Literatura científica selecionada sobre o tema "Enzymes épigénétiques"

IntroductionLe trouble dépressif majeur (TDM) est associé à des altérations de l’expression génique au niveau cérébral et en périphérie, dans les leucocytes sanguins. Chez les dépressifs, les études de neuroimagerie ont mis en évidence des anomalies structurales et fonctionnelles affectant deux régions clés du réseau frontocingulaire : le cortex préfrontal dorso-latéral (DLPFC) et le cortex cingulaire (CC). Actuellement, les mécanismes moléculaires permettant de faire le lien entre ces différents niveaux étiopathogéniques restent inconnus. Les mécanismes épigénétiques, situés à l’interface entre le génome et la réponse cellulaire, constituent des candidats potentiels.ObjectifExplorer le rôle de l’épigenèse dans le cadre du TDM en phase d’état.Matériel et méthodesNous avons mesuré l’expression de différents gènes impliqués dans les mécanismes épigénétiques dans les leucocytes du sang périphérique, le DLPFC et le CC, chez des patients dépressifs et des sujets contrôles appariés. Les niveaux des différents transcrits ont été mesurés par PCR quantitative en temps réel.RésultatsChez les patients dépressifs, nous avons mis en évidence une surexpression des gènes codant pour des enzymes intervenant dans la mise en place de marques chromatiniennes réprimant la transcription : HDACs 4-5-6-8 et DNMT3B dans le DLPFC, HDAC2 dans le CC et les leucocytes sanguins.ConclusionNos résultats retrouvent une activation des mécanismes épigénétiques réprimant l’expression génique dans le DLPFC et le CC chez les patients dépressifs. Il s’agit de la première fois qu’une telle dérégulation est décrite dans ces deux régions. Ces modifications pourraient participer aux dysfonctionnements affectant le DLPFC et le CC et participer à la physiopathologie du TDM. De plus, nous retrouvons une surexpression de HDAC2 dans les leucocytes sanguins des patients dépressifs, ce qui renforce son statut de potentiel biomarqueur périphérique.

La succinate déshydrogénase (SDH) est une enzyme mitochondriale qui participe au cycle de Krebs et à la chaîne respiratoire. Quand elles sont à l’origine de cancers, les mutations des gènes codant les différentes sous-unités de la SDH sont responsables d’une prédisposition aux phéochromocytomes et aux paragangliomes, et, plus rarement, aux tumeurs stromales gastro-intestinales ou au cancer du rein. Une diminution de l’activité de la SDH, non expliquée par la génétique, s’observe aussi dans certains cancers plus fréquents. Une des conséquences de l’inactivation de la SDH est la production excessive de son substrat, le succinate, qui joue un rôle d’oncométabolite en promouvant un statut pseudohypoxique et d’importants remaniements épigénétiques. La compréhension de l’oncogenèse liée à la succinate déshydrogénase permet aujourd’hui de développer des méthodes diagnostiques innovantes et d’envisager des thérapies ciblées pour la prise en charge des patients atteints.

Le métabolisme des monocarbones relie le métabolisme cellulaire à la machinerie épigénétique à travers une molécule commune, la S-adénosylméthionine (SAM). Les changements dans le potentiel de méthylation cellulaire (ratio SAM/SAH) sont impliqués dans plusieurs maladies, notamment l'hépatocarcinome et les défauts de fermeture du tube neural (NTD). La perturbation du ratio SAM/SAH peut être liée à des déficits enzymatiques ou à une exposition à un facteur environnemental. La reméthylation de l'homocystéine (HCY) en méthionine est catalysée par la méthionine synthase (MTR) ou la bétaïne homocystéine méthyltransférase (BHMT) dans le foie. En comparant le tissu tumoral au tissu sain environnant dans le foie, les transcrits de BHMT étaient fortement diminués dans les échantillons mais pas les transcrits de MTR. La protéine BHMT n'a pas été détectée dans les cellules HepG2 et dans 5 des 6 échantillons tumoraux analysés. L'absence d'expression de BHMT était due à un variant génétique conduisant un codon stop prématuré. Une déficience pré-natale en donneurs de méthyle aggrave la susceptibilité face à certaines maladies. La fumonisine B1 (FB1) est une mycotoxine qui contamine les céréales et a été identifiée comme étant un facteur de risque de survenue de tumeur et des NTD. Nous avons étudié les récepteurs des folates et 4 marques de l'hétérochromatine dans le foie des foetus de rat issus de mères exposées à un régime déficient en donneurs de méthyle et/ou à la FB1 à une dose deux fois supérieure à la dose journalière admissible. Le régime carencé et la FB1 diminuent le ratio SAM/SAH. La FB1 inverse le mécanisme d'adaptation consistant en une régulation positive de l'expression des récepteurs des folates lors d'une carence seule. Le régime carencé diminue H4K20me3 mais une combinaison carence/FB1 diminue encore d'avantage H4K20me3 et augmente H3K9me3. Cette augmentation de H3K9me3 peut être vu comme un mécanisme de défense incitant la cellule à résister à la désorganisation de l'hétérochromatine. H3R2me2 et H4K16ac varient également selon ce mécanisme. Cette étude est pertinente car elle suggère que de faibles doses de FB1 interagissent avec la carence en donneurs de méthyle pour perturber le profil épigénétique
Folate-mediated 1-carbon metabolism is a conduit that links cellular metabolism to the epigenetic machinery through the common molecule, AdoMet. There is strong evidence that changes in the cellular methylation potential (AdoMet/AdoHcy ratio) is involved in several types of disease notably tumor proliferation like hepatocarcinoma and developmental disease like neural tube defects. Perturbation of AdoMet/AdoHcy ratio may be related to a cellular cause like enzyme defect or to exposure to an environmental factor. The remethylation of homocysteine to methionine is catalyzed either by methionine synthase (MTR) or by betaine-homocysteine methyltrnasferase (BHMT) in the liver. By comparing tumor tissue to surrounding healthy tissue in the liver we have found that BHMT transcripts, but not MTR, are strongly decreased in tumor samples. Consistently, BHMT protein was not detected in HepG2 cells and in 5/6 tumors investigated. Abolition of BHMT expression was due to a genetic variant producing a