Teses / dissertações sobre o tema "Facteurs de transcription NRF2"

Les espèces chimiques dérivées par réduction incomplète de l'oxygène, les ROS pour « Reactive Oxygen Species », et espèces réactives dérivées de l'azote, les RNS pour « Reactive Nitrogen Species », sont potentiellement toxiques pour les cellules, car leur pouvoir oxydant leur confère une grande réactivité sur la plupart des molécules biologiques. Des systèmes cellulaires existent, qui assurent leur maintien à des concentrations non toxiques. Cependant, l'oxygène est nécessaire aux cellules pour son rôle d'accepteur final d'électrons dans la chaîne respiratoire, et certains ROS ou RNS sont nécessaires à l'accomplissement de diverses fonctions biologiques. En particulier, l'H2O2 participe en tant que second messager à la signalisation cellulaire en aval de l'engagement de certains récepteurs à des facteurs de croissance. Notre objectif est de documenter le rôle possible de ces espèces réactives dans la signalisation cellulaire chez les mammifères, en mettant en évidence des protéines cibles de l'oxydation, et en étudiant l'effet fonctionnel de ces oxydations. Nous avons choisi d'étudier la formation de ponts disulfures en réponse peroxyde d'hydrogène H2O2 et au monoxyde d'azote NO dans la protéine Keap1, qui régule l'activité du facteur de transcription Nrf2, et le facteur de transcription Bach2. Nrf2 et Bach2 sont deux facteurs de transcription de la famille des protéines à CNC-bZip, et contrôlent tous deux l'expression de gènes régulés en cis par des séquences de type ARE, pour « Antioxidant Responsive Element".

Les adjuvants vaccinaux permettent d’augmenter la réponse immunitaire dirigée contre un antigène donné. Certains de ces adjuvants miment des signaux de danger, tels que des agonistes des récepteurs de l’immunité, les récepteurs Toll-like (TLR) ou les récepteurs NOD-like (NLR), et permettent une activation des cellules dendritiques (DC). Les DC sont essentielles dans la mise en place d’une réponse adaptative contre un antigène : elles acquièrent un phénotype mature, contrôlé par les voies des MAPK et NF-κB, permettant la présentation de l’antigène aux lymphocyte T et l’initiation d’une réponse spécifique. La voie Nrf2/Keap1, impliquée principalement dans la détoxication des xénobiotiques et le contrôle du stress oxydant, peut être activée en réponse à des agonistes des TLR tels que le LPS (agoniste TLR 4). Nous avons mis en évidence qu’un traitement par le R848 (agoniste TLR7/8) ou le MDP (agoniste NOD2) induit la transcription des gènes cibles de Nrf2 dans les DC murines. Nrf2 participe également à la production de cytokines inflammatoires en réponse au LPS et au R848 et jouet un rôle dans la prolifération lymphocytaire induite par les DC pré-traitées avec le MDP. Par ailleurs, Nrf2 contrôle la réponse anticorps spécifiques de l’antigène chez la souris. L’injection d’anatoxine tétanique induit une production d’anticorps plus élevé chez la souris déficiente nrf2 par rapport aux souris sauvages. Cette augmentation de la production d’anticorps est corrélée avec une augmentation du nombre de lymphocyte B dans la moelle osseuse et la rate
Vaccine adjuvants are able to boost immune response toward antigens when there are simultaneously injected. Some of these adjuvant mimic danger signals, such as Toll like receptors (TLR) agonists or NOD-like receptors agonists, required for dendritic cell (DC) activation. DC are essentiales for adaptative immune response against antigens : they acquire mature phenotype, controlled by MAPK and NF-kB signaling pathway, leading to antigen presentation and specific immune response. The Nrf2/keap1 signaling pathway, mainly involves in xenobiotics detoxication and oxidative stress control, can be activate by TLR agonists, such as LPS (TLR 4 agonist).We showed that R848 (TLR 7/8 agonist) and MDP (NOD2 agonist) could induce Nrf2’s target genes transcription in murines dendritic cells (BMDC). Nrf2 seems also to be part of inflammatory cytokines production in response to LPS or R848 and modulated T lymphocyte proliferation induced by MDP pre-treated BMDC. Moreover, Nrf2 appears to play a role in specific antibodies response against an antigen in mice. . In fact, Tetanus toxoid (TT) injection induces higher titer of antibodies anti-TT in nrf2-/- mice compared to nrf2+/+ mice. This increase is also correlated with more specific B lymphocytes in bone marrow and spleen after TT immunisation

Le glioblastome (GBM) est la tumeur primitive la plus agressive du cerveau adulte. Il résiste inexorablement aux traitements et la survie moyenne des patients est fortement limitée. L’inefficacité des traitements se justifie notamment par l’hétérogénéité des cellules tumorales, l’accès restreint des molécules au cerveau et une forte immunosuppression. Cette caractéristique du microenvironnement est également responsable de l’absence de réponse des GBM aux immunothérapies. Ainsi, le développement de nouvelles thérapies est essentiel pour améliorer la survie des patients. Pour cela, nous étudions le rôle de la sénescence au cours de la gliomagénèse. Premièrement, à partir de tumeurs de patients et d’un modèle pré-clinique immunocompétent, nous avons démontré l’action protumorale de la sénescence dans le GBM. En effet, la déplétion partielle des cellules sénescentes grâce au transgène p16-3MR augmente la survie des animaux et module le système immunitaire vers un phénotype pro-inflammatoire. Nous avons identifié le facteur de transcription Nrf2 comme régulateur de la sénescence et développé une signature, conservée chez les patients, de 31 gènes associés à la sénescence. Sa forte expression corrèle avec un mauvais pronostic. Cette étude fondatrice ouvre la voie aux deux projets suivants. Deuxièmement, nous étudions la fonction régulatrice de NRF2 sur la sénescence à partir d’une analyse transcriptomique à l’échelle de la cellule unique des fractions tumorales et immunitaires de GBM murins contrôles (miR-ctl) et déplétés pour NRF2 (miR-NRF2). L’inhibition de NRF2 dans les cellules malignes induit une forte plasticité et la surexpression de gènes impliqués dans la machinerie de présentation des antigènes. Ces résultats suggèrent que NRF2 régule l’immunogénicité de la tumeur. L’analyse du transcriptome de la fraction immunitaire ainsi qu’un phénotypage par cytométrie permettront de valider ces résultats. Enfin, nous évaluons l’hypothèse qu’un sénolytique sensibiliserait le GBM aux inhibiteurs de points de contrôle immunitaire (ICB). Nous avons observé que les cellules malignes sont enrichies en gènes associés à la machinerie de présentation des antigènes dans une condition déplétée en cellules sénescentes. Ainsi, des cohortes murines ont été soumises à différents combinaisons de sénolytiques couplés à des ICBs, ce qui nous a permis de déterminer un cocktail induisant une augmentation significative de la survie. Une étude plus poussée caractérisera la fraction immunitaire, analysera les modifications induites par le traitement et identifiera le sous-type immunitaire engendrant la levée de la résistance aux immunothérapies. L’ensemble de ces travaux pourrait mener à une médecine personnalisée pour le traitement du GBM avec l’utilisation d’un sénolytique chez les patients dont la tumeur est riche en cellules sénescentes. Aussi, l’identification de nouveaux sénolytiques liés à la voie NRF2 pourrait bénéficier à de nombreuses pathologies impliquant la sénescence
Diffuse gliomas are the most common primary tumor of the adult central nervous system. Glioblastoma (GBM) accounts for the most aggressive subtype. Conventional treatments remain ineffective as the vast majority of tumors relapse and patient survival remains limited (15 months). Due to a highly immunosuppressive microenvironment, immunotherapies also fail to treat GBM. Thus, the development of novel therapies is crucial to increase patient survival. To this end, we investigate the role of cellular senescence during gliomagenesis. In the first part of my project, we demonstrated the pro-tumoral action of malignant senescent cells in GBM using patient tumor specimens and a mouse GBM model. Indeed, partial removal of malignant senescent cells modulates the immune compartment and improves survival of GBM-bearing mice. In addition, we identified the NRF2 transcription factor, as a determinant of the senescent phenotype. Based on mouse GBM transcriptomic data, we defined a 31-gene senescence signature which is conserved in human lesions. Its high expression correlates with poor outcomes in patients. These findings highlight senolytics as a potential adjuvant therapy to treat GBM. In the light of these findings, we hypothesized that (i) exploring NRF2 signaling may provide new therapeutic insights and that (ii) senolytic-driven modulation of the immune compartment may prime GBM to respond to immunotherapy. Single cell analysis of malignant and immune paired fractions from control (miR-ctl) and NRF2-KD (miR-NRF2) immunocompetent mouse GBMs showed a decrease in the malignant senescent cluster upon NRF2-KD, strengthening NRF2 as a determinant of senescence. NRF2-KD in tumoral cells enhances cellular plasticity and enables the emergence of clusters, characterized by differential upregulation of genes coding for major histocompatibility complex (MHC) molecules. This suggests that NRF2 indirectly promotes immunogenicity in GBM. Immune transcriptomic analysis and immunophenotyping by flow cytometry will help confirming these results. Furthermore, we observed that GBM-bearing mice treated with a genetic senolytic (p16-3MR+GCV) displayed an upregulation of gene signatures associated to the antigen presentation machinery. Thus, we hypothesized that senolytic and immune checkpoint blockade (ICB) might synergize and delay tumor growth. We subjected mouse cohorts to different combination of senolytic and ICBs and highlighted a specific cocktail which positively benefited mouse survival. Thus, our preliminary results suggest that senolytic might potentiates immune checkpoint blockade to hinder GBM progression. Further work is needed to immunophenotype control and treated tumors, investigate treatment-related microenvironment modifications as well as identify the immune subtype driving the response to immunotherapy. Altogether, these results open promising avenues for personalized therapies in the context of senescence enriched GBMs. Also, identification of novel senolytics associated to NRF2 could beneficiate several pathologies in which senescence role is critical

Dans des cellules de mammifère, les facteurs de transcription de la famille CNC-bZip Nrf2 et Bach2 participent au contrôle des réponses à des espèces pro-oxydantes. En réponse à de nombreuses classes d'agents électrophiles, Nrf2 transactive des gènes régulés en cis par des séquences de type ARE codent notamment pour des enzymes de détoxication, permettant ainsi leur maintien homéostatique à des concentrations non toxiques. L'activation de Bach2, un répresseur de la transcription, semble importante pour une mort cellulaire en réponse à certains agents électrophiles. Nous avons cherché à examiner les mécanismes mis en jeu lors de l'activation de Bach2 et Nrf2 par des agents oxydants produits au cours de l'inflammation, tel le peroxyde d'hydrogène et le monoxyde d'azote. Nous avons pu mettre en évidence l'oxydation, sous forme de ponts disulfure, de Bach2 et de Keap1, le régulateur principal de l'activation de Nrf2, et identifier par mutagenèse dirigée, les cystéines impliquées dans les différentes formes oxydées de Keap1. De plus, nous avons montré que l'oxydation de Keap1 résulte en une levée de l'inhibition exercée sur Nrf2, et ainsi en l'activation de Nrf2. La nature et le rôle de l'oxydation de Bach2 n'ont pu être clairement définis. Enfin, nous avons décrit une régulation positive de l'oxydation de Nrf2 et Bach2 par la sur-expression de la peroxyredoxine Prx1. Cet effet est inattendu, car l'activité peroxydase de Prx1 devrait limiter la concentration efficace de peroxyde d'hydrogène disponible pour l'oxydation de Nrf2 ou Bach2. Nous proposons un modèle mécanistique inspiré du système Orp1-Yap1 de S. Cerevisiae pour rationaliser cette observation
In mammalian cells, CNC-bZip family members Nrf2 and Bach2 participate in the cellular control of prooxidant species. Many classes of electrophilic compounds allow Nrf2 to transactivate ARE cis-regulated genes coding for detoxifying enzymes, so as to achieve a homeostatic control at non toxic levels for these compounds. Activation of Bach2, which is a transcriptional repressor, participate in cell killing in response to some electrophilic species, especially in B cell. We sought to determine the mechanisms involved in Nrf2 and Bach2 activation by oxidant molecules produced by activated macrophages during inflamation, such as hydrogen peroxide and nitric oxide. We described the oxidation through disulfide bonds of Bach2 and Keap1, the main regulator of Nrf2 activation. Mutagenesis experiment identified the cysteines engaged in disulfides in the different oxidation forms of Keap1. We also showed that Keap1 oxidation leads to a derepression of Nrf2, thereby to its activation. The nature and function of Bach2 oxidation couldn't be completely understood. We described a positive regulation of peroxiredoxin Prx1 of Nrf2 and Bach2 oxidation, which as unexpected since the peroxidase activity sould have hampered other oxidation reactions. We propose a mechanistic model based on the Orp1-Yap1 peroxyde sensing system of S. Cerevisiae to rationalize this observation

Le facteur de transcription Nrf2 et les enzymes pro-angiogéniques: hème oxygénase (HO-1) et thymidine phosphorylase (TP) sont considérés comme des cibles potentielles pour les traitements combinatoires anticancéreux contre l’angiogenèse. L'objectif de la présente étude était d'examiner les interactions entre ces protéines dans la modulation du potentiel tumorigène et angiogénique de carcinome pulmonaire non à petites cellules (NSCLC). L’augmentation de l’expression de Nrf2 conduit à la réduction de la prolifération cellulaire et à leur capacité de migration, accompagnée d'une expression accrue de microARN suppresseurs de tumeurs ainsi qu’une réduction de l'oncogène miR-378. Ensuite, le rôle de TP dans les cellules NCI-H292 a été étudiée en la surexprimant in vitro (NCI-TP). Ceci a conduit à une atténuation de potentiel tumorigène comme le montre l'inhibition de la prolifération, de la migration et une amélioration concomitante de potentiel angiogénique qui est plus prononcée en hypoxie et en présence de thymidine. In vivo, les tumeurs NCI-TP ont tendance à croître plus rapidement que les témoins et ils sont également mieux oxygénés. Ces tumeurs ont une expression accrue de cytokines pro-inflammatoires IL-1β et IL-6. Nous avons montré pour la première fois que l’enzyme TP peut être régulé par Nrf2 et HO-1 dans les cellules NSCLC, ce qui peut affecter la croissance tumorale par une modulation de l'angiogenèse et de l'expression de facteurs pro-inflammatoires. La corrélation entre l’expression de TP avec celle de l'IL-1β et d'IL-6 a été également confirmée dans les échantillons cliniques de tumeurs issus de patients atteints de NSCLC. L’ensemble de nos résultats montre la potentialité de cibler l’enzyme TP pour le traitement des cancers NSCLC
Nrf2, heme oxygenase-1 (HO-1) and thymidine phosphorylase (TP) are considered as potential targets for combinatorial anti-cancer therapies. The aim of the study was to investigate the interplay of these proteins in regulation of growth and angiogenesis in non-small cell lung carcinoma (NSCLC) cells NCI-H292. Stable overexpression of Nrf2 (NCI-Nrf2 cell line) resulted in decreased cell proliferation and migration in vitro, upregulation of tumor suppressor microRNAs and downregulation of oncogenic miR-378 and many MMPs. Silencing of HO-1 in NCI-Nrf2 cells partially reversed the effect on MMP-1, MMP-3 and miR-378. NCI-Nrf2 cells exhibited increased expression of proangiogenic factors IL-8, angiopoietin-1 and TP, which was also upregulated in cell overexpressing HO-1. In both models, the effect was TP reversible by siRNA targeted at HO-1 and possibly mediated by modulation of oxidative status of the cell. Moreover, it was observed that overexpression of TP in vitro attenuated proliferation and migration of NSCLC cells, but increased their angiogenic potential. In vivo, NCI-TP tumors tended to grow faster, were better oxygenated and exhibited increased expression of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6. Correlation of TP with IL-1β and IL-6 was also confirmed in clinical samples from NSCLC patients. Overall, our results enforce the notion of targeting TP for treatment of NSCLC

