Teses / dissertações sobre o tema "Maladie rare d’origine génétique"

L’albinisme est un groupe de pathologies génétiques hétérogènes sur le plan clinique. On retrouve de manière constante une atteinte ophtalmologique pouvant associer un nystagmus, une hypoplasie fovéolaire et des anomalies de décussation des voies optiques. L’atteinte cutanéophanérienne est plus variable avec une hypopigmentation de la peau, des cheveux et de l’iris. L’hypopigmentation est la conséquence directe et visible d’un défaut de synthèse de mélanine au sein des mélanocytes cutanés chez les patients atteints d’albinisme. La pathologie ophtalmologique résulte quant à elle d’un défaut de signalisation entre l’épithélium pigmentaire de la rétine et la rétine neurosensorielle au cours du développement. Sur le plan génétique, vingt gènes ont été identifiés à ce jour définissant vingt types d’albinisme classés en trois formes : oculocutanée, oculaire, ou syndromique. Le séquençage de ces vingt gènes permet de confirmer le diagnostic clinique dans 70% des cas laissant un nombre significatif de patients sans caractérisation génétique. Parmi ces derniers, on trouve des sujets chez lesquels on aura identifié uniquement un ou deux variants de signification indéterminée (VSI).Cette étude porte sur 5 gènes majeurs dont les altérations provoquent un albinisme oculocutané à transmission autosomique récessive : TYR, TYRP1, DCT, OCA2 et SLC45A2. Les cinq protéines correspondantes jouent un rôle spécifique dans la synthèse de mélanine soit en tant qu’enzyme de la mélanogénèse (TYR, TYRP1 et DCT), soit en tant que régulateur du pH mélanosomal (protéine P, SLC45A2). Leurs fonctions précises dans un contexte donné (espèce, type cellulaire, stade développemental) restent cependant peu documentées.Le premier objectif de ce travail est d’améliorer le diagnostic des patients atteints d’albinisme par plusieurs approches d’analyses de cohortes, de tests fonctionnels et de test de sauvetage de phénotype par des VSI. Le second objectif est la création de modèles cellulaires mélanocytaires inactivés pour les 5 gènes afin d’étudier leur phénotype moléculaire et pigmentaire.Tout d’abord, nous rapportons l’analyse statistique d’une cohorte de patients porteurs de deux variants faux-sens fréquents dans le gène TYR classés VSI. Cette étude montre que la combinaison de ces deux variants faux-sens est pathogène dans le contexte d’un haplotype comportant un variant du promoteur ce qui a d’importantes applications sur la stratégie diagnostique.Puis nous présentons des stratégies robustes pour caractériser des variants synonymes et faux-sens du gène OCA2 classés VSI. Ces travaux ont permis de prouver l’effet pathogène de ces variants par augmentation du saut de l’exon 10 du gène OCA2. Nous montrons également que la recherche d’anomalies d’épissage peut être réalisée à partir d’un simple prélèvement sanguin.Afin de compléter les connaissances sur le rôle de chacune des protéines codées par les cinq gènes d’intérêt (TYR, OCA2, TYRP1, SLC45A2 et DCT), nous avons créé des modèles de cellules mélanocytaires MNT1 inactivées pour chacun des 5 gènes grâce au système CRISPR-Cas9. Nous comparons ces 5 modèles par différentes analyses permettant d’évaluer leur capacité de production de mélanine et leurs caractéristiques moléculaires. Une analyse comparative par protéomique nous permet de mettre en évidence les régulations communes et spécifiques dépendantes de ces gènes.Enfin le modèle inactivé pour TYR est exploité dans le cadre d’un test de rescue pour évaluer la pathogénicité de VSI de TYR. Ce test nous montre que des variants faux-sens peuvent être reclassés bénins ou pathogènes en fonction de leur capacité à restaurer le phénotype pigmentaire dans ce modèle.L’analyse de ces modèles cellulaires permet d’apporter de nouvelles connaissances sur la physiologie de la biosynthèse de mélanine. Les approches développées pour l’analyse des variants seront transférées dans le cadre hospitalier et permettront d’améliorer significativement le diagnostic
Albinism is a group of clinically heterogeneous genetic disorders. Ophthalmologic features are constant including nystagmus, foveal hypoplasia and chiasmal misrouting. Cutaneous features are more variable with hypopigmentation of the skin, hair, and iris. In affected patients, hypopigmentation results directly from a defect in melanin synthesis in skin melanocytes. Ophthalmologic features are due to a signaling defect between the retinal pigmented epithelium and the neuronal retina during development. To date, twenty genes have been identified, defining twenty types of albinism, classified into three forms: oculocutaneous, ocular, or syndromic. Sequencing of these twenty genes confirms the diagnosis in 70% of cases, leaving a significant number of patients without genetic determinism. Among these, patients may bear one or two variants of unknown significance (VUS). This study focuses on 5 major genes which cause autosomal recessive oculocutaneous albinism: TYR, TYRP1, DCT, OCA2 and SLC45A2. The five corresponding proteins have a specific role in melanin synthesis either as a melanogenic enzyme (TYR, TYRP1 and DCT) or as a melanosomal pH regulator (OCA2, SLC45A2). Their precise functions in a given context (species, cell type, developmental stage) remain poorly documented.The first objective of this work is to improve the diagnosis of patients with albinism by multiple approaches of cohort analysis, functional tests and rescue test of VUS. The second objective is the design of melanocyte cell models knock-out (KO) for the 5 genes in order to study their molecular and pigmentary phenotype.First, we report the statistical analysis of a cohort of patients carrying two frequent missense variants in TYR gene classified as VUS. This study shows that the combination of these two missense variants is pathogenic if included in a haplotype with a promoter variant which has important implications in diagnosis strategies.Then we present solid strategies to characterize synonymous and missense variants of OCA2 gene classified as VUS. These analyses prove the pathogenic effect of these variants by increasing skipping of exon 10 of OCA2 gene. We also show that splicing anomalies can be detected from a simple blood sample.In order to increase knowledge on the role of each of the proteins encoded by the five genes of interest (TYR, OCA2, TYRP1, SLC45A2 and DCT), we designed MNT1 melanocyte cell models that are each KO for one of the 5 genes using the CRISPR-Cas9 system. We compare these 5 models by different analyses to assess their melanin production capacity and their molecular characteristics. A comparative proteomic assay allows us to reveal the common and specific regulations between these genes.Finally, the KO model for TYR is used in a rescue test to assess pathogenicity of TYR VUS. This test shows us that missense variants can be reclassified as benign or pathogenic depending on their ability to restore the pigmentary phenotype in this model.Analysis of these cellular models provides new knowledge on melanin biosynthesis physiology. The techniques developed for the analysis of variants will be transferred in a hospital setting to significantly improve diagnosis

