Rozprawy doktorskie na temat „Réparation cassure double-brin”
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Hoff, Grégory. "Réparation des cassures double-brin et variabilité chromosomique chez Streptomyces". Thesis, Université de Lorraine, 2016. http://www.theses.fr/2016LORR0288/document.
Pełny tekst źródłaStreszczenie:
Rayons ionisants, dessiccation, ou encore métabolites secondaires exogènes sont autant de facteurs qui peuvent engendrer des dommages à l’ADN chez les bactéries du sol, notamment en provoquant la formation de cassures double-brin (DSB), préjudice majeur pour une cellule. Chez les procaryotes, l’évolution a sélectionné deux principaux mécanismes de réparation des DSB, à savoir la recombinaison homologue (RH) et le non-homologous end joining (NHEJ). La RH est un mécanisme quasi-ubiquiste dans le monde bactérien qui repose sur l’utilisation d’une copie intacte de la molécule endommagée comme matrice pour la réparation de la DSB. Contrairement à la RH, le NHEJ n’est présent que chez 20 à 25% des bactéries et est considéré comme un mécanisme mutagène puisque la réparation de la DSB se fait sans matrice homologue et peut entrainer l’ajout ou la délétion de nucléotides au site de cassure. Chez la bactérie modèle Mycobacterium, seuls deux acteurs sont nécessaires pour la réparation par NHEJ. Ainsi, un dimère de protéine Ku se fixe sur la cassure puis recrute la protéine multifonctionnelle LigD, qui catalyse le traitement puis la ligation des extrémités grâce à ses domaines polymérase, nucléase et ligase. Les mécanismes de réparation des DSB chez les Streptomyces étaient peu connus à l’initiation de ce travail. Cette bactérie présente des caractéristiques génomiques remarquables avec notamment un chromosome linéaire de grande taille (6 à 12 Mb). En ce qui concerne la RH, nous avons focalisé nos recherches sur les étapes tardives (post-synaptiques) et étudié le rôle du complexe RuvABC et de RecG impliqués chez Escherichia coli dans la migration de la croix de Holliday et de sa résolution. La construction de mutants simples et multiples a montré que bien que les gènes codant ces protéines soient très conservés chez les Streptomyces, leur déficience ne se traduit chez Streptomyces ambofaciens que par une faible baisse de la recombinaison suite à un événement de conjugaison. Aucune baisse de l’efficacité de recombinaison intrachromosomique n’a en revanche été observée. Ces résultats suggèrent que des acteurs alternatifs majeurs sont encore à découvrir chez les Streptomyces. Le décryptage du mécanisme de NHEJ chez S. ambofaciens constitue une première dans ce genre bactérien. Une étude génomique exhaustive a permis de révéler la très grande diversité du nombre d’acteurs potentiels de ce mécanisme (Ku, LigDom, PolDom, NucDom) et de l’organisation des gènes qui les codent.. L’analyse fonctionnelle a révélé que l’ensemble des acteurs étaient impliqués dans la réponse à l’exposition à un faisceau d’électrons accélérés, connus pour induire, entre autre, la formation de DSB. La génération de DSB, par coupure endonucléasique I-SceI, a par ailleurs permis de mettre en évidence au niveau moléculaire des réparations de type NHEJ (délétions ou insertions de quelques nucléotides, intégration de fragments d’ADN). Les cassures dans les régions terminales du chromosome sont accompagnées de grandes délétions (jusqu’à 2,1 Mb) et de réarrangements de grande ampleur incluant circularisations du chromosome et amplifications d’ADN. Les conséquences de la réparation de DSB chez S. ambofaciens sont en tous points similaires aux réarrangements observés spontanément ou par comparaison des génomes des espèces types. Ainsi, il est possible de lier la plasticité du génome à la réparation de DSB. En outre, l’intégration de matériel génétique exogène serait favorisée au cours de la réparation NHEJ ce qui donnerait à ce système de réparation une place importante dans le processus de transfert horizontal, mécanisme d’évolution majeur chez les bactériesIonizing radiation, desiccation or exogenous secondary metabolites are all factors that can cause DNA damage in soil bacteria, especially by triggering double strand breaks (DSB), the most detrimental harm for the cell. In prokaryotes, evolution selected two main DSB repair pathways, namely homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ). HR is almost ubiquitous in bacteria and relies on an intact copy of the damaged DNA molecule as a template for DSB repair. In contrast to HR, NHEJ is only present in 20 to 25% of bacteria and is considered as a mutagenic pathway since DSB repair is performed without the need of any template and can lead to nucleotide addition or deletion at DSB site. In the bacterial model Mycobacterium, two partners are sufficient for a functional NHEJ pathway. Thus, Ku protein dimer recognizes and binds the DSB and then recruits the multifunctional LigD protein for extremities treatment and ligation thanks to its polymerase, nuclease and ligase domains. At the beginning of this work, few informations on DSB repair in Streptomyces were available. This bacteria exhibits remarkable genomic features including a large linear chromosome (6 to 12 Mb). Regarding HR, we focused on the late stage (post-synaptic step) in studying the role of RuvABC complex and RecG, involved in branch migration and Holliday junction resolution in E. coli. Construction of single and multiple mutants showed that although the genes encoding these proteins are highly conserved in Streptomyces, their deficiency in Streptomyces ambofaciens only results in a mild decrease of recombination after conjugation events. Besides, no decrease of intrachromosomal recombination efficiency could be observed. These results suggest that major alternative factors are still to be discovered in Streptomyces. This work was also the first occasion to decipher a NHEJ pathway in Streptomyces. An exhaustive genomic study revealed a great diversity in the number of factors potentially implicated in this pathway (Ku, LigDom, PolDom, NucDom) and in the organization of their encoding genes. Functional analyses revealed that all the factors, whatever they are conserved or not between species, were involved in the response to electron beam exposure, known to induce, amongst other things, DSB formation. Generation of DSB by I-SceI endonuclease cleavage was also used to evidence at a molecular level NHEJ type DSB repair (deletions or insertions of several nucleotides, integration of DNA fragments). Targeted breaks in the terminal regions of the chromosome were accompanied by large deletions (up to 2.1 Mb) and major rearrangements including chromosome circularizations and DNA amplifications. Consequences of DSB repair in S. ambofaciens are in all points similar to chromosome rearrangements observed spontaneously or by comparing genomes of different species. Thus, it is possible to link the genome plasticity to DSB repair. In addition, the integration of exogenous genetic material would be favoured during NHEJ repair which would give this repair system a major role in the horizontal transfer process, known to be a main evolution mechanism in bacteria
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Mosbach, Valentine. "Contraction de répétitions de trinucléotides par induction ciblée d'une cassure double brin". Electronic Thesis or Diss., Paris 6, 2017. http://www.theses.fr/2017PA066040.
Pełny tekst źródłaStreszczenie:
Les répétitions de trinucléotides sont des séquences répétées en tandem pouvant subir, chez l'homme, de larges expansions à l'origine de nombreuses maladies génétiques. La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est due à l'expansion d'une répétition CTG en 3'UTR du gène DMPK. Les mécanismes d'instabilités des répétitions, peu connus, reposeraient sur leur capacité à former des structures secondaires constituant un obstacle aux mécanismes impliquant une synthèse d'ADN. Nous avons montré qu'une TALEN induisant une cassure double brin dans les répétitions CTG à l'origine de la DM1 insérées chez la levure Saccharomyces cerevisiae permettait de manière efficace et spécifique d'aboutir après réparation à leur contraction. Le mécanisme de réparation est dépendant uniquement de deux gènes, RAD50 et RAD52, suggérant la formation de structures aux extrémités de la DSB devant être retirées pour initier la réparation, suivis d'une réaction de SSA entre les répétitions aboutissant à leur contraction. L'efficacité et spécificité d'un système CRISPR-Cas9 à contracter ces répétitions chez la levure ont été comparées à la TALEN. L'induction de CRISPR-Cas9 n'aboutit pas à la contraction des répétitions mais à des réarrangements chromosomiques suggérant un manque de spécificité et un mécanisme de réparation différent de celui de la TALEN. Enfin, nous avons étudié si ces nucléases peuvent contracter ces répétitions CTG à des tailles non pathologiques dans des cellules de mammifères. L'induction de la TALEN dans des cellules de souris transgéniques DM1, puis dans des fibroblastes humains de patients DM1 montre des résultats préliminaires encourageant de contraction des répétitionsTrinucleotides repeats are a specific class of microsatellites whose large expansions are responsible for many human neurological disorders. Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is due to an expansion of CTG repeats in the 3’UTR of DMPK gene, which can reach thousands of repeats. Molecular mechanisms leading to these large expansions are poorly understood but in vitro studies have shown the capacity of these repeats to form secondary structures, which probably interfere with mechanisms involving DNA synthesis. We shown that a TALEN used to induce double-strand break (DSB) in DM1 CTG repeats integrated in the yeast Saccharomyces cerevisiae is specific and leads to highly efficient repeat contractions after repair. Mechanism involved in TALEN-induced DSB only depends of RAD50 and RAD52 genes, suggesting the formation of secondary structures at DSB ends that need to be removed for repair initiation, followed by an intramolecular recombinaison repair such as SSA between repeats leading to their contraction. We compared the efficiency and specificity of a CRISPR-Cas9 and the TALEN to contract CTG repeats in yeast. Surprisingly, CRISPR-Cas9 induction do not lead to repeat contraction but to chromosomal rearrangement, suggesting a lack of specificity and a different repair mechanism than with the TALEN. At last, we studied whether these nucleases could contract CTG repeats to a non-pathological length in mammalian cells. Finally, TALEN induction in DM1 transgenic mice cells, and in DM1 human fibroblasts show promising repeat contractions
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Mosbach, Valentine. "Contraction de répétitions de trinucléotides par induction ciblée d'une cassure double brin". Thesis, Paris 6, 2017. http://www.theses.fr/2017PA066040.
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Les répétitions de trinucléotides sont des séquences répétées en tandem pouvant subir, chez l'homme, de larges expansions à l'origine de nombreuses maladies génétiques. La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est due à l'expansion d'une répétition CTG en 3'UTR du gène DMPK. Les mécanismes d'instabilités des répétitions, peu connus, reposeraient sur leur capacité à former des structures secondaires constituant un obstacle aux mécanismes impliquant une synthèse d'ADN. Nous avons montré qu'une TALEN induisant une cassure double brin dans les répétitions CTG à l'origine de la DM1 insérées chez la levure Saccharomyces cerevisiae permettait de manière efficace et spécifique d'aboutir après réparation à leur contraction. Le mécanisme de réparation est dépendant uniquement de deux gènes, RAD50 et RAD52, suggérant la formation de structures aux extrémités de la DSB devant être retirées pour initier la réparation, suivis d'une réaction de SSA entre les répétitions aboutissant à leur contraction. L'efficacité et spécificité d'un système CRISPR-Cas9 à contracter ces répétitions chez la levure ont été comparées à la TALEN. L'induction de CRISPR-Cas9 n'aboutit pas à la contraction des répétitions mais à des réarrangements chromosomiques suggérant un manque de spécificité et un mécanisme de réparation différent de celui de la TALEN. Enfin, nous avons étudié si ces nucléases peuvent contracter ces répétitions CTG à des tailles non pathologiques dans des cellules de mammifères. L'induction de la TALEN dans des cellules de souris transgéniques DM1, puis dans des fibroblastes humains de patients DM1 montre des résultats préliminaires encourageant de contraction des répétitionsTrinucleotides repeats are a specific class of microsatellites whose large expansions are responsible for many human neurological disorders. Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is due to an expansion of CTG repeats in the 3’UTR of DMPK gene, which can reach thousands of repeats. Molecular mechanisms leading to these large expansions are poorly understood but in vitro studies have shown the capacity of these repeats to form secondary structures, which probably interfere with mechanisms involving DNA synthesis. We shown that a TALEN used to induce double-strand break (DSB) in DM1 CTG repeats integrated in the yeast Saccharomyces cerevisiae is specific and leads to highly efficient repeat contractions after repair. Mechanism involved in TALEN-induced DSB only depends of RAD50 and RAD52 genes, suggesting the formation of secondary structures at DSB ends that need to be removed for repair initiation, followed by an intramolecular recombinaison repair such as SSA between repeats leading to their contraction. We compared the efficiency and specificity of a CRISPR-Cas9 and the TALEN to contract CTG repeats in yeast. Surprisingly, CRISPR-Cas9 induction do not lead to repeat contraction but to chromosomal rearrangement, suggesting a lack of specificity and a different repair mechanism than with the TALEN. At last, we studied whether these nucleases could contract CTG repeats to a non-pathological length in mammalian cells. Finally, TALEN induction in DM1 transgenic mice cells, and in DM1 human fibroblasts show promising repeat contractions
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Vaysse-Zinkhöfer, Wilhelm. "Mécanismes de réparations d’une cassure double-brin et résection au sein d’un microsatellite humain". Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2021. http://www.theses.fr/2021SORUS477.
Pełny tekst źródłaStreszczenie:
Les microsatellites sont des répétitions en tandem d’un motif compris entre une et neuf paires de bases. Ces répétitions retrouvées dans tous les organismes de façon ubiquitaire, sont particulièrement abondantes dans les organismes eucaryotes. Toutes ces répétitions sont capables de former des structures secondaires in vitro et possiblement in vivo. Certains microsatellites sont enclins à une expansion, conduisant à de nombreuses maladies neurodégénératives chez l’homme telle que la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), maladie neurodégénérative la plus fréquemment transmise. L’apparition et la sévérité des symptômes sont positivement corrélée avec le nombre de répétitions, localisées dans le 3’UTR du gène DMPK. Dans des travaux précédents du laboratoire, une TALE nucléase (TALEN) a été élaborée dans le but d’introduire une cassure double-brin au sein d’un microsatellite (CTG)n provenant d’un patient DM1. La compréhension des mécanismes conduisant à la contraction des répétitions chez la levure est nécessaire si l’on souhaite en comprendre les mécanismes chez l’homme. Ainsi, des expériences ont été menées dans des cellules dont les systèmes de réparation des CDB ont été altérés, montrant que RAD51, POL32 et DNL4 n’étaient pas nécessaires à la réparation des CDB au sein des microsatellites. Seul RAD50 et RAD52 semblent nécessaires, indiquant que la cellule répare les CDB dans les régions répétées par single-strand annealing. L’objectif de cette thèse a été d’étudier le rôle de plusieurs gènes (MRE11, EXO1, SGS1, DNA2, SAE2, RIF1 et RIF2), impliqués dans la résection et la réparation d’une unique CDB au sein d’une région répétée CTG, chez la levureMicrosatellites are tandem repeats of a motif between one and nine base pairs. These repeats are found ubiquitously in all organisms and are particularly abundant in eukaryotic organisms. All these repeats are capable of forming secondary structures in vitro and possibly in vivo. Some microsatellites are prone to expansion, leading to many neurodegenerative diseases in humans such as myotonic dystrophy type 1 (DM1), the most frequently transmitted neurodegenerative disease. The onset and severity of symptoms are positively correlated with the number of repeats located in the 3'UTR of the DMPK gene. In previous work in the laboratory, a TALE nuclease (TALEN) was developed to introduce a double-strand break into a microsatellite (GTC)n from a DM1 patient. Understanding the mechanisms leading to repeat contraction in yeast is necessary to understand the mechanisms in humans. Thus, experiments were conducted in cells with altered CBD repair systems showing that RAD51, POL32 and DNL4 were not required for CBD repair within microsatellites. Only RAD50 and RAD52 appear to be required, indicating that the cell repairs CBDs in repeated regions by single-strand annealing. The objective of this thesis was to study the role of several genes (MRE11, EXO1, SGS1, DNA2, SAE2, RIF1 and RIF2), involved in the resection and repair of a single CBD within a CTG repeat region, in yeast
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Dupuy, Pierre. "Réparation des cassures double-brin chez la bactérie symbiotique Sinorhizobium meliloti : caractérisation du mécanisme de non-homologous end-joining". Thesis, Toulouse 3, 2016. http://www.theses.fr/2016TOU30153.
Pełny tekst źródłaStreszczenie:
Les cassures double-brin (CDBs) de l'ADN sont décrites comme étant les lésions de l'ADN les plus délétères puisqu'elles conduisent systématiquement à la mort de la cellule si elles ne sont pas réparées. Les CDBs peuvent être réparées par différents mécanismes et notamment par Non-Homologous End-Joining (NHEJ). Chez les eucaryotes, les protéines centrales de la NHEJ, Ku70 et Ku80, forment un hétérodimère capable de se lier aux extrémités de l'ADN générées par la cassure. Par la suite, Ku70 et Ku80 recrutent de nombreuses autres protéines permettant la modification des extrémités et la réparation de la CDB par ligation. La NHEJ a également été caractérisée chez un nombre limité de bactéries chez qui le mécanisme semble moins complexe que chez les eucaryotes. Chez les bactéries, la NHEJ nécessite seulement deux protéines : un homodimère de Ku, et la protéine multifonctionnelle LigD capable de modifier les extrémités et d'effectuer la ligation. La majorité des études faites sur la NHEJ ont été menées chez des bactéries ne possédant qu'une seule paire des gènes ku/ligD. Cependant, de nombreux autres génomes bactériens possèdent plusieurs copies de ces deux gènes et le fonctionnement de la NHEJ chez ces organismes est inconnu. Le génome de la bactérie symbiotique Sinorhizobium meliloti code quatre Ku putatives (ku1-4) et quatre LigD putatives (ligD1-4). A ce jour, une seule étude a été menée chez ce modèle bactérien montrant que chacun des simples mutants ku est plus sensible que la souche sauvage à un traitement aux rayonnements ionisants, suggérant que chacune des Ku joue un rôle dans la réparation des CDBs par NHEJ. Par l'utilisation de différentes approches in vivo, nous avons mené une caractérisation génétique de la NHEJ chez S. meliloti permettant de clarifier les contributions relatives des gènes ku et ligD dans le mécanisme. Pour la première fois chez une bactérie, nous avons pu obtenir des résultats montrant la présence de plusieurs systèmes indépendants de NHEJ chez S. meliloti, et suggérant l'existence d'un possible hétérodimère de Ku. Nous avons également mis en évidence que la NHEJ est activée dans différentes conditions de stress, telles que le stress thermique et la carence nutritive, et qu'une partie de cette réparation est sous le contrôle du régulateur central de la réponse générale au stress RpoE2. Par ailleurs, nous avons montré que la NHEJ, et plus généralement les mécanismes de réparation des CDBs sont impliqués dans la résistance à la dessiccation chez S. meliloti. Enfin, nous avons généré la première preuve expérimentale d'une implication de la NHEJ dans le transfert horizontal de gène chez les bactéries. Dans leur ensemble, ces travaux enrichissent nos connaissances sur les mécanismes de réparation des CDBs chez les bactéries possédant plusieurs orthologues de Ku et LigD. Ils suggèrent également que la NHEJ pourrait contribuer à l'évolution des génomes, en particulier en condition de stress, non seulement en raison du caractère mutagène de ce type de réparation mais également en participant à l'acquisition d'ADN exogène originaire de bactéries distantesDNA double-strand breaks (DSBs) are described as the most deleterious DNA damages as they can lead to cell death if they are not repaired. DSBs can be repaired through several mechanisms, including Non-Homologous End-Joining (NHEJ). In eukaryotes, the main NHEJ proteins, Ku70 and Ku80, bind DNA ends as a heterodimer, and then recruit several additional proteins including enzymes which catalyze the processing and ligation of DNA ends. NHEJ has also been characterized in a limited number of bacteria, where the repair mechanism appears to be less complex than in eukaryotes. Indeed, only two proteins are required: a homodimeric Ku protein, and a multifunctional LigD enzyme able to process and ligate the DNA ends. However, most studies were performed on bacterial species encoding a single pair of ku/ligD. Actually, many bacterial species encode multiple copies of these genes, whose relative contributions to NHEJ in vivo are so far unknown. The Sinorhizobium meliloti genome encodes four putative Ku (ku1-4) and four putative LigD (ligD1-4). To date, a single study conducted on this model bacterium showed that every ku single mutant is more sensitive than the wild type strain to ionizing radiations showing that all ku genes are involved in NHEJ repair of DSBs in this organism. Here, using several in vivo approaches, we performed a comprehensive genetic characterization of NHEJ repair in S. meliloti, and clarified the respective contributions of the various ku and ligD genes. For the first time in bacteria, we obtained results showing the presence of several independent NHEJ systems in S. meliloti and suggesting the existence of a putative heterodimeric form of Ku. We also demonstrated that NHEJ repair is activated under various stress conditions, including heat and nutrient starvation, and that part of this repair is under the control of the general stress response regulator RpoE2. We showed that NHEJ and more generally DSB repair mechanisms are involved in desiccation resistance in S. meliloti. Finally, for the first time in bacteria, we provided evidence that NHEJ not only repairs DSBs, but can also erroneously integrate heterologous DNA molecules into the breaks. Altogether, our data provide new insights into the mechanisms of DSB repair in bacteria which encode multiple Ku and LigD orthologues. It also suggest that NHEJ might contribute to the evolution of bacterial genomes under adverse environmental conditions not only through error-prone repair of DSB by its mutagenesis repair characteristic but also by participating in the acquisition of foreign DNA from distantly related organisms during horizontal gene transfer events
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Pellegrino, Simone. "Comprendre le rôle de RecN dans la voie de réparation CDB chez Deinococcus radiodurans". Phd thesis, Université de Grenoble, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00769957.
