Rozprawy doktorskie na temat „Mycobacterium tuberculosis – Résistance aux antibiotiques”

Mon projet visait à décrire et caractériser l'émergence chez Mycobacterium tuberculosis de la résistance à la bédaquiline (BDQ). Dans une première étude, nous avons réalisé un test de fluctuation in vitro et adapté celui-ci pour la première fois in vivo dans des souris immunocompétentes et des souris immunodéprimées. Nous avons mis en évidence que l’immunodépression semblait augmenter le risque d’émergence de résistance mais cette augmentation ne serait pas due à une augmentation du taux de mutation mais à une hétérogénéité plus grande au sein de cette population avec des individus s’éloignant beaucoup des valeurs moyennes et hébergeant de grandes quantités de mutants. Dans un second travail, nous avons décrit le premier cas européen de sélection de résistance à la BDQ par mutation atpE. Enfin, nous avons réalisé une étude rétrospective de la sensibilité à la BDQ parmi toutes les souches MDR isolées en France entre 2018 et 2020. Une analyse génotypique et phénotypique a permis de mettre en évidence que des souches mutées sont classées phénotypiquement sensibles selon les critères actuels de l’OMS et que ces souches sont un mélange de souches sans augmentation de la CMI et de souches avec une minime augmentation de la CMI ne faisant pas classer la souche comme résistante. Pour conclure, nous avons montré que les travaux classiquement réalisés in vitro pour mesurer le taux de mutation ne donnent qu’une idée simplifiée de la complexité de l’émergence de la résistance in vivo. Nos travaux ont aussi montré qu’il est difficile avec les outils génotypiques et phénotypiques actuels de distinguer les souches de Mycobacterium tuberculosis sensibles des souches résistantes à la BDQ
The aim of my project was to describe and characterise the emergence of bedaquiline (BDQ) resistance in Mycobacterium tuberculosis. In a first study, we performed an in vitro fluctuation test and adapted it for the first time in vivo in immunocompetent and immunosuppressed mice. We found that immunosuppression appeared to increase the risk of resistance emergence, but this increase was not due to an increase in the mutation rate but to greater heterogeneity in this population, with individuals deviating significantly from the mean values and harbouring large numbers of mutants. In a second work, we described the first European case of selection for BDQ resistance by atpE mutation. Finally, we performed a retrospective study of BDQ susceptibility among all MDR strains isolated in France between 2018 and 2020. Genotypic and phenotypic analysis showed that mutated strains are classified as phenotypically susceptible according to the current WHO criteria and that these strains are a mixture of strains with no increase in MIC and strains with a minimal increase in MIC that do not classify the strain as resistant. In conclusion, we have shown that the work classically performed in vitro to measure mutation rate only gives a simplified idea of the complexity of the emergence of resistance in vivo. Our work has also shown that it is difficult with current genotypic and phenotypic tools to distinguish between Mycobacterium tuberculosis strains that are susceptible and those that are resistant to BDQ

La tuberculose (TB) est, hors COVID, la première cause de décès lié à un agent infectieux. La détermination rapide du profil de résistance complet de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est essentielle pour démarrer un traitement adapté dans les cas de TB multirésistante (MDR) et ainsi limiter l’acquisition de résistances supplémentaires, augmenter les chances de succès thérapeutique et réduire la transmission de ces souches. Il existe 9 lignées principales au sein du complexe M. tuberculosis, dont 2 sont largement répandues dans le monde (L2 et L4). Au sein de la lignée 2, le clone W148 (ou complexe clonal CC 100-32) a diffusé récemment en Europe et en Asie. Cette diffusion pourrait s'expliquer par des mutations spécifiques au sein du génome.En premier lieu, nous avons étudié la technologie Deeplex Myc-TB pour détecter rapidement le génotype et la résistance des souches cliniques de Mtb MDR. Cette technologie, basée sur une PCR multiplex et un séquençage haut débit, détermine à la fois l’espèce (hsp65), le génotype (spoligotype) et la résistance à 13 antituberculeux de première et seconde ligne (18 cibles). Le travail d’évaluation a inclus 112 prélèvements et 94 souches adressés au Centre National de Référence des Mycobactéries et de la Résistance des Mycobactéries aux Antituberculeux (CNR MyRMA). Nous avons observé que le test Deeplex Myc-TB fonctionne sur prélèvement positif à l’examen microscopique et sur souche. Les profils de résistance obtenus sont concordants à 85,4% avec les résultats de la méthode phénotypique de référence. L'utilisation de Deeplex Myc-TB fournit des résultats en une dizaine de jours, soit environ 6 semaines avant ceux de l’antibiogramme phénotypique. Deeplex Myc-TB permet donc d’adapter l’antibiothérapie bien avant que ce qui était fait jusqu’à présent, pour le bénéfice des patients. Nous avons ainsi pu valider cet outil maintenant utilisé en routine au CNR MyRMA. Nous avons ensuite étudié les mutations spécifiques du CC 100-32 MDR. L’analyse du génome complet de 36 souches reçues au CNR MyRMA a permis d’identifier 30 mutations non synonymes et petites délétions spécifiques. Parmi elles, nous avons choisi d’étudier celles présentes dans kdpD et whiB6, car des données de la littérature semblent montrer un impact de ces gènes sur la virulence de la souche. KdpDE est un système à deux composants régulant l’expression du système de transport du potassium inductible KdpFABC. La mutation présente dans le complexe CC 100-32 MDR est une délétion de 2 nucléotides à la fin du gène kdpD entraînant une protéine de fusion KdpDE. Nous avons donc construit un tel mutant chez Mtb H37Rv en supprimant les deux gènes kdpD et kdpE avant de le complémenter avec la forme sauvage ou mutée de kdpDE. Nous n’avons pas observé de différence de croissance in vitro des différentes souches, y compris en l’absence de potassium, suggérant que KdpDE n’est pas essentiel pour le fitness de la bactérie en présence et absence de potassium. L’étude de l’impact de la délétion sur l’activité transcriptionnelle et la virulence est en cours. D’autre part, WhiB6 est un facteur de transcription qui régule le système ESX-1, nécessaire à la virulence. Des travaux du laboratoire ont permis d'obtenir le mutant ∆whiB6 et les souches complémentées WT et mutée (T51P) et leur ré-analyse indique que la souche mutée T51P entraîne une production d’ESAT-6 et de cytokines pro-inflammatoires plus faible que la souche sauvage ; nous réalisons actuellement une analyse du transcriptome. Les premiers résultats obtenus semblent indiquer que la mutation T51P dans WhiB6 entraîne moins de virulence et d’inflammation. Ce travail a permis de valider un outil maintenant indispensable au diagnostic des TB MDR en routine au CNR MyRMA et d’étudier la diffusion d’un clone MDR à travers les fonctions de deux facteurs de transcription impliqués dans la virulence
Tuberculosis (TB) is, excluding COVID, the leading cause of death linked to an infectious agent. Rapid determination of the full resistance profile of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is essential to initiate appropriate treatment of multidrug resistant (MDR) cases, thereby limiting the acquisition of additional resistance, increasing the chances of therapeutic success and reducing transmission of these strains. There are 9 main lineages within the M. tuberculosis complex, 2 of which are widespread throughout the world (L2 and L4). Within lineage 2, the clone W148 (or clonal complex CC 100-32) has recently spread to Europe and Asia. This spread could be explained by specific mutations within the genome.First, we investigated the Deeplex Myc-TB tool for rapid detection of genotype and resistance in clinical Mtb MDR strains. The Deeplex Myc-TB technology, based on multiplex PCR and high-throughput sequencing, determines species (hsp65), genotype (spoligotype) and resistance to 13 first- and second-line anti-tuberculosis drugs (18 targets). Our evaluation included 112 samples and 94 strains sent to the Centre National de Référence des Mycobactéries et de la Résistance des Mycobactéries aux Antituberculeux (CNR MyRMA). We have observed that the Deeplex Myc-TB test is efficient on microscopically positive samples and strains. The resistance profiles obtained are 85.4% concordant with the results of the phenotypic reference method. The use of Deeplex Myc-TB provides results within ten days, and around 6 weeks before those of the phenotypic antibiogram. Deeplex Myc-TB can therefore be used to adapt antibiotic therapy much earlier than was previously possible, to the patient benefit. We were thus able to validate this tool, which is now routinely used at CNR MyRMA. We next studied mutations specific to CC 100-32 MDR. Genome-wide analysis of 36 strains received at CNR MyRMA identified 30 non-synonymous mutations and small deletions specific to CC 100-32 MDR strains. Among these, we chose to study mutations present in kdpD and whiB6, as data in the literature indicated an impact of these genes on the virulence of the strain. On the one hand, KdpDE is a two-component system regulating expression of the inducible potassium transport system KdpFABC. The mutation present in the CC 100-32 MDR complex is a 2-nucleotides deletion at the end of the kdpD gene, resulting in a KdpDE fusion protein. We therefore constructed such a mutant in Mtb H37Rv by deleting both the kdpD and kdpE genes before complementing it with the wild-type or mutated form of kdpDE. We observed no difference in the in vitro growth of the different strains, even in the absence of potassium, suggesting that KdpDE is not essential for bacterial fitness in presence or absence of potassium. The impact of the deletion on transcriptional activity and virulence is currently being studied. On the other hand, WhiB6 is a transcription factor that regulates the ESX-1 system, necessary for virulence. Work from the laboratory generated a ∆whiB6 mutant and the complemented WT and mutated (T51P) strains and their re-analysis indicated that T51P mutant strain produces less ESAT-6 and pro-inflammatory cytokines than the wild-type strain. Our transcriptome analysis of these strains is currently underway. Initial results suggest that the T51P mutation in WhiB6 results in less virulence and inflammation. This work has validated a tool that is now essential for routine diagnosis of MDR TB at CNR MyRMA, and to study the spread of an MDR clone through the function of two transcription factors involved in virulence

La polymérase d'A.R.N. la protéine obligatoire (le RbpA) est l'activateur transcriptional global (mondial) de l'espèce actinomycetes qui est essentielle pour la croissance et qu'augmente la tolérance de bactéries aux antibiotiques. RbpA de la tuberculose Mycobacterium (Mtb) stimule spécifiquement la transcription par la polymérase d'A.R.N. (RNAP) contenant σA ou les sous-unités σB, mais aucune de la 11 autre alternative σ des facteurs. Il a été rapporté que le fonctionnement de RbpA est dépendant de promoteur et c'est indispensable pour le déroulement de promoteur du promoteur sigAP constitutif.Pour déchiffrer la nature de spécificité de promoteur de RbpA, nous avons utilisé des essais biochimiques, mutagensis et des approches de génomique. Nous avons identifié ce remplacement 'TG' le motif entre-14 à-17 positions (postes) dans le promoteur sauvage-type sigAP fait la transcription indépendante de RbpA. Aussi, nous avons montré que la capacité d'augmentations de RbpA de RNAP pour fondre le promoteur sigAP aux températures sous-optimales et stabilise des complexes de promoteur. Mutational l'analyse de résidus d'acide aminé H166 et E169 dans la région σB 3.0 (σR3.0) a démontré une implication de σR3.0 dans la stabilisation RbpA-servie-d'intermédiaire de complexes de promoteur RNAP. Plus loin, la substitution à RbpA au résidu d'acide aminé R79 a affecté la stabilité complexe de promoteur, tandis que les substitutions à RbpA resdiues K73, K74 a affecté l'initiation de transcription. Cependant, aucun des mutants RbpA n'a étudié l'ouverture ici affectée de l'ADN de promoteur par RNAP. Les rôles différentiels joués par ces résidus RbpA dans la stabilisation de complexe de promoteur et l'initiation de transcription ensemble avec l'effet produit par les mutations σB suggèrent l'implication de R3.0 σB dans l'action de RbpA. Ensuite, nous avons exécuté la large de génome cartographie des gènes RbpA-dépendants du σB regulon en utilisant une Analyse de Puce à ADN de Finale(d'Écoulement) in vitro (des ROMS). L'analyse ROM a montré la preuve claire de 15 augmentation de pli du nombre de gènes activés par σB-RNAP en présence de RbpA. L'analyse de bio-informatique de 140 gènes contrôlés par la paire de RbpA-σB nous a permis d'identifier la signature caractéristique dans le-10 consensus ('TANNNT') spécifique à la sous-unité σB.Notre étude sur l'impact d'échelle de génome de RbpA, ensemble avec le déchiffrement du mécanisme moléculaire d'action de RbpA, souligne une importance de l'interaction entre σR3.0 et RbpA dans la transcription Mtb. Basé sur nos résultats nous proposons que RbpA puisse jouer un rôle du remplacement(remplaçant) fonctionnel pour-10 motifs prolongés(étendus) dans l'espèce mycobacterium
RNA polymerase binding protein A (RbpA) is global transcriptional activator from actinomycetes species which is essential for growth and which increases tolerance of bacteria to antibiotics. RbpA from Mycobacterium tuberculosis (Mtb) specifically stimulates transcription by RNA polymerase (RNAP) containing either the σA or σB subunits but none of the other 11 alternative σ factors. It has been reported that the functioning of RbpA is promoter-dependent and it is indispensible for promoter unwinding of the constitutive sigAP promoter. To decipher the nature of promoter specificity of RbpA, we used biochemical assays, mutagensis and genomics approaches. We found that placing ‘TG-motif' between -14 to -17 positions in sigAP wild-type promoter makes transcription independent of RbpA. Also, we have shown that RbpA increases ability of RNAP to melt sigAP promoter at sub-optimal temperatures and stabilises promoter complexes. Mutational analysis of amino acid residues H166 and E169 in the σB region 3.0 (σR3.0), interacting with TG-motif, demonstrated an implication of σR3.0 in RbpA-mediated stabilisation of RNAP promoter complexes. Substitution in RbpA at amino acid residue R79 affected the promoter-complex stability, while the substitutions at RbpA resdiues K73, K74 affected the transcription initiation. However, none of the RbpA mutants studied here affected opening of the promoter DNA. The differential roles played by these RbpA residues in promoter complex stabilization and transcription initiation together with the effect produced by the σB mutations suggest the implication of σR3.0 in RbpA action. Next, we performed genome-wide cartography of the RbpA-dependent genes from the σB regulon by using an in vitro RunOff Microarray Analysis (ROMA). ROMA analysis has shown clear evidence of 15 fold increase in the number of genes activated by σB-RNAP in the presence of RbpA. Bioinformatics analysis of 140 genes controlled by RbpA-σB pair allowed us to identify characteristic signature in the -10 consensus (‘TANNNT’) specific to σB subunit. Our study underlines an importance of the interplay between σR3.0 and RbpA in Mtb transcription. Based on our results we propose that RbpA may play a role of functional replacement for TG-motif of the extended -10 elements in mycobacterium species

Le phénomène émergent de la tuberculose multirésistante et ultrarésistante est un problème de santé publique à l’échelle mondiale. Dans les pays en développement, ce problème est accru du fait que les laboratoires de diagnostic de la tuberculose manquent d’équipement et d’outils de diagnostics pour identifier ces cas pour prescrire une chimiothérapie adaptée. La première partie de ce travail de doctorat a permis à travers le séquençage du locus pncA, de mettre en évidence que la résistance au Pyrazinamide survient généralement et de manière significative lorsque la souche est multirésistante, c’est-à-dire après l’acquisition de la résistance à la Rifampicine et à l’Isoniazide. Le pourcentage des souches résistantes au PZA est même plus élevé chez les souches MDR résistantes aux FQs. Dans la seconde partie de l’étude, nous proposons une méthode alternative à la culture de bacilles dans un environnement confiné de type P3. À partir d’échantillons cliniques non cultivés (expectoration) et grâce au GeneXpert MTB/RIF, au séquençage de gènes et au spoligotypage, nous avons pu identifier 19 souches multirésistantes, une transmission active de souches sensibles appartenant aux clades LAM10, T1, MANU, H3 et enfin une épidémie sous-jacente de 5 souches Beijing multirésistantes
The emerging phenomenon of the MDR and XDR-TB is a worldwide public health issue. In developing countries, this problem is amplified due to the fact that TB diagnostic laboratories lack equipment and diagnostic tools to identify these cases and therefore prescribe appropriate chemotherapy. In the first part of this doctoral work, the sequencing of the pncA gene allowed us to show that the resistance to Pyrazinamide occurs significantly when the strain is MDR, corresponding to the acquisition of resistance to Rifampicin and Isoniazid; and that after the acquisition of Fluoroquinolones and to injectable antibiotics of second line (Amykacine, Kanamycine, Capreomycine) resistance by MDR strains, this rate increases even more. In the second part of the study, we propose an alternative method to the culture of bacilli in a BSL3 confined environment. From uncultivated clinical samples (sputum) and through GeneXpert MTB/RIF, sequencing of genes and spoligotyping, we identified 19 MDR strains, active transmission of sensitive strains belonging to clades LAM10, T1, MANU, H3 and finally as well as an underlying epidemic of 5 Beijing MDR strains.In the first study, 272 retrospective samples of Mycobacterium tuberculosis isolates were selected from two large cosmopolitan cities: Northern Paris (Bichat-Claude Bernard Hospital, 101 strains) and Southwest of Shanghai (Songjiang district, 171 Strains). These strains were selected according to their known phenotypic sensitivity to Rifampicin (RIF) and Isoniazid (INH). These phenotypic resistances were confirmed by the HAIN genotype analysis tools MTBDRplus and by the sequencing of the rpoB and katG/inhA genes. To determine the extensively drug resistance strains (XDR), we sequenced the gyrA/gyrB and rrs genes to identify genetic mutations associated with resistance to Fluoroquinolones (FQs) and second-line injectable antibiotics: Amikacin (AMK)-Kanamycin ( KAN)-Capreomycin (CAP), respectively. Finally, we sequenced the pncA gene of all isolates to identify the genetic mutations associated with resistance to Pyrazinamide (PZA). The strains were genotyped by spoligotyping and MIRU-VNTR.In the second study, from October 2014 to February 2015, 159 morning sputum samples with smear-positive smear after Ziehl-Neelsen staining were collected at the three main diagnostic laboratories for tuberculosis in Libreville, Gabon. These clinical samples were transported to the National Laboratory of Public Health in Libreville for analysis with the GeneXpert MTB/RIF automaton to confirm the microscopic diagnosis and to determine the resistance of bacilli to Rifampicin. Of the 159 samples, 29 samples had a sputum volume less than 1 ml, the minimum required according to the manufacturer's recommendations. For the 130 sputum samples analyzed by the GeneXpert automaton, 375 μl of the remaining GeneXpert solution not introduced into the cartridge was introduced into a 50 ml conical tube containing 25 ml of phosphate buffer (autoclaved solution) to neutralize the pH of the GeneXpert solution. The conical tube is centrifuged for 15 minutes at 4,500 rpm, the pellet is taken up in 100 μl of TE and then transferred to a 100 μl microtube which is subsequently heated for 30 minutes at 90°C. After a cycle of freezing (-40 ° C. for 1 h)-defrosting, the microtube is briefly centrifuged and the supernatant is transferred to a new microtube. From this new microtube we amplified by PCR and then sequenced the rpoB, katG/inhA, pncA, gyrA, rrs and rpsL genes to identify mutations associated with resistance to Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamide, Fluoroquinolones, Antibiotics in second lines: Amikacin-Kanamycin-Capreomycin and Streptomycin (SM), respectively. All the samples were genotyped by the multiplexed spoligotyping applied to the Luminex MagPix

Malgré la disponibilité d’un traitement curatif et un vaccin largement utilisé, l’OMS estime qu’approximativement un tiers de la population mondiale est infectée par Mycobacterium tuberculosis, l’agent étiologique de la tuberculose, et qu’environ 2 millions de personnes en meurent chaque année. La compréhension de l’épidémiologie de la tuberculose et les actions de contrôle de la maladie ont été, récemment, compliquées par l’émergence de bacilles tuberculeux résistants aux antibiotiques et par la synergie fournie par la co-infection avec le VIH. Une tendance alarmante pour la santé publique est l’émergence de souches résistantes à plusieurs antibiotiques (multi-résistantes, MDR), définies comme des isolats résistants au moins à l’isoniazide (INH) et la rifampicine (RIF), les deux agents anti-tuberculeux les plus puissants.