premature termination codon. Prenatal methyl deficient diet (MDD) enhances susceptibility to disease. Fumonisin FB1 is a corn contaminating mycotoxin identified as a risk factor for tumor occurrence and neural tube defects. We have investigated folate receptors and 4 heterochromatin markers in rat foetuses liver derived from dams exposed to MDD and/or FB1 administered at a dose twice higher than the Provisional Maximum Tolerable Daily Intake. We found that MDD and even FB1 by itself decrease the AdoMet/AdoHcy ratio. FB1 reverses the adaptation mechanism consisting in upregulating folate receptors in case of folate depletion. MDD decreased H4K20me3 but combined MDD/FB1 decreased H4K20me3 even more and increased H3K9me3. The elevated H3K9me3 can be viewed as a defence mechanism inciting the cell to resist heterochromatin disorganisation. H3R2me2 and H4K16Ac varied according to this mechanism. This study is relevant because it suggests that low doses of FB1 interact with methyl depletion to disrupt the epigenetic landscape

Mon travail de thèse porte sur l’étude du rôle de l’histone acétyl-transférase MOZ et de l’histone méthyle-transférase MLL dans l’hématopoïèse. Elles contrôlent l’expression de nombreux gènes, nottament des gènes HOX, des facteurs de transcription connus pour leur rôle dans l’hématopoïèse normale et pathologique. Les deux protéines ont des gènes cibles communs tel qu'HOXA9. Ces observations nous ont conduit à rechercher une coopération fonctionnelle entre MOZ et MLL. Nous avons montré que MOZ était associée avec MLL dans les cellules souches/progénitrices humaines CD34+ afin d’activer la transcription des gènes HOXA5, HOXA7 et HOXA9. En effet, les deux protéines interagissent et sont recrutées au niveau de leur promoteur. Nous avons mis en évidence une interférence fonctionnelle entre ces deux facteurs épigénétiques, puisque MOZ est nécessaire au recrutement et à l’activité enzymatique de MLL au niveau des gènes HOXA5, HOXA7 et HOXA9 et réciproquement.Afin de caractériser le mécanisme d’action impliquant la coopération entre MOZ et MLL, nous avons recherché d’autres partenaires associés à ce duo. Nous avons identifié la Symplekin, un membre de la machinerie de polyadénylation. Nous avons mis en évidence l’interaction de la Symplekin avec MOZ et MLL dans les cellules de la lignée hématopoïétique humaine KG1. Les trois protéines sont co-recrutées sur le promoteur du gène HOXA9. Nous avons démontré le rôle ambivalent de la Symplekin. Bien qu’elle soit importante pour la polyadénylation et par conséquent pour la stabilité de l’ARN Hoxa9, la Symplekin empêche le recrutement de MOZ et de MLL au niveau du gène HOXA9, conduisant ainsi à une diminution de sa transcription
My thesis project has consisted of the study of MOZ, and MLL. They are epigenetic regulators. MOZ and MLL activate transcription of HOX genes, which are transcription factors essential during haematopoiesis. MOZ and MLL have some target genes in common. In our study, we characterised a cooperation between MOZ and MLL in human haematopoietic stem/progenitor cells CD34+. They are both recruited onto HOX promoters. MOZ is essential for MLL recruitment, and this is reciprocal. In conclusion, we provided an example of a mechanism involving a direct cross-talk between two histone modifying enzymes.In order to dissect the mechanism of action of this complex, we decided to identify novel proteins interacting with both MOZ and MLL. A member of the RNA polyadenylation machinery has been isolated: Symplekin. We confirmed the interaction between MOZ, MLL and Symplekin in the human haematopoietic immature cell line KG1. We showed that Symplekin is co-recruited to HOXA9 promoter along with MOZ and MLL. We demonstrated the dual role of this member of the polyadenylation machinery. Indeed, besides the fact that Symplekin is important for Hoxa9 polyadenylation, thus its stability, it prevents MOZ and MLL recruitment onto HOXA9 promoter, leading to a decrease of HOXA9 transcription.Our work improved the understanding of the mechanism of action of MOZ and MLL in HOX control

La résistance aux thérapies anti-cancéreuses demeure un enjeu majeur, en particulier dans le cancer du sein triple négatif (TNBC), dont le traitement repose principalement sur la chimiothérapie. L'acquisition de la résistance est un processus en plusieurs étapes qui commence par la survie d'une sous-population rare de cellules cancéreuses. Ces cellules, appelées cellules persistantes, constituent un réservoir à partir duquel les cellules résistantes finiront par émerger. L'état de persistance est transitoire et réversible, ouvrant des perspectives d'intervention thérapeutique. Cependant, comprendre les mécanismes récurrents qui conduisent à l'émergence des cellules persistantes au cours du traitement reste un défi, notamment en raison de leur accessibilité limitée chez les patientes. L'objectif de cette thèse était d'améliorer notre compréhension de la persistance et de proposer de nouvelles cibles pharmacologiques afin d'améliorer la réponse aux chimiothérapies dans les cancers TNBC. Dans cette perspective, nous avons étudié les caractéristiques épigénétiques, telles que le remodelage des paysages chromatiniens, et transcriptomiques des cellules persistantes en utilisant de nombreux modèles de TNBC in vitro et in vivo. Ces modèles reproduisent l'émergence de cellules persistantes lors d'un traitement avec un panel de chimiothérapies. Ils permettent de décortiquer l'évolution phénotypique des cellules tout au long du traitement et d'identifier au niveau transcriptomique et épigénomique les régulateurs moléculaires conduisant la transition d'un état chimio-naïf à un état chimio-persistant. Nous avons ainsi précédemment montré un rôle clé de la marque d'histone répressive H3K27me3 agissant comme une barrière qui, une fois levée au niveau de gènes spécifiques après traitement, permet aux cellules cancéreuses de tolérer le stress thérapeutique. À travers ce travail, nous avons affiné la définition des cellules persistantes dans le TNBC en identifiant les points communs entre les programmes de persistance de plusieurs patientes en réponse à des traitements de chimiothérapie aux modes d'actions