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Deinococcus radiodurans est une bactérie à gram-positive connue pour son extrême résistance à une grande variété d'agents endommageant l'ADN. Parmi ces derniers, les rayonnements ionisants et la dessiccation sont les plus nocifs pour la cellule, car ils introduisent des cassures dans le génome. Les cassures double brin (CDB) sont particulièrement dangereuses et doivent être réparées de façon très efficace, afin d'éviter l'apparition de mutations pouvant mener à la mort de la cellule ou de l'organisme. La recombinaison homologue (RH) est le mécanisme le plus efficace pour la réparation des CDBs. D. radiodurans est capable de restaurer entièrement son génome en à peine 3 heures, et elle accomplit la totalité du processus par la voie RecFOR. Afin d'être réparées, les CDBs doivent d'abord être reconnu. Cette étape importante, qui a lieu peu de temps après l'apparition du dommage dans la cellule, implique la protéine RecN. RecN est recrutée dès les premières étapes de la réparation de l'ADN et des études in vivo ont démontré qu'elle avait tendance à se localiser dans des foyers discrets. Des études in vitro suggèrent également que RecN favorise l'assemblage de fragments d'ADN, une fonction décrite précédemment pour les protéines SMC (telle que cohesin), qui sont structurellement similaires à RecN. De nombreuses études structurales ont été effectuées sur la protéine de type SMC, Rad50, alors qu'à présent aucune information structurale n'est disponible pour RecN. Le travail présenté ici a porté sur la caractérisation structurale de RecN et de ses domaines. Nous avons obtenu les structures cristallines de trois constructions (se chevauchant partiellement) de RecN et une étude de diffusions des rayons X aux petits angles a été effectuée sur les domaines séparés de RecN et sur la protéine entière. Les données obtenues en solution ont complété notre étude cristallographique et nous ont permis de construire un modèle atomique de la protéine entière. Des mutations ont été conçues et les protéines mutées ont été produites et utilisées pour la caractérisation de l'activité d'hydrolyse de l'ATP caractéristique de cette famille de protéines. Des études biochimiques approfondies ont été effectuées sur les différentes constructions et mutants de RecN afin de déterminer le rôle de chacun des ses domaines. Nos résultat nous ont permis de proposer un modèle qui explique comment RecN reconnaît les CDB, maintient les deux extrémités de l'ADN, et prépare l'ADN pour la réparation par les protéines RecFOR.
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Abello, Arthur. "Spécialisation de Ku80c dans le couplage entre coupure et réparation de l’ADN lors des réarrangements programmés du génome chez Paramecium tetraurelia". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019SACLS083.
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Au cours de son cycle sexuel, le cilié Paramecium tetraurelia procède à de massifs réarrangements programmés de son génome (RPG). Ils consistent, entre autres choses, en l’excision de 45 000 séquences précisément délimitées, appelées IES (Internal Eliminated Sequences). La transposase domestiquée Piggymac (Pgm) introduit les cassures double-brin (CDB) à l’extrémité des IES. La réparation très précise de ces dommages est réalisée par la voie de réparation des extrémités non-homologues (NHEJ). Un des acteurs de cette voie est l’hétérodimère Ku70/Ku80. Suite à des duplications globales du génome, la paramécie possède trois gènes KU80, Un seul de ces gènes est induit lors des RPG (KU80c) et une expérience d’ARN interférence (ARNi) contre KU80c montre une complète inhibition de l’introduction des CDB. De plus, des expériences de Co-IP en système hétérologue montrent que Ku70/Ku80c interagit avec Pgm. Ces résultats prouvent le rôle essentiel de Ku dans l’introduction des CDB lors des RPG et soulèvent la question du mécanisme impliqué. Au cours de ma thèse j’ai caractérisé le couplage entre Ku et Pgm en analysant des expériences d’immunofluorescence avec ou sans pré-extraction, permettant de déterminer les interdépendances de ces protéines pour leur localisation et pour leur stabilité nucléaire. Ces approches ont permis de démontrer que Pgm requiert la présence de Ku pour être stablement localisé dans les noyaux lors des RPG. Ku80c partage 74% de sa séquence protéique avec Ku80a. Des expériences de complémentations fonctionnelles surexprimant Ku80a lors des RPG ont montré que Ku80a n’est pas capable ni de se localiser stablement dans les noyaux ni de participer à la stabilisation nucléaire de Pgm. De plus, les RPG sont inhibés. Ces résultats montrent que Ku80c s’est spécialisé dans le couplage avec Pgm pour l’introduction des CDB lors des RPG. L’utilisation de protéines chimériques a permis de déterminer que la spécialisation de Ku80c est portée par son domaine N-terminal ∝-βDuring its sexual cycle, the ciliate Paramecium tetraurelia undergoes massive Programmed Genome Rearrangements (PGR). They consist, among others, in excision of 45,000 precisely delimited sequences, called IES (Internal Eliminated Sequences). A domesticated transposase, PiggyMac (Pgm), introduces double-strand DNA breaks (DSB) at IES ends. The Non Homologous End Joining pathway (NHEJ) handles highly precise repair of DSB. One of the actors of this pathway is the heterodimer Ku70/Ku80. In P. tetraurelia, the KU80 gene is present in three paralogous copies. Only KU80c is specifically expressed during PGR and RNA interferences against KU80c showed a complete inhibition of DNA cleavage. Furthermore, a Co-IP experiment in a heterologous system showed that both Ku70/Ku80c interact with Pgm. These results provide evidence that Ku is an essential partner of Pgm for DSB introduction; raising the question of the activating mechanism involved. During my PhD, I characterized the coupling between Ku and Pgm by analyzing immunofluorescence experiments, with or without pre-extraction, allowing the determination of inter-dependencies between those proteins for their nuclear localization and stability. Those methods demonstrated that Pgm requires the presence of Ku for a stable nuclear localization during the PGR. Ku80c shares 74% of the protein sequence with Ku80a. Functional complementation assays overexpressing Ku80a during the PGR showed that Ku80a is not capable to stably localize in nuclei nor to participate in Pgm nuclear stability. Furthermore, PGR are inhibited. Those results show that Ku80c has specialized for the DSB introduction during PGR. The use of chimeric proteins allowed to determine that Ku80c specialization was carried out by its N terminal domain
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Badie, Christophe. "Influence de la réparation sur la courbe de survie :les cassures double brin de l'ADN et les aberrations chromosomiques de lignées fibroblastiques humaines". Paris 11, 1995. http://www.theses.fr/1995PA11T015.
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Fedor, Yoann. "Nouveau biomarqueur en temps réel de cassures double-brin de l'ADN et génotoxicité de la cytolethal distensing toxin". Toulouse 3, 2012. http://thesesups.ups-tlse.fr/2029/.
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L'ADN est constamment la cible de dommages, provenant aussi bien de sources endogènes (propriétés intrinsèques de la macromolécule, métabolisme cellulaire. . . ) qu'exogènes (radiations, contaminants alimentaires. . . ). Parmi ces dommages, les cassures double-brin de l'ADN (CDB) représentent une des lésions les plus cytotoxiques. En réponse à ce danger, la cellule dispose de voies de détection et signalisation impliquant le recrutement de protéines. Au cours de cette réponse des modifications post-traductionnelles de protéines de signalisation et de réparation sont produites au niveau du site de cassure comme, par exemple, la phosphorylation de H2AX, un variant de l'histone H2A. Cette voie de signalisation permet d'une part d'activer les points de contrôle du cycle cellulaire pour stopper la prolifération et, d'autre part, de stimuler les systèmes de réparation de CDB afin de restaurer l'intégrité de l'ADN. Une réparation infidèle des CDB peut aboutir à des additions/délétions de bases, voir des réarrangements chromosomiques, à l'origine de cancers. Ainsi, élucider les causes et les mécanismes responsables de la formation des CDB en réponse à des stress génotoxiques et suivre leur prise en charge par la cellule sont des éléments importants pour la compréhension de la génotoxicité. Des techniques permettant d'analyser la formation des CDB (immunofluorescence, électrophorèse en champs pulsé, COMET neutre. . . ) existent, mais elles ne permettent d'analyser l'état de l'ADN qu'à un instant fixe. La première partie de mon travail de thèse a été de créer un outil innovant, permettant de détecter et suivre la formation de CDB en temps réel, sur cellules vivantes. Cet outil repose sur la technologie des nanobodies, anticorps monochaines produits uniquement chez les camélidés et certains requins. Nous avons fait exprimer un nanobody intracellulaire dirigé contre H2AX phosphorylé (appelé gammaH2AX), qui semble se relocaliser aux CDB créées par microirradiation. La création de cet outil a nécessité l'immunisation d'un lama avec le peptide phosphorylé et l'isolement/le clonage des séquences codantes des nanobodies afin de produire une banque. Les nanobodies spécifiques de gammaH2AX ont été sélectionnés par phage display et leurs séquences ont été exprimées en cellules humaines, fusionnées à un fluorophore afin d'observer leur relocalisation aux CDB en temps réel. La seconde partie de ma thèse a permis de mieux comprendre le mécanisme d'action d'une génotoxine bactérienne, responsable de cancers en modèle murin : la Cytolethal Distending Toxin (CDT). Cette toxine, sécrétée par des bactéries commensales et pathogènes, se localise au noyau des cellules cibles et provoque des CDB. Si le fonctionnement de cette toxine était préalablement décrit comme celui d'une nucléase produisant des CDB directes, mon travail a montré que pour des concentrations équivalentes à la Dose Létale 50, CDT produit d'abord des cassures simple-brin qui dérivent en CDB au cours de la réplication de l'ADN. De plus, la réparation de ces CDB par recombinaison homologue est cruciale pour la survie des cellules exposées à CDT. En conclusion, mon travail de thèse a permis d'une part de développer un outil innovant permettant d'analyser la dynamique en temps réel des CDB en cellules humaine et, d'autre part, d'éclaircir le mécanisme menant à la génotoxicité de CDT, toxine représentant un risque potentiellement cancérigène chez les mammifères. Les apports de ces travaux sont discutés iciHuman DNA is constantly damaged by endogenous (cellular metabolism) or exogenous (radiations, food contaminants) sources. Among these lesions, DNA double-strand breaks (DSB) are the most cytotoxic. To survive to these lesions, a cellular pathway is in charge for the detection and the signaling of DSB. This pathway involves recruitment and post-translationnal modifications of several proteins around the DSB site (like the phosphorylation of a H2A histone variant called H2AX). This signalization pathway elicits cellular checkpoints in order to stop proliferation, and stimulates DSB repair systems in order to restore DNA initial integrity. An error-prone repair of DSB can lead to base additions/deletions, or chromosomal aberrations that can induce cancer. In order to understand genotoxicity, it is important to elucidate causes and mechanisms responsible for DSB formation and to follow their management by the cell. Techniques allowing DSB formation analysis (immunofluorescence, pulse-field gel electrophoresis, neutral COMET assay. . . ) exist, but can only show DNA state for a given point. During the first part of my thesis work, I created a new tool to detect and follow DSB formation in real time, in human cells. This tool rely on nanobody technology, which are miniatures antibodies produced by camelidae species and some sharks. An intracellular nanobody directed against phosphorylated H2AX (gammaH2AX) has been expressed, and seems to relocate to microirradiation-induced DSB. In order to build this tool, anti-gammaH2AX peptides were designed to immunize a llama, and nanobodies coding sequences were isolated/cloned and gathered as a library. Nanobodies specific for gammaH2AX were selected by phage display. Fused to a fluorophore these nanobodies were expressed in human cells in order to analyze their relocalization to DSB in real time. The second part of my phD shed a new light on the mechanism of action of a bacterial génotoxine causing cancers in mouse models: the Cytolethal Distending Toxin (CDT). This toxin is secreted by commensal and pathogenous bacteria, translocate into the nucleus of targeted cells and induces DSB. CDT mechanism of action was previously described as those of a nuclease inducing DSB. But my work demonstrated for lower doses (equivalent to lethal dose 50), that CDT induced first single-strand breaks leading to double-strand breaks through DNA replication. Moreover, homologous recombination repair of these DSB is crucial in order for cells exposed to CDT to survive. In conclusion, thanks to my thesis work, I developed a new tool to analyze real time dynamic of DSB in human cells in one hand. And in another hand, my work shed a new light on the mechanism of action of CDT genotoxicity, a toxin displaying cancer hazard in mammalians. Contributions brought by this work are discussed here
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Batté, Amandine. "Impact of nuclear organization and chromatin structure on DNA repair and genome stability". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS182/document.
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L’organisation non-aléatoire du noyau des cellules eucaryotes et la compaction de l’ADN en chromatine plus ou dense peuvent influencer de nombreuses fonctions liées au métabolisme de l’ADN, y compris la stabilité du génome. Les cassures double-brin sont les dommages à l’ADN les plus néfastes pour la cellule. Pour préserver l’intégrité de leur génome, les cellules eucaryotes ont développé des mécanismes de réparation des cassures double-brin qui sont conservés de la levure à l’homme. Parmi ceux-ci, la recombinaison homologue utilise une séquence homologue intacte présente ailleurs dans le génome et peut se diviser en deux sous voies de réparation. La conversion génique transfère l’information génétique d’une molécule à son homologue, tandis que le Break Induced Replication (BIR) établit une fourche de réplication qui peut procéder jusqu’à la fin du chromosome.Mon travail de thèse s’est attaché à caractériser la contribution du statut chromatinien et de l’organisation tridimensionnelle du génome à la réparation des cassures double-brin. L’organisation du noyau de la levure S. cerevisiae ainsi que la propagation de l’hétérochromatine au niveau des régions subtélomériques peuvent être modifiées via la surexpression des protéines Sir3 et sir3A2Q. Nous avons montré que le groupement des télomères accroit la conversion génique entre deux séquences subtélomériques, soulignant le rôle clé de la proximité spatiale et de la recherche d’homologie. Nous avons également constaté que la présence d’hétérochromatine au niveau du site de cassure limite la résection, ce qui permet une disparition plus lente des extrémités, qui resteraient disponibles plus longtemps pour réaliser la recherche d’homologie et achever la réparation. Enfin, nous avons observé que la présence d’hétérochromatine au site donneur diminue l’efficacité de recombinaison et qu’elle doit moduler une étape commune aux deux voies de réparation, à savoir l’invasion de brin. Ces travaux nous ont permis de décrire de nouvelles voies de régulation de la réparation de l’ADNThe non-random organization of the eukaryotic cell nucleus and the folding of genome in chromatin more or less condensed can influence many functions related to DNA metabolism, including genome stability. Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA damages for the cells. To preserve genome integrity, eukaryotic cells thus developed DSB repair mechanisms conserved from yeast to human, among which homologous recombination (HR) that uses an intact homologous sequence to repair a broken chromosome. HR can be separated in two sub-pathways: Gene Conversion (GC) transfers genetic information from one molecule to its homologous and Break Induced Replication (BIR) establishes a replication fork than can proceed until the chromosome end.My doctorate work was focused on the contribution of the chromatin context and 3D genome organization on DSB repair. In S. cerevisiae, nuclear organization and heterochromatin spreading at subtelomeres can be modified through the overexpression of the Sir3 or sir3A2Q mutant proteins. We demonstrated that reducing the physical distance between homologous sequences increased GC rates, reinforcing the notion that homology search is a limiting step for recombination. We also showed that heterochromatinization of DSB site fine-tunes DSB resection, limiting the loss of the DSB ends required to perform homology search and complete HR. Finally, we noticed that the presence of heterochromatin at the donor locus decreased both GC and BIR efficiencies, probably by affecting strand invasion. This work highlights new regulatory pathways of DNA repair
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Quintart, Anne. "Mise au point d'un test de réparation des cassures double-brin de l'ADN, application au déficit immunitaire T(-) B(-) caractérisé par un défaut de recombinaison V(D)J avec radiosensibilité accrue". Paris 5, 2001. http://www.theses.fr/2001PA05P019.
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Grabarz, Anastazja. "Réparation des cassures double brin de l'adn chez les mammifères : rôle des protéines MRE11 et BLM dans l’initiation de la ligature d’extrémités non homologues (NHEJ )". Thesis, Paris 11, 2011. http://www.theses.fr/2011PA112172.
