Rozprawy doktorskie na temat „Système assimilé au complément”

L’anophèle est le moustique vecteur du parasite Plasmodium, responsable du paludisme. Chez ce moustique, des protéines de type LRR (à motifs riches en leucine) ont été décrites comme antagonistes cruciaux du développement de Plasmodium. L’une d’entre elles, APL1C (Anopheles Plasmodium-responsive factor) protège spécifiquement le moustique contre les parasites Plasmodium de rongeurs en collaboration avec la protéine TEP1 du complément. En combinant des approches de biologie cellulaire et de génomique fonctionnelle, mon travail de thèse montre que le repas sanguin des moustiques induit le recrutement d’APL1C au niveau du pôle basal de l’épithélium digestif. Ce positionnement d’APL1C lui permet de se lier aux stades ookinètes du parasite émergeant du côté basal de l’épithélium, et ce, indépendamment de la fonction de TEP1. Néanmoins, cette action d’APL1C requiert la contribution des phagocytes et de la Nitration. Par ailleurs, mon travail montre que l’action d’APL1C ne se restreint pas à l'ookinète car elle agit aussi contre le dernier stade de développement de Plasmodium, les sporozoïtes. Avec la capacité de se lier aux sporozoites, APL1C contrôle la prévalence d’infection des glandes salivaires du moustique, mais avec des partenaires différents de ceux agissant sur les ookinètes. Finalement, une étude transcriptomique m’a permis d’identifier des facteurs agissant en aval d’APL1C. L’ensemble de ces résultats génère de nouvelles connaissances relatives à la fonction de cette famille de protéines LRR en tant que récepteurs de reconnaissance d'agents pathogènes capable de déclencher une réponse immunitaire dans différents compartiments tissulaires du moustique
Anopheles mosquito is a vector of Plasmodium parasite, the causative agent of malaria. The Anopheles leucine-rich repeat (LRR) proteins were described as key antagonists of Plasmodium parasites in Anopheles mosquito midgut. APL1C (Anopheles Plasmodium-responsive factor) is a representative of LRR members which specifically protects against rodent malaria parasites by stabilizing the complement-like protein TEP1. By combining cell biology with functional genomic approaches, this study shows that mosquito bloodmeal induce the presence of an extracellular layer of APL1C protein surrounding the midgut beneath of the basal lamina. Consistently with the formation of this layer, APL1C binds to the ookinetes that emerged on the basal side of the midgut. This presence occurs independently from TEP1 function, requires the contribution of the phagocytic cells and nitration pathway. In addition, APL1C defence function is not restricted to the ookinete in the midgut but it also acts against the latest Plasmodium stage, the sporozoites. APL1C inhibits salivary glands infection prevalence, and consistently, it also binds to the surface of the sporozoites in the hemocoel. However, unlike to the midgut stages, anti-sporozoites APL1C-dependent mechanism involves different partners. Moreover, RNAseq study revealed APL1C gene targets, including genes with immune-like function. These results generate novel biological insight for the function of APL1C, and probably other LRR family members, as a pathogen recognition receptor inducing immune response against pathogens that come in contact with mosquito hemolymph compartment

Pendant longtemps, l'activation du complément exprimé dans le système nerveux central a été considérée comme délétère pour les cellules environnantes puisque permettant une amplification de l'inflammation et surtout la lyse cellulaire par le complexe d'attaque membranaire. Mais le concept d'un rôle du complément dans la neuroprotection a émergé suite à des données plus récentes. Le travail de cette thèse a consisté à explorer les mécanismes que le complément met en place également par son activation pour protéger les cellules avoisinantes, les neurones essentiellement. Cela peut passer par une augmentation d'expression de CD55 au niveau neuronal ou par la libération de NGF par les astrocytes grâce à un effet synergique des anaphylatoxines et IL-1b. En revanche, la phagocytose des cellules en apoptose, processus important pour éviter le déclenchement d'un réaction inflammatoire n'est pas régulée par le C3a
For a long time, the classical dogma has considered complement activation in brain pathology deleterious for surrounding cells since it promotes inflammation processes and triggers membran attack complexe formation resulting in cell lysis. A growing body of evidence implicates complement in neuoroprotection processes. My PhD work consisted in exploring the different mecanisms set up by complement activation to protect cells, neurons essentially. The up-regulation of neuronal CD55 or NGF secretion by astrocytes following a simultaneous anaphylatoxins and IL-1b stimulation may contibute to neuronal protection. On the other hand, phagocytosis of apoptotic cells, which is an important process to prevent inflammatory reaction is not regulated by C3a

Chez les patients en état d'insuffisance rénale, les membranes d'hémodialyse à base de cellulose activent le système du complément et induisent la production d'interleukine-1 (il-1) par les monocytes. Le sephadex (seph) a été utilisé comme modèle de la cellulose. C'est un activateur du complément par la voie alterne; cette activation dépend de la présence d'anticorps anti-dextrane et de la surface de contact. Les carboxymethyle seph (cmseph) sont des inhibiteurs de cette activation. Les dérivés de seph: cmseph, cmbseph portant des groupes cmbenzylamide, cmbso3seph portant des groupes cmbsulfonates et deaeseph portant des groupes diethylaminoethyle, substitués à des taux variables, ont été choisis comme surfaces polysaccharidiques modèles d'étude de l'activation et de l'inhibition du complément et de l'induction de la production et de la sécrétion d'il-1par les monocytes humains. Les dosages hémolytiques ch50, radioimmunologiques de c3a et immuno-electrophoretiques de c3 ont montré que les cmbseph et cmbso3seph sont des activateurs du complément. Les deaeseph sont des inhibiteurs; cet effet est du au moins en partie au fait que les anticorps anti-dextranes ne reconnaissent plus les deaeseph. Après contact de tous ces dérivés avec des monocytes humains en absence de sérum, et en présence ou non de stimulateur microbien (lps), les dosages elisa d'il-1 intra et extracellulaires, montrent que seph et cmseph n'ont pas d'effet sur la production et la sécrétion d'il-1, cmbs03seph et surtout cmbseph stimulent la sécrétion, et surtout la production d'il-1 par les monocytes, deaeseph inhibe cette production.

La comparaison des caractéristiques immunologiques du sang et du liquide céphalo-rachidien (LCR) montre des anomalies biologiques du LCR et de l'état de la barrière hémato-encéphalique (BHE) au cours de désordres cérébraux. Nous avons dosé différentes protéines du complément (C) dans des LCR et sérums et montré l'expression de formes courtes du facteur H : FHL-1, FHR-1. Les échantillons sont classés en trois groupes : Normal, Inflammatoire et Transsudat (classification de Schüller). L'origine tres diversifiée des échantillons n'a pas permis d'établir un profil type du C dans les LCR pour un groupe donné. Une synthèse intrathécale des protéines inhibitrices est toujours observée dans les LCR inflammatoires. La présence de FHL-1 dans tous les LCR est certainement due à une synthèse intrathécale par les astrocytes. Au cours des processus pathologiques où la réaction gliale peut être importante, la synthèse de FHL-1 est augmentée. Non synthétisée intrathécalement, FHR-1 est seulement présente dans les LCR Transsudats, par transsudation plasmatique provoquée par une rupture de la BHE. FHL-1 et FHR-1 semblent de bons marqueurs immunologiques, respectivement de l'état inflammatoire du système nerveux central (SNC) associé à une activité gliale importante et de l'état de la BHE. En outre, nous avons voulu savoir si les neurones pouvaient participer au pool local de C dans le SNC, avec les astrocytes et la microglie. Nous avons montré que les neurones in vitro produisent les protéines régulatrices solubles et des composants activateurs des voies alterne et classique. L'étude de la régulation de ces synthèses montre que seules les protéines régulatrices sont sensibles à l'action des cytokines proinflammatoires. Les neurones in vitro activent spontanément le C mais résistent à son action lytique via l'expression de protéines régulatrices membranaires. Ainsi, le C synthétisé localement par les neurones in vivo pourrait être impliqué dans certains processus pathologiques.