Le paludisme demeure la maladie parasitaire la plus meurtrière à travers le monde. La mise en place de nouvelles approches thérapeutiques dans la lutte contre ce pathogène semble indispensable. Les macrophages via le récepteur CD36 jouent un rôle crucial dans la reconnaissance et l'élimination des hématies infectées par P. Falciparum. Ainsi, le maintien d'un niveau élevé d'expression du récepteur CD36 à la surface des macrophages est un élément capital dans la lutte contre le parasite. L'établissement de l'infection est toujours associé à une production excessive de médiateurs pro-inflammatoires. Dans ce travail, nous montrons in vitro que les processus inflammatoires régulent négativement l'expression du récepteur CD36 à la surface des macrophages humains et murins et diminuent la clairance des hématies infectées. Dans ces conditions inflammatoires, nous démontrons que les ligands du récepteur nucléaire PPARgamma sont inefficaces pour promouvoir l'expression du récepteur CD36, phénomène directement associé à un défaut d'expression et d'activation de PPARgamma. Cependant, nous mettons en évidence pour la première fois que l'activation du facteur de transcription Nrf2 permet de restaurer indépendamment de PPARgamma l'expression et les fonctions antiplasmodiales du récepteur CD36. L'ensemble de ces résultats ont été reproduits in vivo dans un modèle de paludisme murin où seulement les activateurs de Nrf2 et non les ligands de PPARgamma contribuent à améliorer l'évolution de l'infection. Ces données soulignent le rôle important du facteur de transcription Nrf2 dans le traitement du paludisme via la modulation d'expression du récepteur CD36 des macrophages
Malaria remains the deadliest parasitic disease in the world. The introduction of new pharmacological approaches in the fight against this pathogen is essential. Macrophages through the expression of CD36 receptor play a crucial role in the recognition and the elimination of P. Falciparum infected erythrocytes. Therefore, maintaining an elevated level of CD36 receptor on the surface of macrophages is a crucial element in the struggle against the parasite. The establishment of malaria infection is always associated with an excessive production of pro-inflammatory mediators. In this work, we show in vitro that inflammatory processes negatively regulate the expression of CD36 receptor on the surface of human and mouse macrophages and hence decrease the clearance of parasitized erythrocytes. In these inflammatory conditions, we demonstrate that PPARgamma activators are ineffective to promote CD36 expression on macrophages, a phenomenon directly associated with a defect of both PPARgamma expression and activation. However, we highlight here for the first time that the activation of the Nrf2 transcription factor controls independently of PPARgamma the expression of CD36 receptor and its antiplasmodial function. All these results have been reproduced in vivo in a murine malaria model where only Nrf2 activators and not PPARgamma ligands contribute to improve the outcome of infection. Collectively, these data highlight the important role of the Nrf2 transcription factor in the control of malaria through the modulation of CD36 expression on macrophages

Les réactions allergiques telles que les réactions d’hypersensibilité de contact (HSC) sont un problème de santé publique. Il s’agit d’une réaction inflammatoire aiguë qui survient suite à des expositions répétées d’une molécule allergisante avec la peau et dans laquelle les cellules dendritiques (DC) jouent un rôle essentiel. Les composés chimiques tels que le dinitrochlorobenzène (DNCB) ou le cinnamaldéhyde (CinA), responsables d'HSC, sont capables d’induire un stress chimique et de produire des espèces réactives de l’oxygène (ERO). Parmi les voies de détoxication en réponse aux xénobiotiques, la voie Nrf2/Keap1 est une voie centrale connue pour la détection de composés électrophiles. A l’état basal et en absence de stress, Nrf2 est couplé à son répresseur cytosolique Keap1 qui assure sa dégradation via le protéasome. En présence d’un stress chimique, Nrf2 transloque dans le noyau et induit l’expression des gènes antioxydants [hème-oxygénase 1 (ho-1), NADPH quinone oxydoréductase (nqo1), glutathione-s-transférase (gst)]. En absence de Nrf2, nous avons montré que le DNCB et le CinA induisent la mort cellulaire des DC via l'activation des caspases impliquées dans la voie mitochondriale ou intrinsèque de l'apoptose. Cette mort cellulaire induite par le DNCB est ERO dépendante tandis que celle induite par le CinA est moins sensible à la production des ERO. En présence de Nrf2, la survie des DC est régulée par l'expression de bcl-2, un gène antiapoptotique, et des gènes antioxydants. Nrf2 semblerait activer ou réprimer la transcription des gènes et ce en fonction de la molécule testée, du temps de traitement. Par ailleurs, nous avons également montré que Nrf2 joue un rôle clef dans les phases de sensibilisation et d'élicitation de la réaction d'HSC mais également au cours de l'irritation. Des transferts adoptifs de DC ont permis de montrer le rôle clef de Nrf2 dans la DC au cours de l'HSC. Enfin, notre étude montre que Nrf2 régule les Treg au niveau du tissu cutané et participe à la tolérance cutanée
Allergic reactions such as contact hypersensitivity (CHS) are a problem of public health occurring after repeated exposures to contact sensitizers. CHS is a common skin disease involving dendritic cells (DC) playing a key role in this pathology. Contact sensitizers, like dinitrochlorobenzene (DNCB) or cinnamaldehyde (CinA) are known to induce reactive oxygen species (ROS) production. The Nrf2/Keap1 pathway is central for detoxification. In the absence of a chemical stress, Keap1 associates with Nrf2 and leading to its degradation. In the presence of an electrophilic compound like contact sensitizers, Keap1’s conformation is modified leading to Nrf2 translocation to the nucleus and transcription of its target genes [heme-oxygénase 1 (ho-1), NADPH quinone oxydoreductase (nqo1), glutathione-s-transferase (gst)]. We showed, for the first time, that Nrf2 controls the loss of mitochondrial membrane potential and caspase-3/7 activity in DC activated by contact sensitizers. In the absence of Nrf2, DNCB and CinA induced DC apoptosis via caspase activation involved in intrinsic pathway of apoptosis also called ‘mitochondrial pathway’. This apoptosis was mainly mediated by the production of ROS in response to DNCB. However, ROS faintly control CinA-induced cell death. We also showed that Nrf2 controls the transcription of the anti-apoptotic gene bcl-2 in response to DNCB or CinA and also the transcription of immune related and antioxidant genes that could be implicated in DC apoptosis.Otherwise, we also showed that Nrf2 plays a key role in sensitization and elicitation phases of CHS and even in the irritation phase. Adoptive transfer experiments showed that Nrf2 plays a crucial role in DC during CHS.Finally, we showed that Nrf2 regulates skin Treg and participates to skin tolerance

Les neutrophiles constituent une première ligne de défense contre les agents infectieux. En revanche, leur activation incontrôlée peut exacerber certaines pathologies inflammatoires telles que les allergies cutanées. Notre équipe a montré précédemment que le facteur de transcription Nrf2 connu pour son rôle anti-oxydant, régulait l’inflammation cutanée dans l’hypersensibilité de contact (HSC). Ainsi ce travail a été mené pour évaluer in vitro l’implication de la voie Nrf2 dans les fonctions des neutrophiles et pour identifier son rôle dans le recrutement et l’activation des neutrophiles dans l’HSC.In vitro, nous montrons que la protéine Nrf2 est fortement exprimée dans les neutrophiles de la moelle osseuse. Nrf2 est fonctionnelle dans les neutrophiles stimulés : il active la transcription de gènes cibles cytoprotecteurs et diminue celle des gènes de l’inflammation. Ainsi, le prétraitement des neutrophiles avec un activateur de Nrf2 tel que le sulforaphane, réduit la production des formes réactives de l’oxygène (FRO)en réponse à une stimulation. En parallèle, l’absence de Nrf2 ne semble pas affecter la phagocytose et la nétose, deux fonctions clés du neutrophile. Enfin, Nrf2 est indispensable pour une migration optimale des neutrophiles en réponse aux chimiokines.Au cours de l’HSC induite par le dinitrochlorobenzène (DNCB), Nrf2 régule indirectement le recrutement des neutrophiles, en contrôlant le stress oxydant cutané et les voies inflammatoires impliquées dans la production de chimiokines, notamment CCL2, CCL4 et CCL11. En outre, Nrf2 induit l’augmentation d’expression du scavenger CD36 dans les macrophages et augmente ainsi leur capacité à éliminer les neutrophiles apoptotiques pour initier la résolution de l’inflammation.En conclusion, l’activation de Nrf2 dans les neutrophiles participe au contrôle de la production des FRO et la migration. En outre, Nrf2 émerge comme un effecteur clé dans le contrôle du recrutement et de la clairance des neutrophiles au cours de la réponse inflammatoire cutanée aux molécules allergisantes. La mise en évidence de ces mécanismes protecteurs de Nrf2 nous permet de proposer cette protéine comme nouvelle cible thérapeutique dans le contrôle d’inflammations cutanées chroniques
Neutrophils form the first line of defense against infectious agents. However, their uncontrolled activation may exacerbate certain inflammatory conditions such as cutaneous allergies. Our team has previously shown that Nrf2 transcription factor known for its antioxidant role, regulates skin inflammation in contact hypersensitivity (CHS). Thus, our work was carried out to evaluate in vitro the involvement of Nrf2 pathway in neutrophil functions and to identify Nrf2 role in neutrophil recruitment and activation in CHS.In vitro, we showed that the protein Nrf2 was highly expressed in bone marrow neutrophils. Nrf2 is functional in stimulated neutrophils: it activates the transcription of cytoprotective genes and downregulates that of inflammatory genes. Thus, pretreatment of neutrophils with an Nrf2 activator such as sulforaphane reduces the production of reactive oxygen species (ROS) in response to stimulation. In parallel, Nrf2 does not affect two key functions of neutrophil, phagocytosis and netosis.Finally, Nrf2 is essential for optimal migration of neutrophils toward chemokines. In CHS induced by the dinitrochlorobenzene (DNCB), Nrf2 indirectly regulates the recruitment of neutrophils, through regulation of skin oxidant stress and inflammatory pathways that are involved in chemokines production, including CCL2, CCL4 and CCL11. In addition, Nrf2 induces the up-regulation of scavenger CD36 in macrophages and thus increases their ability to eliminate apoptotic neutrophils leading to the resolution of inflammation.In conclusion, Nrf2 activation in neutrophils participates in the control of ROS production and migration. In addition, Nrf2 emerges as an important effector in the control of neutrophil recruitment and clearance during the skin inflammatory response to allergenic molecules. The demonstration of Nrf2 protective mechanisms leads us to suggest this protein as a new therapeutic target in the control of chronic skin inflammations

La dermatite allergique de contact (DAC) est une réaction inflammatoire aiguë, médiée par les cellules dendritiques (DCs) survenant suite à l’exposition répétée de la peau avec une molécule allergisante. La prévalence estimée des cas de DAC aux substances parfumantes est de 1,7 % à 4,1 % dans la population générale. Les molécules allergisantes sont des molécules appelées haptènes, qui vont se conjuguer avec des protéines de l’épiderme ou du derme. C’est le cas du cinnamaldéhyde (CinA), une molécule retrouvée dans la cannelle. Le linalol et le limonène sont des terpènes présents dans la lavande et l’orange, qui vont s’autoxyder au contact de l’air pour former des allergènes puissants, tels que les hydroperoxydes allyliques. Le premier objectif de cette thèse a été d’étudier le mécanisme d’action de ces terpènes et leurs hydroperoxydes allyliques respectifs sur la lignée cellulaire THP-1, qui sert de substitut aux cellules dendritiques. Le rôle du facteur de transcription Nrf2, majeur dans la lutte contre le stress oxydant, a également été investigué.Les consommateurs de produits cosmétiques sont exposés à de faibles concentrations de molécules allergisantes, mais plusieurs fois par jour ou par semaine. Nous avons souhaité étudier l’exposition répétée à de faibles doses d’haptène sur la peau.Les kératinocytes jouent également un rôle dans la DAC : ce sont les premières cellules qui vont rencontrer la molécule allergisante dans la peau. La deuxième partie de ce travail a été d’étudier l’impact d’une exposition répétée de CinA à de faible concentration sur ces KCs et plus particulièrement sur la différenciation de l’épiderme, en utilisant un modèle organotypique de peau en 3D
Allergic contact dermatitis (ACD) represents a severe health problem. It is a dendritic cells (DCs) mediated skin disease caused by repeated exposure to an allergenic compound. ACD cases of fragrances in general population is estimated from 1.7 % to 4.1%. Contact sensitizers are compounds termed haptens and they will form a conjugate with epidermis and dermis proteins. Example is cinnamaldehyde (CinA), a molecule found in cinnamon. Linalool and limonene are terpenes found in lavender and oranges. In contact with the air, they will autoxidize to form highly allergenic compounds: allylic hydroperoxides. The first aim of this thesis was to study the mechanism of action of those terpenes and their respective allylic hydroperoxides on THP-1 cell-line, described as a surrogate of DCs. The transcription factor Nrf2 is playing a major role in oxidative stress and was also investigated.Consumers of cosmetic products are exposed to low quantities of allergenic compounds, but several times a day or a week. We wanted to study repeated exposure of low concentration of haptens on the skin.KCs also play a key role in ACD: they are the first cells that will encounter the allergenic compound in the skin. The second aim of this thesis was to study the impact of repeated exposure of low concentrations of CinA on those KCs and more particularly on the epidermis differenciation, using a 3D organotypic culture of skin

Le facteur de transcription nuclear factor erythroid-2-related factor (NRF2) est connu dans différentes espèces pour son rôle dans la défense cellulaire contre les stress oxydatifs et xénobiotiques. SKN-1, l'homologue de NRF2 chez C.elegans, est un important régulateur de la longévité du nématode qui, dans certaines conditions métaboliques spécifiques, agit de manière surprenante par l'activation de l'expression des collagènes en plus des gènes de détoxification. Les fibroblastes sont les principaux producteurs et organisateurs de tissus riches en collagène et, à ce titre, jouent un rôle clé dans l'homéostasie du derme. Nous avons étudié le nouveau rôle potentiel de NRF2 dans la régulation de l'expression de la matrice extracellulaire (MEC) dans les fibroblastes cutanés humains. La dérégulation de NRF2 a été réalisée en utilisant siRNA et shRNA. Une analyse transcriptomique globale des fibroblastes cutanés humains siNrf2, effectuée par RNA-seq, a révélé qu’en plus des cibles NRF2 connues, les gènes du matrisome et du tissu-squelette étaient les catégories de gènes les plus affectées, comprenant certains gènes clés de la MEC. L'analyse de la production et de l'organisation de la MEC a ensuite été réalisée en utilisant une combinaison de microscopies (SHG, confocal, TEM et AFM) dans des fibroblastes shNrf2 en culture. La sous-expression à long terme de NRF2 dans les fibroblastes (shNRF2) affecte les niveaux d’expression du collagène I, ainsi que la formation des fibrilles de collagènes, probablement dû au ratio collagène I/collagène V perturbé. L’analyse transcriptomique a également permis d’identifier en tant que nouvelle cible de NRF2, un second facteur de transcription, décrit comme régulateur de l'expression des collagènes et impliqué dans une maladie du tissu conjonctif. Le marquage de ce facteur par immunofluorescence a révélé que sa localisation subcellulaire, et en particulier sa translocation, est affectée par la sous-expression de NRF2 (siRNA et shRNA). Nos résultats montrent ainsi que la sous-expression de NRF2 dans les fibroblastes cutanés humains impacte les gènes de la MEC et en particulier l’expression des collagènes. Le second facteur de transcription identifié pourrait être un intermédiaire ou un co-facteur spécifique de NRF2 impliqué dans la régulation de l’expression des gènes de la MEC. NRF2 peut ainsi être considéré comme nouveau régulateur des gènes de la MEC dans les fibroblastes cutanés humains et représente une nouvelle cible pour maintenir l'homéostasie du derme
The nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (NRF2) is a transcription factor involved in cell defense against oxidative and xenobiotic stresses. SKN-1, the nematode homologue of NRF2 is a master regulator of longevity that, under specific metabolic conditions, surprisingly acts through the activation of collagens expression. Fibroblasts are the major producers and organizers of collagen-rich tissues and, as such, play a key role in dermis homeostasis. Therefore, we investigated the potential new role of NRF2 in regulating extracellular matrix (ECM) expression in human skin fibroblasts. Dysregulation of NRF2 was realized using siRNA and shRNA. A global transcriptomic analysis of siNrf2 human skin fibroblasts performed by RNA-seq revealed that, in addition to known NRF2 targets, matrisome and tissue skeleton genes were the most represented gene sets, including some key ECM genes. Analysis of ECM production and organization was further conducted in cultured shNrf2 fibroblasts using a combination of microscopies (SHG, confocal, TEM and AFM). Long-term effect of silencing NRF2 in fibroblasts (shNrf2) resulted in defects in collagen expression and fibril formation, likely due to a disturbed collagen I to collagen V ratio. Interestingly, a transcription factor involved in connective tissue disease and described as a regulator of collagen expression was identified as a novel target of NRF2. Immunofluorescence staining of silenced NRF2 fibroblasts (siRNA and shRNA) strikingly revealed that NRF2 downregulation impacts its translocation rate into the nucleus. Our results demonstrate that silencing NRF2 impacts ECM and especially collagens in human skin fibroblasts. A transcription factor known to regulate collagen expression, could act as a specific cofactor of NRF2 in the regulation of ECM gene expression. NRF2 can thus be considered as a novel regulator of ECM genes in human skin fibroblasts and represents a new target to maintain dermis homeostasis