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Les cassures double brin de l’ADN (CDB) sont des lésions qui peuvent conduire à des réarrangements génétiques. Deux voies sont impliquées dans la réparation de ces dommages: la recombinaison homologue (HR) et la ligature d’extrémités nonhomologues (NHEJ).Au laboratoire un substrat intrachromosomique permettant de mesurer l’efficacité et la fidélité du NHEJ à été mis en place (Guirouilh-Barbat 2004). Cette approche a permis de démontrer l’existence d’une voie alternative à KU qui utilise des microhomologies présentes de part et d’autre de la cassure - le NHEJ alternatif (Guirouilh-Barbat 2004, Guirouilh-Barbat et Rass 2007). Les travaux de ma thèse consistent à caractériser les principaux acteurs de cette voie. En absence de KU, cette voie alternative du NHEJ, s'initierait tout d’abord parla résection d'extrémités d’ADN non protégées. Nous avons montré que l’activité nucléasique de MRE11 est nécessaire à ce mécanisme. La surexpression de MRE11 conduit à une stimulation du NHEJ, contrairement à l’extinction de la protéine par siRNA, résultant en une baisse de son efficacité de deux fois. Nos résultats montrent également que les protéines RAD50 et CtIP agissent dans la même voie que MRE11. De plus, dans les cellules déficientes pour XRCC4, la MIRIN – un inhibiteur du complexe MRN - conduit à une chute de l'efficacité de la réparation, démontrant le rôle de MRE11 dans la voie alternative du NHEJ. Nous avons aussi montré que MRE11 peut agir de manière dépendante et indépendante de la kinase ATM (Rass et Grabarz, Nat Struct Mol Biol 2009). L'initiation de la résection de la cassure doit être ensuite poursuivie par une dégradation plus importante de l'ADN qui est assuré par les protéines Exo1 et Sgs1/Dna2 chez la levure. Chez les mammifères, des études in vitro suggèrent un modèle similaire à deux étapes. Nous avons choisi de nous intéresser au rôle de la protéine BLM, qui est l’un des homologues humains de la RecQ hélicase Sgs1, dans la résection. Nos expériences montrent que l’absence de BLM diminue l’efficacité du NHEJ. De plus, l’extinction de BLM conduit à une augmentation d’évènements infidèles lors de la réparation par NHEJ et l’apparition d’évènements de résection de grande taille (>200nt). Ceci suggère que BLM protège contre de longues résections lors de la mise en place du NHEJ alternatif. De manière cohérente, BLM est impliquée dans la protection contre la résection dépendante de CtIP lors des étapes précoces de la recombinaison homologue. En conclusion, nos résultats montrent un rôle prédominant de BLM dans la protection contre un excès de résection médiée par CtIP. BLM interagit avec 53BP1 aux sites de dommages de manière dépendante d’ATM afin de réguler le processus de résection, en contrecarrant l’action de BRCA1. Ceci souligne à nouveau le rôle essentiel de BLM dans la protection contre la résection et la favorisation de la conversion génique sans crossing-over, ce qui est primordial pour le maintien de la stabilité du génomeDNA double strand breaks (DSBs) are highly cytotoxic lesions, which can lead to genetic rearrangements. Two pathways are responsible for repairing these lesions : homologous recombination (HR) and non homologous end joining (NHEJ). In our laboratory, an intrachromosomal substrate has been established in order to measure the efficiency and the fidelity of NHEJ in living cells (Guirouilh-Barbat 2004). This approach led us to identify a KU-independent alternative pathway, which uses microhomologies in the proximity of the junction to accomplish repair – the alternative NHEJ (Guirouilh-Barbat 2004, Guirouilh-Barbat et Rass 2007). The goal of my thesis consisted in identifying and characterising major actors of this pathway. In the absence of KU, alternative NHEJ would be initiated by ssDNA resection of damaged ends. We showed that the nuclease activity of MRE11 is necessary for this mechanism. MRE11 overexpression leads to a two fold stimulation of NHEJ efficiency, while the extinction of MRE11 by siRNA results in a two fold decrease. Our results demonstrate that the proteins RAD50 and CtIP act in the same pathway as MRE11. Moreover, in cells deficient for XRCC4, MIRIN – an inhibitor of the MRN complex – leads to a decrease in repair efficiency, implicating MRE11 in alternative NHEJ. We also showed that MRE11 can act in an ATM-dependent and independent manner (Rass et Grabarz Nat Struct Mol Biol 2009). The initiation of break resection needs to be pursued by a more extensive degradation of DNA, which is accomplished in yeast by the proteins Exo1 and Sgs1/Dna2. In human cells, in vitro studies have recently proposed a similar model of a two-step break resection. We chose to elucidate the role of one of the human homologs of Sgs1 – the RecQ helicase BLM – in the resection process. Our experiments show, that he absence of BLM decreases the efficiency of end joining by NHEJ, accompanied by an increase in error-prone events, especially long-range deletions (>200nt). This suggests that BLM protects against extensive resection during alternative NHEJ. Furthermore, BLM is implicated in the protection against CtIP-dependent resection at the initiation of HR. In conclusion, our results show a major role of BLM in protecting against an excess of resection, mediated by the MRN cofactor – CtIP. BLM interacts with 53BP1 at sites of damage, in an ATM-dependent manner, in order to regulate the resection process and counteract BRCA1 activity. This underlines the novel role of BLM in the protection against resection and favouring gene conversion events without crossing-over, which is substantial for maintaining genomic integrity
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Mamouni, Kenza. "Rôle de la GTPase RhoB dans la réponse aux dommages à l'ADN induits par la camptothécine". Toulouse 3, 2013. http://thesesups.ups-tlse.fr/2031/.
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RhoB est une GTPase impliquée dans diverses fonctions intracellulaires comme l'organisation du cytosquelette. En plus de ses rôles bien établis, RhoB a récemment émergé comme un gène de réponse précoce aux dommages à l'ADN. RhoB est surexprimée et activée en réponse à divers génotoxiques bien que les mécanismes d'induction et la relevance fonctionnelle de cette induction restent mal compris. RhoB possède également des propriétés de suppresseur de tumeurs. Son expression diminue lors de la progression tumorale et la perte de RhoB favorise la prolifération cellulaire et l'invasion. Pour étudier le rôle de RhoB dans la réponse aux dommages à l'ADN et son implication potentielle dans la progression tumorale, nous avons utilisé la camptothécine (CPT), un inhibiteur sélectif de la topoisomérase I qui produit des cassures double-brin (DSBs) de l'ADN. Nous montrons que, dans les cellules traitées par la CPT, les DSBs induisent l'expression de RhoB par un mécanisme qui dépend de Chk2 et de son substrat HuR qui se lie à l'ARNm de RhoB et prévient sa dégradation. Des cellules déficientes en RhoB présentent un défaut de déphosphorylation de gamma-H2AX après le retrait de la CPT, suggérant un défaut de réparation des DSBs. Ces cellules présentent également une diminution de l'activité de PP2A, une phosphatase pour gamma-H2AX et d'autres protéines de la signalisation et de la réparation des dommages à l'ADN. Nous proposons que les DSBs activent une voie Chk2-HuR-RhoB qui favorise la déphosphorylation de gamma-H2AX par PP2A. Enfin, nous montrons que les cellules déficientes en RhoB accumulent du gamma-H2AX endogène et des anomalies chromosomiques, suggérant que la perte de RhoB augmente l'instabilité génomique induite par les DSBs et la progression tumoraleRhoB is a GTPase implicated in various intracellular functions such as cytoskeletal organization. Besides its well-established roles, RhoB recently emerged as an early DNA damage-inducible gene. RhoB is overexpressed and activated in response to various genotoxics although the mechanism of induction and functional relevance remain unclear. RhoB also possesses tumor suppressor properties. Its expression decreases during tumor progression and loss of RhoB promotes cell proliferation and invasion. To study the role of RhoB in the DNA damage response and its potential implication in tumor progression, we used camptothecin (CPT), a selective inhibitor of topoisomerase I that produces DNA double-strand breaks (DSBs). We show that, in CPT-treated cells, DSBs induce RhoB expression by a mechanism that depends on Chk2 and its substrate HuR that binds to and protects RhoB mRNA against degradation. RhoB deficient cells fail to dephosphorylate gamma-H2AX following CPT removal suggesting defective DSB repair. These cells also show decreased activity of PP2A, a phosphatase for gamma-H2AX and other DNA damage signaling and repair proteins. We propose that DSBs activate a Chk2-HuR-RhoB pathway that promotes PP2A-mediated dephosphorylation of gamma-H2AX. Finally, we show that RhoB deficient cells accumulate endogenous gamma-H2AX and chromosomal abnormalities, suggesting that RhoB loss increases DSB-mediated genomic instability and tumor progression
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Fouquin, Alexis. "Fonctions et régulations des protéines PARP2 et de XRCC1 dans la réparation des dommages à l’ADN". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLS236/document.
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Les modifications post-traductionnelles des protéines par des polymères d’ADP-ribose (PAR) ou par phosphorylation permet l’assemblage des complexes de la réparation de l’ADN à la chromatine endommagée dont les fonctions sont essentielles pour assurer le maintien de la stabilité du génome. En réponse aux lésions de l’ADN, l’activité de synthèse de PAR des protéines PARP1 et PARP2 est fortement stimulée. Les PAR servent de signalisation pour le recrutement de multiples protéines, dont la protéine plateforme XRCC1.Les études menées au cours de cette thèse ont porté sur l’étude de la régulation des fonctions des protéines PARP1, PARP2 dans la réparation des cassures double brins (CDB) et l’étude des modifications de XRCC1 par phosphorylation en réponse à des dommages de l’ADN. En utilisant des substrats permettant de mesurer l’efficacité des différentes voies de réparation des CDB, nous avons démontré que PARP2, et non PARP1, est impliqué dans la régulation du choix des voies de la réparation des CDB. Plus spécifiquement, nous avons montré que PARP2 stimule l’initiation de la résection des extrémités des CDB dépendante de CtIP, indépendamment de son activité catalytique. Par des approches de vidéo-microscopie, nous avons pu déterminer que PARP2 limite l’accumulation de 53BP1 aux sites de dommages induits par micro-irradiation laser. Nous proposons que la protéine PARP2, en limitant le recrutement de la protéine 53BP1 aux sites de dommages, favorise la réparation des CDB dépendante de la résection des extrémités d’ADN, au détriment de la voie canonique de jonction des extrémités. Ces résultats sont les premiers démontrant un rôle de PARP2 dans le choix des voies de réparation des CDB.En parallèle, nous avons analysé comment la phosphorylation régule les fonctions de la protéine XRCC1. Par des approches in vitro et in vivo, nous avons pu déterminer que l’interdomaine 1 de XRCC1 est phosphorylé par la kinase CDK5. En réponse aux dommages induits par un agent alkylant, XRCC1 est activement déphosphorylé in vivo. De plus, nous avons observé que lorsque l’interdomaine 1 ne peut pas être phosphorylé in vitro, l’interaction de XRCC1 avec les PAR synthétisés par PARP1 et PARP2 augmente, et le recrutement de XRCC1 aux sites de dommages de l’ADN est accru. Ces résultats indiquent pour la première fois que la déphosphorylation de XRCC1 en réponse à un stress génotoxique participe activement à son recrutement aux sites de dommages.Dans leur ensemble, ces travaux ont contribué à améliorer nos connaissances fondamentales des réseaux de protéines impliquées dans la prise en charge des dommages de l’ADN. La compréhension de ces mécanismes est essentielle non seulement car ils participent au maintien de la stabilité du génome mais aussi du fait du développement exponentiel de nouvelles stratégies anti-tumorales qui visent à inhiber les voies de la réparation dans la but de cibler spécifiquement les cellules cancéreusesPost-translational modifications of proteins by polymers of ADP-ribose (PAR) or by phosphorylation allow the assembly of DNA repair protein complexes at damaged chromatin and are crucial to ensure genome stability. In response to DNA insults, the synthesis of PAR by the PARP1 and PARP2 proteins is strongly induced. PAR act as a signaling platform for the recruitment of multiples proteins at the sites of DNA damages, including the scaffold protein XRCC1. Research conducted during this PhD have been focused on studying the regulation of PARP1 and PARP2 functions in double-strands break repair (DSBR), and in investigating the role of XRCC1 modifications by phosphorylation in response to DNA damage.Using DNA repair assay allowing us to assess the accuracy of the different DSBR pathways, we demonstrated that PARP2, and not PARP1, is involved in the regulation of DNA double-strands break repair pathway choice. More precisely, we showed that PARP2 stimulates CtIP dependent initiation of end-resection at DSB, independently of its catalytic activity. By live cell imaging, we were able to determine that PARP2 limit 53BP1 accumulation at DNA damage sites induced by laser-microirradiation. We propose that by limiting 53BP1 accumulation at DNA damage sites, PARP2 stimulate DSB repair pathway that depend on DNA end-resection, thus counteracting the canonical end-joining pathway. These results are the first demonstrating a role for PARP2 in DNA DBSR pathway choice.In addition, we analyzed how the functions of XRCC1 are regulated by phosphorylation. Using in vitro and in vivo approaches, we were able to demonstrate that the linker 1 region of XRCC1 is phosphorylated by the CDK5 kinase. XRCC1 is actively dephosphorylated in response to DNA damage induced by an alkylating agent in vivo. We also observed that when the linker 1 cannot be phosphorylated, the XRCC1 interaction between the PAR synthetized by PARP1 and PARP2 is stimulated, and XRCC1 recruitement at the sites of DNA damage is far more efficient. These evidences indicate for the first time that the dephosphorylation of XRCC1 actively participate in its recruitment at the site of DNA damage. Put together, this work contributed to strengthen our fundamental knowledge of the protein network involved in the DNA damage response. Knowledge of those mechanisms is crucial since they participate in maintaining genome stability, and because new antitumoral drugs targeting DNA repair pathways in the attempt to specifically killed tumor cells are exponentially released
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Hoffbeck, Anne-Sophie. "Chromatin structure and DNA repair". Thesis, Strasbourg, 2013. http://www.theses.fr/2013STRAJ104/document.
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Notre génome est continuellement endommagé par des agents provoquant des lésions de l’ADN. Les cassures doubles brins de l’ADN (CDBs) sont les lésions les plus dangereuses. En effet, une CDB mal réparée peut mener à des aberrations de l’ADN pouvant conduire à l’apparition d’un cancer. Dans le but d’éviter les effets délétères des CDBs, nos cellules ont développé une voie de signalisation, nommée réponse aux dommages de l’ADN (RDA), permettant la détection des cassures et l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire afin d’arrêter le cycle pendant la réparation des CDBs. Une des caractéristiques principales de la RDA est l’accumulation d’un grand nombre de facteurs sur l’ADN autour de la cassure, formant un foyer visible en microscopie. Cependant, l’efficacité de réparation de l’ADN est entravée par la structure condensée de la chromatine environnante. Les mécanismes de réparation de l’ADN surmontent ce problème en recrutant de nombreuses protéines permettant le réarrangement de la chromatine afin de faciliter la réparation. Le but de mon travail de thèse est d’identifier de nouvelles protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine autour des CDBs. D’une part nous avons pour but d’identifier le protéome complet d’un foyer de réparation de l’ADN grâce à la technique PICh (Proteomics of Isolated Chromatin loci). D’autre part, nous étudions le rôle de l’oncoprotéine SET/TAF-1β, que nous avons identifié lors d’un criblage siRNA réalisé dans le but de découvrir de nouveaux facteurs chromatiniens impliqués dans la réparation des CDBsVarious DNA damaging agents, that can cause DNA lesions, assault constantly our genome. The most deleterious DNA lesions are the breaks occurring in both strands of DNA (Double stand breaks: DSBs). Inefficient repair of DSBs can lead to aberrations that may induce cancer. To avoid these deleterious effects of DSBs, cells have developed signalling cascades which entail detection of the lesions and spreading of the signal that leads to arrest in cell cycle progression and efficient repair. A major characteristic of DNA damage response (DDR) is the accumulation of a vast amount of proteins around the DSBs that are visible in the cell as DNA damage foci. However, efficient DNA repair is hampered by the fact that genomic DNA is packaged into chromatin. The DNA repair machinery overcomes this condensed structure to access damaged DNA by recruiting many proteins that remodel chromatin to facilitate efficient repair. The aim of my PhD work is to identify novel proteinsinvolved in the DDR and/or the remodelling of chromatin surrounding DSBs. On one hand, we take advantage of the PICh (Proteomics of Isolated Chromatin loci) technique and we aim to identify the entire proteome of DNA repair foci. On the other hand, we study the role of the oncogene SET/TAFIβ, a major hit of a siRNA screen performed to identify novel chromatin related proteins that play role in repair of DSBs
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Serra, Heïdi. "Etude des acteurs et des interactions entre les voies de recombinaison chez Arabidopsis thaliana". Thesis, Clermont-Ferrand 2, 2014. http://www.theses.fr/2014CLF22483/document.
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La réparation des cassures double brin (CDB) de l'ADN par recombinaison est essentielle au maintien de l'intégrité du génome de tous les être vivants. Ce processus doit cependant être finement régulé puisque la recombinaison peut générer des mutations ou des réarrangements chromosomiques, parfois extrêmement délétères pour la cellule. Les CDB peuvent être réparées par deux mécanismes : la recombinaison non homologue (ou jonction des extrémités d'ADN) ou la recombinaison homologue (impliquant une homologie de séquence entre les molécules recombinantes). Dans les cellules somatiques, les deux voies principales de recombinaison homologue (RH) sont la voie Synthesis Dependent Strand Annealing (SDSA) dépendante de la recombinase RAD51 et la voie Single Strand Annealing (SSA) indépendante de RAD51. Nos résultats ont d'abord mis en évidence un rôle inattendu de XRCC2, RAD51B et RAD51D - trois paralogues de RAD51 - dans la voie SSA. Nous avons confirmé que la fonction de la protéine XRCC2 dans la voie SSA ne dépend pas de RAD51, ce qui démontre que certains paralogues de RAD51 ont acquis des fonctions indépendantes de la recombinase. La différence de sévérité des phénotypes des mutants individuels ainsi que les analyses d'épistasie menées sur le double et le triple mutant suggèrent des fonctions individuelles de ces protéines au cours du SSA. Nous proposons qu'elles facilitent l'étape d'hybridation des deux séquences complémentaires situées de part et d'autre de la cassure, bien que ceci reste à confirmer par des études in vitro. L'étude des fonctions de l'hétérodimère XPF-ERCC1 - un complexe impliqué dans le clivage des extrémités d'ADN non homologues au cours des voies de RH - a révélé un rôle inhibiteur de ce complexe sur la voie SDSA. Cette action est dépendante de son activité endonucléasique et serait liée au clivage des longues extrémités 3' sortantes réalisant l'invasion d'un duplex d'ADN homologue, l'étape initiale de la voie SDSA. Notre étude a de plus confirmé que le rôle du complexe dépend de la longueur des extrémités non homologues chez Arabidopsis, comme chez les mammifères et la levure. Bien que le complexe XPF-ERCC1 soit essentiel au clivage des longues extrémités d'ADN non homologue, il n'est pas requis à l'élimination des courtes extrémités au cours de la RHThe repair of DNA double-strand breaks (DSB) by recombination is essential for the maintenance of genome integrity of all living organisms. However, recombination must be finely regulated as it can generate mutations or chromosomal rearrangements, sometimes extremely deleterious to the cell. DSB can be repaired by two classes of recombination mechanism: non-homologous recombination (or DNA End Joining) or homologous recombination (implicating DNA sequence homology between the recombining molecules). In somatic cells, the two main pathways of homologous recombination (HR) are RAD51-dependent Synthesis Dependent Strand Annealing (SDSA) and RAD51-independent Single Strand Annealing (SSA). Our results have demonstrated an unexpected role of XRCC2, RAD51B and RAD51D - three RAD51 paralogues – in the SSA pathway. We confirmed that the function of XRCC2 in SSA does not depend upon RAD51, thus demonstrating that some RAD51 paralogues have acquired RAD51 recombinase-independent functions. The different severities of individual mutant phenotypes and epistasis analyses carried out on the double and triple mutants suggest individual functions of these proteins in SSA recombination. We propose that they facilitate hybridization of the two complementary sequences located on both sides of the break, although this remains to be confirmed by in vitro experiments. Study of the roles of XPF-ERCC1 - a complex involved in the cleavage of non-homologous DNA ends during HR - revealed an inhibitory role of this complex on the SDSA pathway. This is dependent on its endonuclease activity and is probably due to the cleavage of long 3' ends performing the homologous DNA duplex invasion, the initial step of the SDSA pathway. Our analyses also confirmed that the role of the complex depends on the length of the nonhomologous ends, as seen in mammals and yeasts. Although XPF-ERCC1 is essential for the cleavage of long nonhomologous DNA ends, it is not required for the elimination of short ends during HR
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Saad, Hicham. "La dynamique de la chromatine en réponse aux cassures double-brin d'ADN". Toulouse 3, 2013. http://thesesups.ups-tlse.fr/2384/.
