Gotowa bibliografia na temat „Protéine de transport membranaire”

RésuméLe transporteur de la sérotonine sodium-dépendant est associé à la membrane plasmatique des plaquettes et des terminaisons nerveuses sérotoninergiques et constitue le mécanisme physiologique d’inactivation de la sérotonine. Un déficit en sérotonine est associé à la pathophysiologie de la dépression, et il a été suggéré que des modifications du transporteur de la sérotonine pouvaient exister au moment des épisodes dépressifs. En particulier, le nombre de sites transporteurs pourrait être diminué sur les plaquettes sanguines de patients déprimés, et des résultats comparables ont été obtenus dans certaines régions du cerveau humain post-mortem. Les inhibiteurs tricycliques et nontricycliques de la capture de sérotonine sont des antidépresseurs efficaces. Cependant, il existe une période de latence de 2 à 3 semaines entre le début du traitement et l’effet thérapeutique maximal. C’est pourquoi les études consacrées aux propriétés biochimiques et à la caractérisation moléculaire du transporteur de la sérotonine sont d’un intérêt particulier. La capture de la sérotonine par le transporteur êeut être inhibée sélectivement par le citalopram, la paroxétine, l’indalpine, la fluoxétine et le SL 81 0385. Cet effet se traduit in vitro par une augmentation de la neurotransmission sérotoninergique comme on a pu le montrer pour la paroxétine et le SL 81 0385 sur la libération de sérotonine induite par stimulation électrique dans des coupes de cortex frontal humain. Les dérivés marqués inhibiteurs de la capture tels que l’imipramine-[3H], la paroxétine-[3H] et le citalopram-[3H] ont été utilisés comme ligands spécifiques pour caractériser le transporteur. Dans les expériences de dissociation de la liaison de la paroxétine-[3H] aux membranes de cortex cérébral de rat, le citalopram, l’indalpine, la fluoxétine, le SL 81 0385, l’imipramine et la sérotonine ont des valeurs de 1½ de dissociation similaires à celle obtenue pour la paroxétine. De plus, le SL 81 0385, la fluoxétine, l’imipramine et la sérotonine induisent une protection contre l’inactivation de la liaison de la paroxétine-[3H] par le N-éthylmaléimide aux membranes de cortex cérébral de rat. Ces résultats suggèrent que le domaine de liaison des inhibiteurs tricyliques et non-tricycliques de la capture de sérotonine correspond à un site d’exclusion mutuelle par rapport au site de reconnaissance du substrat. Le transporteur neuronal de la sérotonine des membranes de cortex cérébral de rat a été solubilisé et purifié par chromatographie d’affinité sur une résine agarose à laquelle un dérivé du citalopram a été fixé par liaison covalente. La liaison de la paroxétine-[3H] à la préparation purifiée est caractérisée par un Kd de 0.71 nM et un Bmax supérieur à 1 962 pmol/mg de protéines. La purification du transporteur se traduit par un accroissement de plus de 3 000 fois de l’activité de la liaison de la paroxétine-[3H] par rapport à celle de la préparation membranaire initiale. Le profil pharmacologique de la liaison de la paroxétine-[3H] à cette préparation purifiée est préservé puisque les valeurs de Ki pour le citalopram, l’imipramine et la sérotonine sont respectivement de 19 nM, 80 nM et 3,5 μM, comparables aux Ki de ces composés sur la liaison de la paroxétine-[3H] aux membranes de cortex cérébral de rat. La purification du transporteur ainsi obtenue est la première étape qui doit permettre d’analyser les propriétés fonctionnelles du transporteur au niveau moléculaire.

