Gotowa bibliografia na temat „Séquence d’adressage à la mitochondrie”

Le résidu situé en position 2 des protéines, suivant leur méthionine initiatrice, est un signal clé pour le recrutement co-traductionnel de diverses enzymes de modification qui impactent précocement leur destinée cellulaire (adressage, repliement, temps de demi-vie). Bien que l’importance de ce résidu soit établie pour quelques protéines, son rôle à l’échelle globale du protéome et la nature des pressions sélectives auxquelles il pourrait être soumis demeurent à ce jour inexplorés. Durant ma thèse, j’ai pour la première fois utilisé des méthodologies d’analyse globale pour réaliser une étude fonctionnelle et évolutive du résidu situé en position 2 des protéines. J’ai mis au profit de cette étude deux approches complémentaires, développées in silico chez la levure modèle Saccharomyces cerevisiae. La première approche utilisée consiste en l’étude d’enzymes de modification dont le recrutement dépend du résidu en position 2 de leurs cibles. Je me suis en particulier intéressée aux N-acétyltransférases. Celles-ci possèdent la même activité enzymatique de N-acétylation, mais ciblent des sous-ensembles distincts de protéines et leurs délétions sont associées à des phénotypes différents, ce qui pose la question du rôle spécifique de chacune dans la physiologie cellulaire. Grâce à l’analyse de données expérimentales relatives à ces enzymes, j’ai caractérisé leur sélectivité globale in vivo et j’ai formellement démontré qu’elles ont effectivement des rôles physiologiques différentiels. La seconde approche utilisée est l’étude de la distribution des acides aminés en position 2 dans le protéome et dans les groupes fonctionnels de protéines définis par la Gene Ontology. Alors que les outils actuels utilisés pour réaliser des analyses de Gene Ontology ne tiennent pas compte de la structure hiérarchique de cette ressource, j’ai développé un algorithme permettant de synthétiser et de visualiser les résultats obtenus par une telle analyse pour en faciliter l’interprétation. Cette approche a permis l’identification de groupes fonctionnels de protéines présentant en position 2 une utilisation d’acides aminés distincte de celle observée dans le protéome à cette position. Ces deux méthodes d’analyse globale ont convergé vers un même résultat, à savoir que les précurseurs mitochondriaux possédant une séquence N-terminale d’adressage (MTS pour mitochondrial targeting sequence) présentent en position 2 une sur-représentation de larges résidus hydrophobes, critique pour leur import à la mitochondrie et permettant leur reconnaissance par la N-acétyltransférase NatC. Le biais d’acides aminés en position 2 des MTS est très conservé dans la lignée des Saccharomycotina et a partiellement évolué chez l’Homme et la plante Arabidopsis thaliana. J’ai de plus mis en évidence l’existence de plusieurs catégories de MTS en fonction de la nature du résidu qu’ils portent en position 2, ce qui peut indiquer une co-évolution de la position 2 des MTS et de leur composition globale et pose la question des propriétés optimales de ces séquences. Enfin, j’ai montré que les peptides signaux de la levure et la séquence N-terminale d’adressage au chloroplaste d’Arabidopsis thaliana présentent également des biais d’acides aminés en position 2, suggérant que le résidu à cette position pourrait jouer un rôle clé dans la reconnaissance de ces séquences par les systèmes d’adressage et d’import associés
The residue located at position 2 of proteins, following their initiator methionine, is a key signal for the co-translational recruitment of various modification enzymes that early impact their cellular fate (addressing, folding, half-life). Although the importance of this residue is established for a few proteins, its role at the global scale of the proteome and the nature of the selective pressures it may be subject to remain unexplored to this day. During my thesis, I used for the first time global analysis methodologies to conduct a functional and evolutionary study of the residue located at position 2 of proteins. I used two complementary in silico approaches developed in the model yeast Saccharomyces cerevisiae. The first approach I used is the study of modification enzymes whose recruitment depends on the residue at position 2 of their targets. I focused in particular on N-acetyltransferases. These enzymes have the same enzymatic activity of N-acetylation but target distinct subsets of proteins, and their deletions are associated with different phenotypes, raising the question of the specific role of each enzyme in cellular physiology. Through the analysis of experimental data related to these enzymes, I characterized their global selectivity in vivo and formally demonstrated that they indeed have differential physiological roles. The second approach I used is the study of the distribution of amino acids