Rozprawy doktorskie na temat „Omique à résolution cellulaire”

La médecine de précision en oncologie a pour but de personnaliser les traitements en fonction des profils génétiques et moléculaires uniques des tumeurs des patients, et ce afin d'améliorer l'efficacité thérapeutique ou de minimiser les effets secondaires. À mesure que les avancées technologiques produisent des données de plus en plus précises sur le microenvironnement tumoral (TME), la complexité de ces données augmente également. Notamment, les données spatiales — un type récent et prometteur de données omiques — fournissent des informations moléculaires à la résolution de la cellule tout en conservant le contexte spatial des cellules au sein des tissus. Pour exploiter pleinement cette richesse et cette complexité, l'apprentissage profond émerge comme une approche capable de dépasser les limitations des approches traditionnelles. Ce manuscript détaille le développement de nouvelles méthodes de deep learning et computationnelles ayant pour but d'améliorer l'analyse des systèmes complexes des données single-cell et spatial. Trois outils sont décrits: (i) Scyan, pour l'annotation de types cellulaires en cytométrie, (ii) Sopa, une pipeline générale de preprocessing de données spatiales, et (iii) Novae, un modèle de fondation pour données spatiales. Ces méthodes sont appliqués à plusieurs projets de médecine de précision, approfondissant notre compréhension de la biologie du cancer et facilitant la découverte de nouveaux biomarqueurs et l'identification de cibles potentiellement actionnables pour la médecine de précision
Precision medicine in oncology customizes treatments based on the unique genetic and molecular profiles of patients' tumors, which is crucial for enhancing therapeutic efficacy and minimizing adverse effects. As technological advancements yield increasingly precise data about the tumor microenvironment (TME), the complexity of this data also grows. Notably, spatial data — a recent and promising type of omics data — provides molecular information at the single-cell level while maintaining the spatial context of cells within tissues. To fully exploit this rich and complex data, deep learning is emerging as a powerful approach that overcomes multiple limitations of traditional approaches. This manuscript details the development of new deep learning and computational methods to enhance our analysis of intricate systems like single-cell and spatial data. Three tools are introduced: (i) Scyan, for cell type annotation in cytometry, (ii) Sopa, a general pipeline for spatial omics, and (iii) Novae, a foundation model for spatial omics. These methods are applied to multiple precision medicine projects, exemplifying how they deepen our understanding of cancer biology, facilitating the discovery of new biomarkers and identifying potentially actionable targets for precision medicine

L’un des enjeux du XXI siècle concerne la compréhension de la machine cellulaire. Le principal problème à l’heure actuelle que rencontrent les biologistes est la diffraction due à la nature ondulatoire de la lumière qui limite la résolution des instruments optiques. Dans cette thèse, nous avons montré pour la première fois que l’up-conversion présent dans les nanoparticules dopées terres rares pouvaient dépasser la limite d’Abbe. Nous avons montré que la résolution latérale dans notre microscope pouvait dépasser λ/5 bien supérieure à la limite d’abbe. Ce concept permet d’atteindre des résolutions proches de 180 nm pour des processus à 4 photons. Ces résultats sont intéressants, ils permettent d’obtenir des résolutions proches d’un microscope confocal, tout en conservant l’excitation infrarouge de faible puissance de l’ordre de quelques µW, permettant de nous s’affranchir d’un laser femto-seconde, et donc de développer un microscope multi-photon à bas cout
Major bottleneck in microscopic imaging is the limited lateral resolution due to the diffraction of light. To overcome this limit, here we demonstrate the up-conversion process in the rare earth doped nanoparticles, which may serve as an original fluorescence source mechanism. Rare earth doped nanoparticles, have been reported to serve as efficient bio-labels for cellular and small animal imaging. In this work, we demonstrate that non-linearity of up-conversion allows achieving high lateral resolution in the images using multiphoton microscopy, demonstrating significant improvement in lateral resolution, using low pumping laser power. This new technique may serve as another approach for high-resolution optical imaging

L'hétérogénéité de l'adénocarcinome canalaire pancréatique (ADCP) est l'obstacle majeur au traitement efficace des patients. En effet, les caractéristiques cliniques et la sensibilité aux traitements sont associés à un phénotype donné et sont plutôt régis à un niveau transcriptomique. Nous avons donc analysé le transcriptome de xénogreffes provenant des patients (Patients Derived Xenografts : PDX) lors des biopsies de tumeurs ou de pièces chirurgicales. Après extraction d’ARN, nous avons trouvé une signature moléculaire capable de diviser les patients en deux groupes, en fonction de leur survie. Nous avons également montré que la réponse autraitement pouvait être prédite par l‘analyse transcriptomique. Nous avons ensuite analysé les tumeurs et leurs stromas, et mis en évidence deux soustypesde stromas et deux sous-types de tumeurs, définis par la transcriptomique basée sur l'ARN, ou la méthylation de l'ADN. Nous avons étudié la réponse aux traitements administrés seuls ou en combinaison avec des chimiothérapies de routine. Nous avons mis en évidence des sous-groupes de patients plus chimiosensibles à certains traitements. Tous ces résultats sont encourageants,mais pas encore applicables en pratique clinique. Nous développons maintenant les organoïdes, véritable représentation de la tumeur en 3dimensions. Contrairement aux PDX, les organoïdes nous permettent d'obtenir des résultats rapidement exploitables. Nous pensons que dans un avenir proche, le traitement des cancers du pancréas sera précédé d'une caractérisation moléculaire étendue afin de sélectionner les traitements les plus appropriés et de pouvoir enfin proposer une médecine personnalisée
Heterogeneity of Pancreatic Ductal AdenoCarcinoma (PDAC) has become the majorimpediment to the effective treatment of patients. Clinical outcome and sensitivity to treatments are associated with a given phenotype and associated at a transcriptomic level. Recent data indicate that studying the expressionof a selected gene set could inform selection of the most appropriate treatments.We areoptimizing this approach by analysing transcriptome of Patient-Derived Xenografts (PDX)from surgical as well as endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration (EUS-FNA)biopsies of tumors, as a source of RNA. We have found a molecularsignature capable of dividing patients into two groups, function of theirsurvival.Independently, we have shown that treatment response pattern can also be foundat a transcriptomic level. We thenanalysed tumors and their stromas, and have found two sub-types of stromas and two sub-types of tumors. These wereindinstinctly defined by RNAseq-based transcriptomics, or DNA methylation. We also studied response to treatments administered alone or incombination to routine chemotherapies. All these results are encouraging, but not yetapplicable in clinical pratice. We are now developing the PDAC Biopsy DerivedPancreatic Cancer Organoids (BDPCO): BDPCO culture represents an excellent source of “exvivo” material. Unlike PDX, which take many months to grow, BDPCO allow us to obtainexploitable material rapidly useful for clinical application. We are convinced that in the near future, the treatment ofpancreatic cancers will be preceded by an extensive molecular characterization of cancercells in order to select the most appropriate treatments

Etudier le rôle des éléments traces à l’échelle cellulaire requiert des outils analytiques de pointe. Nous avons développé une nouvelle méthodologie précise de la répartition des éléments chimiques cellulaires à partir d’une combinaison des méthodes d’analyse par faisceaux d’ions PIXE, RBS et STIM. Cette méthodologie s’appuie fortement sur le développement d’un logiciel (Paparamborde) pour le traitement quantitatif des expériences STIM. La validité de cette méthode ainsi que ses limites sont discutées. La méthode STIM-PIXE-RBS permet de quantifier la composition en éléments traces (µg/g) avec une incertitude de mesure évaluée à 19,8% dans des compartiments cellulaires de masse inférieure à 0,1 ng.Une des limites de la méthode réside dans le faible nombre d’échantillons analysables en raison à la fois du temps minimum nécessaire pour réaliser une acquisition et de l’accès limité aux plateformes d’analyse par faisceaux d’ions. C’est pourquoi nous avons également développé une base de données pour la capitalisation des compositions chimiques cellulaires (BDC4). Cette base de données s’inscrit dans la logique de l’utilisation de la composition chimique cellulaire comme un traceur de l’activité biologique, et doit permettre à terme de définir des compositions chimiques de référence pour les différents types cellulaires analysés.L’application de la méthodologie STIM-PIXE-RBS à l’étude de la toxicologie nucléaire du cobalt permet d’illustrer son intérêt en pratique. En particulier, l’analyse STIM s’avère indispensable dans le cas d’échantillons présentant une perte de masse organique au cours de l’analyse PIXE-RBS
The study of the role of trace elements at cellular level requires the use of state-of-the-art analytical tools that could achieve enough sensitivity and spatial resolution. We developed a new methodology for the accurate quantification of chemical element distribution in single cells based on a combination of ion beam analysis techniques STIM, PIXE and RBS. The quantification procedure relies on the development of a STIM data analysis software (Paparamborde). Validity of this methodology and limits are discussed here. The method allows the quantification of trace elements (µg/g) with a 19.8 % uncertainty in cellular compartments with mass below 0.1 ng.The main limit of the method lies in the poor number of samples that can be analyzed, due to long irradiation times required and limited access to ion beam analysis facilities. This is the reason why we developed a database for cellular chemical composition capitalization (BDC4). BDC4 has been designed in order to use cellular chemical composition as a tracer for biological activities and is expected to provide in the future reference chemical compositions for any cellular type or compartment.Application of the STIM-PIXE-RBS methodology to the study of nuclear toxicology of cobalt compounds is presented here showing that STIM analysis is absolutely needed when organic mass loss appears during PIXE-RBS irradiation

RmI est une molécule hybride contenant 1,03 copie du génome du virus du polyome liée à une insertion cellulaire d'ADN de souris par des répétitions virales directes de 182 pb. Dans ce travail, nous avons examiné la recombinaison intramoléculaire de RmI en utilisant différents recombinants contenant cette molécule. Après transfection dans diverses lignées cellulaires, la recombinaison a été mise en évidence par la production de plages de lyse, ou directement par la méthode de Southern. Nous avons montré que des molécules de taille génomique étaient produites à une fréquence élevée dans des cellules de souris et qu'il s'agissait là d'un événement de recombinaison réciproque. Il semble que la présence de la protéine virale grand T soit nécessaire à cet événement de recombinaison.