Le syndrome oculo-cérébro-rénal de Lowe (OCRL), de transmission récessive liée à l'X, est caractérisé par une cataracte congénitale bilatérale, un retard psychomoteur et un syndrome de Fanconi rénal. Le gène OCRL 1 code pour une PIP2 5-phosphatase de 105 kDa associée à l'appareil de Golgi. La recherche de mutations chez 146 familles a permis de caractériser 107 mutations dont 86 différentes. Parmi les mutations identifiées 2 sont des délétions en phase d'un seul acide aminé, 27 des mutations faux sens, 29 des mutations non sens, 23 des insertions ou délétions avec décalage du cadre de lecture, 19 des mutations d'épissage et 7 des délétions génomiques. L'haplotypage de 18 familles par des marqueurs fortement liés à OCRL 1 a mis en évidence 3 cas de mosaTcisme germinal et somatique. Vingt trois patients atteints de maladie de Dent sans mutation du gène CLCN5 ont été étudiés et 6 mutations ont été identifiées dans le gène OCRL1. L'activité PIP25-phosphatase mesurée dans les extraits cellulaires de fibroblastes de 21 garçons atteints de syndrome de Lowe et de 2 atteints de maladie de Dent est très abaissée par rapport à des fibroblastes normaux. L'analyse par Western blot de la protéine OCRL 1 montre une diminution très importante pour les mutations d'épissage et une délétion génomique. Pour les mutations faux sens la quantité est plus variable mais pas forcément corrélée à l'activité résiduelle de la protéine. L'analyse des transcrits d'OCRL 1 montre qu'il existe une variabilité quantitative chez les patients mais également chez les témoins. Les premières études cliniques chez 55 patients atteints de syndrome de Lowe ne montrent pas de corrélation génotype-phénotype évidente
Lowe syndrome is a rare X-linked disease characterized by congenital cataracts, renal Fanconi syndrome an mental retardation. The OCRL 1 gene encodes a 105 kDa PIP2 5-phosphatase localized in the trans Golgi network. 146 families were analyzed and 107 mutations were identified, 86 are new ones. Two mutations are an aminoacid in trame deletion, 27 are misssense mutations, 29 nonsense mutations, 23 are nucleotide deletion or insertion responsible of a frameshift, 19 are splicing mutations and 7 genomic deletions. Segregation analysis with microsatellite markers linked to the OCRL 1 gene showed three cases of germinal and somatic mosaicism among 18 families. Twenty three patients affected with Dent disease but without CLCN5 mutation were analyzed and 4 missense mutations, 1 splicing mutation and 1 genomic deletion were identified in the OCRL 1 gene. The PIP2 5-phosphatase activity in total fibroblast cellular extracts of 21 patient: affected with Lowe syndrome and 2 affected with Dent disease is greatly reduced compared to normal fibroblast. Western blot analysis of the OCRL 1 protein showed an important reduction for thé splicing mutations and the genomic deletion but a more variable quantity for the misssense mutations. OCRL 1 transcript are present in variable quantity in the patients affected with Lowe syndrome but also in the control patients. The preliminary clinical study of 55 patients with Lowe syndrome showed no evidence of a genotype phenotype correlation

Le gène OCRL1, responsable du syndrome de Lowe de transmission récessive liée à l'X, code pour une PIP2 5-phosphatase associée à l'appareil de Golgi. 107 mutations du gène OCRL1 ont été identifiées chez 146 familles de syndrome de Lowe et 6 mutations ont été identifiées chez 23 patients atteints de maladie de Dent sans mutation du gène CLCN5. L'haplotypage de 18 familles a mis en évidence 3 cas de mosaïcisme germinal et somatique. L'activité PIP2 5-phosphatase fibroblastique des patients est très abaissée par rapport à des fibroblastes normaux. L'analyse par Western blot de la protéine OCRL1 montre une diminution variable de la quantité protéique et pas forcément corrélée à l'activité résiduelle de la protéine. L'analyse des transcrits d'OCRL1 montre qu'il existe une variabilité quantitative chez les patients mais également chez les témoins. Les premières études cliniques chez 55 patients atteints de syndrome de Lowe ne montrent pas de corrélation génotype-phénotype évidente.

Les protéoglycanes (PGs) jouent un rôle important dans de multiples processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation et la migration cellulaires. Les PGs sont constitués d’une protéine porteuse sur laquelle sont fixées de façon covalente des chaînes hétéropolyssacharidiques de glycosaminoglycanes (GAGs). L’initiation de la biosynthèse des GAGs sur les PGs implique une glycosyltransférase, la ß1,3-galactosyltransférase 6 (ß3GalT6) qui catalyse l’addition d’un résidu galactose sur un disaccharide accepteur (Gal-Xyl) fixé au niveau de motifs d’ancrage des GAGs sur la protéine porteuse du PG. Des mutations de la ß3GalT6 ont été récemment associées à une forme pléiotropique du syndrome d’Ehlers-Danlos (SED), un groupe hétérogène de maladies génétiques rares touchant les constituants matriciels des tissus conjonctifs. L’implication de la ß3GalT6 dans la pathogénie du SED n’est cependant pas encore connue à ce jour, point qui sera exploré au cours de ce travail de thèse. Nous avons montré que la mutation du gène B3GALT6 conduit à une diminution de la biosynthèse des GAGs matriciels et membranaires, associée à une réduction de la capacité migratoire des fibroblastes de derme humain issus de patients atteints de SED par rapport aux fibroblastes contrôle, non porteurs de l’altération génétique. Une étude “gain et perte de fonction” a montré que l’extinction du gène B3GALT6 dans des fibroblastes contrôle impacte la biosynthèse des GAGs. De façon complémentaire, la restauration de l’expression de la ß3GalT6 dans les fibroblastes des patients a eu pour conséquences une augmentation du taux de synthèse des GAGs matriciels et membranaires, associée à une augmentation significative de la capacité de migration des cellules équivalente à celle des cellules non déficientes. Les résultats obtenus nous permettent de mieux comprendre le rôle de la ß3GalT6 dans la pathogénie du SED. Ces travaux ciblant la ß3GalT6 peuvent ouvrir la perspective de proposer des stratégies thérapeutiques visant à s’opposer à la perte d’anabolisme des GAGs et au défaut de migration observés dans le SED
Proteoglycans (PGs) play important roles in many physiological processes, including cell proliferation, differentiation and migration. PGs are composed of linear heteropolysaccharide chains, called glycosaminoglycans (GAGs), which are covalently attached to a core protein through a tetrasaccharide linkage. The addition of the third residue (galactose) of the linkage is catalyzed by ß1,3-galactosyltransferase 6 (ß3GalT6), a key glycosyltransferase in GAG initiation. Recently, mutations of ß3GalT6 have been associated to Ehlers-Danlos Syndrome (EDS), a group of rare and severe genetic connective tissue disorders. However, the role of ß3GalT6 defects in EDS pathogeny remains unknown. In my thesis, we showed that ß3GalT6 defective dermal fibroblasts of affected patients exhibited a marked reduction in GAG anabolism associated to a significant delay in wound closure compared to control cells. The ß3GalT6 gain- and loss-of-function studies demonstrated that B3GALT6 gene deletion in control fibroblasts affects the synthesis of GAGs chains. Interestingly, GAG anabolism and cell migration were restored when ß3GalT6 is overexpressed in patient fibroblasts, which could be the starting point to the development of therapeutic strategies against the loss of GAG synthesis and defect of cell migration observed in EDS. This work provides a better understanding of the crucial role of ß3GalT6 in EDS pathogeny

