, nos résultats montrent les différents rôles de STAU1 dans les cellules tumorales vs cellules non tumorales. De ce fait, STAU1 pourrait être une cible thérapeutique spécifique potentielle dans le traitement du cancer.
STAUFEN1 (STAU1) is a double stranded RNA binding protein that plays an important role in the post-transcriptional control of many mRNAs. Its depletion decreases the proliferation of non-cancer cells by altering G1/S and G2/M transitions. In contrast, this has no impact on the proliferation of tumor cells. The decrease of STAU1 expression modulates the level of transcripts/proteins of several genes involved in phase transition checkpoints, including CDK4 and E2F1, two essential regulators in G1/S transition. In addition, CDK4 and E2F1 transcripts have a STAU1 binding site (SBS) in the coding sequence (CDS) and the non-coding region in 3’ (3’UTR), respectively. However, the molecular consequence of STAU1 association with the SBS is not yet studied. Surprisingly, the sensibility of non-cancer and cancer cells to STAU1 expression is reversed following STAU1 overexpression. Indeed, its overexpression alters the entry into mitosis of cancer cells and decreases their proliferation, while it has no effect on non-cancer cells. During mitosis, STAU1 associates with the mitotic spindle, which allows it to localize mRNAs and other non-coding RNAs. STAU1 likely controls their sequestration and/or local translation during mitosis. However, the molecular determinant involved in STAU1-spindle association is still not known. Therefore, for this master thesis, we had two objectives. The first goal is to understand the post-transcriptional regulation mediated by STAU1 on transcripts that are essential for G1/S transition in non-tumor cells. Our hypothesis is that STAU1, by its direct binding to the SBS of its target transcripts, modulates their expression. To do this, plasmids coding for CDK4 and E2F1 containing a wild-type or mutated SBS that does not recognized STAU1 were transfected in wild-type and STAU1-depleted cells. Expression of CDK4 and E2F1 was detected by dual luciferase assay and western blot (WB). Our results first indicate that STAU1 negatively and positively regulates the endogenous expression of CDK4 and E2F1, respectively, which contributes to the passage of G1/S transition, and therefore to the proliferation non-tumor cells. Then, the luciferase assays confirm the role of STAU1 in E2F1 expression, depending on STAU1 binding to E2F1 SBS in its 3’UTR. Unfortunately, the plasmids used for CDK4 expression turned out to be non-functional. The second goal is to identify the molecular determinants responsible for the localization of STAU1 to the mitotic spindle in tumor cells. To this end, the localization of STAU1 or of several mutants was measured by WB using purified spindle preparations. Our data show that the determinant is composed of several amino acids (aa) located between the 26th and 37th aa at the N-terminal end of STAU1. In summary, our results show the different roles of STAU1 in tumor and non-tumor cells. Therefore, STAU1 could be a potential specific therapeutic target in cancer treatments.

碩士
中山醫學大學
生化暨生物科技研究所
101
Asthma is a chronic airway diseases affecting globe population and distributing in every age. Prevalence of asthma has been dramatically increasing in Taiwan and developed nations over the past decades. Allergic asthma is the major type of the respiratory disease. Its major clinical properties of airway include hypersensitiveness, chronic inflammation, dysfunction and proliferation of smooth muscle cell, and fibrosis. Previous studies have been demonstrated that epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) plays important roles in pathogenesis of asthma; however, roles of aeroallergens in developing airway EMT remain unclear. House dust mite (HDM) is the major cause of asthma. Literature has shown that HDM allergens are able to induce chronic airway inflammation, increase mucus production, enhance epithelial cell migration, and EMT of respiratory epithelium. Der p 2 is a major allergen derived from a HDM Dermatophagoides pteronyssinus. In the present study, we aimed to investigate the roles of Der p 2 in EMT on lung tissue. After a 10-day consecutive sensitization with recombinant Der p 2 (rDer p 2), lung tissues from sensitized Balb/c mice were obtained and fixed. The fixed tissues were sectioned and individually reacted with hematoxylin and eosin (HE) stain, mucicarmine stain, Mason’s trichrome stain, silver stain, and immunohistochemical (IHC) stain. Our results revealed that the short rDer p 2 sensitization enlarged blood vessels and enhanced their permeability, resulting in increased red blood cells (RBC) in lung tissues. In contrast to increased RBC, numbers of invaded inflammatory cells in lung tissues were insignificantly changed in rDer p 2-sensitized mice as compared to sham control. Fibrosis and mucin production in lung tissues were insignificantly altered in rDer p 2-sensitized mice as compared to sham control by using Masson staining and silver staining. Interestingly, IHC stains using specific antibodies showed that levels of mesenchymal markers vimentin and

博士
國立成功大學
基礎醫學研究所
100