La sélection de mutants résistants se produit chez le patient lorsque les taux d’antibiotiques présents dans le corps sont sub-thérapeutiques ou lorsque la thérapie est inappropriée. Un des facteurs favorisant est l’exceptionnelle durée de la chémothérapie. Le besoin de maintenir des taux élevés d’antibiotiques pendant des mois, combiné avec la toxicité inhérente des agents, résultent en une observance incomplète du traitement par le patient et le risque d’acquérir des résistances. La résistance aux antibiotiques chez M. tuberculosis résulte d’altérations dans des gènes chromosomiques spécifiques. Les causes génétiques de la résistance ont été définies pour certains antibiotiques bien que plusieurs inconnues persistent.

Le présent travail a consisté en l’étude du problème de la résistance aux antibiotiques anti-tuberculeux par différentes approches :l’analyse génétique des mécanismes de résistance, l’évaluation de l’activité thérapeutique de nouvelles molécules et la caractérisation du profil de résistance de souches cliniques.

L’acide p-aminosalicylique (PAS) est un antibiotique bactériostatique de deuxième ligne dont le mécanisme d'action sur le bacille tuberculeux est incompris. Récemment, en utilisant la mutagenèse par transposon, la résistance au PAS fut associée à des mutations de la thymidylate synthase encodée par le gène thyA. Suite à cette découverte, nous avons entrepris une étude moléculaire de souches cliniques et de mutants spontanés résistants au PAS. Des mutations du gène thyA furent identifiées chez seulement 37% des souches. En tout, vingt-quatre mutations différentes furent identifiées dans le gène thyA. Les séquences nucléotidiques de cinq autres gènes de la voie de synthèse du folate et de la thymine (dfrA, folC, folP1, folP2, et thyX) ainsi que de 3 gènes encodant des N-acétyltransférases (nhoA, aac1 et aac2) furent également analysées mais aucune mutation associée à la résistance au PAS n’a pu être mise en évidence. L’utilisation de techniques bioinformatiques de prédiction structurelle révèle que les mutations identifiées affectent soit la structure soit le site fonctionnel de ThyA. L’étude des profils de croissance des organismes résistants au PAS nous permit de constater que les organismes porteurs d’une mutation de la protéine ThyA présentent un profil de croissance constant en présence de concentrations croissantes de PAS. Les organismes résistants au PAS possédant une protéine ThyA sauvage répondent, quant à eux, aux concentrations croissantes de PAS de façon dose-dépendante, indiquant que le(s) mécanisme(s) alternatif(s) de résistance au PAS est (sont) dose-dépendant(s).

La thymidylate synthase est également une des cibles du 5-fluorouracil (5-FU), l’agent chimiothérapeutique le plus largement utilisé pour le traitement du cancer colorectal avancé. Etant donné l’augmentation du nombre de souches résistantes de M. tuberculosis, de nouveaux composés anti-tuberculeux sont nécessaires de façon urgente. Ici, nous avons évalué l’efficacité in vitro et in vivo du 5-FU sur M. tuberculosis. La concentration minimale inhibitrice du 5-FU fut déterminée sur une collection de souches cliniques sensibles et multi-résistantes ainsi que sur des mutants spontanés résistants au PAS. Tous les isolats montrèrent une sensibilité au 5-FU à des concentrations allant de 0.4 à 1.8 µg/ml, et ce indépendamment de leur profil de sensibilité/résistance aux agents anti-tuberculeux actuels. Les études in vivo du 5-FU (sur un modèle murin de tuberculose active) montrèrent une efficacité de celui-ci durant les deux premières semaines de traitement puis une perte d’activité à la troisième semaine, vraisemblablement engendrée par les effets secondaires du 5-FU.

L’éthionamide (ETH) est un autre antibiotique de deuxième ligne dont l’utilisation est limitée aux tuberculoses multi-résistantes étant donné les effets secondaires qu’il engendre. Ces dernières années, les études ont montré que l’ETH est un pro-médicament, transformé en forme active par l’enzyme monooxygénase EthA dont l’expression est contrôlée par le répresseur transcriptionnel EthR. Notre étude décrit l’élaboration d’inhibiteur d’EthR capable d’augmenter la sensibilité de M. tuberculosis à l’ETH suite à l’amélioration de son activation. Les composés synthétisés et sélectionnés pour leur capacité à inhiber l’interaction EthR-ADN furent co-cristallisés avec EthR. Les structures tridimensionnelles des complexes furent utilisées pour la synthèse d’analogues capables d’améliorer la puissance de l’ETH en culture. Les molécules les plus prometteuses furent testées sur un modèle murin de tuberculose. Pour un des inhibiteurs d’EthR testés, nous avons montré que sa co-administration avec l’ETH permet une réduction de la dose d’ETH utilisée de 3 fois, pour l’obtention d’une même réduction de charge mycobactérienne pulmonaire. Ce travail démontre la possibilité d’augmenter l’index thérapeutique de l’éthionamide en agissant pharmacologiquement sur le mécanisme régulateur de son activation.

Dans certaines régions du monde, le problème de la multi-résistance devient très présent. Nous avons étudié l’état de la situation à Mourmansk (Fédération russe), une région à haute incidence de tuberculose. La résistance aux antibiotiques et l’épidémiologie moléculaire de la tuberculose furent étudiées sur des isolats collectés en 2003 et 2004 dans cette région. Une extrêmement haute prévalence de tuberculose multi-résistante (MDR-TB) fut constatée à la fois pour les nouveaux cas (primaires) (26%) et les cas précédemment traités (72.9%). Le typage des souches MDR primaires révèle une appartenance au génotype Beijing pour la plupart des isolats (79.8%) et l’homogénéité génétique des souches suggère une transmission active au sein de la population. L’analyse moléculaire des gènes impliqués dans la résistance à l’INH et à la RIF montre la présence des mutations katG codon 315 et rpoB codon 531 chez, respectivement, 98,2% et 76,3% des isolats MDR-TB primaires. La haute fréquence de ces mutations « communes » suggère la possible utilisation de tests moléculaires ciblant spécifiquement ces mutations pour détecter rapidement la plupart des cas de MDR-TB.

Nos travaux illustrent les différentes voies à suivre pour maitriser le problème de la résistance aux antibiotiques :l’élucidation des mécanismes de résistance, le développement de nouveaux médicaments et la détection rapide des cas de résistance.

Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
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Ce manuscrit décrit la distribution géographique des génotypes de Mycobacterium tuberculosis dans une large partie de la Chine, et l'étude d'une éventuelle corrélation avec la vaccination BCG et la résistance aux antibiotiques. La prévalence de la résistance a été analysée dans 10 provinces, et les mutations responsables de la résistance à la rifampicin et à l'INH ont été recherchées. La distribution des différents génotypes a été analysée par spoligotypage, par l'identification de délétions génomiques et par l'analyse du polymorphisme de répétitions en tandem (MLVA). Le génotype Beijing représente 55 à 93% des souches dans les provinces étudiées, avec un gradient allant du Sud vers le Nord de la Chine. Plusieurs autres familles sont identifiées, toutes appartenant à la clade dite " Moderne ". Les familles " Chine 2 " et " Chine 3 " qui représentent l'essentiel des autres souches sont rares en dehors de la Chine. Quelques souches de la famille CAS (Central Asia) sont également rencontrées dans une province et un ancêtre possible de la lignée Beijing dans une autre. La prévalence de la résistance aux antibiotiques a été mesurée parmi plus de 2000 isolats de 10 provinces. Le pourcentage de souches résistantes à au moins une drogue est de 45% et celui des souches multirésistantes est d'environ 29%. En Chine, à la différence d'autres pays, aucune corrélation n'est observée entre le génotype Beijing et la vaccination BCG. La distribution des mutations du gène rpoB a été déterminée ainsi que les mutations responsables de la résistance à l'INH. Aucune mutation n'est observée dans les gènes oxyR et ahpC. Cette étude est la première étude de grande envergure effectuée en Chine sur la diversité génétique de M. tuberculosis et sur les mécanismes de résistance aux antibiotiques.

La tuberculose est une maladie provoquée par Mycobacterium tuberculosis habituellement traitée par l’association de rifampicine, d’isoniazide, de pirazinamide et d’éthambutol pendant 6 mois. Des problèmes d’observances ont favorisé l’émergence de souches ultra résistantes (XDR). Les bêta-lactamines n’ont jamais été utilisées contre M. Tuberculosis à cause de la production par la bactérie d’une bêta-lactamase de classe A, BlaC. Nous avons montré que BlaC est capable d’hydrolyser toutes les classes de bêta-lactamines, analysé l’inhibition de BlaC par l’acide clavulanique, le tazobactam et le sulbactam, et montré que l’acide clavulanique est un inhibiteur irréversible de l’enzyme. Nous avons évalué l’efficacité d’une association d’acide clavulanique et de -lactamines contre des souches sensibles et XDR. Le méropénème, en combinaison avec l’acide clavulanique, est bactéricide sur les bacilles en réplication active ainsi que dans un modèle de dormance. La cible du méropénème pourrait être une L,D-transpeptidase, l’enzyme clé d’une nouvelle voie de synthèse du peptidoglycane que nous avons caractérisé chez Enterococcus faecium. Cette voie implique l’activation d’une métallo enzyme qui fournit le substrat d’une L,D transpeptidase (Ldtfm), responsable de la formation de ponts interpeptidiques de type 3-3 dans le peptidoglycane. Nous avons montré que cette enzyme était inactivée par les carbapénèmes. Comme le peptidoglycane de M. Tuberculosis est majoritairement constitué de ponts 3-3 et que cinq paralogues de la famille des L,D-transpeptidases sont présent dans son génome, ces enzymes pourraient être la cible du méropénème.

La tuberculose humaine demeure un problème majeur de santé publique. L'un des aspects les plus alarmants concernant la tuberculose, est l'émergence et la dissémination de souches M. Tuberculosis résistantes aux médicaments, en particulier les souches multi-résistantes (MDR) qui sont de graves menaces pour la lutte contre la tuberculose. La détection précoce de la résistance aux médicaments de M. Tuberculosis dans les isolats cliniques est essentielle pour un traitement approprié afin d'éviter la propagation des souches résistantes. La première partie de ce travail a comparé des tests moléculaires pour la détection de la résistance à la rifampicine (RIF) et à l'isoniazide (INH) par rapport au test conventionnel de sensibilité aux médicaments et le séquençage. Le test Génotype MTBDRplus semble être un outil fiable pour la détection d'INH et de RIF résistance dans des souches. En outre, ce travail a également confirmé que le spoligotype T2 est commun parmi les isolats MDR circulant en République Centrafricaine (RCA). Dans la deuxième partie, nous avons montré que contrairement à la souche de référence (H37Rv), les souches T2 induisent une réponse inflammatoire moins importante et nous avons observé que ces souches semblent toutes provenir d'un ancêtre commun. Enfin, nous avons évalué l'aspiration à l'aiguille fine (FNA) dans le diagnostic des adénopathies tuberculeuses chez les enfants. Cet outil a permis la détection de 67,2% des cas de tuberculose. Il s'agit d'une technique simple et non invasive capable de fournir des échantillons pour la confirmation bactériologique ou moléculaire de la tuberculose
Human tuberculosis remains a major public health problem. One of the most alarming trends concerning tuberculosis is the emergence and spread of drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis, especially multidrug-resistant (MDR) strains, which are serious threats to the control of tuberculosis. Early detection of M. Tuberculosis drug resistance in clinical isolates is crucial for appropriate treatment to prevent the development of further résistance and the spread of resistant strains. The first part of our study compare molecular tests for the detection of rifampin (RIF) and isoniazid (INH) resistant strains to conventional drug susceptibility testing (DST) and sequencing. Génotype MTBDRplus testing seems to be reliable tool for the detection of INH and RIF résistance in various strains. In addition, our work has also confirmed that T2 spoligotype is common among MDR isolates circulating in Central African Republic (CAR). Second, we studied the innate immune response by infecting in vitro human macrophages with T2 and other M. Tuberculosis strains. Our results show that, compared to reference strains (H37Rv), T2 strains induce a less inflammatory response. Sequencing identified SNPs carried by ail T2 strains suggesting a phylogenetic link. These preliminary results give an important information on chacteristics and pathogenicity of MDR strains in CAR. Finally, we assessed Fine-needle aspiration (FNA) in the diagnosis of tuberculous adenopathy in children. FNA allowed detection of 67. 2»% of TB cases. This tool is simple, cost-effective and non-invasive that provides samples that could be used for bacteriological or molecular confirmation of TB

Chez les patients traités par un régime posologique, La concentration sérique moyenne et l'écart type de la concentration SMX était 161,01 ± 69,154 mg/L et de 5,788 ± 2,74 mg/L pour le TMP. La concentration minimale inhibitrice 90% (CMI 90) était de 10 mg/L pour le cotrimoxazole et la sulfadiazine contre Mycobacterium tuberculosis. Toutes les mycobactéries étaient inhibées par 20 mg/L de cotrimoxazole et de sulfadiazine. Les CMI de l'ivermectine contre 13 souches complexe M. tuberculosis ont varié entre 10 et 40 mg/L. En outre, tous isoler M. tuberculosis étaient résistants à la squalamine avec CMI > 100 mg/L. Dans une autre partie nous avons montré que tous les isolats du complexe Mycobacterium avium étaient résistants au triméthoprime avec une CMI > 200 mg/mL. Le cotrimoxazole, le sulfaméthoxazole et la sulfadiazine ont montré une CMI respectivement de 10 mg/L, 25 mg/L et 20 mg/L, à l'exception de Mycobacterium chimaera qui présentait une CMI de 10 mg/L pour ces molécules. La comparaison de la séquence du gène de la dihydroptéroate synthase de M. intracellulare et M. chimaera a montré seulement quatre changements d'acides aminés
Firstly, we measured the serum concentration of Sulfamethoxazole (SMX)-Trimethoprim (TMP) in patients treated with high dosage regimen. The mean values and standard deviation for SMX concentration was 161.01± 69.154 mg/L and of 5.788 ± 2.74 mg/L for TMP. Susceptibility testing yielded a minimum inhibitory concentration 90% (MIC90) of 10 mg/L for cotrimoxazole and sulfadiazine. All M. tuberculosis complex mycobacteria (MTC) were inhibited by 20 mg/L cotrimoxazole and sulfadiazine. Also, the MICs of ivermectin varied between 10 and 40 mg/L, against 13 MTC mycobacteria. Moreover, all M. tuberculosis isolate were resistant to squalamine with MIC > 100 mg/L. Also, all Mycobacterium avium complex (MAC) isolates were resistant to trimethoprim with MIC > 200 mg/L. Cotrimoxazole, sulfamethoxazole and sulfadiazine exhibited MIC of 10 mg/L, 25 mg/L and 20 mg/L, respectively against all tested MAC isolates except for Mycobacterium chimaera which exhibited MICs of 10 mg/L for these molecules. Comparing the DHPS gene sequence in M. intracellulare and M. chimaera type strains and clinical isolates yielded only four amino acid changes