Les protéoglycanes (PGs) sont des composants majeurs de la matrice extracellulaire et jouent un rôle important dans l’organisation architecturale des tissus conjonctifs et dans la signalisation cellulaire. Les PGs sont composés de chaînes de glycosaminoglycanes (GAGs) attachées de façon covalente à une protéine core par une amorce tétrasaccharidique. L’addition du troisième résidu (galactose) est catalysée par la β1,3-galactosyltransférase 6 (β3GalT6), une enzyme clé de l’initiation de la synthèse des GAGs. Plusieurs études ont mis en évidence la présence de mutations de la β3GalT6 associées à la forme spondylodysplastique du Syndrome d’Ehlers-Danlos (SEDsp), une maladie génétique sévère des tissus conjonctifs et caractérisée par une fragilité des tissus, une hyperlaxité articulaire, une hyperextensibilité et des défauts de cicatrisation de la peau ainsi que des altérations du système musculo-squelettique. L’objectif de ce travail de thèse est de comprendre les conséquences fonctionnelles et structurales des mutations de la β3GalT6 et leur rôle dans la pathogénie du SEDsp, (i) en réalisant une caractérisation moléculaire et fonctionnelle de la protéine recombinante humaine et (ii) en développant un modèle cellulaire déficient en β3GalT6 pour étudier l’impact des défauts génétiques sur les fonctions métaboliques des cellules, en particulier sur la synthèse des GAGs. La première partie du projet vise à la détermination de l’impact des mutations sur la fonction de la β3GalT6. Pour ce faire, nous avons produit dans la bactérie et purifié différentes formes tronquées solubles de la β3GalT6. Les essais enzymatiques ont permis de déterminer les constantes cinétiques KM et kcat de la protéine sauvage. La seconde partie de ce travail de thèse a été de réaliser un modèle cellulaire déficient en β3GalT6 en utilisant la technologie CRISPR/Cas9. Les clones déficients obtenus présentent (i) un très faible niveau d’expression de l’ARNm, (ii) une absence d’activité galactosyltransférase et (iii) un défaut de synthèse des GAGs endogènes ou à partir d’un substrat exogène xylosidique. A partir de ce travail, nous avons acquis une meilleure compréhension de l’implication de la β3GalT6 et du le lien entre la perte de fonction de la β3GalT6 et les conséquences métaboliques et cellulaires de cette déficience génétique. Ces résultats devraient aider les cliniciens dans la prise en charge et le suivi clinique des patients atteints de SEDsp
Proteoglycans (PGs) are major components of cell plasma membranes and extracellular matrix. These macromolecules play an important role in matrix organization of connective tissues and in cell signaling or embryonic and post-natal development. PGs are composed of glycosaminoglycan (GAG) chains covalently attached to a core protein through a tetrasaccharide linkage ßGlucuronic acid-ß1,3-Galactose-ß1,3-Galactose-ß1,4-Xylose-ß1-O-ß. The addition of the third residue (galactose) is catalyzed by the ß1,3-Galactosyltransferase 6 (ß3GalT6), a key glycosyltransferase in GAG initiation. Our group and others discovered that mutations of ß3GalT6 are associated to a spondylodysplastic form of Ehlers-Danlos Syndrome (spEDS), a severe connective tissue disorder characterized by skin and bone fragility, musculoskeletal malformations, delayed wound healing, joint hyperlaxity and intellectual disabilities. The objectives of this project is to understand the functional and structural consequences of ß3GalT6 mutations in the development of spEDS, (i) achieving the molecular and functional characterization of the recombinant human β3GalT6 and (ii) to develop cellular models (as ß3GalT6 KO cells) to study the impact of genetic deficiency on cells metabolism, precisely on GAGs synthesis. The first part of the project is dedicated to the determination of mutation impact on the ß3GalT6 function. For this, we produce and purify several truncated soluble forms of hß3GalT6 in fusion to Maltose Binding Protein. The enzymatic activity tests have determined a KM of 30 µM and a kcat of 0,05 min-1 on wild-type enzyme. ß3GalT6 mutants will be further analyzed using the same approach. The second part of the project is achieving to develop a ß3GalT6 deficient cell model using the CRISPR/Cas 9 technology. Deficient clones obtained present (i) a low level of RNA expression, (ii) an absence of galactosyltransferase activity and (iii) a defect on endogenous GAG synthesis or with exogenous substrate. We also analyze the capacity for WT β3GalT6 and two mutants (Asp207His and Gly217Ser) to restore GAGs synthesis in deficient cells. From this work, we better understand the implication of β3GalT6 in the pathology of spEDS and relationships between ß3GalT6 loss of function, cellular consequences of genetic defect. Those results linked with the severity of spEDS clinical symptoms observed in patients, would help clinicians with management and clinical monitoring of spEDS patients

Les maladies rares sont d’identification récente. Elles posent de nombreuses difficultés diagnostiques parce qu'encore mal connues par le corps médical. Elles se présentent parfois par des symptômes que nous avons nommés comme disqualifiants parce que principalement subjectifs et sans manifestation objectivable ou visible par la biologie ou l’imagerie. Notre travail est au carrefour de la philosophie et de la psychologie sociale. Nous avons travaillé à partir du vécu de 16 malades qui ont participé à notre recherche par un entretien semi-dirigé. Les grandes thématiques de leur vécu ont ainsi pu être identifiées : l'expérience pathique de l’éprouvé, les modèles de représentation, les métaphores utilisées pour dire la génétique et la rareté, le lien avec le corps médical et l'expérience sociale des maladies. Pour les personnes atteintes, ces maladie rares ne sont ni des maladies ni des handicaps, mais un entre-deux.Compte tenu que 80 % des maladies rares sont d'origine génétique, nous avons exploré comment cette dimension intervient dans le vécu de la maladie rare. L'imaginaire de la génétique est encore très prégnant, évoquant l'origine causale linéaire de la maladie et tous les espoirs de guérison. Il est souvent associé à une représentation de l'erreur, de la faute ou de la malformation qui est survenue lors de la fécondation. C'est avec toutes ces représentations que les malades vont devoir reconstruire leur vie bouleversée par l'existence de la maladie pour laquelle malheureusement encore le plus souvent il n'existe pas de thérapeutique. Ce parcours nous a conduit à envisager une médecine qui intégrerait une médecine de l'incertitude et reconnaîtrait les limites de la connaissance médicale. À terme, cette médecine devrait pouvoir devenir celle de l’adaptabilité soutenant le travail d'adaptation du malade qui doit trouver le chemin pour continuer d’être un vivant malgré les limites imposées par la maladie. Sur ce chemin parfois très long, la narration, l’échange des savoirs et une importante solidarité entre malades au sein des associations de patients soutiennent les capacités du malade à se reconstruire comme sujet, lui ouvrant la possibilité de vivre son destin comme une destinée
Rare diseases have only recently been identified. They set up quite a lot of diagnostic difficulties because not well-known yet by the medical profession .They sometimes occure by (ou bien with? With symptoms we named as being disqualifying because mainly subjective and without any outbreak possibly objective or evident by biology or medical imaging.Our work is at the crossroad of philosophy and social psychology. Week-end worked on the base of actual experience of 16 sick patients cases who took part in our research through semi-managed talks. So,main themes of their actual current experience could be identified : the pathological of the suffering person, the models of representation,the images used to express the genetics and the rare case, the link with the medical profession and the social experience of the diseases. For the patients concerned,these rare diseases are neither diseases nor handicaps but in-between cases.Taking into account that 80% of rare diseases have a genetique genetic origine origin ,we explored how this theory involves in the way it is lived. The imaginary of genetics still is still very pregnant,calling forth the causal linear origin of the disease and all hopes for recovery .It is often connected to a representation of the error,the fault or the malformation that happened at the time of fecondation. It is with all these representations that patients will have to rebuild their life,upset by the disease against which unfortunately more often most of the time ,no therapy exists yet. This research lead us to view a therapy that would combine a therapy of uncertainty and admit the limits of medical knowledge. In the end, this therapy should be able to become the therapy of an adaptation supporting the adaptability work of the patient who has to find his way to keep being a human person. in spite of the limits compelled by the disease. All along this sometimes very long way, the exchange of knowledge and an amazing solidarity among the patients within the associations back up the patient's capacities to rebuild himself as a subject, giving him the possibility of living his fate as a destiny