Les Encéphalopathies Spongiformes Transmissibles (EST) sont des maladies neurodégénératives caractérisées par l’accumulation dans le cerveau d’une forme anormale de la protéine prion, la PrP. La PrP cellulaire est une glycoprotéine membranaire qui a deux sites de glycosylation. La susceptibilité des moutons à la tremblante, la plus répandue des EST, est sous le contrôle d’un polymorphisme génétique en position 136, 154 et 171 de la protéine PrP. Différents travaux ont montré que l’efficacité de la conversion de la PrP normale (PrPc) en PrP anormale (PrPsc) pouvait être influencée à la fois par son degré de glycosylation et par sa séquence primaire en acides aminés. Au cours de notre travail de production d’anticorps monoclonaux dirigés contre la PrP ovine, nous avons obtenu de nouveaux anticorps discriminants les différentes formes glycosylées de la PrP. Parmi ces anticorps, nous avons montré que certains présentent une affinité différentielle vis-à-vis des allèles de la PrP, essentiellement en position 171. Cette position est connue pour jouer un rôle majeur dans le contrôle de la résistance (Arginine, R171) et de la sensibilité (Glutamine, Q171) des moutons à la tremblante. Ces anticorps représentent de nouveaux outils pour étudier la relation entre le niveau de glycosylation de la PrPc et sa capacité à être convertie en PrPsc. Ils nous permettront également une analyse plus fine du profil électrophorétique des différentes glycoformes de la PrP anormale dans le cadre du typage de souches de prions. Enfin, ces anticorps peuvent être utilisés pour le génotypage rapide des moutons en vue d’une sélection d’animaux résistants à la tremblante et pour la compréhension des bases moléculaires de la résistance à la tremblante conférée par la présence de l’Arginine en position 171 de la PrP.

Dans les cellules eucaryotes, les protéines secrétées subissent de nombreuses modifications co- et post-traductionnelles tout au long du système endomembranaire de sécrétion (SES). Ces modifications, dont la N-glycosylation, permettent aux protéines d’acquérir une conformation biologiquement active. La maturation des glycannes N-liés est initiée par l’-glucosidase I. Au cours de cette thèse, après avoir identifié et caractérisé biochimiquement l’-glucosidase I d’Arabidopsis thaliana (AtGCSI), nous avons étudié sa localisation dans la cellule végétale. AtGCSI est une glycoprotéine membranaire de type II clivant spécifiquement le glucose terminal lié en -1,2 du glycanne précurseur GlcNAc2-Man9-Glc3 et est exclusivement localisée dans le réticulum endoplasmique (RE). En parallèle, l’étude de la localisation d’autres enzymes impliquées dans la maturation des N-glycannes a permis de conclure que toutes ces protéines membranaires de type II sont réparties dans le SES selon leur ordre d’intervention. D’autre part, des études plus approfondies sur les signaux impliqués dans la localisation dans le RE d’AtGCSI a permit de mettre en évidence deux signaux : les motifs di-arginines, localisés dans le domaine cytosolique, et les 60 acides aminés dans le domaine luminal. . Ces signaux sont nécessaires et suffisants pour la rétention de protéines chimères membranaires dans le RE. Au cours de ce travail, des microdomaines à l’interface RE-Golgi ont également été mis en évidence. Aux vus de ces résultats, un modèle pour la rétention de l’-glucosidase I dans le RE de la cellule végétale a été proposer
In all eukaryotic cells, the secreted proteins undergo many co- and post-translational modifications along the secretory pathway. These modifications, among whom Nglycosylation, are required for biological activity of proteins. The maturation of the N-glycans is initiated by the Arabidopsis thaliana -glucosidase I (AtGCSI). During this thesis, after AtGCSI identification and biochemical characterisation, we studied its localisation in plantcell. AtGCSI is a type II membrane glycoprotein that cleaves the distal 1,2-glucose of the asparagines linked GlcNAc2-Man9-Glc3 precursor and it is exclusively located to the endoplasmic reticulum (ER). In parallel, localization studies of other N-glycan processing enzymes showed that all type II membrane proteins are located in the secretory pathway according to the order of their expected function. Then, in this study we demonstrated moreprecisely that two signals confer an ER localization of AtGCSI: the di-Arg signals, located to the cytosolic tail and the 60 amino acids of luminal domain. These signals are necessary and sufficient to retain truncated membrane proteins in the ER. At the same time, microdomains distinct but close to the ER and the Golgi are observed. Regarding these results, a theoretical model to explain ER residency of AtGCSI in plant cell was proposed

