Literatura científica selecionada sobre o tema "Protéome bactérien"

Différents types de vaccins sont actuellement disponibles ou en cours de développement. Ils peuvent être divisés en deux catégories : vaccins vivants et vaccins inertes. Les vaccins vivants traditionnels incluent des souches atténuées par des moyens conventionnels, comme la croissance dans des conditions de culture inhabituelles (bactéries), ou dans des cellules ou des animaux vis-à-vis desquels les souches ne sont pas initialement adaptées (virus). Les nouvelles générations de vaccins vivants utilisant les techniques de recombinaison génétique (vaccins recombinants) peuvent être fabriquées par mutagénèse dirigée de gènes de virulence, ou par clonage de gènes de protéines immunogènes dans des vecteurs viraux ou bactériens qui possèdent les propriétés souhaitées d’innocuité et d’efficacité. Les vaccins inactivés conventionnels sont fabriqués par traitement des microorganismes par des agents physiques ou chimiques. Dans la mesure où les fractions immunogènes des microorganismes sont de mieux en mieux connues, elles peuvent être utilisées pour fabriquer des vaccins ne comprenant que ces fractions immunogènes majeures (vaccin subunitaires) par purification, ou par expressionin vitro de protéines (un autre type de vaccin recombinant) ou enfin synthèse chimique de peptides. Récemment, il a été démontré, chez différentes espèces, que l’inoculation directe dans le muscle d’un gène codant pour une protéine immunogène (immunisation génétique) permettait d’induire une réponse immune cellulaire et humorale. Cette méthode correspond à un dernier type de vaccin recombinant. L’immunité systémique et muqueuse obtenue après injection de vaccin vivant est comparée à celle obtenue après injection de vaccin inerte.

A la suite de l’interdiction des farines animales en alimentation animale, il est nécessaire de mettre au point des procédés simples et économiques pour les valoriser et les décontaminer vis-à-vis de la présence possible de prion pathogène. L’usage des microorganismes est une solution possible. Aussi, des collections de microorganismes capables de croître sur la kératine ou sur des farines animales et sécrétant des protéases capables de dégrader la PrPsc contenue dans les farines animales ont été criblées. Ceci a permis de découvrir trois souches de bactéries thermophiles, isolées de différentes sources chaudes réparties sur la planète, qui sont capables de dégrader la protéine prion infectieuse PrPsc et de croître sur un milieu composé de farines animales. Leur activité protéolytique, de type chymotrypsique pour l’essentiel, est maximale à la température de 60 à 80°C et focalisée sur certaines liaisons peptidiques qui sont nombreuses sur la protéine prion. Leur action découpe ainsi la protéine prion en morceaux plus courts inoffensifs. Les perspectives sont de mettre en oeuvre ces microorganismes thermophiles dont le patrimoine protéolytique permettrait la dégradation des farines animales, actuellement incinérées, et les protéines prions qu’elles renferment.

Introduction : La méningite bactérienne est l’une des plus graves infections néonatales bactériennes précoces. Elle est à l’origine des complications redoutables, dont les séquelles psychomotrices et neurosensorielles sont souvent irréversibles. Objectifs : Décrire les caractéristiques des méningites néonatales bactériennes précoces chez un groupe de nouveaunés marocains. Méthodes : Ont été inclus tous les nouveau-nés hospitalisés, au Centre national de référence en néonatologie et en nutrition de l’hôpital d’Enfants du centre hospitalier universitaire de Rabat, pour prise en charge d’une méningite bactérienne précoce. Après avoir sélectionné les dossiers des nouveau-nés, une fiche d’exploitation a été remplie pour chaque cas. Résultats : Le diagnostic de méningite a été retenu chez 57 (5 %) nouveau-nés. Lors de l’admission, 32 % des nouveaunés avaient un âge inférieur à 24 heures. La protéine C-réactive était positive chez 56 nouveau-nés (98 %). La valeur moyenne de la CRP était de 54 ± 31 mg/l. Les nouveau-nés symptomatiques ont représenté 54 % des cas. L’examen du liquide céphalorachidien prélevé par ponction lombaire a été effectué. Conclusion : L’absence de signe clinique spécifique de la méningite néonatale bactérienne précoce incite le praticien à se fonder sur un faisceau d’arguments cliniques et biologiques afin d’établir le bon diagnostic et prendre en charge le nouveau-né à risque dans un bref délai.