Le syndrome de Netherton (SN) est une maladie génétique cutanée rare et sévère de l'enfant, caractérisée par une érythrodermie desquamative congénitale, une dysplasie pilaire spécifique et une atopie sévère. Notre équipe a identifié le gène dont les mutations sont responsables de la maladie, SPINK5, qui code pour LEKTI, un inhibiteur de protéase à sérine exprimé dans la couche granuleuse de l'épiderme. Afin de mieux comprendre la fonction de LEKTI dans l'homéostasie épidermique, nos travaux ont porté sur la caractérisation structurale et fonctionnelle de LEKTI. Nous avons montré que LEKTI était produit sous la forme de trois précurseurs rapidement clivés par la furine en de nombreux fragments qui présentent des capacités d'inhibition spécifiques vis-à-vis des kallikréines épidermiques (KLKs) 5, 7 et 14. Afin de mieux comprendre la physiopathologie du SN, nous avons généré un modèle murin Spink5-/-. Les nouveaux-nés KO présentent des érosions cutanées résultant d'une dégradation excessive des composants des jonctions intercellulaires due à l'hyperactivité de KLK5 et KLK7. Nous avons identifié par spectrométrie de masse une troisième protéase hyperactive, l'élastase 2 pancréatique (Ela2), dont l'expression épidermique n'était pas connue. Afin de comprendre son implication spécifique dans le développement du phénotype SN, nous avons généré des souris transgéniques pour Ela2. L'analyse de ces souris révèle qu'Ela2 joue un rôle essentiel dans la formation de la barrière cutanée et est impliquée dans le développement de nombreux aspects phénotypiques du SN. Ce travail identifie ainsi une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour le traitement de cette maladie orpheline
Netherton syndrome (NS) is a severe autosomal recessive skin condition characterized by congenital erythoderma, a specific hair shaft defect (Trichorrhexis invaginata) and a broad range of atopic manifestations. In 2000, we identified SPINK5 as the defective gene in NS. SPINK5 encodes LEKTI, a Kazal-type protease inhibitor, which is expressed in the granular layer of the epidermis. In order to understand the role of LEKTI in skin homeostasis, we undertook structural and functional studies. We showed that LEKTI is expressed as three high molecular weight precursors rapidly cleaved by furin in the intracellular compartment of keratinocytes prior to its secretion. Proteolytic maturation of LEKTI gives rise to a panel of proteolytic fragments carrying their own inhibitory capacity profile against epidermal kallikreins (KLK) 5, 7 and 14. In order to investigate the role of LEKTI in vivo, and to understand the pathophysiological events underlying NS, we have genetically engineered mice with a targeted disruption of Spink5. Spink5 deficient newborn mice suffer from severe skin erosions due to excessive desmosomal component cleavage by unregulated KLK5 and KLK7. In addition, we have identified by mass spectrometry a new epidermal proteinase, pancreatic elastase 2 (Ela2), which is hyperactive in the absence of LEKTI. In order to understand its biological role and to investigate its specific contribution to the development of the NS phenotype, we engineered Ela2 transgenic mice. The study of these mice demonstrates that Ela2 is involved in several aspects of the NS phenotype, and thus identifies Ela2 as a novel potential therapeutic target for the treatment of this orphan disease

L'obésité est une maladie multifactorielle complexe avec une forte composante génétique. Contrairement à l'obésité commune qui est une maladie polygénique, les formes d'obésité monogénique sont causées par un seul variant génétique rare avec un effet fort et délétère. Ces formes sont rares, précoces et généralement sévères, affectant environ 5% des individus atteints d'obésité. La plupart des mutations rares liées aux formes monogéniques de l'obésité ont été identifiées dans les gènes de la voie leptine-mélanocortine, qui est essentielle pour la régulation de la prise alimentaire. L'identification de ces gènes est cruciale dans la compréhension de la physiopathologie de l'obésité et l'élaboration de nouveaux traitements.J'ai tout d'abord étudié les variants rares hétérozygotes du gène PCSK1 qui code l'enzyme prohormone convertase 1 (PC1/3). PC1/3 est impliqué dans la voie leptine-mélanocortine. Les mutations bialléliques de PCSK1 causent une obésité précoce avec une endocrinopathie sévère. Les patients déficients en PCSK1 (hétérozygotes ou homozygotes) peuvent dorénavant être traités avec des injections de setmélanotide pour perdre du poids. Or l'impact des variants rares hétérozygotes de PCSK1 sur l'obésité, et leur pertinence en médecine de précision sont encore mal définis. Dans l'étude RaDiO incluant 9320 participants, 65 variants rares hétérozygotes de PCSK1 ont été identifiés et analysés in vitro. Ces variants ont été classés en cinq groupes suivant la sévérité de leur impact sur l'activité enzymatique de PC1/3. Les résultats d'analyses d'association ont révélé que les variants rares induisant une perte totale de fonction augmentaient fortement le risque d'obésité et l'indice de masse corporelle (IMC) alors que les variants des autres groupes avec un effet partiel ou neutre sur l'activité de PC1/3 n'avaient aucun effet sur l'adiposité. Nous avons observé que les outils de prédiction in silico étaient peu fiables pour détecter les mutations entraînant une perte totale de fonction.Dans un second temps, je me suis intéressée aux variants rares du gène DYRK1B. Bien que ce gène ne soit pas impliqué dans la voie leptine-mélanocortine, des variants pathogènes de DYRK1B ont été décrits chez plusieurs patients avec une obésité centrale, un diabète de type 2 (DT2) et une maladie des artères coronaires. Cependant, l'impact des variants rares de DYRK1B n'a pas été évalué à grande échelle. A partir de l'étude RaDiO incluant 9353 participants, 65 variants rares dans DYRK1B ont été détectés. Après une analyse in vitro de chaque variant, nous avons identifié 20 variants pathogènes ou probablement pathogènes (P/LP) d'après les critères de l'American College of Medical Genetics and Genomics. Parmi ces variants P/LP, six montraient un effet entrainant une perte totale de fonction de DYRK1B (P/LP-full). Les analyses d'association ont montré que les variants P/LP-full de DYRK1B étaient fortement associés à une augmentation de l'IMC et de la glycémie à jeun, et à un risque accru d'obésité et de DT2, alors que les variants P/LP n'avaient qu'un effet modeste sur l'adiposité et aucun impact sur l'homéostasie glucidique.En conclusion, l'utilisation de la génétique fonctionnelle a permis de mettre en évidence que seuls les variants hétérozygotes de PCSK1 et DYRK1B avec une perte de fonction totale causaient une obésité monogénique. Pour DYRK1B, l'obésité est en plus associée à un DT2. Ces résultats soulignent l'importance cruciale de déterminer in vitro l'impact fonctionnel des mutations en vue du diagnostic génétique et de l'éventuel choix d'un traitement approprié. Nous avons démontré que les tests de prédiction in silico ne sont pour l'heure pas assez précis
Obesity is a complex multifactorial disease with a strong genetic component. Unlike common obesity, which is a polygenic disease, monogenic forms of obesity are caused by a single rare genetic variant with a strong and deleterious effect. These monogenic forms are rare, early-onset and generally very severe, affecting around 5% of individuals with obesity. Most rare mutations associated with monogenic obesity are found in genes within the leptin-melanocortin pathway, which is crucial for the regulation of food intake. Identifying these genes is crucial for understanding the pathophysiology of obesity and developing new treatments.I initially studied rare heterozygous variants of the PCSK1 gene, which encodes the prohormone convertase 1 (PC1/3) enzyme. PC1/3 is involved in the leptin-melanocortin pathway. Biallelic mutations in PCSK1 cause early-onset obesity with severe endocrinopathy. Patients with PCSK1 deficiency (heterozygous or homozygous) can now be treated with setmelanotide injections to promote weight loss. However, the impact of rare heterozygous variants of PCSK1 on obesity and their relevance in precision medicine are still not well-defined. In the RaDiO study, which included 9,320 participants, 65 rare heterozygous variants of PCSK1 were identified and assessed in vitro. These variants were classified into five groups based on the severity of their impact on the enzymatic activity of PC1/3. Association analysis results revealed that rare variants inducing a complete loss of function significantly increased the risk of obesity and body mass index (BMI), whereas variants in other groups with partial or neutral effects on PC1/3 activity had no impact on adiposity. We observed that in silico prediction tools were unreliable in detecting mutations leading to a complete loss of function.Subsequently, I focused on rare variants of the DYRK1B gene. Although this gene is not directly involved in the leptin-melanocortin pathway, pathogenic variants of DYRK1B have been described in several patients with central obesity, type 2 diabetes (T2D), and coronary artery disease. However, the impact of rare DYRK1B variants has not been assessed on a large scale. In the RaDiO study, which included 9,353 participants, 65 rare variants in DYRK1B were detected. Following in vitro analysis of each variant, we identified 20 pathogenic or likely pathogenic variants (P/LP) according to the criteria of the American College of Medical Genetics and Genomics. Among these P/LP variants, six showed an effect leading to a complete loss of function of DYRK1B (P/LP-full). Association analyses showed that P/LP-full variants of DYRK1B were strongly associated with increased BMI and fasting glucose levels, as well as a heightened risk of obesity and T2D, whereas P/LP variants had only a modest effect on adiposity and no impact on glucose homeostasis.In conclusion, the use of functional genetics has demonstrated that only heterozygous variants of PCSK1 and DYRK1B with a complete loss of function cause monogenic obesity. For DYRK1B, obesity is additionally associated with T2D. These results underscore the critical significance of assessing the functional impact of mutations in vitro for genetic diagnosis and the potential selection of appropriate treatments. We have demonstrated that in silico prediction tests are currently not precise enough