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Les cassures double brin d'ADN (DSBs) sont une menace majeure pour l'intégrité des chromosomes et la survie des cellules qui réagissent en déclenchant des voies de réparation. Toute réparation commence par la fixation du complexe formé par Ku70-Ku80 (Ku) qui protège les bouts de la DSB. Ku favorise la religature rapide des bouts de la cassure qui est sujette aux erreurs. La réparation la plus précise se fait par recombinaison homologue (HR). La résection de l'ADN prépare les bouts d'ADN à entamer une HR, elle génère de l'ADN simple brin (ssDNA) et est suivie par la recherche de la séquence homologue. La résection est la résultante de l'activité hélicase, endo et exonucleolytique de facteurs ultérieurement identifiés. Pendant ma thèse, j'ai étudié la dynamique de la résection, ainsi que les mouvements de la chromatine pendant et après ce processus. Cette étude, menée sur des cellules uniques et in vivo, a été permise après avoir développer une nouvelle technique de marquage fluorescent d'ADNDNA double strand breaks (DSBs) are a major threat to chromosome integrity and cell survival, repairing them is crucial. Repair begins with binding of the Ku70-Ku80 complex (Ku) to protect the exposed DNA ends until a repair pathway is chosen. Ku promotes the direct resealing of breaks by non-homologous end joining (NHEJ) but is error-prone. The most precise repair pathway is the replacement of the broken segment with an intact copy by homologous recombination (HR). The DNA end resection, which generates 3' single stranded DNA tails (ssDNA), is a critical step for initiating HR, and is followed by the homology search. Resection is the result of the helicase, endo and exonuleolytic activities of various factors, previously identified. During this dissertation, I focused on studying the resection dynamics and the chromatin movements that accompany and follows this step. This study, led on single living cells, was allowed after the developing of a compact fluorescent DNA labeling system
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Buisson, Rémi. "Rôles du suppresseur de tumeurs PALB2 dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN". Doctoral thesis, Université Laval, 2012. http://hdl.handle.net/20.500.11794/25970.
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Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013.Une personne sur trois au Canada sera affectée par une forme de cancer durant son existence. Aujourd’hui, il a été clairement démontré que les mutations dans l'information génétique sont l'événement initiateur du cancer. Les cassures double-brin de l'ADN font partie des lésions les plus dangereuses retrouvées dans les cellules puisqu'elles peuvent induire des mutations menant au cancer. La cellule possède plusieurs mécanismes pour réparer les cassures double-brin de l’ADN. La réparation par recombinaison homologue est le seul de ces mécanismes permettant aux cellules de réparer les cassures double-brin de l’ADN de manière fidèle sans créer d’autres mutations. Ce mécanisme dépend en majeure partie de la protéine RAD51 qui en catalyse les étapes essentielles. RAD51 a besoin d’autres cofacteurs appelés médiateurs, comme la protéine BRCA2, pour son fonctionnement. Récemment, PALB2 a été identifiée comme un régulateur clé de RAD51 et BRCA2, et donc de la réparation par recombinaison homologue. Les individus, avec des mutations de PALB2, possèdent une prédisposition au cancer du sein et à l’anémie de Fanconi. Le projet de mon doctorat consiste en la caractérisation biochimique de la protéine PALB2 afin de comprendre son rôle dans le contrôle et le fonctionnement de la réparation par recombinaison homologue. Nous avons montré que la protéine PALB2, comme BRCA2, est un médiateur de la recombinaison homologue. Dans les cellules, l’activité de PALB2 est contrôlée par sa dimérisation. En présence de dommages à l’ADN, la monomérisation de PALB2 provoque son activation et la stimulation de la formation du filament de RAD51. Finalement, nous avons découvert un nouveau partenaire des médiateurs PALB2 et BRCA2 : la polymérase r
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Boubakour-Azzouz, Imenne. "Réparation des cassures double brin de l'ADN et stabilité génomique dans les cellules de mammifères". Paris 7, 2006. http://www.theses.fr/2006PA077221.
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La réparation des cassures double brin de l'ADN (CDBs) est critique pour la survie cellulaire. Les deux voies principales qui assurent la réparation des CDBs chez les eucaryotes, le end-joining (EJ) et, à un moindre degré, la recombinaison homologue (RH), peuvent être mutagènes. Le but de mon travail de thèse a été de déterminer si certaines conditions de stress peuvent affecter l'équilibre efficacité versus fidélité de la réparation des cellules souches embryonnaires (ES) murines. Dans une première étude, nous avons examiné si deux CDBs colinéaires induites par la méganucléase I-Scel, à 9 kpb de distance, dans des régions non-homologues, peuvent provoquer des réarrangements génomiques par EJ. Parallèlement, nous avons développé un système d'étude de réparation des CDBs à l'aide de substrats extra-chromosomiques. Les CDBs sont mimées par des plasmides linéarisés in vitro avant leur transfection dans les cellules ES, plasmides qui peuvent être réparés par EJ ou par RH avec un plasmide portant une séquence homologue. Nous avons analysé les effets d'un stress (privation de sérum) qui bloque la prolifération des cellules ES, sur la contribution de chaque mécanisme de réparation, EJ et RH, et la « fidélité » de réparation de chacun. Nos systèmes ne nous ont pas permis de mesurer de façon précise les fréquences de RH et de EJ. Ils nous ont toutefois permis de montrer que dans des situations de stress qui conduisent à l'apparition de CDBs, la fidélité de la réparation peut ne pas être affectéeRepair of DNA double-strand breaks (DSBs) is critical for cell survival. However, both DSBs repair mechanisms, end-joining (EJ) and, to a lesser extent, homologous recombination (HR), can be mutagenic. The aim of my thesis work was to determine whether specific stress conditions can affect the balance between efficiency and fidelity of DSBs repair in murine embryonic stem cells (ES). In a fîrst study, we investigated whether two colinear DSBs induced by the méganuclease l-Scel 9 kbp apart, in two non-homologous regions, can trigger genomic rearrangements by end-joining. In a second study, we have developed a strategy based on plasmids recombination. Linear plasmids, used to mimic DSBs, are transfected in ES cells where they are repaired by EJ or HR with a plasmid sharing a homologous region. We analysed the effects of a growth-limiting stress (serum starvation) on the respective contributions of NHEJ and HR, and their fidelity. The Systems did not allow us to precisely determine the NHEJ and HR frequencies. However, our studies showed that in stress conditions induced by multiple DSBs, repair fidelity can be increased
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Charbonnel, Cyril. "Etude des voies de réparation des cassures double-brin d'ADN post-réplicatives chez Arabidopsis thaliana". Clermont-Ferrand 2, 2010. http://www.theses.fr/2010CLF22043.
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Parmi toutes les lésions que peut subir la molécule d'ADN, les cassures double-brin d'ADN (CDB) sont les plus délétères. Lorsque ce type de lésions est mal ou non réparé, elles induisent une instabilité chromosomique pouvant conduire à la mort cellulaire voire à une tumorogenèse chez les vertébrés. Les CDB peuvent être réparées par deux mécanismes de recombinaison différents : une réparation par recombinaison homologue (RH) ou une réparation par recombinaison non homologue (NRH). Pour étudier les réparations des CDB, nous avons développé une méthode d'analyse permettant de réaliser des cinétiques de réparation chez A. Thaliana. Cette méthode repose sur l'étude de l'apparition et de l'élimination de foci gammaH2AX, c'est-à-dire la marque des CDB. Tout d'abord, nous avons confirmé que la signalisation gammaH2AX des CDB est conservée chez la plante modèle : la phosphorylation du variant d'histone par les kinases AtATM ou AtATR est dépendant du complexe AtMre 116AtRad50-AtNbs1 suite à la formation de CDB radioinduites. Par la suite, nous avons montré que la protéine AtXrcc1 joue un rôle dans une voie alternative de réparation des CDB. Cette protéine agit indépendamment de l'hétérodimère Ku et de AtRad1. Nos données suggèrent donc l'existence de trois voies différentes de NHR chez les eucayotes supérieurs, la voie C-NHEJ (Ku-dépendante), la voie B-NHEJ (Xrcc-dépendante) et la voie MMEJ initialement décrite chez la levure, dépendante de Rad1). Puis, nous avons révélé que ces trois voies de NHR constituent la réponse majoritaire à la formation de CDB, et que la RH jouerait donc seuleument un rôle mineur au cours de la réparation
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Rass, Emilie. "Réparation des cassures double brin chez les mammifères : impact de XRCC4 et MRE11 sur la ligature d'extrémités non homologues". Paris 11, 2009. http://www.theses.fr/2009PA112236.
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Le NHEJ (ligature d’extrémités sans séquence homologue) est une voie majeure de réparation des cassures double brin (CDB). Un substrat intrachromosomique, établi au laboratoire a permis de montrer que la voie KU-dépendante du NHEJ est fidèle et s’accommode d’extrémités incompatibles. Ici, nous avons analysé l’impact de XRCC4 sur le NHEJ. Le phénotype létal des souris invalidées pour XRCC4 en comparaison à celui viable des souris invalidées pour KU pourrait s’expliquer par une altération différente des voies de réparation, notamment du NHEJ. Comparée aux cellules complémentées, l’efficacité du NHEJ est affectée dans les cellules déficientes pour XRCC4 sans être nulle. Elle n’est pas affectée dans les cellules déficientes pour KU. Il existe donc une voie alternative efficace en absence de KU. Le séquençage des cicatrices de réparation fait apparaître que de nombreux évènements de délétions, observées dans les cellules déficientes pour XRCC4 ou KU80, fait intervenir des microhomologies. Ceci suggère que la voie alternative est initiée par une résection simple brin permettant l’hybridation de microhomologies de chaque côté de la CDB. Nous avons analysé le rôle de l’activité nucléase de MRE11 dans le NHEJ. L’inhibition de Mre11 réduit l'efficacité du NHEJ sans affecter la distribution des évènements fidèles et infidèles, suggérant que les deux voies du NHEJ sont affectées. En revanche, l’activité nucléase de MRE11 stimule l’efficacité du NHEJ et favorise l’apparition d’évènements mutagènes, sans affecter l'utilisation des microhomologies ou la taille des délétions. L’étude des mécanismes du NHEJ permettrait une meilleure compréhension de la stabilité du génomeNHEJ (non homologous end joining) is one major pathway of double strand break repair (DSB). An intrachromosomal substrate designed in our laboratory has allowed the demonstration that Ku dependent NHEJ is error-free and can accommodate non cohesive ends. Here, we have analyzed the impact of XRCC4 on NHEJ. The deficiency of XRCC4 is lethal in mice, in contrast the Ku deficient mice are viable. This difference could be explained by a different efficiency in DNA repair and especially in NHEJ. Compared to complemented cells, the NHEJ efficiency is severely impaired in XRCC4 deficient cells. In contrast, KU deficiency does not affect the NHEJ efficiency, showing existence of an efficient alternative pathway. Sequencing of the break junction reveals that the majority of deletion events observed in XRCC4 or KU deficient cells involved microhomologies to promote the repair. These results suggest that alternative NHEJ is initiated through a resection step to allow annealing of microhomologies from both side of the DSB. We have analyzed the role of MRE11 nuclease activity on NHEJ. MRE11 inhibition reduces the efficiency of NHEJ without affecting the distribution of error-free and error-prone events, suggesting that both canonical and alternative NHEJ are affected. In contrast, MRE11 nuclease activity stimulates the NHEJ efficiency and favors mutagenic events, without affected the use of microhomologies or the deletion length. Characterization of NHEJ mechanisms should allow a better understanding of processes implicated in genome stability
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Vannier, Jean-Baptiste. "Rôle de protéines de la réparation des cassures double brin dans l'homéostasie télomérique chez Arabidopsis thaliana". Phd thesis, Université Blaise Pascal - Clermont-Ferrand II, 2009. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00725958.
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Les télomères sont des structures nucléoprotéiques spécialisées dont l'un des rôles est d'empêcher le raccourcissement progressif de l'extrémité des chromosomes suite à la réplication et à l'instabilité génomique due à la recombinaison de l'extrémité de chromosomes. Malgré le rôle des télomères dans la protection de l'extrémité des chromosomes contre les mécanismes de réparation de l'ADN et de recombinaison, de nombreuses protéines de ces voies jouent des rôles essentiels dans l'homéostasie télomérique et la stabilité des chromosomes. Parmi elles, la protéine RAD50 appartenant au complexe MRE11/RAD50/XRS25(NBS1) et l'endonucléase structure spécifique XPF/ERCC1 sont localisées aux télomères ; ces deux complexes connus pour leur rôle dans les voies de réparation de l'ADN ainsi que dans les études sur la recombinaison. Nous avons identifié deux rôles différents pour la protéine RAD50 dans la maintenance télomérique et dans la protection des extrémités des chromosomes, en contexte de présence et absence de la télomérase. L'absence d'AtRAD50 augmente significativement le nombre de fusions chromosomiques impliquant des télomères raccourcis. Nous proposons que ce rôle protecteur des télomères raccourcis de RAD50 est le résultat de sa fonction de contraindre la recombinaison entre chromatides soeurs et ainsi d'éviter les évènements de fusions par les extrémités. Nous avons recherché le ou des mécanismes impliqué(s) dans ces évènements de fusions chromosomiques chez les mutants atrad50 en réalisant des croisements entre les plantes déficientes pour ATRAD50 et des plantes déficientes pour des gènes codant des protéines des voies de réparation par recombinaison non-homologue et homologue. Au contraire de la situation en cellules de mammifères, nous n'avons pas observé d'instabilité chromosomique chez les plantes mutantes correspondantes pour XPF (AtRAD1) or ERCC1 (AtERCC1). Cependant, en absence de la télomérase, la mutation de l'un de ces deux gènes entraîne une augmentation précose et significative de l'instabilité chromosomique sans accélération générale de la perte des répétitions télomériques, mais associée à la présence de fragments ADN extrachromatiques visibles en cytologie. Une analyse intensive par FISH a permis d'identifier ces ADN comme des bras entiers spécifiques de deux chromosomes. Nos données indiquent un rôle protecteur de RAD1/ERCC1 comme l'invasion de l'ADN simple brin télométrique dans des séquences télomériques interstitielles. Le fait que les mutations de rad1 (ou ercc1) augmentent dramatiquement l'instabilité chromosomique des mutants télomérase a des implications très importantes pour les modèles des rôles de la recombinaison aux télomères.
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Arnould, Coline. "Rôle de l'organisation 3D de la chromatine dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN". Thesis, Toulouse 3, 2020. http://www.theses.fr/2020TOU30141.
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La réparation des cassures double-brin de l'ADN (DSB) est essentielle pour préserver l'intégrité du génome. Suite à l'apparition de DSB dans le génome, la PI3K kinase ATM permet la phosphorylation du variant d'histone H2AX sur un large domaine chromatinien de l'ordre du mégabase, qui constituera ainsi un foyer de réparation. La façon dont ces foyers sont assemblés aussi rapidement pour établir un environnement nucléaire favorable à la réparation n'est pas encore connue. Les TAD (Topologically Associated Domains) correspondent à des régions chromatiniennes organisées en 3D dans le noyau et sont déjà connus comme étant impliqués dans des processus cellulaires tels que la transcription ou la réplication. Cependant leur rôle dans la réparation de l'ADN n'est pas encore connu à ce jour. Nous avons ainsi pu montrer que les TAD sont des unités fonctionnelles de la réponse cellulaire aux dommages à l'ADN puisqu'ils servent de matrice à la formation des foyers de réparation. En effet, nous avons montré que la phosphorylation de H2AX sur un TAD entier est permise grâce à un processus d'extrusion de boucle de chromatine dépendant des cohésines et ayant lieu de part et d'autre de chaque DSB. Ces travaux ont permis de montrer le rôle majeur de la conformation des chromosomes dans la maintenance de l'intégrité du génome tout en mettant en évidence pour la première fois un exemple de modification de la chromatine grâce au processus d'extrusion de boucle de chromatine. D'autre part, nous avons montré que les TAD du génome entier sont renforcés en réponse aux DSB et jouent un rôle majeur dans la répression transcriptionnelle qui a lieu en cis des DSB. Enfin, nous avons démontré que des TAD entiers contenant une DSB sont capables de se déplacer au sein du noyau pour se regrouper entre eux en G1. De façon importante, nous avons montré que ce regroupement des TAD endommagés peut conduire à la formation de translocations, évènement pouvant mener à l'apparition de cancersDNA Double-Strand Breaks (DSBs) repair is essential to safeguard genome integrity. Upon DSBs, the ATM PI3K kinase rapidly triggers the establishment of a megabase-sized, ƴH2AXdecorated chromatin domains which further act as seeds for the formation of DNA Damage Response (DDR) foci. How these foci are rapidly assembled in order to establish a "repairprone" environment within the nucleus is yet unclear. Topologically Associating Domains (TADs) are a key feature of 3D genome organization that regulate transcription and replication, but little is known about their contribution to DNA repair processes. We found that TADs are functional units of the DDR, instrumental for the correct establishment of ƴH2AX/53BP1 chromatin domains in a manner that involves cohesin-mediated loop extrusion on both sides of the DSB. Indeed, we showed that H2AX-containing nucleosomes are rapidly phosphorylated as they actively pass by DSB-anchored cohesin. This work highlights the critical impact of chromosome conformation in the maintenance of genome integrity and provides the first example of a chromatin modification established by loop extrusion. In another hand, we found that TADs of the wole genome are reinforced following DSB induction and that TADs play a major role in the down-regulation of the transcription which takes place in cis of DSBs. Finally, we found that damaged-TADs can move across the nucleus to cluster together in the G1 phase of the cell cycle. We also found that damaged-TADs clustering can lead to the formation of translocations, which are often at the origin of cancers
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Saidj, Rachid. "Les gènes BRCA et FANC : implication dans la réparation des cassures double brin de l'ADN chez l'homme". Paris 5, 2006. http://www.theses.fr/2006PA05P609.