This article presents a case that highlights the importance of excluding underlying intracranial pathology in a patient presenting with severe headache and positive xanthochromia. This case report demonstrated that false-positive xanthochromia without subarachnoid haemorrhage (SAH) is possible in acute bacterial meningitis when there is a combination of traumatic lumbar puncture and either hyperbilirubinaemia or raised cerebrospinal fluids (CSF) protein. Cet article présente un cas qui met en évidence l'importance d'exclure une pathologie intracrânienne sous-jacente chez un patient présentant une céphalée sévère et une xanthochromie positive. Ce rapport de cas a démontré qu'une xanthochromie faussement positive sans hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) est possible dans la méningite bactérienne aiguë lorsqu'il existe une combinaison de ponction lombaire traumatique et d'hyperbilirubinémie ou d'augmentation de la protéine du liquide céphalo-rachidien (LCR).

L’infection du cerveau par divers types d’agents pathogènes, et les réponses inflammatoires qui s’en suivent, occupent une place grandissante dans notre compréhension de l’étiologie de la maladie d’Alzheimer (MA). Le fait que, parmi la vingtaine de gènes identifiés comme étant des facteurs à risque, plusieurs soient impliqués dans la modulation de la réponse immunitaire, ainsi que la diversité même des agents infectieux identifiés comme étant des acteurs possibles dans l’évolution de cette maladie, plaident en faveur de l’hypothèse neuro-inflammatoire, tout comme la prise de conscience que la protéine Aβ, l’un des marqueurs les plus importants de la MA, peut agir comme un système de défense antimicrobienne, capable de neutraliser des bactéries et des virus. Différent types de pathogènes, incluant des bactéries, des champignons, des protozoaires et des virus, ont été identifiés dans le cerveau malade, souvent près des lésions caractéristiques de la MA. Parmi eux, les virus herpétiques (surtout, mais pas seulement, HSV-1), qui se caractérisent par l’établissement d’infections latentes dans les neurones, ponctuées par des épisodes de réactivation suite à des stress ou des immunodépressions, apparaissent comme des candidats très solides à un rôle étiologique, ne serait-ce qu’en tant que cofacteurs, de la MA. La présence de génomes HSV-1 latents dans le cerveau, et donc le risque de réactivation, augmentent significativement avec l’âge. Des résultats récents montrent que, dans des neurones humains et de rat, l’infection par HSV-1 augmente l’expression de la β-sécrétase et de la nicastrine, deux enzymes impliquées dans la formation des Aβ selon la voie amyloïdogénique, ainsi que de celle de GSK3β et PKA, deux kinases impliquées dans la phosphorylation des protéines Tau, un autre marqueur essentiel de la MA. Les preuves croissantes obtenues, selon lesquelles les infections chroniques et les mécanismes de défense suscités, y compris les processus inflammatoires, sont au cœur de la MA, justifient de revoir les médicaments antiviraux tels que l’acyclovir, et peut-être aussi la vaccination, comme des voies potentielles de lutte contre la MA.

Yersinia ruckeri est l'agent responsable de la yersiniose, une maladie rencontrée dans certaines exploitations piscicoles. Trois souches ont été isolées d'une pisciculture normande, principalement sur les parois des bassins et dans les sédiments, suggérant un mode de survie sous la forme de biofilm. Cette hypothèse a été confirmée par la forte capacité de la souche majoritaire à coloniser des matériaux. Cette souche est apparue sensible à l'acide oxolinique et à la fluméquine mais néanmoins plus résistante qu'une souche de collection. Les souches immobilisées dans un modèle in vitro de biofilm et fixées naturellement sur le bois, ont présenté une forte résistance aux antibiotiques par rapport aux bactéries libres. Par une approche protéomique, il a été montré que l'immobilisation induisait la sous-expression de protéines flagellaires et la sur-expression de protéines de stress. Certaines de ces modifications pourraient contribuer à la résistance des bactéries fixées aux antibiotiques
Yersinia ruckeri is the causal agent of yersiniosis, a serious infectious disease in the rainbow trout farms. Three strains have been isolated from a fish farm, essentially from the tank wall surface and from sediments, suggesting a survival in a biofilm status. This hypothesis has been confirmed by the high ability of the majority strain to form biofilms on materials. This environmental strain was sensitive to oxolinic acid and flumequine but exhibited a lower susceptibility to antibiotics as compared to a collection strain. Agar-entrapped and adherent cells were more resistant to antibiotics than plancktonic cells. .