La bioincompatibilité des surfaces mises en contact avec les milieux vivants et particulièrement le sang dans les dispositifs de circulation extracorporelle ou implantes est un problème majeur, en particulier l'activation du systéme du complément. Nous avons choisi d'étudier l'activation du complément par des dérives fonctionnalisés du polystyrène. Les groupes fonctionnels fixés l'ont été seuls ou sont présents simultanément. Ils comprennent soit des groupes susceptibles d'activer le complément (ch#2oh et amines), soit des groupes anioniques (so#3#, coo#, so#2asp), soit des groupes cationiques (ammonium quaternaire). Les surfaces portant des groupes ch#2oh sont activatrices du complément par la voie alterne indépendamment de la présence d'anticorps et cette activation est tres dépendante de la densité des groupes présents. Les polymères portant des groupes aminés sont tous activateurs du complèment. Les surfaces portant des ammonium quaternaires absorbent et activent les protéines du complément. Les polymères portant des groupes so#3# et coo# absorbent les protéines du complément, les premiers étant capables de développer en plus une activité c3 convertasique. Les dérivés portant les groupes so#2asp n'apparaissent pas activateurs dans nos conditions operatoires. Les propriétés des polymères portant à la fois les groupes ch#2oh et so#3# sont différentes de celles des polymères portant les mêmes types de groupes isolés, celui qui a autant de chaque groupe n'est pas activateur du complément. Ces surfaces modèles devraient permettre de prévoir les types et proportions des groupes qui pourraient etre introduits afin de controler in situ l'activation du complément

Le cerveau peut être le siège d'une réaction inflammatoire au cours de nombreuses pathologies durant lesquelles une augmentation de la synthèse du complément, acteur majeur de l'immunité naturelle, a pu être observée. En l'absence de tout infiltrat cellulaire, une réaction inflammatoire intrinsèque peut être réalisée par les cellules gliales. L'activation de ces cellules, qui synthétisent la totalité des composants de la cascade du complément aboutit, notamment, à la libération des anaphylotoxines C3a et C5a, deux puissants médiateurs inflammatoires, ainsi qu'à la formation du complexe d'attaque membranaire. La mise en évidence des récepteurs des anaphylatoxines à la surface des cellules du cerveau et l'observation d'une augmentation de leur expression au cours de certaines pathologies nous a mené à examiner leurs rôles au sein du cerveau, et en particulier au niveau des astrocytes, cellules gliales aux propriétés immunocompétentes. Au cours de ces travaux, nous montrons que le C3a et le C5a entraînent l'activation de plusieurs voies de transduction aboutissant à une augmentation de l'expression des ARNm de chimiokines parmi lesquelles l'IL-8. En revanche, une augmentation de la sécrétion d'IL-8 par les anaphylotoxines n'a pu être observée qu'en présence d'IL-1ß. Ainsi, les anaphylotoxines participeraient, au moins partiellement, au recrutement des leucocytes au sein du cerveau. Le C3a et le C5a augmentent également l'expression des ARNm de certaines neurotrophines ainsi qu'une sécrétion modeste du NGF, participant ainsi aux phénomènes de neuroprotection et de réparation post-lésionnelle. Enfin, nous montrons un rôle tout à fait inattendu du C3a dans l'élimination des cellules apoptotiques via l'augmentation de l'expression du récepteur à la phosphatidylsérine au niveau des astrocytes. L'ensemble de ces travaux, effectués au niveau de l'astrocyte, attribue de nouveaux rôles aux anaphylatoxines et suggère qu'au niveau du cerveau elles exerceraient un effet dualiste
Inflammatory reactions could occur in the brain during numerous pathological disorders when an increase of complement synthesis, actor of natural immunity, has been observed. In the absence of cellular infiltration, an intrathecal inflammatory reaction could be realized by glial cells. The activation of these cells, which synthesize the totality of the complement cascade components, leads to the release of C3a and C5a anaphylatoxins, two potent inflammatory mediators, and to the formation of the membrane attack complex. The presence of anaphylatoxin receptors on brain cells and the increase of their expression during some pathologies led us to determine their roles in the brain, in particular on astrocytes, immunocompetent glial cells. Our studies show that C3a and C5a activate several transduction pathways leading to an increase of chemokine mRNA expression, including IL-8. However an increase of IL-8 secretion could be detected only in the presence of IL-1ß. Thus, at least in part, anaphylatoxins may participate to leukocyte recruitment into the brain. C3a and C5a also increase neurotrophin mRNA expression and lead to a weak secretion of NGF, and so, participate to neuroprotection and post-lesioned repairing. Finally, we show an unexpected role for C3a in the clearance of apoptotic cells via the increase of phosphatidylserine receptor expression by astrocytes. Our data allocate new roles to anaphylatoxins on astrocytes and suggest that they could have a dual effect in the brain

Le système du Complément (C) est une composante importante de l'immunité humorale innée. Ce système est composé d'une trentaine de protéines plasmatiques. Lors de certaines pathologies, il entretient et aggrave l'inflammation. C'est le cas par exemple de certaines maladies neurodégénératives pour lesquelles le blocage du Complément peut apporter un bénéfice thérapeutique. Or, à ce jour, il n'existe aucun principe actif anticomplémentaire disponible dans la pharmacopée. Les glucanes représentent une source de molécules bioactives immense et encore largement inexplorée. Parmi ces molécules, le fucoi͏̈dane est un polysaccharide constitué majoritairement de fucose sulfaté extrait d'algues brunes comme Ascophyllum nodosum. Il possède la propriété de bloquer certains systèmes biologiques importants, notamment celui du Complément. Nous avons montré, par des tests hémolytiques, que ce polysaccharide inhibe les deux voies, classique et alterne, d'activation du Complément. La voie classique est bloquée à la fois lors de l'étape d'activation du complexe Cl et de la formation de la C3 convertase. Des expériences à l'échelle de la molécule unique ont permis de montrer que le fucoi͏̈dane établit des interactions avec une région précise de Clq, ce qui empêche l'incorporation de la sous-unité enzymatique du complexe Cl. La protéine C4, entrant da formation de la C3 convertase, est une autre cible du polysaccharide :l'analyse par électrophorèse capillaire d'affinité a montré pour la première fois, la formation d'un complexe entre C4 et le fucoi͏̈dane. En ce qui concerne la voie alterne, notre étude a montré que le fucoi͏̈dane potentialise l'inactivation de C3b par le Facteur I, en présence du Facteur H. Nos expériences par électrophorèse capillaire en zone laissent penser que H induit un changement conformationnel de C3b, rendant celui-ci plus sensible à l'activité protéolytique de I. L'ensemble de nos résultats nous conduisent à émettre l'hypothèse d'une action de potentialisation par le fucoi͏̈dane de ce changement conformationnel de C3b induit par H. Enfin, en terme d'analyse de relation structure-activité, les études structurales du fucoi͏̈dane actif ont montré que les ramifications, la présence d'unités 2-sulfatées et d'unités disulfatées sont importants pour l'activité anticomplémentaire
Complement System (C) is an important part of the innate humoral immunity and comprises about thirty plasmatic proteins. In the case of several pathologies, this System supports and worsens inflammation. These phenomena occur in several neurodegenerative diseases in which the inhibition of the Complement System may lead to a substantial therapeutic benefit. However, such anticomplementary drugs are not yet available. Glycans represent a huge source of bioactives molecules, although not thoroughly explored. Among those molecules, fucoidan is a polysaccharide extracted from brown seaweed (like Ascophyllum nodosum) and composed of sulfated-fucose units. This polymer is a potent Complement inhibitor. We evidenced that fucoidan inhibits both alternative and classical activation pathways. The classical one is blocked at the Cl-complex activation step and at the C3 convertase formation level. Experiments based on single-molecule observations enable us to show that fucoidan interacts with specifie domains of Clq that leads to the inhibition of the association of the enzymatic sub-unit of the Cl complex. Protein C4 is another target of fucoidan:the analysis by affinity capillary electrophoresis demonstrate for the first time the formation of a complex between the polysaccharide and C4 and also C4b, a fragment of C4. Concerning the alternative pathway, our study shows that fucoidan potentiates the Factor I-mediated inactivation of C3b, in the presence of Factor H. Zonal capillary electrophoresis experiments suggest that H induces a conformational change of C3b, rendering it sensitive to the proteolytic activity of I. We assume that fucoidan interferes with the activation of alternative pathway by potentiating the H-mediated conformational change of C3b. Concerning the structure-activity relationships, structural studies demonstrated that branchings, 2-sulfated units and disulfated units are essential to the anticomplementary activity of fucoidan

Contrairement aux dogmes préexistants, il est maintenant admis que les cellules du cerveau peuvent produire des molécules inflammatoires permettant la mise en place d'une réaction inflammatoire in situ au cours de nombreuses neuropathologies. Les mécanismes de la réaction inflammatoire observée après une ischémie cérébrale contribueraient notamment au développement des lésions post-ischémiques. L'initiation rapide de la réaction inflammatoire en réponse au choc ischémique ainsi que son développement progressif font donc de l'inflammation une cible d'intérêt pharmacologique dans le développement de nouveaux traitements de l'ischémie cérébrale. Le système du complément, composante essentielle de l'immunité naturelle, a pour vocation d'éliminer les pathogènes, directement ou par l'intermédiaire du recrutement des phagocytes. Le complément joue également un rôle important dans l'initiation et le maintien de la réponse inflammatoire au cours de nombreuses pathologies du cerveau. Le but des travaux présentés dans ce mémoire de thèse était de préciser le rôle du système du complément dans la physiopathologie de l'ischémie cérébrale. Nous montrons que l'expression du complément (clustérine, C1Q, C4, récepteurs du C3a et du C5a) est augmentée après l'ischémie cérébrale focale expérimentale chez la souris, suggérant que l'ischémie cérébrale initie l'activation intracérébrale du complément. Nous montrons également que l'expression du récepteur du C3a est induite sur les neurones après une ischémie cérébrale chez l'homme. Nous avons également étudié les effets in vitro du C3a sur la mort neuronale d'origine excitotoxique ou apoptotique, deux voies conduisant à la mort neuronale post-ischémique.