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Les gènes BRCA et FANC, impliqués respectivement dans la prédisposition familiale au cancer du sein et dans l'anémie de Fanconi, font partie des gènes suppresseurs de tumeurs de type " caretakers " et jouent un rôle important dans le maintien de la stabilité du génome. Ces gènes sont étroitement associés et pourraient participer dans une voie métabolique commune. L'objectif de mon travail de thèse à été de mieux comprendre leur rôle dans la réparation des cassures double brin de l'ADN (CDB) chez l'Homme. En utilisant des approches moléculaires basées sur l'utilisation de substrats extrachromosomiques ou intégrés dans le génome, porteurs de CDB-modèles, nous avons examiné l'impact de l'inactivation de ces gènes, par ARN interférant, sur le fonctionnement des deux voies majeures de réparation des CDB : la voie End-Joining (EJ) et la Recombinaison Homologue (RH). Nous avons montré que : (i) la déplétion de BRCA1 affecte sévèrement le processus EJ ; (ii) le lien moléculaire entre BRCA1 et cette voie de réparation est l'association de BRCA1 avec XRCC4, l'un des acteurs principaux de ce mécanisme : (iii) les produits des gènes FANCF et FANCG, appartenant au core complexe FANC, contrôlent la voie EJ, mais ne sont pas impliqués dans la RH ; (iv) FANCJ et FANCD1/BRCA2, dont l'action se situe en aval du complexe FANC (comme BRCA1), contrôlent la RH. En conclusion, l'ensemble des résultats montre que la voie BRCA/FANC intervient dans la réparation des CDB et suggère une spécialisation fine des gènes qui y participentThe BRCA and FANC genes (respectively implicated in breast cancer predisposition and in Fanconi anemia) are classified as “caretakers” tumor suppressor genes and are involved in the maintenance of genomic stability. These genes are tightly associated and could participate in a common pathway. The aim of my thesis work was to improve our understanding of there function in the DNA double strand break (DSB) repair in Human cells. By using molecular approaches based on intra- or extra- chromosomal substrates, carrying model-DSB, we studied the impact of siRNA mediated depletion of these factors on the two major DSB repair pathways in mammalian cells: End-joining (EJ) and Homologous Recombination (HR). We have shown that: (i) BRCA1 depletion severely impairs the EJ pathway, (ii) the novel interaction between BRCA1 and XRCC4 (a key actor of EJ), constitutes a molecular and functional link between BRCA1 and this repair pathway; (iii) depletion of the Fanconi genes products FANCF and FANCG, which belong to the core complex, leads to an impairment of EJ but does not affect HR; (iv) FANCJ and FANCD1/BRCA2 which act downstream of the complex, control HR. On conclusion, our work shows that the BRCA/FANC pathway is implicated in DSB repair, and suggests a tight specialisation of each gene
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Baldeyron, Céline. "Implication des gènes BRCA et FANC dans la réparation des cassures double brin de l'ADN chez l'Homme". Paris 7, 2003. http://www.theses.fr/2003PA077199.
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Laulier, Corentin. "Impact des protéines de la famille Bcl-2 sur la réparation des cassures double-brin de l'ADN". Paris 11, 2008. http://www.theses.fr/2008PA112136.
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Les systèmes de réparation de l’ADN permettent le maintien de l’intégrité du génome en assurant un contrôle entre variabilité et stabilité du génome. Le stress génotoxique est un stimulus majeur du déclenchement de l’apoptose. Les cassures double brin (CDB) de l’ADN notamment sont les plus toxiques pour la cellule. Bcl-2 étant anti-apoptotique, sa surexpression rend les cellules plus résistantes aux stress génotoxiques. Nous avons ici étudié comment des cellules protégées contre l’apoptose par Bcl-2 gèrent la présence de cassures dans leur génome. Dans cette thèse, nous montrons que l’ancrage de Bcl-2 à la mitochondrie est nécessaire et suffisant pour inhiber la RH. De plus, la surexpression de Bcl-2 inhibe la formation des foci BRCA1. Confirmant l’hypothèse que cette diminution des foci BRCA1 est liée à l’inhibition de la RH, l’ancrage de Bcl-2 à la membrane mitochondriale est également suffisant pour inhiber l’induction des foci BRCA1. En revanche, une surexpression de BRCA1 permet de compenser l’inhibition de RH par Bcl-2. Une analyse par microscopie montre que Bcl-2 induit une localisation anormale de BRCA1. Nous montrons aussi que Bcl-2 affecte la réparation des CDB par NHEJ (Non-Homologous-End-Joining). Enfin, nous avons confirmé les effets de Bcl-2 sur la réparation des cassures double brins dans des lignées de lymphomes B présentant une surexpression de Bcl-2. Les protéines de la famille Bcl-2 ayant des effets antagonistes sur la régulation de l’apoptose, nous avons tenté de déterminer si cet antagonisme entre membre pro et anti-apoptotiques existe également pour la régulation de la RH. L’expression de protéines pro-apoptotiques telles que Bax ou Bid inhibe la RH induite par une CDB. Ce travail montre que contrairement à l’antagonisme qui existe entre les membres de la famille Bcl-2 pour la régulation de l’apoptose, la surexpression de membres aussi bien pro qu’anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 inhibe la RHIn addition to the canonical anti-apoptotic role of Bcl-2, there is also accumulating evidence showing that it has a negative impact on genome stability. In this thesis, we show that Bcl-2 family members, including the only-BH3 Bid protein, inhibit homologous recombination (HR) independently of their role in apoptosis. We show that while the BH3 domain of Bcl-2 is not required for HR repression, its transmembrane (TM) domain is essential for this process. We further show that recombinant Bcl-2 bearing a specific mitochondrial anchoring TM, but not a reticulum endoplasmic anchoring TM, causes full HR repression. Consistently, only HR-repressing Bcl-2 forms impair the foci formation of BRCA1 protein, a breast tumor suppressor essential for HR. Hence, our data uncover an important molecular end-point of the mitochondrial retrograde response that affects the maintenance of nuclear genome stability
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Marmignon, Antoine. "Couplage entre introduction et réparation des cassures double brin pendant les réarrangements programmés du génome de Paramecium tetraurelia". Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2013. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00923174.
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L'élimination programmée d'ADN spécifique de la lignée germinale pour former un nouveau noyau somatique a été décrite chez les eucaryotes. Ces réarrangements sont initiés par l'introduction de cassures double brin (CDB) de l'ADN et la préservation de l'intégrité du génome requiert une réparation efficace. Chez Paramecium tetraurelia, le génome est largement réarrangé pendant le développement du nouveau noyau somatique, après l'introduction de milliers de cassures double brin programmées par la transposase domestiquée PiggyMac (Pgm)Ces réarrangements consistent en l'excision précise de dizaines de milliers de séquences uniques et non codantes (IES) qui interrompent 47% des gènes dans la lignée germinale ; et l'élimination hétérogène de séquences répétées qui mène à des délétions internes de taille variable ou à la fragmentation des chromosomes avec addition de télomères aux extrémités.L'implication de la voie du Non Homologous End Joining (NHEJ) dans l'excision précise des IES a été prouvée. Dans des cellules déplétées de Ligase IV ou XRCC4, les cassures aux bornes des IES sont introduites normalement mais il n'y a pas de jonctions d'excision formées et les extrémités cassées s'accumulent sans être dégradées. Mais la voie de réparation impliquée dans les réarrangements imprécis est encore inconnue. L'hypothèse d'une réparation par la voie NHEJ alternative (alt-NHEJ), indépendante de Ku et impliquant la résection des extrémités et l'utilisation de microhomologie, a été émise. C'est pourquoi pendant ma thèse je me suis intéressé à ma thèse au rôle des protéines Ku.Deux gènes KU70 et trois gènes KU80 ont été identifiés dans le génome de la paramécie. KU70a et KU80c sont spécifiquement induits pendant les réarrangements programmés du génome et les protéines localisent dans les noyaux somatiques en développement. Des expériences d'extinction de ces gènes par ARN interférence ont prouvé que ces gènes étaient indispensables. Au niveau moléculaire, l'ADN non réarrangé est amplifié dans les cellules déplétées de Ku. De plus, les cassures double brin programmées ne sont pas introduites aux bornes des IES.Mes résultats suggèrent que Ku fait partie d'un complexe de pré-excision, avec la transposase domestiquée Pgm, et est nécessaire pour l'introduction des cassures double brin programmées pendant les réarrangements programmés du génome.
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Bordelet, Hélène. "Régulation de la résection aux cassures double-brin par l'hétérochromatine SIR dépendante". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019SACLS300.
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L'hétérochromatine est une caractéristique conservée des chromosomes eucaryotes, avec des rôles centraux dans la régulation de l'expression des gènes et le maintien de la stabilité du génome. Comment la réparation de l'ADN est régulée par l'hétérochromatine reste mal compris. Chez Saccharomyces cerevisiae, le complexe SIR (Silent Information Regulator) assemble une fibre de chromatine compacte. La chromatine SIR limite la résection aux cassures double-brin (DSB) protégeant les extrémités chromosomiques endommagées contre la perte d'informations génétiques. Toutefois, lesquels des trois complexes de résection redondants, MRX-Sae2, Exo1 et Sgs1-Dna2 sont inhibés et par quel(s) mécanisme(s) reste à decouvrir. Nous montrons que Sir3, le facteur de fixation des histones de l’hétérochromatine de Saccharomyces cerevisiae, interagit physiquement avec Sae2 et inhibe toutes ses fonctions. Cette interaction limite notamment la résection médiée par Sae2, stabilise MRX à la DSB et augmente le Non-Homologous End Joining (NHEJ). De plus, la chromatine répressive SIR inhibe partiellement les deux voies de résection extensive médiées par Exo1 et Sgs1-Dna2 par des mécanismes distincts. L'inhibition par les SIR de la résection extensive et de Sae2 favorise la NHEJ et limite le Break-Induced Replication (BIR), prévenant ainsi de la perte d'hétérozygotie au niveau des subtélomèresHeterochromatin is a conserved feature of eukaryotic chromosomes, with central roles in regulation of gene expression and maintenance of genome stability. How DNA repair occurs in heterochromatin remains poorly described. In Saccharomyces cerevisiae, the Silent Information Regulator (SIR) complex assembles a compact chromatin fibre. SIR-mediated repressive chromatin limits Double Strand Break (DSB) resection protecting damaged chromosome ends against the loss of genetic information. However, which of the three redundant resection complexes, MRX-Sae2, Exo1 and Sgs1-Dna2 are inhibited and by which mechanism remains to be deciphered. We show that Sir3, the histone-binding factor of yeast heterochromatin, physically interacts with Sae2-mediated resection and inhibits all its functions. Notably, this interaction limits Sae2-mediated resection, delays MRX removal from DSB ends and promotes Non-Homologous End Joining (NHEJ). In addition, SIR-mediated repressive chromatin partially inhibits the two long range resection pathways mediated by Exo1 and Sgs1-Dna2 by distinct mechanisms. Altogether SIR mediated inhibition of extensive resection and of Sae2 promotes NHEJ and limits Break-Induced Replication (BIR) preventing loss of heterozygosity at subtelomeres
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Moretton, Amandine. "Mécanismes de maintenance de l'intégrité de l'ADN mitochondrial humain suite à des cassures double-brin". Thesis, Université Clermont Auvergne (2017-2020), 2017. http://www.theses.fr/2017CLFAC047/document.
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Les mitochondries sont des organites qui possèdent leur propre ADN (ADNmt), codant pour des gènes de la chaine respiratoire. La réparation des dommages dus aux ROS, une réplication défectueuse ou d’autres sources exogènes tels des agents chimiothérapeutiques ou des irradiations ionisantes peuvent générer des cassures double-brin (CDB) de l’ADNmt. L’ADNmt code pour des protéines essentielles à la production d’énergie, et des systèmes de maintenance de l’intégrité de ce génome efficaces sont donc nécessaires pour la viabilité des cellules. En effet des mutations de l’ADNmt sont présentes dans de nombreuses pathologies comme les myopathies mitochondriales, les cancers et les maladies neurodégénératives. Cependant les processus responsables de la maintenance de l’ADNmt suite à des CDB restent controversés.Pour élucider les mécanismes impliqués, nous avons généré des CDB mitochondriales en utilisant une lignée cellulaire humaine exprimant de manière inductible l’enzyme de restriction PstI liée à une séquence d’adressage mitochondrial. Nos résultats montrent, dans notre système, une première phase de dégradation de l’ADNmt lésé avec une cinétique rapide, n’impliquant pas l’autophagie ou l’apoptose, suivie de la ré-amplification d’ADNmt intact dans un deuxième temps. Contrairement à d’autres études nous n’avons pas pu détecter d’évènements de réparation des CDB mitochondriales générées. Nous avons ensuite cherché à identifier les protéines impliquées dans la dégradation de l’ADNmt lésé que nous observons, mais aucune nucléase testée ne semble responsable de ce processus. Des approches plus globales sont mises au point pour identifier de nouveaux acteurs, notamment un crible RNAi à grande échelle. Parallèlement nous nous intéressons aussi à une famille de phosphohydrolases, les Nudix, et à leur rôle protecteur en assainissant le réservoir de nucléotides libresMitochondria are organelles that possess their own genome, the mitochondrial DNA (mtDNA). Repair of oxidative damages, defective replication, or various exogenous sources, such as chemotherapeutic agents or ionizing radiations, can generate double-strand breaks (DSBs) in mtDNA. MtDNA encodes for essential proteins involved in ATP production and maintenance of integrity of this genome is thus of crucial importance. Mutations in mtDNA are indeed found in numerous pathologies such as mitochondrial myopathies, neurodegenerative disorders or cancers. However, the mechanisms involved in mtDNA maintenance after DSBs remain unknown.To elucidate this question, we have generated mtDNA DSBs using a human inducible cell system expressing the restriction enzyme PstI targeted to mitochondria. Using this system, we could not find any support for DSBs repair of mtDNA. Instead we observed a loss of the damaged mtDNA molecules and a severe decrease in mtDNA content, followed by reamplification of intact mtDNA molecules. We have demonstrated that none of the known mitochondrial nucleases are involved in mtDNA degradation and that DNA loss is not due to autophagy, mitophagy or apoptosis but to a selective mechanism. Our study suggests that a still uncharacterized pathway for the targeted degradation of damaged mtDNA in a mitophagy/autophagy-independent manner is present in mitochondria, and might provide the main mechanism used by the cells to deal with DSBs. Global approaches are ongoing to identify proteins involved in degradation of damaged mtDNA following DSBs, mainly an RNAi screen targeting 80 nucleases. In parallel we are interested in a family of phosphohydrolases named Nudix and their putative protective role in sanitizing the nucleotides pool in mitochondria
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Bombarde, Oriane. "La stabilité télomérique : étude fondamentale et applications thérapeutiques". Toulouse 3, 2009. http://thesesups.ups-tlse.fr/785/.
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Dans la plupart des cellules somatiques, en absence de la télomérase, les extrémités des chromosomes appelées télomères, raccourcissent au cours des divisions cellulaires, jusqu'à atteindre une taille limite qui définit la capacité proliférative des cellules. La réactivation de la télomérase provoque une prolifération infinie des cellules : c'est l'immortalisation cellulaire, un processus clé de la cancérogenèse. La molécule ID3-010 présente in vitro pour les structures en G-quadruplex (se formant au niveau des télomères) une affinité 10000 fois supérieure par rapport aux duplex ADN. Malgré une bonne inhibition de la télomérase in vitro, cette molécule s'est révélée inapte à provoquer l'arrêt de prolifération des cellules cancéreuses. Contrairement aux cassures double-brin de l'ADN (CDB), les télomères sont peu réactifs vis à vis des mécanismes de religature de ces cassures. Le mécanisme C-NHEJ ("non-homologous end-joining" classique) est majoritairement responsable de la réparation des CDB dans les cellules humaines. Dans un 2ème projet, j'ai étudié les mécanismes d'inhibition de la C-NHEJ aux télomères. J'ai montré que l'inhibition de la C-NHEJ est basée sur une compétition entre les protéines télomériques TRF2/RAP1 et les protéines de la C-NHEJ, KU et DNA-PKcs. De façon paradoxale, ces protéines de la C-NHEJ sont nécessaires à la stabilité télomérique car leur absence conduit à des fusions dépendantes d'un mécanisme alternatif de ligation (B-NHEJ). Il est proposé un modèle de double protection des télomères contre leur ligature dans lequel les protéines TRF2/RAP1 inhibent la C-NHEJ via un contrôle négatif de KU et DNA-PKcs qui en retour inhibent la voie B- NHEJIn absence of telomerase, telomere decrease during cells divisions, until a limitant length which define the proliferative capacity of cells. Reactivation of telomerase causes a infinite proliferation of cells : it's cell immortalization, a key process of cancerogenesis. ID3-010 molecule had in vitro an affinity 10000 fold high for G-quadruplex (structures formed in telomere) rather than DNA duplex. Despite of a good inhibition of telomerase in vitro, this molecule can't inhibit cancer cell proliferation. Contrary to DNA double strand break (DSB), natural extremities of telomere don't react with ligation or signalization mechanisms. C-NHEJ mechanism (classical non-homologous end-joining) repairs most of DSB in human cells. In the second project of my thesis, I study the inhibition mechanism of C-NHEJ in telomere. I show with ligation and pulldown experiment that inhibition of C-NHEJ is supported by a competition between telomeric proteins TRF2/RAP1 and C-NHEJ proteins KU and DNA-PKcs. Paradoxically, KU and DNA-PKcs are necessary to telomeric stability. Indeed, lack of this proteins causes fusions with a alternative ligation mechanism (B-NHEJ). We propose a model of double protection of telomere against ligation in which TRF2/RAP1 inhibit C-NHEJ via a negative control of KU and DNA-PKcs, themselves inhibit B-NHEJ
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Yuan, Ying. "Modulation of DNA double strand breaks end-joining pathway choice by single stranded oligonucleotides in mammalian cells". Thesis, Toulouse 3, 2015. http://www.theses.fr/2015TOU30091.