Legionella pneumophila est une bactérie naturelle du milieu aquatique qui survit aussi bien sous la forme libre, en biofilm ou en parasitant des protozoaires. Cette bactérie à Gram-négatif est l’agent responsable de la légionellose. L’infection pulmonaire, se fait suite à une inhalation d’aérosols générés par les circuits d’airs conditionnés ou d’eaux chaudes dans lesquels la bactérie prolifère de façon privilégiée sous la forme de biofilms. Très peu de données étant disponibles sur le protéome de L. Pneumophila, nous avons dans un premier temps cartographié différents compartiments de la bactérie : protéome total, protéome membranaire et protéome associé à la surface (surfaceome). Notre étude sur le membranome a permis de localiser plusieurs protéines hypothétiques dont on ne connaissait pas la localisation cellulaire jusqu’alors. Nous avons pu également mettre en évidence la présence de plusieurs porines majoritaires. L’étude du surfaceome nous a permis d’établir une liste non exhaustive mais néanmoins importante de protéines spécifiques à Legionella, susceptibles d’être des antigènes de surfaces intéressants dans le cadre du développement de biocapteurs. Nos différentes cartes protéomiques ont révélé aussi la présence des deux protéines eucaryote-like Lcy et Omp32. Ces protéines pourraient appartenir à un complexe bactérien proche du complexe mitochondrial MPTP. Une étude bioinformatique du génome de L. Pneumophila a permis de montrer la présence d’une troisième protéine (TspO) qui présente de fortes homologies avec la protéine PBR du système mitochondriale MPTP. La fonction de ce complexe bactérien est en encore inconnu mais pourrait être impliqué dans l’induction de l’apoptose de la cellule hôte. Une étude différentielle du protéome total des bactéries planctoniques et cultivées en biofilms (formés sur des coupons d’acier inoxydable) a montré l’accumulation et l’apparition de plusieurs protéines hypothétiques à fonction inconnue chez les bactéries cultivées en biofilm. Parmi ces protéines, nous avons identifié le facteur RpoN et deux protéines hypothétiques, Lpg0563 et Lpg1809. Les recherches d’homologies montrent que ces deux polypeptides sont uniques à L. Pneumophila
Legionella pneumophila is a Gram negative bacterium found world-wide in fresh-water environments, where it persists in a free-living or biofilm-associated state. L. Pneumophila causes the severe pneumonia Legionnnaires’disease. Few data are available on the proteome of L. Pneumophila. In this manuscript, we report the whole proteome and the protein maps of outer membrane proteins (membranome) and surface-associated proteins (surfaceome) of the bacterium. These studies allowed to locate some hypothetical proteins within the outer membrane and at the cell surface. We also identified several majority porins and some proteins which seems specific to Legionella. Among them, some surface-associated proteins might be used for the development of new biosensors. The genome of L. Pneumophila reveals the presence of a high number of genes coding for eukaryotic-like proteins. By using database searches, homology investigations and proteomic approaches, we pointed out the presence in L. Pneumophila of three proteins whose sequences share similarities with that of eukaryotic polypeptides, i. E. , Lpg0211 (TspO), Lpg1974 (Omp32) and Lpg1982 (Lcy). In eukaryotes, the corresponding proteins (PBR, VDAC and cyclophilin) participate to the formation of the mammalian mitochondrial permeability transition pore (MPTP), a complex involved in cell apoptosis. In Legionella, we hypothesized that these proteins are recruited in a multiprotein complex close to the MPTP, which may regulate intracellular survival and/or proliferation. Finally, we compared the proteome of planktonic bacteria with that of biofilm counterparts (formed on stainless steel coupons). Results showed that some proteins were accumulated by sessile organisms. We also identified two hypothetical proteins (Lpg0563s and Lpg1809) that were specifically produced by biofilm cells. Researches of homology showed that Lpg0563 and Lpg1809 are specific to L. Pneumophila