En 1987, Levi-Strauss et Mallat décrivirent, pour la première fois, la synthèse in vitro de deux composants du complément (C), le C3 et la facteur B (FB), par des astrocytes de rongeurs. Nous avons voulu poursuivre cette observation en réalisant une étude sur l'expression in vitro de 20 composants du C, de la voie alterne (C3, FB, FD, FP, FH, FI), de la voie classique (C1q, C1r, C1s, C1-Inh, C4, C4bp, C2, C3), et de la voie effectrice du complexe d'attaque membranaire (CAM) (C5, C6, C7, C8, C9, S-protein), par un modèle de lignées d'astrocytes humains. Ce mémoire de thèse décrit: 1) les différentes approches expérimentales qui ont été utilisées (Western blot, ELISA, immunoprécipitation, tests fonctionnels, Northern blot et RTPCR pour détecter les ARNm; 2) la régulation de ces biosynthèses par des cytokines (interféron-gamma, interleukine-1β, TNF-α). D'une manière générale, les cinq lignées d'astrocytes humains sont capables de synthétiser tous les composants nécessaires à l'activation des deux voies du C, mais également à la formation du CAM, responsable d'activité cytotoxique. Ces synthèses sont pour la plupart constitutives, avec cependant un rôle très important des cytokines (principalement l'interferon-gamma). Selon ces observations, nous pouvons considérer: 1) que, via l'astrocyte, le système nerveux central semble disposer d'une source locale en C; 2) qu'un tel potentiel pourrait être impliqué dans des activités neurodégénératives (maladie d'Alzheimer) et démyélinisantes (sclérose en plaques)

Au cours des vols spatiaux, les astronautes sont sujets à de nombreux stress perturbant leur organisme et notamment leur système immunitaire. Afin d’étudier ces altérations et du fait du nombre restreint de missions spatiales, il est nécessaire d’utiliser des modèles permettant de simuler, sur Terre, les stress rencontrés en vol. Au cours de cette thèse, nous avons étudié les effets de stress associés aux vols spatiaux sur le système du complément et les cellules dendritiques (DC). Dans un premier temps, nous avons étudié les effets d’une combinaison de stress ou de stress individuels, sur l’expression de la molécule C3 du complément chez l’amphibien et la souris. Nous avons montré que certains de ces stress associés aux vols spatiaux, dont la microgravité simulée, provoquent une augmentation de C3 dans des larves de P. waltl. Toutefois, ces variations ne sont pas retrouvées chez des souris placées en microgravité simulée par suspension anti-orthostatique. Dans un deuxième temps, nous avons étudié in vitro les effets d’une microgravité simulée (RPM) sur le phénotype et la fonction de DC murines. Nous avons montré que la structure du cytosquelette d’actine et la survie des DC étaient altérées par la microgravité simulée. De plus, les DC exposées à la RPM présentent un phénotype plus immature caractérisé à la fois par une diminution de l’expression membranaire des molécules de co-stimulation mais également de leur capacité à sécréter des cytokines pro-inflammatoires. Bien que ces caractéristiques soient indispensables aux fonctions des DC, les modifications mises en évidence ne semblent toutefois pas altérer leur capacité à présenter l’antigène. Pris ensemble, ces résultats montrent l’importance d’étudier les effets de stress associés aux vols spatiaux, comme la microgravité, sur le système immunitaire. Une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu permettra de comprendre les effets du stress sur la santé et de développer des contremesures adaptées aux vols spatiaux
During spaceflights, astronauts encounter numerous stresses leading to immune system impairment. Given the scarcity of space missions, simulation models are used on Earth to study the effects of spaceflight-associated stresses on the immune system. The aim of this thesis was to study the effects of spaceflight-associated stresses on the complement system and on dendritic cells (DC). First, we studied the effects of individual or combined spaceflight-associated stresses on the C3 molecule expression in amphibians and mice. We showed that some of these stresses such as microgravity increased the C3 complement expression in P. waltl larvae but no variation were found in mice subjected to simulated microgravity (hindlimb unloading model). We also studied the effects of simulated microgravity by RPM on murine DC phenotype and function. We showed that RPM exposure impaired both DC actin cytoskeleton and survival. Moreover, DC exposed to simulated microgravity showed an immature phenotype characterized by a decrease of co-stimulation molecule expression and pro-inflammatory cytokines secretion, which are essentials for DC functions. However, these numerous alterations did not affect antigen presentation to T cells. Taken together, these results highlight the significant effects of spaceflight-associated stresses on the immune system. Studying microgravity will allow to better understand its effects on health and to develop adapted countermeasures

Le système nerveux central (SNC) peut être le siège de réactions inflammatoires au cours de diverses pathologies. De nombreux acteurs cellulaires et moléculaires participent à l'initiation et à l'amplification de l'inflammation cérébrale. Ainsi, les cellules gliales du SNC et les cellules immunes infiltrantes sont responsables de la production de cytokines et de protéines du complément (C) observée dans le cerveau pathologique. Plusieurs études ont montré l'implication du C dans les pathologies du SNC. Les anaphylatoxines C3a et C5a sont deux peptides pro-inflammatoires libérés lors de l'activation du C. Elles agissent par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques respectivement nommes C3aR et C5aR. Nous avons émis l'hypothèse que C3a et C5a libérées dans le cerveau pourraient exercer leurs effets inflammatoires via leur liaison au C3aR et au C5aR sur les cellules nerveuses. L'astrocyte, cellule gliale du SNC, a constitué notre modèle d'étude car cette cellule possède un étonnant potentiel immunologique et est fortement impliquée dans l'inflammation cérébrale. Notre étude a été menée en parallèle sur des lignées astrocytaires humaines et sur des astrocytes de rat en culture primaire. Nous avons montré l'expression constitutive des récepteurs C3aR et C5aR à la surface des astrocytes. Les deux récepteurs sont fonctionnels puisque leur stimulation par C3a et C5a induit d'une part l'activation de voies de transduction et, d'autre part, une augmentation de l'expression des ARNm des cytokines IL-6 et IL-8, et une sécrétion d'IL-8 par les astrocytes. L'ensemble de ces données nous permet d'attribuer de nouveaux rôles à C3a et C5a au sein du cerveau et renforce l'implication des anaphylatoxines dans les processus inflammatoires cérébraux et la pathogénèse du SNC.

Le système complément s’active au cours de la sclérose en plaques, maladie autoimmune inflammatoire démyélinisante du système nerveux central. Dans le modèle animal d’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE) chez la souris, nous montrons que l’opsonisation par le C3d d’un antogène de la myéline, le myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), peut favoriser la rupture de tolérance et le déclenchement d’une réponse autoimmune. La fixation de C3d à la MOG conduit également à l’exacerbation des signes cliniques d’EAE, corrélée à une infiltration leucocytaire accrue du système nerveux central, une augmentation de l’activation des lymphocytes B et de leurs fonctions, ainsi qu’à une production élevée d’autoanticorps antiMOG. Ces effets concourent à accroître la démyélinisation et les dommages neuronaux responsables des troubles neurologiques. Cette étude met donc en évidence un rôle délétère du C3d lorsqu’il se fixe à un antigène du Soi au cours des maladies autoimmunes
The complement system is activated during multiple sclerosis, an autoimmune inflammatory demyelinating disease of the central nervous system. In the animal model of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice, we have show that C3d opsonization of a myelin antigen, the myelin oligodendrocyte glycoprotein, can promote tolerance breakdown and trigger an autoimmune response. C3d binding to MOG also results in the exacerbation of clinical signs of EAE, correlated with an increased leukocyte infiltration of the central nervous system, enhanced activation of B lymphocytes and their related functions, and an increased production of anti-MOG antibodies. Together, these effects contribute to enhance demyelination and neuronal damages which lead to neurological disorders. Thus, this study has demonstrated the deleterious role of C3d when it is bound to a self-antigen in the course of autoimmune diseases

L'activation du complément participe au rejet de xénogreffe par attaque de l'endothélium en augmentant sa perméabilité vasculaire, en favorisant l'adhésion des leucocytes et la formation d'un environnement pro-coagulant ou en endommageant directement les cellules hétérologues. Dans la première partie de ce travail, nous avons montré, dans le modèle de xénogreffe homme/porc in vitro mettant en contact des cellules endothéliales et du sérum humain, que le dépôt des fragments C3bi et C5 humains présents à la surface des cellules xénogéniques atteint un plateau dés 30 minutes tandis que la fixation du complexe terminal C5b-9 humain atteint son maximum après 90 minutes. Dans ce système, nos résultats suggèrent une efficacité du C5b-9 à former préférentiellement le complexe membranaire puisque la production de C5b-9 soluble (12pM) est mille fois moins importante que la quantité de C5b-9 membranaire (12nM) formé à la surface des cellules hétérologues. La libération des anaphylatoxines C3a et C5a augmente en fonction du temps. La production de C3a est linéaire pendant les 90 premières minutes. Ainsi le clivage de C3 est effectué par la C3 convertase classique (C4b2a) sans le recrutement secondaire de la voie alterne. Nous avons déterminé que 20% des cellules xénogéniques sont lysées par le sérum humain à quatre heures. Cependant, l'incubation des cellules de porc avec du sérum humain décomplémenté par chauffage provoque la libération de 7% de chrome radioactif à quatre heures suggérant un effet cytotoxique du sérum humain complément-indépendant. Nous avons étudié l'effet d'un dérivé sulfaté de dextrane (CMDBS25) soluble sur l'activation du complément induite par les cellules endothéliales dans le modèle homme/porc in vitro. Le CMDBS25 (25mg dans l'essai) inhibe plus de 80% l'activation du complément humain ainsi que la libération des anaphylatoxines C3a et C5a. La même dose de CMDBS25 supprime totalement le dépôt des fragments d'activation C3b/bi et C5 humains liés à la surface des cellules de porc ainsi que la formation du complexe terminal C5b-9 à la surface des cellules et la production du complexe soluble C5b-9. Cependant, le CMDBS25 inhibe seulement de 42% la lyse des cellules xénogéniques. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons mis en évidence que le Séphadex G active le complément de rat in vitro. Après avoir montré l'efficacité du CMDBS25 à inhiber l'activation du complément de rat induite par le Séphadex G25 in vitro, nous avons testé l'effet inhibiteur du polymère sulfaté sur l'activation systémique du complément de rat dans un modèle expérimental in vivo " mimant " une situation de rejet xénogénique. Le CMDBS25 supprime totalement pendant deux heures l'activation systémique du complément de rat Lewis et de façon partielle les deux heures suivantes. Des expériences de xénotransplantation cardiaque rat/cobaye montrent que le CMDBS25 prolonge la survie du greffon discordant de façon significative (p<0. 001). Le dérivé sulfaté de dextrane (CMDBS25), inhibiteur soluble des deux voies d'activation du complément pourrait ainsi être un agent thérapeutique potentiellement capable de prévenir le rejet de xénogreffe.