variés. L'état de persistance est partagé et caractérisé par l'activation de voies de signalisation telles que la réponse au stress et l'inflammation, représentant des cibles potentielles pour prévenir la persistance avant même la résistance. Nous avons également obtenu des clés de compréhension sur les mécanismes d'action des acteurs moléculaires conduisant à l'expression du programme de persistance. Grâce à des prédictions utilisant des réseaux de régulation des gènes, nous avons observé que certains facteurs de transcription, tels que les protéines de la famille AP-1, sont des régulateurs “maîtres” pouvant conduire à l'activation des gènes impliqués dans cet état de persistance aux chimiothérapies. Parmi les facteurs AP-1, nous avons montré que FOSL1 se lie aux enhancers et reprogramme le transcriptome des cellules cancéreuses pour leur permettre de persister sous chimiothérapie. En parallèle, en testant comment les enzymes épigénétiques contrôlent le programme de persistance, nous avons démontré que la méthyltransférase EZH2, responsable de la triméthylation de H3K27, est un régulateur maître du programme de persistance qui pourrait lui-même être régulé par d'autres partenaires. En résumé, les régulateurs maîtres que nous avons identifiés orchestrent au niveau génomique, épigénomique et transcriptomique l'activation de gènes spécifiques et sont nécessaires et/ou suffisants pour conduire à l'état de persistance. A travers ces découvertes, nous proposons des stratégies prometteuses afin de surmonter la persistance et améliorer la réponse aux traitements dans le TNBC : l'inhibition de régulateurs clés tels que le facteur de transcription FOSL1 et les déméthylases KDM6A/B responsables de la déméthylation de H3K27 ; ainsi que le ciblage des voies spécifiques du programme de persistance
Resistance to anti-cancer therapies remains a major challenge, particularly in triple-negative breast cancer (TNBC), which primarily relies on chemotherapy for treatment. The acquisition of resistance is a multi-step process that begins with the survival of a rare subpopulation of cancer cells. These cells, known as persister cells, form a reservoir from which resistant cells will emerge. The persister state being transient and reversible, it offers opportunities for therapeutic intervention. However, understanding the recurrent mechanisms leading to the emergence of persister cells during treatment remains a challenge, particularly due to their limited accessibility in patients. The goal of this thesis was to improve our understanding of persistence and propose new pharmacological targets to enhance chemotherapy responses in TNBC. To this end, we studied the epigenetic characteristics, such as chromatin landscape remodeling, and transcriptomic profiles of persister cells using numerous in vitro and in vivo TNBC models. These models reproduce the emergence of persister cells during treatment with a panel of chemotherapies. They allow us to dissect the phenotypic evolution of cells during cancer treatment and identify at the transcriptomic and epigenomic levels the molecular regulators driving the transition from a chemo-naive state to a chemo-persister state. This way, we have previously shown a key role for the repressive histone mark H3K27me3, acting as a barrier that, once removed at specific genes after treatment, enables cancer cells to tolerate therapeutic stress. Through this work, we refined the definition of persister cells in TNBC by identifying commonalities between the persister programs of several patients in response to chemotherapies with varying modes of action. The persister state is shared and characterized by the activation of signaling pathways such as stress response and inflammation, representing potential targets to prevent persistence before resistance even develops.We also gained insights into the mechanisms of action of the molecular players driving the expression of the persister program. Using predictions from gene regulatory networks, we observed that key transcription factors, such as the AP-1 family proteins, are master regulators capable of activating genes involved in chemotherapy persistence. Among the AP-1 factors, we showed that FOSL1 binds enhancers and reprograms the transcriptome of cancer cells to confer them the ability to persist under chemotherapy. In parallel, by testing how epigenetic enzymes control the persister program, we demonstrated that the methyltransferase EZH2, responsible for H3K27 trimethylation, is a master regulator of the persister program, which itself may be regulated by other partners. In summary, the master regulators that we have identified orchestrate the activation of specific genes at the genomic, epigenomic, and transcriptomic levels and are necessary and/or sufficient to drive the persister state. Through these discoveries, we propose promising strategies to overcome persistence and improve treatment responses in TNBC: inhibiting key regulators such as the transcription factor FOSL1 and the demethylases KDM6A/B responsible for H3K27 demethylation; as well as targeting specific pathways of the persistence program

Des facteurs génétiques et d’environnement sont impliqués dans l’étiopathogénie de la schizophrénie avec un modèle d’interaction. Le substratum biologique de cette interaction est inconnu mais pourrait être expliqué par un modèle épigénétique. Dans la première partie de ce travail, nous avons choisi d’examiner en détail, à travers une revue critique des données de la littérature, le facteur environnemental qu’est l’exposition prénatale au diethylstilbestrol, un oestrogène de synthèse considéré comme perturbateur endocrinien mais aussi perturbateur de la régulation épigénétique particulièrement la méthylation de l’ADN. Bien que les données épidémiologiques ne permettent pas d’incriminer ou d’exclure l’exposition prénatale au diethylstilbestrol comme facteur augmentant le risque des troubles psychiatriques, plusieurs arguments sont en faveur de cette hypothèse. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons testé l’hypothèse des polymorphismes génétiques des enzymes de la machinerie de régulation épigénétique comme facteur de vulnérabilité génétique pour la schizophrénie. Une étude d’association familiale (325 trios) a été réalisée intéressant 10 gènes codant pour les HDACs. Les marqueurs de type SNP (n = 551) ont été extraits par la méthode de tagSNP. Les analyses statistiques ont identifié 10 SNPs associés avec la schizophrénie avec un seuil de signification inférieur à 0. 01. Ils sont situés sur HDAC3, HDAC9, HDAC10 et HDAC11. Une interaction épistatique a été identifiée entre HDAC3, HDAC9 et HDAC10. Bien que cette étude est exploratoire et sans correction pour les tests multiples, nos résultats confortent des données en faveur de l’implication de ces gènes avec des troubles neurodéveloppementaux