at position 2 in the proteome and in functional groups of proteins defined by the Gene Ontology. While current tools used to perform Gene Ontology analyses do not take into account the hierarchical structure of this resource, I developed an algorithm to synthesize and visualize the results obtained by such analyses to facilitate their interpretation. This approach allowed the identification of groups of proteins that present a distinct amino acid usage at position 2 compared to that observed in the proteome at this position. These two global analysis methods converged toward the same result, namely that mitochondrial precursors possessing an N-terminal addressing sequence (MTS for mitochondrial targeting sequence) exhibit at position 2 an overrepresentation of large hydrophobic residues, critical for their import into mitochondria and enabling their recognition by the NatC acetyltransferase. The amino acid bias at position 2 of MTS is highly conserved in the Saccharomycotina lineage and has partially evolved in humans and the plant Arabidopsis thaliana. I also highlighted the existence of several categories of MTS depending on the nature of the residue they carry at position 2, which may indicate co-evolution of position 2 of MTS and their overall composition and raises the question of optimal properties of these sequences. Finally, I showed that yeast signal peptides and the chloroplast N-terminal addressing sequence in Arabidopsis thaliana also exhibit amino acid biases at position 2, suggesting that the residue at this position could play a key role in the recognition of these sequences by associated addressing and import systems

Les mitochondries sont des organites complexes impliquant un millier de protéines, la plupart codées dans le génome nucléaire. Leur biogenèse a nécessité au cours de l’évolution la mise en place de systèmes efficaces d’adressage et d’import protéique, et des défaillances de ces systèmes sont associées à des pathologies graves, neuropathies, troubles cardiovasculaires, myopathies, maladies neurodégénératives ainsi que cancers. De nombreuses protéines mitochondriales possèdent en N-terminal une séquence d’adressage appelée MTS (Mitochondrial Targeting sequence) qui forme une hélice alpha amphiphile essentielle pour leur import mitochondrial. La séquence des divers MTSs est néanmoins très variables et leur caractéristiques critiques ne sont pas encore bien comprises. Le point de départ de ma thèse est la découverte, chez les levures, d’une surreprésentation en position 2 des séquences MTSs de 4 acides aminés hydrophobes (F, L, I, W). Au cours de mes années de thèse, j’ai pu confirmer, par des expériences de mutagenèse dirigée, le rôle critique de la nature du résidu en position 2 des MTSs. En effet, grâce au développement d’un système novateur de criblage des défauts d’import basé sur le sauvetage fonctionnel de la toxicité d’une protéine mitochondriale, j’ai pu observer que seuls les résidus surreprésentés en position 2 des protéines mitochondriales permettaient un import efficace. Mon travail a ainsi démontré l'existence de fortes contraintes évolutives s’exerçant au niveau de la position 2 des MTSs dont la compréhension pourrait à terme être utile pour optimiser l’adressage mitochondrial de protéines thérapeutiques chez des patients atteints de maladies mitochondriales
Mitochondria are complex organelles involving a thousand proteins, most of which are encoded in the nuclear genome. Their biogenesis has required the evolutionary development of efficient protein addressing and import systems, and failures of these systems are associated with serious pathologies, neuropathies, cardiovascular disorders, myopathies, neurodegenerative diseases and cancers.Many mitochondrial proteins have an N-terminal addressing sequence called MTS (Mitochondrial Targeting Sequence) which forms an amphiphilic alpha helix essential for their mitochondrial import. However, the sequence of the various MTSs is highly variable and their critical characteristics are not yet well understood. The starting point of my thesis was the discovery in yeast of an overrepresentation of 4 hydrophobic amino acids (F, L, I, W) at position 2 of the MTSs sequences. During my thesis, I was able to confirm the critical role of the nature of the residue in position 2 of the MTSs through directed mutagenesis experiments. Indeed, thanks to the development of an innovative system for screening import defects based on the functional rescue of the toxicity of a mitochondrial protein, I was able to observe that only residues overrepresented at position 2 of mitochondrial proteins allowed efficient import. My work has thus demonstrated the existence of strong evolutionary constraints at position 2 of MTSs, the understanding of which could ultimately be useful for optimising the mitochondrial addressing of therapeutic proteins in patients suffering from mitochondrial diseases