Le système nerveux des invertébrés présente des caractéristiques fonctionnelles différentes de celles des vertébrés. Chez la sangsue Hirudo medicinalis, modèle d’étude privilégié en neurobiologie, une réparation efficace de la chaîne nerveuse est possible après lésion. Ce processus physiologique nécessite la mobilisation des cellules microgliales présentes au sein au système nerveux de la sangsue et rappelle certaines phases d’une réaction inflammatoire. Une recherche des effecteurs moléculaires impliqués dans ce recrutement cellulaire a été entreprise. Une protéine homologue au facteur du complément humain C1q, nommée HmC1q, a été caractérisée et a été montrée comme impliquée dans le phénomène d’accumulation précoce de la microglie. En effet, constitutivement exprimée au sein des neurones, HmC1q s’accumule directement au niveau de la lésion du connectif et a été démontrée capable d’augmenter le recrutement d’une sous-population de cellules microgliales en réponse à la lésion. HmC1q se comporte ainsi comme une cytokine à activité chimio-attractante. La production d’une forme recombinante en levure de type Pichia pastoris a permis ensuite de préciser les modalités d’action de ce nouveau facteur chimiotactique, fortement actif au sein du système nerveux de la sangsue. Les expériences de cytométrie en flux, d’immunopréciptation et de chimiotactisme réalisées avec un anticorps anti-gC1qR plaident pour l’existence d’une structure réceptrice homologue au gC1qR des vertébrés sur la sous-population réactive à HmC1q.Par ce travail, il a été mis en évidence, pour la première fois dans le SNC d’un invertébré, l’existence d'une « nouvelle cytokine » HmC1q, ayant une homologie avec la protéine C1q des vertébrés, mais également faisant partie de la vaste famille des cytokines C1q-TNF. Les résultats originaux obtenus suggèrent que HmC1q puisse avoir un rôle-clé dans le dialogue neurone-glie nécessaire au maintien de l’intégrité du système nerveux
The nervous system of invertebrates has functional characteristics different from those of vertebrates. In the leech Hirudo medicinalis, a well-recognized model in neurobiology, the nerve cord repair might be effective after injury. This physiological process requires the mobilization of microglial cells present in the leech nervous system and seems to mimic some key-phases of an inflammatory reaction.A search of the effector molecules involved in this cell recruitment was undertaken. A protein homologous to human complement factor C1q, named HmC1q, was characterized and was shown to be involved in the early accumulation of microglia. Indeed, constitutively expressed in neurons, HmC1q is directly expressed on the cut end of the connective and, in response to the injury, has been shown to increase the recruitment of a subpopulation of microglial cells. Thus HmC1q behaves as a chemoattractant cytokine. The production of its recombinant form in the yeast Pichia pastoris enabled us to specify the molecular mechanisms by which this new chemoattractant, might be highly active in the leech nervous system. The experiments carried out by flow cytometry, immunopreciptation and in chemotaxis analysis that were performed with an anti-gC1qR, argue for the existence of an human homologous gC1qR-like receptor at the surface the reactive of microglial cell subpopulation reactive to HmC1q. By this work, it was shown, for the first time in the CNS of an invertebrate, the existence of a « new cytokine » HmC1q, homologous to the vertebrate protein C1q, but also belonging to the vast C1q-TNF cytokine family. Finally the present original results suggest that HmC1q may have a key role in neuron-glia dialogue that is essential to maintain the integrity of the nervous system

Les troubles de la mémoire sont une des symptômes invalidants de la sclérose en plaques (SEP) qui peuvent être présents dès les premiers stades de la maladie. Les travaux précédents réalisés au sein du laboratoire ont identifié des altérations synaptiques et dendritiques au sein du gyrus denté de l’hippocampe en association avec une forte activation microgliale qui pourraient être le substrat des déficits mnésiques. Néanmoins, la voie moléculaire conduisant à une telle neurodégénérescence hippocampique reste à éclaircir.Dans cette étude, nous avons d'abord testé l'expression des gènes impliqués dans les interactions microglie-neurone au sein du gyrus denté de souris au stade précoce d'encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE). Nous avons trouvé une surexpression sélective des gènes impliqués dans la voie du complément. Comparativement à des souris contrôles, le composé central du complément, C3, présentait la plus forte augmentation de son transcrit dans l’EAE par un facteur supérieur à 10, ce qui a été confirmé par la quantification de la protéine C3. Il n'y avait pas d'augmentation des composants en aval de C3 et notamment pas de modification de la voie terminale C5. Une approche en hybridation in situ couplée à de l’immunofluorescence a montré que le C3 était principalement produit par les cellules microgliales activées.Par la suite, nous avons utilisé deux approches différentes pour inhiber le composant C3 du complément. L'inhibition pharmacologique de C3 par l'administration quotidienne d'acide rosmarinique (RMA) chez des souris EAE était suffisante pour prévenir la perte dendritique des neurones granulaires, la phagocytose microgliale des synapses et aussi les altérations mnésiques alors qu’une forte activation de la microglie était toujours présente. De même, les dendrites granulaires et les épines étaient protégées lorsque l'EAE était induite chez des souris déficientes en C3 (C3KO), ce qui se traduisait par des performances mnésiques préservées.Au total, ces travaux de thèse mettent en évidence le rôle central de la protéine C3 dans la neurodégénérescence précoce au sein de l'hippocampe et la détérioration de la mémoire. Ces résultats ouvrent la voie vers de nouvelles stratégies neuroprotectrices dans la SEP pour prévenir les troubles cognitifs via des inhibiteurs microgliaux comme le RMA
Memory impairment is one of the disabling manifestations of multiple sclerosis (MS) that could be present from the early stage of the disease. Hippocampal synaptic dysfunction and dendritic loss in association with microglia activation have been suggested in previous work done in our laboratory as the substrate for memory deficit. However the main molecular mechanistic pathways driving such hippocampal neurodegeneration are still to elucidate.In this study, we first tested the expression of genes involved in microglia-neuron interactions within the dentate gyrus of early-stage experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mice. We found a selective overexpression of genes involved in the complement pathway. Compared to control CFA-mice, the central complement component C3 showed the strongest upregulation by a factor of 10, which was confirmed by quantification of C3 protein, while there was no increase of downstream components such as the terminal component C5. In situ hybridization coupled with immunofluorescence showed that C3 transcripts were mainly originating from activated microglial cells.Secondly, we used two different approaches to inhibit C3 complement component. Pharmacological inhibition of C3 by daily administration of rosmarinic acid (RMA) in EAE mice was sufficient to prevent early dentate gyrus dendritic loss, microglial phagocytosis of synapses and early memory impairment, while microglia activation was still present. Similarly, dentate gyrus dendrites and spines were protected when EAE was induced in C3 deficient mice (C3KO) which translated into preserved memory performances.Altogether this PhD work highlights a central role of C3 in early hippocampal neurodegeneration and memory impairment in EAE. These results pave the way toward new neuroprotective strategies in MS to prevent cognitive deficit, with microglial inhibitor such as RMA

La survenue d'anticorps neutralisant le facteur VIII de la coagulation (FVIII) chez les patients hémophiles A constitue un échec thérapeutique majeur. Si les étapes effectrices de la réponse immunitaire, la nature des cellules immunitaires impliquées et les propriétés des anticorps ont été largement documentées, les étapes précoces de la réponse immunitaire restent mal connues et constituent l'objet de ma thèse. La première partie de ma thèse aborde le rôle du microenvironnement rencontré par le FVIII une fois administré in vivo, notamment le rôle des molécules du complément. Acteur majeur de l'immunité innée, le système du complément participe également aux réponses immunitaires adaptatives et peut interagir avec la cascade de la coagulation. Alors que le complément est impliqué dans les réponses immunitaires contre des agents pathogènes, son implication dans les réponses immunitaires dirigées contre les protéines thérapeutiques n'a jamais été décrite jusqu'à présent. Je me suis donc intéressé au potentiel rôle des molécules du complément dans l'immunogénicité du FVIII thérapeutique.La seconde partie de ma thèse aborde l'implication de la structure du FVIII pour sa reconnaissance par le système immunitaire. Ainsi, a-t-il été démontré l'importance du domaine C1 du FVIII pour sa prise en charge par les cellules du système immunitaire in vitro et pour son immunogénicité in vivo. En raison des fortes homologies de structure entre les domaines C1 et C2, je me suis intéressé au rôle potentiel du domaine C2 dans la capture du FVIII par les cellules présentatrices d'antigènes et l'élaboration de la réponse immunitaire anti-FVIII
Occurrence of pro-coagulant factor VIII (FVIII) neutralizing antibodies in hemophilia A patients constitutes a major therapeutic failure. While the effector steps of the immune response, the nature of the involved immune cells and the antibodies properties have been well-reported, the early stages of the immune response are poorly described and constitute the topic of my PhD thesis. The first part of my thesis deals with the role of the microenvironment encountered by FVIII once administered in vivo, especially the role of complement system molecules. While complement system is a major actor of the innate immunity, it also participates to adaptive immune responses and can interact with the coagulation cascade. Though complement is involved in immune responses against pathogens, its contribution to immune responses against therapeutic proteins has never been reported so far. Therefore I have investigated the potential role of the complement system in the immunogenicity of therapeutic FVIII. The second part of my thesis focuses on the involvement of FVIII structure for its recognition by the immune system. It has been demonstrated that FVIII C1 domain plays a major role of its uptake by immune cells in vitro and its immunogenicity in vivo. Because of strong structural homologies between C1 and C2 domains, I investigated the potential role of FVIII C2 domain for its endocytosis by antigen presenting cells and the elicitation of the anti-FVIII immune response