Avec les nouvelles avancées en biologie et toxicologie, on constate de plus en plus la complexité des mécanismes et le grand nombre de voies de toxicité. Les concepts de ‘biologie systémique’ (SB) et de ‘voies des effets indésirables’ (adverse outcome pathway, AOP) pourraient être des outils appropriés pour l’étude de la toxicologie à ces niveaux de complexité élevés. Le point central du travail de cette thèse est le développement d’un modèle de SB du rôle de la voie de signalisation Nrf2 dans le contrôle du stress oxydant. Pour la calibration de ce modèle avec des données expérimentales (exposition des cellules rénales RPTEC/TERT1 à différentes doses de bromate de potassium), plusieurs cycles de proposition/vérification d’hypothèses ont progressivement contribué à l’ajout de nouvelles réactions. Ces nouvelles hypothèses (par exemple : action directe du bromate de potassium sur le DCF, atténuation de la fluorescence du DCF avec le temps, etc.) devraient être confirmées par de futures expérimentations. Ce modèle de SB a été ensuite utilisé pour la quantification d’un AOP de l’insuffisance rénale chronique et comparé à deux autres approches: l’utilisation de modèles statistiques empiriques et celle d’un réseau Bayésien dynamique. Les calibrations des paramètres ont été effectuées par chaînes de Markov simulées MCMC avec le logiciel GNU MCSim avec une quantification des incertitudes associées aux prédictions. Même si la mise au point du modèle SB a été une tâche complexe, la compréhension de la biologie qu’offre ce modèle n’est pas accessible aux deux autres approches. Nous avons aussi évalué les interactions entre Nrf2 et deux autres voies de toxicité, AhR et ATF4, dans le cadre d’une analyse utilisant des données de toxico-génomique provenant de trois projets différents. Les résultats de cette dernière analyse suggèrent d’ajouter au modèle SB de Nrf2 la co-activation par AhR de plusieurs gènes (par exemple, HMOX1, SRXN1 et GCLM) ainsi que d’associer (au moins partiellement) à ce modèle la voie ATF4. Malgré leur complexité, les modèles SB constituent un investissement intéressant pour le développement de la toxicologie prédictive
New understanding of biology shows more and more that the mechanisms that underlie toxicity are complex and involve multiple biological processes and pathways. Adverse outcome pathways (AOPs) and systems biology (SB) can be appropriate tools for studying toxicology at this level of complexity. This PhD thesis focuses on the elaboration of a SB model of the role of the Nrf2 pathway in the control of oxidative stress. The model’s calibration with experimental data (obtained with RPTEC/TERT1 renal cells exposed to various doses of potassium bromate) comprised several rounds of hypotheses stating/verification, through which new reactions were progressively added to the model. Some of these new hypotheses (e.g., direct action of potassium bromate on DCF, bleaching of DCF with time, etc.) could be confirmed by future experiments. Considered in a wider framework, this SB model was then evaluated and compared to two other computational models (i.e., an empirical dose-response statistical model and a dynamic Bayesian model) for the quantification of a ‘chronic kidney disease’ AOP. All parameter calibrations were done by MCMC simulations with the GNU MCSim software with a quantification of uncertainties associated with predictions. Even though the SB model was indeed complex to conceive, it offers insight in biology that the other approaches could not afford. In addition, using multiple toxicogenomic databases; interactions and cross-talks of the Nrf2 pathway with two other toxicity pathways (i.e., AhR and ATF4) were examined. The results of this last analysis suggest adding new AhR contribution to the control of some of the Nrf2 genes in our SB model (e.g., HMOX1, SRXN1 and GCLM), and integrating in it description of the ATF4 pathway (partially at least). Despites their complexity, precise SB models are precious investments for future developments in predictive toxicology

The KEAP1/NRF2/ARE pathway is at the forefront of cellular defense. Induction of this pathway is protective against various conditions of stress such as oxidative stress and exposure to electrophiles. Conversely, failure to upregulate the pathway leads to increased disease susceptibility and accelerated pathogenesis. Under basal conditions, transcription factor nuclear factor erythroid 2 p45-related factor 2 (NRF2) is targeted for ubiquitination and proteasomal degradation by a repressor protein Kelch-like (ECH)-associated protein (KEAP1), a substrate adaptor for Cullin 3-based E3 ubiquitin ligase. Inducers of the pathway chemically modify specific cysteines within KEAP1, leading to loss of repressor function, NRF2 accumulation and enhanced transcription of genes encoding a large network of cytoprotective proteins. The cyanoenones are the most potent NRF2 activators known. Cyanoenones bind to KEAP1 covalently and reversibly, and are suitable for chronic in vivo administration. However, the cysteine sensor for these compounds is unknown. Among the cysteine sensors of KEAP1, C151 in the BTB domain and C273 and C288 in the intervening region, are best characterized. In this study using KEAP1-knockout mouse embryonic fibroblasts (MEFs) rescued with wild-type (WT) KEAP1 or cysteine mutants, we tested a series of cyanoenones for their ability to modify specific cysteine sensors in KEAP1. We discovered that remarkably, all compounds of this class specifically target C151 regardless of their molecular shape or size. In addition, primary peritoneal macrophages (PMφ) derived from KEAP1C151S/C151S knock-in mice generated using the CRISPR/Cas9 technology, had higher LPS-induced inflammatory responses than cells from WT animals. Furthermore, at nanomolar concentrations, the tricyclic cyanoenone TBE-31 strongly suppresses LPS-induced inflammatory responses in primary PMφ cells, suggesting the potential for therapeutic use in inflammatory diseases. Another cytoprotective response is the heat shock response (HSR) which is activated when cells are exposed to stressors such as elevated temperatures, heavy metals and cytotoxic compounds. The HSR, mainly mediated by Heat Shock Factor 1 (HSF1), protects the integrity of the cellular proteome through the upregulation of a battery of genes involved in ameliorating proteotoxicity. Several small molecule activators of the KEAP1/NRF2/ARE pathway have been shown to activate HSR through the activation of HSF1. Work in this thesis focused on one such dual activator, the dietary agent phenethyl isothiocyanate (PEITC). We found that PEITC reacts with KEAP1 C151 to stabilize NRF2, and that it is able to activate the HSR by activating HSF1 through the inhibition of heat shock protein 90, the main negative regulator of HSF1. We further showed that PEITC activates p38 mitogen-activated protein kinases (MAPKs). In vitro, all members of the p38 MAPK family rapidly and stoichiometrically catalyze the phosphorylation of HSF1 on S326, a hallmark of HSF1 activation. The use of stable knockdown cell lines and inhibitors indicated that among the p38 MAPK, p38γ is the principal isoform responsible for the phosphorylation of HSF1 at S326 in cells. A protease-mass spectrometry approach confirmed S326 phosphorylation, and unexpectedly, revealed that p38 MAPKs also catalyze the phosphorylation of HSF1 at S303/307, previously known repressive post-translational modifications. Thus, we identified p38 MAPKs as highly efficient catalysts for the phosphorylation of HSF1. Furthermore, our findings suggest that the magnitude and persistence of activation of p38 MAPKs are important determinants of the extent and duration of the HSR. In order to investigate the physiological significance of HSF1 phosphorylation at S326, we used immunofluorescence and western blotting techniques. We found that mitotic cells have high levels of HSF1 pS326 compared to interphase cells. Interestingly, our studies revealed that phosphorylated HSF1 at S326 is concentrated at the midbody of telophase cells, suggesting a potential role for HSF1 during the late-stage of cell division. Further studies are needed to define the role(s) of the HSF1 pS326 during the cell cycle.

Dendritic cells (DCs) are potent innate antigen presenting cells which are able to sense and engulf pathogens from sites of infection, which are then processed and presented to adaptive T lymphocytes in secondary lymphoid organs. Therefore, they are critical for the initiation and modulation of primary antigen-specific adaptive immune responses. They also play a critical role in the maintenance of T cell tolerance. T cells play vital roles in mediating both cellular and humoral-specific adaptive immune responses. There are various types of T cells present within the immune system including the cytotoxic CD8 T cells and T helper CD4 cells. CD4 T cells can be further subdivided into various subtypes examples of which include T helper 1 cells (Th1), Th2, Th17 and T regulatory cells. Each subset has its own distinctive function, transcriptional regulation and effector cytokine profile. It is established that appropriate DC and T cell immune function is highly dependent on their intracellular redox status. Cellular redox homeostasis is maintained through a balance between oxidising agents e.g. reactive oxygen species (ROS) and anti-oxidant or reducing agents e.g. glutathione (GSH). Excessive ROS production resulting in oxidative stress is extremely deleterious to the cell and if left unimpeded can result in cell necrosis, tissue damage and the onset of disease. As a result, mammalian cells have evolved an inducible adaptive defence system which provides protection against such oxidative or chemical insult. The functionality of this cellular defence system is principally governed by the activity of the redox-sensitive transcription factor Nrf2. In response to oxidative stress, Nrf2 induces the transcription of a battery of cytoprotective and antioxidant genes involved in GSH synthesis, detoxification of xenobiotics and their reactive metabolites and the maintenance of cellular redox homeostasis. It is now emerging that Nrf2 plays a pivotal role in immunity. However, its precise role in DC and T cell function is unclear. Using immature bone marrow-derived DCs (iDCs) from Nrf2+/+ and Nrf2-/- mice, the work presented in this thesis demonstrates that Nrf2 deficiency in iDCs resulted in lowered GSH levels, enhanced iDCs co-stimulatory receptor expression, impaired endocytic and phagocytic capacity, and increased iDC-mediated antigen-specific CD8 T cell stimulatory capacity in response to both an antigenic and self-peptide. Furthermore, artificially lowering GSH levels in the iDCs did not recapitulate the Nrf2 deficient iDC phenotype. Moreover, Nrf2-/- DCs exhibited an enhanced capacity to present cell-associated peptide antigens to antigen-specific CD8 T cells, resulting in increased CD8 T cell effector function. Loss of Nrf2 in LPS-stimulated DCs results in a lowered Th1 cytokine profile. These results have implications for Nrf2 in DC-mediated CD8 T-cell immunity, peripheral CD8 T cell tolerance and CD4 effector differentiation. The role of Nrf2 in T cell function is poorly understood. Using thymocytes, splenocytes and lymph-node derived T cells from Nrf2+/+ and Nrf2-/- mice, we demonstrate that loss of Nrf2 did not affect the development of CD4+CD25+ natural occurring Treg, mature CD4 and CD8 T cell populations within the thymus. Furthermore, Nrf2 deficiency did not alter the composition of CD4 and CD8 T cell populations within secondary lymphoid organs. It was observed that splenic Nrf2-/- naïve T cells exhibited enhanced ROS generation, accompanied by low level increases in T cell activation markers. However, the marginal augmentation of Nrf2-/- naïve T cell activation status did not result in increased T cell receptor (TCR)-triggered T cell proliferation. In contrast, Nrf2 deficient effector T cells exhibited enhanced TCR/CD3-triggered proliferation, associated with increased Th1 and decreased Th2 effector function. Importantly, we demonstrated that Nrf2-/- effector T cells secreted increased levels of IL-17A and IL-22, a signature cytokine profile indicative of the more recently identified Th17 cell lineage. This was also observed under Th17 polarising conditions, further suggesting that loss of Nrf2 predisposes effector Th17 development. The implications of the latter findings are significant given the pivotal role that Th17 cells play in the pathogenesis of a variety of autoimmune diseases including multiple sclerosis (MS) and Systemic lupus erythematosus (SLE). Nrf2 plays a critical role in the detoxification of xenobiotics in the liver, which as the primary drug-metabolising organ, is subjected to an array of xenobiotics and their respective metabolites. Individuals vary in their responses to xenobiotic exposure from adaptation to severe adverse drug reactions. However, it is unknown whether this human disparity in drug response is a consequence of inter-individual variation in the Nrf2 adaptive defence system to xenobiotic stress. In light of this, we aimed to firstly investigate whether variation in the Nrf2 adaptive system was present within individuals in response to a chemical inducer of Nrf2, CDDO-Me. To address this issue, basal and induced Nrf2 protein levels and downstream NQO1 expression were measured in activated human T cell blasts, in response to increasing concentrations of CDDO-Me. Examination of various donor-derived T cells, demonstrated that humans vary in their Nrf2 response to CDDO-Me, with respect to nuclear Nrf2 and NQO1 mRNA expression. Therefore we concluded that inter-individual variation does exist in the human’s Nrf2 adaptive system in response to a known Nrf2 probe. Overall, the experimental results obtained in this PhD programme have provided detail on the role of Nrf2 in immune cells and highlights the potential for therapeutically targeting Nrf2 in immune-mediated disease.

Les études chez la souris ont montré que les facteurs de transcription STAT5 sont nécessaires à la prolifération et /ou à la survie des cellules hématopoïétiques. Ces protéines jouent un rôle important dans les propriétés transformantes de certaines oncoprotéines telles que Bcr-Abl, Tel-Abl et Tel-Jak2 et sont souvent constitutivement activées dans les cellules de tumeurs solides ou de patients leucémiques. Leur implication directe dans la genèse de leucémie a été démontrée par l’utilisation de formes mutées constitutivement actives de STAT5 (cS5F et STAT51*6). Afin de comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu dans l’activité oncogénique de STAT5, nous avons étudié les propriétés transformantes de cS5F dans les cellules primaires de moelle osseuse de souris ainsi que dans la lignée cellulaire Ba/F3. L’expression de cS5F dans les cellules de moelle osseuse de souris conduit, en effet, à l’induction d’une leucémie multi-linéage après transplantation de ces cellules dans des souris receveuses et rend les cellules Ba/F3 indépendantes de l’IL-3 pour leur prolifération. Nos résultats montrent aussi bien dans les cellules primaires leucémiques que dans les cellules Ba/F3 que cS5F induit l’activation d’Akt un effecteur crucial de la voie PI 3-kinase. Cette activation passe par une interaction entre la sous-unité régulatrice de la PI 3-kinase, p85 et la molécule adaptatrice Gab2. L’utilisation de formes mutées de Gab2 ou d’Akt et d’un inhibiteur pharmacologique de la PI 3-kinase montre que l’activation de la voie Gab2/PI 3-kinase/Akt joue probablement un rôle essentiel dans les propriétés leucémogènes de cS5F. Les résultats des études immuno-cytochimiques et de Western blot sur des extraits nucléaires et cytoplasmiques avec un anticorps anti-P-Y-Stat5 montrent que cS5F est majoritairement localisé dans le cytoplasme des cellules leucémiques, soutenant donc nos observations d’un rôle actif de cette protéine oncogénique dans ce compartiment cellulaire. Des résultats similaires ont été obtenus sur des cellules et de biopsies médullaires de patients leucémiques (LMC, LAM et mastocytoses), montrant ainsi que cette localisation inhabituelle des formes actives de STAT5 n’est pas liée à une propriété spécifique de cS5F. La présence de formes phosphorylées de STAT5 dans les mastocytoses nous a conduit à étudier le rôle de STAT5 dans la signalisation de c-Kit, le récepteur au Stem Cell Factor (SCF). Nos résultats montrent que l’activation de STAT5, aussi bien dans les cellules de moelle osseuse transformées par cS5F que dans des progéniteurs hématopoïétique humains, joue un rôle important le développement des mastocytes in vitro en présence de SCF et que son activation constitutive contribue à un développement anormal des mastocytes in vivo. L’ensemble de nos données suggère que l’activation constitutive de STAT5 pourrait promouvoir une localisation et une activité cytoplasmique susceptible d’être relié à l’activation d’autres voies de signalisation comme la voie PI3-K et que l’inhibition simultanée de l’activité de STAT5 (cytoplasmique et nucléaire) et de la PI 3-kinase pourrait ouvrir des perspectives thérapeutiques intéressantes dans le traitement d’hémopathies associées à l’activation de ces deux voies de signalisation.

Cancer is one of the foremost causes of death worldwide with about 14.1 million new incidences and 8.2 cancer related deaths occurring globally. NF-E2 p45-related factor 2 (Nrf2), a cap-'n'-collar basic leucine zipper (CNC-bZIP) transcription factor, prevents carcinogenesis through expression of genes that ensure the excretion, enzymatic modification, and repair of oxidative damage in cells containing the antioxidant response element (ARE) in their promoter region. Beyond providing cytoprotection against oxidative stress and xenobiotics, Nrf2 pays a role in maintaining basic physiological processes such as energy metabolism and cell cycle regulation. Whilst Nrf2 plays a pivotal role in preventing degenerative and inflammatory disease, upregulation of Nrf2 promotes tumourigenesis in cancerous cells. Therefore, understanding the mechanisms controlling Nrf2 activity is important in translational medicine. Nrf2 is regulated by proteasomal degradation by Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1) an E3 ubiquitin ligase substrate adaptor protein that recruits of cullin-3 (Cul3) to Nrf2 via its Neh2 domain. Nrf2 is also negatively regulated by phosphorylation by glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) causing β-transducin repeat-containing protein (β-TrCP) to ubiquitinate Nrf2 by Skp1-Cul1-F-box (SCF) ubiquitin ligase through the Neh6 domain of Nrf2. Several research groups have shown that induction of ARE-driven genes can be regulated by phosphoinositide 3- kinase- protein kinase B (PI3K-Akt/PKB) signalling pathway. The ability of tert-butylhydroquinone (tBHQ), 1-[2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-diene-28-oyl]imidazole (CDDO-Im), diethyl maleate (DEM), curcumin, carnosol, ferulic acid and sulforaphane (SFN) to activate Nrf2-target genes in a Keap1-dependent or Keap1-independent manner was tested. It was discovered that all compounds, except for SFN, activate Nrf2-target genes in a Keap1-independent manner, inhibiting GSK-3 and functioning through the Neh6 domain of Nrf2. Analysis of the involvement of PI3K-Akt/PKB pathway in Nrf2 activation revealed that regulation of Nrf2 through the PI3K-Akt/PKB pathway is independent of Keap1 but dependent on GSK-3. Also, it was shown that tBHQ, DEM, CDDO-Im, curcumin, ferulic acid directly decreased phosphatase and tensin homolog (PTEN) activity, thereby preventing formation of the phosphodegron in the Neh6 domain of Nrf2. With increased Nrf2 levels reported in various cancers including lung cancer, leading to the progression of these cancers, Nrf2 can be seen as a double-edged sword. Loss-of-function somatic mutations in KEAP1 as well as somatic mutation in NFE2L2 has been reported in several human cancers playing a role in the development of such cancer. Using short hairpin RNA (shRNA) and the CRISPR/Cas9 system to generate stable Nrf2 knockdown A549 and H460 cells, the second part of this thesis investigated biochemical and physiological changes that occur, when the Nrf2 is genetically downregulated, and further on to determine what mechanism(s) is responsible for decreased cell proliferation in tumours. The findings obtained confirm that downregulation of Nrf2 from the human non-small lung adenocarcinoma epithelial cell line A549 and H460, in which Nrf2 is upregulated though somatic mutations in KEAP1, results in decreased cell proliferation. Analysis of the genes involved in NADPH generation and pentose phosphate pathway (PPP) show that decrease in Nrf2 caused a decrease in the expression of genes involved in PPP. Although knockdown of Nrf2 resulted in a decrease in cell proliferation, it was shown that this decrease was not as a result of cell death. Nrf2 is able to control cell proliferation by induction of metabolic reprogramming geared towards favoring anabolic pathways and influencing the PPP as well as provide energy source required for cell proliferation.