L'objectif du travail présenté est la résolution d'un problème inverse d'origine biologique. Plus précisément, il s'agit de la mise en place d'un modèle mathématique et des outils informatiques de calculs correspondants. Par problème inverse, on désigne une classe de problèmes qui consistent à déterminer certains paramètres d'un modèle proposé, de façon à ce que celui-ci approche le mieux possible les résultats obtenus expérimentalement. Pour ceci, on cherche des valeurs des paramètres qui minimisent l'écart, en général en norme L2, entre les valeurs mesurées expérimentalement et celles obtenues par la modélisation. Dans notre cas, le modèle proposé est une équation aux dérivés partielles de type parabolique non linéaire. Les paramètres à appréhender sont des constantes. On est donc ramené à un problème d'optimisation. Notre étude se divisera en quatre parties. Au chapitre 1, on présente le problème physique, sa modélisation originale dans sa formulation non linéaire. Au chapitre 2, on définit une méthode numérique pour la résolution du problème, en justifiant les choix effectués. Au chapitre 3, on étudie plus en détail le point essentiel, mais aussi le plus délicat de la modélisation ; c'est-à-dire la résolution de l'équation parabolique non-linéaire.

État de l’art : La dormance tumorale est une stratégie de résistance utilisée par les cellules cancéreuses. Elle constitue un obstacle majeur dans la thérapie du cancer, puisqu’elle mène à la maladie résiduelle minimale (MRD) et augmente le risque de rechute. Bien que cliniquement significatifs, les mécanismes derrière la dormance tumorale et la MRD ne sont pas bien compris. Nous avons utilisé deux modèles murins syngéniques de leucémie myéloïde et de mélanome élaborés par le laboratoire pour explorer les profils génétiques, épigénétiques, transcriptomiques et protéomiques liés à la dormance tumorale. Par cette approche multi-omique, nous avons cherché à découvrir les processus moléculaires conduisant à la MRD et à identifier des cibles thérapeutiques potentielles.Résultats :Nous avons réalisé une analyse multi-omique complexe incluant le séquençage de l'exome entier (WES), l'analyse des variations du nombre de copies (CNV), l'immunoprécipitation de la chromatine suivie du séquençage (ChIP-seq) et des investigations du transcriptome et du protéome. L'analyse WES a identifié un chevauchement subtil de mutations génétiques entre les modèles de dormance de mélanome et de leucémie, avec de nombreuses mutations trouvées exclusivement dans les cellules de dormance. Ces signatures génétiques spécifiques suggèrent que les pressions sélectives durant la MRD peuvent conférer une résistance au microenvironnement ou aux traitements. En combinant les données CNV, les marques d'histones et les signatures d'expression génique transcriptomique avec l'analyse d'enrichissement de Gene Ontology (GO), nous avons identifié des rôles fonctionnels potentiels de ces gènes mutés et obtenu des informations sur les voies impliquées dans la MRD. De plus, en comparant les "gènes MRD murins" avec les données correspondantes aux maladies humaines provenant de bases de données publiques,nos travaux soulignent des caractéristiques communes liées à la progression de la maladie. L'analyse protéomique, combinée aux investigations génétiques multiomiques,a révélé une signature protéique distincte dans les cellules de dormance avec une implication minimale des mécanismes génétiques. L'analyse 'enrichissement des voies a mis en évidence les processus métaboliques, de différenciation et de remodelage du cytosquelette impliqués dans la MRD. Enfin, nous avons identifié 11 protéines exprimées différemment dans les cellules de dormance de ces deux pathologies. Conclusions : Notre recherche met en évidence la nature complexe de la dormance tumorale,impliquant à la fois des éléments génétiques et non génétiques. En comparant les données génomiques, transcriptomiques, protéomiques et épigénomiques, nous fournissons un aperçu approfondi du paysage moléculaire associé à la MRD. Ces résultats posent une base solide pour de futures études et suggèrent des directions prometteuses pour le développement de thérapies ciblées pour la MRD chez les patients atteints de leucémie et de mélanome. Cela souligne la nécessité de prendre en compte à la fois des facteurs génétiques et non génétiques dans les stratégies de traitement
Background : Tumor dormancy, a resistance strategy used by cancer cells, is a major impediment in cancer therapy, leading to minimal residual disease (MRD) and increasing the risk of relapse. Although clinically significant, the mechanisms behind tumor dormancy and MRD are not well understood. In this research, we employed two syngeneic murine models of myeloid leukemia and melanoma to explore the genetic,epigenetic, transcriptomic, and proteomic profiles linked to tumor dormancy. By applying a multiomics approach, we aimed to uncover the molecular processes driving MRD and identify possible therapeutic targets. Results : We performed a comprehensive omics analysis that included whole-exome sequencing (WES), copy number variation (CNV) analysis, chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq), and investigations of the transcriptome and proteome. The WES analysis identified a limited overlap of gene mutations between the melanoma and leukemia dormancy models, with many mutations found exclusively in dormant cells. These unique genetic signatures suggest that selective pressures during MRD may provide resistance to the surrounding microenvironment or treatments. Combining CNV data, histone marks, and transcriptomic gene expression signatures with Gene Ontology enrichment analysis,we identified the potential functional roles of these mutated genes and gained insights into the pathways involved in MRD. Furthermore, by comparing "murine MRD genes"with corresponding human disease data from public databases, we identified common features related to disease progression. Proteomic analysis, integrated with multi-omics genetic investigations, revealed a distinct protein signature in dormant cells with minimal involvement of genetic mechanisms. Pathway enrichment analysis pointed to the metabolic, differentiation, and cytoskeletal remodeling processes involved in MRD. Ultimately, we identified 11 proteins that were differentially expressed in dormant cells across both types of pathology. Conclusions : Our research highlights the intricate nature of tumor dormancy, involving both genetic and non-genetic elements. Through the comparison of genomic,transcriptomic, proteomic, and epigenomic data, we deliver an extensive overview of the molecular landscape associated with minimal residual disease. These findings laya solid groundwork for future studies and suggest promising directions for developing targeted therapies for MRD in leukemia and melanoma patients. This underscores the necessity of incorporating both genetic and non-genetic factors into treatment strategies

Les macrophages sont en première ligne de la défense innée et jouent un rôle important dans l’initiation de la réponse immunitaire puisque régulant l’inflammation et permettant la clairance des pathogènes. Dans la mucoviscidose, ces phénomènes sont exacerbés et deviennent chronique sans pouvoir être résolus. Les objectifs de cette thèse ont été de déterminer des cibles potentielles responsables des altérations du macrophage dans la mucoviscidose. Dans le contexte inflammatoire, la forme soluble du CD14 (sCD14), dont la sécrétion est augmentée par les macrophages de patients atteints de la mucoviscidose, est caractérisé comme un DAMP puisqu’il contribue à l’entretien de l’inflammation au niveau tissulaire. Dans le contexte infectieux, l’activité de TRPV2, impliqué dans la phagocytose, est altérée. Dans la mucoviscidose, l’inflammation et l’infection sont aussi intimement liées par l’intermédiaire d’une altération des microstructures de la membrane plasmique impliquée dans la production du sCD14 et dans le processus de phagocytose. En conclusion, les modifications des fonctions du macrophage affaiblissent la défense innée des patients atteints de mucoviscidose et peuvent être impliqués dans la progression de la maladie. Par conséquent, les interventions visant à réduire l’inflammation et l’infection pourraient être bénéfiques afin de préserver la fonction pulmonaire des patients. Ainsi, les approches thérapeutiques visant à corriger les dysfonctions du macrophage de patients atteints de mucoviscidose pourrait fournir une meilleure résolution de l'infection et l'inflammation
Macrophages play a significant role in the initiating stages of immune responses regulating inflammation and clearance of the pathogens. In cystic fibrosis, inability of the macrophage to act as a suppressor cell leading to chronic inflammation/infection cannot be resolved. The aims of this work was to find new targets responsible for alterations in cystic fibrosis macrophages. Regarding inflammation, the soluble form of CD14 (sCD14), find overproduced by cystic fibrosis macrophages, is characterized to be a DAMP as it contributes for maintenance of inflammation in tissues. Regarding infection, the activity of TRPV2, involved in phagocytic capacity of macrophage, is impaired. In cystic fibrosis, inflammation and infection were closely linked to the alteration of the plasma membrane microstructures involved in the production of sCD14 and in the phagocytosis process. In conclusion, the alterations of macrophage weaken innate defense of cystic fibrosis patients and may be involved in cystic fibrosis disease progression and lung damage. Consequently, interventions aimed to reduce ongoing infection and destructive inflammatory response may be beneficial in order to preserve their lung function. In this way, therapeutic approaches aimed to correct cystic fibrosis macrophages dysfunctions might provide improved resolution of infection and inflammation