Les épilepsies temporales mésiales (ETM) humaines sont la forme la plus fréquente et la plus sévère d’épilepsies partielles et sont très fréquemment réfractaires aux médicaments anti-épileptiques. Elles représentent à ces titres un véritable enjeu à la fois médical, scientifique et économique. Les ETM se développent généralement à la suite d’une atteinte du système nerveux central comme les traumatismes crâniens, les infections, ou les convulsions fébriles. Cet événement initial entraînerait une série d’événements cellulaires et moléculaires dans des aires spécifiques du cerveau. Ces modifications confèrent progressivement de nouvelles propriétés au tissu épileptogène, et conduiraient au développement de crises épileptiques spontanées récurrentes. Les crises limbiques sont souvent associées à la sclérose de l’hippocampe, cependant différentes études ont également souligné le rôle majeur que joue le cortex entorhinal (CE) dans le réseau épileptogène. De plus, le CE présente moins d’altérations histopathologiques que l’hippocampe et les modifications moléculaires et cellulaires qui lui sont associées sont encore peu caractérisées. Malgré les avancées dans la compréhension de la pathogenèse des épilepsies, les mécanismes physiopathologiques des ETM sont encore mal connus et parmi les quelques études à grande échelle réalisées chez l’Homme aucune n’a analysé le CE. Un premier crible à grande échelle par cDNA microarray, et dans un second temps des expériences de validation par RT-PCR quantitative ont permis d’identifier 6 gènes différentiellement exprimés dans le CE de patients ETM en comparaison avec le cortex temporal externe (CTE) (zone non épileptogène) issu des mêmes patients (contrôles internes), ainsi qu’avec quatre contrôles autopsiques non épileptiques. Deux gènes codant pour des récepteurs de neurotransmetteurs (HTR2A et NPY1R) et un gène codant pour une protéine, FHL2, s’associant à la préséniline et à la sous unité mink du canal potassium KCNE1 sont sous-exprimés et trois gènes codant pour des protéines du système immunitaire et du complément (CD99, CD74 et C3) sont sur-exprimés dans le CE des patients ETM. Les expériences de Western blot quantitatif et d’immunomarquage ont ensuite permis de confirmer la sous-expression de NPY1R dans le CE des huit patients MTLE testés et la surexpression de C3 dans le CE de 7 parmi 11 patients testés. De plus, les expériences d’immunomarquage ont révélé l’existence d’une activation locale du système du complément spécifiquement et exclusivement dans le cortex entorhinal des patients, sous forme d’infiltrats périvasculaires de leucocytes C3+ et / ou de dépôts de C3 et/ou de complexes C5b-9 (membrane attack complex : MAC) à la surface de neurones dans le CE de la majorité des patients analysés (9 sur 11). Ces résultats montrent que la dérégulation locale des systèmes de neurotransmission et l’activation du système du complément sont fréquemment associées à l’évolution des MTLE humaines. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement de nouvelles stratégies préventives, diagnostiques et thérapeutiques, notamment ciblées sur les gènes candidats identifiés dans cette étude
Human mesial temporal lobe epilepsies (MTLE) are the most frequent form of partial epilepsies and display high frequency of drug-resistance. They represent a major medical and scientific issue and a major health care problem. Generally, epilepsy may develop as a consequence of a brain-damaging insult such as head trauma, stroke, brain infection, or febrile seizure (FS). This initial insult triggers a cascade of progressive and parallel cellular and molecular events in specific areas of the brain, which may in turn confer new properties to the epileptogenic tissue, and result in the development of spontaneous recurrent seizures. While limbic seizures have often been associated with hippocampus sclerosis, several studies have also highlighted the major role that play the entorhinal cortex (EC) in MTLE. EC displays les dramatic histological changes than the hippocampus, with few or no detectable cell loss, and the molecular and cellular events have been little studied. Despite some progress in the understanding of the pathogenesis of human MTLE, their molecular bases remain mainly undetermined. Few large-scale studies have been performed in human MTLE, and none has analysed the entorhinal cortex. A two-step transcriptional analysis consisting of cDNA microarray experiment followed by quantitative RT-PCR validations was performed in the entorhinal cortex (epileptogenic area) of MTLE patients, as compared with lateral temporal neocortex (LTC)(non-epileptogenic control area) obtained from the same patients as well as to non-epileptic autopsic controls. Six consistently dysregulated genes were identified: three up-regulated genes encode proteins involved in the immune response : CD99, CD74, C3; two downregulated genes encode neurotransmitter receptors NPY1R, HTR2A and a third one FHL2 encodes a protein associating with the KCNE1 (mink) potassium channel subunit and with presenilin-2. Analysis of the qualitative and quantitative changes at the protein level, led to the confirmation of NPY1R downregulation and C3 upregulation by western blot and immunohistochemistry respectively. Furthermore, immunohistochemistry experiment revealed the existence of perivascular infiltration of C3 positive leucocytes and/or detected C3 and membrane attack complexes on a subset of neurons within the EC of nine out of the eleven MTLE patients. Overall our data indicate that local dysregulation of the neurotransmission and complement system is a frequent event in human MTLE. These data open new avenues for understanding the molecular basis of these epilepsies. It also provide new perspectives for the future development of preventive, diagnostic and therapeutic strategies, directed towards the molecular targets that we have identified

Ce travail est consacré à l'analyse des relations existant entre la cellule endothéliale et le complément au cours de l'inflammation. Une première approche a consisté en une étude in vitro de la synthèse constitutive et de sa régulation, sous l'influence de cytokines pro-inflammatoires et d'un agent pharmacologique anti-inflammatoire, par les cellules endothéliales, de protéines essentielles de la voie alterne: les protéines activatrices C3 et facteur B et les protéines inhibitrices facteur H et facteur I. Les résultats suggèrent que, in vivo, les cellules endothéliales seraient orientées, dans des conditions physiologiques normales, vers une fonction inhibitrice de l'activation spontanée du complément par la voie alterne, c'est-a-dire vers une fonction anti-inflammatoire. Cytokines et corticoïdes influenceraient les synthèses dans un sens, qui respectivement, favoriserait l'activation locale du complément ou au contraire renforcerait son inactivation constitutive. L'existence de ces synthèses locales hautement régulées des protéines de la voie alterne du complément constituerait de nouveaux éléments dans les processus d'activation de l'endothélium au cours de l'inflammation et d'inactivation de l'endothélium au cours de glucocorticothérapie. La deuxième approche est une étude clinique de l'implication du complément au cours de pathologies inflammatoires de l'endothélium à complexes immuns: les vascularités leucocytoclasiques cutanées. Elle a permis de démontrer: i) l'intérêt, dans l'exploration clinique du complément au cours de ces maladies, de nouveaux dosages plasmatiques des marqueurs d'activation initiale et finale, le fragment C3d,g et le complexe d'attaque membranaire (CAM); ii) l'implication de l'intégralité de la cascade, jusqu'à formation du CAM  à la surface de l'endothélium, dans la genèse des lésions vasculaires; iii) la responsabilité potentielle prépondérante des immunoglobulines A dans l'activation pathologique du complément; iv) l'intervention d'un processus de contrôle de l'activation par les protéines régulatrices du complément. A la fois source et cible du complément, l'endothélium pourrait potentialiser le processus inflammatoire local, mais aussi subir les dommages consécutifs à son activation pathologique