Lors de la vie, des mécanismes de réparation de l'ADN sont mis en oeuvre lors d'agressions, pour protéger le génome. La réparation par excision de nucléotides (NER) est l'un de ces mécanismes. Des mutations des facteurs NER sont à l'origine de 3 maladies génétiques humaines: Xeroderma pigmentosum (XP), la trichothiodystrophie (TTD) et le syndrome de Cockayne (CS). Certains de leurs signes cliniques ne sont pas expliqués par un défaut de réparation de l'ADN. Des études suggèrent que ces facteurs interviennent dans d'autres processus, notamment lors de l'expression des gènes. Durant ma thèse, je me suis intéressé aux rôles des facteurs NER dans la transcription. En effet, j'ai montré que ces facteurs, dit de réparation, étaient recrutés avec la machinerie transcriptionnelle au niveau du promoteur et du terminateur de gènes activés. Ils influencent l'environnement chromatinien des gènes activés (boucles de chromatine et modifications post-­‐ traductionnelles des histones). Ma thèse apporte une meilleure compréhension du processus de transcription des gènes activés, permettant de mieux comprendre certaines anomalies associées aux yndromes XP, CS et TTD.

The transcription factor nuclear factor-erythroid 2 p45-related factor 2 (Nrf2) controls the basal and inducible expression of a plethora of genes, predominantly those associated with oxidative stress response through its regulation of the glutathione and thioredoxin based antioxidant systems, and the maintenance of cellular redox homeostasis. While Nrf2 has long been studied in this context, it has more recently become apparent that the role of Nrf2 goes far beyond this narrow spectrum, including a clear role in the regulation of pathways involved in NADPH generation, gluconeogenesis, and lipid metabolism, although the true extent of the contribution of Nrf2 in vivo to many of these processes has yet to be fully elucidated. When the Nrf2 gene is disrupted, many genes involved in lipogenesis, which are known to be regulated by Pparα, are upregulated, indicating a potential role for Nrf2 in the repression of Pparα, a master regulator of hepatic lipid metabolism. The primary aim of this thesis was to further define the role of Nrf2 during metabolic stress and to determine the mechanism of action of such a function. Genetically altered animals of the genotypes WT, Nrf2-/-, Pparα-/- and Nrf2-/-/::Pparα-/- double knockout were utilised during the course of this study in an effort to tease apart the interactions of transcription factors Nrf2 and Pparα under acute and extended fasting conditions, when Pparα is strongly activated, to better understand their in vivo relationship. Data presented within this thesis demonstrate that during periods of extended fasting, Nrf2 serves to diminish the magnitude of gene induction mediated by Pparα in response to fasting. In Nrf2-/- animals during 48 hr fasting, the level of Pparα target gene expression is significantly higher, with corresponding lower plasma free fatty acid concentration than their WT counterparts. Upon genetic knockout of Pparα the target genes which were upregulated in the Nrf2-/- animals were not induced in response to fasting, indicating that their increased expression in response to fasting is solely regulated by Pparα. In order to further verify that the induction of these fasting-associated genes in the absence of Nrf2 was Pparα-dependent, animals null for both transcription factors were subjected to an extended fast and were shown not to support increased expression of the Pparα target genes despite the absence of Nrf2. Together, these data substantiate our hypothesis that under prolonged fasting conditions, the Pparα response is negatively regulated by Nrf2. Examination of gene induction at the more acute 24 hr time point revealed that Nrf2-/- animals showed similar expression levels of Pparα target genes as WT animals, in addition to exhibiting similar plasma free fatty acid concentrations as their WT counterparts, suggesting that the negative regulation of Pparα by Nrf2 reflects chronic biochemical changes. Additionally, it was demonstrated for the first time that robust activation of Nrf2 occurs in response to prolonged fasting, with highly significant induction of the prototypic Nrf2 target gene Nqo1. Importantly, this activation also occurred in the absence of Pparα, indicating that it is not via direct crosstalk between the transcription factors, nor is it a consequence of the generation of reactive oxygen species by the oxidation of fatty acids. In conclusion, this thesis describes data that provide further insight into the physiological role of Nrf2 in fatty acid metabolism. Future work is required to build upon this foundation and fully elucidate the signal(s) which leads to Nrf2 activation in response to prolonged periods of fasting.

Le transport cyto-nucleaire de la proteine c-fos necessite une stimulation continue par des facteurs seriques. Nous avons montre qu'il est aussi sensible a differents facteurs environnementaux et etendu cette observation a la proteine c-jun. Des questions aussi elementaires que le nombre de voies cataboliques operant sur une proteine et leur lieu de degradation restent non resolues. Nous avons tente de repondre a ces questions pour les differents membres des familles fos et jun. La degradation cytoplasmique de la plupart de ces facteurs, a l'exception de fra1 et fra2, peut etre initiee par des calciproteases cytosoliques ubiquitaires, les calpaines. Cela pourrait participer a la regulation de la composition des complexes transcriptionnels ap-1. Les proteines virales v-fos fbr et v-jun asv17, fortement transformantes, sont insensibles aux calpaines, contrairement a v-fos fbj. Cette stabilite pourrait participer au pouvoir transformant des proteines virales en favorisant leur accumulation. Enfin, la proteine c-fos est degradable par une thioprotease dependante du calcium dans les cellules. La sensibilite aux calpaines n'est pas liee a la presence de sequences pest, specifiques des proteines instables. Nous avons montre a partir des proteines fos et jun, et par extension a d'autres proteines, qu'elles ne constituent pas des sequences cibles des calpaines

La bonne coordination des différents évènements qui participent au maintien de l’intégrité du génome et régulent son expression est un pré-requis pour la différentiation, la prolifération et le vie de la cellule. L’interconnection de ces divers phénomènes est illustrée par l’existence d’un complex aux multiples fonctions, le facteur TFIIH. Identifié à l’origine comme un facteur de transcription associé à l’ARN polymérase II, TFIIH participe également à la réparation de l’AND soumis à diverses attaques génotoxiques. Je me suis interessé à le contribution fonctionelle et structurale de la sous-unité p52, une des dix sous-unités de TFIIH, au sein du complex, ainsi qu’au lien reliant les mecanismes de transcription et de réparation, dans lesquelles TFIIH joue un role prépondérent. Premièrement, j’ai démontré que l’extrémité carboxyl terminale de p52 était importante pour stabiliser l’ancrage de XPB, une des sous-unité de TFIIH, au sein du complex. Cette interaction est primordiale pour permettre à XPB d’exercer son role dans l’ouverture de l’ADN au cours de l’initiation de la transcription. Puis, je me suis attaché aux mécanismes couplant la réparation à la transcription. J’ai montré qu’une ARN polymérase arretée sur une lésion est capable de recruter les différents facteurs de réparation et d’induire le relarguage d’un fragment d’ADN contenant le dommage
Accurate coordination of the various events that maintain the integrity of the genome and regulate its expression is a prerequisite for differentiation, proliferation and cell life. The interconnection of such cellular processes is highlighted by the multi-functional complex TFIIH. Originally identified as a RNA polymerase II transcription factor, TFIIH also participates in the DNA nucleotide excision repair (NER) reaction. Ve focused my work on the functional/structural contribution within the complex of p52, one of the ten subunits of TFIIH, the link between transcription and NER, and the role of TFIIH in both. I first demonstrated that the carboxy-terminal of p52 is important for stabilizing the anchoring of XPB, another subunit of TFIIH, within the complex. This interaction is important for the role of XPB in the DNA opening step during transcription initiation. Then I focused my attention on the mechanism linking transcription to NER. I was able to show that a stalled elongating RNA polymerase II is able to recruit the repair factors at the site of the lesion and promote the removal of the DNA patch containing the lesion

Carcinogenesis is a complex process which requires a number of modifications to the genome in order to progress to tumor formation. Reactive oxygen species (ROS) have been identified as one of the causes of these mutations. The cellular response to ROS is to upregulate the production of an array of detoxifying enzymes. The transcription factors Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-p45 related factor 2) and the AhR (arylhydrocarbon receptor) are modulators of antioxidant response element and xenobiotic response element regulated genes respectively. These proteins control biological responses to a range of redox, electrophilic and non-endogenous compounds by controlling the expression of overlapping groups of proteins involved in phase I and II metabolism, redox control and anti-inflammatory activity. In the context of cancer cells, activation of these pathways has been associated with cytoprotective activity in the case of Nrf2 and various activities including cytotoxic activity in the case of the AhR. The ligands that activate or inhibit these transcription factors partially overlap and there is cross-talk between the two signalling pathways. A chemical biology approach was explored to elaborate series of heterocyclic inducers of Nrf2 and the AhR with a focus on flavone-like compounds (flavones, flavanols, flavanones, chalcones) and flavone isosteres (2-phenylbenzothiazole, 2-phenylbenzothiophenes and 3,5-diphenylisoxazolines). The aims were to characterise the behaviour of these isosteric compounds in relation to their Nrf2 inducing activity and/or AhR-dependent cytotoxicity. Structural modifications that develop structure-activity relationships and modify drug-like or drug delivery properties were invistigated. The synthesis of selected compounds and the initial biological studies are presented in this thesis.

L’expression des gènes codant les facteurs sigma ComX et SigX chez Lactococcus lactis varie pendant la croissance : le pic d’expression de comX correspond à l’entrée en phase stationnaire et celui de sigX se situe en phase exponentielle. Le but de ce travail est de comprendre le rôle de ces facteurs sigma chez L. Lactis. ComX est homologue aux sigma induisant la transcription des gènes tardifs de compétence naturelle chez certains streptocoques. L. Lactis n’est pas répertorié comme naturellement compétent mais son génome comporte des gènes codant un système tardif potentiel. Deux types de ComX (ComXIL et ComXMG) ont été identifiés chez les lactocoques divergeant par des substitutions d’acides aminés. La surexpression de comXIL engendre l’induction de la transcription des gènes tardifs. Un motif conservé (« cin-box ») est retrouvé en amont de ces gènes et pourrait correspondre à la séquence reconnue par ComXIL pour initier la transcription. La « cin-box » s’est révélée être très conservée chez les lactocoques, y compris dans les souches comportant le ComXMG. La purification de ComXIL, ComXMG et de l’ARN polymérase a été entreprise pour étudier l’affinité des ComX pour la « cin-box » et pour l’ARN polymérase. Pour identifier le régulon contrôlé par SigX, deux approches sont menées en comparant deux conditions : surexpression ou non de sigX. La première approche était la protéomique. Cette étude n’a pas révélé de cibles de SigX. La seconde approche est la transcriptomique. Les premiers résultats indiquent que SigX contrôlerait la transcription de gènes codant des protéines membranaires. Cette étude devrait aboutir à l’identification du rôle de SigX chez L. Lactis
The expression of the genes encoding the sigma factors ComX and SigX in Lactococcus lactis differs during growth : the expression peak of comX corresponds at the onset of the stationary phase and the one of sigX takes place in exponential phase. The aim of this work is to understand the role of these sigma factors in Lactococcus lactis. ComX is homologous to sigma inducing the transcription of the late genes of natural competence in several streptococci. L. Lactis is not listed as a natural competent bacterium but its genome includes some genes encoding a potential late system. Two types of ComX (ComXIL and ComXMG) were identified in lactococci that diverge by amino-acid substitutions. The overeexpression of ComXIL allows the induction of the transcription of the late genes. A conserved motif (« cin-box ») is found upstream of these genes and could correspond to the sequence recognised by ComXIL to initiate the transcription. The « cin-box » revealed itself to be very conserved in lactococci, including in the strains with a ComX of type ComXMG. The purification of ComXIL, ComXMG and of the RNA polymerase has been undertaken to study the affinity of the ComX for the « cin-box » and for the RNA polymerase. To identify the regulon controlled by SigX, two approaches are used by comparing two conditions : overexpression or not of sigX. The first approach was the proteomic. This study did not reveal any targets of SigX. The second approach is the transcriptomic. The first results indicate that SigX may control the transcription of genes encoding membrane proteins. This study should lead to the identification of the role of SigX in L. Lactis

Germ line mutations of the gene encoding the tricarboxylic acid (TCA) cycle enzyme fumarate hydratase (FH) cause a hereditary cancer syndrome known as hereditary leiomyomatosis and renal cell cancer (HLRCC). HLRCC-associated tumors harbor biallelic FH inactivation that results in the accumulation of the TCA cycle metabolite fumarate. Although it is known that fumarate accumulation can alter cellular signaling, if and how fumarate confers a growth advantage remain unclear. Here we show that fumarate accumulation confers a chronic proliferative signal by disrupting cellular iron signaling. Specifically, fumarate covalently modifies cysteine residues on iron regulatory protein 2 (IRP2), rendering it unable to repress ferritin mRNA translation. Simultaneously, fumarate increases ferritin gene transcription by activating the NRF2 (nuclear factor [erythroid-derived 2]-like 2) transcription factor. In turn, increased ferritin protein levels promote the expression of the promitotic transcription factor FOXM1 (Forkhead box protein M1). Consistently, clinical HLRCC tissues showed increased expression levels of both FOXM1 and its proliferation-associated target genes. This finding demonstrates how FH inactivation can endow cells with a growth advantage.