Les ABC (ATP binding cassettes) transporteurs constituent une grande famille de protéine transmembranaire présentent dans tous les organismes. Les ABC hydrolysent l'ATP pour transporter une quantité immense de substrats amphiphiles, comme les lipides, steroids, peptides... Certains ABCs confèrent un phénotype cellulaire de multiresistance aux drogues des bactéries contre les antibiotiques à l’homme contre les agents anticancéreux, antiviraux ...Une question fondamentale pour comprendre le transport de drogues est comment les propriétés de membranes modulent la fonction et l’organisation spatio temporelle des ABCs transporteurs. Nous avons étudié en détails ces couplage avec BmrA, un ABC bactérien de B. subtillis en utilisant différents systèmes membranaires in vitro et différentes approches de biochimie et de biophysique membranaire. Dans un premier temps, après expression et purification des protéines en détergent, nous avons caractérisé l’hydrolyse d’ATP en fonction de l’état de l’environnement membranaire, solubilisé en micelle de détergent et en micelles mixtes. Les proteoliposomes ont été caractérisés en fonction de l’orientation des protéines, leur taux d’incorporation, leur taille et la lamellarité. Cela nous a permis de moduler de façon contrôlée la composition lipidique, la densité et la conformation des protéines et la courbure membranaire pour déterminer de façon quantitative les contributions respectives de ces paramètres de membranes. Ainsi, nous montrons que l’hydrolyse d’ATP est sensible à la spécificité lipidique quand la protéine est dans une bicouche et que les lipides négatifs et les lipides de type phosphatidylethanolamine stimulent de façon synergique l’activité hydrolytique. L’hydrolyse d’ATP diminue pour les fortes courbure positives. Dans un second temps, nous avons déterminé les conditions de reconstitution de BmrA dans des vésicules géantes qui ont ensuite permis d’étudier les rôles respectifs de la courbure et de la tensions membranaire dans l’organisation spatiale de BmrA par des approches de nanotube pulling. Les expériences en collaboration montrent que BmrA a une préférence marquée pour les régions membranaires à forte courbure conduisant à la formation de cluster de protéines et que cette préférence varie en fonction de l’état catalytique de la protéine. Finalement, nous avons mis au point une méthode pour étudier la dynamique des NBDs par transfert d'énergie de résonance de Förster au niveau de la molécule unique dans un système reconstitué par spectroscopie de fluorescence et de corrélation croisée.L’ensemble des données suggère que organisations spatiales des ABC transporteurs dans les cellules bactériennes et eucaryotes sont différentes avec la possibilité de tris dans des zones de fortes courbures lors de remodelages membranaires mais sans modification importante de la fonction
ABCs (ATP binding cassettes) transporters constitute a large family of transmembrane proteins present in all organisms. ABC transporters hydrolyze ATP to translocate an immense quantity of amphiphilic substrates, such as lipids, steroids, peptides... Some ABCs confer a multiresistance cellular phenotype to drugs from bacteria against antibiotics to humans against anticancer agents, antivirals...A fundamental question for understanding drug transport at the molecular level is how the properties of membranes modulate the function and spatial temporal organization of ABCs. We studied in detail these coupling with BmrA, a bacterial ABC of B. subtillis using different in vitro membrane systems and different biochemical and membrane biophysical approaches. Firstly, after expression and purification of proteins in detergent, we characterized the hydrolysis of ATP of BmrA according to its membrane environment, solubilized in detergent micelles and in mixed lipid/detergent micelles. Proteoliposomes were characterized according to protein orientation, incorporation rate, size and lamellarity. This allowed us to modulate in a controlled manner lipid composition, protein density and conformation and membrane curvature to quantitatively determine the respective contributions of these membrane parameters. Thus, we show that ATP hydrolysis is sensitive to lipid specificity when the protein is embedded in a bilayer. This lipid specificity is provided by negative lipids and phosphatidylethanolamine type lipids that synergistically stimulate hydrolytic activity. However, ATP hydrolysis was decreased in high positive membrane