Rozprawy doktorskie na temat „Signalisation TGF-beta”

Mon projet de thèse s’inscrit dans le cadre des études visant à comprendre comment les cellules embryonnaires intègrent les différents signaux auxquels elles sont exposées pour s’engager dans une voie de différenciation définie. Il est plus particulièrement centré sur le rôle des protéines Smad dans ces processus et peut se diviser en deux axes de recherche. Le premier a trait au rôle de Mad (Smad1) dans les interactions entre signaux Wnt (Wg) et BMP chez la drosophile. Nous avons pu démontrer que la forme Mad non phosphorylée par le récepteur BMP se lie au complexe transcriptionnel ß-catenin/dTCF et est requise pour le signal Wnt canonique. La phosphorylation de Mad par le récepteur BMP dirige Mad vers la voie BMP, créant la possibilité d’une compétition entre ces deux classes de signaux. Le second axe de recherche concerne le facteur de transcription Smad4 qui est requis pour la transduction des signaux TGF-ß et BMP. J’ai pu identifier trois sites potentiels de phosphorylation par la kinase GSK3 dans la séquence primaire de Smad4. En utilisant de nombreuses techniques de biochimie, j’ai pu montrer que Smad4 est phosphorylé par la kinase Erk, puis par GSK-3 en réponse à un signal FGF. Lorsque Smad4 est doublement phosphorylé, il est reconnu par une E3-ligase, beta-TrCP, ce qui entraine sa polyubiquitination et sa dégradation. La voie Wnt étant capable d’inhiber GSK-3, j’ai pu montrer que Smad4 est stabilisé par des signaux Wnt. Ce mécanisme augmente la sensibilité des cellules aux signaux TGF-beta lorsqu’elles reçoivent également un signal Wnt
During my PhD I studied how cells receive and integrate multiple signals from the extracellular milieu. I focused on Smad proteins and my project can be divided into two parts. My first project was centered on the transcription factor Mad (Smad1) and its requirement for the BMP and Wg pathways. Using a combination of genetic and biochemistry experiments, we showed that Mad is required for Wg signaling both in Tcf reporter gene assays and in vivo in Drosophila. We found that the choice for Mad to transduce Dpp or Wg signals is controlled by C-terminal phosphorylations so that Mad binds to Pangolin and participates in Wg target genes transcription only when not phosphorylated at its C-terminus. This results in a competition between Dpp and Wg controlled by the phosphorylation state of Mad. My second project was focused on the tumor suppressor Smad4. When I first joined the lab, I identified three new potential GSK3 phosphorylation sites in Smad4 primary sequence. I used a home-made phospho-specific antibody to demonstrate that FGF or EGF stimulation trigger Erk-mediated phosphorylation of Smad4 which primes subsequent GSK3 phosphorylations. These phosphorylations regulate a transcription activation domain located in Smad4 linker region and generate a Wnt-regulated phosphodegron recognized by the E3 ligase beta-TrCP. This mechanism provides a means of integrating distinct pathways which would otherwise remain insulated, allowing cells to sense FGF and Wnt inputs and adapt TGF-beta outcome to their context. It provides a molecular explanation of the long-standing mystery of the “competence modifier” effect of Wnt on Nodal signals discovered 20 years ago

La stimulation des cellules au TGF- entraîne l’assemblage des protéines cytoplasmiques Smad2/3 avec Smad4. Ce complexe activé se transloque dans le noyau et régule la transcription des gènes cibles du TGF-. Dans le noyau, le complexe Smad peut soit recruter un co-répresseur tel que TGIF. Le TGIF peut inhiber la transcription dépendante du TGF- par différents mécanismes. Récemment, il a été démontré que le TGIF est capable de séquestrer la protéine cytoplasmique cPML dans le noyau inhibant ainsi la phosphorylation de Smad2/3. Dans cette étude, nous avons identifié un nouveau partenaire du TGIF que nous avons nommé PCTA (PML Competitor for TGIF Association). PCTA s’associe à TGIF dans les cellules de mammifères et cette association est stimulée par le TGF-. L’expression de PCTA stimule la transcription induite par le TGF-, une activité qui est due à l’inhibition de la séquestration nucléaire de cPML à travers une compétition de liaison au TGIF. Par ailleurs, nous avons démontré que la surexpression de PCTA peut inhiber la progression tumorale. Ces résultats nous permettent de classer PCTA comme une nouvelle protéine anti-tumorale effectrice de la voie du TGF-.