La dystrophie myotonique (DM) est considérée comme l'une des maladies neuromusculaires les plus complexes. Bien que les travaux de recherche de ces 30 dernières années aient permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents, la nature de l'anomalie génétique hors norme, son expression multisystémique et son large spectre clinique ne permettent pas, à l'heure actuelle, une prise en charge optimale des patients. Mon travail a eu pour but d'approfondir les connaissances et de préciser l'histoire naturelle de cette maladie rare. La première partie du manuscrit est consacrée à la présentation de l'observatoire DM-Scope, sur lequel s'appuie tout mon travail de thèse. Après la description du concept, du fonctionnement et de la plateforme de recueil, les caractéristiques de la cohorte DM1, à partir de laquelle les analyses ont été réalisées, sont présentées : spectre clinique couvert, atteinte multisystémique, corrélations génotype/phénotype, interrelations entre les symptômes et comparaison à la dystrophie myotonique de type II (DM2). Ensuite, dans une deuxième partie, nous abordons les avancées majeures obtenues dans les DM grâce à DM-Scope et aux analyses réalisées pendant ma thèse : (i) précision de l'histoire naturelle de la maladie, notamment avec la proposition d'une nouvelle classification ; (ii) mise en exergue de facteurs déterminants du phénotype comme le genre, la taille de la mutation ou les interrelations entre les symptômes. Ces travaux ont conduit à des recommandations de soins, notamment pour la transition enfants-adultes mais aussi la validation de critères d'inclusion importants pour les essais cliniques comme le genre. DM-Scope permet d'accéder à des échantillons biologiques pour des études de recherche fondamentale et valider de nouvelles approches thérapeutiques. Il est aujourd'hui un leader à l'international et un outil incontournable dans la recherche translationnelle dans la DM. Ce concept transférable à n'importe quelle autre population, peut être utilisé pour la prise en charge d’autres maladies rares. Enfin, le développement d'un modèle de survie construit à partir de la cohorte DM de l'observatoire est présenté. Ce modèle a trois spécificités : (i) il est applicable en grande dimension, à des cas comme DM-Scope, où l'on a un nombre important de variables; (ii) il prend en compte les risques compétitifs, lorsque les patients sont exposés simultanément à plusieurs évènements. Dans notre observatoire, l'étude des décès de cause respiratoire est biaisée sans la prise en compte des évènements concurrents tels que le décès de cause cardiaque; (iii) il modélise l'hétérogénéité entre les groupes de patients (effets centres), potentiellement due à une prise en charge différente. L'analyse des données de DM-Scope nécessite cette spécificité issue des modèles à fragilité car l'observatoire est multicentrique (55 centres). Le modèle est transférable et applicable à d'autres données car de plus en plus de bases sont de grandes dimensions, la majorité des analyses de survie ont une censure liée à la survenue de l'événement d'intérêt et les études multicentriques sont de plus en plus communes
Myotonic dystrophy (DM) is considered one of the most complex neuromuscular diseases. Although research work over the past 30 years has permitted a better understanding of its underlying molecular mechanisms, the unusual nature of its genetic anomalies, its multisystemic expression and its broad clinical spectrum do not allow, at the moment, optimal patient management. The purpose of my work was to deepen our knowledge of this rare disease and to clarify its natural history. The first part of my manuscript is dedicated to the presentation of the DM-Scope Registry, on which all my thesis work is based. After the description of the concept, the functioning and the data collection platform, the manuscript features the characteristics of the DM1 cohort, from which our analyses were conducted : the clinical spectrum covered, multisystemic impairment, genotype/phenotype correlations, interrelations between symptoms and comparison to myotonic dystrophy type II (DM2). In the second part, we focus on the major progress achieved through the existence of DM-Scope and the analyses conducted during my thesis: (i) detailing the natural history of the disease, in particular proposing a new classification; (ii) highlighting the phenotype’s determining factors such as gender, mutation size, interrelations between symptoms. This work has led to recommendations for care, in particular for the transition from child to adult, but also the validation of important inclusion criteria for clinical trials such as gender. DM-Scope provides access to available biological samples for basic research studies and validates new therapeutic approaches. DM-Scope is now a worldwide leader and an essential tool in translational research in DM. The DM-Scope concept can be transferred to any other population and can be used for care management in other rare diseases. Finally, we present the development of a survival model built from the DM-Scope cohort. This model has three specificities: (i) it is applicable to high dimensional data, in such cases as DM-Scope, where there is a large number of measurements; (ii) it takes into account competitive risks, when patients are simultaneously exposed to several events. In our registry, the study of respiratory-related deaths is biased if competing events such as heart disease deaths are not taken into account ; (iii) it models the heterogeneity between patient groups probably due to divergent care, called \og centres effects \fg{}. DM-Scope data analysis requires such specificity of frailty models due to its multicentric coverage (55 centres). This model can be transferred and applied to other data, considering the following : more and more large-scaled registries are being used ; a majority of survival analyses includes censorship caused by the occurrence of the event of interest ; multicentre studies have become increasingly common