La tuberculose (TB) reste parmi les 10 premières causes de décès dans le monde ; l’émergence/réémergence de la TB résistante aux antituberculeux aggrave la situation et représente un défi majeur pour l’éradication de la TB. Le Laos est entouré par des pays fortement touchés par la TB et la TB multi-résistante (MDR) et cette maladie représente une priorité en termes de santé publique dans ce pays. Il n’existe encore aucune donnée sur la structure génétique et la résistance aux antibiotiques de la population de M. tuberculosis au Laos.Dans ce contexte, ce travail avait pour but d’analyser la diversité génétique et la structure des populations de M. tuberculosis ainsi que les déterminants génétiques associés à la résistance à partir d’échantillons collectés lors de l’enquête de prévalence nationale de la Tuberculose (TBPS) 2010-2011, l’enquête de résistance aux antituberculeux (DRS) 2016-2017 et chez les cas suspects de MDR-TB au Laos (2010-2014). Plusieurs techniques d’analyses ont été utilisées, comprenant les tests de sensibilité aux médicaments (phénotypique et génotypique), le séquençage et le génotypage par spoligotypage et MIRU-VNTR. Les données ont été analysées par des méthodes statistiques et phylogénétiques.Premièrement, ce travail s’est focalisé sur la diversité des familles de M. tuberculosis circulant au Laos. Les familles EAI et Beijing (76.7% et 14.4% respectivement) ont été principalement observées dans les échantillons de TBPS, alors que la famille Beijing était plus fréquente dans les échantillons de DRS et chez les patients suspectés de MDR-TB (35% et 41% respectivement). La transmission récente était non-négligeable avec un taux de « clustering » global de 11.9%, et des taux pour Beijing de 20 % et EAI de 11 %. Deuxièmement, les résultats ont révélé des profils de résistance très diverses allant de la mono-résistance jusqu’à la pré-XDR (ultrarésistance). Les mutations associées aux profils de résistance ont montré une grande diversité, avec cependant certaines mutations majeures dans les gènes rpoB, katG, et rpsL. Le gène pncA a montré un pattern différent avec de la diversité sans mutations prééminentes. En plus des mutations détectées, des délétions et insertions de bases ont été également observées. Le séquençage a montré son utilité pour la détection de la résistance aux antibiotiques dans les trois échantillons à l’étude. Enfin, la famille Beijing, famille la plus problématique au niveau mondial en termes de résistance et de transmissibilité, a été identifiée de manière significative dans le groupe de patients <35 ans, principalement dans les provinces du Nord, dans les cas de transmissions récentes et chez les isolats très résistants. Tous ces points suggèrent un risque d’émergence de la MDR-TB accrue au Laos dû à la famille Beijing.En conclusion, cette étude permet d’avoir pour la première fois un aperçu de la structure des populations de M. tuberculosis au Laos. Les résultats soulignent le risque d’augmentation du nombre de cas infectés par la famille Beijing et donc des cas de résistance. Pour empêcher une dégradation de la situation, il est essentiel d’améliorer les stratégies pour le dépistage des résistances et de développer des tests moléculaires capables de couvrir un large nombre de mutations qui soit simple à implémenter dans les pays à ressources limités. Les résultats de ce travail serviront de base en termes de famille/sous-famille/génotype et de mutations associées à la résistance au Laos. Ces données pourront être comparées avec de futures études/analyses pour étudier l’évolution de la TB et de la TB résistante et ainsi d’évaluer l’efficacité des politiques de contrôle mises en place. La description des mutations associées aux résistances est utilisée pour créer une base de données régionale en collaboration avec le Vietnam et le Cambodge pour développer un outil de diagnostic basé sur la technologie des puces à ADN pour améliorer la détection de la résistance dans la région
Tuberculosis (TB) is still one of the top 10 leading causes of death worldwide; the emergence/re-emergence of drug resistant TB aggravates the situation globally and challenges the prospect of ending TB by 2035. Lao PDR is surrounded by TB and MDR-TB high burden countries and TB continues to be one of the priority infection diseases in this country. The prevalence of TB in 2010 was almost twice as high than previous estimates and little is known about drug resistance. Up to now, M. tuberculosis population data regarding drug resistance and genetic structure are totally absent. In this context, we aimed to study the diversity and the structure of M. tuberculosis population and the genetic determinants associated to drug resistance using clinical samples collected from the TB prevalence survey (TBPS), 2010-2011; from the Drug resistance survey (DRS), 2016-2017 and from presumptive MDR-TB cases in Lao PDR (2010-2014). Various methods and analyses were used, including drug susceptibility testing (phenotypic and genotypic), DNA sequencing and genotyping of M. tuberculosis using spoligotyping and MIRU-VNTR. The data were analyzed by statistical and phylogenetic analyses.Firstly, this work was focused on the diversity of M. tuberculosis families circulating in Lao PDR. According to the result form TBPS, EAI and Beijing family (76.7% and 14.4% respectively) were mainly observed, while Beijing family was more observed in DRS, and presumptive MDR-TB cases (35% and 41% respectively). The level of recent transmission in Lao PDR was non-negligible with a global clustering rate of 11.9% and in Beijing and EAI of 20% and 11%, respectively. Secondly, the results demonstrated the diversity of drug resistant patterns from mono-resistance to pre-extensively drug resistance (pre-XDR). A high diversity of mutations associated with drug resistance was also observed, however common mutations were mainly found (e.g: mutations in rpoB gene, katG and rpsL). The pattern was different for pncA gene, we observed a diversity of mutations without preeminent ones. Besides the number of known and unknown mutations associated with anti-TB drug resistance, deletion and insertion of bases were also observed. The sequencing showed its usefulness for drug resistance detection. Lastly, Beijing family, which is the more problematic family in the world in terms of resistance and transmissibility, was observed on a significant manner in young age group, mainly in the northern provinces, in recent transmission cases and among highly drug resistant isolates, suggesting an increasing risk of highly drug resistance TB due to highly transmissible Beijing strains in Lao PDR.In conclusion, this study provides the first genetic insights into the M. tuberculosis population in Lao PDR. The results underline the risk of increase of Beijing and drug resistant TB in the country. In order to prevent a more serious situation in the future regarding drug resistance as observed in neighboring countries, there is an urgent need of effective strategy improvement for drug resistance screening and the development of rapid molecular tests that cover a large number of drug resistance simultaneously with a feasible implementation in the limited resource countries. The results of genotyping from our study will be the baseline of families/subfamilies/genotype of M. tuberculosis population and of the mutations associated with drug resistance in Lao PDR. These data will be compared with further study/analysis to evaluate the trend of TB and drug resistant TB in the country and to determine if the drug resistance is under control after the set-up of new policies. The data of drug resistance associated mutations are used to build a regional database in collaboration with Vietnam and Cambodia in order to develop a diagnostic tool based on DNA chip technology to improve the drug resistance detection in the region

L'humanité a beaucoup progressé depuis l'époque où les infections courantes étaient considérées comme une condamnation à mort. Cependant, comme les organismes responsables de ces infections deviennent résistants aux traitements, nous sommes obligés de nous confronter à la réalité potentielle de l'ère post-antibiotique qui approche rapidement. La résistance aux antibiotiques évolue à un rythme qui dépasse considérablement les thérapies médicales existantes et il est urgent d'innover. L'objectif de mon doctorat est justement d'y parvenir en créant une plateforme de biologie synthétique à science ouverte pour accélérer la découverte d'antibiotiques et faire avancer la recherche sur les profils de résistance des bactéries pathogènes. La plateforme est basée sur la manipulation d'E.coli pour exprimer des cibles pathogènes étrangères et pour identifier les candidats médicaments antimicrobiens correspondants. Ce projet est également fondé sur les principes de la science ouverte et de l'accessibilité, qui sont évidents dans le développement d'un kit de détection de médicaments frugal et d'un spectrophotomètre pour faire participer les citoyens scientifiques de tous niveaux
Humanity has come a long way from a time where common infections were seen as a death sentence. However, as the organisms driving these infections evolve resistance to treatment, we are forced to face the fast approaching reality of a post-antibiotic era. Antibiotic resistance is evolving at a pace that is significantly ahead of the present-day systems and innovation is urgently required. The aim of my PhD is to do just that by generating an open-science synthetic biology platform to accelerate antibiotic discovery and to further study resistance landscapes of pathogen targets. The platform is based on engineering E.coli as a host to express foreign pathogen targets in order to identify their corresponding antimicrobial drug candidates. This project is also founded on principles of open science and accessibility, which are evident in the development of a frugal drug screening kit and spectrophotometer to engage citizen scientists of all levels

L'émergence du phénotype MDR (« multidrug resistance») des cellules cancéreuses est souvent corrélée à la surexpression de protéines membranaires appartenant à la superfamille ABC (« ATP binding cassette »). Ces protéines couplent l'hydrolyse de l'ATP au transport d'agents chimiothérapeutiques vers l'extérieur des cellules. Chez les bactéries, des transporteurs homologues ont été impliqués dans certains cas de résistance aux antibiotiques.
Deux nouveaux transporteurs ABC bactériens, Rv1747 de Mycobacterium tuberculosis et YheI/YheH de Bacillus subtilis, potentiellement impliqués dans la résistance aux antibiotiques, ont été étudiés ici en réalisant une expression hétérologue chez Escherichia coli et en isolant des vésicules de membrane inversées. Ce système s'est avéré inapproprié pour l'étude du transporteur Rv1747, à cause vraisemblablement des différences entre E. coli et M. tuberculosis dans l'usage des codons. En revanche, nous avons obtenu un degré important de surexpression de YheI/YheH qui nous a permis de caractériser son activité de transport et d'hydrolyse de l'ATP. Nous avons ainsi montré que les deux protéines, YheI et YheH, s'associent pour former un exportateur hétérodimérique capable de transporter de multiples drogues, et que le rôle des deux sous-unités n'est pas identique dans le mécanisme catalytique du transporteur. Enfin, nous avons réussi à purifier le transporteur YheI/YheH avec un rendement élevé et dans un état fonctionnel stable, permettant d'approfondir sa caractérisation biochimique ainsi que d'obtenir des cristaux bidimensionnels pour une étude structurale par microscopie électronique.

La tuberculose causée par Mycobacterium tuberculosis (Mtu), est un problème de santé majeur aggravé par la résurgence inquiétante de souches de Mtu multirésistantes aux antibiotiques. Il est crucial de développer de nouvelles molécules antituberculeuses et de découvrir des cibles thérapeutiques. L'enveloppe de Mtu, atypique et très peu perméable, contient des acides mycoliques, acides gras à très longues chaines, qui sont essentiels et dont le métabolisme représente un réservoir de cibles validées. La dégradation de ces molécules, qui semble importante lors des mécanismes de l'infection de l'hôte, reste encore peu explorée.Le projet de thèse a porté sur l'étude de la première étape-clef de cette voie, catalysée par une enzyme de la famille des Baeyer-Villiger-Mono-Oxygénase (BVMO). Cette étape d'oxygénation permet d'adresser l'acide mycolique vers la voie de dégradation. Nous avons sélectionné cinq candidats potentiels pour cette étape sur le génome de Mtu, dont trois codant des protéines "BVMO-like", présentant une séquence signature BVMO. L'expression et l'optimisation de la production des différentes protéines candidates dans deux systèmes d'expression, Escherichia coli et Mycobacterium smegmatis, ont été réalisées. L'activité BVMO et les spécificités de substrat des protéines candidates ont été testées. Les candidats BVMO-like ont une plus forte activité en présence d'un substrat aliphatique présentant un pseudo-motif mycolique par rapport à d'autres substrats cyclique ou aliphatiques testés. Ces résultats sont en accord avec l'hypothèse que ces candidats BVMO-like pourraient être impliqués dans la première étape de dégradation des acides mycoliques. Deux des trois BVMO sont déjà connues pour activer la prodrogue éthionamide, un antituberculeux de seconde ligne. Ces travaux montrent également que la troisième BVMO peut elle aussi métaboliser ce composé.Dans le but d'approfondir les connaissances sur le rôle de ces protéines candidates chez Mtu, deux stratégies complémentaires ont été adoptées, la production et l'analyse de (i)souches de surexpression et (ii) mutants de délétion. L'analyse lipidomique des souches de surexpression montre des variations quantitatives significatives des glycolipides contenant des acides mycoliques, le monomycolate de tréhalose et le dimycolate de tréhalose. D'autre part, les différents mutants de délétion présentent des variations quantitatives d'un composé apolaire potentiellement apparenté à un produit de la voie de dégradation des acides mycoliques. L'ensemble des travaux de lipidomique semble confirmer le lien entre les BVMO et le métabolisme des acides mycoliques, et notamment leur dégradation
Tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtu) is a major health problem aggravated by the worrying resurgence of multi-resistant Mtu strains. It is crucial to develop new anti-tuberculosis molecules and discover therapeutic targets. The Mtu envelope, atypical and displaying very low permeability, contains mycolic acids, very long chain fatty acids, which are essential and whose metabolism represents a reservoir of validated targets. The degradation of these molecules, which seems important during the mechanisms of host infection, has yet to be fully explored.The thesis project focused on the study of the first key step of this pathway, catalyzed by an enzyme from the Baeyer-Villiger-Mono-Oxygenase (BVMO) family. This oxygenation step allows the mycolic acid to be directed towards the degradation pathway. We have selected five potential candidates for this step on the Mtu genome, including three coding for BVMO-like proteins with a BVMO signature sequence. The expression and optimization of the production of the various candidate proteins in two expression systems, Escherichia coli and Mycobacterium smegmatis, were carried out. The BVMO activity and substrate specificities of the candidate proteins were tested. BVMO-like candidates have a higher activity in the presence of an aliphatic substrate with a mycolic pseudo-motif compared to other cyclic or aliphatic substrates tested. These results are in agreement with the hypothesis that these BVMO-like candidates could be involved in the first step of mycolic acid degradation. Two of the three BVMOs are already known to activate the prodrug ethionamide, a second-line anti-tuberculosis drug. This work also shows that the third BVMO can also metabolize this compound. To further our knowledge of the role of these candidate proteins in Mtu, two complementary strategies were adopted, the production and analysis of (i) overexpression strains and (ii) deletion mutants. Lipidomic analysis of overexpression strains shows significant quantitative variations in glycolipids containing mycolic acids, trehalose monomycolate and trehalose dimycolate. On the other hand, the different deletion mutants exhibit quantitative variations of an apolar compound potentially related to a product of the mycolic acid degradation pathway. All the lipidomic studies seem to confirm the link between BVMOs and the metabolism of mycolic acids, and in particular their degradation

La tuberculose (TB), provoquée par Mycobacterium tuberculosis, est une des trois maladies prioritaires dans le monde. Les TB multi-résistantes (MDR) et ultra-résistantes (XDR-TB) représentent des obstacles majeurs pour la lutte antituberculeuse. Dans les pays à MDR-TB élevée, comme le Vietnam, la détection insuffisante de la résistance aux antibiotiques est un des facteurs principaux qui favorisent la transmission des souches résistantes. De plus, dans ces pays, encore très peu de choses sont connues sur la résistance à la pyrazinamide et aux antibiotiques de seconde ligne et sur les déterminants génétiques liés à ces résistances. Dans ce contexte, ce travail vise donc à acquérir des connaissances sur la résistance aux antibiotiques au Vietnam et à étudier comment M. tuberculosis évolue de l’état sensible à l’état ultra-résistant.260 isolats cliniques collectés au Vietnam entre 2005 et 2009 ont été inclus. Diverses techniques et analyses ont été utilisées: tests de sensibilité aux médicaments (développement d'un test à temps réduit), spoligotypage et MIRU-VNTR (24 loci) et séquençage de gènes. Les données ont été analysées par des analyses statistiques et phylogénétiques. Ce travail s’est d’abord focalisé sur la caractérisation d’isolats hautement résistants et sur la résistance à la pyrazinamide. Une forte proportion d'isolats quadruple résistants aux antibiotiques de première ligne a été identifiée comme pré-XDR et XDR et en majorité appartenant à la famille Beijing. L'analyse moléculaire a également révélé une forte proportion d'isolats, en particulier MDR, quadruple résistants et de la famille Beijing, portant des mutations associées à la résistance à la pyrazinamide.L'analyse génétique et phylogénétique globale a ensuite montré une grande diversité de profils de mutations dans chaque famille et chaque cluster MIRU-VNTR. Ces données suggèrent que M. tuberculosis peut suivre des chemins évolutifs variés pour devenir ultra-résistant. La prédominance de mutations et de combinaisons de mutations associées à un haut niveau de résistance et à un faible coût en termes de fitness suggère un effet cumulatif des mutations et un rôle de l’épistasie dans l'acquisition de la résistance multiple. De plus, une fréquence élevée de mutations compensatoires associées à la résistance à la rifampicine a été détectée chez les isolats très résistants. Ces processus semblent donc influencer fortement l'évolution de la résistance dans notre échantillon. Il est à noter que les mutations liées à des niveaux de résistance élevée et à de faibles coûts en termes de fitness, ainsi que les mutations compensatoires étaient plus particulièrement associées à la famille Beijing.En conclusion, ce travail fournit des connaissances uniques sur la résistance aux antibiotiques chez M. tuberculosis au Vietnam. En particulier, ces données prédisent une évolution de la résistance vers une situation de plus en plus préoccupante. Premièrement, la famille Beijing, en cours d’invasion au Vietnam, apparaît associée à de hauts niveaux de résistance, de faible coût en termes de fitness et aux mutations compensatoires. Deuxièmement, le risque élevé de résistance à la pyrazinamide remet en question son efficacité et son utilisation dans les traitements contre la MDR et la XDR-TB. Troisièmement, les données suggèrent une évolution de M. tuberculosis vers un potentiel de résistance plus élevé par effet cumulatif des mutations associés à la résistance et l’existence de phénomènes d’épistasie. Comme les échantillons étudiés dans ce travail ont été collectés, l’étape suivante est de valider nos hypothèses sur des données actualisées.Enfin, ce travail avec les données déjà publiées a permis d’établir, pour la première fois, un inventaire des mutations associées à la résistance aux antibiotiques chez M. tuberculosis au Vietnam. Cette base de données sera utilisée pour le développement d'une puce à ADN pour la détection rapide de la résistance aux antibiotiques au Vietnam
Tuberculosis (TB) is one of the deadliest infectious diseases worldwide, mainly caused by Mycobacterium tuberculosis. Multidrug resistant (MDR) and extensively drug resistant (XDR) TB are currently main challenges for TB control. In high MDR-TB burden countries like Vietnam, one of the main factors of drug resistant strain spread is the insufficient capacity of drug resistance detection. Besides, still little is known in these countries about the resistance to second line and pyrazinamide drugs (key drugs in the MDR-TB treatment) and the genetic determinants linked to these resistances. In this context, this work aimed to acquire knowledge on drug resistance in Vietnam and to understand how M. tuberculosis evolved from sensitive to highly drug resistance form by molecular analysis.260 clinical isolates collected in Vietnam between 2005 and 2009 were included. Various techniques and analyses were used: drug susceptibility testing (development of a test with a reduced turn-around time), spoligotyping and 24-MIRU-VNTR typing and gene sequencing. The data were analyzed by statistical and phylogenetic analyses.First, this work was focused on highly drug resistant M. tuberculosis clinical isolates and pyrazinamide resistance. A high proportion of quadruple first-line drug resistant isolates (resistant to isoniazid, rifampicin, streptomycin and ethambutol) have been characterized as pre-XDR and XDR isolates, belonging especially to Beijing family. The molecular analysis revealed also high proportion of drug resistant isolates carrying highly confident pyrazinamide resistance-associated mutations, particularly in MDR and quadruple resistant isolates and in Beijing family.Second, the genetic and phylogenetic analyses showed high diversity of mutation patterns within each family and each MIRU-VNTR cluster suggesting various evolutionary trajectories towards first and second-line drug resistance. The predominance of specific mutations and combinations of mutations associated with high level of resistance and low fitness cost suggests a cumulative effect of mutations and a role for epistasis in multiple-drug resistance acquisition. In addition, high frequency of fitness-compensatory mutations associated with rifampicin resistant mutations was detected in highly drug resistant isolates. These processes may drive the evolution of drug resistance in this sample and lead to a successful spread of highly drug resistant strains. It is worth noting that Beijing family was specifically linked to high-level drug resistance and low fitness cost mutations and to compensatory mutations.In conclusion, this work provides knowledge on the resistance to the first and second-line anti-TB drugs in clinical M. tuberculosis samples collected in Vietnam between 2005 and 2009. These data predict an evolution towards a more problematic situation in terms of drug resistance. First, because the Beijing family, which is currently invading Vietnam, is associated with highly drug resistance, mutations linked to high-level drug resistance and low fitness cost and compensatory mutations. Second, the high risk of pyrazinamide resistance in our sample challenges the efficacy and the use of this drug in MDR-TB treatment. Third, our data suggest an evolution of M. tuberculosis towards a higher potential of drug resistance because of a probable cumulative effect of drug resistant mutations and epistatic interactions. Since the samples under study were collected between 2005-2009, the next step is to test our hypotheses on a recent sampling. Finally, this study together with published data allowed making, for the first time, an inventory of the drug resistance associated mutations in M. tuberculosis isolates from Vietnam