Bronchial asthma is a heterogeneous inflammatory airway disease; it develops a complex pathology that is characterized by reversible expiratory airflow limitation and airway inflammation accompanying with airway remodeling and airway hyper- responsiveness (AHR). Over 50% of individuals who suffered with asthma have been sensitized with environmental allergens such as house dust mites (HDM) and developed a Th2-biased immune response. More than 20 HDM allergen groups have been defined based on sequence and functional homologies. Belonging to group 2 allergens, Der p 2 and Der f 2 are low molecular weight protein without proteolytic activity that can induce specific IgE antibodies production in allergic patients. Epidemiological studies showed that children exposed to an environment with rich microbes may be protected from allergic asthma; however, infections are likely to be connected with asthma exacerbation. The airway is not sterile; therefore, the microbes from the external environment and the microbes residing in the airway may have great influences on asthma development. Recently, others’ studies and ours have demonstrated that activation of the innate immunity also plays a critical role in HDM-induced allergic inflammation, particularly in the combination with environmental endotoxins. The molecular interaction between aeroallergens and LPS in the mucosal membranes of airway is still not clear, and whether this interaction will cause the pathological effect that lead to epithelial-mesenchymal transition (EMT) in the airway epithelial cells is also unknown. Therefore, in this study, we expressed, isolated, and applied recombinant Der p 2 (rDer p 2) with high IgE binding activity from Pichia pastoris to human airway epithelial cell lines to investigate (1) whether the major HDM allergen, Der p 2, could directly induce inflammation and EMT in airway epithelial cells, and if so whether the natural product of propolis could have preventive effects in the TGF-β1-induced EMT in airway epithelial cells; (2) whether the major HDM allergen, Der p2, could augment LPS-induced airway inflammation, and if so, explored the possible molecular mechanisms involved in this augmentation effect. In the first part of our research, the results showed that stimulation of rDer p 2 alone could not induce EMT in airway epithelial cells. Therefore, we used a well-established model, TGF-β1-induced-EMT in A549 cells, to perform our experiments on EMT. Experimental results showed progressive cell morphological change, decreased E-cadherin production, increased N-cadherin production, intracellular F-actin rearrangement, increased ROS production, and increased cell motility with an increase in the concentrations of TGF-1 in A549 cells. Pretreated with propolis and then treated with TGF-1 for 24 h regained epithelial cells morphology and decreased the production of N-cadherin and ROS and decreased cell motility. Propolis prevented the effect of TGF-1-induced Smad2 and Akt activation pathways and Snail expression. Moreover, propolis pretreatment may prevented the TGF-1-induced down-regulation of nuclear hormone receptor and peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) protein in A549 cells, whose effect was blocked by adding PPARγ antagonist, GW9662. Two active components of propolis, caffeic acid phenethyl ester (CAPE) and pinocembrin (PIN) only had partial effects on TGF-β1-induced EMT in A549 cells. The results of this study suggest that other unidentified components of propolis may be involved in the inhibitory effect on TGF-1-induced EMT in A549 cells. In the follow-up research, the aim was set to explore the pathological roles of Der p 2 in airway epithelia cells, and its effect in LPS-induced airway inflammation. We used rDer p 2 to treat human airway epithelial cell lines, BEAS-2B, A549, or H292 to evaluate the effect of Der p 2 on LPS-induced cytokines or chemokines production. rDer p 2 alone could not induce high levels of IL-6, IL-8 or CCL20. We then added rDer p 2 with LPS. In any case (pre-treatment, co-treatment, and post-treatment), the production levels of IL-6, IL-8 or CCL-20 were higher than those by adding LPS only. This enhancement of inflammatory cytokines production was through JNK signal pathway. These results were further confirmed by using in vivo experiment, which administrated intra-tracheally rDer p 2 and LPS simultaneously into the lungs of mice. These mice produced higher IL-6 and TARC, and the amount of infiltrated cells in their bronchoalveolar lavage fluids (BALF) was larger than mice stimulated with rDer p 2 or LPS alone. In conclusion, our results suggest that recombinant Der p 2 allergen can participate and enhance LPS-induced airway inflammation into eosinophil infiltration and Th2 chemokine predominant, asthma-like inflammation. Propolis is a popular folk medicine with potential pharmacological actions related to immunological reactions. The results of this study suggest that natural propolis extracts may prevent TGF-β1-induced EMT in immortalized type II AECs via multiple inhibitory pathways, which may be clinically applied in the prevention and/or treatment for EMT-related fibrotic diseases as well as airway remodeling in chronic asthma. Der p 2 allergen can participate and enhance LPS-induced airway inflammation. This study also suggested that LPS play an import role in allergy; the phenomenon that Der p 2 and LPS may work together to deteriorate inflammatory reactions reminds us the potential affects from LPS to allergy development cannot be ignored. Appropriate and in-time control over LPS may keep allergy from exacerbation. In the future, further investigations about the effect of LPS in the airway will be continued. There may be novel targets for stopping the progression from chronic inflammation of asthma.