Streptococcus pneumoniae est un pathogène humain majeur causant des pneumonies, méningites et septicémies. Pour assurer sa survie et sa dissémination le pneumocoque déploie un ensemble de facteurs de virulence favorisant l'invasion des tissus et l'évasion du système immunitaire. Une classe particulière de protéines dites « moonlighting », ne sont associées à aucun système d'export connu et pourtant se trouvent localisées en surface du pneumocoque. Les protéines « moonlighting » sont des protéines cytoplasmiques conservées, localisées dans divers compartiments cellulaires et présentant des fonctions additionnelles. La glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) est retrouvée en surface de nombreuses cellules et exerce divers rôles dans les processus de virulence d'organismes pathogènes. La GAPDH de surface du pneumocoque agit comme un facteur de virulence en recrutant le plasminogène / la plasmine de l'hôte, ce qui facilite l'invasion bactérienne à travers la matrice extracellulaire et les barrières endothéliales et épithéliales. Cependant, les mécanismes permettant l'export et la fixation de la GAPDH à la surface de la bactérie n'avaient pas encore été découverts. Ce travail démontre que la GAPDH est relarguée par lyse cellulaire et s'associe au peptidoglycane. C1q, un composant clé de la voie classique du complément, est un acteur majeur dans la réponse aux infections microbiennes et peut également détecter des éléments nocifs du soi-altéré comme les cellules apoptotiques. L'usage d'approches expérimentales complémentaires a permis d'identifier la GAPDH comme un partenaire de C1q quand elle est exposée en surface de S. pneumoniae et de cellules apoptotiques humaines. Néanmoins et de manière plutôt inattendue, seule la GAPDH du pneumocoque active la cascade du complément à la différence de la protéine homologue humaine. Ces résultats encouragent la poursuite d'études afin de comprendre comment la reconnaissance par C1q de deux protéines très proches peut conduire à de telles différences sur ses propriétés d'activation du complément
Streptococcus pneumoniae is a major human pathogen, which causes pneumonia, meningitis and septicemia. To insure its survival and dissemination, the pneumococcus deploys an array of virulence factors promoting invasion of tissues and evasion from the immune system. A particular class of proteins not associated with any known export system, the moonlighting proteins, is found at the pneumococcal surface. Moonlighting proteins are conserved cytoplasmic metabolic enzymes or molecular chaperones localized in various cellular compartments and exhibiting additional functions. The glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) is found at the surface of numerous eukaryotic and prokaryotic cells, and display diverse roles in the virulence processes of pathogenic organisms. The pneumococcal surface GAPDH acts as a virulence factor by binding to host plasminogen/plasmin, which facilitates the bacterial invasion through the extracellular matrix and the endothelial and epithelial cell barriers. However, the mechanisms leading to the GAPDH export and binding to the bacterial surface had not been deciphered yet. This work demonstrates that the GAPDH is released upon cell lysis and associates with the peptidoglycan. C1q, a key component of the classical complement pathway, is a major player in the response to microbial infection and has been shown to detect noxious altered-self substances such as apoptotic cells. The use of complementary experimental approaches allowed the identification of the GAPDH as a C1q partner when exposed at the surface of S. pneumoniae and human apoptotic cells. However, and rather unexpectedly, the pneumococcal GAPDH activates the complement cascade unlike the human one. Those results encourage further studies in order to understand how C1q recognition of two closely related proteins can lead to such striking differences on its complement activation properties

L’activation du système complément, qui se produit à la suite d’une infection ou d’un trauma, génère de puissants signaux moléculaires capables d’initier la réaction inflammatoire. Parmi ces signaux, le fragment actif C5a permet de recruter sur le site lésé les cellules qui expriment son récepteur (le C5aR/CD88). Bien que le C5aR/CD88 soit initialement connu pour être exprimé par les cellules inflammatoires, il est établi que de nombreuses cellules non immunitaires expriment ce récepteur indiquant son implication dans d’autres processus. Nos résultats ont permis de démontrer que l’activation du système du complément au niveau de la pulpe dentaire est réalisée non seulement à partir des protéines plasmatiques mais aussi des protéines synthétisées par les fibroblastes pulpaires. Ainsi, l’activation locale du système du complément, produit à la suite d’une infection, d’un trauma ou de l’application de biomatériaux, génère du C5a qui induit la migration des cellules progénitrices. Ce travail démontre pour la toute première fois l’implication du fragment actif C5a dans le recrutement de progénitrices pulpaires, étape clef au processus de régénération pulpo-Dentinaire. Ces travaux pourraient donc constituer une piste sérieuse dans l’établissement de nouvelles thérapies permettant de cibler les cellules progénitrices au cours du processus de régénération
After tissue injury or infection, Complement activation provides powerful signals initiating the inflammatory reaction. These events are mediated by biologically active fragments such as C5a which attracts cells expressing its receptor (C5aR/CD88) to the injury site. Besides inflammatory cells as the main C5aR-Expressing cells, various tissue cells have been reported to express this receptor suggesting its involvement in other processes. In order to investigate the possible relationship between complement activation and pulp regeneration, we investigated Complement activation in the dental pulp and progenitor cell migration from their perivascular niches to the pulp injury site to initiate the regeneration process.Our results indicate that complement activation in the dental pulp is the result of both plasma and fibroblast secreted complement proteins. Thus upon local complement activation, which can occur after pathological injury or biomaterials application, C5a induces pulp progenitors’ migration which is critical in initiating the regenerative processes. To our knowledge, this is the first work to demonstrate the involvement of C5a biologically active fragment in the recruitment human pulp progenitor cells. This may provide a useful future therapeutic tool in targeting the progenitor cells in a dentin/pulp regeneration process

La synaptogenèse est un processus précis : chaque type d'afférences innerve des domaines subcellulaires post-synaptiques spécifiques sur leur cible neuronale. Pour tester si cette spécificité est contrôlée par une combinaison unique de molécules à chaque synapse, j'ai utilisé le système olivo-cérébelleux comme modèle. Deux afférences excitatrices, les fibres parallèles issues des grains et les fibres grimpantes issues des neurones de l'olive inférieure, innervent des territoires distincts sur la même cible, la cellule de Purkinje. Une analyse comparative des profils d'expressions génique des grains et des neurones olivaires a montré que ces derniers expriment une plus grande diversité de protéines membranaires et sécrétées liées au système immunitaire. De plus, chaque type d'afférences exprime une combinaison spécifique de gènes liés à la voie du complément du système immunitaire inné. Parmi ceux-ci, la protéine sécrétée C1QL1, de la famille C1Q, joue un rôle instructif pour l'établissement du territoire d'innervation des fibres grimpantes sur les cellules de Purkinje. La protéine membranaire liée au complément SUSD4 assure, quant à elle, la maturation fonctionnelle et la stabilisation de ces synapses. Sachant que la protéine CBLN1 de la famille C1Q contrôle la synaptogenèse des fibres parallèles, ces résultats montrent que les différents membres de la famille C1Q sont des déterminants importants de l'identité et de la connectivité spécifique de chaque synapse excitatrice dans le cortex cérébelleux. Cette étude porte un nouvel éclairage sur l'hypothèse de la " chemoaffinité " et de sa participation à la formation de circuits neuronaux spécifiques et précis
Synapse connectivity occurs in a precise manner such that no two types of afferents innervate the same postsynaptic subcellular domain. To test whether this specificity is controlled by a unique combination of molecules at each synapse, I used the olivo-cerebellar circuit as a model. There, two excitatory inputs, the Parallel fibers originating from granule cells and Climbing fibers originating from inferior olivary neurons, innervate distinct territories on the same target neuron, the Purkinje cell. Comparative gene expression analysis of these two inputs showed that the inferior olivary neurons express a greater diversity of genes encoding membrane and secreted proteins belonging to immune system-related pathways. Moreover, each input expresses a specific combination of complement-related genes. Among these, I identified the functional roles of two novel candidate genes specifically expressed by inferior olivary neurons. Secreted C1Q-related protein C1QL1 plays an instructive role in specifying Climbing fiber innervation territory on Purkinje cells, while membrane-bound complement control-related protein SUSD4 ensures the acquisition of proper functional properties of Climbing fiber synapses and their long-term stability. Given that C1Q-related CBLN1 promotes Parallel fiber synaptogenesis, these results show that different members of the C1Q family are important determinants of the identity and specific connectivity of each excitatory synapse in the cerebellar cortex. This study provides novel insights into the “chemoaffinity code” that controls subcellular specificity at each synapse type during the formation of neural circuits