La compréhension des processus cellulaires au niveau membranaire est un domaine d’étude important en recherche biomédicale. Contourner la limite de diffraction en microscopie de fluorescence est maintenant devenu possible en exploitant les transitions moléculaires du fluorophore. Ce travail présente le développement instrumental de deux techniques complémentaires permettant d’atteindre une résolution nanométrique, grâce à l'émission stimulée (STimulated Emission Depletion - STED) d’une part, et la microscopie de fluorescence aux angles supercritiques (Supercritical Angle Fluorescence, SAF) d’autre part. La microscopie STED est une méthode permettant de surpasser la barrière de diffraction et d’atteindre des résolutions latérales de l'ordre de 40 nm dans des échantillons biologiques. Ce dispositif de microscopie exploite les transitions moléculaires des marqueurs fluorescents pour surmonter la limite de résolution due à la diffraction. L'amélioration de la résolution est obtenue par déplétion de l'état excité du fluorophores dans les régions périphériques de l'espace du volume focal. Cependant, malgré l'amélioration importante de la résolution latérale avec la technique STED, cette dernière présente une réelle complexité de mise en œuvre qui a par conséquence un impact important sur le cout des instruments STED commerciaux. Dans ce contexte, la réalisation instrumentale et la performance en imagerie d'un dispositif STED sont présentées dans ce manuscrit. Bien que les microscopes STED classiques offrent une meilleure résolution latérale, la résolution axiale est toujours limitée par la diffraction. L’amélioration de la résolution dans cette direction implique une certaine complexité instrumentale. Dans ce cadre, nous démontrons une nouvelle approche utilisant l’imagerie SAF permettant d'obtenir un sectionnement axial de l'ordre de 150 nm. L’approche se base sur la propriété d'une molécule à émettre dans les angles supercritiques uniquement lorsqu’elle se rapproche de l'interface verre-eau. Le sectionnement axial est obtenu dans une configuration simple en détectant uniquement les composantes de l’émission supercritique. La combinaison de ces techniques d'imagerie donne un outil puissant pour étudier les phénomènes moléculaires sur les membranes biologiques
Understanding cellular processes on membranes has been a key area of biomedical research. Circumventing the diffraction limit in fluorescence microscopy has now become possible by exploiting the molecular transitions of the fluorophore. In this context, this work presents the instrumental development of two complementary techniques for realizing nanometric all-optical resolution and axial sectioning, namely STimulated Emission Depletion (STED) and Supercritical Angle Fluorescence (SAF) microscopy. STED microscopy is an elegant method that has allowed us to break the diffraction barrier with light microscopes and has achieved resolutions of the order of 40 nm (transverse) in biological samples. In this technique, we exploit the molecular transitions of the fluorescent marker to overcome the resolution limit due to diffraction. Resolution enhancement is achieved by efficient depletion of the excited state of the marker in the peripheral spatial regions of the focal volume by using depletion beams in addition to the excitation beam. Despite the major resolution improvement demonstrated, the technique is not well spread out, mainly due to its apparent complexity; and the cost and limited tunability of the commercial system. In this context, the instrumental realization and the imaging performance of a cost-effective home-built STED microscope is presented in this manuscript. While conventional STED microscopes offer improved lateral resolution, an isotropic gain in resolution usually comes at the cost of complex instrumentation. In this regard, we demonstrate SAF microscopy as a powerful tool that achieves an axial sectioning of the order of 150 nm. This is done by exploiting the property of a molecule to emit into the supercritical anglesonly when near the glass-water interface. Axial sectioning is obtained in a simple configuration by detecting solely the supercritical components of radiation. A combination of these imaging techniques offer a powerful tool to study molecular phenomena on the biological membranes

En recherche pharmacologique, les cellules vivantes sont largement utilisées comme milieu d’analyse pour l’étude de phénomènes biologiques, par exemple l’apoptose et la réorganisation cellulaire. Différents outils de caractérisation sont développés pour analyser et traduire l’information biologique en information quantifiable. L’imagerie à résonance de plasmons de surface (SPR) est sensible aux variations d’indice de réfraction d’un milieu à l’interface d’une couche métallique. Elle trouve beaucoup d’applications en recherche pharmacologique, car elle permet l’acquisition d’images en temps réel et ne nécessite pas de marquage biologique comme en fluorescence. Cependant, la nature propagative des plasmons de surface (PSP) limite la résolution spatiale en entraînant un étalement de l’information dans la direction de propagation des PSP. Cela signifie qu’il est difficile de résoudre spatialement des détails inférieurs à la distance de propagation des PSP, généralement de l’ordre des dizaines de micromètres. Plusieurs groupes de recherche travaillent à améliorer la résolution spatiale en imagerie SPR. Toutefois, bien que des résolutions spatiales inférieures à celle de la propagation ont été obtenues, certains compromis ont été effectués, par exemple la diminution de la résolution temporelle ou d’indice de réfraction.Ce projet de thèse s’insère dans cette problématique en concevant et réalisant des dispositifs plasmoniques permettant d’améliorer la résolution spatiale en imagerie SPR, tout en minimisant les compromis avec les autres paramètres d’imagerie. Ces puces SPR sont composées de surfaces métalliques nanostructurées dont le mode guidé combine les propriétés des plasmons propagatifs et des plasmons localisés. Un logiciel de modélisation numérique a permis de démontrer comment la géométrie des surfaces nanostructurées peut être optimisée de manière à réduire la longueur d’atténuation du mode plasmonique tout en conservant un fort contraste d’imagerie. Une géométrie optimale a été identifiée et des structures de l’ordre du micromètre ont été observées à l’aide des puces SPR nanostructurées optimisées. Les résultats expérimentaux ont montré une réduction de la propagation d’un facteur de 6.3 comparativement à des surfaces métalliques uniformes.Les performances en imagerie des puces SPR nanostructurées ont été validées au cours d’études de réponses cellulaires causées par stimulation à l’aide d’agents pharmacologiques. Les puces ont été employées dans l’étude de changements d’intégrité de couches confluentes de cellules suivant stimulation. La quantification de trous intercellulaires dans la couche a montré une augmentation significative du nombre de petits trous détectés (~ 1-2 µm2) lors de l’utilisation des puces SPR nanostructurées. Cette augmentation de la sensibilité à l’activité cellulaire est le résultat de l’amélioration de la résolution spatiale. Finalement, l’étude de la morphologie de cellules au cytosquelette fortement linéaire a permis d’observer des structures subcellulaires et de suivre la réorganisation du cytosquelette de cellules individuelles. Les puces SPR nanostructurées conçues et réalisées au cours de cette thèse montrent un fort potentiel d’applications en imagerie sans marquage de cellules vivantes
In pharmacological research, living cells are widely used as the sensing medium for biological studies, such as cell apoptosis and cellular reorganization. Different characterization systems are developed to analyze and quantify biological information. Surface plasmon resonance (SPR) imaging is sensitive to minute refractive index variations occurring in a medium at the proximity of a metal layer. It has found many applications in pharmacological research since it allows the real-time image acquisition and does not require biological labeling like for fluorescence. However, the propagative nature of surface plasmons (PSPs) limits the spatial resolution by spreading the information in the direction of propagation of the PSPs. This means that it is difficult to spatially resolve details smaller than the attenuation length of the PSPs, generally of the order of tens of micrometers. Several research groups have worked on this limitation in order to improve the spatial resolution in SPR imaging. However, although spatial resolutions lower than that of the propagation have been obtained, those techniques require compromises, such as loss in temporal resolution or in refractive index.In this thesis project, plasmonic devices were designed and characterized in order to improve spatial resolution in SPR imaging, while minimizing compromises with other imaging parameters. These SPR chips are composed of nanostructured metal surfaces where the guided mode combines the properties of propagative plasmons and localized plasmons. An in-house numerical modeling software has demonstrated how the geometry of nanostructured surfaces can be optimized to reduce the attenuation length of the plasmonic mode, while maintaining a high imaging contrast. An optimum geometry was identified, and micron-sized structures have been observed using the optimized nanostructured SPR chips. Experimental results showed a reduction in propagation by a factor of 6.3 compared to uniform metal surfaces.The imaging performances of nanostructured SPR chips were assessed by studying cellular responses following pharmacological stimulation. The chips were used in real-time monitoring of integrity changes in confluent endothelial cell layer following stimulation. Quantification of intercellular gaps in the monolayers showed a significant increase in the number of small holes detected (~ 1μm2) when using nanostructured SPR chips. This increase in sensitivity to cellular activity is the result of improved spatial resolution. Finally, the study of morphology in highly linear cytoskeleton cell enabled the observation of subcellular structures and the monitoring of cytoskeleton reorganization in individual cells. The nanostructured SPR chips designed and realized during this thesis show a strong potential label-free live cell imaging

L'objectif de cette thèse étudie puis d'implémenter une méthode de reconstruction sur la tomographie aux rayons X qui permette de scanner des gros échantillons avec une bonne résolution qui permettrait de scanner l'intérieur d'un cylindre(tomographie locale) et caractériser des matériaux réels. Notre méthode peut être réalisé pour améliorer la quantitative et la qualitative d'image de fantôme. Dans cette thèse, cet méthode est utilisé sue les matériaux cellulaires. Nous avons réalisé des essais in situ en tomographie aux rayons X sur le mousse ERG et les sphères creuses. Un comparaison entre les résultats d'Élément Finis et des essais réels montre le mécanisme d'endommagement de ces matériaux.

Pseudomonas aeruginosa (P.a) est un bacille Gram négatif responsable d’infections chroniques associées à une mortalité élevée due à la prédilection de la bactérie à développer une résistance aux antibiotiques et l’inefficacité des thérapies actuelles. Notre groupe a montré dans un modèle d’infection aigue chez la souris, que l’élastase B (LasB), un facteur de virulence de P.a, dégrade la cytokine IL-6 et la molécule antimicrobienne Elafine et que la surexpression de ces deux médiateurs confère une protection aux souris en diminuant l’inflammation et augmentant la réparation. Les macrophages alvéolaires représentent la population myéloïde la plus abondante dans l’espace alvéolaire et jouent un rôle clé dans le maintien de l’homéostasie, l’initiation & la résolution de l’inflammation. Compte tenu de leur importance, ils sont très étudiés dans le cadre de développement de nouvelles approches de thérapie cellulaire. Nous avons donc émis l’hypothèse que le macrophage alvéolaire qui est également cible de P.a et de LasB plus particulièrement, puisse être un outil adéquat pour le transfert de la protection IL-6- et Elafine-médiée. L’objectif principal de ce travail est de modifier le macrophage avec des vecteurs adénoviraux permettant la surexpression de l’IL-6 et de l’Elafine, et de l’utiliser comme un outil thérapeutique dans un modèle de transplantation intrapulmonaire suivie d’une infection par P.a. Nous montrons que le transfert de macrophages génétiquement modifiés avec l’IL-6 et l’Elafine est protecteur. L’Elafine induit dans le macrophage une signature IL6/IL10/peptides antimicrobiens qui, en synergie avec l’IL-6, confère un phénotype régulateur à l’unité alvéolaire
Pseudomonas aeruginosa (P.a) is a Gram-negative bacillus responsible for chronic infections associated with high mortality due to the bacterium's predilection for developing antibiotic resistance and the inefficacy of current therapies. Our group showed in a model of acute infection in mice that Elastase B (LasB), a virulence factor of Pa, degrades the cytokine IL-6 and the antimicrobial molecule Elafine and that the overexpression of these two mediators provides protection to mice by decreasing inflammation and increasing repair. Alveolar macrophages represent the most abundant myeloid population in the alveolar space and play a key role in maintaining homeostasis, initiation and resolution of inflammation. Given their importance, they are very much studied in the development of new approaches to cell therapy. We therefore hypothesized that the alveolar macrophage which is also targeted by P.a and LasB more particularly, may be an adequate tool for the transfer of IL-6- and Elafine-mediated protection. The main objective of this work is to modify the macrophage with adenoviral vectors allowing the overexpression of IL-6 and Elafine, and to use it as a therapeutic tool in an intrapulmonary transplantation model followed by a Pa infection We show that the transfer of genetically modified macrophages with IL-6 and Elafine is protective. Elafine induces in the macrophage an IL6 / IL10 / antimicrobial peptide signature which, in synergy with IL-6, confers a regulatory phenotype to the alveolar unit