La tuberculose, causée par Mycobacterium tuberculosis, connaît actuellement une résurgence inquiétante, et l’OMS estime à plus de 10 millions le nombre de nouveaux cas cliniques en 2015 avec environ 1,8 millions de décès dus à la maladie. Environ un tiers de la population mondiale est exposée à M.tuberculosis, et après exposition, la plupart des individus sont infectés par la mycobactérie. La grande majorité (~90%) des individus infectés ne présentera jamais de symptomatologie clinique. Parmi les 10% qui développent la maladie, environ la moitié le fera dans les deux années suivant l’infection, ce qui est en général considéré comme une forme primaire de tuberculose. Les autres patients présenteront leur maladie à distance de l’infection primaire (parfois plusieurs dizaines d’années plus tard) ; il s’agit des formes pulmonaires classiques de l’adulte. Chez l’homme, le rôle de certains facteurs génétiques a été maintenant démontré dans le développement d’une tuberculose active, à la fois la tuberculose pulmonaire de l’adulte et les formes plus disséminées de l’enfant, et aussi dans le contrôle de l’infection tuberculeuse. Cependant, la plus grande part de ces facteurs génétiques reste à identifier. Le premier objectif de ma thèse était d'identifier les facteurs génétiques de l'hôte modulant les phénotypes immunologiques de production d'Interféron gamma in vitro (IGRA) après exposition à M. tuberculosis dans un échantillon de 590 individus ayant été en contact avec un cas avéré de tuberculose dans le Val de Marne, en région parisienne. Puis, dans un second temps, de voir si les facteurs trouvés pouvaient être répliquées dans un échantillon familial d'Afrique du Sud, zone de très forte endémie tuberculeuse. Pour cela, j'ai tout d'abord réalisé des analyses de liaison génétique à l'échelle du génome entier sur plusieurs phénotypes quantitatifs d'IGRA. Celles-ci ont permis de mettre en évidence 2 loci majeurs (p < 10-4) répliqués en Afrique du Sud et liés à la production d'interféron gamma induite pour l’un par le bacille du BCG, et pour l’autre, par la part spécifique de l'antigène ESAT6 de M. tuberculosis (absent de la plupart des mycobactéries environnementales et du BCG), indépendamment de la capacité intrinsèque de réponse aux mycobactéries. La seconde étape a consisté en la réalisation d'une étude d'association sur les régions de liaison ainsi identifiées. Un variant associé au phénotype spécifique de l’ESAT6 (p < 10-5) a ainsi été trouvé, variant contribuant de manière significative au pic de liaison précédemment découvert (p<0.001) et ayant été rapporté comme modulant l’expression du gène ZXDC. Le second objectif de la thèse concernait l’identification de variants génétiques rares sous-jacents à la déclaration d’une tuberculose pulmonaire chez les individus infectés par le bacille. A cette fin, j’ai comparé les exomes de 120 patients tuberculeux à ceux de 136 individus infectés par le bacille mais non malades, tous originaires du Maroc. Cette étude m’a permis d’identifier le gène BTNL2, en bordure de la région HLA, dans lequel près de 10% des patients comportaient un variant rare perte de fonction contrairement aux contrôles qui n’en présentaient aucun
Tuberculosis remains a major public health concern, with approximately 10.4 million new cases and 1.8 million deaths due to the disease in 2015 according to WHO. While an estimated one third of the world population is estimated to be infected with Mycobacterium tuberculosis, only about 10% of infected individuals go on to develop a clinical disease. Among them, half will declare the disease in the 2 years following infection, which is generally considered as primary tuberculosis. The other patients will develop the disease more distant in time of primary infection, sometimes several tens of years latter; these are classical pulmonary forms in adults. In humans, the role of genetic factors have been demonstrated in the development of active tuberculosis, in pulmonary forms as in disseminated forms in childhood, et also in the control of M.tuberculosis infection. Nevertheless, most of these genetic factors remain to identify. The first aim of my PhD was to identify genetic factors controlling in vitro interferon-gamma production phenotypes (IGRA) after exposure to M.tuberculosis in a sample of 590 subjects who were in contact with a proven tuberculous patient in Val-de-Marne, Paris suburbs, and in a second time, to try to replicate the findings in a south African familial sample where the tuberculosis is highly endemic. For this purpose, I first performed genome-wide genetic linkage analysis for several quantitative IGRA phenotypes. They led to identify 2 major loci (p<10-4) replicated in South-Africa and linked to the interferon-gamma production induced by live BCG for the first one, and for the second one, by the specific part of the ESAT6 antigen of M.tuberculosis (absent from most of environmental mycobacteria and from BCG), independently of intrinsic ability to respond to mycobacteria. The second step was an association study in the identified linkage regions. A variant associated to the specific ESAT6 phenotype was found (p<10-5), which was significantly contributing to the linkage peak (p<0.001) and previously reported as eQTL of ZXDC gene. The second objective of my PhD was the identification of rare genetic variants underlying the development of pulmonary tuberculosis in infected individuals. To this end, I compared exome data from 120 tuberculous patients and 136 infected individuals without any clinical symptoms. All of them were from Morocco. This study resulted in the lighting of BTNL2 gene, very closed to the HLA region, in which around 10% of patients had a rare loss of function variant whereas the controls didn’t have any

Les maladies rares sont définies en Europe par une prévalence inférieure à 1/2 000 cas et représentent plus de 7000 entités différentes dont 80% sont d’origine génétique. La majorité est de début pédiatrique. J’ai réalisé l’étude de cas familiaux rares avec récurrence dans la fratrie de cardiopathies congénitales avec hétérotaxie (défaut de latéralité gauche/droite) d’une part, et de mort subite cardiaque inexpliquée chez le nourrisson ou en période néonatale d’autre part. La stratégie d’identification de gène par séquençage de l’exome au sein de ces familles dans l’hypothèse d’une transmission autosomique récessive a permis d’identifier trois gènes et d’en étudier deux sur le plan fonctionnel dans différents modèles : 1) Perte de fonction de MMP21 et malformations cardiaques congénitales par anomalie de latéralité embryonnaire. MMP21 code pour une métallopeptidase matricielle dont nous démontrons le rôle très spécifique au niveau du nœud embryonnaire sur un modèle poisson zèbre et souris. Ceci ouvre de nouvelles perspectives dans la compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la mise en place de l’asymétrie gauche/droite chez la plupart des vertébrés. De manière intéressante, alors que tous les mammifères ont le cœur latéralisé à gauche, tous n’ont pas un gène MMP21 codant. Il existe donc plusieurs voies de signalisation de l’asymétrie gauche/droite chez les vertébrés. 2) Mutations hypomorphes de PPA2 et mort subite cardiaque chez le nourrisson. PPA2 code pour une pyrophosphatase mitochondriale et les données chez la levure ont montré que la fonction de cette enzyme était essentielle au fonctionnement mitochondrial. Nous décrivons une nouvelle présentation clinique de maladie mitochondriale responsable de décès par arrêt cardiaque inattendu chez le nourrisson. 3) Perte de fonction de PLCD3 et cardiomyopathie foudroyante par apoptose et nécrose diffuse des cardiomyocytes en période néonatale. Ce résultat nécessite encore d’être confirmé par l’identification d’autres cas mais la fonction de la protéine et des données chez la souris sont des arguments majeurs en faveur de la causalité du gène. Au total, ces travaux sont déterminants à la fois sur le plan clinique dans le cadre du conseil génétique pour les familles concernées et sur le plan fondamental en éclairant les mécanismes biologiques de mise en place de l’axe gauche-droit au cours du développement embryonnaire avec MMP21, sur le rôle essentiel de PPA2 dans la mitochondrie et sur celui de PLCD3 dans la survie des cardiomyocytes en postnatal
Rare diseases are defined in Europe by a prevalence of less than 1/2,000 individuals and represent more than 7,000 different diseases of which 80% are genetic. Most have a paediatric onset. My project involved the study of rare cardiac disorders in familial cases with recurrence in siblings, focusing on congenital heart disease in the context of heterotaxia (laterality defects) and sudden unexpected death due to cardiac arrest in infancy and the neonatal period. Whole exome sequencing was used as a tool for disease gene discovery in these families with the hypothesis of autosomal recessive inheritance. This strategy led to the identification of 3 novel disease genes. I performed functional validation for two of these genes in different models, confirming their involvement in each disease. 1) Loss of function of MMP21 and cardiac malformations due to left-right patterning defects during embryonic development. MMP21 encodes a metallopeptidase for which I demonstrated a highly specialized role in the generation of left-right asymmetry at the node using zebrafish. This gives new insight into the molecular mechanisms at the origin of left-right asymmetry in vertebrates. Interestingly, all mammals have a left-sided heart, but some species have lost the Mmp21 gene, indicating that there are different pathways leading to left-right determination in vertebrates. 2) Hypomorphic mutations in PPA2 cause sudden cardiac arrest in infants. PPA2 is a nuclear gene encoding the mitochondrial pyrophosphatase and using a yeast model we showed that this enzyme is essential for the mitochondrial energy transducing system and biogenesis. I described a novel clinical spectrum for a mitochondrial disease responsible for unexpected cardiac arrest in infancy. 3) PLCD3 loss of function and fatal cardiomyopathy by cardiomyocyte apoptosis and necrosis in neonates. Exome sequencing in one familial case with 2 siblings presenting fatal cardiomyopathy led to the identification of compound heterozygous mutations in PLCD3, a gene previously implicated in a similar pathology in a mouse model. Identification of further cases with mutations in this gene will be needed in order to confirm the role of PLCD3 in the disease. In total, these studies are crucial from a clinical point of view for the genetic counseling of the affected families and they contribute to the elucidation of biological mechanisms of embryonic development and left-right determination (MMP21), mitochondrial function (PPA2) and post-natal cardiomyocyte survival (PLCD3)