La signalisation cellulaire regroupe l'ensemble des mécanismes biologiques permettant à une cellule de répondre de façon adaptée à son microenvironnement. Pour ce faire, de nombreuses réactions biologiques entrent en jeux avec un important enchevêtrement, créant ainsi un réseau dont le comportement s'apparente à un système complexe. Le compréhension de la réponse cellulaire à une stimulation passe par le développement conjoint des techniques d'acquisition de données, et des méthodes permettant de formaliser ces données dans un modèle. C'est sur ce dernier point que s'inscrivent les travaux exposés dans cette thèse. Nous présentons ici deux approches visant à répondre à des questions de natures différentes sur la signalisation cellulaire. Dans la première nous utilisons un modèle différentiel pour étudier le rôle d'un nouvel interactant dans la voie canonique du TGF-beta. Dans la seconde nous avons exploré la combinatoire de la signalisation cellulaire en développant un formalisme discret basé sur les transitions gardées. Cette approche regroupe l'interprétation de la base de données Pathway Interaction Database dans un unique modèle dynamique de propagation du signal. Des méthodes de simulations et d'analyses inspirées des techniques de vérification de modèles telles que l'atteignabilité et l'invariance ont été développées. En outre, nous avons étudié la régulation du cycle cellulaire en réponse à la signalisation, ainsi que la régulation des gènes de notre modèle en comparaison avec des données d'expressions.

MAN1, protéine intégrale de la membrane nucléaire interne, régule la voie de signalisation au « transforming growth factor-β” (TGF-β) en interagissant directement avec les protéines R-Smads. Des mutations hétérozygotes et perte de fonction dans le gène LEMD3codant pour MAN1conduisent à des dysplasies osseuses chez les hommes ainsi qu’à une suractivation de la voie TGF-β. Afin d’élucider les mécanismes de régulation de la voie TGF-β par MAN1, nous avons dans un premier temps, caractérisé la structure de la région C-terminale de MAN1 qui interagit avec Smad2. Cette région est composé d’un domaine « Winged Helix » (WH), un « linker » flexible, un domaine de type « U2AF Homology Motif » (UHM) ainsi qu’une extrémité C-terminale desordonée. Le « linker » inter-domaine agit comme un ligand intramoléculaire du domaine UHM via une interaction direct avec ce domaine. Ce « linker » est également impliqué dans l’interaction de MAN1 avec Smad2. Nous suggérons alors qu’il pourrait interagir avec d’autres protéines à domaines UHM permettant ainsi la régulation de l’interaction MAN1/Smad2. Nous avons également identifié deux résidus de Smad2 Y366 et W368 qui sont nécessaire pour la liaison de MAN1 à Smad2. Ces résidus sont également nécessaires pour l’interaction entre Smad2 et différents facteurs de transcription (Fast, FoxH1 and Mixer). Nous avons montré in vivo et in vitro que MAN1 rentre en compétition avec ces facteurs de transcription pour la liaison à Smad2 aboutissant à une inhibition de l’activité transcriptionnelle de Smad2. Nous avons également montré qu’in vitro MAN1 interagit avec la même affinité à Smad2/3 seul ou complexé à Smad4. De manière surprenante, nous avons montré qu’in vivo MAN1 induit la dissociation des complexes Smad2/3-Smad4 en favorisant leur déphosphorylation. Nous avons montré qu’in vitro MAN1 interagit avec la phosphatase PPM1A qui permet la déphosphorylation des protéines R-Smads. Ces résultats suggèrent que MAN1 recrute à la fois les complexes Smad2/3-Smad4 et PPM1A permettant la déphosphorylation de l’extrémité C-terminale de Smad2/3 conduisant à la dissociation et l’inactivation de ces complexes