curvature. Secondly, we determined the conditions of reconstitution of BmrA in Giant Unilamellar Vesicles, which then allowed our collaborator to study the respective roles of membrane curvature and tension in the spatial organization of BmrA. Nanotube pulling experiments performed in collaboration show that BmrA has a strong preference for highly curved membrane regions leading to protein cluster formation and that this preference varies according to the catalytic state of the protein. Finally, we developed a method to study the dynamics of NBDs by Förster resonance energy transfer at the single molecule level in reconstituted system via fluorescence cross-correlation spectroscopy.The data set suggest that spatial organizations of ABC transporters in bacterial and eukaryotic cells are different with the possibility of sorting during membrane remodeling of eukaryotic membranes in areas of strong membrane curvatures but without significant change in function

Cette thèse propose l’étude par Dynamique Moléculaire (DM) de la structure de l’ATPase-Ca2+ (SERCA1a) pendant le processus de transport des ions à travers la membrane. On a considéré trois structures, représentant trois étapes conformationnelles successives du processus de pompage. Les simulations sur les structures ont été faites en utilisant deux types de recouvrement de la région transmembranaire: en monocouche de surfactant (LDAO) et en bicouche lipidique (POPC). L’étude structurale s’est intéressée à la mobilité relative des domaines cytoplasmiques ainsi qu’à celle des hélices transmembranaires. Une étude sur l’hydratation des différentes régions transmembranaires a révélé la formation de canaux de solvant à l’intérieur de la protéine. Le surfactant LDAO a été séparément étudié par DM dans sa forme micellaire. L’étude de l’hydratation de la micelle a été présentée dans un article publié dans J. Phys. Chem. B 110: 11504 (2006) comparant la micelle de LDAO avec une micelle de C12E6.

L'objectif principal de ce projet de thèse était d'obtenir de nouvelles données structurales sur les transporteurs ADP/ATP mitochondriaux et de développer des outils pour les approches de micro- et nano-cristallographie appliquées à la biologie structurale des protéines membranaires.Le rôle principal du transporteur ADP/ATP (AAC) est d'importer et d'exporter respectivement de l’ADP3- et l’ATP4- à travers la membrane mitochondriale interne, entre l'espace intermembranaire et la matrice. AAC est le transporteur mitochondrial le mieux caractérisé de toute cette famille de protéines. De nombreuses études ont été menées pour caractériser sa fonction et sa structure. Toutefois, les données structurales n’étant disponibles que pour une conformation de la protéine, de nombreuses questions fondamentales notamment sur les différents états conformationnels adoptés par la protéine au cours du processus de transport restent encore posées. Dans cette thèse, nous avons étudié les 4 isoformes humaines d’AAC. Elles sont impliquées dans diverses maladies génétiques, mais jouent également un rôle dans la cancérogenèse. Cette thèse décrit ainsi en détail la caractérisation structurale et fonctionnelle de ces protéines et leur comparaison. C’est est une étape essentielle pour définir leurs propriétés, et constitue un point de départ précieux dans le développement de nouvelles thérapies.Le domaine de la biologie structurale ne cesse de connaître de nouveaux développements, comme c’est le cas par exemple avec l’avènement de la cristallographie sérielle. Il y a donc un besoin constant de nouvelles approches notamment pour la préparation des échantillons, leur montage sur les lignes de lumière et les collectes de données afin de continuer à améliorer la qualité des données collectées au synchrotron. Ainsi, notre objectif était d'utiliser différents échantillons de protéines membranaires pour développer de nouvelles techniques de cristallisation et de montage d’échantillons sur les lignes de lumière afin de préserver au mieux la qualité des échantillons tout en permettant des collectes de données plus rapides, plus efficaces et plus simples