Les protéines ATF7 sont des protéines à leucine-zipper caractérisées par leur capacité à se fixer sur les séquences ATF/CRE (TGACGTCA) de différents promoteurs précoces d'adénovirus et de certains gènes cellulaires. Elles sont capables d'interagir avec certains membres de la famille des oncoprotéines Jun/Fos et de moduler leurs activités. Pour préciser le rôle d'ATF7 dans les mécanismes d'activation transcriptionnelle, nous avons analysé ses relations avec les hsTAFs, des protéines qui font partie de plusieurs complexes multiprotéiques comme le complexe TFIID. Nos résultats indiquent que l'activité transcriptionnelle d'ATF7 est spécifiquement relayée par hsTAF12, principalement par l'isoforme de 20 kDa. De plus ATF7 et hsTAF12 interagissent in vivo et l'intégrité du domaine activateur amino-terminal d'ATF7 et du motif "histone-fold" de hsTAF12 sont indispensables à cette interaction. Nous montrons enfin que la transactivation relayée par hsTAF12 est spécifiquement inhibée par hsTAF4 (son partenaire d'hétérodimérisation au sein de TFIID) mais pas par hsTAF4b, un homologue tissu-spécifique de hsTAF4. Parmi les protéines interagissant et modulant l'activité d'ATF7, notre équipe a détecté la protéine Ubc9, une enzyme clé de la voie de SUMOylation. Par ailleurs, nous avons identifié dans la partie amino-terminale d'ATF7 un motif consensus d'un site de SUMOylation et montré que la protéine est SUMOylée, à la fois par des expériences in vitro et in vivo. Nous avons observé que la localisation intracellulaire d'ATF7 était dépendante de sa SUMOylation : nos résultats suggèrent qu'ATF7 ne serait présent dans le noyau qu'à l'état dé-SUMOylé ; la SUMOylation cytoplasmique d'ATF7 induirait sa séquestration au niveau des complexes des pores nucléaires (NPC). Nous avons notamment mis en évidence, par des expériences d'immunomarquage, une colocalisation d'ATF7 avec une protéine des NPC, RanBP2. Cette dernière est également une enzyme E3 de la voie de SUMOylation qui augmente spécifiquement la SUMOylation d'ATF7 in vitro. De plus, une protéine ATF7 non SUMOylable (mutée au niveau de son site unique de SUMOylation) présente une activité transcriptionnelle nettement supérieure à celle de la protéine SUMOylée. Des expériences d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) ont également révélé que la SUMOylation d'ATF7 diminue sa présence au niveau de ses promoteurs cibles
ATF7 proteins, which are members of the b-Zip family of transcription factors, are able to bind ATF/CRE sequences (TGACGTCA) within different early adenoviral or cellular promoters. ATF7 can interact with the family of Jun/Fos oncoproteins and modulate their activities. To get an insight into the transactivation mechanism mediated by ATF7, we analyzed its relations with hsTAFs proteins, which are components of several multiproteic complexes like TFIID. Our results show that transactivation by ATF7 is specifically mediated by hsTAF12, mainly by its 20-kDa isoform. Moreover, ATF7 and hsTAF12 interact in vivo : the integrity of the ATF7 amino-terminal activation domain and of the hsTAF12 "histone-fold" domain is required for this interaction. We show that hsTAF12 mediated transactivation is specifically inhibited by hsTAF4 (its heterodimerization partner within TFIID), and not by hsTAF4b, a tissue-specific hsTAF4 homolog. Ubc9, a protein involved in the SUMOylation pathway, was found among the proteins interacting with ATF7 and modulating its activity. We have identified a consensus SUMOylation site within the N-terminal part of ATF7 and demonstrate that ATF7 is SUMOylated both by in vitro and in vivo experiments. Moreover, our results reveal that the intracellular localization of ATF7 is affected by its SUMOylation : ATF7 is found in the nucleus only in a de-SUMOylated form ; the cytoplasmic SUMOylation of ATF7 likely induces its sequestration at the level of the nuclear pore complexes (NPC). Using immunohistochemistry assays, we observe a colocalization between ATF7 and RanBP2, a protein of the NPC, which is an E3 ligase of the SUMOylation pathway. Accordingly, RanBP2 is able to stimulate ATF7 SUMOylation in vitro. This NPC targeting seems to influence ATF7 transactivation activity as an ATF7 mutant, whose SUMOylation is impaired, is more active than its SUMOylated counterpart. These results correlate with our chromatin-immunoprecipitation (ChIP) experiments, which show that the occupancy of a target promoter by ATF7 is highest in the presence of the unSUMOylated protein

Les composés phénoliques de la baie, et plus particulièrement les flavonoïdes (flavonols, tanins condensés, anthocyanes), constituent un des paramètres clés contrôlant la qualité organoleptique du raisin et du vin. Ils représentent également une source de molécules antioxydantes d’intérêt grandissant pour les industries pharmacologiques, agro-alimentaires et cosmétiques. De nombreux travaux réalisés sur les plantes modèles ont démontré que la régulation de la voie de biosynthèse des flavonoïdes est essentiellement gouvernée par des facteurs de transcription de type MYB, bHLH et des protéines de type WD40. Chez la Vigne (Vitis vinifera L.), plusieurs facteurs de transcription de type MYB régulant la voie des anthocyanes et/ou des tanins condensés ont déjà été identifiés. Cependant, aucun facteur de transcription de type bHLH ou WD40 n’a encore été caractérisé. Différentes approches ont été mises en œuvre pour identifier de nouveaux régulateurs de la voie des flavonoïdes chez la Vigne. Dans un premier temps, le facteur de transcription VvMYB5b a été utilisé comme appât dans une approche de double hybride non ciblé chez la Levure (Saccharomyces cerevisiae). Dans un deuxième temps, le promoteur d’un gène codant une enzyme centrale de la voie de biosynthèse des flavonoïdes, VvDFR, a été choisi afin de développer une approche de simple hybride non ciblé chez la Levure. Enfin, une approche ciblée vers des « gènes candidats » a permis l’identification des facteurs de transcription de type bHLH VvMYC1 et VvMYCA1. Le profil d’expression de VvMYCA1 correspond à celui de l’accumulation des tanins condensés dans la pellicule, et celui de VvMYC1 corrèle avec le profil de synthèse des flavonols, des anthocyanes et des tanins condensés dans la baie de raisin, ainsi que dans les inflorescences. De plus, VvMYC1 peut interagir avec différents partenaires MYB de Vigne régulant la synthèse des anthocyanes et/ou des tanins condensés, à la fois dans la Levure mais également in planta, où l’interaction VvMYC1/VvMYBs affecte l’expression de gènes structuraux tels que l’UFGT et l’ANR. Cette interaction induit une synthèse d’anthocyanes, aussi bien en système homologue qu’en système hétérologue (Tabac et Arabidopsis). Enfin, des essais complémentaires impliquant le promoteur de VvMYC1 ont permis de démontrer que VvMYC1, en interagissant avec VvMYBPA1, peut moduler sa propre expression in vivo
Phenolic compounds, and more specifically flavonoids (flavonols, condensed tannins and anthocyanins), are key components of the grapevine and wine quality. Because of their antioxidant activities, these compounds are of interest in pharmacological and cosmetic industries, as well as being beneficial to the human diet. Previous work on model plants showed that the flavonoid pathway was mainly regulated by the MYB and bHLH transcription factors, and WD40 proteins. In the grapevine (Vitis vinifera L.), only MYB regulators have been identified until now, and no bHLH or WD40 have been characterised. In this work, several approaches were used to identify new transcription factors involved in grapevine flavonoid biosynthesis. Firstly, the VvMYB5b protein was used as a bait in a large scale two hybrid experiment in yeast (Saccharomyces cerevisiae). Secondly, the promoter of the VvDFR gene, coding a central enzyme of the flavonoid pathway, was chosen to conduct a large scale one hybrid experiment, also in yeast. Finally, a “gene candidate” approach allowed identification of the bHLH transcription factors VvMYC1 and VvMYCA1. VvMYCA1 expression profile in berry skin and seeds correlates with condensed tannins synthesis, whereas VvMYC1 transcript accumulation in these tissues and the grapevine inflorescence correlates with condensed tannins, anthocyanins and flavonols accumulation. In yeast, VvMYC1 could physically interact with different MYB partners regulating the anthocyanin or the condensed tannins biosynthesis. This interaction was confirmed by transient promoter assays in grape cell suspensions, where co-expression of VvMYC1 with specific MYB partners activated the UFGT and ANR promoters. Likewise, this interaction induced anthocyanin accumulation in grape cells, as well as in tobacco leaves and Arabidopsis. Eventually, additional transient promoter assays revealed that VvMYC1 is involved, with VvMYBPA1, in feedback regulation of its own expression

Les enhancers sont des régulateurs cruciaux de l’expression des gènes pendant le développement embryonnaire. L’ascidie Ciona intestinalis est un organisme-modèle qui se prête à l’étude de ces séquences cis-régulatrices car ses enhancers sont généralement petits et compacts, et le lignage invariant des cellules chez l’embryon permet de visualiser leur activité avec une résolution cellulaire. Deux signatures indépendantes associées à l’activité d’un enhancer avaient été identifiées : la présence de sites de fixation pour des facteurs de transcription spécifiques, et une signature dinucléotidique globale à l’échelle des enhancers. (Khoueiry 2010). Cependant, si ces signatures corrèlent avec l’activité des enhancers, elles ne permettent pas d’identifier de nouveaux enhancers grâce à leur séquence. Pendant ma thèse, j’ai utilisé un enhancer neural précoce de Ciona, le très bien caractérisé élément-a du gène Otx, comme enhancer-modèle. Ce petit enhancer (55pb), est lié par les facteurs de transcription GATA-a et ETS1/2 et activé par la voie de signalisation FGF. Afin de mieux comprendre les déterminants de l’activité neurale précoce d’un enhancer, j’ai testé l’impact de mutations ponctuelles affectant l’affinité de sites de fixation de l’élément-a pour les facteurs de transcription. J’ai également randomisé les séquences intercalantes, situées entre les sites de fixation pour ETS et GATA dans quatre clusters de ces sites.Nos résultats suggèrent au moins deux niveaux de contrôle de la régulation en cis : i) la spécificité spatiotemporelle de l’activité d’un enhancer est définie par l’identité des sites de fixation des facteurs de transcription, et ii) son niveau d’activité dépend à la fois de l’affinité des facteurs de transcription pour leurs sites de fixation et la composition des séquences intercalantes. La majorité des variants randomisés de l’élément-a sont actifs dans les mêmes lignées cellulaires que le sauvage et leurs niveaux d’activité sont très divers. Le même résultat est obtenu en randomisant les séquences intercalantes d’un autre cluster ETS/GATA actif. La randomisation de ces séquences a même conféré de l’activité enhancer à de nombreux variants de clusters inactifs. En accord avec leur activité neurale précoce et la présence de sites de fixations pour ETS et GATA, ces variants, comme l’élément-a, répondent à l’induction neurale de FGF. Nous n’avons pas réussi à expliquer l’action des séquences intercalantes sur l’activité des enhancers par des caractéristiques simples de leurs séquences (nucléotidique ou dinucléotidique), et l’on ne comprend pas pourquoi il est si simple de créer un enhancer synthétique quand la majorité des clusters génomiques de sites de fixations putatifs pour ETS et GATA sont inactifs. En utilisant une approche de fixation in vitro des facteurs de transcription, nous avons montré que la randomisation des séquences intercalantes peut affecter la fixation d’un facteur de transcription sur l’élément a, sans changer la séquence primaire du site de fixation, mais que la fixation sur l'élément entier ne peut pas toujours être expliquée par la fixation sur les sites isolées. Ces résultats suggèrent que la structure physique de l’hélice d’ADN autour des sites de fixation peut jouer un rôle important dans le contrôle de l’activité d’un gène
Enhancers are crucial elements for the control of gene expression during embryonic development. The ascidian Ciona intestinalis offers unique experimental features to study these cis-regulatory sequences: enhancers are generally small and compact and their activity can be tracked at the single cell level thanks to the invariant cell lineage of ascidian embryos.Previous work identified two independent signatures associated with enhancer activity: the presence of specific transcription factors binding sites (TFBS) and a global dinucleotide signature along enhancers (Khoueiry, 2010). Although they correlate with enhancer activity, these signatures are insufficient to identify enhancer sequences from their sole sequence. During my thesis, I used a well-characterized early neural Ciona enhancer, the a-element of the Otx gene, as a model enhancer. This small (55pb) enhancer, is bound by GATA-a and ETS1/2 and is activated by the FGF pathway. To better understand the determinants of early neural enhancer activity, I tested the impact of point mutations affecting the affinity of the a-element TFBS for their binding TF and of the randomization of the spacer sequences that separate the TFBS in four ETS and GATA binding site clusters.Our results suggest at least two levels of cis-regulatory control: spatiotemporal specificity of enhancer activity is encoded in the identity of TF-binding sites, while the level of enhancer activity is set both by the affinity of TFs for their binding sites and by the composition of the spacer sequences. A surprisingly high number of variants of the a-element with randomized spacers are active, always in the same cell lineages as the WT. These variants, however, display a wide range of activity levels. This effect is also observed when the spacers in another active ETS/GATA cluster are randomized. Randomization of the spacers can even confer enhancer activity to a large fraction of inactive cluster variants. Consistent with their early neural activity and with the presence of ETS- and GATA-binding sites, these variants are, like the a-element, responsive to the FGF neural inducer.We could not link the action of the spacers on enhancer activity to any simple nucleotide or dinucleotide sequence features and it currently remains unclear why it is so easy to create a synthetic enhancer while most putative genomic ETS/GATA clusters are inactive. Using in vitro transcription factor binding assays, we showed that randomization of spacer sequences can affect TF binding to the a-element without changing the primary sequence of the binding site, and that extended minimal TFBS do not always recapitulate binding to the whole element. These results suggest that the physical structure of the DNA helix around the binding sites may play an important role in the control of enhancer activity

Les facteurs de transcription induits par l’hypoxie (HIF) sont responsables de la transcription de nombreux gènes impliqués dans la réponse à l’hypoxie. En plus de réguler de nombreux processus cellulaires et physiologiques, ces facteurs sont impliqués dans plusieurs pathologies. Hétérodimères constitués d’une sous-unité β constitutive et d’une sous-unité α sensible à l’oxygène, ces facteurs sont majoritairement régulés par l’hydroxylation et la dégradation de la sous-unité α. En situation d’hypoxie, ce mécanisme de dégradation est inhibé, ce qui favorise la formation de complexes HIF. Les travaux présentés dans cette thèse visent à élucider les mécanismes régulant l’activation de HIF en situation d’hypoxie ou de normoxie. Dans la section Résultats, vous retrouverez une section consacrée à l’activation de HIF par l’angiotensine II (AngII) chez les cellules musculaires lisses vasculaires. Plus précisément, le rôle de la transactivation de récepteurs à activité tyrosine kinase suivi de l’implication de HIF dans la biologie de ces cellules seront abordés. Dans un deuxième temps, un inhibiteur des métalloprotéases, le BiPS, vous sera présenté comme étant un puissant inducteur des protéines HIF-α. En effet, le BiPS est un puissant inhibiteur des enzymes responsables de la dégradation des protéines HIF-α. En outre, le BiPS permet l’activation des complexes HIF ainsi formés. Ces résultats inattendus pourraient avoir des répercussions importantes dans l’utilisation de cet agent à des fins angiostatiques dans le traitement du cancer en plus de présenter un nouvel agent ayant un potentiel thérapeutique important dans le traitement de pathologies ischémiques. Finalement, vous retrouverez une section consacrée à l’étude d’un nouveau répresseur de HIF, l’histone acétyltransférase HBO1. De façon étonnante, HBO1 réprime l’activité des complexes HIF par un mécanisme indépendant de la stabilisation des sous-unités α mais dépendant du remodelage de la chromatine. En conclusion, ces résultats mettent en lumière de nouveaux mécanismes de régulation de l’activité des facteurs de transcription HIF. Considérant les rôles physiologiques importants de ces complexes ainsi que leurs implications dans diverses maladies, ces résultats permettront d’accroître les connaissances disponibles quant aux fonctions de ces complexes et mèneront vers le développement d’outils thérapeutiques efficaces.
Hypoxia-inducible transcription factors (HIF) are decisive elements in the transcriptional regulation of numerous genes expressed in conditions of hypoxic stress. In addition to their roles in many physiological and cellular processes, HIF are also involved in diverse pathological situations. Obligate heterodimers composed of a constitutive β subunit and of an oxygen tension-regulated α subunit, these transcription factors are mainly regulated by the hydroxylation and subsequent degradation of the α subunit. In hypoxia, this degradation mechanism is inhibited, resulting in HIF complex formation and binding to specific DNA sequences. The work presented in this thesis aims to elucidate regulatory mechanisms involved in HIF activation during hypoxia or in normal oxygen conditions. In the Results section, you will find a study devoted to HIF activation by angiotensin II (Ang II) in vascular smooth muscle cells. Specifically, the role of receptor tyrosine kinase transactivation on HIF activation was evaluated along with a description of HIF-1’s role in smooth muscle cells biology. Next, an inhibitor of matrix metalloproteases, BiPS, will be presented as a novel and potent HIF activator. This unexpected effect may have important implications for the use of this compound for its angiostatic potential in cancer treatment. In addition, BiPS and derivative molecules could also have strong therapeutic potential in ischemic diseases. Finally, you will find a section devoted to the study of a new transcriptional repressor of HIF complexes, the histone acetyltransferase bound to ORC-1, HBO1. Surprisingly, HBO1 represses the activity of HIF complexes by a mechanism independent of the availability of the α subunits, but dependent on a chromatin remodelling event. In conclusion, this thesis highlights new regulatory mechanisms responsible for HIF activation. Considering the important physiological roles of HIF complexes and their implications in the pathogenesis of different diseases, these studies increase the available knowledge concerning the biological functions of these complexes and could contribute to the development of more effective and safe therapeutic tools.