MAN1, an integral protein of the inner nuclear membrane, influences transforming growth factor-β (TGF-β) signaling by directly interacting with R-Smads. Heterozygous loss of function mutations in LEMD3 gene coding for MAN1 cause sclerosing bone dysplasias in humans and increased levels of TGF-β signaling in cells. As a first step to elucidate the mechanism of TGF-β pathway regulation by MAN1, we characterized the structure of the MAN1 C-terminal region that binds Smad2. This region comprises a winged helix domain, a structurally heterogeneous linker, a U2AF homology motif (UHM) domain and a disordered C-terminus. The inter-domain linker plays the role of an intramolecular UHM ligand motif interacting with the UHM domain. This linker is also crucial for Smad2 interaction. We suggest that it can interact with other UHM domains, thus regulating the MAN1-Smad2 interaction. We also identified two Smad2 residues Y366 and W368 which are necessary for Smad2 binding. These residues are necessary for the interaction between Smad2 and several transcription factors (Fast, FoxH1 and Mixer). We show that, in vivo and in vitro MAN1 competes with these transcription factors for Smad2 binding resulting in a decrease of the Smad2 transcriptional activity. We also show that in vitro, MAN1 binds with the same affinity to free Smad2/3 or Smad2/3-Smad4 complexes. Interestingly, we show that in vivo, MAN1 induces Smad2/3-Smad4 dissociation by favouring R-Smads dephosphorylation. We show that in vitro, MAN1 interacts with PPM1A phosphatase which is responsible of R-Smads dephosphorylation. All these results suggest that MAN1 recruits both Smad2/3-Smad4 complexes and PPM1A that dephosphorylates the C-terminus of Smad2/3 resulting in a dissociation and inactivation of these complexes

Pour compléter les composants de la voie de signalisation de la superfamille des TGF-beta chez les Lophotrochozoaires, un récepteur de type II aux Activines (Cg-ActRII), proche du récepteur humain ActRIIB, a été caractérisé chez Crassostrea gigas. Il est fortement exprimé lors des premiers stades de développement de l’huître et dans les tissus nerveux. Il est fonctionnel dans des embryons de poisson zèbre, se comportant de façon similaire à son orthologue de poisson, pouvant jouer un rôle dans les deux voies TGF-beta/Activine et BMP. Afin de comprendre comment les différents composants de la voie de signalisation interagissent, le ligand Cg-TGF-beta et différentes combinaisons des récepteurs ont été co-exprimés dans des lignées cellulaires de mammifères. Les résultats montrent une interaction entre Cg-TGF-beta et deux récepteurs de type I (TbetaRI/ALRI) pour activer la voie de signalisation TGF-beta/Activine. Le récepteur TbetafRII semble inhiber cette voie mais il active la voie des BMP en présence du récepteur BMPRI et du ligand recombinant BMP2. Structuralement proche des ligands vertébrés de la famille des TGFbeta, les fonctions de Cg-TGF-beta dans des chondrocytes articulaires de lapin ont été étudiées. Bien qu’entrainant une inhibition de la prolifération et stimulant la synthèse de composés extracellulaires (Aggrécane et collagène de type II), il possède des activités différentes de ses orthologues. Cette étude suggère une conservation de la fonctionnalité des composants de la voie de signalisation des TGF-betass chez les Lophotrochozoaires, avec une polyvalence des interactions entre les composants, ce qui constitue un mécanisme essentiel pour des réponses cellulaires spécifiques
To complete the full repertoire of the TGF-beta pathway components in Lophotrochozoans, an Activin type II receptor (Cg-ActRII) was characterized from the oyster Crassostrea gigas. This receptor showed highest identity with human ActRIIB and demonstrated high expression during the first stages of oyster development and in the nervous tissues. It was found functional in zebrafish used as reporter organism and appeared to behave in a way similar to its zebrafish counterpart playing seemingly a dual role in both activin and BMP pathways. To decipher how, the various TGF-beta pathway components characterized in oyster interact to each other, Cg-TGF-beta ligand as well as various combinations of TGF-β receptors were co-expressed in mammalian cell lines. The results show interactions between Cg-TGF-β and two type I receptors (TbetaRI/ALRI) in the TGF-betass/Activin pathway. The receptor Cg-Tbeta sfRII seems to inhibit this pathway but activates the BMP pathway in presence of Cg-BMPRI and recombinant BMP2 though discrete Cg-ALR1 also activates this pathway. Since Cg-TGF-β is structurally related to the vertebrate TGF-βss family, its activity was investigated on Rabbit Articular Chondrocytes. Although Cg-TGF-beta inhibits their proliferation and promotes the transcription of some extracellular matrix components like Agrecan or type II Collagen, Cg-TGF-b activity was distinct from that of its vertebrate counterpart. This study suggests a preservation of the functionality of the TGFbeta pathway components in Lophotrochozoans, a relative conservation of the hierarchy but a versatility of the interactions between the various components which constitutes the central mechanism for fine tuning cellular responses