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1), est une maladie génétique héréditaire affectant environ 1/8000 personnes. Les patients souffrant de DM1 développent essentiellement des troubles musculaires tels qu’une faiblesse et une atrophie musculaire. La cause de la DM1 est expliquée par la mutation du gène "DMPK". Lors de ma thèse, j’ai pu démontrer que l’épissage de l’ARNm BIN1 était altéré dans le muscle DM1. En effet, l’exon 7 de BIN1, qui est absent du muscle normal, est exprimé de façon aberrante chez les patients DM1. En utilisant un modèle murin, j’ai prouvé que l’expression forcée de l’exon 7 de BIN1 altérait simultanément la structure et la fonction du muscle. Nous avons notamment observés une diminution de la taille des fibres musculaires et une augmentation de la faiblesse musculaire, comparé à des souris normales. Par conséquent, ce travail aidera à la compréhension du mécanisme de la maladie et pourrait expliquer les causes de la faiblesse musculaire et de l’atrophie
Myotonic dystrophy of type 1 (DM1), is an inherited genetic disease affecting around 1 in 8000 person. Patients suffering from DM1 develop essentially muscle disorders such as muscle weakness, muscle loss and atrophy. The cause of DM1 is explained by the mutation of a gene called “DMPK“.During my thesis, I discovered that the alternative splicing of BIN1 mRNA was altered in the muscle of DM1 patients. Indeed, the BIN1 exon 7, which is normally absent in healthy muscle, is aberrantly expressed in DM1 muscle. By using a mouse model, I found that the forced expression of BIN1 exon 7 was responsible of the alteration of both muscle structure and function. Notably, we found a decrease in muscle fibers area (atrophy) and an increase of muscle weakness, compared to wild-type mice. Therefore, this work will help in the understanding of the disease mechanism and could explain the causes of muscle weakness and atrophy, which have never been elucidated to this date

Environ 6000 à 8000 maladies rares différentes existent aujourd’hui, affectant environ 6 à 8% de la population mondiale. La grande majorité d’entre elles correspond à des maladies génétiques, pour lesquelles il n'existe pas de traitement curatif. La révolution génomique a augmenté l’espoir d’obtenir des traitements spécifiques du défaut génétique pour de nombreuses maladies. Dans ces conditions, le traitement et l’analyse des données ne sont pas triviaux et s’éloignent de la simple routine.Cette thèse rapporte la création de Saut d'exon, capables d’aider les chercheurs et les cliniciens à identifier les mutations responsables de certaines maladies et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ainsi, les systèmes Human Splicing Finder et UMD-Predictor permettent respectivement de prédire l’effet d’une mutation sur l’épissage et la fonction de la protéine. Ils ont été validés grâce à des jeux de données de référence et/ou issus de la littérature, et peuvent aider les cliniciens à annoter correctement les variations de signification inconnue. De plus, cette thèse propose deux outils à visées thérapeutiques : Skip-E, un outil d’identification des AON candidats à la thérapie par saut d’exon, et NR-Analyser, un système de prédiction des codons de terminaison prématurés candidats à la thérapie par translecture des codons stop.Ces différents systèmes s'intègrent dans un projet plus global dédié à la recherche translationnelle. Par ces deux volets, prédictif et thérapeutique, cette thèse s’inscrit dans une stratégie de recherche en adéquation avec les objectifs du Consortium International pour la Recherche contre les Maladies Rares, l’IRDiRC
About 6,000 to 8,000 distinct rare diseases exist today and are estimated to affect 6-8% of the world population. The vast majority of them are genetic and for most of them there is no cure. The genomic revolution has increased the hope of specific treatments based on the gene for many diseases. New technologies have emerged, changing drastically data scale produced in biomedical research. In these conditions, treatment and analysis of data are far from trivial and mere routine, despite spectacular advances in computer technology.This thesis reports the creation of bioinformatics systems, capable of helping researchers and clinicians to identify mutations responsible for certain diseases and to develop new therapies. Thus, the Human Splicing Finder and UMD-Predictor systems predict the effect of a mutation on splicing and protein, respectively. Both bioinformatics systems have been validated through high quality reference datasets, and may help clinicians to properly annotate variations of unknown significance. In addition, this thesis offers two new systems for therapeutic purposes: the Skip-E system identifies optimal candidates AONs for exon skipping therapies, and NR-Analyser, a system that predicts premature termination codons potentially candidates to nonsense readthrough therapies.These different systems are part of a larger project dedicated to translational research. With its predictive and therapeutic aspects, this thesis is part of a research strategy matching with the objectives of the IRDiRC (International Rare Diseases Research Consortium)

Les études d'association à grande échelle consistent à étudier la corrélation de plusieurs millions de polymorphismes nucléotidiques avec un risque de cancer chez des milliers d'individus, sans avoir besoin de connaissances préalables sur la fonction biologique de ces variants. Ces études ont été utiles pour établir des hypothèses étiologiques et comprendre l'architecture génétique sous-jacente de plusieurs maladies humaines. Cependant, la plupart des facteurs héréditaires de ces maladies restent inexpliqués. Une partie de cette variation pourrait venir de variants rares qui ne sont pas ciblés par les puces de génotypage actuelles ou encore de variants avec un effet plus modéré voire faible pour lesquels une détection par les études d'association actuelles n'est pas envisageable. Dans ce contexte et comme illustré dans cette thèse, les récentes études d'association peuvent maintenant servir de point de départ pour de nouvelles découvertes, en mettant en place des stratégies innovantes pour étudier à la fois les variants rares et les maladies rares. Nous avons plus particulièrement exploré ces techniques dans le cadre du cancer du poumon, des voies aérodigestives et du lymphome de Hodgkins. L'utilisation de la bioinformatique pour combiner les résultats des études avec d'autres sources d'information, l'intégration de différents types de données génomiques ainsi que l'investigation de la relation entre altérations germinales et somatiques représentent les principales opportunités poursuivies dans ce travail de thèse
Genome-wide association (GWA) studies consist in testing up to one million (or more) single nucleotide polymorphisms (SNPs) for their association with cancer risk in thousands of individuals, without requiring any prior knowledge on the functional significance of these variants. These studies have been valuable for establishing etiological hypotheses and understanding the underlying genetic architecture of human diseases. However, most of the heritable factors of these traits remain unexplained. Part of this variation may come from rarer variants that are not targeted by current genotyping arrays or variants with moderate to low effects for which detection by current GWA studies is impractical. In this context and as illustrated in this thesis, GWA studies can now serve as starting points towards further discoveries, looking for new strategies to study both rarer variants and rarer diseases. We have specifically explored these approaches in the context of lung cancer, head and neck cancer and Hodgkin's lymphoma. The use of bioinformatics to combine recent GWA study results with other sources of information, the integration of different types of genomic data as well as the investigation of the interrelationship between germline and somatic alterations represent the main opportunities pursued in this thesis work