L'éthionamide (ETH) est un puissant antituberculeux de seconde ligne utilisé pour le traitement des patients infectés par des souches de Mycobacterium tuberculosis multirésistantes aux antibiotiques de première intention. Bien que l'ETH soit un analogue structural de l'isoniazide (INH) et que ces deux antibiotiques partagent une cible moléculaire commune (InhA), il n'est cependant observé que peu de résistances croisées parmi les isolats cliniques. Au cours de cette étude, nous avons identifié deux gènes de M tuberculosis, Rv3854c (ethA) et Rv3855 (ethR), impliqués dans la résistance à l'ETH. L'analyse de la séquence en acides aminés de EthA, montrant que cette protéine appartient à la famille des monooxygénases, et la surproduction de EthA, conduisant à un phénotype d'hypersensibilité des mycobactéries à l'ETH, suggèrent que EthA peut être l'activateur biologique de la pro-drogue ETH. Parallèlement, la surexpression de ethR, gène voisin de ethA, génère des mycobactéries hautement résistantes à l'ETH. L'analyse de la séquence en acides aminés révèle l'existence dans la région amino-tenninale de EthR d'un motif hélice-tour-hélice caractéristique des régulateurs de la famille TetR/CamR. En outre, l'inactivation de ethR chez M tuberculosis rend le bacille hypersensible à l'ETH. Ensembles, ces informations suggèrent que EthR pourrait réguler l'expression de ethA. Grâce à des expériences de génétique, de biochimie et de biologie moléculaire, nous avons confinné que EthR régule négativement l'expression de ethA et que cette régulation se fait par fixation directe et spécifique du régulateur sur la région promotrice du gène ethA. Nous avons montré que le site d'initiation de la transcription de ethA est localisé dans la zone opératrice de EthR de 55 pb définie par l'ana]yse d'empreinte à la DNase 1. Pour la première fois, nous montrons qu'un régulateur de la famille TetR/CamR se fixe sur son opérateur par octamérisation de type coopératif. Ce comportement original a motivé l'étude cristallographique de EthR qui révèle une structure dimérique ligandée à deux molécules hydrophobes de faible poids moléculaire. Ces travaux ouvrent des perspectives de développement d'inhibiteurs potentiels de EthR qui pourraient aboutir à l'amélioration du traitement de la tuberculose.

La résurgence de la tuberculose est due entre autre à l'apparition de souches résistantes aux antituberculeux comme l'isoniazide (INH). L'INH est une prodrogue qui a besoin d'être activée par l'enzyme KatG pour former avec le cofacteur NADH les adduits INH-NAD. Ces adduits inhibent l'enzyme InhA impliquée dans la biosynthèse des acides mycoliques, constituants essentiels de l'enveloppe mycobactérienne. Il est admis que de nombreuses résistances à l'INH sont dues à des mutations de katG. L'INH ne peut plus être activé, il est inactif sur InhA. Des molécules capables d'inhiber directement InhA sans étape d'activation sont de bons candidats à de nouveaux médicaments. Nous avons dans un premier temps, synthétisé des analogues simplifiés de l'adduit INH-NAD afin de contourner les problèmes de résistances liés à KatG. L'évaluation biologique de ces composés n'a pas montré d'inhibition significative ni de l'enzyme InhA, ni de la croissance mycobactérienne. Dans un second temps, nous avons développé une autre stratégie, appelée bisubstrat. L'ensemble des composés préparés a été testé sur l'inhibition d'InhA et de croissance de mycobactéries et a donné des résultats intéressants et prometteurs. Parallèlement nous nous sommes intéressés à l'étude de l'équilibre tautomérique des adduits INH-NAD. Nous avons étudié cet équilibre sur des modèles simplifiés des adduits avec des données expérimentales soutenues par des études de modélisation moléculaire. Enfin pour essayer de comprendre ce phénomène, nous avons réalisé des études d'interaction des différents adduits présents en solution avec InhA par docking et de dynamique moléculaire
The resurgence of tuberculosis can be associated to the resistance of Mycobacterium tuberculosis strain to the most important antitubercular drugs as isoniazid (INH). INH is a prodrug that requires activation by catase peroxydase KatG to form with NADH the INH-NAD adduct. This adduct inhibits the InhA enzyme, necessary to the biosynthesis of mycolic acids that are essential components of mycobacterial envelope. The resistance to INH is resulting from mutations in katG that diminish its ability to convert INH in active form. So, compounds able to inhibit directly InhA without requiring activation have tremendous promise as novel drugs. We have synthesized in one first stage, truncated analogues of INH-NAD adduct in order to eliminate resistance problems attributed to KatG. The biological evaluation of these compounds did not exhibit satisfactory inhibition of the enzyme InhA neither of the mycobacterial growth. In one second stage, we have developed another strategy named bi-substrate. All compounds prepared was tested on the inhibition of InhA and mycobacterial growth and it gave interesting and promising results. Next we have used simplified analogues to studied tautomerism equilibrium of INH-NAD adduct with experimental data supported by studies of molecular modeling. Lastly, in order to try to understand this phenomenon, we carried out studies of interaction of different adducts present in solution with InhA by docking and molecular dynamics

La recrudescence de la tuberculose a été favorisée par l'émergence de souches du bacille tuberculeux, Mycobacterium tuberculosis, résistantes aux agents antituberculeux et notamment à l'isoniazide (INH). Cet antituberculeux de première ligne inhibe un métabolisme propre aux mycobactéries, la biosynthèse des acides mycoliques. Ces acides gras à très longue chaîne sont des composés majeurs et caractéristiques de l'enveloppe mycobactérienne. Une cible moléculaire de l'isoniazide, la protéine InhA, est une énoyl-ACP réductase et catalyse une étape de la voie classique de biosynthèse d'acides gras, avec une spécificité pour des substrats à longue chaîne. InhA interviendrait dans un système d'élongation d'acides gras participant à la biosynthèse des acides mycoliques. Toutefois, aucune donnée expérimentale n'a clairement établi le rôle de cette protéine chez les mycobactéries. Parmi les systèmes d'élongation mycobactériens, c'est le système FAS-II qui est le plus susceptible de contenir InhA. Après isolement d'une fraction protéique soluble présentant l'activité d'élongation FAS-II, nous avons démontré la présence de InhA dans cette fraction et confirmé l'implication de cette protéine dans FAS-II, en utilisant des inhibiteurs de l'activité de InhA. La microscopie électronique a permis de localiser InhA à la fois dans le cytoplasme et dans l'enveloppe. En effet, nous avons mis également en évidence la présence de InhA dans un extrait de parois mycobactérien catalysant l'activité de biosynthèse des acides mycoliques. La sensibilité de cette dernière activité aux inhibiteurs de InhA suggère fortement l'implication de InhA, et de FAS-II, dans la biosynthèse des acides mycoliques mycobactériens. Par contre, la protéine InhA n'a pas été détectée dans des genres apparentés, résistants à l'INH et synthétisant des acides mycoliques plus courts. Afin de rechercher de nouvelles cibles potentielles pour des agents anti-mycobactériens, nous avons étudié le produit du gène mabA, en opéron avec inhA sur le chromosome de M. Tuberculosis. Après surproduction de MabA dans Escherichia coli et purification, son activité catalytique a été caractérisée et correspond à une b-cétoacyl réductase, NADPH-dépendante, spécifique de substrats à longue chaîne. Ces propriétés, ainsi que la présence de MabA dans la fraction enzymatique contenant le système FAS-II suggèrent l'implication de cette protéine dans le même complexe enzymatique que InhA. L'étude de la structure tridimensionnelle de MabA par modélisation moléculaire a permis de montrer que cette protéine appartenait à la famille structurale des RED (réductases/épimérases/deshydrogénases), et qu'elle était susceptible d'interagir avec l'isoniazide. Nous avons effectivement pu montrer que l'activité de MabA était inhibée par cet antibiotique
Emergence of tubercle bacilli resistant to multiple drugs has prompted the search for a new generation of antibiotics effective against Mycobacterium tuberculosis. Among the first line antituberculous drugs, isoniazid (INH) is highly specific of mycobacteria, and its primary effect corresponds to inhibition of a characteristic metabolism of these bacteria, the mycolic acid biosynthesis. Mycolic acids are very long-chain fatty acids and are major components of mycobacterial cell-wall. It was established that an isoniazid target, the InhA protein, is a 2-trans-enoyl-ACP reductase probably involved in the mycolic acid pathway. However, the exact role of InhA in mycobacteria is still unclear. Reduction of enoyl compounds corresponds to one step of fatty acid biosynthesis. We therefore isolated an enzymatic complex which contains the InhA protein, and using InhA inhibitors, we showed that the elongation activity of the system is InhA-dependent. Moreover, the inhibition of mycolic acid biosynthesis in cell-wall extracts by InhA inhibitors strongly suggests that the InhA-containing elongation system participates in the mycolic acid production in mycobacteria. .

Depuis le début des années 1990, l'OMS a pu constater une résurgence de la tuberculose. L'association de Mycobacterium tuberculosis, l'agent étiologique de la tuberculose, au virus de l'immunodéficience humaine (VIH) et l'apparition de souches multirésistantes aux antituberculeux en sont les principales causes. Dans ce contexte, les voies de biosynthèse des composés essentiels de l'enveloppe (acides mycoliques et arabinogalactane), représentent des cibles potentielles dans le développement de nouveaux agents thérapeutiques. Dans un premier temps, mon projet de thèse a été de déterminer le rôle précis du tréhalose dans la biosynthèse des acides mycoliques, acides gras spécifiques et essentiels au genre Mycobacterium. Alors que le tréhalose est essentiel pour la survie de M. Tuberculosis, Corynebacterium glutamicum, malgré une croissance perturbée, est viable en l'absence de ce composé. L'analyse biochimique d'un mutant délété dans les trois voies de biosynthèse de ce disaccharide (mutant Tre-) chez C. Glutamicum, nous a permis de démontrer que la biosynthèse du tréhalose, dans les conditions standards de culture (milieu minimum + saccharose), était nécessaire à la production des acides mycoliques. De plus, une approche de microscopie électronique par cryo-décapage est venue compléter cette étude, montrant que la pseudo-bicouche lipidique externe (ou mycomembrane), était absente de l'enveloppe. Nous avons montré que le mutant Tre-, dépourvu d'acides mycoliques en culture sur saccharose, est capable de synthétiser à nouveau des acides mycoliques lorsqu'il est cultivé sur glucose, maltose ou maltotriose. Nous avons alors caractérisé structuralement des nouveaux glycolipides estérifiés par des acides mycoliques en position 6 des unités ?-glucopyranosyles terminales non-réductrices. De plus, nous avons mis en évidence que la biosynthèse de monomycolate et de dimycolate de tréhalose (respectivement MMT et DMT) est localisée dans la paroi. .
Tuberculosis remains a major health problem for humans caused by the etiologic agent, Mycobacterium tuberculosis. Association of M. Tuberculosis with AIDS is responsible of the resurgency of tuberculosis since the nineties. In this context, the cell wall constituants represent potential targets of choice for the development of new antitubercular drugs. First, I study the role of trehalose in the biosynthesis of mycolic acids, specific and essential fatty acids of Mycobacterium genus. Contrary to M. Tuberculosis, Corynebacterium glutamicum can grow without trehalose althought the growth is severely impaired. We have shown that the triple mutant of trehalose of C. Glutamicum (Tre- mutant), grown in standard culture conditions (minimal medium + sucrose) was totaly devoided of mycolic acids. Furthermore freeze-fracture analysis of Tre- mutant demonstrate that the external pseudo-bilayer (mycomembrane), is absent of the cell wall. However, the Tre- mutant is able to synthesis mycolic acids when is grown on minimal medium with glucose, maltose or maltotriose. In these culture conditions, we have structuraly caracterised new glycolipids esterified by mycolic acids on the C-6 of their terminal non-reducing ?-glucopyranosyl unit. Then, we have demonstrated by using radiolabeled trehalose in transport experiments that the biosynthesis of trehalose monomycolate and dimycolate (TMM and TDM respectively) is localised in the cell wall. All these results led us to propose a new model of the final steps of mycolate biosynthesis and transfer in Corynebacterineae. Second, we study the role of mycolic acids in the permeability of the cell wall of the L-lysine producer strain of C. Glutamicum ATCC 21527, in collaboration with Pr. R. Krämer. This project is involved in the improvement of the amino acids producer strains, used in food industry. .

La résistance aux antibiotiques est une menace mondiale qui conduit à un besoin urgent de développement de nouveaux antibiotiques. L'étude du mécanisme d'inhibition des cibles des antibiotiques est cruciale pour le développement de nouvelles molécules. Le caractère essentiel du peptidoglycane, le composant majeur de la paroi bactérienne, ainsi que soixante-dix ans d'utilisation des β-lactamines ont fait de la polymérisation du peptidoglycane une cible attractive et validée pour les antibiotiques. Les protéines de liaison à la pénicilline (PLP) ont longtemps été considérées comme les seules enzymes catalysant l’étape essentielle de réticulation du peptidoglycane. La thèse explore l'inhibition d'une famille distincte d'enzymes, les L,D-transpeptidases (LDT), qui jouent un rôle prépondérant dans la réticulation chez Mycobacterium tuberculosis. Nous avons montré que l'efficacité d'inhibition des LDT par les β-lactamines est principalement régie par la réactivité du noyau β-lactame. Nous proposons que l'acylation des LDT par les β-lactamines implique la formation d'un intermédiaire, une amine anionique, suivie d'une étape irréversible qui est essentielle pour l'activité antibactérienne. Une approche par spectroscopie de fluorescence a été développée pour explorer les mécanismes d'inactivation et évaluer l'efficacité de nouvelles molécules. Nous avons également identifié une nouvelle famille de molécules, les diazabicyclooctanes (DBO), qui inactivent les LDT par la formation d'un thio-carbamoyl-enzyme. Nous discutons de plusieurs stratégies basées sur le mécanisme d’inactivation pour l’optimisation rationnelle d’inhibiteurs appartenant aux familles des β-lactamines et des DBO
Antibiotic resistance is a growing and global threat to human health that has led to an acute need for the development of new antibiotics. Elucidating the mechanism of inhibition of antibiotic targets is crucial for the development of more potent drugs. The essentiality of peptidoglycan and more than seventy years of successful use of β-lactams have made polymerization of this major cell wall component an attractive and validated target for drug development. Active-site serine Penicillin-Binding Proteins (PBPs) have long been considered as the only enzymes catalyzing the essential cross-linking step of peptidoglycan polymerization. The thesis explores inhibition of a distinct family of enzymes, the active-site cysteine L,D-transpeptidases (LDTs), that have a preponderant role in peptidoglycan synthesis in Mycobacterium tuberculosis. We show that the efficacy of LDT inhibition by β-lactams is primarily governed by the reactivity of the four-membered ring. We propose that acylation of LDTs by β-lactams proceeds through formation of an amine anion intermediate, followed by a subsequent irreversible step that is essential for the antibacterial activity of the drugs. A fluorescence spectroscopy approach enabling kinetic analyses of the acylation steps was developed to explore inactivation mechanisms and to evaluate the efficacy of new synthetic drugs. We also identify diazabicyclooctanes (DBOs) as new pharmacophores that inactivate LDTs by formation of a thio-carbamoyl-enzyme. We discuss several mechanism-based strategies for rational optimization of LDT inhibitors belonging to the β-lactam and DBO families

La résistance aux fluoroquinolones (FQ) est le principal facteur d'aggravation du pronostic de la tuberculose multi-résistante. Il apparait donc essentiel de mieux comprendre le développement de la résistance aux FQ afin d'améliorer les outils permettant une détection précoce de cette résistance. Nous avons (i) évalué les performances du séquençage des gènes gyrA et gyrB dans la détection de la résistance aux FQ grâce à une étude prospective menée au CNR-MyRMA ; (ii) étudié l'histoire naturelle de l'émergence de la résistance aux FQ in vivo dans un modèle murin de tuberculose et (iii) identifié de nouveaux mécanismes de résistance aux FQ par génomique comparative. Nous avons montré que la méthode des proportions, désignée comme méthode de référence, n'est pas performante pour la détection des bas niveaux de résistance aux FQ et que ni les méthodes génotypiques ni les méthodes phénotypiques, ne permettent le diagnostic de la résistance hétérogène aux FQ. Une stratégie combinée reposant sur une détection phénotypique d'une proportion anormale de bactéries résistantes et une caractérisation génotypique de ces bactéries résistantes permettrait d'améliorer la détection de cette résistance hétérogène. Nous avons identifié des pistes pour de nouveaux mécanismes de résistance aux FQ. Il pourrait s'agir de mécanismes responsables d'une résistance de bas niveau facilitant la sélection d'une résistance de haut niveau due à une mutation dans les gènes codant l'ADN gyrase dans un deuxième temps. Cependant, leur implication dans la résistance aux FQ, ainsi que notre hypothèse quant au processus de sélection, reste à démontrer
Fluoroquinolone (FQ) resistance is the main factor of worsened prognosis of multidrug resistant tuberculosis. Therefore to better understand the development of FQ resistance is essential in order to improve the tools for early detection of this resistance. We have (i) evaluated the performance of gyrA and gyrB sequencing in the detection of FQ resistance through a prospective study; (ii) studied the natural history of the emergence of FQ resistance in vivo using a murine model of tuberculosis; and (iii) identified tracks for new mechanisms of resistance to FQ by comparative genomics. We showed that the proportion method, designated as the reference method, is not effective in detecting low levels of FQ resistance and that, neither genotypic methods nor phenotypic methods, allow the diagnosis of FQ heterogeneous resistance. A combined strategy based on phenotypic detection of an abnormal proportion of resistant bacteria and genotypic characterization of these resistant bacteria would improve the detection of this heterogeneous resistance. We have identified hypotheses for new FQ resistance mechanisms. These new mechanisms could be responsible of a low-level resistance facilitating the selection of a high-level resistance due to mutations in genes encoding DNA gyrase in a second time. However, their involvement in FQ resistance and our assumption about the selection process remain to be demonstrated