Mon projet de thèse s’inscrit dans le cadre des études visant à comprendre comment les cellules embryonnaires intègrent les différents signaux auxquels elles sont exposées pour s’engager dans une voie de différenciation définie. Il est plus particulièrement centré sur le rôle des protéines Smad dans ces processus et peut se diviser en deux axes de recherche. Le premier a trait au rôle de Mad (Smad1) dans les interactions entre signaux Wnt (Wg) et BMP chez la drosophile. Nous avons pu démontrer que la forme Mad non phosphorylée par le récepteur BMP se lie au complexe transcriptionnel ß-catenin/dTCF et est requise pour le signal Wnt canonique. La phosphorylation de Mad par le récepteur BMP dirige Mad vers la voie BMP, créant la possibilité d’une compétition entre ces deux classes de signaux. Le second axe de recherche concerne le facteur de transcription Smad4 qui est requis pour la transduction des signaux TGF-ß et BMP. J’ai pu identifier trois sites potentiels de phosphorylation par la kinase GSK3 dans la séquence primaire de Smad4. En utilisant de nombreuses techniques de biochimie, j’ai pu montrer que Smad4 est phosphorylé par la kinase Erk, puis par GSK-3 en réponse à un signal FGF. Lorsque Smad4 est doublement phosphorylé, il est reconnu par une E3-ligase, beta-TrCP, ce qui entraine sa polyubiquitination et sa dégradation. La voie Wnt étant capable d’inhiber GSK-3, j’ai pu montrer que Smad4 est stabilisé par des signaux Wnt. Ce mécanisme augmente la sensibilité des cellules aux signaux TGF-beta lorsqu’elles reçoivent également un signal Wnt
During my PhD I studied how cells receive and integrate multiple signals from the extracellular milieu. I focused on Smad proteins and my project can be divided into two parts. My first project was centered on the transcription factor Mad (Smad1) and its requirement for the BMP and Wg pathways. Using a combination of genetic and biochemistry experiments, we showed that Mad is required for Wg signaling both in Tcf reporter gene assays and in vivo in Drosophila. We found that the choice for Mad to transduce Dpp or Wg signals is controlled by C-terminal phosphorylations so that Mad binds to Pangolin and participates in Wg target genes transcription only when not phosphorylated at its C-terminus. This results in a competition between Dpp and Wg controlled by the phosphorylation state of Mad. My second project was focused on the tumor suppressor Smad4. When I first joined the lab, I identified three new potential GSK3 phosphorylation sites in Smad4 primary sequence. I used a home-made phospho-specific antibody to demonstrate that FGF or EGF stimulation trigger Erk-mediated phosphorylation of Smad4 which primes subsequent GSK3 phosphorylations. These phosphorylations regulate a transcription activation domain located in Smad4 linker region and generate a Wnt-regulated phosphodegron recognized by the E3 ligase beta-TrCP. This mechanism provides a means of integrating distinct pathways which would otherwise remain insulated, allowing cells to sense FGF and Wnt inputs and adapt TGF-beta outcome to their context. It provides a molecular explanation of the long-standing mystery of the “competence modifier” effect of Wnt on Nodal signals discovered 20 years ago