Genetic factors and environment are involved in the etiopathogeny of schizophrenia with an interaction model. The biological substratum of this interaction is unknown but could be explained by an epigenetic model. In the first part of this work, we chose to examine in detail, through a critical review of the literature data, the environmental factor of prenatal exposure to diethylstilbestrol, a synthetic estrogen considered as endocrine disruptor which also perturbs epigenetic regulation particularly DNA methylation. Although epidemiological data do not incriminate or exclude prenatal exposure to diethylstilbestrol as a factor increasing the risk of psychiatric disorders, there are several arguments in favor of this hypothesis. In the second part of this work, we tested the hypothesis of genetic polymorphisms of enzymes of the machinery of epigenetic regulation as a genetic vulnerability factor for schizophrenia. A family-based association study (325 trios) was conducted involving 10 genes encoding HDACs. SNP markers (n = 551) were extracted by the method of tagSNP. Statistical analysis identified 10 SNPs associated with schizophrenia with a threshold significance less than 0. 01. They are located on HDAC3, HDAC9, HDAC10, and HDAC11. An epistatic interaction was identified between HDAC3, HDAC9 and HDAC10. Although this study is exploratory and without correction for multiple testing, our results support data for the involvement of these genes with neurodevelopmental disorders

Dotés d’une position stratégique à la surface des cellules et au sein des matrices extracellulaires, les PGs à héparane-sulfates (HS) jouent un rôle essentiel dans de multiples processus physiopathologiques en régulant l’activité de nombreux médiateurs solubles. Les voies de biosynthèse des glycosaminoglycanes (GAGs) nécessitent l’action coordonnée de glycosyltransférases (GTs) et sulfotransférases (STs). Bien que celles-ci soient en partie caractérisées, leurs mécanismes de régulation restent mal connus. Dans la première partie de notre travail, nous avons réalisé une étude structure-fonction de la ß1,4-galactosyltransférase 7 (ß4GalT7) qui catalyse une étape clé de l’initiation des chaînes de GAG. Nous avons identifié deux motifs D163VD165 et 221FWGWGREDDE230 strictement conservés au sein des ß4GalTs. Une approche in vitro combinée à la mesure du taux de biosynthèse des PGs par incorporation de 35S ex vivo, a permis d’évaluer l’impact des mutations conservative et non conservative sur les propriétés cinétiques et fonctionnelles de la ß4GalT7. Nous avons ainsi pu cerner les résidus clés impliqués dans la reconnaissance des substrats donneur (UDP-galactose)/Mn2+, accepteur et la catalyse enzymatique. Dans un second temps, afin d’explorer les mécanismes de régulation des voies de biosynthèse, nous avons examiné les régions situées en 5’ des gènes codant les GTs et STs et mis en évidence une méthylation aberrante touchant en particulier la famille des 3-OSTs, dans les cellules de chondrosarcome humain H-EMC-SS (HEMC). Cette hyperméthylation provoque une diminution d’expression de ces transcrits conduisant à une altération des chaînes de HS, restaurée par le traitement des cellules par un agent déméthylant, la 5-aza-2’déoxycytidine. Ce traitement ainsi que la surexpression des 3-OSTs par transfert de gène produit un ralentissement de la prolifération et motilité cellulaires et une augmentation de capacité d’adhésion des cellules. Ces résultats soulignent l’importance de l’altération des chaînes de HS cellulaires dans le caractère invasif des HEMC et suggèrent que la 3-O-sulfatation est un facteur contribuant à ce processus. Nous avons montré pour la première fois que les gènes codant les ST à HS sont régulés par un mécanisme épigénétique dans les cellules HEMC. Ces résultats ouvrent la voie à une meilleure compréhension des pathologies articulaires d’origine cancéreuse et permettent d’envisager des stratégies thérapeutiques ciblant la méthylation de l’ADN
Located at the cell-tissue-organ interface, heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) facilitate ligand-receptor interactions crucial to many physiopathological processes. The synthesis of glycosaminoglycans (GAGs) requires the coordinated action of an array of glycosyltransferases (GTs) and sulfotransferases (STs). Although the biosynthetic scheme of HSPGs has been outlined, little is known about the regulation of this complex process. In the first part of our work, we performed structure-function studies of the human ß1,4-galactosyltransferase 7 (ß4GalT7) which catalyses a key step of the initiation of GAG synthesis and identified two conserved domains D163VD165 and 221FWGWGREDDE230 in the ß4GalT family. In vitro studies combined to ex vivo analysis of PG synthesis by 35S incorporation allowed us to determine the impact of site-directed mutations on the catalytic and functional properties of ß4GalT7. We identified key residues for donor UDP-galactose/Mn2+ and acceptor substrate binding, and catalysis. Secondarily, to investigate more in depth the mechanisms involved in the regulation of PG biosynthetic pathway, we inspected the 5’ region of the genes coding for GT and ST enzymes and identified the presence of typical CpG islands with the most striking hypermethylation pattern for the 3-OST gene subfamily in the chondrosarcoma cell line H-EMC-SS (HEMC). Aberrant methylation was associated with downregulation of these genes and altered HS-GAG chains, as demonstrated both at biochemical and cellular levels. Treatment of cells with an inhibitor of DNA methyltransferases (5-aza-2’deoxycytidine) or reintroduction of 3-OST cDNA expression into HEMC cells resulted in a decrease in the proliferative and migration capacities of HEMC cells, and augmented adhesion ability of the cells. These findings underline the significance of HS alterations in the invasive phenotype of HEMC and identify 3-O-sulfation as a contributing factor to this process. We show for the first time that a specific set of HS-O-sulfotransferases is regulated via an epigenetic mechanism in HEMC cells, may be of particular relevance in understanding the process of cartilage tumor pathogenesis, towards the development of therapies targeting DNA methylation