The main objective of this PhD project was to gain new structural data on the mitochondrial ADP/ATP carriers and develop tools for micro- and nano-crystallography approaches applied to membrane protein structural biology.The main role of the ADP/ATP carrier (AAC) is to import and export ADP3- and ATP4- respectively between the intermembrane space and the matrix through the inner mitochondrial membrane. AAC is the best characterized among all mitochondrial carriers. Much has been done to investigate its function and structure. However, since structural data are only available for one conformation of the protein some fundamental questions about the different conformational states adopted during the transport process still need to be answered.In this thesis we considered 4 human AAC homologs as a main target. They are involved in different genetic diseases but play also a role in cancerogenesis. This thesis describes and compares in detail the functional and structural characterization of the human AAC isoforms. It was an essential step to give insight into their native properties and is a precious starting point for the drug development field.Since the structural biology field is rapidly developing especially in serial crystallography techniques, there are more and more new applications for samples preparation, mounting and measurements in order to improve the quality of the data collected at the synchrotrons. Hence, our second objective was to use different membrane protein samples to develop new crystal-friendly crystallization set up combined with different sample environment on the beamline toward faster, more efficient and simpler data collection

Le transporteur NTT1 est responsable pour l'import d'ATP dans les chloroplastes afin de maintenir le métabolisme en période d'activité réduite ou nulle de la photosynthèse. Cependant, le mécanisme moléculaire de ce transporteur est encore méconnu, essentiellement du à la difficulté de manipulation des protéines membranaires. Nous avons réussi à développer un protocole pour la production de ce transporteur, permettant une bon rendement de solubilisation et obtention de protéines purifiées pour des études structurales. Combinant des caractérisations biochimiques et biophysiques, nous avons pu identifier des conditions de préparation d'échantillons qui ont mené aux premiers cristaux. Afin d'étendre notre connaissance sur les transporteurs de nucléotides, nous avons également entrepris des études structurales et fonctionnelles sur AAC, le transporteur ADP/ATP des mitochondries. AAC et NTT1 appartiennent à des familles de protéines différentes mais ont des fonctions voisines. À partir de la première structure d'AAC déjà connue, nous avons recherché par des criblages in silico de nouvelles molécules se liant au transporteur de façon compétitive avec le nucléotide et pouvant ainsi inhiber le transport. Les outils de docking ont été mis en place et ont permis à partir d'une librairie de 75000 composés d'identifier 17 molécules. Ensuite, nous avons testés ces molécules expérimentalement et montré qu'une d'entre elles inhibent le transport. De plus, trois nouveaux analogues d'ADP ont également été identifiés comme inhibiteurs.

Ce travail de thèse s'est concentré sur l'étude de la protéine CHMP2B. Cette protéine fait partie du complexe ESCRT-III, impliqué dans divers processus de fissions membranaires à topologies inversées (genèse ces corps multivésiculés, cytokinèse, bourgeonnement des virus enveloppés, autophagie). Des mutations dans le gène codant pour CHMP2B ont été très fortement corrélées à la survenue de maladies neuro-dégénératives (démences fronto-temporales et amyotrophie latérale spineuse). Ce travail a consisté à préciser les mécanismes moléculaires d'action de cette protéine afin de mieux cerner les causes potentielles des ces dysfonctionnements. Il se divise en trois sous parties: - L'étude du l'import potentiel de CHMP2B dans les mitochondries, et de son rôle dans la dynamique mitochondriale. - Le rôle de CHMP2B et l'impact de mutants pathogènes dans la morphogénèse des épines dendritiques. - L'étude de la formation de d'hyper-complexes tubulaires de CHMP2B déformants la membrane plasmique. Nous avons ainsi pu montrer les propriétés suivantes: L'extinction de CHMP2B semble inhiber la fission des mitochondries par un mécanisme qui reste à préciser. L'expression des mutants de CHMP2 liés aux démences fronto-temporales perturbe la morphogénèse des épines dendritiques. Cette altération pourrait participer à l'émergence progressive des symptômes de la FTD. La littérature suggère que les fonctions que CHMP2B concernent des organelles cytoplasmiques (endosomes tardifs, autophagosomes,centrosome). Nous avons montrés que cette protéine est principalement recrutée à la membrane plasmique, où elle se polymérise en une structure tubulaire rigide capable de déformer cette bicouche lipidique