L’endosymbiose à l’origine de l’acquisition des plastes par les cellules végétales s’est accompagné d’un transfert de gènes du génome de l’endosymbiote vers le génome nucléaire de l’hôte. Cet évènement a conduit à la mise en place de systèmes d’adressage et d’import des protéines chloroplastiques. De récentes études mettent en lumière l’existence de nouvelles voies d’adressage des protéines vers les chloroplastes. Dans ce contexte, ce travail de thèse avait pour but l’identification d’autres protéines empruntant des voies alternatives d’adressage chloroplastique. Pour ce faire, deux stratégies ont été retenues. La première était basée sur des méthodologies de capture spécifiques des N-glycoprotéines. La seconde stratégie était basée sur l’analyse protéomique des fractions chloroplastiques suivie de la recherche de protéines candidates par analyse in silico. L’analyse de la localisation subcellulaire des protéines sélectionnées révèle une localisation chloroplastique pour trois protéines
One important mechanism that participates in the regulation of accumulation of plastid proteins is the protein targeting that allows import of thousands of nuclear encoded proteins to the chloroplast. Recent studies have revealed intriguing arrays of alternative or noncanonical chloroplast import pathways. In this context, the aim of this study was to identify other plastid proteins trafficking through these alternative targeting pathways and to understand the mechanisms that control these pathways. Two complementary approaches have been initiated. The first one was based on specific glycoprotein isolation methods. The second strategy was based on a systematic proteomic analysis, targeted to Arabidopsis subplastidial fractions, and followed by in silico identification of proteins containing noncanonical targeting sequences. Subcellular localization analyses of selected proteins reveal that some of these proteins are targeted to chloroplasts while lacking any classical N-terminal signal

Les mitochondries et les chloroplastes sont des organites de cellules eucaryotes issus d’événements endosymbiotiques impliquant une bactérie et une cellule hôte il y a plus d’un milliard d’années. Aujourd’hui la très grande majorité des protéines présentes dans ces organites sont codées dans le noyau. Le ciblage des protéines cytosoliques vers les mitochondries et les chloroplastes pourrait dériver d’un mécanisme de résistance bactérienne aux attaques de peptides antimicrobiens, ces acteurs majeurs de l’immunité innée, présents dans tous les domaines du vivant. Cette hypothèse se base sur les similarités frappantes entre ces deux mécanismes. Au cours de mon doctorat, j’ai mis à l’épreuve cette hypothèse. Dans une première partie, j’ai pu montrer qu’un sous-ensemble de peptides antimicrobiens se structurant en hélice ↵-amphipathique et les peptides d’adressage possédaient des propriétés physico-chimiques communes, qui sont distinctes de celles partagées entre les peptides signaux de sécrétion bactériens et eucaryotes dont l’origine évolutive commune est bien établie. De plus, ils peuvent se complémenter fonctionnellement in vivo, confortant l’hypothèse de leur origine commune (Garrido et al. 2020). La transition moléculaire nécessaire pour passer d’un peptide antimicrobien à un peptide d’adressage comporte trois étapes cruciales : i) le remplacement des lysines par des arginines qui permet de diminuer l’activité microbienne et de favoriser l’activité d’adressage, ii) l’acquisition d’un site de clivage au sein des peptides d’adressage, iii) l’acquisition d’un domaine N-terminal peu structuré afin d’orienter l’adressage vers le chloroplaste et non vers la mitochondrie au sein des eucaryotes photosynthétiques (Caspari, Garrido et al., article soumis). Dans une deuxième partie, j’ai établi le catalogue exhaustif des familles d’homologues des peptidases impliquées dans la dégradation des peptides d’adressage dans l’arbre du vivant. J’ai pu démontrer que chacune de ces peptidases a été acquise via un évènement de transfert horizontal depuis une bactérie. En accord avec notre hypothèse, on retrouve de nombreux homologues de bactéries résistantes aux peptides antimicrobiens proches des peptidases des organites (Garrido et al., article soumis)