Certains génotypes de papillomavirus humains (PVH) sont responsables de cancers anogénitaux (PVH16 et 18) et de carcinomes cutanés (PVH5 et 8) (chez les patients atteints d'épidermodysplasie verruciforme [EV]). Le potentiel oncogène des PVH est lié à l'activité des protéines E6 et E7. Dans le cas des PVH génitaux à haut risque (PVH16 et 18), ces oncoprotéines dégradent les protéines inhibitrices du cycle cellulaire p53 (E6) et pRb (E7). En revanche, les propriétés biologiques des oncoprotéines du PVH5 et 8 sont peu connues. Notre objectif a été d'étudier le rôle de l'oncoprotéine E6 des PVH5 et 8. Nous avons identifié des protéines cellulaires partenaires d'E6 par criblage en double hybride chez la levure. Les interactions ont été validées par des méthodes de biologie moléculaire et cellulaire. Nos études ont montré l'interaction d'E6 avec la protéine SMAD3 qui joue un rôle central dans la voie de transduction du TGF-bêta. Cette association est spécifique des PVH5 et 8 et conduit à la dégradation du complexe SMAD3/4. L'impact fonctionnel de cette interaction a été étudié par la régulation d'un gène rapporteur luciférase. Nous avons également montré la fixation d'E6 sur SnoN, un inhibiteur des protéines SMAD. Cette association semble avoir un rôle synergique pour la dégradation des SMAD. La voie du TGF-bêta induit la synthèse de protéines qui bloquent le passage de la phase G1 à S du cycle cellulaire. La levée de ce blocage par E6 peut constituer une étape cruciale pour la réplication virale. Le fait qu'il s'agisse des protéines E6 des PVH de l'EV oncogènes suggère que la voie du TGF-bêta est une cible privilégiée dans l'immortalisation des kératinocytes infectés
Some human papillomavirus (HPV) genotypes are responsible of ano-genital cancers (HPV16 and 18) and cutaneous carcinomas (HPV5 and 8) (in patients suffering epidermodysplasia verruciformis [EV]). The oncogenic potentiel of HPVs is mainly related to the activity of E6 and E7 early proteins. In the case of genital high risk HPVs (HPV16 et 18), thèse oncoproteins induce degradation of p53 (E6) and pRb (E7), two key inhibitor proteins of thé cell cycle. In contrast, the biological properties of thèse two oncoproteins from HPVS and 8 are poorly understood. Our aim was to study the role of the oncoprotein E6 from HPVS and 8. We identified cellular partners of E6 by yeast two-hybrid screening. The interactions found were validated by diverse molecular and cellular biology methods. Our work allowed us to show the interaction between E6 and SMAD3, a cellular protein that plays a central role in TGF-beta signaling pathway. This association is specific of HPVS and 8 and induces degradation of SMAD3/4 complexes. The functional impact of this interaction was studied by regulation of a luciferase reporter gene. We equally identified fixation of E6 on SnoN, a cellular inhibitor of SMAD proteins. This association seems to synergize for dégradation of SMADs. The TGF-beta transduction pathway is crucial for the synthesis of proteins that block cell cycle passage from phase G1 to S. Thus, the inhibition of TGF-beta signaling by E6 may constitute a crucial step towards viral replication. Moreover, the interaction specificity of E6 proteins from EV HPVs suggests that TGF-beta signaling may be a privileged target in the way of immortalizing keratinocytes upon viral infection

Le phénotype des chondrocytes peut être modulé par des facteurs de croissance comme par des contraintes mécaniques. Nous avons caractérisé le potentiel chondrogénique de la "Bone Morphogenetic Protein" (BMP)-2 sur des chondrocytes murins primaires amplifiés en culture monocouche sur plastique. Nous avons aussi développé un nouveau modèle d’étude de la mécanotransduction par la compression dynamique de ces cellules incluses en hydrogel d’agarose. Nous avons ainsi confirmé l’implication des voies ERK1/2 et p38 dans ces mécanismes, révélé l’activation de Smad2/3 en réponse à la compression et identifié de nouveaux gènes mécano-sensibles. Par ailleurs, nous avons mis en évidence le rôle des intégrines-bêta-1 dans la rigidité du tissu cartilagineux. Nos résultats complètent la connaissance fondamentale des mécanismes de régulation du phénotype chondrocytaire, mais peuvent également contribuer à l'amélioration des techniques de reconstruction du cartilage dans le domaine de l'ingénierie tissulaire
Chondrocytes phenotype can be modulated by growth factors as well as mechanical stress. We characterised Bone Morphogenetic Protein (BMP)-2 chondrogenic potential on mouse primary chondrocytes expanded in monolayer on culture plastic. Also, we developed a new model to investigate mechanotransduction by applying dynamic compression on these cells embedded in agarose hydrogel. Hence, we confirmed ERK1/2 and p38 pathways implication in such mechanisms, we revealed Smad2/3 activation in response to compression and we identified new mechanosensitive genes. Besides, we highlighted the role of beta-1-integrins in cartilage stiffness. Our results completed the basic knowledge of regulation mechanisms underlying chondrocytes phenotype, but could also contribute to improve techniques for cartilage reconstruction in the field of tissue engineering