This work focused on CHMP2B, an ESCRT-III complex subunit. This protein complex is involved in several membrane fission processes with an inversed topology (virus budding, multivesicular body genesis, cytokisesis, autophagy). Mutations in the gene coding for CHMP2B have been linked to neurodegenerative diseases such as fronto temporal demencia (FTD) and Spinal Lateral Amyotrophy (SLA). This work consisted in understanding molecular mechanisms of CHMP2B's action in order to better understand it' s links with these pathologies. The project was organized around three research axis: - The potential involvement of CHMP2B in the mitochondrial dynamics. - The role of CHMP2B and the impact of the FTD linked mutations on the morphology and the physiology of dendritic spines. - The study of helical CHMP2B containing complexes that deform the plasma membrane into tubular structures. Our experiments led us to the following observations: Extinction of CHMP2B inhibits mitochondrial fission by an unknown mechanism. The FTD linked CHMP2B mutants disrupt the normal pattern of spine development. This alteration could participate to the progressive appearance of FTD. CHMP2B is thought to be involved in the remodeling of cytoplasmic organelles such as late endosomes, autophagosomes, centrosome. . . Our work demonstrate that the protein is manly recruited at the plasma membrane where it assembles in rigid tubular structure that can deform the lipid bilayer

Les ATPases-P4 sont des transporteurs membranaires couplant l'hydrolyse de l'ATP au transport de lipides dans les membranes cellulaires eucaryotes. Avec leurs partenaires, les protéines CDC50, les ATPases-P4 transportent les phospholipides, en particulier la phosphatidylsérine (PS) et la phosphatidyléthanolamine (PE), du feuillet exoplasmique au feuillet cytosolique des membranes, assurant ainsi le maintien de l'asymétrie membranaire.Drs2p est l'une des cinq ATPases-P4 de la levure Saccharomyces cerevisiae. Elle est localisée dans les membranes du trans-Golgi (TGN), et elle a comme partenaire la protéine Cdc50p, qui est nécessaire à l'adressage correct et probablement au transport catalysé par Drs2p. Drs2p est principalement responsable du transport de la phosphatidylsérine (PS) dans les membranes du TGN et son activité est essentielle pour le maintien de la PS dans le feuillet cytosolique de ces membranes. En raison du rôle crucial de la PS dans de nombreuses voies de signalisation, aussi bien à l’extérieur (au cours de l’apoptose par exemple) qu’à l’intérieur de la cellule (par le recrutement de protéines impliquées dans des processus cellulaires essentiels), il est important de comprendre le mécanisme par lequel l’asymétrie de la PS est établie.Afin de progresser dans la compréhension du mécanisme moléculaire du transport de lipides, nous avons mis au point une procédure qui nous a permis de co-exprimer Drs2p et Cdc50p dans Saccharomyces cerevisiae. La purification de Drs2p par chromatographie d'affinité sur résine streptavidine a permis d'obtenir une fraction purifiée contenant très majoritairement Drs2p et Cdc50p, à raison de 1-2 mg/L de culture. Les deux protéines sont sous forme de complexe avec une stœchiométrie d'association de 1:1. Le complexe purifié est fonctionnel, et présente une activité d’hydrolyse de l’ATP stimulée par son substrat, la PS. Cette stimulation n’est cependant possible qu’en présence de PI4P, un phosphoinositide impliqué dans la régulation du trafic membranaire.De par leur rôle crucial dans le maintien de l'asymétrie membranaire, les ATPases-P4 ne peuvent qu'être régulées. Comme de nombreuses ATPases de type P sont soumises à une auto-régulation de leur activité, nous avons examiné la possibilité d’une telle auto-régulation dans le cas des ATPases P4. Pour ce faire, une approche par mutagenèse dirigée et protéolyse ménagée associée à l’identification par spectrométrie de masse des peptides ont été effectuées. La protéolyse ménagée du complexe purifié Drs2p/Cdc50p montre une activité ATPasique dépendante au PI4P de 30-50 fois plus importante. La protéolyse par la thrombine engendre un Drs2p dépourvu d'une partie N-terminale (R104) et d'une partie C-terminale (R1290) qui reste toujours associé à Cdc50p. Ce résultat montre qu'une coupure appropriée au niveau des extrémités terminales de Drs2p peut augmenter de façon significative, en présence du PI4P, l'activité ATPasique du complexe, nous amenant ainsi à identifier un rôle auto-inhibiteur des extrémités N- et/ou C-terminales de Drs2p.Ce travail ouvre des perspectives quant à la caractérisation structurale et fonctionnelle du mécanisme de transport de lipides par le complexe. Par ailleurs, il laisse entrevoir la possibilité d’étudier les bases moléculaires des pathologies associées aux mutations de certaines ATPases P4 humaines