Le cytosquelette bactérien des homologues d'actine (protéines de la famille MreB) joue un rôle majeur dans la morphogénèse cellulaire. Des homologues de MreB sont retrouvés chez la plupart des espèces bactériennes non sphériques, où ils sont essentiels pour la viabilité cellulaire. Les bactéries à Gram-positif ont généralement plusieurs isoformes. L'organisme modèle Bacillus subtilis en possède trois : MreB, Mbl et MreBH, tous trois impliqués dans la détermination de la forme de la cellule. Le postulat actuel est une organisation, des complexes de synthèse du peptidoglycane, le long des parois latérales par les filaments hélicoïdaux des MreB-like. Cependant, les mécanismes moléculaires et les protéines effectrices impliqués dans cette fonction ne sont pas encore élucidés. Par analogie avec les rôles de l'actine eucaryote, des implications dans d'autres processus cellulaires cruciaux et la présence de partenaires protéiques sont également attendus pour les actines procaryotes. Afin d'explorer les rôles des protéines MreB chez B. subtilis nous avons généré, par des criblages génomiques double hybride chez la levure, un réseau d'interaction protéine-protéine centré sur MreB, Mbl et MreBH. Une vérification systématique et drastique de toutes les interactions obtenues lors des criblages a été réalisée afin d'éliminer les faux positifs. Les interactions identifiées révèlent des liens entre les protéines MreB-like et seize protéines issues de catégories fonctionnelles variées ou de fonction inconnue. Une étude exploratoire a été menée pour huit des protéines partenaires par des approches in silico et in vivo et nous a permis de sélectionner une seule interaction à caractériser plus en détail. Nous nous sommes principalement intéressés à l'interaction physique et directe entre MreB et DapL, une protéine essentielle vraisemblablement impliquée dans la voie de biosynthèse des précurseurs du peptidoglycane, par analogie à DapE d'E. coli. La caractérisation approfondie de DapL a confirmé son essentialité dans la synthèse du peptidoglycane. Bien que l'interaction MreB-DapL ait été confirmée biochimiquement, son rôle biologique exact n'a pas été élucidé. Cependant, nous avons mis en évidence d'autres interactions entre MreB et DapG, LysA et MurE, des enzymes également impliquées dans les étapes précoces de la synthèse du peptidoglycane. L'existence de telles interactions renforce le rôle du cytosquelette MreB de B. subtilis dans l'orchestration des machineries de synthèse de la paroi cellulaire.

Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria (Xcv) est un pathogène du Poivron et de la Tomate. Grâce à leur système de sécrétion de type III, les bactéries "injectent" des protéines effectrices, telles AvrBs3, dans les cellules-hôtes. AvrBs3 provoque l'hypertrophie des cellules du mésophylle des plantes sensibles, tandis que les plantes résistantes reconnaissent AvrBs3 et montent une réaction de défense. L'objectif de ce travail était de comprendre la fonction et le mécanisme d'action d'AvrBs3 dans la plante sensible. AvrBs3 est adressé au noyau cellulaire et possède un domaine d'activation de la transcription indispensable à sa fonction, ce qui en fait un activateur potentiel de gènes de l'hôte. Un crible différentiel nous a permis d'isoler 13 gènes induits par AvrBs3 (upa), dont 9 au moins ont des homologues impliqués dans l'élongation cellulaire. D'autre part, upa12 et upa13 codent des facteurs de transcription (FT) potentiels. Upa13 est un probable FT de la famille ERF, se liant à la boîte GCC et activant l'expression d'un gène rapporteur sous le contrôle d'une boîte GCC. Upa12 est un probable FT de la famille AP2 capable de contrecarrer l'activité d'Upa13, sans toutefois se lier à la boîte GCC. Upa12 pourrait être un répresseur de certains gènes de défense de plante. Le profil d'induction par différentes formes d'AvrBs3 des gènes upa a été examiné. Ces expériences suggèrent que les 17. 5 répétitions d'un motif de 34 acides aminés que possède AvrBs3 déterminent l'éventail de gènes que la protéine peut induire. En outre, l'induction de 4 gènes upa ne requiert pas la néosynthèse de protéines. Ces gènes sont donc candidats à une induction directe par AvrBs3. Deux de leurs promoteurs ont été réduits à de courtes séquences conférant à un gène rapporteur l'inductibilité par AvrBs3. Ce travail suggère qu'AvrBs3 est un facteur de transcription permettant aux bactéries de manipuler le génome de leur hôte, et permet une meilleure compréhension du mécanisme d'action d'AvrBs3.