La résistance aux fluoroquinolones (FQ) est le principal facteur d'aggravation du pronostic de la tuberculose multi-résistante. Il apparait donc essentiel de mieux comprendre le développement de la résistance aux FQ afin d'améliorer les outils permettant une détection précoce de cette résistance. Nous avons (i) évalué les performances du séquençage des gènes gyrA et gyrB dans la détection de la résistance aux FQ grâce à une étude prospective menée au CNR-MyRMA ; (ii) étudié l'histoire naturelle de l'émergence de la résistance aux FQ in vivo dans un modèle murin de tuberculose et (iii) identifié de nouveaux mécanismes de résistance aux FQ par génomique comparative. Nous avons montré que la méthode des proportions, désignée comme méthode de référence, n'est pas performante pour la détection des bas niveaux de résistance aux FQ et que ni les méthodes génotypiques ni les méthodes phénotypiques, ne permettent le diagnostic de la résistance hétérogène aux FQ. Une stratégie combinée reposant sur une détection phénotypique d'une proportion anormale de bactéries résistantes et une caractérisation génotypique de ces bactéries résistantes permettrait d'améliorer la détection de cette résistance hétérogène. Nous avons identifié des pistes pour de nouveaux mécanismes de résistance aux FQ. Il pourrait s'agir de mécanismes responsables d'une résistance de bas niveau facilitant la sélection d'une résistance de haut niveau due à une mutation dans les gènes codant l'ADN gyrase dans un deuxième temps. Cependant, leur implication dans la résistance aux FQ, ainsi que notre hypothèse quant au processus de sélection, reste à démontrer
Fluoroquinolone (FQ) resistance is the main factor of worsened prognosis of multidrug resistant tuberculosis. Therefore to better understand the development of FQ resistance is essential in order to improve the tools for early detection of this resistance. We have (i) evaluated the performance of gyrA and gyrB sequencing in the detection of FQ resistance through a prospective study; (ii) studied the natural history of the emergence of FQ resistance in vivo using a murine model of tuberculosis; and (iii) identified tracks for new mechanisms of resistance to FQ by comparative genomics. We showed that the proportion method, designated as the reference method, is not effective in detecting low levels of FQ resistance and that, neither genotypic methods nor phenotypic methods, allow the diagnosis of FQ heterogeneous resistance. A combined strategy based on phenotypic detection of an abnormal proportion of resistant bacteria and genotypic characterization of these resistant bacteria would improve the detection of this heterogeneous resistance. We have identified hypotheses for new FQ resistance mechanisms. These new mechanisms could be responsible of a low-level resistance facilitating the selection of a high-level resistance due to mutations in genes encoding DNA gyrase in a second time. However, their involvement in FQ resistance and our assumption about the selection process remain to be demonstrated

Mycobacterium abscessus est une bactérie environnementale non-tuberculeuse causant des infections pulmonaires sévères chez les patients atteints de mucoviscidose. Sa résistance intrinsèque aux antibiotiques rend les infections à M. abscessus extrêmement difficiles à traiter. Ses mécanismes de résistance sont variés et incluent des pompes à efflux expulsant les antibiotiques ainsi que des enzymes modifiant leurs cibles. La trithérapie standarde contre M. abscessus implique un aminoglycoside (amikacine (AMK)), une -lactamine (imipénème (IPM)) et un macrolide (clarithromycine (CLR) ou azithromycine (AZM). Ma thèse a porté sur la régulation de nouveaux mécanismes d’antibiorésistance via des pompes à efflux de la famille MmpL ainsi que sur une enzyme modifiant la cible des macrolides. La sélection de mutants résistants aux dérivés du thiacétazone (TACd) et à la clofazimine (CFZ) a permis d’identifier des mutations dans les régulateurs TetR MAB_4384 et MAB_2299c, respectivement. Les mutants CFZ, également co-résistants à la bédaquiline (BDQ), surexpriment deux MmpS/MmpL distincts, MAB_1135c/1134c et MAB_2300/2301 tandis que les mutants TACd surproduisent le système MmpS/MmpL MAB_4383c/4382c. Des approches biochimiques, génétiques et structurales ont confirmé le rôle de ces protéines dans la résistance à ces composés et ont permis de disséquer le mode de régulation. Ainsi, MAB_2299c représenterait un marqueur de résistance à exploiter chez des patients traités par CFZ ou BDQ. La méthyltransférase Erm(41) modifie l’adénosine 2058 de l’ARNr 23S du ribosome, bloquant l’action des macrolides. WhiB7 serait l’activateur de cette résistance inductible observée chez 40% des isolats cliniques, conduisant souvent à l’échec thérapeutique. Nous avons confirmé le rôle de WhiB7 dans ce mécanisme et montré que la résistance inductible opérait in vivo chez le modèle zebrafish. Nos résultats indiquent que l’AZM induit une résistance plus rapide et forte que la CLR in vitro et qu’elles exercent un effet antagoniste sur l’AMK, réduisant l’efficacité du traitement. Ces travaux décrivent l’export d’antibiotique via des MmpL et la résistance adaptative aux macrolides chez M. abscessus. Enfin, ils apportent des nouveaux outils génétiques performants pour étudier la fonction de protéines d’intérêt via une nouvelle technique de délétion génique et pour tester rapidement de nouveaux antibiotiques contournant la résistance induite aux macrolides
Mycobacterium abscessus is an environmental non-tuberculous mycobacteria causing severe lung infections in cystic fibrosis patients. Its intrinsic resistance to antibiotics renders treatments extremely challenging. This pathogen has developed a wide panel of strategies to resist to antibiotics, including efflux pumps and target-modifying enzymes. Standard antibiotherapy combines an aminoglycoside (amikacin (AMK)), -lactams (imipenem (IPM)) and macrolides (clarithromycin (CLR) or azithromycin (AZM)). My thesis was focusing on the regulation of antibiotic resistance mechanisms involving efflux pumps from the MmpL family as well as an enzyme modifying the macrolide target. Selection of resistant mutants against thiacetazone derivatives (TACd) and clofazimine (CFZ) unraveled mutations in the TetR regulators MAB_4384 and MAB_2299c, respectively. The CFZ-mutants, also co-resistant to bedaquiline (BDQ), overexpress two distinct MmpS/MmpL, MAB_135c/1134c and MAB_2300/2301 while the TACd mutants overproduce the MAB_4383c/4382c efflux pump. Biochemical, genetic and structural approaches confirmed their involvement in drug resistance mechanisms. MAB_2299c could therefore represent a potential resistance marker to monitor in strains isolated from patients under CFZ/BDQ therapy. The methyltransferase Erm(41) modifies the adenosine 2058 of the ribosomal 23S rRNA, protecting the ribosome from the macrolides. WhiB7 may represent a major actor in inducible resistance, observed in 40% of clinical cases, often leading to treatment failure. We confirmed the role of WhiB7 in this process and showed that inducible resistance occurred also in vivo in the zebrafish model. Our data suggest that AZM is a stronger and faster resistance inducer than CLR in vitro and that both drugs show antagonism with AMK, thus reducing drugs’ efficacy. This work enriched our knowledge regarding both MmpL-mediated and macrolides inducible resistance mechanism against M. abscessus. It also provides new efficient tools to investigate the function of proteins through a novel unmarked gene deletion approach and to rapidly assay new antibiotics to counteract inducible macrolide resistance

Le complexe Mycobacterium abscessus (MABSC) fait partie des mycobactéries non tuberculeuses. C’est un pathogène opportuniste environnemental pouvant causer des infections pulmonaires chroniques, en particulier chez les patients atteints de mucoviscidose, et extra-pulmonaires sévères. Il est également résistant à la plupart des antibiotiques, et ne connait pas de traitement efficace. Il se divise en trois sous-espèces : Mycobacterium abscessus subsp. abscessus, Mycobacterium subsp. massiliense et Mycobacterium subsp. bolletii, Ces trois sous espèces possèdent des différences cliniques et de résistance aux antibiotiques, une identification sûre et rapide est don essentielle. De plus, son épidémiologie reste peu connue, notamment au sein des patients atteints de mucoviscidose.Dans un premier temps, nous avons évalué la performance d’identification au sein du MABSC et la caractérisation des principales résistances du kit Genotype NTM-DR. Celui-ci s’est révélé extrêmement efficace, avec une réussite de 100% d’identification de la sous-espèce mais aussi pour la caractérisation des résistances à la clarithromycine et à l’amikacine, qui sont les antibiotiques recommandés pour le traitement d’une infection à MABSC. Ce kit est donc une alternative rapide et robuste aux principales méthodes d’identification et de caractérisation de la résistance chez MABSC.Dans un second temps, nous avons testé l’efficacité de deux molécules différentes, la clofazimine et la tigecycline, en synergie. Une synergie a pu être mise en évidence sur 42 % des isolats, et la présence de clofazimine a permis d’abaisser la concentration minimale inhibitoire de la tigecycline pour 52 % des isolats. Cette association pourrait constituer une alternative thérapeutique efficace et mieux supportable pour le patient.Enfin, nous avons réalisé deux études épidémiologiques : au Vietnam, chez des patients possédant une condition pulmonaire inflammatoire, et en France, chez des patients atteints de la mucoviscidose dans cinq centres hospitaliers différents. En France, un suivi longitudinal a pu être réalisé sur 7 patients de deux centres différents.Le Vietnam présentait un grand nombre de Sequence Type (ST) nouveaux (29/38) ainsi qu’une grande diversité génotypique (0.72 pour 53 isolats). Une majorité de M. massiliense a été mis en évidence. De plus, des ST responsables d’épidémies dans différents pays ont aussi été retrouvés (ST 23 et ST 117). Trois complexes clonaux ont été identifiés, reflétant la grande diversité du complexe M. abscessus dans ce pays. Deux de ces complexes clonaux étaient constitués de M. abscessus subsp. massiliense contenaient les ST 23 et 117. Le grand nombre de nouveaux génotype est dû au manque de données au Vietnam, il s’agit là de la première étude épidémiologique dans ce pays.En France, on retrouvait un plus grand nombre de sequence type connus (20/31), certainement dû au nombre d’études existantes dans cette région. Une majorité de M. abscessus subsp. abscessus a été retrouvé. Sept sequence type d’importance épidémiologique ont été retrouvés, dont le ST 23. Le suivi longitudinal montre que : le risque d’infection exogène est grand ; le pool de génotypes à Brest est plus important qu’à Montpellier, même si les ST persistent chez un même patient, on ne peut exclure le risque d’une infection exogène. Enfin, l’analyse VNTR des isolats des cinq centres suggère une possible transmission nosocomiale ainsi que la diffusion de génotypes en France.En conclusion, ce travail de thèse a permis d’améliorer l’approche de l’identification et du traitement des infections du complexe M. abscessus, en plus d’explorer et de comparer son épidémiologie dans deux populations différentes. Nous montrons la présence ubiquitaire de certains génotypes d’importance cliniques, une grande diversité génotypique, une variabilité du portage chez le patient mucoviscidose ainsi qu’un risque d’infections exogènes et de transmission chez cette population
The Mycobacterium abscessus complex is a nontuberculous mycobacteria. It is an environmental opportunistic pathogen that can cause chronic lung infections, especially in patients with cystic fibrosis, and severe extra-pulmonary infections. It is also resistant to most antibiotics, and does not have an effective treatment. It is divided into three subspecies: Mycobacterium abscessus subsp. abscessus, Mycobacterium subsp. massiliense and Mycobacterium subsp. bolletii, These three subspecies have clinical and antibiotic resistance differences, Thus, a safe and rapid identification is essential. In addition, little is known about its epidemiology, particularly among patients with cystic fibrosis.First, we assessed the identification performance within the M. abscessus complex and the characterization of the main resistances of a commercial assay (Genotype NTM-DR). The kit was highly efficient, with 100% success in identifying the subspecies and also in characterizing resistance to clarithromycin and amikacin, which are the recommended antibiotics for the treatment of complex M. abscessus infection. This kit is therefore a fast and robust alternative to the main methods for identifying and characterizing resistance in the M. abscessus complex.Secondly, we tested the efficacy of two different molecules, clofazimine and tigecycline, in synergy. Synergy was demonstrated in 42% of the isolates, and the presence of clofazimine reduced the minimum inhibitory concentration of tigecycline in 52% of the isolates. This combination could be an effective and more tolerable therapeutic alternative for the patient.Finally, we carried out two epidemiological studies: in Vietnam, in patients with inflammatory lung disease, and in France, in patients with cystic fibrosis in five different hospitals. In France, longitudinal follow-up was carried out on 7 patients from two different centres, Brest and Montpellier. Two different typing tools were used: MLST and VNTR.Vietnam had a large number of new Sequence Type (ST) (29/38) and a high genotypic diversity (0.72 for 53 isolates). A majority of M. abscessus subsp. massiliense was found. In addition, STs responsible for epidemics in different countries have also been found (ST 23 and ST 117). Three clonal complexes have been identified, reflecting the great diversity of the M. abscessus complex in this country. Two of these clonal complexes were composed of M. abscessus subsp. massiliense containing ST 23 and 117. The large number of new genotypes is due to the lack of data in Vietnam, this is the first epidemiological study in this country.In France, there was a greater number of known sequence type (20/31), certainly due to the number of existing studies in this region. A majority of M. abscessus subsp. abscessus was found. Seven sequence type of epidemiological importance were found, including ST 23. Longitudinal monitoring shows a high variability of the ST in Brest compared to Montpellier, which is confirmed by the VNTR. This follow-up shows that: the risk of exogenous infection is high; the genotype pool in Brest is greater than in Montpellier, even if STs persist in the same patient, the risk of exogenous infection cannot be excluded. Finally, the VNTR analysis of isolates from the five centres suggests possible nosocomial transmission and the spread of genotypes in France.In conclusion, this thesis work has improved the approach to the identification and treatment of M. abscessus complex infections, as well as exploring and comparing its epidemiology in two different populations. We show the ubiquitous presence of certain clinically important genotypes, a high genotypic diversity, a variability in carrying in the cystic fibrosis patient as well as a risk of exogenous infections and transmission in this population

Dans la première partie de ma thèse nous nous sommes intéressés à l'étude de la résistance de M. Abscessus aux antibiotiques de la famille des aminoglycosides. Nous avons démontré la présence de quatre différentes mutations dans i la partie 3'du gène rrs (T1406A, A1408G, C1409T and G1491T) qui code pour TARN 16S de l'opéron ARNr, et qui est présent en une seule copie chez M. Abscessus. Ces mutations conféraient un niveau élevé de résistance (>1 mg/ml) aux 2 deoxystreptamine aminoglycosides testés (kanamycine, amikacine, gentamycine et tobramycine) mais ne conférait pas de résistance à la streptomycine. Nous avons ensuite démontré le caractère récessif de ces mutations après avoir clone les différents gènes rrs mutés indépendamment dans les quatre positions (T1406A, A1408G, C1409T et G1491T) dans le vecteur réplicatif pNBVl-ZeoR et avoir transformé la souche sauvage de M. Abscessus. Dans un dernier point nous nous somme intéressés à l'étude de coût conféré par ces mutations parraport à la croissance de M. Abscessus, phénomène assez fréquent chez les bactéries multi-résistantes à plusieurs antibiotiques. Nos résultats montrent que dans nos conditions expérimentales les mutations ne conféraient pas de « coût » à la croissance de la bactérie. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'ai mis au point un procédé dans le système de mutagénèse utilisé pour la construction de mutants chez M. Abscessus (système de recombineering adapté pour M. Abscessus par Dr Medjahed Halima, et qui a fait l'objet de sa thèse), ce procédé permettait de s'affranchir des isolats spontanés rencontrés. Ces outils m'ont permis de construire un mutant du gène mmpL4b dans la souche isogénique M. Abscessus 390S. Ce gène joue potentiellement un rôle dans le transfert des glycopeptidolipides (GPL) vers la surface cellulaire de la bactérie, la souche mutante M. Abscessus AmmpL4b présente un phénotype rugueux, alors que la souche sauvage possède un phénotype lisse. La complémentation par le gène sauvage mmpL4b restaure le phénotype muqueux de la souche sauvage M. Abscessus 390S(S). Ensuite j'ai montré que la souche M. Abscessus ΔmmpL4b perdait la faculté de se mouvoir par glissement sur milieu solide. Le mutant M. Abscessus ΔmmpL4b ainsi que la souche complémentée ont été utilisées dans le cadre d'une collaboration avec l'équipe de Dr Thomas F Byrd (New-Mexico, USA), cette équipe a montré que le mutant M. Abscessus ΔmmpL4b était incapable de former des biofilmes contrairement à la souche sauvage et à la souche complémentée par le gène sauvage ΔmmpL4b. En outre, cette équipe a démontré le rôle des glycopeptidolipides (GPL) dans la virulence de M. Abscessus au niveau cellulaire. En effet, les résultats obtenus montrent que la souche M. Abscessus ΔmmpL4b (qui produit un taux faible de GPL) pouvait se répliquer dans les macrophages et à stimuler le récepteur toll-like 2 des macrophages (TLR2), alors que les souches sauvage et complémentée n'activaient pas le récepteur TLR2 des macrophages
My thesis work was focused on the study of M. Abscessus resistance to aminoglycoside drugs, including kanamycin, amikacin gentamycin and streptomycin. In this study, we reported the presence of four mutations affecting the gene coding for the 16S rRNA (rrs) within a single rRNA operon, these mutations conferred drugs résistance to M. Abscessus. Besides the substitution A1408G (E. Coli numbering) found in earlier study i found three new substitutions T1406A, ; C1409T and G1491T conferring high level résistance to kanamycin, amikacin and gentamycin (MICs > 1000 ug/ml) but not to streptomycin. These mutations were shown to confer the same drugs résistance profil in clinical isolates of M. Tuberculosis (7). On the other hand, by complementing the different spontaneous mutants of M. Abscessus with wild-type rrs gene cloned into replicative plasmid pNBVl, l showed that these mutations are recessive compared to the wild type rrs gene. The absence of the three new mutations found in this study in clinical isolates of M. Abscessus, led us to consider their potential fitness cost. Our data showed that these mutations are no-cost (the mutations have no effect on the fitness of M. Abscessus) in our in-vitro competition System. This work lead to a publication submitted to Antimicrobial Agents and Chemotherapy journal this month. Another part of my project concerns the optimization of the recombineering System; this System was successfully used in M. Abscessus to generate mutants. However its low effkiency (7% of double cross over DCO) led us to develop a better System in order to improve the method. Three major phenomenons are responsible for the low level of the double cross-over (DCO) event in M. Abscessus : singles cross over (SCO), illegitimate recombination and the presence of spontaneous kanamycin resistant isolates. I have replaced the antibiotic résistance cassette kanamycin by zeocin (a Bleomycin family of antibiotic) in order to suppress the spontaneous background, in the linear construct used to make the homologous recombination; our System improved the method (15-20 % of double cross-over). In the final part of my project I have constructed by using the optimized recombineering System a mutant in mmpL4b gene in 390S isogenic strain of M. Abscessus and have complemented this M. Abscessus mmpL4b knock out strain by cloning the gene mmpL4b into replicative vector pNBVl and transforming the mutant strain with the construct pNBVl mmpL4b. The product of this gene is predicted to be involved in the transport of GPL to the cell surface. The mutant has rough phenotype (deprived from glycopeptidolipids (GPL) at the cell surface) the complemented strain has a smooth phenotype like the wild-type M. Abscessus 390S strain. I have shown that unlike the wild type and complemented strains, The mmpL4b deletion mutant lost sliding motility, demonstrating a role of the glycopeptidolipids in conferring motility. In collaboration with Dr Thomas F Byrd's group, we have shown that the M. Abscessus 390S mmpL4b knock out strain lost the ability to form biofilm. Importantly, the deletion mutant has regained the ability to replicate in macrophage and stimulate macrophage toll-like receptor 2. This study indicates that a single genetic change associated with loss of GPL is sufficient to convert M. Abscessus to a virulent phenotype. This study lead to a publication submitted this month to Microbiology Journal