Maintenance of phospholipid asymmetry in eukaryotic cell membranes is essential for cellular integrity and function. P4-ATPases, from the P-type ATPases family, are energy-dependent transporters, together with their CDC50 accessory subunits couple ATP hydrolysis to lipid transport from the exoplasmic to cytoplasmic leaflet to maintain membrane asymmetry.Drs2p is one of these P4-ATPases in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Drs2p is localised in trans-Golgi (TGN) membranes in association with its binding partner Cdc50p, which contributes to the correct addressing of Drs2p and probably in the catalyzed transport by Drs2p. Drs2p transport principally phosphatidylserine (PS) in TGN membranes. The PS is important for a several signalling pathways, for example, in apoptosis and recruitment of the proteins implied in various essential cellular process, so, it's very important to understand the mechanism that establishes this asymmetry.To gain in comprehension of molecular mechanism of lipid transport, robust protocols for expression and purification are required. In this work, we present a procedure for high-yield co-expression of Drs2p and Cdc50p. The purification of Drs2p and Cdc50p is achieved in a single step by affinity chromatography on streptavidin beads, yielding, 1-2 mg purified Drs2p/Cdc50p per liter of culture. This procedure allows purification of the complex Drs2p/Cdc50p with stoichiometry to 1:1. Our complex is functional, overal ATP hydrolysis by the complex is dependent of PS, favourite substrate of Drs2p. This hydrolyze is critically dependent on the presence of PI4P, a phosphoinositide involved in regulation of membrane trafficking.Like many P-type ATPases auto-regulate their activity, we examined the possibility that P4-ATPases are auto-regulated. In this work, we use directed mutagenesis and limited proteolysis associated with mass spectrometry for identify peptides. We show that limited proteolysis of a purified complex Drs2p/Cdc50p resulted in up to a 30-50 fold increase of it ATPase activity, which however remained dependent on PI4P. Using thrombin as the protease, Cdc50p remained intact and in complex with Drs2p, which was cleaved at two positions, namely after R104 and after R1290. Our results therefore reveal that trimming off appropriate regions of the terminal extensions of Drs2p can increase its ATPase activity in the presence of PI4P by an enormous factor, thereby identifying a role of N and/or C-terminal extensions in auto-inhibition of Drs2p.Our results open perspectives on the structural and the functional characterization of the lipid transport mechanism by the complex Drs2p/Cdc50p. Furthermore, our procedures open up the possibility of studying the molecular bases of the pathologies associated with the mutations of human P4-ATPases

Dans les systèmes d'expression eucaryotes, les protéines destinées à être sécrétées sont introduites dans le système endomembranaire de sécrétion via le réticulum endoplasmique (RE). Ces protéines sont ensuite transportées par des vésicules jusqu'à leur compartiment de stockage : vacuole et compartiment extracellulaire en passant par l'appareil de Golgi. Dès leur insertion dans la lumière du RE, ces protéines vont subir des maturations post-traductionnelles qui leur confèreront stabilité et activité biologique. Les protéines responsables de ces maturations doivent posséder des signaux peptidiques spécifiques de rétention pour échapper au flux de sécrétion. Les mécanismes de localisation des protéines solubles et membranaires dans le RE ont été très étudiés dans les cellules animales et de levure mais peu d'informations sont disponibles chez les plantes. Au cours de cette étude, la calnexine d'A. Thaliana a été choisie comme protéine modèle pour identifier les signaux impliqués dans la rétention d'une protéine membranaire de type I dans le RE de cellules végétales. Des protéines chimères contenant les domaines transmembranaire et/ou cytosolique de la calnexine d'A. Thaliana fusionnés à une protéine marqueur extracellulaire, la prosporamine, ont été réalisées. Ces protéines chimères ont été exprimées dans des cellules de tabac BY2 via Agrobacterium tumefaciens et leur localisation a été étudiée. Nous avons mis en évidence que le segment transmembranaire de la calnexine d'A. Thaliana permet la rétention d'une protéine marqueur dans le RE de cellules de tabac. Toutefois, nous avons observé que, quand ce segment transmembranaire est remplacé par celui d'une protéine vacuolaire, l'extrémité cytosolique de la calnexine est également impliquée dans la rétention de la protéine marqueur dans le RE.