Nous avons étudié le mécanisme de sécrétion de Myxococcus xanthus, bactérie à gram-négatif, en utilisant comme sonde une protéine étrangère, la phosphatase hyperacide de Escherichia coli, qui est partiellement sécrétée chez M. Xanthus. Nous devions tout d'abord cloner son gène, appA, sous contrôle d'un promoteur inductible. En utilisant le gène lact comme gène rapporteur, nous avons comparé l'efficacité d'induction de deux promoteurs chez M. Xanthus, l'un endogène, le promoteur carQRs, inductible par la lumière, et l'autre exogène, le promoteur hybride tac, inductible par l'IPTG chez E. Coli en présence du gène répresseur lacIq: le système lacIq ptac est fonctionnel et inductible par l'IPTG chez M. Xanthus, mais le promoteur carQRs est plus fort chez M. Xanthus. Malgré de nombreux essais, nous ne sommes cependant pas parvenu à obtenir une souche de M. Xanthus chez laquelle la production de phosphatase hyperacide était inductible par la lumière. Nous avons alors clone le gène appA en aval du promoteur tac, puis obtenu une souche de M. Xanthus chez laquelle la production de phosphatase était inductible par l'IPTG. Par dosage, après induction, de l'activité appA dans les cellules et dans le surnageant, au cours du temps, et à trois niveaux d'induction différents, nous avons obtenu des cinétiques de sécrétion de la phosphatase hyperacide chez M. Xanthus dont l'analyse nous a permis de poser les bases d'un modèle de sécrétion chez M. Xanthus

Les interactions entre protéines sont un enjeu majeur en recherche. Hautement spécifiques, elles régulent l'organisation cellulaire, ainsi que les réponses aux stimuli extérieurs ; ce sont des cibles idéales des agents thérapeutiques. Diverses techniques d'étude sont disponibles, mais peu d'entre elles permettent d'analyser simultanément plusieurs interactions. L'objectif de ce travail est d'utiliser le double hybride bactérien pour découvrir de nouveaux partenaires de 2 régulateurs de la prolifération tumorale humaine, p21 et STAT3, et en parallèle pour déterminer la fonction de MtSAP1, impliquée dans la germination et la réponse aux stress abiotiques chez Medicago truncatula. L'analyse des partenaires potentiels de l'oncogène STAT3 et de l'inhibiteur p21 suggère l'existence de nouveaux mécanismes moléculaires de la tumorogenèse auxquels participerait STAT3, et permet d'envisager de nouvelles hypothèses quant au rôle de p21. Un nouveau complexe, p21/prohibitine2, est étudié mais sa fonction reste supposée : il pourrait agir comme corégulateur transcriptionnel et/ou réguler la protéolyse de p21. L'étude du gène MtSAP1 et des partenaires d'interactions suggèrent fortement que MtSAP1 serait induit par l'hypoxie : elle jouerait un rôle considérable dans la détoxification et la tolérance de la plante au stress. Ce travail, appuyé par la littérature, met en évidence un lien fonctionnel entre p21, STAT3 et MtSAP1 au cours de l'hypoxie dans les cellules cancéreuses humaines. La confirmation de cette hypothèse permettrait d'approfondir les mécanismes de protection cellulaire face à l'hypoxie, tant au sein des tumeurs humaines que lors de la tolérance de Medicago truncatula.