L'interleukine-6 (il-6) est une cytokine produisant une impressionnante variete d'effets biologiques. Le but de cette these est d'identifier des voies intracellulaires menant du recepteur de l'il-6 aux changements d'expression genique dans le noyau et de comprendre a quelle etape dans la transmission du signal les effets d'il-6 divergent d'une cellule a une autre. La transcription du gene irf-1 est induite tres rapidement et directement par l'il-6 dans toutes les lignees cellulaires testees. Nous avons caracterise sur ce gene une sequence d'adn palindromique, pire, impliquee dans la reponse a l'il-6, mais aussi dans la reponse aux interferons (ifns). L'etude des facteurs de transcription se liant a des elements d'adn homologue, en reponse a l'il-6 et aux ifns nous a permis de caracteriser un nouveau facteur de transcription, pirf-a, specifiquement active dans les premieres minutes du traitement par l'il-6. Ce facteur heteromerique contient une proteine de 46 kda et au moins deux proteines de 91-98kda, une de ces dernieres reagissant avec des anticorps anti aprf/stat3. Trois autres facteurs sont aussi actives par l'il-6 et contiennent differentes combinaisons de facteurs stat3/aprf avec ou sans stat1, une proteine appartenant aussi a la voie de signalisation des ifns. Etudiant en parallele l'activation par l'il-6 du gene myd88 dans les cellules myeloides, nous montrons que ce gene est regule par une sequence pire chevauchant une sequence cible de irf-1. Une des fonctions d'irf-1 est d'inhiber la multiplication cellulaire, irf-2 ayant un effet antagoniste. Nous montrons que l'il6 stimule aussi l'expression de la proteine irf1, mais que la liaison d'irf-1 a son site cible n'est observee que dans les cellules ou il-6 inhibe la croissance. Nous avons mis en evidence et etudie l'activite de differentes formes d'irf-2 et en particulier une forme de clivage apparaissant au cours de l'infection par le chlamydia, dont l'activite repressive semble plus importante

Virtuellement tous les habitats terrestres sont dominés par les angiospermes, ou plantes à fleurs. Leur capacité à coloniser de nouveaux habitats et supplanter une autre espèce est due à l'avènement d'une nouvelle structure reproductrice – la fleur. La fleur uni les organes mâles et femelles dans une structure compacte et contient la graine. Les plantes à fleurs ne sont pas seulement le type dominant des plantes terrestres, mais sont également la principale source de nourriture et l'habitat de tous les animaux, y compris les humains. En termes d'évolution, les fleurs sont considérées comme un développement récent. Elles ont fait l'objet de spéculations depuis l'époque de Charles Darwin qui à nommé l’évolution dominante et la diversification des plantes à fleurs comme «un abominable mystère» en raison de l'absence d'une transition en douceur de la non-floraison vers la floraison des plantes dans le registre fossile. Avec le séquençage de plusieurs génomes de gymnospermes (semences de plantes non-florales), d’angiospermes basals et de plantes à fleurs supérieures, certaines familles de gènes jouant un rôle central dans le développement et l'évolution de la fleur ont été identifiées. Notre recherche se concentre sur une de ces familles de régulateurs de niveau supérieur appelée « famille de facteur de transcription MADS » (TF). Cette famille de TF permet d'orchestrer le développement des fleurs. Nous nous sommes intéressés à la compréhension des mécanismes moléculaires de la famille des MADS et à la façon dont ces protéines sont capables de contrôler les fonctions de reproduction complexes.Ce projet intègre différentes techniques biophysiques comme la cristallographie aux rayons X, la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) et la microscopie à force atomique (AFM) afin d’étudier les interactions protéine-protéine et protéine-ADN des FT MADS. Aucune étude n’a, à ce jour, porté sur les mécanismes moléculaires des FT MADS en utilisant cette approche structurale intégrée.Un obstacle important dans l'étude des FT MADS a été l’expression des protéines recombinantes et leur purification. Dans ce projet, les protocoles de purification de plusieurs recombinants FT MADS entières ont été établis, permettant la caractérisation structurale et biochimique des protéines dans leurs intégralités. La structure aux rayons X du domaine d'oligomérisation de la protéine de la famille MADS, SEPALLATA3 (SEP3) est présenté et utilisé comme modèle pour comprendre les motifs d'oligomérisation de la famille élargie et les bases moléculaires des interactions protéine-protéine. Des solutions de structures9provenant d'études SAXS de AGAMOUS (AG) et de la phase végétative courte (SVP) sont présentées et complétés par la caractérisation biochimique de leur état d'oligomérisation.Afin d'étudier les interactions protéine-ADN, des procédés complémentaires ont été utilisés. Une propriété importante des FT MADS est leur capacité à modifier la structure de l'ADN grâce à la formation de boucles d'ADN. De manière hypothétique, les FT MADS oligomérisent et fixent l'ADN sur deux sites différents, bouclant potentiellement l'ADN. En utilisant l'AFM, la première preuve directe de la formation de boucle d'ADN par SEP3 est obtenue. Les caractéristiques de liaison d'ADN de SVP ont été étudiées par analyse de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA), par thermophorèseà échelle microscopique (MST) et par AFM. Contrairement au cas de SEP3, l’EMSA et l’AFM ont montrés que SVP est un dimère et présente différents modes de liaison à l'ADN.Ces données fournissent une base atomique et structurale de la fonction des FT MADS. Sur la base de ce travail, nous commençons à comprendre l’oligomérisation et certaines spécificités déterminantes de liaison à l'ADN. Ces études montrent comment les FT MADS s’oligomérisent
Virtually all terrestrial habitats are dominated by angiosperms, or flowering plants. Their success in colonizing new habitats and supplanting other species is due to the advent of a complex reproductive structure – the flower. The flower unites the male and female organs into one compact structure and encloses the seed. Flowering plants are not only the dominant type of land plants, but also are the primary source of food and habitat for all animals, including humans. In evolutionary terms, flowers are considered a recent development and have been a subject of speculation from the time of Charles Darwin who termed the dominant rise and diversification of flowering plants as “an abominable mystery”* due to the lack of a smooth transition from non-flowering to flowering plants in the fossil record. With the sequencing of multiple genomes from gymnosperms (non-flowering seed plants), basal angiosperms and higher flowering plants, certain gene families have been identified which play a central role in the development and evolution of the flower. My research focuses on one such family of high-level regulators, the MADS transcription factor (TF) family. This TF family helps to orchestrate flower development among other functions. As such, there is great interest in understanding the molecular mechanisms of the MADS family and how these proteins are able to control complex reproductive pathways.This project integrates different biophysical techniques including x-ray crystallography, small angle x-ray scattering (SAXS) and atomic force microscopy (AFM) to investigate protein-protein and protein-DNA interactions of MADS TFs. No studies to date have investigated the molecular mechanisms of MADS TFs using this integrated structural approach.One important hurdle in the study of the MADS TFs has been recombinant protein expression and purification. In this project, recombinant purification protocols for several full length MADS TFs were established, allowing the structural and biochemical characterisation of the proteins. The crystal structure of the oligomerisation domain of the MADS family protein SEPALLATA3 (SEP3) is presented and used as a template for understanding the oligomerisation patterns of the larger family and the molecular basis for protein-protein interactions. Investigation of solution structures, derived from SAXS studies, of AGAMOUS (AG) and SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP) along with biochemical characterisation of their oligomerisation states are also presented.In order to study protein-DNA interactions, complementary methods were used. An important putative property of the MADS TFs is their ability to change the structure of DNA through the formation of DNA loops. MADS TFs are hypothesized to oligomerise and bind DNA at two different sites, potentiating looping of DNA. Using AFM, the first direct evidence of DNA looping by SEP3 is described. The DNA binding characteristics of SVP were studied using electrophoretic mobility shift assay (EMSA), microscale thermophoresis (MST) and AFM. Unlike SEP3, SVP is dimeric and thus exhibits different DNA-binding patterns.The data presented here provide an atomic and structural basis for MADS TF function. Based on this work, we now are beginning to understand some of the oligomerisation and DNA-binding specificity determinants. These studies demonstrate how the MADS TFs oligomerise and the results show that we can disrupt oligomerisation and potentially DNA-binding very specifically through the introduction of point mutations. Future work will investigate the in vivo consequences of altered oligomerisation and how this affects different developmental programs in plant reproduction and floral organ morphogenesis.*Letter from Charles Darwin to Joseph Dalton Hooker, written 22 July 1879 (Source: Cambridge University Library DAR 95: 485 – 488) (Friedman, 2009b)

ERM est un facteur de transcription de la famille ETS appartenant au groupe PEA3 qui joue un rôle important dans divers processus biologiques dont la tumorigenèse mammaire. La régulation de son activité transcriptionnelle nécessite des modifications post-traductionnelles et des interactions avec des partenaires. Nous avons mis au point différentes techniques de chromatographie d’affinité dans le but d’identifier de nouveaux partenaires d’ERM. Parmi ceux-ci, trois ont été confirmés comme partenaires directs d’ERM : la protéine CoAA (CoActivator Activator) et les protéines MED23 et MED25. MED23 et MED25 sont des sous-unités du médiateur, complexe qui régule la transcription en intégrant les signaux entre des facteurs de transcription et la machinerie transcriptionnelle. Nous avons démontré que ces protéines interagissent in vitro et in vivo avec ERM et sont nécessaires à l’activation transcriptionnelle induite par ce facteur de transcription. Toutefois, ces sous-unités ont une capacité différente de recrutement du médiateur sur ERM in vitro.La ribonucléoprotéine CoAA régule l’expression de certains gènes et l’épissage alternatif des ARN messagers. CoAA interagit in vitro et in vivo avec ERM. L’activité d’ERM est augmentée par la surexpression de CoAA tandis qu’elle est diminuée par sa sous-expression. Cette activation médiée par CoAA est liée à une modulation du taux de sumoylation d’ERM. Ces travaux ont permis de définir de nouvelles voies de régulation de l’activité transcriptionnelle d’ERM et des autres membres du groupe PEA3. Il reste maintenant à préciser les mécanismes impliqués dans la modulation de l’activité des membres du groupe PEA3 par ces nouveaux interacteurs
ERM is an ETS transcription factor which belongs to the PEA3 group and is involved in several processes such as migration and dissemination during organogenesis and cancer development. Regulation of its transcriptional activity requires post-translational modifications and interactions with partner proteins. In order to identify new ERM partners, we have developed various affinity chromatography techniques to isolate new potential partners. Among these candidates, CoAA (CoActivator Activator), MED23 and MED25 directly interact with ERM.MED23 and MED25 are subunits of the mediator. The mediator is a 30 sub-units multi-protein complex which mediates signals from transcription factors bound at upstream promoter elements or enhancers to RNA polymerase II and the general initiation factors bound at the core promoter. We found that MED23 and MED25 interact with ERM in vitro and in vivo and are required for transcriptional activation induced by ERM. However, these sub-units display various ability to recruit the mediator on ERM in vitro. The heterogeneous nuclear ribonucleoprotein-like protein CoAA regulates gene expression and RNA splicing. We demonstrated that ERM interacts in vitro and in vivo with CoAA. ERM transcriptional activity is enhanced upon CoAA overexpression and is decreased by CoAA knock-down. We demonstrated that CoAA modulates ERM transcriptional activity by decreasing sumoylated ERM levels. This work demonstrated new ways to regulate the activity of ERM and the two other PEA3 group members. The molecular mechanisms involved in the modulation of PEA3 member activity by these partners remain to be clarified

Le développement du muscle squelettique murin s’effectue sous le contrôle de plusieurs facteurs de transcription tels que Myod et Myf5. Les facteurs de croissance IGF (Igf1 et Igf2) sont également impliqués. Pour étudier les interactions entre Myod et Igf2, un modèle murin d’invalidation de ces gènes a été obtenu. Bien que les animaux simples mutants soient viables, les souris Myod-/- Igf2-/- présentent une létalité périnatale, due à une insuffisance respiratoire. Des analyses histologiques, à 18,5 dpc, ont montré une atrophie importante du diaphragme ainsi qu’une hypertrophie du tissu adipeux brun des doubles mutants en comparaison aux contrôles. Etonnamment, l’atrophie musculaire est spécifique du diaphragme et s’explique par un nombre réduit de fibres. De plus, une désorganisation importante des sarcomères a été mise en évidence et la capacité contractile du diaphragme est sévèrement réduite en comparaison aux diaphragmes contrôles. Enfin, les interactions moléculaires ont été étudiées dans le diaphragme et les muscles des cuisses à 18,5 dpc. Nous avons pu montrer l’existence d’une boucle de rétrocontrôle négative entre Myod et Igf2, au niveau transcriptionnel, ainsi qu’un contrôle de l’expression de Myod et Myf5 par Igf2, de façon spécifique au diaphragme. Des expériences de ChIP ont mis en évidence une fixation du facteur de transcription Myod au niveau d’une séquence activatrice contrôlant l’expression du locus Igf2/H19, spécifiquement dans les tissus mésodermiques. Enfin, une expérience de 3C a permis de corroborer l’interaction de cette séquence activatrice du mésoderme avec le promoteur H19, permettant l’introduction d’un nouvel acteur dans la myogenèse.

L'objectif de ma thèse a été de définir l'impact de la sur-expression des facteurs de transcription Olig sur la différenciation des cellules souches neurales en oligodendrocyte dans un modèle de souris transgénique. L'expression des transgènes est induite par la doxycycline dans les cellules souches nestine+. Au cours du développement, l'expression forcée de Olig1 ou Olig2 induit une genèse ectopique d'oligodendrocytes. De plus, la sur-expression de Olig2 bloque la spécification des interneurones V3. En post-natal, la sur-expression de Olig2 dans les zones germinatives provoque une myélinisation précoce et une augmentation du nombre d'astrocytes dans le corps calleux. L'ensemble de mes résultats indique que la sur-expression des facteurs Olig pourrait constituer une stratégie thérapeutique intéressante pour promouvoir la régénération de la myéline dans des pathologies démyélinisantes, telle que la scérose en plaques
Olig1 and Olig2 are b-HLH transcription factors involved in oligodendrocyte development in the central nervous system. My project aims to analyse the effect of Olig gene over-expression in neural stem cells. Therefore, I designed and analyzed transgenic mice models with inducible expression of Olig genes in nestin+ neural stem/progenitor cells (Tet-On system). At embryonic stages, forced expression of Olig1 and Olig2 leads to ectopic expression of oligodendrocyte markers. Moreover, Olig2 over-expression decreased V3 interneuron specification. At postnatal stage Olig2 over-expression in germinative area induced earlier myelination and astrocyte specification in corpus callosum. These transgenic mice provide a useful model to test whether forced expression of Olig genes represents a possible strategy to enhance remyelination in demyelinating disease such as multiple sclerosis

La regulation de l'expression des genes transcrits par l'arn polymerase ii repose en partie sur le controle de l'etape de l'initiation de la transcription. Ce processus necessite le recrutement de nombreux facteurs au niveau du promoteur des genes a transcrire, dont le facteur de transcription tfiid. Tfiid est un complexe multiproteique compose de tbp et d'au moins onze facteurs associes (taf#i#is). Ce facteur est responsable de la reconnaissance de l'element tata present dans la plupart des promoteurs. Au cours de ce travail de these, nous avons isole et caracterise trois composants du complexe tfiid humain (h), htaf#i#i100, htaf#i#i55 et htaf#i#i28 et mis en evidence certaines de leurs caracteristiques fonctionnelles. Nous avons mis en evidence une interaction fonctionnelle entre htaf#i#i100 et le facteur general tfiif qui contribut a la formation du complexe de preinitiation in vitro. D'autre part, nous avons caracterise des interactions entre htaf#i#i55 et differents recepteurs nucleaires, interactions qui semblent contribuer a l'activation transcriptionnelle par ces recepteurs. Des experiences de cotransfection ont demontre que htaf#i#i28 et tbp peuvent cooperer pour augmenter l'activation de la transcription par plusieurs recepteurs nucleaires. La structure de l'heterodimere htaf#i#i28/htaf#i#i18 a ete determinee par cristallographie aux rayons x revelant une structure de type histone. Nous avons utilise ces donnees structurales pour identifier des acides amines dans l'2-helice du histone fold de htaf#i#i28 et dans l'helice h1' de tbp necessaires a l'interaction de ces deux proteines. De plus, la cooperation fonctionnelle entre tbp et htaf#i#i28 necessite une interaction dynamique entre htaf#i#i28, tbp et d'autres facteurs cellulaires.