Les protéines arginine méthyl transférases ("PRMTs") sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires essentiels. La protéine CARMI ("Coactivator-associated arginine methyltransferase 1", appelée aussi "PRMT4") a été initialement identifiée par sa fonction co-activatrice de la transcription impliquantplusieurs récepteurs nucléaires des hormones. CARMI est une enzyme qui catalyse la réaction de méthylation sur les histones via un donneur de méthyl naturel, la S-adénosY-L -méthionine (SAM). De nombreux travaux ont montré que CARMI est surexprimée dans les cancers du sein et de la prostate. L' objectif de ce travail est la compréhension à l'échelle moléculaire du mode d'action de CARMI et l'étude du mécanisme de reconnaissances moléculaires et de transferts d' informations gouvernés par la protéine CARMI. La structure cristallographique obtenue de cette enzyme en présence de cofacteur, la S-AdénosyhHomocystéine ou la Sinefungine a eu un effet stabilisant. Ainsi, notre stratégie a été de créer des molécules hameçons basées sur le motif de la SAM capables d' ancrer un peptide mimant la séquence de l' histone H3, pour ensuite les tester en co-cristallisation avec CARMI. Ainsi, grâce à la diffraction aux rayons X, les interactions mises en jeu dans le complexe CARMlImolécules hameçons/peptide pourront être déterminées. Cette stratégie s'est effectuée en trois étapes : la première étape, décrite dans le chapitre 2, a consisté en la synthèse d'analogues de la SAM obtenus grâce à des modifications réalisées autour de l'atome de soufre. Ces composés nous ont permis d' explorer la " poche du sulfonium ". Puis la seconde étape, décrite dans le chapitre 3, a été la synthèse * d'analogues de bisubstrats nécessaires pour l'exploration de la " poche de l'arginine ". Dans une dernière étape, décrite dans les chapitres 4 et 5, nous avons abordé la synthèse d'adduits SAM-peptide pouf pouvoir étudier le " domaine de fixation du peptide ". Dans le quatrième chapitre, la méthode de choix est la création d'un lien covalent entre une molécule hameçon électrophile etun peptide par chimie de click in-situ : par réaction de cycloaddition de Huisgen; par réaction entre des molécules hameçons électrophiles capables de piéger un peptide cystéine ou un peptide arginine. Ces essais se sont révélés infructueux et une nouvelle stratégie a été employée en utilisant des molécules ancres. Dansle cinquième chapitre des molécules ancres ont donc été préformés pour ensuite être testés en cocristallisation dans CARMl.

L'ochratoxine A (OTA) est une mycotoxine néphrotoxique, produite par plusieurs espèces de champignons, des genres Aspergillus et Penicillium, se développant en particulier sur les denrées alimentaires au cours de leur stockage. L'exposition de l'homme à cette toxine se fait via la chaîne alimentaire aussi bien par les produits végétaux que par la viande. Chez les animaux, elle est clairement cancérogène au niveau du rein, chez l'homme elle a été classée par le CIRC en 1993 (Centre international de la recherche sur le cancer) comme "potentiellement cancérogène pour l'homme" (groupe 2B). Le mécanisme par lequel cette toxine induit des cancers n’est pas totalement élucidé et fait l’objet de débats. En effet, il reste à déterminer si c'est un cancérogène génotoxique (via une liaison covalente sur l'ADN) ou un cancérogène épigénétique (non génotoxique, via un stress oxydatif par exemple). Le but de notre travail est de clarifier le mécanisme d’action de cette toxine, en identifiant la nature exacte des adduits à l’ADN formés ainsi que les métabolites responsables de l’induction de cancer des voies urinaires. Le post-marquage de l'ADN au 32P est une méthode très sensible de détection des adduits à l'ADN. Lors d'analyses d'ADN de rats, post-marqués au 32P en co-chromatographie avec des adduits standard OTA-Guanine, nous avons montré que des adduits covalents de l'OTA sur l'ADN étaient formés in vivo. D'autre part, l'administration d'OTA à des souris gestantes a induit la formation d'un adduit sur l'ADN testiculaire et rénal de leur progéniture. Cet adduit est chromatographiquement identique au standard C-C8 OTA-dG. D'autre part, nous avons montré que le dérivé OTHQ induisait la formation d'adduits à l'ADN sans activation métabolique supplémentaire et similaires à ceux observés avec l’OTA; l'OTHQ est donc un métabolite réactif de l'OTA. L'analyse de la biotransformation de l'OTA par différents systèmes de métabolisation a permis de mettre en évidence la métabolisation de l'OTA en divers métabolites. Au moins 23 dérivés différents ont été formés lors d'incubations de microsomes de porc (foie et rein). Certains ont été identifiés (OTB, 4R, 4S-OHOA, OP-OA, Otα). Nous avons mis en évidence, par spectrométrie de masse, la formation d'un dérivé déchloriné de l'OTA (différent de l'OTB) de masse 366g/mol. D'autres restent encore de nature inconnue. Nous avons montré que la métabolisation était spécifique du sexe, de l'organe et de l'espèce de l'animal. De plus, la modulation de la biotransformation de l'OTA par les composés buthionine sulfoximine, acivicine et mélatonine a orienté fortement le métabolisme de l'OTA vers la production, respectivement, d'un dérivé déchloriné de l'OTA, de l'OTB et de l'OP-OA. Ces expériences corrélées avec l'étude des adduits à l'ADN nous ont permis de montrer que l'OTA est un cancérogène génotoxique qui nécessite d'être biotransformé pour exercer ses effets sur l'ADN; la lipoxygénase est impliquée dans cette activation métabolique.