Le système du complément est une cascade de défense immunitaire complexe et étroitement régulée, conduisant à des dommages tissulaires lorsqu’il est suractivé. L’hème, un motif moléculaire de danger dérivant de l’hémolyse, est capable d’activer le complément dans le sérum et à la surface des cellules endothéliales (CE) in vitro, suggérant un rationel pour examiner l’impact de l’activation du complément dans les maladies hémolytiques. L’objectif de ce projet était d’étudier si et comment l’hémolyse intravasculaire active le complément in vivo, et de comprendre les mécanismes sous-jacent conduisant à l’acquisition d’un phénotype activateur du complément par les CE afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons détecté des dépôts de complément, de C3 et de C5b-9, dans des reins de patients souffrants de nephropathie drépanocytaire ainsi que dans un modèle murin de drépanocytose. Nous avons mis en place un modèle murin d’hémolyse intravasculaire massive, déclenchée par la phénylhydrazine (PHZ), et caractérisé l’atteinte rénale. Nous avons détecté des dépôts de C3 au niveau des reins de ces souris. Cet effet a été inhibé par l’administration préventive du scavenger naturel de l’hème, l’hémopexine (Hx), et reproduit par des injections d’hème libre, démontrant une activation hème-dépendante in vivo. Les microvésicules d’érythrocytes (MVs) drépanocytaires représentent une source naturelle d’hème, de par leur concentration en hème trois fois supérieure à celle observée chez les donneurs sains. Nous avons démontré que les MVs drépanocytaires activent le complément dans le sérum et sur les CE, de manière en partie hème-dépendante. Ces résultats révèlent le rôle activateur de l’hème sur le complément dans les maladies hémolytiques. De plus, nous avons démontré que l’interaction de l’hème avec TLR4 peut en partie expliquer les dépôts de C3 sur l’endothélium in vivo et les CE in vitro. L’utilisation d’un inhibiteur de TLR4, le TAK-242, a réduit de 50% les dépôts de complément sur les CE, confirmé par une réduction des dépôts sur l’endothélium vasculaire chez des souris TLR4-/- traitées par PHZ ou hème. De plus, nous avons montré que ces dépôts hème/TLR4 dépendants sont liés à l’expression rapide de P-sélectine, qui recrute C3b et C3(H2O) à la membrane des CE, révélé par l’analyse des interactions protéiques en temps réel et l’utilisation d’un anticorps bloquant anti-P-sélectine. Ensemble, ce projet démontre que l’hème et les MVs sont les produits dérivés de l’hémolyse responsables de l’activation du complément. Au niveau cellulaire, l’induction par l’hème d’un phénotype activateur du complément des CE dépend de l’axe TLR4/P-sélectine, induisant des dépôts de C3 à la surface cellulaire. Ainsi, ces études soulignent les bénéfices potentiels de l’Hx et du TAK-242 contre l’activation du complément dans des pathologies associées à une hémolyse
Complement system is a complex and tightly regulated innate immune defensive cascade, which can promote tissue damage, when overactivated. Hemolysis-derived danger associated molecular pattern heme is able to activate complement in serum and on endothelial cells (EC) in vitro, providing a rational for scrutinizing the impact of complement activation in hemolytic diseases. The objectives of this work were to study whether and how intravascular hemolysis induces complement activation in vivo, and to understand the underlying mechanism that leads to the acquisition of a complement activating phenotype of the endothelium in order to identify novel therapeutic strategies. We found complement deposits, including C3 activation fragments and C5b-9, within kidneys of patients with sickle cell disease (SCD) nephropathy (a prototypical hemolytic disease) as well as in a mouse model of SCD. We set up and characterized the renal injury of a mouse model of massive intravascular hemolysis, triggered by injection of phenylhydrazine (PHZ). We revealed C3 deposition within kidneys of the PHZ-treated animals. It was prevented by heme scavenging with hemopexin (Hx) and reproduced by injections of free heme, thus demonstrating the importance of heme for the complement activation in vivo. SCD erythrocytes microvesicles (MVs), are a pathologically relevant source of labile heme, since they carry three times more heme on their surface compare to MVs from healthy donors. We demonstrated that MVs, generated from SCD erythrocytes, activate complement in human serum and on EC surface, in part on a heme-dependent manner. These data highlight the importance of heme as a complement activator in hemolytic diseases. Further, we found that the C3 activation fragments deposits on endothelium in vivo and on EC in vitro can be in part explained by interaction of heme with TLR4. Indeed, the use of a specific inhibitor of TLR4, TAK-242, reduced about 50% the complement deposits on EC surface and such deposits on vascular endothelium in PHZ- or heme-injected mice were attenuated TLR4-/- mice. Moreover, we found that heme/TLR4-dependent complement deposition was mediated by the rapid expression of P-selectin, which in turn, recruited C3b and C3(H2O) on the EC surface, as evidenced by real time protein interaction analyses and using of blocking antibodies. Together our results demonstrated that heme and erythrocytes MVs are the hemolysis-derived products which promoted complement activation. At cellular level, heme induced complement-activating phenotype of EC by triggering TLR4/P-selectin axis and resulting in C3 activation fragments on cell surface. Together, these studies underline the potential benefits of Hx and TAK-242 against complement activation in pathologies related to hemolysis

Le système GPS est un précieux outil en navigation, en géodésie et en métrologie du temps. Des comparaisons d'horloges peuvent être effectuées sur de très longues distances, de façon opérationnelle, avec une exactitude de l'ordre de la nanoseconde. En navigation aérienne, outre les dégradations volontaires du système, les principales limitations du GPS sont ses indisponibilités partielles, et son défaut d'intégrité. Le projet d'un complément au GPS consiste à générer à bord de satellites géostationnaires -par asservissement au sol- des signaux de mêmes caractéristiques radioélectriques que ceux du système GPS, et synchrones de ces derniers. L’objectif d'un tel complément est, grâce à la surveillance du GPS et à l'accroissement de sa disponibilité, l'homologation du système comme moyen unique de navigation dans les phases de vol précédant l'approche précise. L’expérimentation d'un complément européen au GPS confirme la faisabilité du projet. Des méthodes de prédiction du temps du GPS sont étudiées, pour différents modèles de SA. Une méthode originale de synchronisation d'horloges en temps réel, sans transfert de données, est également proposée. Cette possibilité, combinée à la prédiction du temps du GPS serait du plus grand intérêt pour la mise en place d'un système global de diffusion des corrections au message GPS
The Global Positioning System is a valuable tool in navigation, geodesy and time metrology. Operational time transfer can be performed over very long baselines at the nanosecond level. In civil aviation though, aprt from intentional degradation, outages and lack of integrity are the main shortcomings of GPS. The project of a complement to GPS consist of generating on board a geostationary stellite, through servo-control from the earth, GPS-like signals and a time scale synchronized in GPS time. The goal is to enable GPS to be ratified as a stand-alone en route navigation means, thanks to a space segment augmentation and the monitoring mission of the complement. The European Complement to GPS experiment confirms the feasibility of the project. Alternative methods for GPS time restitution are studied, with different SA models. An original method for real time clock synchronization, without data transfer, is also proposed. This possibility, combined with GPS time prediction, would be of great interest for a Wide Area Differential Global Positioning System

Chez les vertébrés, le foie est un des organes majeurs du métabolisme en étant le siège de la régulation de différentes voies du métabolisme qui contrôlent l’homéostasie du glucose et des lipides. En se basant sur des travaux de recherche récents suggérant que le système de conjugaison de l'ubiquitine est engagé en réponse à différents signaux métaboliques, nous avons réalisé une analyse protéomique globale dans le but d’identifier des protéines ubiquitylées dans le foie de souris soumises á un protocole de jeûne – re-nourrissage. Parmi les 117 protéines différemment ubiquitylé sur le jeûne ou le re-nourrissage, nous avons identifié complément 3 (C3) dans le foie de souris réalimentées. Nous avons observé qu'un produit d'activation de C3, C3a, est ubiquitylé dans les hépatocytes primaires traités avec les médias riches en nutriments. Ainsi, nous proposons que l'ubiquitination de C3 joue un rôle dans la régulation des fonctions inflammatoires ou métaboliques de C3 dans le foie
In vertebrates, the liver has developed to be a major metabolic organ able to control glucose and lipid homeostasis. It activates or inhibits specific pathways in a regulated manner, depending on the metabolic state of our organism. Based on the emerging experimental evidence suggesting that the ubiquitin conjugation system is engaged in response to different metabolic cues, we conducted a global proteomic analysis to identify metabolic pathways modified by ubiquitylation. To this end, we used livers of mice subjected to a fasting – refeeding protocol. Amongst the 117 proteins differentially ubiquitylated upon fasting or refeeding conditions, we identified complement 3 (C3) to be ubiquitinated in livers of refed mice. We observed that an activation product of C3, C3a, is ubiquitylated in primary hepatocytes treated with nutrient-rich media. Thus, we suggest that the ubiquitylation of C3 plays a role in the regulation of inflammatory or metabolic functions of C3 in the liver