La progression du cancer colorectal procède selon une série de transitions, de la crypte épithéliale normale vers l'adénome conduisant au carcinome primaire in situ et aux métastases généralement localisées au niveau du foie. Ces événements séquentiels sont orchestrés par un ensemble d'altérations géniques et moléculaires (syndromes familiaux HNPCC, FAP et cancers sporadiques CIN-LOH et MSI) qui se traduisent de manière générale par l'activation constitutive de (proto)oncogènes ou par la perte de gènes suppresseurs de tumeurs ou de métastases. Si les récepteurs du TGF-β et leurs réseaux de signalisation associés ont été tout particulièrement incriminés quant à leur rôle péjoratif pendant les phases tardives de la progression des tumeurs solides et des cancers du côlon chez l'homme, les informations concernant le rôle des cytokines BMP apparentées au TGF-β dans ce domaine ne sont que très fragmentaires. Quand ce projet a été initié, une étude attribuait à BMP-7 un rôle anti-inflammatoire dans l'intestin chez le rat, suggérant ainsi que cette cytokine pouvait exercer un rôle direct et bénéfique sur la muqueuse digestive et les cellules épithéliales intestinales en particulier. Les BMP agissent par l'intermédiaire de leurs récepteurs de type II (BMPRII, ActRII, ActRIIB) , de type I (ALK-2, ALK-3, ALK-6), et des protéines SMADs (SMAD1, SMAD4, SMAD5, SMAD8). Cependant, 50% des cancers du côlon métastatiques présentent une forme mutée de SMAD4. Des mutations germinales dans le gène codant le récepteur ALK-3 sont observées chez 38% des patients atteints de polypose juvénile (JPS). Enfin, 83% des cancers colorectaux présentant une instabilité des séquences microsatellites (MSI) montrent une mutation dans le gène codant le récepteur de l'activine ActR-II. Dans ce contexte, mon projet de thèse a été centré sur l'expression et le rôle de BMP-7 sur la progression des cellules cancéreuses colorectales humaines et dans les tumeurs associées. Nous avons démontré par RT-PCR, immunohistochimie, et en ELISA que BMP-7 et ses récepteurs sont présents dans des cryptes coliques histologiquement normales, les foci de cryptes aberrantes dans la sigmoïdite, les tumeurs colorectales humaines et plusieurs lignées de cellules cancéreuses coliques. Nous avons aussi démontré que BMP-7 est un facteur de dissémination inducteur du " scattering " et de l'invasion cellulaire dans le collagène de type I. Le pouvoir invasif de BMP-7 est indépendant de SMAD4 et de l'oncogène src, mais associé à l'activation différentielle et cyclique des GTPases (Rac1 et RhoA), de la tyrosine kinase FAK (phosphorylation de la tyr925 impliquée dans la signalisation invasive et l'angiogenèse), et des MAPK /SAPK (JNK et ERK1/2). L'ensemble de ces travaux suggère que BMP-7 se comporte comme un facteur de dissémination proinvasif, agissant par un mécanisme autocrine et paracrine au niveau des cellules cancéreuses du côlon et du stroma tumoral. Cette cytokine exerce donc des actions divergentes sur la progression des tumeurs coliques humaines, en s'opposant aux processus inflammatoires transitoires (rôle bénéfique), mais en favorisant la néoplasie lors des étapes plus tardives associées à l'acquisition du pouvoir invasif à la transition adénome- carcinome pendant la cancérogenèse (rôle péjoratif). Parallèlement, dans cette thèse, nous avons démontré que l'intégrine α1 fait partie de l'échafaudage moléculaire impliqué dans l'invasion cellulaire dépendant de l'oncogène src. D'une autre part, nous démontrons que le VEGF est un inducteur autocrine de l'invasion cellulaire par les cellules cancéreuses du côlon. Selon ce modèle, le VEGF sécrété par les cellules tumorales au sein de la tumeur primaire agit à la fois sur les cellules cancéreuses et les cellules endothéliales en induisant des signaux de survie, de prolifération et d'invasion nécessaires à la croissance des tumeurs primaires et à la génération des métastases.