"L'ochratoxine A (OTA) est une mycotoxine néphrotoxique, produite par plusieurs espèces de champignons, des genres Aspergillus et Penicillium, se développant en particulier sur les denrées alimentaires au cours de leur stockage. L'exposition de l'homme à cette toxine se fait via la chaîne alimentaire aussi bien par les produits végétaux que par la viande. Chez les animaux, elle est clairement cancérogène au niveau du rein, chez l'homme elle a été classée par le CIRC en 1993 (Centre international de la recherche sur le cancer) comme "potentiellement cancérogène pour l'homme" (groupe 2B). Le mécanisme par lequel cette toxine induit des cancers n'est pas totalement élucidé et fait l'objet de débats. En effet, il reste à déterminer si c'est un cancérogène génotoxique (via une liaison covalente sur l'ADN) ou un cancérogène épigénétique (non génotoxique, via un stress oxydatif par exemple). Le but de notre travail est de clarifier le mécanisme d'action de cette toxine, en identifiant la nature exacte des adduits à l'ADN formés ainsi que les métabolites responsables de l'induction de cancer des voies urinaires. Le post-marquage de l'ADN au 32P est une méthode très sensible de détection des adduits à l'ADN. Lors d'analyses d'ADN de rats, post-marqués au 32P en co-chromatographie avec des adduits standard OTA-Guanine, nous avons montré que des adduits covalents de l'OTA sur l'ADN étaient formés in vivo. D'autre part, l'administration d'OTA à des souris gestantes a induit la formation d'un adduit sur l'ADN testiculaire et rénal de leur progéniture. Cet adduit est chromatographiquement identique au standard C-C8 OTA-dG. D'autre part, nous avons montré que le dérivé OTHQ induisait la formation d'adduits à l'ADN sans activation métabolique supplémentaire et similaires à ceux observés avec l'OTA; l'OTHQ est donc un métabolite réactif de l'OTA. L'analyse de la biotransformation de l'OTA par différents systèmes de métabolisation a permis de mettre en évidence la métabolisation de l'OTA en divers métabolites. Au moins 23 dérivés différents ont été formés lors d'incubations de microsomes de porc (foie et rein). Certains ont été identifiés (OTB, 4R, 4S-OHOA, OP-OA, Otα). Nous avons mis en évidence, par spectrométrie de masse, la formation d'un dérivé déchloriné de l'OTA (différent de l'OTB) de masse 366g/mol. D'autres restent encore de nature inconnue. Nous avons montré que la métabolisation était spécifique du sexe, de l'organe et de l'espèce de l'animal. De plus, la modulation de la biotransformation de l'OTA par les composés buthionine sulfoximine, acivicine et mélatonine a orienté fortement le métabolisme de l'OTA vers la production, respectivement, d'un dérivé déchloriné de l'OTA, de l'OTB et de l'OP-OA. Ces expériences corrélées avec l'étude des adduits à l'ADN nous ont permis de montrer que l'OTA est un cancérogène génotoxique qui nécessite d'être biotransformé pour exercer ses effets sur l'ADN; la lipoxygénase est impliquée dans cette activation métabolique. ABSTRACT : Ochratoxin A (OTA) is a nephrotoxic mycotoxin, produced by several molds of the Aspergillus and Penicillium species which may contaminate foodstuffs mainly during storage. Humans are exposed to this toxin via the food chain, by ingestion of plants or meat. OTA induced kidney cancer in rodent, and has been classified by International agency on Cancer Research (IARC) in 1998 as "possible human carcinogen" (group 2B). OTA carcinogenic mechanism is still under debate. Does OTA act as a genotoxic carcinogen (by direct covalent binding on DNA) or as an epigenetic carcinogen (no genotoxic, oxidative stress by example)? The overall goal of this work was to determine the nature of DNA adducts and their relation to metabolic fate. Thus, the existence of the “true” adducts responsible for the induction of urothelial tract tumors should be ascertained. Covalent DNA adducts have been detected by the sensitive method of 32P-postlabelling of DNA. By commigration of authentic OTA-Guanine adduct postlabelled with DNA adducts from rat or pig kidney DNA, it was demonstrated that covalent adducts are formed in vivo. In addition, exposure of pregnant mice to OTA has induced OTA-DNA adduct formation in kidney and testis of newborn mice. One adduct formed in both organs exhibited the same chromatographic properties as C-C8 dG OTA standard. OTHQ (quinone form of OTA) induced direct DNA adduct without metabolic activation. Some adduct induced by OTHQ are similar to OTA DNA adducts. Thus OTHQ is one of the OTA derivatives implicated in the genotoxic activity of OTA. Use of several models (cell cultures, in vitro incubation with microsomes of pig's liver or kidney. . . ) led to the formation of at least 23 OTA derivatives, including OTB, 4R, 4S-OHOTA, OP-OTA, OTα. By mass spectrometry, a dechlorinated OTA derivative (not similar to OTB) was detected, having a mass of 366g/mol. Some other derivatives of unknown structure have been isolated in the chromatographic system used. Biotransformation of OTA depends of species, gender and organs of animal. Modulation of metabolic pathway by buthionin sulfoximine, acivicin or melatonin increases the formation of large amount of dechlorinated OTA, OTB or OP-OTA respectively. These studies indicated that OTA, after metabolic activation via lipoxygenase pathway, forms covalent DNA adducts and acts as a genotoxic carcinogen. "