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En réponse aux dommages de son génome, le choix par la cellule de la voie de réparation de l'ADN est un crucial par ses conséquences en termes de mutagénèse et de survie. Pour faire face aux cassures double-brin de l'ADN (CDB), les cellules humaines possèdent deux voies principales qui consistent soit à rejoindre les extrémités de la cassure par jonction d'extrémités non-homologues (voie conventionnelle C-NHEJ), soit à reconstituer par recombinaison homologue la séquence clivée en copiant son double non endommagé présent après la réplication (voie RH). La RH nécessite de dégrader l'un des brins d'ADN de part et d'autre de la cassure. Cette dégradation produit de courts fragments d'ADN simple-brin, connus pour aider à signaler le dommage à la cellule. Dans ce travail, nous avons évalué directement l'effet de ces fragments d'ADN simple brin sur la réparation des CDB dans des expériences biochimiques et cellulaires. Nous montrons que de courts fragments d'ADN simple-brin inhibent la C-NHEJ en inactivant sa protéine clef Ku, tout en stimulant une forme minoritaire de jonction des cassures dite NHEJ alternative (A-EJ). Ces travaux permettent de mieux comprendre comment la réparation par la voie peu connue A-EJ peut s'exprimer dans les cellules mais aussi d'envisager des stratégies pour piloter la réponse des cellules cancéreuses aux thérapies induisant des CDBIn response to DNA damage, the choice made by the cells between DNA repair mechanisms is crucial for mutagenic and survival outcomes. In humans, DNA double-strand breaks are repaired by two mutually-exclusive mechanisms, homologous recombination or end-joining. Among end-joining mechanisms, the main process is classical non-homologous end-joining (C-NHEJ) which relies on Ku binding to DNA ends and DNA Ligase IV (Lig4)-mediated ligation. Mostly under Ku- or Lig4-defective conditions, an alternative end-joining process (A-EJ) can operate and exhibits a trend toward microhomology usage at the break junction. Homologous recombination relies on an initial MRN-dependent nucleolytic degradation of one strand at DNA ends. This process, named DNA resection generates 3' single-stranded tails necessary for homologous pairing with the sister chromatid. While it is believed from the current literature that the balance between joining and recombination processes at DSBs ends is mainly dependent on the initiation of resection, it has also been shown that MRN activity can generate short single-stranded DNA oligonucleotides (ssO) that may also be implicated in repair regulation. In this work, we evaluate the effect of ssO on end-joining at DSB sites both in vitro and in cells. Under both conditions, we report that ssO inhibit C-NHEJ through binding to Ku and favor repair by the Lig4-independent microhomology-mediated A-EJ process. Our data bring new clues in the understanding of the cellular response to DNA double-strand breaks
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Taty, Taty Gemael Cedrick. "Rôle des modifications de la chromatine dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN et la stabilité génétique". Thesis, Toulouse 3, 2016. http://www.theses.fr/2016TOU30190/document.
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Le génome humain est constamment la cible d'agents qui endommagent l'ADN. Ces dommages sont multiples et variés tels que les cassures simple et double brin (DSB). Les DSBs sont des lésions très toxiques dont l'origine peut être multiple. Les cellules de mammifères réparent les DSBs en utilisant deux mécanismes principaux, la recombinaison homologue (RH) qui est dépendante du cycle cellulaire et utilise la chromatide sœur comme matrice de réparation et la jonction des extrémités non homologues (NHEJ) qui est indépendante du cycle cellulaire et consiste en la ligation des extrémités d'ADN endommagées. Cette réparation a lieu dans un contexte chromatinien qui nécessite un dynamisme pour rendre accessible les sites lésés aux différentes machineries de réparation. Lors de mes travaux, j'ai étudié le remodeleur de la chromatine p400 ainsi que le variant d'histone H2A.Z qui sont deux protéines impliquées dans la dynamique de la chromatine, afin de comprendre leur rôle dans les mécanismes de réparation des DSBs et la stabilité du génome. p400, une ATPase de la famille SWI2/SNF2 participe à l'incorporation du variant d'histone H2A.Z dans la chromatine. Au cours de ma thèse, j'ai montré que la déplétion par siRNA du variant d'histone H2A.Z, dans la lignée d'ostéosarcome humain (U2OS) et dans des fibroblastes humains immortalisées, n'a pas d'effets sur la réparation des DSBs. Ces résultats sont corrélés avec une absence de recrutement de H2A.Z au niveau des cassures après étude par micro irradiation laser ou par immunoprécipitation de chromatine. Cependant, la déplétion de H2A.Z affecte la prolifération cellulaire en influençant l'efficacité de clonage et le cycle cellulaire. L'autre partie de mes travaux a mis en évidence que l'ATPase p400 est un frein à l'utilisation de la voie alternative de jonction des extrémités (alt-EJ) qui est un processus de réparation des DSBs très mutagène. L'augmentation des événements du NHEJ-Alternatif et la génération d'instabilité génétique observés lors de la déplétion de p400 par siRNA semblent tributaires de la résection des DSBs par CtIP. Ces résultats indiquent que p400 joue un rôle post-résection dans les étapes plus tardives de la RH. De plus, la déplétion de p400 conduit au recrutement de la polyADP ribose polymérase (PARP) et de l'ADN ligase 3 à la DSB, ce qui provoque la mort sélective de ces cellules lors d'un traitement par des inhibiteurs de PARP. Ces résultats montrent que P400 agit comme un frein pour empêcher l'utilisation du NHEJ-Alternatif et donc l'instabilité génétiqueThe human genome is constantly targeted by DNA damaging agents. These damages are many and varied, such as single and double strand breaks (DSBs). The DSB are highly toxic lesions whose origin can be multiple. Mammalian cells mainly use two DNA repair pathways to repair DSB, homologous recombination (RH), which is dependent on the presence of the intact homologous copy (the sister chromatid) and on the cell cycle stage and the non-homologous end joining (NHEJ) pathway, which is cell cycle independent and performs direct ligation of the two DNA ends. The repair of DNA damage takes place in a chromatin context that needs to be remodeled to give access to damaged sites. During my work, I studied the chromatin remodeler p400 and the histone variant H2A.Z both involved in chromatin remodeling, to understand their role in DSB repair and genome stability. p400, an ATPase of the SWI2/SNF2 family is involved in the incorporation of H2A.Z in chromatin. I have shown that H2A.Z depletion in the osteosarcoma cell line U2OS and in immortalized human fibroblasts did not alter DSB repair. These results are correlated with the lack of H2A.Z recruitment at DSB observed after local laser irradiation or Chromatin Immunoprecipitation. However, H2A.Z depletion affects cell proliferation and the cell cycle distribution. In addition, I have shown that the chromatin remodeler p400 is a brake to the use of alternative End Joining (alt-EJ) which is a highly mutagenic repair process. The increase in alt-EJ events observed in p400-depleted cells is dependent on CtIP- mediated resection of DNA ends. Moreover, p400 depletion leads to the recruitment of poly(ADP) ribose polymerase (PARP) and DNA ligase 3 at DSB, leading to selective cell killing by PARP inhibitors. Altogether these results show that p400 acts as a brake to prevent alt-EJ dependent genetic instability and underline its potential value as a clinical marker
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Gratias, Ariane. "Mécanisme d'excision des IES lors de la différenciation macronucléaire chez la paramecie". Paris 6, 2003. http://www.theses.fr/2003PA066146.
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Kapusta, Aurélie. "Réarrangements du génome chez Paramecium tetraurelia : ligases ADN et voies de End-Joining". Paris 11, 2010. http://www.theses.fr/2010PA112207.
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De façon spectaculaire, à chaque cycle sexuel, le cilié Paramecium remodèle l'intégralité de son génome somatique. Ce processus implique notamment l'excision de dizaines de milliers de courtes séquences (IES), présentant un dinucléotide 5'-TA-3' à chacune de leurs bornes. Les IES interrompant les séquences codantes, leur élimination précise est nécessaire à la survie de la descendance. Ces réarrangements sont initiés par l'introduction de cassures double-brin (CDB), dont la géométrie de 4 bases sortantes en 5' centrées sur le TA, permettrait un recollement des extrémités suite à une maturation minimale. Toutefois, les acteurs protéiques impliqués dans l'assemblage final et précis des gènes somatiques restent à établir. En me focalisant sur l'étape finale de réparation, j'ai tout d'abord caractérisé in silico les ligases ADN dépendantes de l'ATP de la paramécie. L'analyse fonctionnelle de la Ligase IV et de son partenaire Xrcc4, impliqués dans une voie cellulaire canonique de réparation des CDB (Non Homologous End-Joining ou NHEJ), a montré qu'ils étaient indispensables à la réparation des CDB introduites lors de l'excision des IES. Mes résultats ont mené à un modèle actualisé d'excision des IES de type « couper & recoller ». J'ai pu y inclure les acteurs protéiques avérés, ou supposés, notamment pour la protection des extrémités cassées et pour l'étape de maturation contrôlée, points déterminants pour une réparation précise hautement reproductible. Ainsi, la paramécie constituerait un excellent organisme modèle pour l'étude de l'implication de la voie NHEJ dans la réparation précise de CDB introduites de façon programmée à l'échelle d'un génome entierDuring the sexual cycle of the ciliate Paramecium, the somatic genome is spectacularly and reproducibly rearranged. This process involves two kinds of germline DNA elimination, including the precise excision of tens of thousands of short sequences (Internal Eliminated Sequences or IESs), each one flanked by two 5' - TA- 3' dinucleotides. These developmentally programmed rearrangements are initiated by DNA double-strand breaks (DSBs) that exhibit a characteristic geometry, with 4-base 5' overhangs centered on the conserved TA, and may readily align and undergo ligation with minimal processing. However, the actors involved in the final and precise assembly of somatic genes have remained unknown. My work has been focused on the last step of DNA repair, which first led me to characterize in silico the Paramecium ATP-dependent DNA ligases. Functional analysis of Ligase IV and its partner Xrcc4p, core components of a canonical cellular DSB repair pathway (non-homologous endjoining or NHEJ), showed their requirement both for the repair of IES excision sites and for the circularization of excised IESs. Moreover, my data provide direct evidence for the introduction of initiating double-strand cleavages at both ends of each IES, followed by DSB repair via highly precise end-joining. This led to a "cut-and-close" model, including confirmed or putative actors, mostly involved in the protection of broken ends and their controlled processing, key steps in a highly reproducible and precise repair. Paramecium may therefore be an excellent model organism to study precise DSB repair in genome-wide programmed rearrangements
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Joshi, Niraj Gaurishankar. "Rôles et régulation des protéines de l'anémie de Fanconi dans les voies de réparation des cassures double-brin de l'ADN". Doctoral thesis, Université Laval, 2016. http://hdl.handle.net/20.500.11794/27340.
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L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie génétique récessive caractérisée par des anomalies congénitales, une défaillance progressive de la moelle osseuse, une hypersensibilité aux pontages inter-brins de l’ADN (ICLs) et une susceptibilité à développer le cancer. La voie AF implique au minimum 20 gènes FANC (FANCA-FANCU) et les protéines encodées par ces gènes interagissent également dans une voie cellulaire connue permettant la résistance des cellules aux ICLs de l’ADN. Les agents pontants qui génèrent les ICLs lient de manière covalente les deux brins de l’ADN, créant de ce fait une obstruction physique aux processus cellulaires qui nécessitent le déroulement des deux brins d’ADN tels que la réplication de l’ADN et la transcription. La monoubiquitination de FANCI et FANCD2 par la E3 ubiquitine ligase FANCL est l’évènement culminant de l’activation de la voie AF. Ce processus est dépendant des protéines FANC ayant un rôle en amont de cette étape. Le complexe moléculaire formé par FANCI et FANCD2 coordonne plusieurs événements de la voie AF à la suite de sa monoubiquitination. Tout au long de mon travail de doctorat, nous avons étudié différents aspects de la voie de l’anémie de Fanconi. Nous avons montré deux importants domaines de liaison à l’ADN dans FANCD2 dans lesquels se trouvent six acides aminés polaires, principalement des résidus lysines, très conservés à travers l’évolution. Ces domaines contribuent de manière importante à la liaison à l’ADN dépendante des charges spécifiques. Un de ces domaines de liaison à l’ADN s’avère être également une séquence de localisation nucléaire (NLS) dont la mutation empêche la localisation nucléaire de FANCD2. Les mutants cytoplasmiques de FANCD2 ont aboli leur monoubiquitination et furent incapables de promouvoir la monoubiquitination de FANCI, de même que l’association à la chromatine. Lorsque les défauts de transport nucléaire sont complémentés par un NLS hétérologue, il en résulte une réduction de la monoubiquitination de FANCD2. Ainsi, nos résultats suggèrent que le domaine de liaison à l’ADN et le NLS identifiés dans cette étude soient des régions cruciales de FANCD2. Les cassures double-brins de l’ADN (CDB) sont un autre aspect de la voie de AF qui a fait l’objet de nos études. Les CDB sont des structures intermédiaires formées au moment du décrochage (« unhooking ») du pont inter-brin lors du processus de résolution des ICLs. Nous avons attribué de nouvelles fonctions pour la protéine FANCG dans l’inhibition de la résection des extrémités d’ADN générées par la CDB, affectant ainsi le choix de la voie de réparation de l’ADN. Cette fonction de FANCG est indépendante des autres protéines FANC ayant un rôle en amont, à l’exception de la protéine FANCA. Nous avons également mis en lumière de nouvelles fonctions pour les protéines AF/cancer du sein BRCA2 et PALB2 aux fourches de réplication bloquées. Puis, nous avons également montré qu’un rôle pour ces protéines consiste en la stimulation de la polymérase eta (Polη) afin d’initier la synthèse de l’ADN. En effet, BRCA2 et PALB2 interagissent avec Polη et sont requises pour le recrutement de cette polymérase aux fourches de réplication bloquées. De plus, elles stimulent la synthèse d’ADN dans la D-Loop via la stimulation de la Polη, un élément essentiel à ce processus. Nous concluons donc que PALB2 et BRCA2, en plus de leurs fonctions dans la stimulation de la formation de la D-Loop par RAD51, jouent un rôle crucial dans la synthèse d’ADN associée à la recombinaison via la réparation de l’ADN régulée par la Polη.Fanconi anemia (FA) is a recessive genetic disorder characterized by congenital abnormalities, progressive bone marrow failure, DNA interstrand cross-links (ICLs) hypersensitivity, and cancer susceptibility. The FA pathway consists of at least 20 FANC genes (FANCA-FANCU), and the encoded protein products interact in a common cellular pathway to gain resistance against DNA ICLs. The ICL-producing agents covalently cross-link two DNA strands and thus, are obstructions to processes which requires unwinding of the two DNA strands such as DNA replication, and transcription. FA pathway activation culminates in the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI proteins by E3 ubiquitin ligase FANCL, a process dependent on other upstream FA proteins. The molecular complex formed by FANCI and FANCD2 coordinates multiple events in the FA pathway upon its monoubiquitination. Throughout my doctoral work, we studied various aspects of the FA pathway. We have demonstrated two major DNA binding motifs (DBMs) in FANCD2, comprising of six evolutionally conserved polar amino acids predominantly consisting of lysine, which contributed to the specific charge dependent DNA binding. One of the DBM also consisted of a nuclear localization sequence (NLS), disruption of which abrogated the nuclear localization of FANCD2. The cytoplasmic mutants of FANCD2 had abolished monoubiquitination and were unable to promote FANCI monoubiquitination and chromatin association. Complementation of the nuclear transport defect by a heterologous NLS resulted in the reduction of FANCD2 monoubiquitination. Our results suggest that the DNA binding and NLS identified in this study are crucial regions of FANCD2. DNA double-strand breaks (DSB) are produced as one of the structural intermediates upon ICL unhooking step. We assigned novel functions to the FA protein FANCG in limiting the DNA end-resection, and thus it affects the repair pathway choice. This function of FANCG is independent of other upstream FA proteins except FANCA. We also reveal new functions for FA/breast cancer proteins BRCA2 and PALB2 at blocked replication forks and show a role for these proteins in stimulating polymerase eta (Polη) to initiate DNA synthesis. PALB2 and BRCA2 interact with Polη, and are required to sustain the recruitment of Polη at blocked replication forks. PALB2 and BRCA2 stimulate Polη-dependent DNA synthesis on Displacement loop (D-loop) substrates. We conclude that PALB2 and BRCA2, in addition to their functions in stimulating D-loop formation by RAD51, play crucial roles in the initiation of recombination-associated DNA synthesis by Polη-mediated DNA repair.
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Meyer, Laura. "Régulation de la réponse à divers stress et réparation des cassures double brin de l’ADN chez la bactérie Deinococcus radiodurans". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018SACLS422/document.