Les résistances aux antibiotiques sont de plus en plus fréquentes et la thérapie des patients infectés par des souches multi-résistantes devient très complexe et délicate, voire dans certains cas inefficace. Il devient donc urgent de trouver des antibiotiques innovants et ainsi repousser la menace renaissante d'épidémie bactérienne.Pour ce faire, la biosynthèse du peptidoglycane – l'un des composants majeurs de la paroi des bactéries, est une cible qui a amplement fait ses preuves dans la lutte contre les infections bactériennes et reste d'intérêt thérapeutique. Des études récentes ont en effet suggéré que ce processus impliquerait des complexes macromoléculaires dont l'intégrité pourrait être perturbée par de nouveaux antibiotiques. En particulier, il a été suggéré que les ligases Mur – qui participent à la synthèse de l'unité monomérique du peptidoglycane dans le cytoplasme, feraient partie d'un complexe multipartite impliquant probablement la transglycosylase MurG et la protéine du cytosquelette MreB. En outre, ces enzymes ne sont à l'heure actuelle la cible d'aucun antibiotique médical, malgré leur intérêt thérapeutique largement reconnu.Les travaux réalisés lors de cette thèse ont permis de montrer par résonance plasmonique de surface et par dot blot, que les ligases MurD, MurE, MurF interagissent toutes avec MurG et MreB, ces dernières formant elles-mêmes un complexe. En revanche, aucune interaction n'a été détectée entre les ligases. Un criblage de conditions de cristallogenèse a été effectué afin de déterminer l'empreinte cristallogénique et cristallographique des protéines seules ainsi que des complexes potentiels dans le but de déterminer la structure cristallographique de l'un des complexes étudiés. Grâce à ce criblage, la structure par diffraction aux rayons X des trois ligases a pu être résolue, suggérant que leur flexibilité conformationnelle pourrait être importante dans les interactions protéiques, et l'analyse cristallographique de jeux de diffraction pouvant correspondre aux complexes MreB-MurE et MreB-MurF est en cours.Ces résultats marquent les premiers pas dans la caractérisation de la machinerie cytoplasmique de la biosynthèse du peptidoglycane, ouvrant la porte à de nouvelles cibles thérapeutiques
Resistance to antibiotics is increasingly frequent and therapy for patients infected by multi-resistant strains is more and more complicated and delicate, nay sometimes inefficient. Therefore, there is an urgent need for novel antibiotics to stave off the resurgent threat of bacterial epidemics.The relatively well-known mechanism of bacterial cell wall formation remains a pathway of prime interest in the search for therapeutic targets. Strikingly, recent studies have suggested that the biosynthesis of its main component, peptidoglycan, would involve macromolecular protein-protein complexes. Particularly, Mur ligases were suggested to form a multipartite complex which would recruit transglycosidase MurG and bacterial actin homolog MreB as well. Interestingly, these enzymes are targetted by none of the antibiotics in clinical use.The work carried out during this PhD showed by surface plasmon resonance and dot blot techniques that MurD, MurE, and MurF all recognize MurG and MreB, but not each other, whilst the two latter proteins interact. A crystallogenesis screening allowed to determine the crystallogenic fingerprints of single proteins and potential complexes, aiming for the crystal structure of one of the Mur complexes. Thanks to this screening, the structures of MurD, MurE, MurF were solved, suggesting that the conformational flexibility of their C-terminal domain might be involved in complex formation and stability. In addition, two data sets which could correspond to MreB-MurE and MreB-MurF complexes are still beeing processed.These results mark a further step in the characterization of the cytoplasmic peptidoglycan machinery, opening up towards novel therapeutic targets which would impair the integrity of the macromolecular complex