Le Syndrome de Down, aneuploïdie la plus courante, a pour cause première la présence d'un chromosome 21 Numéraire. L'établissement de cartes de corrélation génotypes/phénotypes chez les patients atteints du Syndrome de Down a permis de mettre en évidence la kinase DYRKIA, codée par le gène DYRKIA localisé dans la région DCR-1 du chromosome 21, comme candidat pouvant être impliqué dans l'apparition d'un retard mental. Comprendre le rôle et la régulation de DYRKIA est donc essentiel et pour cela, utiliser un test fiable de mesure d'activité de l'enzyme est indispensable. Nous avons développé une nouvelle méthode de dosage de l'activité kinase de DYRKIA utilisant la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). Cette méthode s'est révélée très sensible et peu coûteuse. En utilisant cette nouvelle méthode, nous avons confirmé les principales données obtenues in vitro sur l'activité de DYRKIA. Nous avons également caractérisé le comportement d'inhibiteurs connus de DYRKIA (harmine) et confirmé les résultats rapportés dans la littérature. En collaboration avec l'équipe du Dr. Dodd nous avons criblé des dérivés hétérocycliques azotés de faible poids moléculaire, inhibiteurs potentiels de DYRKIA. Enfin, le test d'activité a été utilisé ex vivo sur des extraits de cerveau de souris. Nos résultats indiquent que cette nouvelle méthode de dosage d'activité kinase est spécifique, reproductible et rapide. Elle peut potentiellement s'appliquer à d'autres kinases, phosphatases et plus largement à d'autres enzymes catalysant une réaction de modification de protéines
La GnRH joue un rôle essentiel en régulant la sécrétion et la synthèse de LH et de FSH via des récepteurs spécifiques (GnRHR) exprimés à la surface des cellules gonadotropes hypophysaires. L'expression tissulaire spécifique du Gnrhr est contrôlée par une combinatoire bien définie de facteurs de transcription comportant trois acteurs majeurs, SF1, LHX3 et ISL1. Au contraire du Gnrhr, nous montrons que les séquences régulatrices d'M7 en amont du site d'initiation de transcription (TSS) sont insuffisantes pour diriger l'expression hypophysaire spécifique, suggérant l'existence de mécanismes additionnels. De fait, les régions régulatrices (ou promoteurs) ainsi que les "corps" des gènes sont altérés par des modifications épigénétiques. Les résultats, obtenus par immunoprécipitation de la chromatine, montrent que dans les lignées cellulaires exprimant Isl1, notamment les cellules gonadotropes, Isl1 est complexé avec des histones H3 triméthylées sur la Lys4 (H3K4Me3) au niveau du TSS, une marque d'histones corrélée avec les gènes actifs. En revanche, dans les lignées cellulaires où Isll est silencieux, il est complexé avec des histones H3 triméthylées sur la Lys27, marque liée à la répression des gènes. On observe cette même corrélation au niveau du TSS du Gnrhr. De plus, notre étude suggère que la méthylation de F ADN, en amont de l'îlot CpG est inversement corrélée à l'activité de ce gène. Ces données suggèrent que les modifications épigénétiques sont essentiellement responsables de l'expression hypophysaire spécifique d'/s/ycontrairement à l'expression du Gnrhr qui semble principalement dépendante de la présence de facteurs de transcription tissulaires spécifiques majeurs
Down syndrome is the most common aneuploidy, it originates from the presence of an extra 21st chromosome. The establishment of genotype/phenotype correlations in patients with Down's syndrome made it possible to highlight the DYRKIA kinase, encoded by the DYRKIA gene localized in the region DCR-1 on 21st chromosome, as a good candidate in the onset of mental retardation. Understandïng the role and regulation of DYRKIA is thus necessary and for that, to get a reliable kinase activity assay is essential. First, we focused on the establishment of a new method of DYRKIA kinase activity assay using High Pressure Liquid Chromatography (HPLC). This method proved to be highly sensitive and affordable. Second, we sought to confirm previous data on in vitro activity of DYRKIA by using this new method. We also characterized the behavior of known inhibitors of DYRKIA (harmine) and the results obtained are in agreement with the literature. In collaboration with Dr. Dodd's team, we screened various molecules as potential inhibitors of DYRKIA. Finally, the activity assay was tested ex vivo, in mice brain extracts. Our results indicate that this new method of kinase activity assay is specific, reproducible and fast. This method can be potentially applied to other kinases, phosphatases and more broadly to other enzyme catalyzing a reaction of protein modification
GnRH plays a critical role by regulating LH and FSH secretion and synthesis via specific receptors (GnRHR) expressed at the surface of gonadotrope cells. Tissue-specific expression of Gnrhr is arbitrated by a combinatorial code of transcription factors that involves SF1, LHX3 and ISLL Unlike for Gnrhr, we showed that Ml regulatory sequences upstream of the transcription start site (TSS) were not sufficient to direct pituitary-specific expression, suggesting the existence of additional regulatory mechanisms. Indeed regulatory regions (or promoters) as well as gene bodies, are altered by epigenetic modifications. Results of chromatin immunoprecipitation reveal that in cell lines expressing Isll, namely gonadotrope cells, Isll was linked to histone H3 tri-methylated on Lys4 (H3K4Me3) at thé TSS, an histone mark correlated with gène activity. In contrast, in cell Unes where Isll was silent, Isll was bound by histone H3 tri-methylated on Lys27, a histone mark linked to gene repression. Similar correlation between histone modifications and gene activities where observed at the Gnrhr TSS. Our study further suggests that DNA methylation upstream of the CpG Island of Isll was inversely correlated with gene activity. Together, these data suggest that epigenetic modifications predominantly direct Isll tissue-specific expression whereas Gnrhr expression is primarily dependent on the presence of master tissue-specific transcription factors