Au sein des tumeurs, y compris pour le carcinome hépatocellulaire (CHC), des sous-populations de cellules néoplasiques ont révélé une grande capacité à initier de nouvelles tumeurs et à induire des métastases. Les premières études sur ces cellules ont rapidement montré que la présence de ces cellules était déterminante dans le développement tumoral et elles ont donc été renommées " cellules souches cancéreuses " (CSCs). Malheureusement les mécanismes impliqués dans la maintenance de ces CSCs ne sont que partiellement compris. Par ailleurs dans le CHC un lien a été établi entre les signaux du facteur de croissance de transformation (Transforming Growth Factor, TGF-ß) provenant du microenvironnement tumoral et certaines populations de cellules cancéreuses dont la présence est corrélée à un faible pronostic. La façon dont TGF-ß peut ainsi établir et modifier un phénotype cellulaire dans le CHC reste néanmoins obscure. La méthylation de l'ADN étant un acteur majeur dans la mise en place des programmes cellulaires, notre but a été de caractériser le méthylome de CSCs hépatiques et son lien avec la capacité de TGF-ß à induire des CSCs. Nous nous sommes appuyés sur l'expression du marqueur CD133 pour définir la population de CSCs hépatiques. Afin comprendre l'importance des marques de méthylation de l'ADN dans les CSCs hépatiques, nous avons dans un premier temps déterminé quelle était la signature des cellules CD133+ au niveau de la méthylation de l'ADN en utilisant des puces de méthylation à grande échelle. Les sites CpG différentiellement méthylés ont montré un enrichissement pour d'une part des voies de signalisation déjà identifiées dans les CSCs et, d'autre part, pour des voies de signalisation associées au processus inflammatoire dont la voie TGF-ß/SMAD. Par la suite, nous avons montré que TGF-ß pouvait induire de façon permanente les cellules CD133+ contrairement à une autre cytokine influente dans le cancer du foie, l'interleukine 6. Cette augmentation de cellules CD133+ induite par TGF-ß est associée à des changements de méthylation de l'ADN sur l'ensemble du génome et qui sont, de plus, maintenus au cours des divisions cellulaires. La comparaison entre les deux méthylomes (liés aux cellules CD133+ et à l'action de TGF-ß) a exposé une signature commune significative indiquant que TGF-ß pourrait promouvoir le phénotype de CSC via le processus de méthylation de l'ADN. Mais nous avons également déterminé qu'une grande partie des effets sur la méthylation induits par TGF-ß était totalement indépendante de l'induction de cellules CD133+. Enfin, nous avons observé que les sites de méthylation sensibles au signal de TGF-ß étaient regroupés de façon significative au niveau de régions " enhancer " qui régulent la transcription des gènes. Par ailleurs, ces sites incluaient également des gènes précédemment identifiés comme cibles de TGF-ß mais aussi des gènes codant pour des acteurs épigénétiques de premier ordre comme les méthyltransférases de l'ADN. Ces résultats constituent la première description d'une signature de méthylation de l'ADN induite par TGF-ß permettant une reprogrammation stable vers un profil épigénétique de CSC hépatiques.

Nous avons mis en évidence que l'expression de GLI2 est inversement corrélée à celle de Mlcrophtalamia-associated Transcription Factor (MITF) et celle des marqueurs de la différenciation mélanocytaire tels que la tyrosinase, TRP1 et TRP2. Nous avohs montré qu'il existe une balance d'expression dynamique entre ces deux facteurs de transcription contrôlée par deux voies de signalisation distinctes : la voie du TGF-beta et la voie PKA/AMPc. La surexpression de GLI2 inhibe l'expression de MITF ainsi que la pigmentation et promeut les capacités invasives des cellules alors que la forte expression de MITF réprime l'expression de GLI2, l'invasion et induit la différenciation mélanocytaire. Nous avons identifié un site de fixation pour le facteur de transcription GLI2 dans la région -3347-296 du promoteur de MITF. Cependant, d'autres mécanismes sont impliqués dans la répression de MITF par le TGF-beta. En effet, nous avons démontré que le TGF-beta réprime la transcription de MITF par deux mécanismes distincts : le premier étant la répression de la voie PKA/AMPc et le second étant l'induction de l'expression de GLI2 et sa fixation à la position -316/-306 sur le promoteur de MITF. Enfin, nous avons observé que le mécanisme de répression de TRP2, un gène cible de MITF, par GLI2 et/ou le TGF-beta est indépendant de celui de MITF. L'analyse in silico du promoteur de TRP2 suggère la présence de sites putatifs de liaison pour GLI2. L'ensemble de mes travaux de thèse a permis de mettre en évidence l'implication du facteur de transcription GLI2 et de la voie TGF-beta dans la régulation du gène central du lignage mélanocytaire, MITF, mais aussi dans la plasticité du phénotype mélanocytaire