Tuberculosis (TB) is a potentially fatal contagious disease that can affect almost any part of the body but is mainly an infection of the lungs. It is caused by micro-organisms of the Mycobacterium tuberculosis complex. It is the second greatest killer worldwide due to a single infectious agent, after the Human Immunodeficiency Virus (HIV). Without treatment, fatality is 50% in immune competent persons. TB remains the leading cause of death among HIV positive persons, causing one fifth of the deaths. The World Health Organization estimates that one third of the world population is infected by this micro-organism but only 5 to 10% develop TB disease. Nevertheless, this enormous reservoir leads to around 1.4 millions deaths annually. Standard curative treatment lasts at least 6 months and includes 4 different drugs. Toxicity of the drugs leading to (severe) adverse events and the long duration of the daily administration challenges patient’s compliance. Subinhibitory concentration of the drugs (due to poor adherence) can induce resistance of the mycobacteria to the provided drugs. Unlike most bacteria where resistance is acquired by plasmids, drug resistance of mycobacteria is obtained by genomic mutations. “Multi drug-resistant tuberculosis (MDR-TB)” is strictly defined as TB resistant to specifically isoniazid and rifampicin, the two main first line drugs. “Extensively drug resistance (XDR)” is defined as MDR-TB with additional resistance to any of the fluoroquinolones (such as ofloxacin or moxifloxacin) and to at least one of three injectable second-line drugs (amikacin, capreomycin or kanamycin). The increase of MDR-TB represents an enormous challenge to Public Health globally. This research examined different aspects of tuberculosis resistance performed in the Belgian National Reference Center, a clinical laboratory setting.

First of all, a profound analysis of the MDR-TB situation in Belgium was conducted. It is the first retrospective population-based survey of MDR-TB in Belgium, covering a 15-year period (1994-2008). It comprises 174 patients representing more than 80% of the culture positive MDR-TB patients reported to the Belgian register, thus this study is considered of national relevance. It includes bacteriological and molecular data on the isolates as well as clinical aspects of the patients and treatment results. Considering only the patient’s first MDR-TB isolate, an increase over time was observed in the number of isolates resistant to a second-line drug as well as the total number of drugs each isolate was resistant to. XDR-TB was detected since 2002 and panresistant TB (resistant to every available antituberculosis drug) since 2009. Overall, a successful treatment outcome was obtained for 67.8% of the MDR-TB cases. Drug susceptibility testing (DST) of Mycobacterium tuberculosis to first line drugs (isoniazid, rifampicin, ethambutol and pyrazinamide) in liquid culture medium has a turn around time of at least two weeks, after identification of the positive culture (obtained after 2 to 4 weeks) from the patient’s clinical isolate. In order to provide the clinician with valuable information about the isolated mycobacteria leading to patient adapted therapy before bacteriological DST results are available, resistance is predicted by detection of mutations in certain genes of the mycobacteria. It is common practice for rifampicin (rpoB gene) and isoniazid (katG gene and/or inhA promoter region). In this MDR-TB collection, rifampicin resistant related mutations were found in 97.1% (168/173) of the clinical isolates and isoniazid resistant related mutations in 94.1% (160/170). The pncA, embB and gyrA genes have been sequenced to identify possible mutations because of their possible involvement with resistance to pyrazinamide, ethambutol and the fluoroquinolones respectively. However, little is known about the resistance prediction value of the mutations in these genes.

The study is also the first study on the molecular epidemiology of MDR-TB in the country. DNA fingerprinting showed a large diversity of strains (67% of the patients were infected by a strain with a unique pattern) and further epidemiological examination revealed limited local transmission of MDR-TB in Belgium.

The second part investigated the pncA gene and its association with pyrazinamide resistance in MDR-TB isolates from Belgium and in vitro cultured spontaneous mutants. The genetic analysis showed that 98.3% (59/60) of the Belgian clinical MDR pyrazinamide resistant (PZAR) isolates present a mutation in the pncA gene. We found 1.7% (1/60) of the PZAR MDR-isolates encoding wild type pncA and flank. A total (PZAR and PZAS) of 41 different amino acid changes, 3 protein truncations and 5 frameshifts were observed including eight novel mutations: 8Asp>Ala, 13Phe>Leu, 64Tyr>Ser, 107Glu>stop, 143Ala>Pro, 172Leu>Arg and frameshifts starting in codon 55 and 82. Analysis of all observed mutations (i.e. in clinical isolates as well as spontaneous mutants) revealed that they are not always associated with drug resistance and that they are not scattered randomly throughout the gene, but occur rather at preferential sites such as in codons with amino acids associated with either iron or substrate binding and catalytic active sites. The frequency of in vitro mutagenesis to pyrazinamide at pH 6.0 was determined and found to be relatively high at 10-5 CFU/ml.

Finally, the in vitro activity of tobramycin and clarithromycin (with unclear efficacy against M. tuberculosis) was evaluated on 25 M. tuberculosis clinical isolates with various resistance profiles. The effect of the drugs administered together was examined for possible synergistic effect. The median minimum inhibitory concentration (MIC) of 8 µg/ml obtained for both drugs in this study is rather high but are beyond the concentrations obtained in lung tissues. This suggests that both drugs should be investigated further as potential adjuncts to the treatment of resistant TB when other alternatives have failed; in particularly through new drug delivery systems such as the Dry Power Inhaler which allows local drug deposition with high drug concentrations in the lungs but low toxicity due to limited systemic absorption. In addition, for 36% of the tested isolates a decrease of the MIC of clarithromycin by a single or twofold dilution was observed in the presence of a subinhibitory concentration of tobramycin and no antagonistic effect was seen for the remaining isolates.

This research illustrates different (laboratory) aspects in the fight against drug resistant TB, all using the Belgian TB collection: characterisation of the Belgian MDR-TB situation on bacteriological, molecular and epidemiological level; profound analysis of genomic mutations and their possible association with drug resistance; and investigation of synergistic activity of drugs with low efficacy against M. tuberculosis.

Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
info:eu-repo/semantics/nonPublished

Nous avons réalisé l'étude de la résistance à la clarithromycine chez Mycobacterium abscessus. Cette mycobactérie est responsable d'infections pulmonaires chroniques, en particulier chez les patients atteints de mucoviscidose, et d'infections extra-pulmonaires le plus souvent iatrogènes. M abscessus est très résistant aux antibiotiques et le traitement efficace n'est pas encore connu. Après avoir synthétisé les données de la littérature sur les mycobactéries non tuberculeuses dont M abscessus Nous avons étudié le génotypage de M abscessus par REP-PCR standardisée DiversiLab® et montré que les malades étaient infectés par des souches différentes mais qu'un malade atteint de mucoviscidose conservait la même souche au cours du temps. L'étude par spectrométrie de masse MALDI-TOF a permis de distinguer les sous-espèces de M abscessus. Nous avons étudié la résistance à la clarithromycine chez M abscessus avec deux approches: l'une descriptive sur des souches cliniques (nous y avons ajouté l'étude de la résistance aux autres antibiotiques dont l'amikacine), l'autre expérimentale par sélection de mutants in vitro. Nous avons pu décrire de nouveau, mécanismes de résistance. La majorité des mutants et des souches cliniques résistantes à la clarithromycine avaient des mutations de l'ARNr 23S ou des protéines ribosomales. La résistance naturelle ou inductible était due au polymorphisme du gène erm(41). Ces données nous ont permis de développer un prototype de test moléculaire diagnostique (collaboration avec Hain LifeScience, GenoType NTM-DR). Nous avons évalué ce test avec des résultats de performance très satisfaisants
This work focuses on phenotypic and genotypic characterization of clarithromycin resistance in Mycobacterium abscessus. This nontuberculous mycobacteria is causing infections in patients with chronic lung diseases, especially cystic fibrosis, and extra-respiratory diseases usually in a iatrogenic context. M abscessus is extremely resistant to most available antibiotics with no standard effective treatment so far. First, we reviewed current literature for nontuberculous mycobacteria and M abscessus infections. We studied M abscessus genotyping by a semi-automated REP-PCR DiversiLab® and showed that each patient is infected by a different strain but a cystic fibrosis patient is infected by the same strain over time. MALDI-TOF mass spectrometry (MS) study permits to distinguish subspecies of M abscessus. We studied clarithromycin resistance mechanisms for M abscessus with two approaches: one descriptive including clinical strains (we studied also resistance to other antibiotics especially amikacin, second important antibiotic), the other done through in vitro mutant selection. We described new resistance mechanisms. The majority of mutants and resistant clinical strains had mutations of 23S rRNA or in ribosomal proteins. Natural inducible resistance was due to erm(41) gene polymorphism. Knowledge of resistance mechanisms to clarithromycin and amikacin allowed us to develop a molecular diagnostic test prototype, with Hain LifeScience (GenoType NTM-DR). The clinical evaluation in our laboratory gave highly satisfactory results. This test is now commercially available. We have developed new tools for diagnosis and epidemiological surveillance of M abscessus infection

Mycoplasma (M.) bovis est une bactérie pathogène des bovins, à l'origine de signes cliniques divers, comme des mammites, des arthrites, des otites et des bronchopneumonies, ces dernières étant majoritaires en France. Les mycoplasmoses à M. bovis ont un fort coût économique et leur contrôle impose une importante mobilisation sanitaire et un recours très fréquent à l'antibiothérapie. Peu de données étaient disponibles jusque récemment concernant le typage moléculaire et l'antibiosensibilité des souches françaises de M. bovis. Deux études antérieures à ce travail et réalisées au sein de l'UMR « Mycoplasmoses des ruminants » ont montré que les isolats cliniques de M. bovis collectés en France après 2000 appartiennent à un sous-type moléculaire majoritaire (ST2), très homogène et sont par ailleurs multirésistants à la plupart des familles antibiotiques à l'exception des fluoroquinolones. Ces résultats suggèrent la diffusion sur le territoire national d'un clone unique multirésistant. Le premier objectif de cette étude était de déterminer les mécanismes à la base de la perte de sensibilité aux antibiotiques des isolats français. Dans un deuxième temps, les liens entre les différents sous-types moléculaires, les profils d'antibiosensibilité, les maladies associées et le polymorphisme des gènes cibles des antibiotiques ont été investigués. Cette approche a été déployée pour trois familles d'antibiotiques utilisées en pratique vétérinaire: les macrolides, les tétracyclines et également les fluoroquinolones, quoique récemment classées comme molécules critiques. De façon générale, les mutations identifiées dans les cibles des antibiotiques expliquent à elles seules les phénotypes de résistance observés. Des mutations dans les ARNs ribosomaux, cibles des macrolides et des tétracyclines, ont été observées sur des isolats cliniques dès 1978 et sont devenues systématiques sur tous les isolats collectés après 2000 et appartenant au sous-type ST2 majoritaire. En ce qui concerne les fluoroquinolones, la faible augmentation des CMI (concentrations minimales inhibitrices) mesurée chez la plupart des isolats cliniques récents n'a pas été associée à des mutations des QRDR (« Quinolones Resistance-Determining Regions »). Par contre, des altérations cumulées de façon séquentielle dans ces QRDR, associées à une hausse des CMI, ont été mises en évidence lors d'expériences de sélection in vitro et majoritairement pour des souches appartenant à un sous-type récent minoritaire, ST3, apparemment plus variable et plus apte à fixer les mutations. En 2013, le premier isolat clinique présentant une CMI augmentée aux fluoroquinolones a été isolé: il appartient à ce sous-type ST3. L'ensemble des résultats obtenus montrent que les différents sous-types de M. bovis n'évoluent pas de la même façon vers la résistance. Ce constat ajouté à celui de la multirésistance des isolats récents (ST2 ou ST3) met en exergue l'intérêt de la surveillance (sous-typage et antibiosensibilité) et le suivi de l'évolution des isolats de M. bovis circulant en France. Ce suivi permettrait notamment d'anticiper une éventuelle émergence de la résistance aux fluoroquinolones
Mycoplasma (M.) bovis is a bacterial pathogen for cattle, responsible for various clinical signs, like mastitis, arthritis, otitis and respiratory diseases, the latter being the main syndrome present in France. Mycoplasmoses have a great economic impact and their control entails drastic sanitary measures and a frequent use of antibiotherapy. Few data was available until recently on the molecular subtyping and the antimicrobial susceptibility of the French strains of M. bovis. Two previous studies done in the UMR « Mycoplasmoses des ruminants » proved that clinical isolates collected in France after the year 2000 belonged to one major subtype (ST2), which is very homogeneous, and that they were multiresistant to the main antimicrobial families except fluoroquinolones. These results suggested the diffusion of one unique multiresistant clone on the national territory. The first aim of the present study was to decipher the molecular mechanisms underlying the loss of susceptibility to antimicrobials of the French strains. Secondly the links between the molecular subtypes, the antibiotics susceptibility profiles, the clinical origins and the polymorphisms of the target genes were assessed. This approach was used for 3 antimicrobial families currently used in veterinary medicine: macrolides, tetracyclines and fluoroquinolones, although recently classified as critical. Actually, the point mutations observed in the target genes of the antimicrobials accounted for the observed resistance phenotypes. Some mutations in the ribosomal RNAs, targets of the macrolides and the tetracyclines, were observed in clinical isolates as soon as 1978 and they were generalized in all isolates collected after 2000 and belonging to the major subtype ST2. Concerning the fluoroquinolones, the slight increase in MIC (Minimum Inhibitory Concentration) observed in most of the recent isolates was not associated with mutations in the QRDR (Quinolone Resistance-Determining Regions). However alterations that were associated with increased MICs were highlighted and proved to be sequentially cumulated during experiments of in vitro selection under antimicrobials pressure. This was mainly true for strains belonging to a recent and uncommon subtype, ST3, which is apparently more variable and more able to fix the mutations. In 2013 the first clinical strain showing an increased MIC to fluoroquinolones was isolated and proved to belong to ST3. The whole results of this study showed that the different subtypes did not evolve with the same speed towards resistance. This fact, associated with the multiresistant phenotype of the recent isolates (ST2 or ST3), highlights the urge to monitor (subtyping and antimicrobial susceptibility profiles) and to follow-up the evolution of the isolates of M. bovis circulating in France in order to anticipate a potential emergence of the resistance to fluoroquinolones