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus nombreux et les premières cellules à arriver au site de l’infection où elles internalisent les pathogènes par phagocytose. Dès le début du processus, la NADPH oxydase s’assemble au phagosome où elle permet la production de formes réactives de l’oxygène contribuant ainsi à la destruction du pathogène. La sous-unité catalytique membranaire de la NADPH oxydase, Nox2, est donc présente à la coupe phagocytaire puis au phagosome. Le dessein de cette étude était de déterminer quelles sont les sources subcellulaires de la protéine Nox2, de savoir si la protéine s’accumule au phagosome et le cas échéant selon quelle cinétique. Dans le but de comprendre la dynamique de la protéine Nox2, la protéine d’échafaudage IQGAP1 qui est associée au cytosquelette a également été étudiée. Enfin l’étude de l’organisation spatiale de la protéine Nox2 à la synapse phagocytaire a également été abordé.En utilisant des cellules neutrophil-like (PLB-985) ainsi que des neutrophiles humains, notre étude a montré par immunofluorescence la présence de la protéine Nox2 dans des endosomes de recyclage ou dans des endosomes précoces. Lors de la phagocytose ils avoisinent le phagosome suggérant leur implication dans l’apport de la protéine Nox2 à la membrane de ce dernier. L’utilisation de cellules PLB-985 pour lesquelles l’expression de Nox2 a été supprimée puis réintroduite avec un transgène codant pour la protéine GFP-Nox2 montre que la sous-unité Nox2 s’accumule au phagosome pendant les vingt minutes suivant sa fermeture. Dans notre étude, la protéine IQGAP1 ne semble pas avoir d’effet sur la phagocytose ou sur la production de FRO par la NADPH oxydase. Enfin, grâce à une technique de microscopie super-résolution (le dSTORM) l’évolution du pattern de Nox2 dans la membrane a été évalué au cours du temps en phagocytose frustrée. En dix minutes, le nombre de clusters de protéine Nox2 augmente mais leur taille reste inchangée
Neutrophils are the most numerous leukocytes and the first cells to arrive at the site of infection where they internalize pathogens by phagocytosis. From the beginning of the process, the NADPH oxidase is assembled at the phagosome, where it allows the production of reactive oxygen species (ROS), thus contributing to the destruction of the pathogen. The membrane bound catalytic subunit of the NADPH oxidase, Nox2, is therefore recruited at the phagocytic cup and then at the phagosome. The purpose of this study was to determine, which are the subcellular sources of the Nox2 protein, whether the protein accumulates at the phagosome and if so, according to which kinetics. In order to modify the dynamics of the Nox2 protein, the scaffold protein IQGAP1 that is associated with the cytoskeleton was also studied. Finally, the spatial organization of the Nox2 protein in the phagocytic synapse was also investigated.Using neutrophil-like cells (PLB-985) as well as human neutrophils, our study showed by immunofluorescence the presence of the Nox2 protein in recycled or early endosomes. During phagocytosis, they are close to the phagosome, suggesting their involvement in the contribution of the Nox2 protein to the phagosome membrane. The use of PLB-985 for which Nox2 expression has been suppressed and then reintroduced with a transgene encoding the GFP-Nox2 protein shows that the Nox2 subunit accumulates at the phagosome during the first twenty minutes after its closure. In our study, the protein IQGAP1 does not appear to have any effect on phagocytosis or on the production of ROS by NADPH oxidase. Finally, using super resolution microscopy (dSTORM) the evolution of the Nox2 pattern in the membrane has been evaluated over time in frustrated phagocytosis. Within ten minutes, the number of Nox2 protein clusters increases but their size remains unchanged

Pour transmettre une information d'un neurone à un autre, les neurones utilisent des jonctions communicantes spécialisées : les synapses. Dans l'hippocampe, une bonne proportion des synapses excitatrices se situent dans de petites protrusions membranaires : les épines dendritiques. La dynamique et la morphologie des épines évoluent au cours du temps de façon dépendante de l'activité synaptique. Les zones synaptiques, pré et post, sont sujettes à un trafic intracellulaire dense et actif. Parmi les protéines qui régulent ce trafic, on trouve les protéines SNAREs (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor) qui assurent la fusion de vésicules avec la membrane cible et permettent la libération de neurotransmetteurs (pré-synaptique) ou de récepteurs synaptiques (post-synaptique). Les protéines SNAREs se regroupent en deux grandes catégories, les v-SNAREs que l'on trouve à la membrane des vésicules et les t-SNAREs que l'on trouve sur la membrane cible. v- et t-SNAREs interagissent entre elles pour rapprocher les deux membranes et déclencher la fusion membranaire. L'objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle du trafic intracellulaire dans le remodelage membranaire des zones synaptiques dendritiques au cours de l'apprentissage et de la mémoire. Mon travail s'est focalisé sur la v-SNARE VAMP7 qui s'exprime dans les neurones, des stades développementaux aux stades matures bien que son rôle reste peu connu dans les dendrites. Précédemment au laboratoire, il a été montré que les souris VAMP7 KO présentent de meilleures performances mnésiques lors de tests comportementaux impliquant la mémoire et l'apprentissage. Dans un premier temps, j'ai montré que VAMP7 se localise préférentiellement dans les dendrites et que les souris VAMP7 KO présentent une augmentation des épines dendritiques matures, confirmant un rôle de VAMP7 dans les phénomènes d'apprentissage et de mémoire. Avec une approche de microscopie, j'ai montré que VAMP7 se localise à une très forte proximité des synapses et que VAMP7 se trouvait dans une grande majorité des épines dendritiques, plus particulièrement dans la tête de celles-ci. Afin de déterminer sa fonction, j'ai évalué la distribution de VAMP7 et de compartiments intracellulaires classiques (endosomes précoces et de recyclage, endolysosomes, etc...) dans les dendrites. Mes résultats indiquent que VAMP7 n'est pas majoritairement localisé dans ces compartiments suggérant l'existence d'un compartiment encore non caractérisé dans les dendrites. Grâce à l'imagerie vivante et super-résolutive, STED et STORM, j'ai montré que VAMP7 se localise dans des extensions golgiennes dans les dendritiques (Golgi sattelite). Finalement, mes résultats montrent que VAMP7 et certains récepteurs au glutamate de type NMDA sont dans les mêmes compartiments dans le tronc et les épines dendritiques. En complément de l'étude du rôle de VAMP7 dans les processus de remodelage membranaire j'ai, en collaboration avec des chimistes spécialisés dans la synthèse de sondes fluorescentes, mis au point l'utilisation de sondes organiques photoconvertibles en microscopie conventionnelle et super-résolutive. Plus précisément, nous avons découvert des propriétés physico-chimiques de sondes fluorescentes photoconvertibles que j'ai utilisées pour reconstruire la membrane plasmique en imagerie STORM sur cellules vivantes. Ceci permettra à l'avenir de suivre la dynamique des épines lors de la plasticité synaptique en imagerie STORM. Mes résultats suggèrent qu'il existerait des compartiments dendritiques VAMP7-positif, encore non caractérisés, qui agirait comme une station de stockage de récepteurs synaptiques. Il serait intéressant d'investiguer si l'activité et le trafic des récepteurs synaptiques se ferait alors sous le contrôle de VAMP7 et dépendrait du niveau d'activité synaptique. Ainsi à l'avenir on pourrait étudier l'exocytose de VAMP7 et comment son activité est modulée pendant la plasticité synaptique (LTD et LTP)
To transmit information from one neuron to another, neuronal cells use specialized communicating junctions called synapses. In the hippocampus, a large proportion of excitatory synapses are located in tiny membrane protrusions called dendritic spines. The dynamics and morphology of the spines change over time, depending on the activity to which the synapse is subjected. The pre- and post-synaptic zones are subject to a dense and active intracellular traffic. Among the proteins that regulate this traffic, we can find SNAREs (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor) which are mediating membrane fusion. This process allows vesicles to fuse with targeted membrane and enable the release of: neurotransmitters (pre-synaptic) or synaptic receptors (post-synaptic). SNARE proteins are classified into two main categories: v-SNAREs, found on the vesicle membrane, and t-SNAREs, found on targeted membrane. v- and t-SNAREs interact with each other to bring the two membranes together and trigger membrane fusion. The aim of my thesis was to determinate the role of intracellular trafficking in the membrane remodeling during learning and memory. My work focused on the v-SNARE VAMP7, which is expressed in neurons from developmental to mature stages, although little is known about its role in dendrites. Previously in the laboratory, it has been shown that VAMP7 KO mice show improved memory performance in behavioral tests involving learning and memory. First, I showed that VAMP7 is localized preferentially in dendrites. Then, I quantified on electron microscopy that VAMP7 KO mice show an increase in mature dendritic spines, confirming a role for VAMP7 in learning and memory processes. Using microscopy, I showed that VAMP7 is localized in close proximity to synapses and that VAMP7 is found in a large majority of dendritic spines, particularly in the head of these. To determinate its function, I assessed the distribution of VAMP7 and classical intracellular compartments (early and recycling endosomes, endolysosomes, etc.) in dendrites. My results indicate that VAMP7 is not predominantly localized in these compartments, suggesting the existence of an uncharacterized dendritic compartment. Using live imaging and super-resolution imaging, STED and STORM, I show that VAMP7 is localized in dendritic golgi extensions (Golgi sattelite). Finally, my results show that VAMP7 and some type of NMDA receptors are in the same compartments in both dendritic shaft and spines. In addition to studying the role of VAMP7 in membrane remodeling processes, I have, in collaboration with chemists specializing in the synthesis of fluorescent probes, discovered and developed the use of photoconvertible organic probes in conventional and super-resolution microscopy. More specifically, we discovered the physico-chemical properties of photoconvertible fluorescent probes, which I used to reconstruct the plasma membrane in STORM imaging on living cells. In the future, this will make it possible to follow the dynamics of spines during synaptic plasticity in STORM imaging. My results suggest the existence of an uncharacterized VAMP7-positive dendritic compartments, whose function would be to act as a storage station for synaptic proteins and receptors. It would be interesting to investigate whether the activity and trafficking of synaptic receptors would then be under the control of VAMP7 which could also be dependent on the level of synaptic activity. In this way, we could study VAMP7 exocytosis and how its activity is modulated during synaptic plasticity (LTP - LTD)