La maladie de Parkinson (MP) est une affection neurodégénérative invalidante et incurable. Il est maintenant clairement établi que d’importants déterminants génétiques prédisposent à son apparition. La recherche génétique sur des formes familiales de la MP a mené à la découverte d’un minimum de six gènes causatifs (SNCA, LRRK2, Parkin, PINK1, DJ-1 and GBA) et certains, par exemple LRRK2, contiennent des variations génétiques qui prédisposent également aux formes sporadiques. La caractérisation des protéines codées par ces gènes a mené à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sousjacents. Toutefois, en dépit de ces efforts, les causes menant à l’apparition de la MP restent inconnues pour la majorité des patients. L’objectif général des présents travaux était d’identifier des mutations prédisposant à la MP dans la population canadienne-française du Québec à partir d’une cohorte composée principalement de patients sporadiques. Le premier volet de ce projet consistait à déterminer la présence de mutations de LRRK2 dans notre cohorte en séquençant directement les exons contenant la majorité des mutations pathogéniques et en effectuant une étude d’association. Nous n’avons identifié aucune mutation et l’étude d’association s’est avérée négative, suggérant ainsi que LRRK2 n’est pas une cause significative de la MP dans la population canadienne-française. La deuxième partie du projet avait pour objectif d’identifier de nouveaux gènes causatifs en séquençant directement des gènes candidats choisis à cause de leurs implications dans différents mécanismes moléculaires sous-tendant la MP. Notre hypothèse de recherche était basée sur l’idée que la MP est principalement due à des mutations individuellement rares dans un grand nombre de gènes différents. Nous avons identifié des mutations rares dans les gènes PICK1 et MFN1. Le premier code pour une protéine impliquée dans la régulation de la transmission du glutamate tandis que le second est un des acteurs-clés du processus de fusion mitochondriale. Nos résultats, qui devront être répliqués, suggèrent que le séquençage à grande échelle pourrait être une méthode prometteuse d’élucidation des facteurs de prédisposition génétiques à la MP ; ils soulignent l’intérêt d’utiliser une population fondatrice comme les canadiens-français pour ce type d’étude et devraient permettre d’approfondir les connaissances sur la pathogénèse moléculaire de la MP.
Parkinson’s disease (PD) is a complex neurological disorder with significant genetic predisposing factors which are extremely heterogeneous. Investigations of familial forms of the disorder revealed causative mutations in six different genes, namely SNCA, LRRK2, Parkin, PINK1, DJ-1 and GBA, and functional analyses of these gene products pinpointed dysfunction of key molecular pathways involved in the neurodegenerative process of the disorder. Further sequencing and genome-wide association studies indicated that some of these genes, including LRRK2, also contain variants predisposing to sporadic forms of PD. Despite these significant breakthroughs, the vast majority of PD genetic predisposing factors remain unknown. Our goal was to identify mutations predisposing to PD in the French Canadian (FC) population from a cohort mostly composed of late-onset sporadic cases. We therefore sequenced the two exons of LRRK2 that contain most of the pathogenic mutations and we performed a case-control association study. Sequencing analysis did not reveal any reported or novel mutations and the case-control association study did not provide any positive signal, thus indicating that common variants in LRRK2 are unlikely to be a significant cause of late-onset PD in the FC population. Because of the allelic and non-allelic genetic heterogeneity observed for PD, we hypothesized that dozens of genes may carry rare pathogenic mutations. The second part of this research project was therefore aimed at identifying new PD causative genes by direct sequencing of genes functionally associated with the known causative gene pathways. Our screening uncovered several rare mutations likely pathogenic in the PICK1 and the MFN1 genes. PICK1 is involved in internalization of AMPA receptors whereas MFN1 is one of the core components of the mitochondrial fusion/fission machinery. Although these observations will need to be replicated, our findings support the previously suspected pathogenic role for glutamate excitotoxicity and imbalanced mitochondrial dynamics in Parkinson’s disease. They further emphasize the value of inbred populations in genetic studies of PD and provide new clues to the molecular pathogenesis of the disorder.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la maladie des neurones moteurs la plus fréquente, affectant 4-6 individus par 100,000 habitants à l’échelle mondiale. La maladie se caractérise par une faiblesse et une atrophie musculaire suite à la dégénérescence des neurones du cortex moteur, tronc cérébral et moelle épinière. Les personnes atteintes développent les premiers symptômes à l’âge adulte et la maladie progresse sur une période de trois à cinq ans. Il a été répertorié qu’environ 10% des patients ont une histoire familiale de SLA; 90% des gens affectés le sont donc de façon sporadique. La découverte il y a 19 ans de mutations dans le gène zinc/copper superoxide dismutase (SOD1), présentes dans 15-20% des cas familiaux de SLA et environ 2% du total des individus affectés, a été l’événement déclencheur pour la découverte de variations génétiques responsables de la maladie. La recherche sur la génétique de la SLA a connu une progression rapide ces quatre dernières années avec l’identification de mutations dans de nouveaux gènes. Toutefois, même si certains de ces gènes ont été démontrés comme réellement liés à la maladie, la contribution d’autres gènes demeure incertaine puisque les résultats publiés de ceux-ci n’ont pas, à ce jour, été répliqués. Une portion substantielle de cas reste cependant à être génétiquement expliquée, et aucun traitement à ce jour n’a été démontré comme étant efficace pour remédier, atténuer ou prévenir la maladie. Le but du projet de recherche de doctorat était d’identifier de nouveaux gènes mutés dans la SLA, tout en évaluant la contribution de gènes nouvellement identifiés chez une importante cohorte multiethnique de cas familiaux et sporadiques. Les résultats présentés sont organisés en trois sections différentes. Dans un premier temps, la contribution de mutations présentes dans le gène FUS est évaluée chez les patients familiaux, sporadiques et juvéniles de SLA. Précisément, de nouvelles mutations sont rapportées et la proportion de mutations retrouvées chez les cas familiaux et sporadiques de SLA est évaluée. De plus, une nouvelle mutation est rapportée dans un cas juvénile de SLA; cette étude de cas est discutée. Dans un deuxième temps, de nouvelles avenues génétiques sont explorées concernant le gène SOD1. En effet, une nouvelle mutation complexe est rapportée chez une famille française de SLA. De plus, la possibilité qu’une mutation présente dans un autre gène impliqué dans la SLA ait un impact sur l’épissage du gène SOD1 est évaluée. Finalement, la dernière section explique la contribution de nouveaux gènes candidats chez les patients atteints de SLA. Spécifiquement, le rôle des gènes OPTN, SIGMAR1 et SORT1 dans le phénotype de SLA est évalué. Il est souhaité que nos résultats combinés avec les récents développements en génétique et biologie moléculaire permettent une meilleure compréhension du mécanisme pathologique responsable de cette terrible maladie tout en guidant le déploiement de thérapies suite à l’identification des cibles appropriées.
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is the most common of motor neuron diseases, affecting 4-6 individuals per 100,000 individuals worldwide. ALS is characterized by muscle weakness and atrophy caused by the degeneration of neurons located in the motor cortex, brain stem and spinal cord. This fatal disease generally has an adult onset and progresses over a three to five year period. While 10% of patients affected have a family history of the disease, 90% of cases do not and are considered sporadic. The finding of mutations in the zinc/copper superoxide dismutase gene (SOD1) gene 19 years ago in about 15-20% of familial ALS (FALS) patients and approximately 2% of overall cases developed the interest of identifying rare genetics variants causing the disease. The ALS research field experienced a rapid progression during the last four years as mutations in new genes have been identified. While mutations in some of those new genes have been clearly linked to ALS, the role of others is still questionable and so far has not been positively replicated in other populations. Importantly, a significant portion of cases still need to be genetically explained and, unfortunately, there is still no effective treatment to cure, attenuate or prevent the disease. The aim of this Ph.D research project was to identify new ALS mutated genes while analysing the causative role of other newly identified genes in a large familial and sporadic ALS cohort of different origins. The results presented here are categorized into three different sections. First, the contribution of FUS mutations to familial, sporadic and juvenile ALS is analysed. Specifically, new FUS mutations are reported in ALS cases and the proportions of variants present in the tested familial and sporadic ALS cohorts are assessed. In addition, a new mutation is reported in a juvenile ALS patient, and this interesting case is discussed. Second, new genetic avenues are explored for the SOD1 gene. Precisely, a new and complex SOD1 mutation is reported in a French ALS family. Moreover, the possibility that other ALS mutated genes influence SOD1 splicing events is evaluated. Third, the contribution of new candidate genes is evaluated. Precisely, the contribution of OPTN, SIGMAR1 and SORT1 genes to the ALS phenotype is assessed. Hopefully, our different findings combined with recent developments in genetics and molecular biology will permit a better understanding of the pathological mechanisms involved in the disease and will lead to the identification of the right targets in order to develop appropriate therapeutics for ALS patients.