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La bactérie Deinococcus radiodurans se distingue par sa résistance exceptionnelle aux rayonnements γ, UV, à la dessiccation et au stress oxydant. La radiorésistance de D.radiodurans résulte de l’association de plusieurs mécanismes, dont des systèmes efficaces de réparation de l’ADN et de détoxification des ROS, la protection des protéines contre l’oxydation, une structure compacte du nucléoïde et des protéines spécifiques aux Deinococcaceae, qui sont fortement induites après l’exposition des cellules au rayonnement γ. Le gène ddrI (DNA damage response) est fortement induit après exposition des cellules au rayonnement γ et code un régulateur transcriptionnel appartenant à la sous-famille CRP (cAMP receptor protein). Comparée à la souche sauvage, la souche privée de DdrI présente des défauts de division cellulaire et/ou de ségrégation de l’ADN, et est sensible aux agents génotoxiques, au stress oxydant et au choc thermique. La prédiction in silico des cibles potentielles de DdrI suggère que cette protéine régule l’expression d’une centaine de gènes impliqués dans la réplication, la réparation de l’ADN, la transduction de signal, la réponse au stress oxydant et au choc thermique. La séquence consensus 5’TGTGA(N6)TCACA3’, extrapolée à partir des 115 séquences cibles potentielles de DdrI, est spécifiquement fixée par DdrI uniquement en présence d’AMPc. Après un choc thermique, DdrI induit directement ou indirectement l’expression de nombreux gènes codant des protéases, des protéines du métabolisme de l’ADN, des lipides, des carbohydrates ainsi qu’un inhibiteur de la traduction. PprA, une protéine spécifique aux Deinococcaceae, joue un rôle crucial dans la radiorésistance et est impliquée dans la ségrégation des chromosomes et/ou la division cellulaire après réparation de l’ADN. De manière intéressante, l’absence de RecN, une protéine de la famille SMC, supprime la sensibilité du mutant ΔpprA aux agents génotoxiques, aux inhibiteurs de l’ADN gyrase et les défauts de ségrégation observés dans le mutant ΔpprA après irradiation des cellules. Après exposition des cellules au rayonnement γ, l’absence de RecN réduit la fréquence de recombinaison entre ADN chromosomique et plasmidique, suggérant que RecN intervienne dans la réparation de l’ADN par recombinaison homologue. Nous proposons un modèle, dans lequel RecN, en favorisant la réparation de l’ADN par recombinaison homologue, nécessite la présence de PprA pour favoriser le recrutement des ADN topoisomérases et la résolution des contraintes topologiques engendrées par ce mécanisme de réparation d’ADNThe Deinococcus radiodurans bacterium exhibits resistance to γ and UV radiation, desiccation and oxidative stress. The molecular mechanisms contributing to the radioresistance of D. radiodurans include very efficient DNA repair mechanisms and ROS detoxification systems, protein protection against oxidation, a compact nucleoid structure and a subset of Deinococcus specific genes which are strongly induced after γ radiation. The ddrI (DNA damage response) gene is highly up-regulated after exposure to γ radiation and encodes a transcription factor belonging to the CRP (cAMP receptor protein) family. Compared to wild type cells, cells devoid of DdrI display defects in cell division and/or DNA segregation and is sensitive to DNA damaging agents, oxidative stress and heat shock treatment. In silico predictions of putative DdrI targets suggest that hundreds of genes,belonging to various cellular processes (DNA replication and repair, oxidative stress and heat shock responses, regulation of transcription and signal transduction) may be regulated by DdrI. The pseudopalindromic 5’TGTGA(N6)TCACA3’ consensus sequence, extrapolated from 115 potential DdrI binding sites, is specifically bound by DdrI only in presence of cAMP. After heat shock treatment, DdrI is involved directly or indirectly, in the induction of heat shock response genes coding proteases, proteins involved in DNA, lipid, carbohydrate metabolism and a translation inhibitor. Among the Deinococcus specific proteins required for radioresistance, the PprA protein was shown to play a major role for accurate chromosome segregation and cell division after completion of DNA repair. Here, we analyzed the cellular role of the RecN protein belonging to the SMC family and, surprisingly, observed that the absence of the RecN protein suppressed the sensitivity of cells devoid of the PprA protein to γ- and UV-irradiation and to treatment with mitomycin C or DNA gyrase inhibitors. The absence of RecN also alleviated the DNA segregation defects displayed by the ΔpprA cells recovering from irradiation. After irradiation, the absence of RecN reduced recombination between chromosomal and plasmid DNA, indicating that the RecN protein is important for recombinational repair of DNA lesions. Here, we propose a model in which RecN, by favoring recombinational repair of DNA double strand breaks, requires the PprA protein to facilitate the recruitment of the DNA topoisomerases to resolve the topological constraints generated by DNA double strand break repair through homologous recombination
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Marcinkova, Zuzana. "Signalisation et réparation des cassures double-brin de l'ADN dans les gliomes : modulation de la réponse aux traitements chimio-radiothérapeutiques". Grenoble 1, 2007. http://www.theses.fr/2007GRE10098.
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6000 nouveaux cas de tumeurs du système nerveux sont dépistés chaque année en France et leur pronostique reste incertaine. Nos travaux visent à éclaircir la réponse moléculaire et cellulaire de cette pathologie suite aux traitements radio-chimiothérapiques. Une nouvelle voie de réparation des cassures double-brin de l'ADN dépendant de la protéine MRE II mais indépendante de la phosphorylation de H2AX a été mise en évidence. Les caractéristiques radiobiologiques des 3 modèles de gliomes de rongeurs et de 7 modèles de gliomes humaines ont été analysées. Des dysfonctionnements de la protéine BRCAI en réponse aux radiations ou au cisplatine ont été observés dans la majorité de ces modèles testés, soulevant la question du rôle de cette protéine dans les traitements anti-gliomes ainsi que dans la gliomagenèse. Nous avons étudié l'effet de quelques drogues inhibitrices de protéine kinases sur la qualité de réparation par la recombinaison ou par la suture. Le défaut de réparation résulte du blocus de voies de signalisation causé par ces traitements ciblés. Les caractéristiques radiobiologiques d'un syndrome génétique associé aux tumeurs du système nerveux périphérique et central, la neurofibromatose de type 1 (NFI), ont été analysées. La NFI a montré une radiosensibilité modérée, associée à une faible déficience de réparation de l'ADN par suture mais une forte activité de MRE Il6000 new cases of tumours of the nervous system are detected each year in France and their prognostic stay uncertain. This thesis aims to provide new insights in the molecular and cellular response ofbrain tumours to radio-chemotherapy. A DNA double-breaks repair depending on the MREII protein but independent of the phosphorylation of H2AX emerged from the study of artefacts of the immunofluorescence technique. The radiobiological characteristics of the 3 rodent glioma celllines and 7 human glioma celllines were analyzed. Functional impairments of the BRCAI protein in response to radiation and/or cisplatin were observed in the majority of the models tested, raising the question of the role of this protein in the anti-glioma treatments and in gliomagenesis. We studied the effect of sorne protein kinases inhibitors on the quality of damage repair by the recombination or the DNA end-joining repair. The defect of repair results from the blockade of signaling pathways caused by these targeted treatments. The radiobiological characteristics of the neurofibromatosis of the type 1 (NFl), a genetic syndrome associated the tumors of the peripheral and central nervous system, were analyzed. NFI appeared to be a syndrome with moderated radiosensitivity, associated with a weak deficiency ofDNA end-joining repair but with a strong activity ofMRE11
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Vahidi, Ferdousi Leyla. "Etude de la réparation des cassures double-brin de l'ADN dans les cellules souches du muscle squelettique et leurs progéniteurs". Thesis, Paris 6, 2014. http://www.theses.fr/2014PA066335.
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Les cassures double brin (CDB) de l’ADN sont des lésions dangereuses qui peuventêtre produites par des agents physiologiques et environnementaux. La réparation inefficace desCDB dans les cellules souches adultes (CSA), qui sont au sommet de la hiérarchie cellulaire,peut affecter leur capacité d’auto-renouvellement et également le processus de régénération.Le maintien de la stabilité génomique est fondamental et l’altération de ce processus accélèrele vieillissement et peut engendrer des cancers (cellules souches cancéreuses).Les CSA du muscle squelettique (cellules satellites, CS) sont responsables del’homéostasie et de la régénération musculaire. Après activation, les CS quiescentesprolifèrent, régénèrent les myofibres et reconstituent le pool, en s’auto-renouvelant.Ce projet de thèse a eu pour but d’étudier la réparation des CDB dans les CS et leursdescendants, au cours de la différenciation. Nous avons montré que les CS réparent les CDBplus efficacement et plus fidèlement que les cellules différenciées, avec l’implication du NHEJet de DNA-PK. Cette efficacité dépend plus de l’état de différenciation que de la proliférationet la niche a un impact mineur. De plus, des expériences avec des mutants de réparation,apoptose et différenciation suggèrent un mécanisme spécifique de réparation des CDB dans lesCS, qui pourrait être lié à l’architecture distincte de la chromatine de ces cellules. Ces étudesdevraient aider à comprendre comment le maintien de l’intégrité de l’ADN préserve le pooldes CS, influence la régénération et le vieillissement et protège de la carcinogenèseDNA double strand breaks (DSBs) are dangerous DNA lesions that are generated byphysiological and environmental DNA agents. Mismanagement of DSBs in adult stem cellsthat are at the top of the hierarchy generating the differentiated tissue, can affect their selfrenewalcapacity and the fate of their progeny. Maintenance of genome stability throughrobust DNA repair is fundamental for tissue regeneration, and impairment of this processaccelerates aging and may lead to cancers (cancer stem cells).Adult muscle stem cells (satellite cells, SCs) sustain skeletal muscle homeostasis andregeneration. Upon activation, quiescent SCs proliferate thereby regenerating muscle fibersand reconstituting the satellite cell pool by self-renewing.This thesis project aims to study DSB repair in SCs and their progeny, duringdifferentiation. We showed that muscle SCs repair DSBs more efficiently and, surprisingly,more accurately than differentiated cells by implicating NHEJ and DNA-PK. The repairefficiency is more a function of the differentiation status than of the replication status ofmyogenic cells, and the niche has a minor effect on the repair efficiency of SCs. Moreover,experiments with DSB repair, apoptosis and differentiation mutants suggest that SCs repairDSBs through a specific mechanism, that may be linked to the distinct chromatin architectureof these cells. These studies should help understanding how the maintenance of genomestability preserves SCs pool, influence regeneration and aging and protect fromcarcinogenesis
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Vahidi, Ferdousi Leyla. "Etude de la réparation des cassures double-brin de l'ADN dans les cellules souches du muscle squelettique et leurs progéniteurs". Electronic Thesis or Diss., Paris 6, 2014. http://www.theses.fr/2014PA066335.
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Les cassures double brin (CDB) de l’ADN sont des lésions dangereuses qui peuventêtre produites par des agents physiologiques et environnementaux. La réparation inefficace desCDB dans les cellules souches adultes (CSA), qui sont au sommet de la hiérarchie cellulaire,peut affecter leur capacité d’auto-renouvellement et également le processus de régénération.Le maintien de la stabilité génomique est fondamental et l’altération de ce processus accélèrele vieillissement et peut engendrer des cancers (cellules souches cancéreuses).Les CSA du muscle squelettique (cellules satellites, CS) sont responsables del’homéostasie et de la régénération musculaire. Après activation, les CS quiescentesprolifèrent, régénèrent les myofibres et reconstituent le pool, en s’auto-renouvelant.Ce projet de thèse a eu pour but d’étudier la réparation des CDB dans les CS et leursdescendants, au cours de la différenciation. Nous avons montré que les CS réparent les CDBplus efficacement et plus fidèlement que les cellules différenciées, avec l’implication du NHEJet de DNA-PK. Cette efficacité dépend plus de l’état de différenciation que de la proliférationet la niche a un impact mineur. De plus, des expériences avec des mutants de réparation,apoptose et différenciation suggèrent un mécanisme spécifique de réparation des CDB dans lesCS, qui pourrait être lié à l’architecture distincte de la chromatine de ces cellules. Ces étudesdevraient aider à comprendre comment le maintien de l’intégrité de l’ADN préserve le pooldes CS, influence la régénération et le vieillissement et protège de la carcinogenèseDNA double strand breaks (DSBs) are dangerous DNA lesions that are generated byphysiological and environmental DNA agents. Mismanagement of DSBs in adult stem cellsthat are at the top of the hierarchy generating the differentiated tissue, can affect their selfrenewalcapacity and the fate of their progeny. Maintenance of genome stability throughrobust DNA repair is fundamental for tissue regeneration, and impairment of this processaccelerates aging and may lead to cancers (cancer stem cells).Adult muscle stem cells (satellite cells, SCs) sustain skeletal muscle homeostasis andregeneration. Upon activation, quiescent SCs proliferate thereby regenerating muscle fibersand reconstituting the satellite cell pool by self-renewing.This thesis project aims to study DSB repair in SCs and their progeny, duringdifferentiation. We showed that muscle SCs repair DSBs more efficiently and, surprisingly,more accurately than differentiated cells by implicating NHEJ and DNA-PK. The repairefficiency is more a function of the differentiation status than of the replication status ofmyogenic cells, and the niche has a minor effect on the repair efficiency of SCs. Moreover,experiments with DSB repair, apoptosis and differentiation mutants suggest that SCs repairDSBs through a specific mechanism, that may be linked to the distinct chromatin architectureof these cells. These studies should help understanding how the maintenance of genomestability preserves SCs pool, influence regeneration and aging and protect fromcarcinogenesis
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Slade, Dea. "Mécanisme moléculaire de la réparation de l'ADN chez Deinococcus radiodurans". Paris 6, 2009. http://www.theses.fr/2009PA066758.
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Deinococcus radiodurans est une bactérie qui présente une exceptionnelle résistance à de nombreux stress génotoxiques qui fragmentent notamment son génome en une multitude de segments. Nous avons montré que la réassociation des fragments générés dépend d’un nouveau mécanisme moléculaire, qui implique l’activité interdépendante de la recombinaison et de la réplication de l’ADN. Dans une première étape, la majorité des fragments est réassemblée par la voie de « synthèse étendue par appariement des brins » (extended synthesis-dependant strand annealing ou ESDSA). Les protéines RecA et RadA initient la synthèse de nouveaux brins en utilisant comme matrice l’ADN complémentaire d’un fragment chevauchant appartenant à une autre copie génomique de la même cellule. Polymérase III est essentielle pour l’initiation de la synthèse réparatrice de l’ADN, tandis que les ADN Polymérases III et I sont nécessaires pour l’élongation de la synthèse. Dans une seconde étape, les longs fragments linéaires reconstitués sont réassemblés en chromosomes circulaires par recombinaison homologue dépendante de RecA.
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Cabal, Ghislain. "Implications fonctionnelles de l’organisation de la chromatine : Rôles du pore nucléaire chez saccharomyces cerevisiae". Paris 11, 2007. http://www.theses.fr/2007PA112172.
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Dans le noyau des cellules eucaryotes, la chromatine ainsi que les processus métaboliques qui l’accompagnent ne sont pas distribués de manière aléatoire. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé au rôle que pouvait jouer cette organisation dans la régulation de la réparation de l’ADN et de la transcription. J’ai participé à la mise au point de méthodes permettant de localiser in vivo un locus chromosomique unique et de le suivre au court du temps chez la levure Saccharomyces cerevisiae. J’ai ainsi pu montrer que les gènes GAL sont confinés dans des territoires bien définis et que leur mobilité est très contrainte. Par ailleurs, lorsqu’ils sont transcrits, les mouvements de ces gènes sont confinés le long de l’enveloppe nucléaire. Mes travaux ont également montré que le complexe d’initiation de la transcription SAGA interagissant avec le promoteur et les pores nucléaires (NPC) via la machinerie d’export des ARNm, était responsable de l’ancrage des gènes GAL à l’enveloppe nucléaire. Ces résultats constituent la première description du mécanisme de "gene gating". L’utilisation des techniques d’imagerie cellulaire, nous a aussi permis de montrer que la réparation des cassures de l’ADN dans les régions subtélomériques dépendait de leur ancrage aux NPC. Enfin, l’implication des pores dans le contrôle de la réparation de l’ADN a été confortée par l’identification d’interactions fonctionnelles entre certaines nucléoporines, et des protéines impliquées dans la réparation de l’ADN. Ensembles mes travaux démontrent l’importance des NPC dans l’organisation fonctionnelle de la chromatine chez S. CerevisiaeIn the nucleus of eukaryotic cells, chromatin and nuclear processes are not randomly distributed. During my PhD thesis, I have focused on the role of nuclear organization may play in regulating transcriptional regulation and DNA metabolism. To investigate this assumption, I developed an experimental system able to monitor the movement and sub-nuclear position of a single tagged genetic locus in the yeast Saccharomyces cerevisiae. When tracked in the nuclear volume over time, I found chromatin to undergo very constrained movement. Interestingly, I show that transcriptional activation of the GAL genes leads to the confinement of their motility towards the nuclear periphery. I further demonstrate that members of the SAGA transcription initiation complex and mRNA export factors mediate this recruitment by physically linking the activated GAL genes to nuclear pore complexes (NPC). These results prove for the first time that the ‘gene gating’ mechanism occurs in living cells. Additionally, I participated in a study showing that binding of chromosome ends to the NPC is essential for efficient DNA double strand break repair in subtelomeric region. I also performed a genetic screen revealing an exciting genetic interaction network of nucleoporins with the DNA repair machinery and chromatin remodeling complexes. Altogether the studies I carried out during my PhD uncover the role of the NPC in chromatin organization and consequently in regulating nuclear processes
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Jacob, Sandrine. "Impact du système de réparation des mésappariements de bases dans la réponse des cancers colorectaux aux inhibiteurs de topoisomérases". Paris 6, 2004. http://www.theses.fr/2004PA066165.
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Chabot, Thomas. "Modulation de l'activité du Rad51 par le récepteur tyrosine kinase c-Met dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN". Thesis, Nantes, 2020. http://archive.bu.univ-nantes.fr/pollux/show.action?id=360755d5-6a18-407f-9af7-fe215a83747f.
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L'instabilité génomique due à la dérégulation des voies de réparation de l'ADN peut être à l’initiation de cancer et entraîner par la suite une résistance à la chimiothérapie et à la radiothérapie. La compréhension de ces mécanismes biologiques est donc essentielle dans la lutte contre le cancer. RAD51 est la protéine centrale de la voie de réparation des cassures double-brin de l'ADN par recombinaison homologue. Cette réparation conduit à une réparation fidèle de l'ADN. L'activité recombinase de la protéine RAD51 est finement régulée par des modifications post- traductionnelles telles que la phosphorylation. Au cours de la dernière décennie, de plus en plus d’études, suggèrent l'existence d'une relation entre les récepteurs à activité tyrosine kinases, souvent suractivés et impliqués dans l’agressivité et la prolifération cancéreuse, et la réparation de l'ADN. Parmi ces récepteurs à activité tyrosine kinases, le duo c-Met/HGF-SF est souvent muté, sur exprimé ou activé constitutivement dans de nombreux cancers et son inhibition a été montrée comme induisant une diminution de la réparation par recombinaison homologue. Au travers de cette thèse, nous montrons pour la première fois que c-Met est capable de phosphoryler la protéine RAD51 sur quatre résidus tyrosine localisés principalement dans l'interface monomère- monomère du nucléofilament de la recombinase humaine. Nous montrons l’implication de ces phosphorylations sur l’activité de RAD51 dans les différentes étapes de la recombinaison homologue. L'ensemble des résultats obtenus suggère le rôle possible de ces modifications dans la régulation de RAD51 et souligne l'importance de c-Met dans la réponse aux lésions de l'ADNGenomic instability due to deregulation of DNA repair pathways may be at the onset of cancer and subsequently lead to resistance to chemotherapy and radiotherapy. Understanding these biological mechanisms is therefore essential in the fight against cancer. RAD51 is the core protein of the homologous recombinant double-stranded DNA repair pathway. This repair leads to faithful DNA repair. The recombinase activity of the RAD51 protein is finely regulated by post-translational modifications such as phosphorylation. Over the last decade, more and more studies have suggested the existence of a relationship between receptors with tyrosine kinase activity, which are often overactivated and involved in aggressiveness and cancer proliferation; and DNA repair. Among these receptors with tyrosine kinase activity, the c-Met/HGF-SF duo is often mutated, over-expressed or constitutively activated in many cancers and its inhibition has been shown to induce a decrease in repair by homologous recombination. Through this thesis, we show for the first time that c-Met is able to phosphorylate the RAD51 protein on four tyrosine residues located mainly in the human recombinase nucleofilament monomer- monomer interface. We show the implication of these phosphorylations on the activity of RAD51 in the different steps of homologous recombination. All the results obtained suggest the possible role of these modifications in the regulation of RAD51 and underline the importance of c-Met in the response to DNA damage
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Robert, Flavie. "TRRAP,une protéine plateforme : Fonction d'un co-facteur de l'acétylation des histones dans la réparation des cassures double brin de l'ADN". Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2005. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2005/ROBERT_Flavie_2005.pdf.