La détection de Mycobacterium tuberculosis (M. Tb) par le système immunitaire inné fait intervenir différents récepteurs appelés "Pattern Recognition Receptor " (PRR), parmi lesquels on trouve des récepteurs "Toll-like" (TLR1, 2, 4, 8 et 9), NOD2, ainsi que des lectines de type C, telles que le Récepteur au Mannose (RM) et DC-SIGN. L'action concertée de ces récepteurs se traduit d'une part, par la phagocytose des mycobactéries, et d'autre part, par l'activation de voies de signalisation intracellulaires, aboutissant à la translocation de facteurs de transcription nucléaires (notamment NF-kB et AP-1) et à l'expression et la régulation de gènes codant pour des cytokines et des chimiokines. Cependant, M. Tb est capable d'inhiber la réponse immune innée, notamment la réponse inflammatoire, favorisant ainsi sa survie dans les macrophages infectés. Dans ce contexte, mes travaux ont consisté à explorer les mécanismes moléculaires utilisés par le bacille pour inhiber la réponse immune innée, en me focalisant plus particulièrement sur les composés immunomodulateurs de nature (glyco)lipidique de l'enveloppe. La stratégie a consisté à cribler une banque d'environ 11 000 mutants de transposition de M. Tb sur la lignée macrophagique humaine THP-1 exprimant un système rapporteur de l'activation de NF-kB. Cette lignée exprime la plupart des PRRs impliqués dans la détection de M. Tb: TLR2, 4, 9, Récepteur au Mannose, DC-SIGN, Mincle, NOD2. A l'issue de ce criblage et des étapes de validation, un mutant, dont le gène mmpL8 est interrompu, a été sélectionné pour une étude approfondie car : i) il induit une activation de NF-kB supérieure à la souche sauvage et est donc susceptible d'être affecté dans un mécanisme d'inhibition utilisé par M. Tb, et ii) il est altéré pour la biosynthèse de glycolipides spécifiques de M. Tb, les sulfolipides, composés suspectés d'être impliqués dans la virulence du bacille. Nous nous sommes attachés à déterminer par quels mécanismes moléculaires et cellulaires les sulfolipides sont capables d'exercer cette inhibition. Une étude des relations structures/fonctions des sulfolipides pour leurs propriétés inhibitrices et l'utilisation de différents modèles cellulaires, nous ont permis de montrer que les sulfolipides agissent comme antagonistes de TLR2, inhibant ainsi les voies de signalisation associées à ce récepteur. Nous avons ainsi pu mettre en évidence un nouveau mécanisme d'inhibition de la réponse cellulaire par M. Tb impliquant les sulfolipides mycobactériens et le récepteur TLR2
Mycobacterium tuberculosis (M. Tb) detection by innate immune system involves different receptors called, Pattern Recognition Receptors (PRRs), which include: Toll-like receptors (TLR1, 2, 4, 8 and 9), NOD2, and C-type lectins such as the mannose receptor (MR) or DC-SIGN. The concerted action of these receptors results in the phagocytosis of mycobacteria and activation of intracellular signaling pathways, leading to nuclear translocation of transcription factors (such as NF-kB and AP -1) inducing genes expression and regulation of cytokines and chemokines. However, M. Tb is also able to inhibit the innate immune response, most particularly the inflammatory response, thus promoting its survival in infected macrophages. In this context, my work was aimed at deciphering the mechanisms used by M. Tb to inhibit the innate immune response, by focusing on immunomodulatory (glyco)lipids of the bacilli envelope. The strategy consisted in screening a library of about 11,000 transposition mutants of M. Tb on a human THP-1 macrophage cell line expressing a reporter system for NF-kB activation. This cell line expresses most of the PRRs involved in the detection of M. Tb: TLR2, 4, 9, mannose receptor, DC-SIGN, Mincle, NOD2. After the screening and validation steps, a mutant disrupted in the mmpL8 gene was selected for further study because: i) it induced an increased NF-kB activation as compared to the wild-type strain and was thus likely to be affected in an inhibition mechanism used by M. Tb, and ii) it was altered for the biosynthesis of M. Tb specific glycolipids, namely sulfolipids, which suspected to be involved in the bacilli virulence. We investigated by which molecular and cellular mechanisms sulfolipids were able to inhibit the innate immune response. By performing the structures/activities relationships study of sulfolipids inhibitory properties and using different cell models, we were able to show that sulfolipids act as TLR2 antagonists, thereby inhibiting the signaling pathways associated to this receptor. In conclusion, we highlighted a new inhibitory mechanism of innate immune response, involving M. Tb mycobacterial sulfolipids and TLR2

Actuellement, le problème des résistances aux antibiotiques est devenu une inquiétude majeure pour la santé publique. Leur développement depuis l’âge d’or des antibiotiques a contribué à la mise sur le marché d’une grande variété de familles d’antibiotiques notamment dans la lutte contre les souches bactériennes de type mycobactérie, pneumocoques, staphylocoques etc. Les infections bactériennes pathogènes représentent cependant toujours un souci urgent de santé publique dû à l’apparition de résistances aux principes actifs que l’on utilise contre elles. Il devient donc vital d’explorer de nouveaux antibiotiques capables de rester efficaces même contre des infections bactériennes résistantes ou multi-résistantes. Dans ce manuscrit, il est décrit la synthèse d’analogues nucléosidiques innovants selon l’approche du DOS pour explorer l’espace chimique des Mur ligases en tant que nouvelles cibles multiples. Le développement d’une nouvelle méthodologie de synthèse pour accéder au pseudo-sucre cyclopentanone des carbanucléosides a été initié ainsi que la synthèse d’un analogue carbocyclique issu d’une chimiothèque virtuelle. Une autre chimiothèque d’hétérocycliques de type indolique a été synthétisée contre les Mur ligases. Pour cela, nous nous sommes appuyés sur des réactions de cycloaddition catalysées au cuivre (CuAAC) permettant une synthèse orientée vers la diversité moléculaire. De même, l’exploration synthétique pour obtenir le pseudo-sucre carbanucléosidique, nous avons utilisé la réaction de cyclisation par une activation C-H allylique catalysée au palladium. Ces nouveaux composés se sont révélés être inhibiteurs multiples de Mur Ligases issues de Mycobacterium tuberculosis
Last decade, a growing problem of antibiotic resistance has become true worries for public health. Since the golden age of antibiotics, their development contributed to improve new marketing active compounds with large broad structural varieties, especially against mycobacteria, pneumococcal or staphylococcal strains. However, pathogenic bacterial infections, still an urgent public health concern because of bacterial resistance, remove the efficacy of employed antibiotics. Therefore, the development of new structural compounds for new antibiotics is a most potent pathway to improve their biological powerful against multi- and/or resistant bacterial strains. This manuscript describes new nucleosidic analogues obtained by diversity-oriented synthesis (DOS) approach. Thus, new synthetic methodology for carbocyclic nucleosides cyclopentanone moiety was investigated and carba-nucleoside from virtual screening was synthetized. Small library of heterocyclic compounds containing an indole structure was developed. Key reactions was used like 1,3-dipolar cycloaddition (CuAAC) allowing to develop a diversity-oriented synthesis approach (DOS). Furthermore, new methodology for pseudo-sugar of carbanucleoside synthesis use an allylic C-H activation cyclization palladium-catalyzed as C(sp3)-C(sp3) bond formation. These molecules have been shown to be active against Mur ligases from Mycobacterium tuberculosis

Les PLP qui assurent la polymérisation finale du peptidoglycane sont les cibles des β-lactamines. Un nouveau mécanisme de résistance à ces antibiotiques par activation d'une autre voie de synthèse (L,D-transpeptidation) a été récemment caractérisé. L'existence et l'impact de la voie de L,D-transpeptidation ont éte�� étudiés chez C. Jeikeium et M. Tuberculosis. Leur L,D-transpeptidases utilisent un substrat tétrapeptidique et sont inhibées par les carbapénèmes. Chez C. Jeikeium la voie des PLP est prédominante. La disponibilité du substrat tétrapeptidique généré par la Pbp4 est le facteur limitant la L,D-transpeptidation. La Pbp2C a été identifiée comme responsable de la résistance aux β-lactamines. Chez M. Tuberculosis, le peptidoglycane des formes non réplicatives comporte très majoritairement des ponts générés par L,D-transpeptidation suggérant que les L,D-transpeptidases et les carbapénèmes représentent une cible et une famille d'antibiotiques pour le traitement de la tuberculose
The PBP that catalyze the last cross-linking step of peptidoglycan synthesis are the targets of β-lactams. A novel mechanism of β-lactam resistance due to activation of another pathway (L,D-transpeptidation) has been recently characterized. The aim of the study was to investigate the impact of the L,D-transpeptidation pathway in C. Jeikeium and M. Tuberculosis. Their L,D-transpeptidases use substrates containing a tetrapeptide stem and are inhibited by carbapenems. In C. Jeikeium, the PBP pathway is predominant. The supply in tetrapeptide substrate generated by Pbp4 is the limiting factor for L,D-transpeptidation pathway. Pbp2C was identified as the cross-linking enzyme responsible for β-lactam resistance in C. Jeikeium. In M. Tuberculosis, the peptidoglycan of non-replicating cells predominantly contains crosslinks generated by L,D-transpeptidation. L,D-transpeptidases and carbapenems may represent a target and a drug family relevant to the eradication of persistent M. Tuberculosis

La tuberculose est une maladie infectieuse et contagieuse, dont l'agent pathogène principal est l'espèce Mycobacterium tuberculosis. Cette thèse a pour objectif principal d'étudier la tuberculose par une approche d'épidémiologie génétique dans deux pays à forte incidence, Djibouti et le Burkina Faso, et une zone à faible incidence, Montpellier et sa région. Ce travail permet de mieux comprendre la propagation de cette maladie infectieuse dans ces régions et de donner des informations indispensables pour les services de santé publique. Pour chacune de ces régions, ce sont les premières études du genre et cette thèse représente donc un travail original et informatif. Les objectifs spécifiques sont : (i) d'étudier la diversité génétique, les relations phylogénétiques entre les souches et la structure des populations de M. Tuberculosis dans ces trois zones ; (ii) de comprendre la dynamique de transmission de la tuberculose dans ces trois régions ; (iii) de tenter d'identifier des facteurs de risque impliqués dans la transmission de la tuberculose ; (iv) enfin par une approche globale de comparer les résultats obtenus pour ces trois régions et de les confronter avec les données de la littérature. Les isolats ont été prélevés par les services de santé publique de chacun des pays concernés et ont été cultivés et/ou stockés au laboratoire de bactériologie du CHU de Montpellier (un total de 320 souches). La caractérisation génétique des échantillons est réalisée par 2 marqueurs moléculaires complémentaires reconnus pour le génotypage de M. Tuberculosis : le spoligotypage et les MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit Variable Number of Tandem Repeats). La caractérisation génétique a permis d'identifier 247 souches comme appartenant à des familles déjà décrites dans la littérature et 73 souches présentant des nouveaux génotypes. Une grande hétérogénéité génétique observée dans l'échantillon de Montpellier reflète le niveau endémique et le bon contrôle de cette maladie dans cette région de faible incidence (6,6 cas pour 100000 habitants). Cette étude permet d'identifier que la majorité des cas sont dus à des réactivations endogènes. Néanmoins, les données mettent en évidence des cas de transmission récente familiale et des cas de tuberculose importés. Au Burkina Faso, pays présentant une incidence élevée (163 cas pour 100000 habitants), les points importants sont : un faible nombre de cas résistants aux antituberculeux et non impliqués dans les cas de transmission récente ; une diversité génotypique relativement élevée reflétant l'existence d'une prise en charge de la maladie ; l'infection par le VIH ne constitue pas un facteur de risque de transmission récente malgré une incidence du VIH élevée ; on observe l'émergence de la famille LAM10 déjà décrite au Cameroun appelée famille Cameroun. Cette famille est responsable de la majorité des nouveaux cas de tuberculose au Burkina Faso. A Djibouti, pays présentant la plus forte incidence de tuberculose au niveau mondial (733 cas pour 100000 habitants), on observe une structuration remarquable de la population de M. Tuberculosis en 3 lignées bien individualisées, proches des familles EAI, T et CAS. La diversité génétique observée dans ce pays apparaît élevée en dépit d'un taux de transmission récente important. Ceci suggère l'ancienneté de ces lignées dans ce pays en accord avec les données de la littérature. Les études génétiques apportent non seulement des informations fondamentales pour l'épidémiologie de la tuberculose mais également sur la structure des populations, base indispensable pour appréhender la lutte et le contrôle d'un organisme pathogène. La comparaison des données obtenues dans ces trois pays d'incidences différentes et la mise en regard avec les données de la littérature permettent d'identifier des profils épidémiologiques et génétiques observés classiquement pour cette maladie infectieuse, mais également des caractéristiques spécifiques à chacun des pays d'étude. En conclusion, ces études réalisées à un niveau local mais également abordées d'un point de vue global permettent de définir quelles sont pour chacune des zones d'études les perspectives de recherche et les stratégies à développer pour le contrôle de la tuberculose.

Mycobacterium abscessus (MAB), une mycobactérie associée à une multirésistance aux antibiotiques, est responsable d'infections pulmonaires, notamment chez les patients atteints de mucoviscidose. La protéine membranaire mycobactérienne large (MmpL) est une famille de pompes d’efflux (PE) à substrats multiples impliquées dans la biosynthèse de la paroi cellulaire et la résistance aux antibiotiques. Le complexe MmpSL4ab intervient dans la biosynthèse/transport des glycopeptidolipides (GPL) à travers la membrane plasmique. MAB affiche des morphotypes lisses (S) ou rugueux (R), caractérisés par la présence ou non de GPL, respectivement.La thèse portait sur l’apport de MmpL dans la transition S-à-R et sur les mécanismes de résistance à antibiotiques chez MAB. Nous avons développé des outils génétiques pour générer facilement des mutants, basés sur des événements de recombinaison homologue simple et double. Nous avons ensuite décrit l'hétérogénéité S/R de plusieurs isolats cliniques issus de deux patients atteints de mucoviscidose et co-infectés par les deux variants. Nous avons ensuite élucidé les mécanismes de résistance aux analogues du thiacétazone qui impliquent le régulateur de transcription TetR (MAB_4384) dans la régulation du MmpSL5. Nous avons également montré que les mutations du régulateur de transcription TetR, MAB_2299c, étaient associées à la surexpression de deux systèmes de PE, qui toutes deux contribuent dans la résistance intrinsèque à la clofazimine et à la bédaquiline.Globalement, ces résultats élargissent nos connaissances sur les mécanismes de régulation de la famille des protéines MmpL et sur un nouveau mécanisme de résistance aux médicaments dans MAB
Mycobacterium abscessus (MAB), a rapidly growing mycobacterium associated to multidrug resistance, is responsible of pulmonary infections especially in cystic fibrosis (CF) patients. Mycobacterial membrane protein large (MmpL) is a family of multisubstrate efflux pumps involved in cell wall biosynthesis and drug resistance. The MmpSL4ab complex mediates the biosynthesis/transport of glycopeptidolipids (GPL) across the plasma membrane. MAB displays smooth (S) or rough (R) morphotypes, characterized by the presence or absence of GPL, respectively. The thesis research was focused in the contribution of MmpL in the S-to-R transition and in drug resistance mechanisms in MAB. We also developed genetic tools to easily generate mutants, based on a single and double homologous recombination events. We next described the heterogeneity of isolates from two CF patients pulmonary co-infected with both morphotypes using whole genome sequencing. We further elucidated the mechanism of resistance to thiacetazone analogues involving the TetR transcriptional regulator (MAB_4384) in the regulation of MAB MmpS5/MmpL5 efflux pump system. Our work based in genetic and biochemical approaches also demonstrated that mutations in the TetR transcriptional regulator MAB_2299c were associated with overexpression of two efflux pump systems, MAB_2300-2301 and MAB_1135c-1134c, both contributing to the intrinsic resistance to clofazimine and bedaquiline, two alternative therapeutic options recently proposed for treatment of MAB infections.Overall, these results expand our knowledge with respect to the regulatory mechanisms the MmpL family of proteins and on a novel mechanism of drug resistance in MAB

Les muqueuses hébergent des cellules immunitaires résidentes qui jouent un double rôle : elles contribuent au maintien de l'intégrité tissulaire et à la protection du tissu lors d'infection par des pathogènes. Parmi celles-ci, les cellules lymphoïdes innées (ILC) sont des actrices clés de l'homéostasie tissulaire et de la réponse immunitaire. Les dernières années ont révélé l'existence de différents types d'ILC, classées selon leur similarité avec les lymphocytes T au niveau de l'expression de facteurs de transcription et de leurs fonctions effectrices. Ainsi, on retrouve les ILC1, les ILC2 et les ILC3 qui forment les "contreparties" innées des cellules T CD4+ de type Th1, Th2 et Th17 respectivement, ainsi que les NK, contrepartie des lymphocytes cytotoxiques CD8+. De façon similaire aux sous-types de Th, les différents types d'ILC ont été associés à divers pathologies. Au sein du tissu pulmonaire, les ILC2 constituent le sous-type quantitativement majoritaire d'ILC chez les rongeurs et leur rôle a notamment été caractérisé dans des pathologies de type 2 (asthme, allergies, infections parasitaires). Le poumon représente le site d'entrée pour de nombreux agents infectieux, mais le rôle des ILC2 lors des infections pulmonaires d'origine bactérienne reste peu exploré. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé au rôle des ILC, et particulièrement des ILC2, dans le modèle murin d'infection par Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agent étiologique de la tuberculose (TB). L'infection par Mtb induit principalement une réponse immunitaire de type 1, l'IFNƴ produit permettant l'activation des fonctions microbicides des macrophages infectés. Néanmoins, ce mécanisme dominant de l'immunité antituberculeuse peine à prédire l'issue de l'infection et la vision actuelle est que d'autres acteurs cellulaires contribuent probablement de façon importante à la protection. Sur la base de leur présence dans le poumon à l'entrée du pathogène et de la diversité de leur potentiel effecteur antimicrobien et protecteur du tissu, nous avons donc émis l'hypothèse que les ILC pouvaient être activées et participer à la réponse immunitaire antituberculeuse. Dans le modèle murin de la tuberculose, nous avons pu montrer que les ILC étaient diversement régulées au cours de l'infection : alors que les ILC1 et les ILC3 se développent et s'activent, les ILC2 se contractent et sont inhibées. De façon intéressante, l'inhibition des ILC2 est associée à un mécanisme de plasticité caractérisé par la perte de marqueurs d'ILC2 tels que GATA3, ST2, Arg1 et IL-5 et l'acquisition de marqueurs caractéristiques des ILC1 comme T-bet, IL-18Ra, CD49a et IFNƴ. Différents stades de la plasticité des ILC2 ont été identifiés sur la base de l'expression de CD49a et d'IL-18Ra conduisant à la formation de cellules ILC1-like, présentant un potentiel protecteur au cours de l'infection.[...]
Mucosal tissues harbor resident immune cells that play a dual role in maintaining both tissue integrity and protection against infection by pathogens. Among these, innate lymphoid cells (ILCs) are key players in tissue homeostasis and immune response. The last few years have revealed the existence of different types of ILCs, classified according to their similarity to T cells based on expression of dedicated transcription factors and the execution of specific effector functions. These include ILC1, ILC2 and ILC3, which form the innate counterparts of CD4+ T cells of the Th1, Th2 and Th17 types respectively, as well as NK for CD8+ cytotoxic lymphocytes. Similar to the associated Th subtypes, the different types of ILC have been implicated in various diseases. Within lung tissue, ILC2 is the quantitatively dominant subtype of ILC and its role has been characterized in particular in type 2 pathologies (asthma, allergies, parasitic infections). The lung is the site of entry for many infectious agents: yet the role of ILC2 in bacterial lung infections remains poorly explored. During my thesis, I was interested in the role of ILC, particularly ILC2, in the mouse model of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection, the etiological agent of tuberculosis. Infection with Mtb typically induces a type 1 immune response: IFNƴ production allows the activation of the microbicidal functions of infected macrophages. Nevertheless, this dominant mechanism of TB immunity barely predicts the outcome of infection, and the current view is that other cellular actors are likely to contribute significantly to protection. Based on their presence in the lung at the entry of the pathogen and the diversity of their antimicrobial and tissue-protective effector potential, I hypothesized that ILC could be activated and participate in the antituberculous immune response. In the mouse model of tuberculosis, I could show that ILC are differentially regulated during infection: while ILC1 and ILC3 expand and become activated, ILC2 contract and become functionally inhibited. Interestingly, inhibition of ILC2 is associated with a plasticity mechanism characterized by the loss of ILC2 markers, such as GATA3, ST2, Arg1 and IL-5, together with the acquisition of ILC1 characteristic markers, such as T-bet, IL-18Ra, CD49a and IFNƴ. Different stages of ILC2 plasticity were identified based on the expression of CD49a and IL-18Ra, leading to the formation of ILC1-like cells, which display a protective potential during infection. In this infectious model, as well as through the development of an easier model of plasticity based on the administration of cytokines, we showed that IFNƴ, originating from ILC1 and NK cells, as well as the expression of the transcription factor STAT1, were essential components for the generation of ILC1-like cells. With the aim to identify the molecular mechanisms governing this plasticity, we hypothesized that the ILC2-to-ILC1-like cell plasticity was associated with a marked metabolic change. [...]