Les adhérences focales (AF), structures adhésives reliant la cellule à la matrice extra-cellulaire (MEC), constituent de véritables plateformes de signalisation biochimique et mécanique qui contrôlent l'adhérence, la migration, la différenciation et la survie cellulaire. Les récepteurs transmembranaires intégrines sont au coeur des AF, où elles connectent la MEC au cytosquelette d'actine. Au début des années 2000, la protéine intracellulaire taline, qui se lie aux parties cytoplasmiques bêta des intégrines, était considérée comme le principal activateur des intégrines. Néanmoins, il a depuis été montré que la kindline, autre protéine intracellulaire se liant aux parties bêta cytoplasmiques, jouait également un rôle essentiel dans l'activation des intégrines. Ainsi,plusieurs études ont mis en évidence que la kindline et la taline étaient complémentaires et avaient une action synergique durant l'activation des intégrines. Les bases moléculaires de ces phénomènes restent à déterminer. De plus, la plupart des données sur lerôle de la kindline dans l'adhérence et l'activation des intégrines provient d'expériences menées sur des cellules en suspension et/ou avec l'intégrine plaquettaire αIIbβ3. Ainsi, la régulation de ces processus par la kindline dans les cellules adhérentes est encore peu comprise. Dans cette étude, nous combinons la microscopie PALM et le suivi de protéines individuelles pour révéler le rôle et le comportement de la kindline à l'intérieur et à l'extérieur des AF au cours des événements moléculaires clés se déroulant au niveau de la membrane plasmique, et qui mènent à l'activation des intégrines. Nous avons observé que les intégrines bêta1 etbêta3 portant une mutation ponctuelle inhibant l'interaction avec la kindline montrent un défaut d'immobilisation dans les AF. Nous avons également observé que la kindline-2, qui est enrichie dans les AF, diffusait librement au niveau de la membrane plasmique,à l'intérieur et à l'extérieur des AF. Ceci constitue une distinction majeure par rapport à la taline, qui, au niveau de la membrane plasmique, est essentiellement observée dans les AF où elle est immobile, montrant qu'elle est recrutée dans les AF directement depuis le cytosol sans diffusion latérale membranaire (Rossier et al. 2012). Afin d'identifier les bases moléculaires du recrutement et de la diffusion membranaire de la kindline, nous avons utilisé différents variants mutés de kindline précédemment décrits. Le mutant kindline-2-QW614/615AA (liaison aux intégrines inhibée) montre une diffusion membranaire accrue, ce qui suggère que la kindline peut diffuser au niveau de la membrane plasmique sans être associée aux intégrines. Par ailleurs, la baisse d'immobilisation au niveau des AF observée avec ce mutant montre qu'une partie de l'immobilisation de la kindline est due aux intégrines, suggérant l'existence d'un complexe intégrine-kindline immobile dans les AF. La délétion du domaine PleckstrinHomology (PH) de la kindline diminue considérablement son recrutement et sa diffusion membranaire. Nous avons évalué le rôle fonctionnel du recrutement et de la diffusion membranaire de la kindline en réexprimant ces mutants dans des cellules déplétéesen kindline-1 et -2 (cellules KO kindline-1 -/-, kindline-2 -/-). Ces expériences montrent que le recrutement et la diffusion membranaire de la kindline sont cruciaux pour l'activation des intégrines durant l'étalement cellulaire et favorisent la formation d’adhérences. Cela suggère que la kindline utilise un chemin différent de celui de la taline pour atteindre et activer les intégrines,ce qui pourrait expliquer au niveau moléculaire comment la kindline complémente la taline durant l'activation des intégrines
Focal adhesions (FAs) are adhesive structures linking the cell to the extracellular matrix (ECM) and constitute molecular platforms for biochemical and mechanical signals controlling cell adhesion, migration, differentiation and survival. Integrin transmembrane receptors are core components of FAs, connecting the ECM to the actin cytoskeleton. During the early 2000s, the intracellular protein talin, which directly binds to the cytoplasmic tail of β-integrins, was considered as the main integrin activator. Nevertheless, it has been shown that kindlin, another intracellular protein that bind to β-integrin, is also a critical integrin activator. In fact, several studies have shown that kindlin and talin play complementary and synergistic roles during integrin activation. The molecular basis of these phenomena remains to determine. Moreover, most studies focusing on the role of kindlin during integrin activation and cell adhesion have been performed with suspended cells and/or with the platelet integrin αIIbβ3. Here we combined PALM microscopy with single protein tracking to decipher the role and behavior of kindlin during key molecular events occurring outside and inside FAs at the plasma membrane and leading to integrin activation, as we have done previously for talin (Rossier et al., 2012). We found that beta1 and beta3-integrins with a point mutation inhibiting binding to kindlin show reduced immobilization inside FAs. We also found that kindlin-2, which is enriched inside FAs, displayed free diffusion at the plasma membrane outside and inside FAs. This constitutes a major difference with talin, which, at the plasma membrane level, is observed almost exclusively in FAs, where it is immobile, which shows that talin is recruited into FAs directly from the cytosol without lateral diffusion along the plasma membrane (Rossier et al. 2012). To determine the molecular basis of kindlin membrane recruitment and diffusion, we used a kindlin variant known to decrease binding to integrins (kindlin-2- QW614/615AA). This mutant displayed increased membrane diffusion, suggesting that kindlin-2 can freely diffuse at the plasma membrane without interacting with integrins. Moreover, the kindlin-2-QW mutant showed decreased immobilization inside FA, showing that part of kindlin immobilization depends on interaction with integrins. This suggests that kindlin can form an immobile complex with integrins inside focal adhesions. Deletion of the kindlin pleckstrin homology (PH) domain strongly reduced the membrane recruitment and diffusion of kindlin. We assessed the functional role of kindlin membrane recruitment and diffusion by re-expressing different kindlin-2 mutants in kindlin-1/kindlin-2 double KO cells. Those experiments demonstrated that kindlin-2 membrane recruitment and diffusion are crucial for integrin activation during cell spreading and favor adhesion formation. This suggests that kindlin uses a different route from talin to reach integrins and trigger their activation, providing a possible molecular basis for their complementarity during integrin activation

Les microscopies optiques super-résolues aident à mieux comprendre certains mécanismes biomoléculaires, notamment au sein des neurones. Nous avons construit un tel microscope de type STED (STimulated Emission Depletion) pour observer des défauts azote-lacune (NV) fluorescents dans le diamant, et avons atteint une résolution de 50 nm. À plus long terme, cet instrument permettra d’étudier l’organisation macromoléculaire de protéines impliquées dans la plasticité synaptique, et marquées avec des nanodiamants (ND) fluorescents. Dans cette perspective, nous avons étudié la limite de résolution du STED pour des ND de tailles sub-longueur d’onde. Nos expériences, menées avec l’équipe de Stefan Hell (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry) ont montré que la taille du spot STED d’un NV dans un ND pouvait atteindre 10 nm, performance similaire à celle obtenue dans un diamant macroscopique. Nous pouvons aussi résoudre plusieurs centres NV dans un ND séparés de seulement ~15 nm. Ces résultats sont en accord avec les simulations numériques faites par l’équipe de Jean-Jacques Greffet (Laboratoire Charles Fabry). En parallèle, nous avons démontré l’internalisation spontanée de ND fluorescents dans des neurones corticaux d’embryons de souris en culture primaire, et étudié leur colocalisation avec des vésicules du réseau trans-Golgi. Enfin, nous avons débuté l’étude du trafic des vésicules contenant les ND et montré qu’il dépend du réseau de microtubules. Les paramètres du mouvement sont compatibles avec ceux des moteurs moléculaires, mais nous nous attendons à ce qu’ils soient différents dans le cas de la surexpression de protéines impliquées dans le trafic (travail en cours)
Super resolution microscopy techniques are a useful tool to understand some biomolecular mechanisms, particularly in neurons. We have built such a STED (STimulated Emission Depletion) microscope for observing Nitrogen-Vacancy (NV) fluorescent defect in diamond, and have reached a resolution of 50 nm. In the longer term, this instrument will study the macromolecular organization of proteins involved in synaptic plasticity and marked with fluorescent nanodiamonds (ND). In this context, we studied the resolution limit of STED for ND of subwavelength size. Our experiments, conducted with the team of Stefan Hell (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry) showed that the STED spot size of an NV in ND could reach 10 nm, which is similar to performances obtained in a macroscopic diamond. We can also resolve several NV centers, which are separated from only ~15 nm in the same ND. These results are in agreement with numerical simulations carried out by the team of Jean-Jacques Greffet (Laboratoire Charles Fabry). In parallel, we have demonstrated the spontaneous internalization of fluorescent ND in primary culture of cortical neurons from mouse embryos, and studied their colocalization with vesicles of the trans-Golgi network. Finally, we started the study of trafficking vesicles containing ND and showed that it depends on the microtubule network. The motion parameters are compatible with those of molecular motors, but we expect them to be different in the case of overexpression of proteins involved in traffic (work in progress)

Les microscopies optiques super-résolues aident à mieux comprendre certains mécanismes biomoléculaires, notamment au sein des neurones. Nous avons construit un tel microscope de type STED (STimulated Emission Depletion) pour observer des défauts azote-lacune (NV) fluorescents dans le diamant, et avons atteint une résolution de 50 nm. À plus long terme, cet instrument permettra d'étudier l'organisation macromoléculaire de protéines impliquées dans la plasticité synaptique, et marquées avec des nanodiamants (ND) fluorescents. Dans cette perspective, nous avons étudié la limite de résolution du STED pour des ND de tailles sub-longueur d'onde. Nos expériences, menées avec l'équipe de Stefan Hell (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry) ont montré que la taille du spot STED d'un NV dans un ND pouvait atteindre 10 nm, performance similaire à celle obtenue dans un diamant macroscopique. Nous pouvons aussi résoudre plusieurs centres NV dans un ND séparés de seulement ~15 nm. Ces résultats sont en accord avec les simulations numériques faites par l'équipe de Jean-Jacques Greffet (Laboratoire Charles Fabry). En parallèle, nous avons démontré l'internalisation spontanée de ND fluorescents dans des neurones corticaux d'embryons de souris en culture primaire, et étudié leur colocalisation avec des vésicules du réseau trans-Golgi. Enfin, nous avons débuté l'étude du trafic des vésicules contenant les ND et montré qu'il dépend du réseau de microtubules. Les paramètres du mouvement sont compatibles avec ceux des moteurs moléculaires, mais nous nous attendons à ce qu'ils soient différents dans le cas de la surexpression de protéines impliquées dans le trafic (travail en cours).

Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) est une bactérie commensale de l'homme pouvant provoquer dans certaines conditions des pneumonies, des méningites ou des septicémies. Les stratégies de lutte utilisées contre le pneumocoque reposent sur l'emploi d'antibiotiques ou de vaccins. Ces deux approches se heurtent cependant à son remarquable potentiel de plasticité génétique qui dépend de sa capacité à transformer. La transformation est un mécanisme d'échange d'ADN très conservé chez les bactéries, qui contribue à leur diversification, leur évolution et leur adaptation. La capacité des bactéries à transformer est liée à un état physiologique dit de ‘compétence'. Chez le pneumocoque, la compétence se développe de façon transitoire dans toutes les cellules de la population lors de leur phase de multiplication. Elle s'accompagne d'un blocage du processus de division qui permet aux cellules de finaliser les étapes terminales de la transformation sans compromettre l'intégrité de leur génome. ComM, une protéine synthétisée pendant la compétence, apparait nécessaire et suffisante pour induire ce blocage. Le but de mon projet de thèse était de comprendre le mécanisme d'action de ComM. Pour mesurer l'impact de ComM, et plus généralement du développement de la compétence, sur la dynamique des protéines de la division, j'ai utilisé la technique de microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF), Une autre stratégie a consisté à mettre en évidence les connexions potentielles entre les protéines de la transformation et celles de la division, par une approche double hybride. Mes résultats ont montré que le développement de la compétence ralentie la mobilité de deux protéines clés de la synthèse du septum. Par ailleurs, les expériences de double hybride ont révélé plusieurs interactions entre ComM et les protéines de la division, parmi lesquelles la protéine MurA1, impliquée dans la synthèse du précurseur du PG. Sur la base de mes résultats, je propose un modèle dans lequel ComM pourrait moduler l'activité de MurA1 pour diminuer la synthèse de PG septal. A terme, ce projet pourrait inspirer de nouvelles pistes pour bloquer la croissance du pneumocoque et donc lutter contre ce pathogène humain majeur
Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a commensal bacterium that can cause pneumonia, meningitis or septicemia under certain conditions. Control of pneumococcal infections is based on the use of antibiotics or vaccines. However, both of these approaches come up against the pneumococcus remarkable potential for genetic plasticity, which depends on its ability to uptake exogenous DNA through transformation. Transformation is a highly conserved DNA exchange mechanism in bacteria that contributes to their diversification, evolution and adaptation. The ability of bacteria to transform requires the development of a specific physiological state called 'competence'. In the pneumococcus, competence develops transiently in all cells of the population during their multiplication phase. It is accompanied by an arrest of the division process, which allows the cells to complete the final stages of transformation without compromising the integrity of their genome. ComM, a protein of unknown function synthesized during competence, appears necessary and sufficient to induce this inhibition of cell division. The goal of this PhD project was to decipher the mechanism of action of ComM. To measure the impact of ComM, and more generally the development of competence, on the dynamics of cell division proteins, I used total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Another strategy was to identify potential interactions between transformation and division proteins, using a yeast two-hybrid approach. My results show that the development of competence interferes with the mobility of the two key proteins of the septal peptidoglycan synthesizing machinery FtsW and PBP2x. Furthermore, two-hybrid experiments revealed several interactions between ComM and division proteins, in particular the MurA1 protein, involved in the synthesis of the precursor of the PG. On the basis of my results, I propose a model in which ComM could modulate MurA1 activity to decrease the septal PG synthesis. Ultimately, this project could inspire new strategies to block the growth of the pneumococcus and thus fight against this major human pathogen

Le ciblage, l'imagerie et le sondage spécifiques des membranes plasmiques et des organites intracellulaires peuvent être faits par des sondes fluorescentes à façon sensibles à la polarité. Ici, un nouveau fragment ciblant la membrane plasmique à été développé et testé dans cinq colorants cyanines, montrant d'excellentes performances en microscopie cellulaire et in vivo. Le fragment à été greffé à un fluorophore solvatochrome Prodan, donnant une sonde de membrane plasmique avec une sensibilité élevée à l'ordre lipidique. Le rouge de Nil, greffé aux fragments avec les chaînes alkyles C12 et C4, à donné deux sondes solvatochromes à membrane plasmique : NR12A pour la microscopie conventionnelle, et NR4A pour la microscopie à super-résolution PAINT. Le rouge de Nil avec des groupes ciblant les organites à donné un éventail de sondes sensibles à la polarité et à l'ordre lipidique dans les membranes des organites. Les sondes synthétisées trouveront des applications en bioimagerie, biologie cellulaire, biophysique ou mécanobiologie
Specific targeting, imaging and probing of cell plasma membranes and intracellular organelles can be addressed by rationally designed polarity-sensitive fluorescent probes. Here, a new efficient plasma membrane-targeting moiety was developed and tested in five cyanine dyes, showing excellent performance in cellular and in vivo microscopy. Next, the targeting moiety was grafted to a solvatochromic dye Prodan, yielding a plasma membrane probe with high lipid order sensitivity. Modifying a Nile Red using the moieties with varied alkyl chain lengths resulted in two solvatochromic plasma membrane probes: NR12A with high affinity to membranes for conventional microscopy, and NR4A, a low-affinity probe for PAINT super-resolution microscopy. Tethering Nile Red with organelle-targeted groups yielded an array of probes, able to sense polarity and lipid order in organelle membranes. The synthesized probes will find applications in bioimaging, cell biology, biophysics or mechanobiology

Le cerveau est composé de neurones et de cellules gliales qui jouent un rôle de soutien et de protection du réseau cellulaire. L’espace extra-cellulaire (ECS) correspond à l’espace qui existe entre ces cellules. Les modifications de sa structure peuvent dépendre de plusieurs paramètres comme l’âge, l’apprentissage ou les maladies neuro-dégénératives. Le volume de l’ECS correspond à environ 20$%$ du volume total du cerveau et les neurotransmetteurs et autres molécules circulent dans cet espace pour assurer une communication neuronale optimale. Cependant, les dimensions et la viscosité locale de cet espace restent encore mal-connues. L’ECS est composé entre autres de protéoglycans, de glycoaminoglycans (acide hyaluronique…) et de fluide cérébrospinal. Nous avons proposé dans cette thèse une stratégie pour mesurer les dimensions et les propriétés rhéologiques de l’espace extra-cellulaire de tranches de cerveaux de rats maintenue en vie à l’aide du suivi de nanotubes de carbone individuels luminescents. Pour ces applications, nous avons étudier la biocompatibilité et le rapport signal sur bruit de nos échantillons de nanotubes afin de les détecter en profondeur dans les tranches de cerveaux et de pouvoir mesurer leurs propriétés de diffusion
The brain is mainly composed of neurons which ensure neuronal communication and glialcells which play a role in supporting and protecting the neural network. The extracellular space corresponds to the space that exists between all these cells and represents around 20 %of the whole brain volume. In this space, neurotransmitters and other molecules circulate into ensure optimal neuronal functioning and communication. Its complex organization whichis important to ensure proper functioning of the brain changes during aging, learning or neurodegenerative diseases. However, its local dimensions and viscosity are still poorly known.To understand these key parameters, in this thesis, we developed a strategy based on the tracking of single luminescent carbon nanotubes. We applied this strategy to measure the structural and viscous properties of the extracellular space of living rodent brains slices at the nanoscale. The organization of the manuscript is as follows. After an introduction of the photoluminescence properties of carbon nanotubes, we present the study that allowed us to select the optimal nanotube encapsulation protocol to achieve our biological applications. We also present a quantitative study describing the temperature increase of the sample when laser irradiations at different wavelengths are used to detect single nanotubes in a brain slice.Thanks to a fine analysis of the singular diffusion properties of carbon nanotubes in complex environments, we then present the strategy set up to reconstruct super-resolved maps (i.e. with resolution below the diffraction limit) of the brain extracellular space morphology.We also show that two local properties of this space can be extracted : a structural complexity parameter (tortuosity) and the fluid’s in situ viscosity seen by the nanotubes. This led us to propose a methodology allowing to model the viscosity in situ that would be seen, not by the nanotubes,but by any molecule of arbitrary sizes to simulate those intrinsically present or administered in the brain for pharmacological treatments. Finally, we present a strategy to make luminescent ultra-short carbon nanotubes that are not intrinsically luminescent and whose use could be a complementary approach to measure the local viscosity of the extracellular space of the brain