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L'initiation de la transcription est une étape clé de la régulation de l'expression des gènes codant pour les protéines. Le complexe TFIID, formé de TBP et des TAFs (TBP associated factors), est au cœur de ce processus car il reconnaît le promoteur du gène, et déclenche la formation du complexe de pré-initiation (PIC). Le complexe TFTC (TBP free TAF containing complex) peut lui aussi initier la transcription, malgré l'absence de TBP. Conservé de la levure à l'homme, il possède en sus une activité d'acétylation des queues d'histones, et participe à l'ouverture de la chromatine. TRRAP, sa plus grande sous unité, est le sujet d'étude de cette thèse. Le gène trrap est essentiel au développement embryonnaire, et influence le cycle cellulaire. Au niveau moléculaire, la protéine est la cible de nombreux activateurs de la transcription. Cependant, sa fonction propre était mal connue au début de ce travail, d'autant plus que TRRAP appartient par sa structure à une famille de kinase (PI3K), mais n'en possède pas l'activité enzymatique. Un protocole d'immuno-purification et d'analyse par spectrométrie de masse, complété par des contrôles biochimiques, nous a permis de mettre en évidence une interaction stable entre TRRAP et le complexe Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN), indépendamment de TFTC. MRN est un acteur central de la réponse cellulaire aux cassures double brin de l'ADN. Notre étude de la fonctionnalité de cette interaction a montré que MRN associé à TRRAP est dépourvu d'activité d'acétylation des histones. En revanche, elle apporte les preuves in vitro et in vivo que TRRAP a un rôle spécifique dans la réparation et la signalisation des cassures double brin de l'ADN, comme ATM et ATR qui sont d'autres protéines PI3K. La participation de TRRAP à de nombreuses structures multiprotéiques, suggère que cette grande protéine se comporte en plateforme de communication et d'échange entre les machineries cellulaires de transcription, de réparation et de modification de la chromatine. Ce manuscrit présente par ailleurs des résultats indépendants, portant sur la caractérisation par spectrométrie de masse d'une modification post-traductionnelle de l'histone H3 spécifique de la mitoseTranscription initiation is a key event in the regulated expression of protein-coding genes. The general transcription factor TFIID, containing TBP and TAFs (TBP associated factors), plays a central role in transcription, because it recognizes the promoter, and triggers pre-initiation complex formation. TFTC (TBP free TAF containing complex) is another complex able to initiate transcription. TFTC possesses Histone Acetyltransferase (HAT) activity and thus participates in chromatin opening. These studies focus on TRRAP, TFTC's largest subunit. Trrap gene is essential to embryonic development, and indirectly influences the cell cycle. Moreover, TRRAP protein is targeted by DNA binding activators of transcription. Despite the fact that TRRAP structurally belongs to the family of PI3K kinase, which regulates cellular response to genotoxic stress, its in vivo function is not well understood. Immunoprecipitation and mass spectrometry analysis, associated to biochemical controls, reveal a stable interaction between TRRAP and Mre11-Rad50-Nbs1 complex (MRN) independent of TFTC. MRN is a critical component of DNA double strand break (DSB) cellular response. Functional studies of the TRRAP-MRN complex have shown that it does not possess HAT activity. Nevertheless, in vitro and in vivo evidences demonstrate that TRRAP, like other members of the PIKK family, plays a specific role in DNA DSB repair and signalling. Taken together, our studies give an insight into TRRAP function as a transcription co-factor. We propose to discuss in which TRRAP acts as a molecular platform, allowing communication between the cellular processes of DNA transcription, DNA repair, and chromatin remodeling. Independently, this manuscript summarizes the results of another study, addressing the mass spectrometry characterisation of a mitosis-specific post-translational modification of histone H3
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Hardy, Sara. "Etudes fonctionnelles des complexes multiprotéiques contenant la protéine TRRAP : Implication de hTRRAP dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN". Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2005. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2005/HARDY_Sara_2005.pdf.
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Chayot, Romain. "Réparation des causes double brin de l'ADN par le mécanisme de non homologous end joining : des bactéries aux cellules souches". Paris 6, 2009. http://www.theses.fr/2009PA066028.
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Les travaux de thèse présentés dans ce manuscrit ont contribué à démontrer que la réparation des cassures double brin (CDBs) de l’ADN par End Joining (raboutage des extrémités) est un mécanisme flexible, qui s’est adapté aux contraintes des organismes et également à celles des types cellulaires. Le Proto End Joining, que nous avons mis en évidence chez Escherichia coli, est hautement mutagène. C’est un mécanisme de secours, qui utilise des protéines également employées lors de la Recombinaison Homologue (recBCD) et vraisemblablement lors de la réplication de l’ADN (LigA). Ceci fait naître des interrogations, d’un point de vue évolutif, sur l’origine ou la co-origine des mécanismes de réplication/réparation. Le minimalisme et la flexibilité des protéines du PEJ bactérien contrastent avec la panoplie de protéines hautement spécialisées utilisées par le NHEJ chez les mammifères. Nous savions que la polymérase µ, une polymérase de la famille X, n’était pas indispensable pour l’organisme. Néanmoins, nous démontrons que cette protéine perfectionne la machinerie du NHEJ. Elle rend le complexe synaptique plus efficace et accélère la réparation des CDBs. Les conséquences de ce perfectionnement se manifestent par une meilleure réponse de la cellule aux dommages de l’ADN et finalement par une sénescence cellulaire moins accentuée. Enfin, les données préliminaires sur les cellules satellites du muscle squelettique murin, cellules indifférenciées en charge du maintien de l’homéostasie du tissu, indiquent que le NHEJ est optimisé, extrêmement rapide et très efficace. Il reste à savoir si cette plus grande efficacité est également associée à une plus grande fidélité du NHEJ.
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Delacote, Fabien. "La réparation des cassures double brin de l'ADN chez les mammifères:intervention séquentielle de la recombinaison non homologue puis de la recombinaison homologue". Paris 11, 2002. http://www.theses.fr/2002PA11T046.
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Chanut, Pauline. "Comprendre et perturber le choix de la voie de réparation des cassures double brin de l'ADN pour augmenter l'efficacité et la sélectivité des agents anticancéreux génotoxiques". Thesis, Toulouse 3, 2017. http://www.theses.fr/2017TOU30151.
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Parmi les dommages de l'ADN, la cassure double-brin (CDB) constitue la lésion la plus toxique, puisqu'une seule CDB non réparée ou réparée de façon incorrecte peut conduire à la mort cellulaire. Cette toxicité est justement exploitée en clinique pour éradiquer les cellules tumorales. Parmi l'arsenal des molécules utilisées en chimiothérapie, les poisons de topoisomérase I (TOPO1), tel que la camptothécine (CPT), sont capables d'induire un type particulier de CDBs à une seule extrémité, générées lors de la collision entre la fourche de réplication et la TOPO1 bloquée sur l'ADN. Ces cassures sont réparées par recombinaison homologue (RH) puisqu'en absence de seconde extrémité, elles ne peuvent être substrats de la jonction d'extrémités non homologues (JENH) qui, pour ligaturer en nécessite deux. L'hétérodimère Ku, initiateur de la JENH est à la fois un détecteur majeur des CDBs de par son abondance nucléaire et sa forte affinité, et un puissant inhibiteur de la RH. Ainsi, pour la compréhension des mécanismes déterminants le choix de la voie de réparation adaptée à chaque type de CBD, la régulation de la liaison de Ku aux CDBs à une extrémité est donc une question cruciale. Dans ce contexte, mon premier projet de thèse a concerné la compréhension moléculaire du choix de la voie de réparation des CDBs à une extrémité. Par une technique de microscopie à haute résolution, j'ai d'abord montré que l'hétérodimère Ku et son partenaire la DNA-PKcs sont rapidement recrutés au niveau de ces dommages dans l'ADN de cellules humaines. J'ai ensuite démontré que grâce à la phosphorylation de CtIP par ATM et à l'action coordonnée des activités nucléases de MRE11 et CtIP, Ku est relargué des CDBs à une extrémité. La dissociation de la DNA-PKcs des CDBs à une extrémité dépend de sa phosphorylation par ATM au niveau du cluster ABCDE. A l'aide d'un mutant non phosphorylable de ce cluster, j'ai montré que le défaut de dissociation de la DNA-PKcs prévient le relargage de l'hétérodimère Ku dépendant de MRE11. Mes travaux suggèrent toutefois l'existence d'une voie additionnelle pouvant éliminer Ku de plus 50% des CDBs à une extrémité. Enfin, j'ai démontré que la persistance de Ku et de la DNA-PKcs aux extrémités de la cassure ne perturbe ni la résection longue distance ni la formation de filament de RAD51 mais compromet la survie cellulaire. Mon second projet de thèse a consisté à perturber les mécanismes contrôlant le choix de la voie de réparation des CDBs dans le but de potentialiser l'effet de la CPT. Comme l'inhibition d'ATM induit une sensibilisation dramatique des cellules en réplication à la CPT, il devrait être possible d'identifier d'autres sensibilisateurs à la CPT qui désorganiseraient la réparation des CDBs à une extrémité. Sur la base d'un test de cytotoxicité, j'ai réalisé un criblage phénotypique de la chimiothèque du NIH et identifié un antibiotique, la nitrofurantoïne (NTF) et l'hydrocortisone acétate (HCA) capables de potentialiser l'effet de la CPT. Si la sensibilisation par la NTF semble plutôt associée à la génération d'espèces oxygénées réactives (ROS) par nitroréduction de la molécule, celle induite par l'HCA n'a pas été reproduit et est toujours en cours d'investigation. Mes travaux de thèse contribuent à la compréhension des mécanismes du choix de la voie de réparation impliqués dans la tolérance des cellules à la CPT et ouvrent des perspectives de ciblage pour potentialiser son pouvoir anti-cancéreuxDNA double-strand break (DSB) is the most toxic DNA damage, because a single mis- or un-repaired DSB can lead to cell death. This toxicity is exploited in clinics to eradicate tumoral cells. So, among molecules currently used in chemotherapy, topoisomerase 1 (TOPO1) poisons such as camptothecin (CPT), are able to generate a particular type of DSB bearing one single end (seDSBs); these lesions are created when a replication fork collides with the TOPO1 blocked on the DNA. They are repaired by homologous recombination (HR) because, devoid of a second end, they cannot be ligated by non-homologous end-joining (NHEJ). The Ku heterodimer, the initiator of the NHEJ is both a major detector of the DSBs due to its nuclear abundance and strong affinity, and a powerful HR inhibitor. Therefore, the regulation of Ku binding to one-ended DSB is a crucial question for the understanding of mechanisms determining the choice of the suitable DSB repair pathway. In this context, my first thesis project aimed at deciphering the molecular mechanisms responsible for the DNA repair pathway choice at seDSBs. Firstly, using High Resolution Microscopy, I demonstrated that Ku and DNA-PKcs are rapidly recruited on seDSBs. Then, I showed that ATM-dependent phosphorylation of CtIP and the epistatic and coordinated actions of MRE11 and CtIP nuclease activities are required to limit the stable loading of Ku on seDSBs. I established that DNA-PKcs removal from seDSBs relies on ATM-dependent phosphorylation of the ABCDE cluster. Using a non-phosphorylable mutant of this cluster, I demonstrated that impaired DNA-PKcs removal prevents MRE11 from releasing Ku. However, my work also suggested the existence of an additional mechanism that contributes to prevent Ku accumulation at 50% of seDSBs. Finally, I demonstrated that Ku and DNA-PKcs persistence on seDSBs does not impair long range resection and RAD51 recruitment but compromises cell survival. My second thesis project was dedicated to target the DSB repair pathway choice mechanisms in order to potentiate the effect of CPT. Indeed, since ATM inhibition increases drastically the death of replicative cells treated with CPT, we may identify others sensitizers able to disrupt the repair pathway choice. On the basis of a cytotoxicity assay on mouse embryonic fibroblasts (MEFs), I performed a phenotypic screening of the NIH Clinical Collection and identified the antibiotic nitrofurantoin (NTF) and hydrocortisone acetate (HCA) as a sensitizer of MEFs to CPT. However, sensitization induced by NTF does not depend on Ku but rather seems to rely on Reactive Oxygen Species (ROS) generation by nitroreduction of the molecule and sensitization induced by HCA is not reproducible and is still under investigation. My work contributes to extend the knowledge of the repair pathway choice mechanisms involved in cell tolerance to CPT and opens new opportunities to potentiate its anticancerous property
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Drouet, Jérôme. "Mobilisation de protéines de la voie de jonction d'extrémités non homologues en réponse aux cassures double-brin de l'ADN dans les cellules de mammifère". Toulouse 3, 2004. http://www.theses.fr/2004TOU30243.
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Les cellules sont constamment exposées à de multiples facteurs endogènes ou exogènes susceptibles de compromettre l’intégrité de leur génome. Parmi les différents types de lésions de l’ADN, les cassures double-brin (CDB) sont considérées comme les dommages les plus cytotoxiques, du fait de leur pouvoir potentiellement létal voire cancérogène. Face à ce danger permanent, les cellules disposent de systèmes enzymatiques de réparation adaptés. La NHEJ (Non Homologous End Joining) est considérée comme la voie majoritaire de réparation des CDB chez les eucaryotes supérieurs. Le mécanisme biochimique précis de la NHEJ est encore largement méconnu, et l’essentiel des connaissances provient d’expériences réalisées in vitro. Dans un premier temps, nous avons testé la validité physiologique du modèle biochimique de la NHEJ, par une approche in vivo de fractionnement cellulaire optimisé basée sur une technique d’extraction par du détergent. Nous avons confirmé l’assemblage des principaux complexes de réparation, DNA-PK et Xrcc4 / DNA ligase IV, en présence de CDB in vivo, dans différentes lignées cellulaires humaines. Nous avons décrit pour la première fois un recrutement de Xrcc4 strictement dépendant de la présence physique de la DNA ligase IV, et proposons un modèle d’un rôle de la phosphorylation de Xrcc4 dans le recrutement optimisé de la DNA ligase IV sur les CDB. Nous avons de plus observé une mobilisation spécifique du complexe Xrcc4 / DNA ligase IV vers la matrice nucléaire en réponse aux CDB, et proposons un rôle de la matrice nucléaire comme site spécialisé de réparation des CDB présentant des extrémités complexes. .Cells are constantly exposed to a variety of endogenic and exogenic factors likely to compromise their genome integrity. Among the various kinds of DNA lesions, double-strand breaks (DSB) are considered as the most cytotoxic damages due to potentially lethal, and possibly carcinogenic, effects. Facing this permanent danger, cells are equipped with adapted repairing enzymatic systems. The NHEJ (Non Homologous End Joining) is considered as the major DSB-repairing process in the case of superior eucaryotes. The precise biochemical mechanism used by the NHEJ is still not well known, and most of the present knowledge is based on in vitro experiments. In a first step, we have tested the physiological validity of the NHEJ biochemical model by an in vivo approach using optimized cell fractioning, based on a detergent-mediated extraction technique. We have confirmed the assembly of the major repairing complexes, DNA-PK and Xrcc4 / DNA ligase IV, in the presence of DSB in vivo, in several human cell lines. We have described for the first time a Xrcc4 recruitment, strictly dependent on the physical presence of DNA ligase IV, and we propose a model for the role of Xrcc4 phosphorylation on the optimized recruitment of DNA ligase IV in double-strand breakages. In addition, we observed a specific mobilization of the Xrcc4 / DNA ligase IV complex toward the nuclear matrix in response to DSB, and we propose that the nuclear matrix acts as a specialized DSB-repairing site exhibiting complex extremities. .
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Malivert, Laurent. "Analyse moléculaire des facteurs de réparation de l'ADN et de leur répercussion sur le système immunitaire : étude de Cernunnos, un facteur de NonHomologous End-Joining". Paris 7, 2009. http://www.theses.fr/2009PA077080.
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Le système immunitaire subit de nombreuses cassures double-brin (cdb) de l'ADN, provoquées par des éléments exogènes, ou programmées par la cellule lors de processus physiologiques importants comme la recombinaison V(D)J, qui permet le développement, la diversité et la maturation du système immunitaire. Chez les mammifères, les cdb de l'ADN sont majoritairement réparées par le système de réparation des extrémités non homologues (ou NHEJ), composé de sept facteurs : Ku70 , Ku80 , DNA-PKcs, Artémis, XRCC4, DNA LigaselV et Cernunnos (ou XLF), facteur le plus récemment identifié par notre équipe. Une déficience du NHEJ conduit à une immunodéficience combinée sévère (SCID), à des anomalies du développement, et à des prédispositions au cancer. Ce travail de Thèse revient sur la constitution d'une cohorte de patients SCID grâce à un outil biochimique d'analyse du NHEJ in vitro et sur l'identification de Cernunnos, gène responsable de leur défaut moléculaire. Nous montrons aussi que XRCC4 et Cernunnos partagent des homologies de séquence et de structure, mais ont des fonctions distinctes de réparation de l'ADN. Nous prouvons que Cernunnos appartient au complexe de ligature, constitué de XRCC4 et de DNA LigaselV, et rapportons les dépendances entre ces partenaires. Enfin, en utilisant des mutants de Cernunnos générés in vitro et une série d'essais fonctionnels in vivo, nous démontrons entre autres que la région C-terminale de Cernunnos n'est pas essentielle à sa fonction et définissons la zone d'interaction de Cernunnos avec XRCC4. Toutes ces données établissent que Cernunnos est un élément important de la machinerie du NHEJ, dont la fonction reste cependant encore à préciserThe immune System is the target of lots of DNA double-strand breaks (dsb), issued from exogenic elements, but also programmed by the cell itself during important physiological processes like the V(D)J Recombination, which allows the development, diversity and maturatiom of the immune System. In mammals, the majority of DNA dsb are processed by the NonHomologous End-Joining pathway (NHEJ), composed of seven factors : Ku70, Ku80 , DNA-PKcs, Artemis, XRCC4, DNA LigaselV and Cernunnos (or XLF), the most recent factor identified by our team. A NHEJ defect leads to a severe combined immunodeficiency (SCID), to which developmental abnormalities and cancer prédisposition can be added. This Thesis work starts with the constitution of a SCID patients's cohort by an improved in vitro NHEJ assay and the identification of Cernunnos, the gene responsible of their defect. We also show that XRCC4 and Cernunnos share homologies of sequence and structure, but have distinct DNA Repair functions. We prove that Cernunnos is part of the ligation complex, constituted by XRCC4 and DNA Ligase IV and we report the interdependance of these partners within the complex. Then, by using in vitro generated Cernunnos mutants (point mutations, protein deletions, and chimeras between XRCC4 and Cernunnos) and different in vivo functional assays, we demonstrate for example that the C-terminal domain of Cernunnos is not required for its function, and define the interaction surface of Cernunnos with XRCC4. All these data establish that Cernunnos is a major component of the NHEJ machinery, even if its function stillneeds to be precised