Mitochondria and chloroplasts are eukaryotic organelles that originated from endosymbiotic events betweena bacteria and a host cell more than a billion years ago. Today, the vast majority of proteins present in theseorganelles are encoded in the nucleus. Targeting of cytosolic proteins to mitochondria and chloroplasts couldderive from a mechanism of bacterial resistance to the attacks of antimicrobial peptides, major actors of theinnate immunity system, present in all domains of life. This hypothesis is based on the striking similaritiesbetween these two mechanisms. During my PhD, I challenged this hypothesis. In a first part, I showed thata subset of antimicrobial peptides structuring in ↵-amphipathic helix and organelle targeting peptides havecommon physico-chemical properties, distinct from those shared by bacterial and eukaryotic secretory signalpeptides whose common evolutionary origin is well established. Furthermore, they can functionally complementeach other, supporting the hypothesis of their common origin (Garrido et al. 2020). The molecular transitionrequired for the emergence of a targeting peptide from an antimicrobial peptide involves 3 crucial steps : (i)the replacement of lysines with arginines, which decreases microbial activity and promotes addressing activity,(ii) the acquisition of a cleavage site and (iii) the acquisition of a loosely structured N-terminal domain forchloroplast specific targeting within photosynthetic eukaryotes (Caspari, Garrido et al. , submitted). In asecond part, I established the exhaustive catalog of peptidase homologous families involved in the degradationof taregting peptides across the tree of life. I showed that each of these peptidases was acquired via a horizontaltransfer event from a bacterium; and consistent with the hypothesis, many homologs from antimicrobialpeptide-resistant bacterial are closely related to the organelle peptidases (Garrido et al., submitted)

Ces travaux portent sur l'étude de mutants nucléaires de la levure S. Cerevisiae, modifiés dans la synthèse mitochondriale des sous-unités 8 et 6 de l'ATPsynthase, qui restent respiratoire-compétents. Ces souches sont modifiées dans la régulation de la synthèse de l'ATP par la concentration en phosphate externe. Ceci est dû à la modification de la stoechiométrie relative des sous-unités 8, 6 et 9 dont le résultat est une altération de la perméabilité aux protons de la membrane interne. Une analyse des transcrits mitochondriaux a permis de corréler cette baisse du taux protéique à une modification spécifique du cotranscrit ATP8-ATP6. Une analyse génétique des mutants a mis en évidence deux mutations nucléaires indépendantes toujours associées à une mutation mitochondriale, qui entraîne une sensibilité accrue à la paromomycine, un antibiotique qui augmente le taux d'erreurs au niveau traductionnel mitochondrial. Les séquences nucléotidiques de l'ARN ribosomique 15S et de l'ARN messager VAR1, deux composants des mitoribosomes codés par l'ADN mitochondrial, ont été étudiées : aucune différence n'a pu être mise en évidence entre les souches mutante et sauvage. Les deux gènes nucléaires mutés entraînent un phénotype de cryosensibilité sur substrat respiratoire seulement lorsqu'ils sont présents simultanément. Donc, les deux gènes sauvages ont été recherchés par complémentation fonctionnelle. Deux gènes nucléaires NCA2 et NCA3, impliqués dans l'expression spécifique des sous-unités 8 et 6 de l'ATP synthase, ont été isolés et séquencés. Aucune homologie significative avec des protéines connues n'a été identifiée dans les banques de données. NCA2 et NCA3 sont deux gènes monocopie qui codent respectivement pour des protéines de 70800 et 35400 Da. NCA2 est localisé sur le chromosome 16 et NCA3 sur le chromosome 4. Leur disruption au locus chromosomique ne conduit pas à une incompétence respiratoire
These works concerned the study of respiratory-competent nuclear mutants of the yeast S. Cerevisiae, altered in the mitochondrial synthesis of subunits 8 and 6 of the ATPsynthase. These strains are altered in the regulation of the ATP synthesis by the external phosphate concentration. It was due to a modification of the relative stoichiometry of the mt DNA-encoded 8, 6 and 9 subunits which results in an enhanced proton-leakage through the inner membrane. The mitochondrial transcripts has permitted to correlate the decrease in the subunits 6 and 8 ratio with a specific modification of cotranscript ATP8-ATP6. Genetic analysis of these mutants showed the presence of two unlinked mutations always associated with a mitochondrial mutation, which confered a paromomycin sensitivity, an inhibitor of the mitochondrial protein synthesis. The nucleic sequence of 15S rRNA and VAR1 mRNA, two components of mitoribosomes encoded by mitochondrial DNA, were studied : no difference exist between mutant and wild-type strains. The simultaneous presence of the two mutant nuclear genes induced a cryosensitive phenotype on a nonfermentable carbon source. Then, the two wild-type genes were cloned by functional complementation. Two nuclear genes NCA2 and NCA3, involved in the specific expression of subunits 8 and 6 of the ATPsynthase, were isolated and sequenced. No significant homologies with known proteins were identified in data bases. NCA2 and NCA3 are two single-copy genes which encode for proteins of molecular mass of 70800 and 35400 Da respectively. NCA2 is located on chromosome 16 and NCA3 on chromosome 4. A null mutation of each gene did not let to a respiratory-incompetent phenotype