Les membranes cellulaires sont constamment remodelées par le bourgeonnement et la fusion de vésicules assurant le transport entre les différentes organelles. De nombreuses protéines périmembranaires orchestrent ce trafic vésiculaire. Les hélices amphipathiques jouent un rôle important dans le mécanisme d'interaction de certaines de ces protéines avec les membranes. A la différence de domaines protéiques reconnaissant spécifiquement un lipide, les hélices amphipathiques reconnaissent plus globalement la physicochimie d'une membrane (forme, charge...). GMAP-210 est une très longue protéine golgienne qui agit comme corde moléculaire grâce à sa structure en coiled-coil. Le laboratoire avait montré que l'extrémité N-terminale de GMAP-210 possède un motif ALPS, une hélice amphipathique singulière sensible à la courbure membranaire. Les motifs ALPS sont caractérisés par l'absence de résidus basiques, l‘interaction avec les membranes ne repose donc que sur l'hydrophobicité. Pour compenser ce déficit, la liaison des motifs ALPS n'a lieu qu'au contact de membranes fortement courbées. Dans le cas de GMAP-210, le motif ALPS permettrait de capturer des vésicules de transport. J'ai démontré que l'autre extrémité de la corde interagit avec Arf1GTP sur des membranes. Cette interaction est conditionnée par le contact avec la surface membranaire d'une petite hélice amphipathique située en aval du domaine d'interaction avec Arf1. De façon remarquable, l'interaction entre Arf1GTP et le domaine C-terminal de GMAP-210 est régulée indirectement par la courbure membranaire. En effet, ArfGAP1, identifiée comme la première protéine possédant un motif ALPS, est capable de dissocier rapidement le complexe de membranes courbées. Par conséquent, GMAP-210 connecte des membranes courbées, par exemple des vésicules, à des membranes planes recouvertes d'Arf1, par exemple des citernes golgiennes. Le mécanisme vectoriel d'attachement de membranes par GMAP-210 repose donc sur de nombreuses hélices amphipathiques (deux dans GMAP-210, une dans Arf1 et une dans ArfGAP1) et permettrait d'expliquer le confinement des vésicules de transport autour de l'appareil de Golgi. Des mesures de vitesse spontanée de désorption membranaire des extrémités de GMAP-210 suggèrent que l'attachement des membranes est très dynamique et a lieu sur des échelles de temps de la seconde à la minute. Le motif ALPS n'est pas le seul motif amphipathique sensible à la courbure. L'alpha-synucléine, une protéine synaptique célèbre pour son implication dans la maladie de Parkinson, contient également une hélice amphipathique senseur de courbure. Curieusement, la physicochimie du motif ALPS et de l'alpha-synucléine est opposée tant pour la face polaire que pour la face hydrophobe. L'alpha-synucléine a une périodicité atypique (3/11), une face polaire zwittérionique et une face hydrophobe présentant de petits résidus et des thréonines. En utilisant des liposomes de composition et de rayon définis, j'ai montré que la charge négative des membranes est un paramètre discriminant dans la liaison aux membranes des deux protéines. En effet, à la différence de GMAP-210, l'alpha-synucléine est strictement dépendante d'un taux élevé de phospholipides anioniques. Par contre, ces protéines sont toutes les deux très sensibles à la nature des chaînes insaturées des phospholipides. Les premiers résultats montrent néanmoins des subtilités intéressantes : l'alpha-synucléine semble mieux adaptée que GMAP-210 à une membrane polyinsaturée comme l'est celle des vésicules synaptiques. En conclusion, de nombreuses hélices amphipathiques sont impliquées dans le trafic vésiculaire. Elles présentent de nettes différences dans leur physicochimie suggérant une adaptation à des membranes cellulaires (de composition lipidique et de rayon définis) par des mécanismes qui restent largement à explorer.