L’ontogenèse des lymphocytes B (LB) comporte une première phase de différenciation, dans la moelle osseuse en l'absence de toute stimulation antigénique spécifique, aboutissant au LB immature. La seconde phase, d’activation et de maturation finale, est dépendante des antigènes et se déroule dans les organes lymphoïdes secondaires, au sein de structures transitoires appelées centres germinatifs (CG). Elle génère des plasmocytes et des cellules B mémoires spécifiques d’un antigène.Ce travail de thèse s’intéresse à différents acteurs impliqués dans la régulation épigénétique et transcriptionnelle de la différenciation lymphoïde B terminale : les enzymes TET2 et TET3 et le facteur de transcription (FT) SPI1/PU.1. Des mutations affectant les gènes codant pour ces protéines sont trouvées dans les hémopathies chez l’Homme et nous avons cherché à déterminer leurs conséquences fonctionnelles en utilisant des modélisations in vivo et in vitro.J’ai d’une part analysé l’impact de la perte de fonction de TET2 sur la différenciation et la maturation des cellules B. Les résultats montrent un blocage de la différenciation plasmocytaire associé à une hyperplasie des CG et une augmentation du pourcentage et du nombre absolu des LB du CG (BGC). L’analyse par PCR quantitative de l’expression des FT importants pour la différenciation des BGC et des plasmocytes a montré que les cellules déficientes pour TET2 présentent une répression du gène Prdm1 codant pour BLIMP1, un régulateur essentiel de la différenciation plasmocytaire. Je me suis ensuite intéressée à TET3, autre protéine de la famille TET exprimée dans la lignée B. Les modèles Tet3-déficients in vivo et in vitro n’ont pas montré d’altération marquée de la différenciation B terminale.J’ai par ailleurs étudié une mutation somatique de SPI1/PU.1, identifiée par notre équipe chez des patients atteints de maladie de Waldenström (MW). Dans plus de 95% des cas, la mutation activatrice L265P du gène MYD88 est également présente. Nous avons montré que la mutation de SPI1, bien que n'empêchant pas sa liaison à l’ADN, modifie son affinité de liaison sur les sites normalement reconnus par la forme sauvage. La mutation semble faire adopter à cette protéine ETS de classe III un comportement qui ressemble à celui d'une classe I/IIa. J’ai ensuite cherché à documenter les bases de la coopération oncogénique entre SPI1 et MYD88 de deux façons. La première, en étudiant la prolifération et la différenciation de lymphocytes B naïfs issus d’un modèle murin knock-in pour la mutation SPI1 développé dans l’équipe, transduits avec un rétrovirus apportant la mutation de MYD88. Les résultats montrent une augmentation de la prolifération dans la condition double mutante ainsi qu’une augmentation de la différenciation terminale. La seconde approche consiste à modifier la lignée humaine BCWM1 de MW par CRISPR/Cas9 afin d’y introduire la mutation de SPI1 en même temps que l’expression de la GFP. Ce modèle sera notamment utilisé pour réaliser des expériences de ChIP-seq afin d’identifier les cibles de la protéine mutante dans un contexte MW-like.En conclusion, le respect des programmes transcriptionnels est essentiel pour le bon déroulement de la différenciation B terminale et peut être impacté soit directement, par des mutations affectant des FT comme SPI1, soit indirectement lorsque le profil de méthylation de gènes codant pour des FT (PRDM1) est altéré suite à des mutations affectant des enzymes comme TET2
B-cell development involves a first phase of differentiation in the bone marrow, in the absence of any specific antigenic stimulation, leading to immature B-cells. The second phase, staging activation and final maturation, is antigen-dependent and takes place in the secondary lymphoid organs, within transient structures called germinal centers (GC). It generates antigen-specific plasma cells and memory B cells.This thesis work focuses on different actors involved in the epigenetic and transcriptional regulation of B-cell differentiation: the enzymes TET2 and TET3 and the transcription factor (TF) SPI1/PU.1. Mutations in genes encoding these proteins are found in human neoplasms, we used in vivo and in vitro models to determine their functional consequences.I analyzed the impact of TET2 loss of function on the differentiation and maturation of B-cells. The results show an impaired plasma cell differentiation associated with GC hyperplasia and an increase in the percentage and absolute number of GC B-cells (BGC). Quantitative PCR analysis of the expression of key BGC and plasma cell TF showed that Tet2-deficient cells exhibit repression of the Prdm1 gene encoding BLIMP1, a master regulator of plasma cell differentiation. I then turned my attention to TET3, another TET family protein expressed in the B-cell lineage. In vivo and in vitro Tet3-deficient models show that the loss of TET3 does not significantly affect terminal B differentiation.In addition, I studied a somatic mutation of SPI1/PU.1, identified by our team in patients with Waldenström's disease (WM). In more than 95% of cases, the L265P activating mutation of MYD88 gene is also present. We have shown that SPI1 mutation, although not preventing its binding to DNA, alters its binding affinity at sites normally recognized by the wild-type form. The mutation appears to cause this class III ETS protein to behave in a manner similar to a class I/IIa ETS protein. I then sought to document the basis for oncogenic cooperation between SPI1 and MYD88 in two ways. First, by studying the proliferation and differentiation of naïve B-cells from a locally developped mouse model knock-in for the SPI1 mutation, transduced with a retrovirus carrying the MYD88 mutation. The results show an increase in proliferation in the double mutant condition as well as an increase of the terminal differentiation. Second, by modifying the human BCWM1 WM cell line by CRISPR/Cas9 in order to introduce the SPI1 mutation at the same time as the expression of the GFP. This model will be used in particular to perform ChIP-seq experiments to identify the targets of the mutant protein in a MW-like context.In conclusion, compliance to transcriptional programs is essential for the smooth progress of B-terminal differentiation and can be impacted either directly, by mutations affecting TF such as SPI1, or indirectly when the methylation profile of key TF-encoding genes (PRDM1) is altered following mutations in enzymes such as TET2