L’hypopituitarisme se définit par le déficit d’une ou plusieurs hormones hypophysaires.L’hypopituitarisme congénital est lié à des mutations de facteurs de transcriptionimpliqués dans le développement hypophysaire. Identifier les mécanismes et étiologiesd’hypopituitarisme congénital doit permettre d’améliorer les traitements des patients.Dans cette optique, ce travail a porté sur 3 aspects :Clarifier les mécanismes permettant la différenciation des lignées hypophysaires. Aucours du développement hypophysaire chez la souris, il existe un phénomène complexed’interaction entre 2 facteurs de transcription à homéodomaine paired (Prop1 et Hesx1),la voie Wnt-ßcaténine et les co-répresseurs de la famille Groucho/TLE. Ces interactionssont nécessaires à l’expression d’un autre facteur de transcription hypophysaire, Pit-1(Pou1f1), impliqué dans la différentiation des lignées hypophysaires somato-lactotropeset thyréotropes. Nous avons démontré in vitro, que les co-répresseurs de la famille TLEjouaient un rôle inhibiteur direct sur l’activation de l’early enhancer de POU1F1 à e12-e13, indépendamment de l’action de HESX1. Nos modèles de souris transgéniquesavec expression permanente de HESX1 et TLE3 permettent de mettre en évidence lerôle inhibiteur majeur de HESX1, et le rôle accessoire de TLE3. Les mutations dePROP1 étant à l’origine d’une expression persistante de HESX1 et TLE3, il est probablequ’ils jouent un rôle dans le déficit en sous-unité alpha observé chez les patientsdéficitaires en PROP1.Identifier et analyser la signification fonctionnelle de nouveaux variants alléliques dugène d’un facteur de transcription à homéodomaine LIM, LHX4. La mutation T99fs deLHX4 est à l’origine d’un phénotype hypophysaire très variable au sein d’une mêmefamille, en termes de déficits et de morphologie hypophysaires, et d’anomalies extrahypophysairesassociées. Les études fonctionnelles ont montré que cette mutation étaitresponsable d’un phénomène d’haplo-insuffisance. Cette nouvelle mutation permetd’enrichir le spectre phénotypique des patients chez lesquels doit être effectué unséquençage du gène LHX4 à la recherche d’étiologie de déficit hypophysaire combinémultiple.Identifier des mécanismes nécessaires au développement de l’axe thyréotrope. Dessouris exprimant une nouvelle recombinase Cre sous contrôle du promoteur de la Tshßont été croisées avec des souris transgéniques pour lesquelles les gènes de Pitx2 oud’Isl1 (2 facteurs de transcription impliqués dans le développement hypophysaire)étaient encadrés de séquences flox. Les modèles permettaient ainsi l’inactivation dePitx2 et Isl1 au sein des cellules thyréotropes au cours de l’embryogenèse. L’étudephénotypique retrouve un déficit de croissance compatible avec un déficit thyréotropepartiel en cas d’inactivation de Pitx2 : ce phénotype est probablement lié à unmécanisme compensateur assuré par PITX1, un facteur de transcription àhoméodomaine bicoïde possédant le même homéodomaine et domaine C terminal quePITX2. A l’inverse, l’inactivation de Isl& se traduit par un déficit thyréotrope complet. Lefait que les transcrits de l’ensemble des facteurs de transcription nécessaires audéveloppement de l’axe thyréotrope soient diminués dans ce modèle souligne le rôlemajeur de ISL1 dans la fonction et la maintenance de l’axe thyréotrope.Nos résultats permettent de mieux appréhender certains des nombreux mécanismes etfacteurs impliqués dans le développement hypophysaire chez la souris, et dans lapathologie hypophysaire chez l’homme
Hypopituitarism is defined by one or several pituitary deficiencies. Congenital hypopituitarism is mostly due to transcription factors mutations. Our aims were to try to better identify some of the mechanisms involved in pituitary ontogenesis and pituitary diseases, mainly pituitary deficiencies: new pathways, new transcription factors, new mutations. - First we identified novel mechanisms necessary for the differenciation of the Pou1f1 lineages (ie somatolactotroph and thyrotroph cells). The role of TLE co-repressors is crucial, as they are able by themselves to inhibit the stimulatory actions of PROP1 on POU1F1 promoter. This is necessary to obtain a correct timing of differentiation during pituitary development (Carvalho, Brinkmeier, castinetti et al., Molecular Endocrinology, 2010). - Second, we showed the roles of 2 transcription factors, PITX2 and ISL1, in thyrotrophs maintenance and function. By using a new cre recombinase driven by the TSHb promoter, we managed to inactivate each of these transcription factors in the thyrotrophs. Inactivation of PITX2 led to a partial thyrotroph deficiency, counterbalanced by an overexpression of PITX1 (Castinetti et al., Molecular Endocrinology, submitted). Inactivation of ISL1 led to a complete thyrotroph deficiency (Castinetti et al., Molecular Endocrinology, in preparation). - Finally, we reported 1 new mutation of the LIM transcription factor LHX4, responsible for combined pituitary hormone deficiencies in a family. New phenotypic traits will help the physician improve the way to select which patients to screen for LHX4 mutations (Castinetti, Saveanu et al., JCEM, 2008)

Nous avons étudié la régulation de la transcription du gène alpha-tropomyosine (TM) dans les cellules musculaires lisses (CML), squelettiques et cardiaques en culture. Les séquences régulatrices C-rich et MCAT activent la transcription dans les trois types cellulaires. Le trans-facteur TEF-1, qui lie la séquence MCAT, joue un rôle majeur dans la régulation de la transcription dans les trois types de muscles. Le facteur SRF interviendrait de façon indirecte, dans les CML et les cardiomyoctes, en augmentant la liaison de TEF-1 sur la boîte MCAT, et directement dans les myoblastes squelettiques en se liant à la boîte CArG. La fonction activatrice de TEF-1 et SRF semble corrélée à leur localisation sub-cellulaire dans les CML
We have studied the transcriptional regulation of alpha-tropomyosin (α-TM) gene, in smooth, skeletal and cardiac muscle cells in culture. The regulatory sequences, C-rich and MCAT enhance transcription of the α-TM gene in the three muscle types. TEF-1 trans-factor plays a major role in the transcriptional regulation in the three muscle types, by binding to MCAT sequence. SRF factor seems to be involved, directly and indirectly, in the transcription activation of the gene. SRF could act indirectly in smooth and cardiac muscle cells, by enhancing TEF-1 binding, and directly in skeletal muscle cells, by binding to a CarG box. The role of TEF-1 and SRF factors could be related to their subcellular localization in smooth muscle cells

Le facteur de transcription TFIID est un grand complexe multiprotéique qui joue un rôle clé dans la régulation de l'expression des gènes de classe II. Ce complexe est composé de TBP (TATA Binding Protein) et de 14 TAFs (TBP-Associated Factors). La microscopie électronique et la technique d'analyse d'images de molécules isolées nous ont permis d'obtenir les structures 3D des complexesTFIID humain et de levure aux résolutions de 3,5 nm et 3 nm, respectivement. Ces structures sont très semblables en tailles et en formes, elles sont toutes deux constituées de trois domaines, organisés en une pince moléculaire offrant une cavité d'une taille compatible avec celle de l'ADN. De façon surprenante, le complexe TFTC (TBP-Free TAF Containing Complex) est aussi capable d'initier la transcription in vitro, bien qu'il soit dépourvu de TBP. Il possède 8 TAFs aussi présents dans TFIID et comporte des sous-unités qui lui sont spécifiques. Le modèle de TFTC à la résolution de 3,5 nm a révélé que TFTC et TFIID avait un noyau structural commun organisé en une pince moléculaire. Enfin, parmi les 14 TAFs qui constituent TFIID, 9 comportent un motifs de repliement de type histone, (HFD, Histone Fold Domain), permettant leurs hétérodimérisations en 5 paires dans des systèmes de coexpression et d'interaction deux-à-deux. Nous avons immunolocalisé ces 9 TAFs sur TFIID de levure et montré que les partenaires contenant des HFD colocalisaient, cependant la distribution de chacun de ces TAFs dans deux lobes différents suggère une architecture inattendue du complexe TFIID. Laire
TFIID is a big complex, which plays a key role in regulation of transcription of class II genes. Its binding to the ADN promoter allows the recruitment and the assembly of the whole preinitiation complex. TFIID is composed of TBP (TATA Binding Protein) associated to 14 TAFs (TBP-Associated Factors). We obtained 3D structures of human and yeast TFIID using electron microscopy and single molecule image analysis. The human and yeast complexes appeared very similar in size and in shape and were organised in three domains forming a molecular clamp with a size suitable to accommodate a double stranded DNA molecule. Surprisingly, the TFTC complex (TBP-Free TAF Containing Complex), which is able to initiate transcription in the same manner than TFIID and contain 8 TAFs, but which doesn't contain TBP, also organised in molecular clamp very similar to TFIID. Finally, we mapped the 9 Histone Fold Domain-containing TAFs (HFD-TAFs), reported to heterodimerize in 5 pairs in coexpressions experiments and in pair-wise interactions. The immunolocations show that HFD-partners colocalise but that each HFD-TAF was found in two different lobes of the yeast TFIID structure revealing an unexpected and novel molecular organisation of TFIID

Lmx1a et Lmx1b sont des facteurs de transcription connus pour leur rôle au cours du développement des neurones dopaminergiques du mésencéphale (mDA). Ils ont été montrés comme essentiels à chacune des étapes de différentiation des progéniteurs en neurones dopaminergiques matures. Des études récentes ont également mis en évidence l'importance de ces deux facteurs de transcription dans les neurones dopaminergiques chez l'adulte. Lmx1a/b sont impliqués dans la régulation de gènes mitochondriaux ainsi que dans l'autophagie. Cependant, jusqu'à présent, rien n'est connu sur le rôle de Lmx1a/b dans les neurones dopaminergiques post-mitotiques. Le but de cette thèse est d'élucider le rôle de Lmx1a/b dans les neurones dopaminergiques matures. L'analyse des projections axonales dopaminergiques de souris doubles conditionnelles mutantes (cKO) pour Lmx1a/b a mis en évidence un défaut de guidage axonal confirmant le rôle essentiel de ces deux facteurs de transcription dans la formation des circuits dopaminergiques. Afin d’identifier précisément les molécules impliquées dans la régulation du système dopaminergique des techniques adaptées doivent être développées pour déterminer les principaux acteurs régulés par Lmx1a/b. À cette fin, nous avons mis au point une technique de marquage immunohistochimique rapide de la tyrosine hydroxylase (TH, enzyme nécessaire à la synthèse de la dopamine) sur des sections de mésencéphale de souris afin de délimiter la région d’intérêt. Par la suite, nous utilisons une technique de microdissection au laser afin de spécifiquement récolter les cellules dopaminergiques du mésencéphale pour réaliser un profil d'expression génique. Un premier article de méthodologie a été publié concernant cette technique. Cette procédure menée sur des souris cKO pour Lmx1a et Lmx1b et leurs contrôles associés a permis de mettre en évidence des gènes régulés par Lmx1a et Lmx1b tels que Plxnc1. Plxnc1 est une protéine de guidage axonal ayant pour ligand la sémaphorine 7a (Sema7a). Afin d'observer si la régulation de Plxnc1 par Lmx1a/b est à l'origine du défaut de guidage axonal observé chez les souris cKO pour Lmx1a/b, nous avons réalisé une analyse in vitro de l’effet de la Sema7a sur les axones d'explants mDA. Notre étude a montré un effet chimiorépulsif de la Sema7a pour les axones des neurones mDA exprimant Plxnc1. De plus, l’étude de souris Sema7a KO montre une augmentation de l’innervation DA dans la partie dorsale du striatum, partie exprimant Sema7a chez des souris contrôles. Ce phénotype met en évidence une chimiorépulsion induite par l’interaction Sema7a/Plxnc1. L’étude de souris surexprimant Plxnc1 a, quant à elle, montré une perte d’innervation DA dans la partie dorsale du striatum. En effet, la majorité des cellules du mésencéphale se mettent à exprimer Plxnc1, les rendant ainsi sensibles à la chimiorépulsion induite par Sema7a. L’ensemble de ces résultats met en évidence l’importance de la régulation de la protéine de guidage axonal Plxnc1 par Lmx1a/b pour l'innervation des cibles du mésencéphale. La répression de Plxnc1 dans les neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta (SNpc) semble nécessaire à l’innervation du striatum dorsal riche en Sema7a. Cette étude est la première à identifier les bases moléculaires du guidage axonal expliquant la ségrégation des voies mDA nigrostriée et mésolimbique, et devrait contribuer à améliorer l'efficacité des thérapies cellulaires pour la maladie de Parkinson. Un second article sera soumis prochainement sur le rôle des facteurs de transcription Lmx1a/b dans les neurones dopaminergiques post-mitotiques du mésencéphale. La principale caractéristique histopathologique de la maladie de Parkinson est la dégénérescence des neurones mDA de la SNpc. La thérapie de remplacement cellulaire utilisant des neurones dopaminergiques nouvellement générés à partir de cellules souches représente une thérapie prometteuse. Cependant, la mauvaise innervation des neurones nouvellement greffés limite le succès des études de transplantation. L’identification de facteurs régulant la connectivité des neurones mDA devient primordiale pour élucider les mécanismes impliqués dans la mise en place du système dopaminergique. C'est pourquoi, dans une derniere partie, afin d'illustrer cette possibilité d'amélioration d'une thérapie de remplacement cellulaire, j’ai réalisé l’implantation de cellules souches différenciées en neurones dopaminergiques dans un modèle de souris lésées à la 6-hydroxydopamine (6OHDA). Les cellules nouvellement réimplantées sont de type SNpc, en raison de l'infection par un vecteur viral induisant l'inhibition de l'expression de Plxnc1.
Lmx1a et Lmx1b sont des facteurs de transcription connus pour leur rôle au cours du développement des neurones dopaminergiques du mésencéphale (mDA). Ils ont été montrés comme essentiels à chacune des étapes de différentiation des progéniteurs en neurones dopaminergiques matures. Des études récentes ont également mis en évidence l'importance de ces deux facteurs de transcription dans les neurones dopaminergiques chez l'adulte. Lmx1a/b sont impliqués dans la régulation de gènes mitochondriaux ainsi que dans l'autophagie. Cependant, jusqu'à présent, rien n'est connu sur le rôle de Lmx1a/b dans les neurones dopaminergiques post-mitotiques. Le but de cette thèse est d'élucider le rôle de Lmx1a/b dans les neurones dopaminergiques matures. L'analyse des projections axonales dopaminergiques de souris doubles conditionnelles mutantes (cKO) pour Lmx1a/b a mis en évidence un défaut de guidage axonal confirmant le rôle essentiel de ces deux facteurs de transcription dans la formation des circuits dopaminergiques. Afin d’identifier précisément les molécules impliquées dans la régulation du système dopaminergique des techniques adaptées doivent être développées pour déterminer les principaux acteurs régulés par Lmx1a/b. À cette fin, nous avons mis au point une technique de marquage immunohistochimique rapide de la tyrosine hydroxylase (TH, enzyme nécessaire à la synthèse de la dopamine) sur des sections de mésencéphale de souris afin de délimiter la région d’intérêt. Par la suite, nous utilisons une technique de microdissection au laser afin de spécifiquement récolter les cellules dopaminergiques du mésencéphale pour réaliser un profil d'expression génique. Un premier article de méthodologie a été publié concernant cette technique. Cette procédure menée sur des souris cKO pour Lmx1a et Lmx1b et leurs contrôles associés a permis de mettre en évidence des gènes régulés par Lmx1a et Lmx1b tels que Plxnc1. Plxnc1 est une protéine de guidage axonal ayant pour ligand la sémaphorine 7a (Sema7a). Afin d'observer si la régulation de Plxnc1 par Lmx1a/b est à l'origine du défaut de guidage axonal observé chez les souris cKO pour Lmx1a/b, nous avons réalisé une analyse in vitro de l’effet de la Sema7a sur les axones d'explants mDA. Notre étude a montré un effet chimiorépulsif de la Sema7a pour les axones des neurones mDA exprimant Plxnc1. De plus, l’étude de souris Sema7a KO montre une augmentation de l’innervation DA dans la partie dorsale du striatum, partie exprimant Sema7a chez des souris contrôles. Ce phénotype met en évidence une chimiorépulsion induite par l’interaction Sema7a/Plxnc1. L’étude de souris surexprimant Plxnc1 a, quant à elle, montré une perte d’innervation DA dans la partie dorsale du striatum. En effet, la majorité des cellules du mésencéphale se mettent à exprimer Plxnc1, les rendant ainsi sensibles à la chimiorépulsion induite par Sema7a. L’ensemble de ces résultats met en évidence l’importance de la régulation de la protéine de guidage axonal Plxnc1 par Lmx1a/b pour l'innervation des cibles du mésencéphale. La répression de Plxnc1 dans les neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta (SNpc) semble nécessaire à l’innervation du striatum dorsal riche en Sema7a. Cette étude est la première à identifier les bases moléculaires du guidage axonal expliquant la ségrégation des voies mDA nigrostriée et mésolimbique, et devrait contribuer à améliorer l'efficacité des thérapies cellulaires pour la maladie de Parkinson. Un second article sera soumis prochainement sur le rôle des facteurs de transcription Lmx1a/b dans les neurones dopaminergiques post-mitotiques du mésencéphale. La principale caractéristique histopathologique de la maladie de Parkinson est la dégénérescence des neurones mDA de la SNpc. La thérapie de remplacement cellulaire utilisant des neurones dopaminergiques nouvellement générés à partir de cellules souches représente une thérapie prometteuse. Cependant, la mauvaise innervation des neurones nouvellement greffés limite le succès des études de transplantation. L’identification de facteurs régulant la connectivité des neurones mDA devient primordiale pour élucider les mécanismes impliqués dans la mise en place du système dopaminergique. C'est pourquoi, dans une derniere partie, afin d'illustrer cette possibilité d'amélioration d'une thérapie de remplacement cellulaire, j’ai réalisé l’implantation de cellules souches différenciées en neurones dopaminergiques dans un modèle de souris lésées à la 6-hydroxydopamine (6OHDA). Les cellules nouvellement réimplantées sont de type SNpc, en raison de l'infection par un vecteur viral induisant l'inhibition de l'expression de Plxnc1.
Lmx1a and Lmx1b are transcription factors known for their role in the development of midbrain dopamine neurons (mDA). They were shown as essential for each stage of differentiation from progenitors to mature dopaminergic neurons. Recent studies have also highlighted the importance of these two transcription factors in dopaminergic neurons in adult mice. Lmx1a/b are involved in the regulation of mitochondrial genes and in autophagy. Although some evidence suggest that they could be involved in the formation of mDa circuit formation, their role in post-mitotic mDA neurons remains unknown. The aim of this thesis is to elucidate the role of Lmx1a/b in post-mitotic dopaminergic neurons. Analysis of dopaminergic axonal projections of double conditional mutant (cKO) mice for Lmx1a/b showed an axon guidance defect confirming the essential role of these transcription factors in the formation of dopaminergic circuits. In order to precisely identify the molecules involved in the regulation of the dopamine system, suitable techniques must be developed to identify the main genes that are regulated by Lmx1a/b. To this end we developed a new technique allowing gene profiling of brain sub-population. By combining rapid immunolabeling of mDA neurons with laser capture microdissection we manage to extract RNA from two sub-regions of mDA neurons such as ventral tegmental area (VTA) and substantia nigra pars compacta (SNpc). The advantage of this technique is to compare quickly the regulation of genes expression by studying controls and mutant mice. A first methodological article has been published regarding this procedure. We then applied this technique on cKO mice for Lmx1a/b and their associated controls to identify genes regulated by Lmx1a and Lmx1b. Among these genes, we identified Plxnc1, an axon guidance receptor for the semaphorin 7a (Sema7a). In order to verify whether the regulation of Plxnc1 by Lmx1a/b is at the origin of the axon guidance defect observed in double conditional mutant for Lmx1a/b, we have made an in vitro analysis of the effect of Sema7a on mDA explants. Our study showed a chemorepulsive effect of Sema7a on Plxnc1 positives axons. In addition, the study of knockout mice for Sema7a shows an increase of DA innervation in the dorsal part of the striatum which is the region expressing Sema7a in control mice. This phenotype reveals a chemorepulsion induced by Sema7a/Plxnc1 interaction. The study of mice overexpressing Plxnc1 shows a loss of DA innervation in the dorsal striatum. Indeed, by overexpressing Plxnc1, the majority of midbrain cells begin to express this axon guidance protein instead of only mDA neurons from the VTA. Thus, all mDA neurons including neurons from the SNpc express Plxnc1 making them sensitive to Sema7a. This interaction Sema7a/Plxnc1 leads to a chemorepulsion of axons guided away from the dorsal striatum. Overall these results highlight the importance of the regulation of the axon guidance protein Plxnc1 by Lmx1a/b for the innervation of midbrain targets. The repression of Plxnc1 expression in dopaminergic neurons of the SNpc appears necessary for the innervation of dopaminergic axons in the dorsal striatum, rich in Sema7a. This study is the first to identify the molecular basis of the development of the dopaminergic system explaining the segregation of the nigrostriatal and mesolimbic pathways. These results should help to improve the effectiveness of cell therapies for Parkinson's disease. A second article will be submitted soon about the role of Lmx1a/b transciption factors in post-mitotic midbrain dopaminergic neurons. The main histopathological feature of Parkinson's disease (PD) is the degeneration of SNpc neurons. The cell replacement therapy using newly generated dopaminergic neurons from stem cells represents a promising therapy. However, a poor innervation of the newly grafted neurons limits the success of transplantation studies. The identification of factors regulating neuronal connectivity of mDA neurons becomes essential to elucidate the mechanisms involved in the establishment of the dopaminergic system. Therefore, in a final section of this thesis, I report preliminary study about cell replacement therapy in PD mouse model. I differentiated DA neurons from stem cells, knock-down Plxnc1 expression and performed grafting in 6-hydroxydopamine (6OHDA) mouse model to illustrate the possibility of improving a cell replacement therapy.
Lmx1a and Lmx1b are transcription factors known for their role in the development of midbrain dopamine neurons (mDA). They were shown as essential for each stage of differentiation from progenitors to mature dopaminergic neurons. Recent studies have also highlighted the importance of these two transcription factors in dopaminergic neurons in adult mice. Lmx1a/b are involved in the regulation of mitochondrial genes and in autophagy. Although some evidence suggest that they could be involved in the formation of mDa circuit formation, their role in post-mitotic mDA neurons remains unknown. The aim of this thesis is to elucidate the role of Lmx1a/b in post-mitotic dopaminergic neurons. Analysis of dopaminergic axonal projections of double conditional mutant (cKO) mice for Lmx1a/b showed an axon guidance defect confirming the essential role of these transcription factors in the formation of dopaminergic circuits. In order to precisely identify the molecules involved in the regulation of the dopamine system, suitable techniques must be developed to identify the main genes that are regulated by Lmx1a/b. To this end we developed a new technique allowing gene profiling of brain sub-population. By combining rapid immunolabeling of mDA neurons with laser capture microdissection we manage to extract RNA from two sub-regions of mDA neurons such as ventral tegmental area (VTA) and substantia nigra pars compacta (SNpc). The advantage of this technique is to compare quickly the regulation of genes expression by studying controls and mutant mice. A first methodological article has been published regarding this procedure. We then applied this technique on cKO mice for Lmx1a/b and their associated controls to identify genes regulated by Lmx1a and Lmx1b. Among these genes, we identified Plxnc1, an axon guidance receptor for the semaphorin 7a (Sema7a). In order to verify whether the regulation of Plxnc1 by Lmx1a/b is at the origin of the axon guidance defect observed in double conditional mutant for Lmx1a/b, we have made an in vitro analysis of the effect of Sema7a on mDA explants. Our study showed a chemorepulsive effect of Sema7a on Plxnc1 positives axons. In addition, the study of knockout mice for Sema7a shows an increase of DA innervation in the dorsal part of the striatum which is the region expressing Sema7a in control mice. This phenotype reveals a chemorepulsion induced by Sema7a/Plxnc1 interaction. The study of mice overexpressing Plxnc1 shows a loss of DA innervation in the dorsal striatum. Indeed, by overexpressing Plxnc1, the majority of midbrain cells begin to express this axon guidance protein instead of only mDA neurons from the VTA. Thus, all mDA neurons including neurons from the SNpc express Plxnc1 making them sensitive to Sema7a. This interaction Sema7a/Plxnc1 leads to a chemorepulsion of axons guided away from the dorsal striatum. Overall these results highlight the importance of the regulation of the axon guidance protein Plxnc1 by Lmx1a/b for the innervation of midbrain targets. The repression of Plxnc1 expression in dopaminergic neurons of the SNpc appears necessary for the innervation of dopaminergic axons in the dorsal striatum, rich in Sema7a. This study is the first to identify the molecular basis of the development of the dopaminergic system explaining the segregation of the nigrostriatal and mesolimbic pathways. These results should help to improve the effectiveness of cell therapies for Parkinson's disease. A second article will be submitted soon about the role of Lmx1a/b transciption factors in post-mitotic midbrain dopaminergic neurons. The main histopathological feature of Parkinson's disease (PD) is the degeneration of SNpc neurons. The cell replacement therapy using newly generated dopaminergic neurons from stem cells represents a promising therapy. However, a poor innervation of the newly grafted neurons limits the success of transplantation studies. The identification of factors regulating neuronal connectivity of mDA neurons becomes essential to elucidate the mechanisms involved in the establishment of the dopaminergic system. Therefore, in a final section of this thesis, I report preliminary study about cell replacement therapy in PD mouse model. I differentiated DA neurons from stem cells, knock-down Plxnc1 expression and performed grafting in 6-hydroxydopamine (6OHDA) mouse model to illustrate the possibility of improving a cell replacement therapy.