Dans cette thèse, nous avons construit et optimisé des méthodes de microscopie de fluorescence super-résolue stochastique, polarisée et quantitative qui nous permettent d'imager l'orientation moléculaire dans des environnements dynamiques et statiques a l’échelle de la molécule unique et avec une résolution nanoscopique. En utilisant un montage de microscopie super-résolue à lecture stochastique en combinaison avec une détection polarisée, nous avons pu reconstruire des images d'anisotropie de fluorescence avec une résolution spatiale de 40 nm. En particulier, nous avons pu imager l'ordre orientationnel d'assemblages biomoléculaires et cellulaires. Pour l'imagerie cellulaire, nous avons pu étudier la capacité d'étiquettes de marquer fluorophoresde reporter quantifier l'orientation moléculaire dans l'actine et les microtubules dans des cellules fixées. Nous avons également mis à profit la meilleure résolution et la détection polarisée pour étudier l'ordre moléculaire d’agrégats d’amyloïdes a l’échelle nanoscopique. Enfin, nous avons étudié l'interaction de la protéine de réparation RAD51 avec l'ADN par microscopie de fluorescence polarisée super-résolue pour quantifier l'ordre orientationnel de l'ADN et de la protéine RAD51 afin de comprendre la recombinaison homologue du mécanisme de réparation de l'ADN
.In this thesis we built and optimized quantitative polarized stochastic super-resolution fluorescence microscopy techniques that enabled us to image molecular orientation behaviors in static and dynamic environments at single molecule level and with nano-scale resolution. Using a scheme of stochastic read-out super resolution microscopy in combination with polarized detection, we can reconstruct fluorescence anisotropy images at a spatial resolution of 40 nm. In particular, we have been able to use the techniques to quantify the molecular orientationalorder in cellular and bio-molecular assemblies. For cellular imaging, we could quantify the ability of fluorophore labels to report molecular orientation of actin and microtubules in fixed cells. Furthermore, we used the improvements of resolution and polarization detection to study molecular order of amyloid aggregates at a nanoscopic scale. Also, we studied repair protein RAD51` s interaction with DNA by using dual color polarized fluorescence microscopy, to quantify the orientational order of DNA and RAD51 to understand the homologous recombination of DNA repair mechanism

Récemment, le concept monofonctionnel de la protéine Tau en tant que protéine stabilisatrice des microtubules a été remis en cause. Ces nouvelles fonctions sont liées à de nouvelles localisations comme le noyau, la membrane, la synapse ou encore les vésicules. La localisation extracellulaire est particulièrement intéressante car elle pourrait intervenir dans la sécrétion de Tau et expliquer l’évolution hiérarchisée de certaines tauopathies sporadiques dont fait partie la maladie d’Alzheimer. La pathologie Tau peut être induite chez l’animal par injection intracrânienne d’espèces pathologiques et semble se transmettre d’un neurone à un autre et d’une région à une autre. Ce phénomène suit des voies neuroanatomiques et suggère une propagation active des assemblages toxiques des protéines Tau. Des études in vitro ont mis en évidence que les protéines Tau sont capables de se déplacer d’une cellule à une autre propageant ainsi la pathologie par un mécanisme de recrutement des espèces saines. L’existence d’une progression hiérarchisée de la pathologie Tau combinée à sa localisation extracellulaire permet de formuler une nouvelle hypothèse. La protéine Tau serait une protéine de type prion et se comporterait comme telle pour propager la pathologie.Cette caractéristique implique l’existence de mécanismes cellulaires de transports actifs pour transférer les protéines pathologiques. Plusieurs travaux ont montré que la protéine Tau est libérée dans le milieu extracellulaire ou enfermée dans des vésicules extracellulaires lors de son transport entre les cellules. Parallèlement aux mécanismes de sécrétion/capture, des ponts membranaires établissant un contact direct entre deux cellules pourraient être impliquer dans la propagation de Tau. Les TNTs constituent une piste sérieuse de part leur rôle déjà établi dans le transfert de pathogènes et de protéines mal repliées impliqués dans différentes maladies neurodégénératives. Notre objectif a donc été d’étudier l’implication de ces structures dans le transfert interneuronal des assemblages de protéines Tau.Dans ce travail de thèse, nous démontrons que les espèces pathologiques de Tau empruntent les TNTs pour leur transfert interneuronal. Nous apportons les preuves, par vidéo-microscopie, de l’existence d’un transfert de protéines Tau pathologiques d’un neurone primaire à un neurone secondaire et donc d’une implication potentielle des TNTs dans la propagation de la pathologie Tau et la transmission de la maladie. Fait remarquable, la présence des fibres Tau au niveau extracellulaire active la formation des TNTs et facilite leur transfert. Ce résultat place les TNTs au coeur du processus pathologique de la propagation et de son cycle infernal (transfert de Tau dans les cellules naïves par les TNTs – seeding - mort neuronal - libération de Tau dans le milieu extracellulaire - augmentation du nombre des TNTs…). Nous avons aussi apporté une caractérisation des TNTs dans les neurones primaires. Ce résultat est d’autant plus important qu’il est difficile d’identifier des TNTs dans les neurones et c’est dans ce contexte que nous avons réalisé une découverte étonnante, la protéine Tau endogène est présente de manière physiologique dans les TNTs de neurones primaires. Ces résultats révèlent, et pour la première fois, que la protéine Tau, comme l’actine, peut être considérée comme une composante constitutive des TNTs dans les neurones. Elle pourrait ainsi être utilisée comme un marqueur des TNTs. Ces résultats mettent également en lumière une nouvelle fonction de Tau appuyant une fois de plus le caractère multifonctionnel de cette protéine [...]
Over the past few years, the monofunctional concept of Tau protein as a microtubule-associated stabilizing protein has been challenged. These new functions are linked to new localizations: nucleus, membrane, synapse or vesicles. The extracellular localization is particularly interesting as it could play a role in the secretion of Tau and explain the hierarchical evolution of some sporadic tauopathies such as Alzheimer's disease. The Tau pathology can be induced in animals by intracranial injection of pathological species and seems to be transferred from one neuron to another and from one region to another. This phenomenon follows neuroanatomic pathways and suggests an active propagation of the toxic assemblies of Tau proteins. In vitro studies have shown that proteins are able to move from one cell to another and induce the same abnormal conformation of endogenous Tau proteins initiating a self-amplifying cascade. The existence of a hierarchical progression of the Tau pathology combined with its extracellular localization enables to express a new hypothesis. The Tau protein would be a prion-like protein and would behave like that to propagate the pathology.This characteristic implies the existence of cellular active transport mechanisms to transfer pathological proteins. Several studies have shown that the Tau protein, during transport between cells, is released in the extracellular medium or enclosed in extracellular vesicles. Simultaneously with secretion / capture mechanisms, membrane bridges, establishing direct contact between two cells, could be involved in Tau propagation. TNTs are a serious candidate with their already established role in the transfer of pathogens and misfolding proteins involved in various neurodegenerative diseases. Thus, our objective was to study the involvement of these structures in the interneuronal transfer of Tau protein assemblies.In this thesis, we demonstrate that Tau pathological species use TNTs for their interneuronal transfer. We bring evidences, by videomicroscopy, that pathological Tau proteins are transferred from a primary to a secondary neuron and that TNTs could be involved in the spreading of Tau pathology and the disease transmission. Furthermore, the presence of extracellular Tau fibers can activate the formation of TNTs and facilitate their transfer. This result places TNTs in a central place for propagation pathological process and its vicious cycle (transfer of Tau in naive cells by TNTs - seeding - neuronal death – release of Tau in the extracellular environment - increase in the number of TNTs…). We also made a characterization of the TNTs in primary neurons. This result is really important as it is really complex to identify TNTs in neurons. And in this context, we made a surprising discovery: the endogenous Tau protein is physiologically present in TNTs in primary neurons. These results reveal, for the first time, that the Tau protein, like actin, can be considered as a constitutive component of TNTs in neurons. Thus, it could be used as a marker for TNTs. All these results also highlight a new Tau function and reinforce the multifunctional characteristic of this protein.To confirm the importance of this new pathway in the pathological process, further studies should be considered by analyzing if the transfer of pathological Tau species induces a pathological phenotype in the recipient cell and by looking for the cellular mechanisms involved in the transfer of toxic Tau assemblies by TNTs. In vivo studies on integrated systems such as Caenorhabditis elegans would confirm the involvement of these dynamic structures in the pathological process and identify a new therapeutic target

L’extraction des cellules cancéreuses d’un fluide corporel est une procédure importante lors d’un diagnostic clinique et d’une thérapie. En particulier, lorsque la technique de séparation est basée sur la chromatographie cellulaire, il est important de disposer de connaissances précises sur les capacités de liaison des cellules cibles avec le milieu poreux. Pour cette raison, des expériences utilisant la tomodensitométrie à résolution temporelle ont été́ conçues et réalisées à l’Installation Européenne de Rayonnement Synchrotron. Les distributions des courbures et des torsions des trajectoires de cellules situées dans suspension s’écoulant à travers un milieu poreux sont des informations précieuses pour caractériser l’efficacité́ des procédés chromatographiques. Cependant, le calcul de la torsion est un défi car étant basé sur des dérivées d’ordre supérieur qui sont très sensibles au bruit de discrétisation. Cette thèse présente deux nouvelles méthodes d’estimation des courbures et des torsions de trajectoires de particules données respectivement sous la forme de points discrets connectes ou non connectes. La première méthode est basée sur une approche dite d’approximation de Fourier. Des études de cas ont mis en lumière une diminution de l’erreur d’estimation des torsions d’au moins 65% par rapport à la méthode de référence d’approximation par les splines. Par ailleurs, le paramètre de lissage de l’approximation de Fourier peut rester constant pour une large plage de résolutions latérales et pour différentes valeurs de courbures et de torsion. La méthode dite d’approximation de Fourier n’étant pas applicable à des courbes échantillonnées avec un pas variable, une deuxième méthode basée sur la discrétisation des formules géométriques différentielles (DDGF) a été́ développée. L’approximation par les splines et la DDGF conduisent à des erreurs moyennes similaires. Cependant, le masque filtrant reste inchangé́ pour le DDGF, alors que le paramètre de lissage de l’approximation par les splines doit être adapté à la forme ainsi qu’au pas d’échantillonnage de la courbe
The extraction of cancerous cells from body uids is an important procedure in clinical diagnostics and therapy. Notably, when the separation technique is based on cell chromatography, it is important to have precise knowledge about binding capacities of target cells in porous media. Therefore, experiments using time-resolved micro-computed tomography were designed and carried out at the European Synchrotron Radiation Facility. The curvature and torsion distributions of cell paths in a two-phase ow through a porous medium are valuable information to characterize the efficiency of chromatographic processes. However, the computation of torsion is very challenging, since it is based on higher order derivatives which are very sensitive towards discretization noise. In this thesis, two new curvature and torsion estimation methods of particle paths are presented. The first method is based on a Fourier approximation. Case studies showed a decrease of the torsion estimation error of at least 65% compared to the commonly used spline approximation. Moreover, the smoothing parameter of the Fourier approximation can remain unchanged for both a wide range of lateral resolutions and curvatures and torsion values. Since this Fourier approximation approach cannot be applied at non-equidistant points, a second method based on the discretization of the differential-geometric formulas (DDGF) was developed. The spline approximation and the DDGF led to similar mean torsion errors. However, the filter mask remains unchanged for the DDGF, whereas the smoothing parameter of the spline approximation must be adapted to the curve shape and discretization