We have demonstrated that the expression of GLI2 is inversely correlated with that of Mlcrophtalamia-associated Transcription Factor (MITF) and melanocytic differentiation markers such as tyrosinase, TRP1 and TRP2. We have shown that there is a dynamic expression balance between these two transcription factors controlled by two distinct signaling pathways: the TGF-beta/Smad and cAMP/PKA pathways. Overexpression of GLI2 inhibits MITF expression, pigmentation and promotes the invasive capacity of melanoma cells, whereas the strong expression of MITF represses the expression of GLI2, invasion and induces melanocytic differentiation. We identified a binding site for GLI2 in the -3S4/-296 region of MITF promoter. However, other mechanisms are involved in the repression of MITF by TGF-beta. Indeed, we demonstrated that TGF-beta represses the transcription of MITF by two distinct mechanisms: the first being the inhibition of the cAMP/PKA pathway and the second being the induction of GLI2 expression and its binding to position -316/-306 of the MITF promoter. Finally, we observed that the mechanism of TRP2 repression by GLI2 and/or by TGF-beta is partly independent of the MITF inhibition, although TRP2 is a transcriptional target of MITF. In silico analysis of the TRP2 promoter suggests the presence of putative sites for GLI2 proteins. Our results has highlighted the involvement of the transcription factor GLI2 under the control of TGF-beta pathway, in the loss of the melanocytic « master gene » MITF, but also in the plasticity of melanocytic phenotype

La formation d’un embryon est dictée par la séquence ADN propre à cet organisme. La variabilité génétique donne naissance à une grande diversité morphologique, tout en maintenant une organisation générale robuste. Les mutations présentes dans les régions cis-régulatrices impactent la transcription via des mécanismes épigénomiques. La variabilité d’expression génique qui en découle peut être compensée par des mécanismes trans de rétrocontrôle au sein du réseau de régulation. L’organisation précise de ces interactions cis et trans restent encore difficile à déchiffrer. Afin de mieux saisir l’effet des mutations sur la transcription, j’ai analysé des données génétiques, épigénomiques et transcriptomiques en collaboration avec le laboratoire Furlong (EMBL, Heidelberg). L’utilisation de données allèle-spécifiques de lignées F1 de Drosophile a permis d’inférer les interactions directes en cis entre les niveaux de régulation, suggérant une différence d’action des marques épigénétiques H3K27ac et H3K4me3 sur l’expression des gènes. Pour mieux comprendre l’impact en trans de la structure des réseaux de régulation sur l’expression génique, j’ai ensuite construit un modèle logique de la spécification de l’axe dorso-ventral chez l’embryon d’oursin, en collaboration avec le laboratoire Lepage (iBV, Nice). Les analyses multicellulaires et stochastiques ont permis de détecter les composants clés du réseau, notamment la dynamique de répression mutuelle entre Nodal et BMP. En conclusion, l’analyse de données allèle-spécifique et la modélisation logique m’ont permis de d’étudier les mécanismes de la régulation transcriptionnelle sous deux perspectives complémentaires
The development of an embryo derives from the DNA sequence of this organism. Genetic variability gives rise to great morphological diversity, while maintaining a robust general organisation. Mutations present within cis-regulatory regions impact transcription via epigenomic mechanisms. The resulting variability in gene expression can be buffered by tran feedback mechanisms within the regulatory network. The precise organisation of these cis and trans interactions remains difficult to decipher. In order to better grasp the effect of mutations on transcription, I analysed genetic, epigenomic and transcriptomic data in collaboration with the Furlong laboratory (EMBL, Heidelberg). The use of allele-specific data from Drosophila F1 lines enabled to infer direct cis-interactions between the regulatory layers, suggesting a difference in the action of the epigenomic markers H3K27ac and H3K4me3 on gene expression. To better understand the trans impact of the structure of regulatory networks on gene expression, I have built a logical model of the dorsal-ventral axis specification in sea urchin embryo, in collaboration with the Lepage laboratory (iBV, Nice). Multicellular and stochastic analyses permitted to detect key components of the network, including the cross-repression dynamic between Nodal and BMP. To conclude, allele-specific data analysis and logical modelling allowed me to study the mechanisms of transcription regulation from two complementary perspectives

La famille du TGF- regroupe les facteurs BMP et TGF- et participe au développement vasculaire. Nous étudions d’abord le rôle des BMP dans l’angiogenèse et montrons qu’au cours du développement murin la voie BMP est active dans les vaisseaux de l’embryon et certains organes après la naissance. De plus, BMP4 induit la prolifération de cellules endothéliales (CE), stimule l’angiogenèse in vitro et induit dans les CE l’expression des récepteurs du VEGF et d’ANG-1, VEGFR2 et TIE2, et de leur forme active, suggérant que ces molécules participent aux effets de BMP4. Enfin, BMP4 inhibe l’expression du peptide vasoactif et angiogène apelin dans la CE humaine. Nous étudions ensuite le rôle de CD105, corécepteur du TGF- dans la CE, dans le Rendu-Osler-Weber de type 1 ou HHT1, maladie vasculaire due à des mutations sur CD105 qui touche principalement la peau. Nous montrons que la réponse des CE au TGF- est perturbée si l’expression de CD105 passe sous un certain seuil et que l’expression de CD105 murin est particulièrement faible dans la peau et diminue avec l’âge, suggérant que les défauts vasculaires typiques de l’HHT1 surgissent d’abord dans les vaisseaux exprimant peu CD105