Leptosphaeria maculans ‘brassicae’ (Lmb) est un ascomycète de la classe des Dothideomycètes faisant partie d’un complexe d’espèces présentant différents niveaux d’adaptation au colza. Lmb est responsable d’une des maladies les plus dommageables sur colza : la nécrose du collet. Lmb présente un cycle de vie complexe au cours duquel il alterne différents modes de vie, traduisant l’existence de mécanismes de régulation fine de l’expression des gènes lui permettant de s’adapter rapidement à de nouvelles conditions. Le séquençage de son génome a révélé une structure originale, avec l’alternance de deux types de régions : les isochores GC et les isochores AT. Alors que les isochores GC sont riches en gènes, les isochores AT sont pauvres en gènes et présentent des caractéristiques de l’hétérochromatine (régions génomiques riches en éléments transposables et présentant un faible taux de recombinaison). Bien que pauvres en gènes, les isochores AT représentent une « niche écologique » pour les gènes codant des effecteurs puisque 20 % des gènes des isochores AT codent des effecteurs putatifs contre seulement 4 % des gènes localisés en isochores GC. Les gènes codant des effecteurs situés en isochores AT présentent un comportement transcriptionnel différent de ceux localisés en isochores GC : une faible expression pendant la croissance mycélienne et une forte induction d’expression pendant l’infection primaire du colza. Sur la base de ces observations, l’objectif de ma thèse était de caractériser le déterminisme de la co-expression des effecteurs situés dans les isochores AT et en particulier d’évaluer si la régulation de l’expression de ces gènes se fait par un contrôle épigénétique lié à leur localisation particulière et/ou par l’intervention de régulateurs communs. Afin de déterminer le rôle de la structure des isochores AT, l’analyse fonctionnelle de protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine (i.e. HP1, DIM-5 et DMM-1) a été réalisée et leur implication dans la régulation de l’ensemble des gènes prédits dans le génome de L. maculans a été évaluée. Cette étude a permis de démontrer l’implication de la structure hétérochromatinienne des isochores AT dans la répression de l’expression pendant la croissance mycélienne des gènes situés dans cet environnement génomique, en particulier les gènes codant des effecteurs. Parmi les gènes sous contrôle épigénétique, nous avons pu observer qu’en plus des gènes localisés en isochores AT, des zones en isochores GC étaient aussi affectées et pouvaient constituer des « hot-spots » de contrôle épigénétique. Afin d’identifier des régulateurs candidats pouvant être impliqués dans le contrôle de l’expression des effecteurs pendant l’infection, le répertoire des gènes codant des facteurs de transcription (FTs) chez Lmb a été établi et l’analyse de la conservation de ce répertoire parmi les autres espèces du complexe d’espèces Leptosphaeria a permis d’identifier les FTs spécifiques, ou spécifiquement sur-exprimés pendant l’infection du colza, chez Lmb. Des candidats ont été sélectionnés pour réaliser leur analyse fonctionnelle : des gènes codant des FTs sur-exprimés pendant l’infection (9 FTs) ainsi que les orthologues de FTs qui avaient été décrits chez d’autres espèces comme régulateurs majeurs de la pathogénie (StuA, Sge1 et Fox1). L’analyse fonctionnelle de FTs candidats a permis d’établir que StuA, comme chez d’autres champignons phytopathogènes, joue un rôle important dans la mise en place de l’infection et l’expression des effecteurs chez L. maculans. Le « silencing » d’un FT de type AT-Hook, famille de FTs se fixant préférentiellement au niveau de séquences riches en AT, a un fort effet sur la pathogénie du champignon et entraîne une diminution d’expression de 2 effecteurs. Cette thèse a permis d’apporter de nouveaux éléments concernant la régulation des gènes codant des effecteurs chez un champignon phytopathogène impliquant, pour la première fois, un mécanisme épigénétique
Leptosphaeria maculans is an ascomycete belonging to the Dothideomycete class and is part of a species complex showing different level of adaptation toward oilseed rape. Within this species complex, Lmb is responsible for the most damaging disease of this crop: “stem canker”. Lmb presents a complex life cycle during which it alternates between different life styles and nutritional strategies underlying the involvement of precise regulatory networks for gene expression to rapidly adapt to new conditions. The sequencing of the Lmb genome has revealed an unusual structure, alternating two types of regions, GC- and AT-isochores. While GC-isochores are gene-rich, AT-isochores are gene-poor and have several characteristics of heterochromatin (they are rich in transposable elements and present a lower rate of recombination compared to GC-isochores). Although gene-poor, AT-isochores are “ecological niches” for effector genes as 20% of the genes in these regions encode for putative effectors against only 4% of the genes in GC-isochores. Effector-encoding genes located in AT-isochores present a different transcriptional behavior compared to those located in GC-isochores: a very low expression in axenic culture and a drastic increase in expression during primary leaf infection. On these bases, the aim of my thesis was to characterize the determinism of the concerted effector gene expression. Are AT-isochores targets of reversible epigenetic modifications that affect the regulation of effector genes? and/or are one or several common regulators involved in the control of the concerted expression of effector genes? To assess the role of the structure of AT-isochores, functional analysis of three key players involved in chromatin remodeling (i.e. HP1, DIM-5 and DMM-1) was performed and their role in global gene expression was assessed. This study validated that heterochromatic structure of AT-isochores represses expression of genes located in such a genomic environment, notably effector genes. Among genes under an epigenetic control, we also identified genes located in GC-isochores that were similarly influenced and may represent “hot spots” for epigenetic control. To identify putative regulators of effector gene expression, we established the complete repertoire of transcription factors (TFs) of Lmb and by analyzing the conservation of this repertoire among species of the Leptosphaeria species complex, we identified TFs specific of Lmb, or specifically induced during infection. Functional analysis of 12 TFs was set up: nine TF-encoding genes induced during infection and three orthologs of TFs described as required for pathogenesis in other phytopathogenic fungi (StuA, Sge1, Fox1). This functional analysis showed that StuA, as in other phytopathogenic fungi, plays a major role in infection and expression of effector genes in Lmb. The silencing of an AT-Hook type TF, family of TFs that specifically interact with AT-rich sequences, was associated with a reduction of the expression of two effector genes during infection and with pathogenicity defects. This study brought new insights into the regulation of effector genes in a phytopathogenic fungus involving, for the first time, an epigenetic mechanism

Afin d'étudier la structure et la fonction du complexe PTF au sein du système basal de transcription par l'ARN polymérase III humaine mais aussi afin d'élargir les connaissances à l'extérieur de ce système et mettre en évidence des régulateurs de la transcription par l'ARN polymérase III, j'ai entrepris par double-hybride l'étude des partenaires d'interactions des sous-unités de ce complexe. J'ai montré in vitro une interaction enttre les sous-unités PTFα et PTF β ainsi qu'entre les protéines PTFα et Brf2. J'ai mis en avant un régulateur potentiel de la transcription par l'ARN polymérase III. Un modèle de régulation faisant intervenir cette protéine posé au laboratoire semble se confirmer. Les résultats obtenus sont très encourageants et importants étant donné que nous savons que lors de la transformation cellulaire la transcription par l'ARN polymérase III est dérégulée. Cependant des expériences compléùentaires sont nécessaires à la confirmation de ce modèle
In order to study the structure and the function of the complex PTF within the human RNA polymerase III transcription basal system but also in order to widen knowledge outside this system and to highlight regulators of the RNA polymerase III transcription, I undertook by double-hybrid the study of the interaction partners of the complex sub-units. I showed in vitro an interaction between sub-units PTFα and PTFβ and between proteins PTFα and Brf2. I proposed a potential regulator of the RNA polmerase III transcription. A model of regulation utilizing this protein posed at the laboratory seems to be confirmed. The results obtained are very encouraging and important since we know that during cellular transformation the RNA polymerase III transcription is down-regulated. However complementary experiments are necessary to confirm this model

La phosphorylation de la grande sous-unité de l'ARN polymérase II (Rpb1) est importante dans la régulation de la transcription. Nous avons étudié sa phosphorylation chez plusieurs espèces après un choc thermique. L'anticorps CC-3 reconnaît Rpb1 en situation normale, sa réactivité étant diminuée lors d'un stress. L'anticorps MPM-2 montre une réactivité accrue envers Rpb1 après le choc thermique. Ainsi, les anticorps CC-3 et MPM-2 peuvent distinguer des populations de Rpb1 potentiellement distinctes. CC-3 reconnaît aussi une protéine de 180 kDa qui serait hSpt5, un facteur de régulation de la transcription. Rpb1 et hSpt5 sont déphosphorylés quand les cellules sont exposées à des inhibiteurs de la kinase Cdk9, suggérant que celle-ci est la kinase majeure in vivo. Nous démontrons aussi que la peptidyl-prolyl isomérase Pin1 interagit avec hSpt5 phosphorylée. La phosphorylation de Rpb1 et de hSpt5, suivie d'une liaison par Pin1, pourrait contribuer à la régulation de la transcription
The phosphorylation of the largest subunit of RNA polymerase II (Rpb1) is important for the regulation of transcription. We have studied its phosphorylation state in different species after heat shock. MAb CC-3 recognizes Rpb1 in normal condition, its reactivity being reduced following heat shock. The antibody MPM-2 shows an increased reactivity towards Rpb1 after heat shock. Therefore, mAbs CC-3 and MPM-2 are able to discriminate between subsets of Rpb1 which could be functionaly distinct. CC-3 also recognizes a 180-kDa protein which is probably hSpt5, a transcription regulation factor. Rpb1 and hSpt5 are dephosphorylated when cells are exposed to Cdk9 kinase inhibitors, suggesting that it is the major kinase phosphorylating Rpb1 and hSpt5 in vivo. We also demonstrate that the peptidyl-prolyl isomerase Pin1 interacts with phosphorylated hSpt5. The phosphorylation of Rpb1 and hSpt5 followed by Pin1 interaction might thus contribute to the regulation of transcription