L’extraction des cellules cancéreuses d’un fluide corporel est une procédure importante lors d’un diagnostic clinique et d’une thérapie. En particulier, lorsque la technique de séparation est basée sur la chromatographie cellulaire, il est important de disposer de connaissances précises sur les capacités de liaison des cellules cibles avec le milieu poreux. Pour cette raison, des expériences utilisant la tomodensitométrie à résolution temporelle ont été́ conçues et réalisées à l’Installation Européenne de Rayonnement Synchrotron. Les distributions des courbures et des torsions des trajectoires de cellules situées dans suspension s’écoulant à travers un milieu poreux sont des informations précieuses pour caractériser l’efficacité́ des procédés chromatographiques. Cependant, le calcul de la torsion est un défi car étant basé sur des dérivées d’ordre supérieur qui sont très sensibles au bruit de discrétisation. Cette thèse présente deux nouvelles méthodes d’estimation des courbures et des torsions de trajectoires de particules données respectivement sous la forme de points discrets connectes ou non connectes. La première méthode est basée sur une approche dite d’approximation de Fourier. Des études de cas ont mis en lumière une diminution de l’erreur d’estimation des torsions d’au moins 65% par rapport à la méthode de référence d’approximation par les splines. Par ailleurs, le paramètre de lissage de l’approximation de Fourier peut rester constant pour une large plage de résolutions latérales et pour différentes valeurs de courbures et de torsion. La méthode dite d’approximation de Fourier n’étant pas applicable à des courbes échantillonnées avec un pas variable, une deuxième méthode basée sur la discrétisation des formules géométriques différentielles (DDGF) a été́ développée. L’approximation par les splines et la DDGF conduisent à des erreurs moyennes similaires. Cependant, le masque filtrant reste inchangé́ pour le DDGF, alors que le paramètre de lissage de l’approximation par les splines doit être adapté à la forme ainsi qu’au pas d’échantillonnage de la courbe
The extraction of cancerous cells from body uids is an important procedure in clinical diagnostics and therapy. Notably, when the separation technique is based on cell chromatography, it is important to have precise knowledge about binding capacities of target cells in porous media. Therefore, experiments using time-resolved micro-computed tomography were designed and carried out at the European Synchrotron Radiation Facility. The curvature and torsion distributions of cell paths in a two-phase ow through a porous medium are valuable information to characterize the efficiency of chromatographic processes. However, the computation of torsion is very challenging, since it is based on higher order derivatives which are very sensitive towards discretization noise. In this thesis, two new curvature and torsion estimation methods of particle paths are presented. The first method is based on a Fourier approximation. Case studies showed a decrease of the torsion estimation error of at least 65% compared to the commonly used spline approximation. Moreover, the smoothing parameter of the Fourier approximation can remain unchanged for both a wide range of lateral resolutions and curvatures and torsion values. Since this Fourier approximation approach cannot be applied at non-equidistant points, a second method based on the discretization of the differential-geometric formulas (DDGF) was developed. The spline approximation and the DDGF led to similar mean torsion errors. However, the filter mask remains unchanged for the DDGF, whereas the smoothing parameter of the spline approximation must be adapted to the curve shape and discretization

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est caractérisé par des lésions alvéolaires diffuses menant à un œdème alvéolaire lésionnel et une insuffisance respiratoire aiguë hypoxémique. Malgré les progrès récents dans la prise en charge des patients de réanimation, le SDRA reste un syndrome fréquent et associé à une morbimortalité importante. Deux mécanismes principaux du SDRA semblent associés à une mortalité plus élevée et à des réponses thérapeutiques différentes : la déficience de la clairance liquidienne alvéolaire (AFC, pour alveolar fluid clearance), l’incapacité pour l’épithélium alvéolaire de résorber l’œdème alvéolaire, et la présence d’un phénotype « hyper-inflammatoire ». Les approches pharmacologiques du traitement du SDRA restent limitées et il est nécessaire de poursuivre l’étude des voies biologiques impliquées dans la pathogénie du SDRA et dans sa résolution afin de développer des approches innovantes des prises en charge diagnostique et thérapeutique du SDRA. RAGE, le récepteur des produits de glycation avancée, est un récepteur multi-ligands, exprimé abondamment par les cellules épithéliales alvéolaires du poumon (pneumocytes), qui module de nombreuses voies de signalisation intracellulaire. De nombreuses études récentes suggèrent que sRAGE, la forme soluble principale de RAGE, pourrait servir de marqueur lésionnel du pneumocyte de type I, et que RAGE pourrait jouer un rôle-pivot dans la pathophysiologie du SDRA, en initiant et en entretenant la réponse inflammatoire alvéolaire. Nos objectifs étaient de caractériser les rôles de RAGE au cours du SDRA, grâce à une approche translationnelle combinant études cliniques et précliniques. D’abord, des études cliniques observationnelles et interventionnelles ont été conduites afin de caractériser sRAGE comme un véritable biomarqueur dans le SDRA. Ensuite, des cultures in vitro de cellules épithéliales et de macrophages, ainsi qu’un modèle expérimental in vivo de SDRA murin par instillation trachéale d’acide chlorhydrique ont été utilisés pour décrire les effets de la voie RAGE sur les mécanismes d’AFC et l’inflammation macrophagique médiée par l’inflammasome « Nod-Like Receptor family, Pyrin domain containing 3 » (NLRP3). Enfin, l’effet d’une inhibition de RAGE, par sRAGE recombinant ou par anticorps monoclonal anti-RAGE, était testée en modèle murin. Nos résultats issus des études cliniques suggèrent que sRAGE présente toutes les caractéristiques d’un biomarqueur au cours du SDRA, avec un intérêt dans le diagnostic, le pronostic et la prédiction du risque de développer un SDRA dans une population à risque. Pris ensemble, notre travail suggère que la voie RAGE joue un rôle important dans la régulation de l’atteinte pulmonaire, de l’AFC et de l’activation macrophagique au cours du SDRA. Toutefois, les mécanismes précis de cette régulation restent incertains. La forme soluble de RAGE (sRAGE), lorsqu’elle est dosée dans le plasma, présente toutes les caractéristiques d’un biomarqueur pouvant être utile en pratique clinique, mais son intérêt dans la sélection de sous-groupes (ou « phénotypes ») de patients pouvant bénéficier de traitements ciblés reste à étudier. La voie RAGE pourrait enfin représenter une cible thérapeutique prometteuse. Bien que des études de validation restent nécessaires, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles perspectives dans la prise en charge des patients atteints de SDRA
The acute respiratory distress syndrome (ARDS) is associated with diffuse alveolarinjury leading to increased permeability pulmonary edema and hypoxemic respiratory failure. Despite recent improvements in intensive care, ARDS is still frequent and associated with high mortality and morbidity. Two major features of ARDS may contribute to mortality and response to treatment: impaired alveolar fluid clearance (AFC), i.e. altered capacity of the alveolar epithelium to remove edema fluid from distal lung airspaces, and phenotypes of severe inflammation. Pharmacological approaches of ARDS treatment are limited and further mechanistic explorations are needed to develop innovative diagnostic and therapeutic approaches. The receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) is a multiligand pattern recognition receptor that is abundantly expressed by lung alveolar epithelial cells andmodulates several cellular signaling pathways. There is growing evidence supporting sRAGE (the main soluble isoform of RAGE) as a marker of epithelial cell injury, and RAGE may be pivotal in ARDS pathophysiology through the initiation and perpetuation of inflammatory responses. Our objectives were to characterize the roles of RAGE in ARDS through a translational approach combining preclinical and clinical studies. First, observational and interventional clinical studies were conducted to test sRAGE as a biomarker during ARDS.Then, cultures of epithelial cells, macrophages and a mouse model of acidinduced lung injury were used to describe the effects of RAGE pathway on AFC and inflammation, with special emphasis on a macrophage activation through NodLikeReceptor family, Pyrindomain containing 3 (NLRP3) inflammasome. Acidinjured mice were treated with an antiRAGE monoclonal antibody or recombinant sRAGE to test the impact of RAGE inhibition on criteria of experimental ARDS. Results from clinical studies support a role of sRAGE as a biomarker of ARDS, withdiagnostic, prognostic and predictive values. In addition, plasma sRAGE is correlated with a lung imaging phenotype of nonfocal ARDS and could inform on therapeutic response. Herein, we also describe in vivo and in vitro effects of RAGE activation on transepithelial fluid transport and expression levels of epithelial channels (aquaporin 5, αNa,KATPaseandαENaC) and on macrophage activation through NLRP3 inflammasome. Finally, RAGE inhibition improves AFC and decreases lung injury in vivo. Taken together, our findings support a role of RAGE pathway in the regulation of lung injury, AFC and macrophage activation during ARDS, albeit precise regulatory mechanisms remain uncertain. sRAGE has most features of a validated biomarker that could be used in clinical medicine, but whether it may help to identify subgroups (or phenotypes) of patients that would benefit from tailored therapy remains underinvestigated. Modulation ofRAGE pathway may be a promising therapeutic target, and though validation studies are warranted, such findings may ultimately open novel diagnostic and therapeutic perspectivesin patients with ARDS