Les génomes bactériens contiennent de nombreuses séquences répétées qui ont un rôle majeur dans la plasticité et l'évolution des génomes. Parmi elles, les séquences REP sont de courtes séquences d'ADN, trouvées en grand nombre dans des régions intergéniques de plusieurs espèces bactériennes. Ces séquences ont la particularité de présenter des structures en tige boucle précédées par un tétranucléotide conservé. Elles peuvent exister seules mais sont majoritairement groupées dans des clusters consécutifs appelés BIME. De nombreux rôles ont été attribués aux REP/BIME dans la physiologie de la cellule : elles sont notamment impliquées dans la régulation de l'expression des gènes et elles constituent des sites de fixation pour plusieurs protéines de l'hôte. Toutefois, leur origine et le mécanisme de leur dissémination dans les génomes ne sont pas connus. Récemment, un gène codant une protéine (TnpAREP) apparentée aux transposases de la famille des séquences d'insertions IS200/IS605 a été identifiée en association avec des REP/BIME au sein de structures appelées REPtron. Il a été alors proposé que les REP/BIME pourraient être des éléments transposables non-autonomes mobilisables par la protéine TnpAREP. Cette protéine fait partie de la superfamille des enzymes HuH comprenant des Relaxases, des protéines Rep des phages/plasmides à réplication en cercle roulant et certaines transposases. Elles utilisent le motif HuH (Histidine - résidu hydrophobe - Histidine) pour coordonner des cofacteurs métalliques ainsi que des résidus tyrosines pour leur activité catalytique. Comme pour les transposases HuH de la famille IS200/IS605, TnpAREP reconnait spécifiquement des substrats ADN simple brin. Elle est active in vitro sur des séquences structurées contenant des REP/BIME sous forme simple brin et celle-ci clive au niveau d'un dinucléotide spécifique. Des données cristallographiques suggèrent que TnpAREP serait monomérique, contrairement aux transposases d'IS200/IS605 qui sont des dimères obligatoires. Cela pose de nombreuses questions sur le site catalytique de l'enzyme ainsi que sur le mécanisme de prolifération des REP/BIME dans les génomes bactériens, d'autant plus qu'aucune activité de TnpAREP n'a été décrite in vivo. Mes premiers résultats portent sur la caractérisation du site catalytique de TnpAREP d'E. coli et ont permis d'exclure la possibilité d'un site catalytique hybride comme dans le cas des protéines Rep de certains plasmides. J'ai pu mettre en évidence une activité in vivo de TnpAREP : son expression sous contrôle d'un promoteur inductible à un effet toxique et induit la réponse SOS chez E. coli. J'ai également développé un test pour cartographier des sites de clivage de TnpAREP in vivo et montré que l'enzyme est capable de cliver les deux brins des plasmides et de l'ADN chromosomique. De plus, une excision d'un BIME a pu être observée dans ces conditions. J'ai aussi construit des souches bactériennes permettant d'étudier l'évolution expérimentale des REP/BIME in vivo dont les résultats sont en cours d'analyse. Enfin, nous avons élargi notre étude à un sous-groupe de TnpAREP associées à un autre type de REP/BIME. Cette analyse comparative nous a permis non seulement de généraliser des propriétés observées avec TnpAREP d'E. coli, mais aussi de révéler des caractéristiques spécifiques de ce sous-groupe
In spite of their compact size, bacterial genomes carry many repetitive sequences, often important for genome function and evolution. Among them, REPs are short DNA found at high copy number in intergenic regions in many bacterial species. These sequences can form stem-loop structures preceded by a conserved tetranucleotide. They can exist as individual units but also as complex consecutive clusters called BIMEs. REP/BIMEs are known to interact with different proteins and several important roles have been attributed to these sequences in cell physiology. However, their origin and dissemination mechanisms are poorly understood. Recently, a first example of prokaryotic domesticated transposases (TnpAREP) was found associated with REP/BIME sequences in structure called REPtron. REP/BIMEs might represent a special type of non-autonomous transposable element mobilizable by TnpAREP. TnpAREP is member of the HuH enzymes superfamily including Relaxases, Rep proteins of RCR plasmids/ss phages and some transposases. These transposases are fundamentally different from classical transposases. They use HuH motif (Histidine-hydrophobe-Histidine) to coordinate metal cofactor and tyrosine residues (Y) as nucleophile for catalysis. TnpAREP shares certain similarities to Y1 HuH transposases encoded by the IS200/IS605 family which processes only ssDNA substrates. Analysis of E. coli TnpAREP activity in vitro also shown the strict requirement of structured single stranded REP/BIME DNA substrates. Cleavage in vitro occurs at a specific dinucleotide. In contrast to Y1 HuH transposases which are obligatory dimers, E. coli TnpAREP is a monomer as shown by structural studies. Furthermore, TnpAREP activities have never been described in vivo. This raises questions about its catalytic sites and also the way by which it promotes REP/BIME proliferation within their host genomes. The first objective of my PhD was to characterize the TnpAREP catalytic site. My results exclude the possibility of a second catalytic site as observed for REP protein of some plasmid families. Here I show that in vivo, expression of TnpAREP under control of an inducible external promoter is toxic to E. coli cells and induces SOS response, the effect depending on catalytic activity of the protein. I have developed an assay to map TnpAREP cleavage sites in vivo and show that it can cleave both DNA strands on plasmid and bacterial chromosome. In these conditions, an excision of BIME could be observed. I also constructed bacterial strains to perform REP/BIME experimental evolution, results are under analysis. Finally, we are extending our analysis to a subgroup of TnpAREP that are associated with another type of REP/BIME. This comparative analysis not only permitted to generalize some properties observed with E. coli TnpAREP but also revealed some interesting distinct characteristics of this subgroup