Les nanomédecines injectées par voie intraveineuse interagissent avec les éléments biologiques qui les entourent dans le compartiment sanguin. Parmi ces interactions, celles avec les protéines sanguines se révèlent être très importantes dans le devenir de ces nanovecteurs, leur conférant une identité biologique influençant leur chemin jusqu’au tissu et aux cellules cibles. La compréhension et le contrôle de ces phénomènes reste un enjeu crucial dans le développement des nanomédecines. Des méthodes permettant une étude facilitée de ces interactions sont nécessaires à cet égard. Les travaux de cette thèse ont eu pour but de développer des méthodes, utilisables en routine, permettant une caractérisation fine des nanomédecines et de leurs interactions avec les protéines plasmatiques, applicables dans un contexte clinique. Ils s’inscrivent dans un projet intitulé « Nano Innovation for CancEr » (NICE, BPI France) regroupant un consortium de partenaires industriels en développement clinique de nanomédecines.Dans un premier temps, un travail bibliographique sur les méthodes actuellement mises en œuvre pour une telle caractérisation ont pu mettre en avant deux limitations majeures. (i) D’une part, la complexité des méthodes actuelles disponibles pour lesquelles la spécificité des équipements et l’expertise requise limitent une utilisation à large échelle. (ii) D’autre part, les propriétés aujourd’hui caractérisées en routine (taille, morphologie globale, charge) ne sont que grossières comparées à la finesse des processus biologiques qui interagissent et « analysent » les nanovecteurs une fois introduits dans le milieu biologique. Ces deux aspects limitent aujourd’hui un développement plus sûr des nanomédecines pour une bonne reproductibilité en clinique et garantir des essais de contrôle qualité fiables.Au cours de nos travaux, nous avons développé des méthodes permettant de répondre en partie à la problématique posée par la caractérisation des nanomédecines. Une méthode d’analyse à haut débit de l’activation du système du complément par immunoélectrophorèse en deux dimensions a été développée et validée. Elle permet l’analyse reproductible de l’activation de la protéine C3. Elle est applicable à l’étude de l’effet de la présence de nanoparticules dans le sérum humain et leur degré d’action sur la cascade du complément. Cette méthode a été utilisée pour mener une étude plus fondamentale du mécanisme de l’activation du système du complément en regard de l’architecture de la surface de nanoparticules.Une deuxième méthode d’étude de l’activation du complément produit par des nanomédecine a été proposée sur la base de la résonnance plasmonique de surface (SPR). Une puce permettant un screening automatisé de l’activation du complément a été développée. L’application de cette méthode comparée à d’autres méthodes d’études de l’activation du système du complément (Immunoélectrophorèse 2D, ELISA) a permis d’identifier des biais lors de leur application à l’évaluation des nanomédecines.Enfin, une approche originale de caractérisation de la surface de nanoparticules a été proposée utilisant des protéines pour sonder la capacité de la surface des nanoparticules à adsorber ou repousser ces dernières. Dans cette méthode, l’électrophorèse capillaire est utilisée comme outil analytique permettant une analyse directe de l’échantillon sans séparation préalable des nanomédecines.Les méthodes développées au cours de ces travaux peuvent être appliquées à la caractérisation de nanomédecines et proposées comme des méthodes de contrôle en routine de façon plus générale. Un développement de la caractérisation dans ce sens constitue l’un des leviers pour une translation plus fructueuse des nanomédecines entrant en phase clinique
Nanomedicines injected intravenously interact with surrounding biological elements in the bloodstream. Among these interactions, those with blood proteins turn out to be very important regarding the becoming of the nanovectors. They acquire a biological identity upon interaction with proteins which influence their path to target tissue and cells. The understanding and mastering of these phenomena remains a crucial issue in nanomedicine development. Methods allowing an easier study of these interactions are needed. The aim of these PhD thesis was to develop such methods, usable on a routine basis in a clinical context, allowing a fine characterization of nanomedicines and their interactions with plasmatic proteins. This PhD is part of the project “Nano Innovation for CancEr” (NICE, BPI France), gathering a consortium of industrials partners developing clinical nanomedicines.In a first time, a bibliographic study about current methods used for such a characterization could identify two major limitations. (i) On one hand, the complexity of current available methods for which the equipment specificity and required expertise prevent their use at a large scale. (ii) On the other hand, properties today characterized on a daily basis (size, morphology, charge) are too rough compared to the sharpness of biological processes who interact and “analyze” the nanovectors introduced in biological media. These two aspects are limiting a safer development of nanomedicines as well as a good reproducibility of their action in clinics.During this thesis, we developed methods allowing a beginning of answer to the wide problematic of nanomedicine characterization. A method for a high throughput analysis of complement activation by nanomedicines via 2D immunoelectrophoresis was developed and validated. It allows the reproducible analysis of protein C3 fragmentation. This method is applicable to the study of the impact of nanoparticles in human serum and their degree of action on the complement cascade. This method has been used for a more fundamental study on complement activation pathways activated according to the architecture of nanoparticles surface.A second method for the study of complement activation produced by nanoparticles has been proposed using surface plasmon resonance (SPR). A chip allowing an automated screening of complement activation has been developed. This method was compared to other methods for complement activation study (2D immunoelectrophoresis, ELISA) and allowed the identification of bias during nanomedicine evaluation.Finally, an original approach for the characterization of nanomedicine’s surface architecture using proteins as molecular probes has been proposed. In this method, capillary electrophoresis has been used as analytical tool to allow a direct analysis of sample without preliminary nanoparticle removal step.Methods developed during this work can be applied to the characterization of nanomedicines and proposed as routine methods for quality control. A development of nanomedicines characterization in this direction constitute one of the lever for a more fruitful translation of nanomedicines entering in clinical phase

À la suite d’une lésion carieuse ou d’un traumatisme, des bactéries infiltrent la pulpe dentaire. Des macrophages de phénotype M1 pro-inflammatoire migrent jusqu’au tissu infecté ou lésé et éliminent les éléments pathogènes par phagocytose. Une fois l’infection maitrisée, les macrophages M2 anti-inflammatoire initient la régénération. Cette thèse a comme objectif d’étudier l’interaction des fibroblastes pulpaires, cellules majoritaire de la pulpe dentaire, avec les macrophages dans l’élimination des bactéries et dans l’initiation de la régénération pulpo-dentinaire. Nos résultats démontrent que les fibroblastes pulpaires sont capables de produire le fragment C3b du Complément, agissant comme une opsonine se fixant à la surface des bactéries et facilitant ainsi leur phagocytose par les macrophages. Les fibroblastes pulpaires, au contact d’éléments pathogènes, stimulent la différenciation des macrophages vers un phénotype M1 pro-inflammatoire, favorable à la sécrétion de facteurs pro-inflammatoires (tel le TNF-α) et à la phagocytose. De plus, les macrophages M1 initient la régénération en recrutant les cellules souches pulpaires. Au contraire, des lésions fibroblastiques exemptes de bactéries stimulent la différenciation des macrophages vers un phénotype M2 anti-inflammatoire. Les macrophages M2 libèrent des facteurs anti-inflammatoires (tel l’IL-10) et stimulent la prolifération de cellules souches pulpaires. Les fibroblastes pulpaires sont un soutien majeur aux macrophages dans l’élimination des bactéries et l’initiation des processus de régénération de la pulpe dentaire
Upon pulp traumatic injuries or carious lesions, bacteria may infiltrate the dental pulp. Pro-inflammatory M1 macrophages are recruited to the infected/injured tissue and eliminate pathogens by phagocytosis. Once the infection is under control, the anti-inflammatory M2 macrophages initiate the regeneration processes. The aim of this thesis is to understand the possible interaction between pulp fibroblasts, the most abundant cell population within the dental pulp, and macrophages leading to bacteria elimination and to the initiation of dentin-pulp regeneration. Our results show that pulp fibroblasts produce the Complement C3b fragment. This fragment acts as an opsonin by binding to salivary and cariogenic bacteria, thus inducing their phagocytosis by macrophages. When pulp fibroblasts are subjected to pathogens, they induce macrophage differentiation into the pro-inflammatory M1 phenotype. This phenotype secretes pro-inflammatory factors, such as Tumour Necrosis Factor (TNF-α) and carries out phagocytosis. The pro-inflammatory M1 macrophages also initiate the regeneration process by inducing dental pulp stem cell recruitment. When fibroblasts are injured without being subjected to pathogens, they promote the macrophage anti-inflammatory M2 phenotype. M2 macrophages release anti-inflammatory factors, such as interleukin 10 (IL-10), and induce dental pulp stem cell proliferation. In conclusion, pulp fibroblasts provide a major support to macrophages in bacteria elimination and represent a major actor in the dental pulp regeneration process. Thus, through their interaction with macrophages, fibroblasts regulate pulp inflammation and regeneration

Les premières étapes de développement du cerveau dépendent fortement de programmes génétiques. Après la naissance, les connexions neuronales deviennent susceptibles d’être remodelées en réponse à des changements de l’environnement. Cette plasticité culmine au cours de fenêtres temporelles appelées périodes critiques. Les mécanismes sous-jacents sont encore mal connus. Dans le cadre de ma thèse, j’ai étudié les mécanismes qui sous-tendent la plasticité des réseaux au cours de deux périodes critiques chez la souris : la période critique de plasticité de dominance oculaire dans le cortex visuel et la période critique de l’élagage synaptique dans le cortex préfrontal. Dans une première étude, je me suis intéressée aux synapses excitatrices dans les interneurones PV du cortex visuel au cours du développement postnatal. Mes résultats suggèrent que la régulation développementale de l’expression de la protéine GRIP1 dans les interneurones PV gouverne la composition des récepteurs AMPA et la plasticité homéostatique des synapses, et pourrait jouer un rôle dans l’ouverture de la période critique du cortex visuel. Dans une deuxième étude, j’ai étudié les conséquences d’une expression élevée du gène du complément C4, qui chez l’homme prédispose à la schizophrénie, sur la maturation corticale. J’ai montré que la surexpression de C4 dans le cortex préfrontal cause plusieurs phénotypes qui, chez l’homme, ont été associés à la schizophrénie : perte d’épines dendritiques, modifications de la transmission portée par les récepteurs NMDA, altérations de la transmission GABAergique et déficits de la mémoire de travail
The early stages of brain development are largely determined by genetic programs. After birth, neuronal connections become susceptible to remodeling in response to changes in the environment. This plasticity culminates during specific time windows termed critical periods. The underlying mechanisms are still poorly understood. In my thesis, I studied the mechanisms underlying network plasticity during two critical periods in mice: the critical period of ocular dominance plasticity in the visual cortex and the critical period of synaptic pruning in the prefrontal cortex. In a first study, I studied the properties of excitatory synapses in PV interneurons of the visual cortex during postnatal development. My results suggest that the developmental regulation of GRIP1 protein expression in PV interneurons governs the composition of AMPA receptors and homeostatic synaptic plasticity, and may play a role in the opening of the critical period in the visual cortex. In a second study, I investigated the consequences of high expression of the C4 complement gene, which in humans predisposes to schizophrenia, on cortical maturation. I showed that overexpression of C4 in the prefrontal cortex causes several phenotypes that in humans have been associated with schizophrenia: loss of dendritic spines, changes in transmission carried by NMDA receptors, alterations in GABAergic transmission and deficits in working memory