Le rôle important joué par la mitochondrie dans la cellule eucaryote est admis depuis longtemps. Cependant, la composition exacte des mitochondries, ainsi que les processus biologiques qui sy déroulent restent encore largement inconnus. Deux facteurs principaux permettent dexpliquer pourquoi létude des mitochondries progresse si lentement : le manque defficacité des méthodes didentification des protéines mitochondriales et le manque de précision dans lannotation de ces protéines. En conséquence, nous avons développé un nouvel outil informatique, YimLoc, qui permet de prédire avec succès les protéines mitochondriales à partir des séquences génomiques. Cet outil intègre plusieurs indicateurs existants, et sa performance est supérieure à celle des indicateurs considérés individuellement. Nous avons analysé environ 60 génomes fongiques avec YimLoc afin de lever la controverse concernant la localisation de la bêta-oxydation dans ces organismes. Contrairement à ce qui était généralement admis, nos résultats montrent que la plupart des groupes de Fungi possèdent une bêta-oxydation mitochondriale. Ce travail met également en évidence la diversité des processus de bêta-oxydation chez les champignons, en corrélation avec leur utilisation des acides gras comme source dénergie et de carbone. De plus, nous avons étudié le composant clef de la voie de bêta-oxydation mitochondriale, lacyl-CoA déshydrogénase (ACAD), dans 250 espèces, couvrant les 3 domaines de la vie, en combinant la prédiction de la localisation subcellulaire avec la classification en sous-familles et linférence phylogénétique. Notre étude suggère que les gènes ACAD font partie dune ancienne famille qui a adopté des stratégies évolutionnaires innovatrices afin de générer un large ensemble denzymes susceptibles dutiliser la plupart des acides gras et des acides aminés. Finalement, afin de permettre la prédiction de protéines mitochondriales à partir de données autres que les séquences génomiques, nous avons développé le logiciel TESTLoc qui utilise comme données des Expressed Sequence Tags (ESTs). La performance de TESTLoc est significativement supérieure à celle de tout autre outil de prédiction connu. En plus de fournir deux nouveaux outils de prédiction de la localisation subcellulaire utilisant différents types de données, nos travaux démontrent comment lassociation de la prédiction de la localisation subcellulaire à dautres méthodes danalyse in silico permet daméliorer la connaissance des protéines mitochondriales. De plus, ces travaux proposent des hypothèses claires et faciles à vérifier par des expériences, ce qui présente un grand potentiel pour faire progresser nos connaissances des métabolismes mitochondriaux.
The important role of mitochondria in the eukaryotic cell has long been appreciated, but their exact composition and the biological processes taking place in mitochondria are not yet fully understood. The two main factors that slow down the progress in this field are inefficient recognition and imprecise annotation of mitochondrial proteins. Therefore, we developed a new computational tool, YimLoc, which effectively predicts mitochondrial proteins from genomic sequences. This tool integrates the strengths of existing predictors and yields higher performance than any individual predictor. We applied YimLoc to ~60 fungal genomes in order to address the controversy about the localization of beta oxidation in these organisms. Our results show that in contrast to previous studies, most fungal groups do possess mitochondrial beta oxidation. This work also revealed the diversity of beta oxidation in fungi, which correlates with their utilization of fatty acids as energy and carbon sources. Further, we conducted an investigation of the key component of the mitochondrial beta oxidation pathway, the acyl-CoA dehydrogenase (ACAD). We combined subcellular localization prediction with subfamily classification and phylogenetic inference of ACAD enzymes from 250 species covering all three domains of life. Our study suggests that ACAD genes are an ancient family with innovative evolutionary strategies to generate a large enzyme toolset for utilizing most diverse fatty acids and amino acids. Finally, to enable the prediction of mitochondrial proteins from data beyond genome sequences, we designed the tool TESTLoc that uses expressed sequence tags (ESTs) as input. TESTLoc performs significantly better than known tools. In addition to providing two new tools for subcellular localization designed for different data, our studies demonstrate the power of combining subcellular localization prediction with other in silico analyses to gain insights into the function of mitochondrial proteins. Most importantly, this work proposes clear hypotheses that are easily testable, with great potential for advancing our knowledge of mitochondrial metabolism.