La thèse porte sur une surveillance de la résistance aux antituberculeux à travers des réseaux spécifiques, d’un déjà en place en France à la mise en place d’un réseau de surveillance régionale au Vietnam. En France, nous avons participé à (1) la surveillance de la résistance des antituberculeux de première ligne à travers le réseau Azay-Mycobactéries, et analysé les tendances sur 10 ans; (2) une évaluation de la qualité des données. Les résultats de 1995-2004 ont montré une augmentation de la proportion de patients nés à l’étranger et une stabilité de la co-infection par le VIH. La prévalence de la résistance est faible en France. La multirésistance primaire augmente légèrement. L’évaluation montre une bonne qualité des informations d’Azay, à l’exception des antécédents. L’impact des discordances est non significatif sur les taux de résistance. Les méthodes de l’OMS et du Azay sont adaptées à une surveillance au Vietnam. Les résultats montrent une prévalence élevée de résistance et de co-infection au VIH; suggérant la nécessité d’adapter le traitement standard et de renforcer la collaboration des activités de soins des cas co-infectées par le VIH.

D’après un rapport de l’OMS, la tuberculose reste en 2015 l’une des 10 premières causes de décès à l’échelle mondiale. De ce fait, en matière de santé, éradiquer la maladie à l’horizon 2030 est un des objectifs majeurs fixés par les Nations Unies. La bactérie responsable de cette infection, Mycobacterium tuberculosis, est un pathogène obligatoire dont l’origine et l’évolution sont intrinsèquement liées à celles de son hôte principal, Homo sapiens. En effet, les souches actuelles de tuberculose présentent, tout comme l’homme, une forte structure phylogénétique, trace de leur origine géographique. Les pays pauvres et en développement sont les plus touchés par l’épidémie globale, favorisée par des systèmes de santé défaillants et une haute prévalence du VIH. Les pays occidentaux ne sont pas épargnés, menacés par l’émergence de souches de plus en plus résistantes aux antibiotiques provenant en grande partie de l’ex URSS. Au cours de cette thèse, j’analyse l’histoire évolutive, la propagation et l’acquisition de résistances aux antibiotiques de plusieurs épidémies de tuberculose en me basant sur des données génétiques et génomiques. Dans un premier temps je m’intéresse aux effets d’une campagne nationale de traitements en Asie Centrale sur le développement de souches multi-résistantes et met également en lumière le rôle clef de certaines mutations dans le succès des clones présentés. Ainsi cette campagne a été partiellement mise en échec par la présence de souches pré-résistantes, grâce à la survenue de mutations avant même la mise en place des traitements antibiotiques. Par la suite je me suis focalisé sur un clade particulier de souches multi-résistantes, le clone Russe W148. Je présente sa dispersion géographique et temporelle à travers l’Eurasie et démontre l’importance des mutations compensatoires dans son succès épidémique. De plus, la tuberculose ne touche pas seulement les hommes mais infecte également plusieurs autres mammifères. Afin d’appréhender les contraintes adaptatives accompagnants ces changements d’hôtes, j’ai effectué divers tests de sélection dans le but d’identifier les gènes impliqués. Pour finir, nous avons développé un indice souche spécifique, permettant de mesurer le succès épidémique de celles-ci à un niveau individuel. Dans le cadre d’études épidémiologiques, cette mesure peut être croisée avec des informations sur le patient, la souche ou même socio-économiques
According to a 2015 WHO report, tuberculosis remains one of the top 10 causes of death worldwide. Despite considerable efforts by the United Nations to eradicate the disease by 2030, a global TB epidemic still persists. Its causative agent, the bacterium Mycobacterium tuberculosis, an obligate pathogen, has been plaguing humanity since it originated, and has coevolved with its main host, Homo sapiens, over thousands of years. Contemporary tuberculosis strains exhibit a structured phylogeographic pattern, carrying the genetic print of their geographic origin. The Koch bacillus infects and kills in large numbers, in poor and developing countries, where fragile health care systems, combined with high HIV prevalence, facilitate epidemic spread. In western countries, the major current threats are the multiplication and propagation of antibiotic resistant strains (MDR/XDR) coming predominantly from former Soviet republics. In this thesis, I unravel the evolutionary history, propagation, and acquisition of drug resistance-conferring mutations in different settings, by implementing multiple genetic and genomic data sets. First, focusing on Central Asia, using whole genome sequencing and Bayesian statistics, I assess the effects of a treatment campaign on the development of MDR strains and highlight key mutations in successful strains. More importantly, the success of DOTs campaigns was compromised by the genetic make-up of these outbreak clades (pre-treatment low frequency resistance SNPs). Special attention was also given to a particular outbreak of MDR strains, i.e. the Russian W148 clone. I present its westward spatial and temporal propagation at a continental scale during the last century, and underline the key contribution of compensatory mutations in its epidemic success. However, tuberculosis does not only infect humans, but also has experienced successive mammalian host jumps. To decipher the adaptive constraints accompanying such secondary events, a systemic gene screen with selection signature-detecting algorithms was implemented to identify putative targets during diversifying selection. Finally, novel mathematical tools and indices that reflect the epidemicity of a strain were developed, jumping from a population-driven approach to a strain specific one, with broader epidemiological applications. This allows us to correlate strain fitness with patient, lineage, and socio-economic information

Le tréhalose monomycolate (TMM) est un glycolipide majeur qui constitue la paroi atypique des mycobactéries. La protéine « Mycobacterial membran protein Large 3 » (MmpL3) transportant le TMM est essentielle à la croissance des bacilles. MmpL3 apparaît donc comme une cible thérapeutique prometteuse à exploiter pour contrer les infections à mycobactéries. Par des approches de biologie structurale et biochimiques, ce projet de thèse visait à comprendre les bases moléculaires du transport du TMM et le mode d'action des inhibiteurs ciblant cette voie. Dans cette finalité, un protocole de purification de MmpL3 a été établi. Nous avons obtenu des cristaux de MmpL3 permettant de résoudre la structure cristalline (S3D) de MmpL3 de Mycobacterium smegmatis. Par ailleurs, des études récentes ont démontré que MmpL3 agit en concert avec d’autres protéines pour le transport du TMM. Nous avons résolu la S3D d’un de ces partenaires, le facteur A de transport du TMM (TtfA) qui est essentiel à la survie des mycobactéries. TtfA possède un repliement unique et notre analyse bioinformatique suggère que la fonction de TtfA ne serait pas uniquement dédiée au transport du TMM. Les mycobactéries peuvent inactiver les antibiotiques de type aminoglycosides (AG) par acétylation. La protéine Eis2 (Enhanced Intracellular Survival) de M. abscessus (Mab) est importante pour la survie du bacille dans les macrophages. Nous avons pu montrer que Eis2, en plus de son rôle important dans la persistance intracellulaire, est capable de modifier les AG et en particulier l' amikacine (AMK), un antibiotique de base du traitement des infections à Mab. La S3D de Eis2, nous a permis d’ identifier plusieurs inhibiteurs de l’ enzyme. Nous avons également démontré que le site actif atypique de Eis1 de Mab, un homologue de Eis2, ne permet pas à l’ enzyme d’ inactiver les AG. Nos études génétiques permettent de conclure que Eis1 contrairement à Eis2 n’ est pas impliqué dans la résistance aux AG
Mycobacteria possess an atypical and hydrophobic cell wall which, limits the penetration of the antibiotics and drug-like molecules. Trehalose monomycolates (TMM) are glycolipids and building blocks of the mycomembrane. The Mycobacterial membrane protein Large 3 (MmpL3) mediates the TMM transport and is essential for bacilli growth. Several studies have highlighted MmpL3 as a promising drug target. To understand by structural and biochemical approaches the molecular basis of TMM transport and the mode of action of inhibitors targeting this pathway, we first established a robust purification protocol of MmpL3. We crystallized MmpL3 from several mycobacterial species, which allowed determination of the MmpL3 crystal structure (S3D) from Mycobacterium smegmatis. Recent studies demonstrated that MmpL3 requires several accessory proteins for efficient TMM transport. We could solve the S3D of one of these MmpL3 partners, the TMM transport factor A (TtfA) that was reported to be essential for the survival of mycobacteria. The TtfA S3D revealed a unique protein fold and bioinformatics analysis suggested that the TtfA function might not be solely dedicated to TMM transport. Mycobacteria can modify and inactivate antibiotics. The enhanced intracellular survival protein (Eis2) from M. abscessus (Mab) is important for invasion of the host and persistence. We could show by structural and biochemical approaches that Eis2, on top of its role in colonization, can modify by acetylation and thus inactivate several aminoglycosides (AG) and particularly amikacin (AMK), one of the cornerstone antibiotics for Mab infection treatment. Furthermore, by exploiting the Eis2 structural data, we found several inhibitors of Eis2 and could propose why apramycin an efficient anti-Mab AG is not inactivated by Eis2. We demonstrated also that the atypical active site of Eis1 from Mab a close homolog of Eis2 is not allowing the inactivation of AG. We could conclude that Eis1 contrary to Eis2 is not involved in AG resistance

Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium abscessus produisent les β-lactamases BlaC et BlaMab qui contribuent à la résistance intrinsèque de ces bactéries aux β-lactamines. Notre objectif est de caractériser l’inhibition de ces β-lactamases par l’avibactam et le clavulanate pour contribuer au développement de nouveaux traitements. Nous avons déterminé le profil de substrat et d’inhibition de BlaMab ainsi que sa structure cristalline, révélant trois différences majeures avec BlaC. BlaMab a une activité supérieure à celle de BlaC pour toutes les β-lactamines sauf la céfoxitine qui est utilisée pour les infections dues à M. abscessus. BlaC est inhibée irréversiblement par le clavulanate et inefficacement par l’avibactam alors que BlaMab présente le comportement inverse impliquant une hydrolyse du clavulanate et une inhibition très rapide par l’avibactam. La structure de BlaMab diffère de celle de BlaC principalement par le remplacement du motif conservé SDN par SDG. L’introduction de SDG dans BlaMab et de SDN dans BlaC a montré que cette différence détermine le profil d’inhibition des β-lactamases. Une seule mutation peut donc entraîner l’émergence d’une résistance aux combinaisons d’une β-lactamine avec le clavulanate ou l’avibactam mais pas avec les deux inhibiteurs. L’avibactam et le clavulanate offrent donc des alternatives thérapeutiques en cas de résistance à l’un des inhibiteurs. Nous nous sommes également intéressés aux β-lactamines partenaires du clavulanate, pour le traitement de la tuberculose et montrer que la structure des carbapénèmes pouvait être optimisée pour améliorer l’inactivation des cibles et diminuer l’hydrolyse par BlaC
Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium abscessus produce the β-lactamases BlaC and BlaMab that contribute to the intrinsic resistance of those bacteria to β-lactams. Our objective was to characterize the inhibition of these β-lactamases by avibactam and clavulanate in order to contribute to the development of new treatments. We have determined the inhibition and substrate profiles of BlaMab, as well as its crystal structure, revealing three major differences with BlaC. BlaMab is more active than BlaC with respect to hydrolysis of all β-lactams except cefoxitin, which is used for the treatment of infections due to M. abscessus. BlaC is inhibited irreversibly by clavulanate and inefficiently by avibactam. In contrast, BlaMab shows the opposite behavior involving hydrolysis of clavulanate and a rapid inhibition by avibactam. Structurally BlaC differs from BlaMab mainly by the replacement of the conserved motif SDN by SDG. The introduction of SDG in BlaMab and of SDN in BlaC revealed that this difference determines the inhibition profile of the β-lactamases. A single mutation can therefore lead to the emergence of resistance to the association of β-lactam with clavulanate or avibactam, but not to both associations. Thus, avibactam and clavulanate offer therapeutic alternatives in case of resistance to one of the two inhibitors. We have also investigated the β-lactam partners of clavulanate for the treatment of tuberculosis and showed that the structure of carbapenems could be optimized to enhance the inactivation of the targets and to reduce hydrolysis by BlaC

Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium abscessus produisent les β-lactamases BlaC et BlaMab qui contribuent à la résistance intrinsèque de ces bactéries aux β-lactamines. Notre objectif est de caractériser l’inhibition de ces β-lactamases par l’avibactam et le clavulanate pour contribuer au développement de nouveaux traitements. Nous avons déterminé le profil de substrat et d’inhibition de BlaMab ainsi que sa structure cristalline, révélant trois différences majeures avec BlaC. BlaMab a une activité supérieure à celle de BlaC pour toutes les β-lactamines sauf la céfoxitine qui est utilisée pour les infections dues à M. abscessus. BlaC est inhibée irréversiblement par le clavulanate et inefficacement par l’avibactam alors que BlaMab présente le comportement inverse impliquant une hydrolyse du clavulanate et une inhibition très rapide par l’avibactam. La structure de BlaMab diffère de celle de BlaC principalement par le remplacement du motif conservé SDN par SDG. L’introduction de SDG dans BlaMab et de SDN dans BlaC a montré que cette différence détermine le profil d’inhibition des β-lactamases. Une seule mutation peut donc entraîner l’émergence d’une résistance aux combinaisons d’une β-lactamine avec le clavulanate ou l’avibactam mais pas avec les deux inhibiteurs. L’avibactam et le clavulanate offrent donc des alternatives thérapeutiques en cas de résistance à l’un des inhibiteurs. Nous nous sommes également intéressés aux β-lactamines partenaires du clavulanate, pour le traitement de la tuberculose et montrer que la structure des carbapénèmes pouvait être optimisée pour améliorer l’inactivation des cibles et diminuer l’hydrolyse par BlaC
Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium abscessus produce the β-lactamases BlaC and BlaMab that contribute to the intrinsic resistance of those bacteria to β-lactams. Our objective was to characterize the inhibition of these β-lactamases by avibactam and clavulanate in order to contribute to the development of new treatments. We have determined the inhibition and substrate profiles of BlaMab, as well as its crystal structure, revealing three major differences with BlaC. BlaMab is more active than BlaC with respect to hydrolysis of all β-lactams except cefoxitin, which is used for the treatment of infections due to M. abscessus. BlaC is inhibited irreversibly by clavulanate and inefficiently by avibactam. In contrast, BlaMab shows the opposite behavior involving hydrolysis of clavulanate and a rapid inhibition by avibactam. Structurally BlaC differs from BlaMab mainly by the replacement of the conserved motif SDN by SDG. The introduction of SDG in BlaMab and of SDN in BlaC revealed that this difference determines the inhibition profile of the β-lactamases. A single mutation can therefore lead to the emergence of resistance to the association of β-lactam with clavulanate or avibactam, but not to both associations. Thus, avibactam and clavulanate offer therapeutic alternatives in case of resistance to one of the two inhibitors. We have also investigated the β-lactam partners of clavulanate for the treatment of tuberculosis and showed that the structure of carbapenems could be optimized to enhance the inactivation of the targets and to reduce hydrolysis by BlaC

L’émergence et l’augmentation continue de la résistance aux médicaments chez Mycobacterium tuberculosis (MTB) constituent un défi majeur pour la lutte antituberculeuse. Pour résoudre le problème de temps (2 à 8 semaines) posé par les tests classiques de sensibilité aux médicaments (DST), des tests moléculaires ont été développés pour la détection précoce des mutations associées à la résistance. Jusqu'à présent, à l'exception du séquençage complet (incompatible avec un diagnostic de routine dans les pays en développement), aucun test ne détecte simultanément les différents types de résistance majeurs en une seule réaction. Sur la base de la littérature et de travaux antérieurs menés au Vietnam, au Laos et au Cambodge, une puce à ADN capable de détecter 184 mutations liées à la résistance aux médicaments de première et de deuxième lignes a été mise au point. En comparaison avec les données de DST, la puce a montré une sensibilité (84,3%-100%) et une spécificité élevées (89,2%-100%). Par rapport au séquençage, la puce a donné des résultats comparables, avec une sensibilité entre 90% et 100% et une spécificité entre 98,2% et 100%. Elle offre, de plus, une meilleure couverture que les tests moléculaires approuvés par l'OMS, car elle permet la détection des résistances aux médicaments de première et de deuxième lignes dans un seul test. Le temps de traitement des isolats issus de la culture est d’environ 6 à 7 heures, ce qui réduit considérablement le temps de diagnostic par rapport au DST. En conclusion, la puce à ADN a été développée avec succès. Certains aspects techniques doivent maintenant être améliorés pour en faire un outil de diagnostic abordable et facile à utiliser
The emergence and continuous increase of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis (MTB) is a major challenge for tuberculosis (TB) control. To overcome the time-consuming problem of conventional drug susceptibility testing (DST), many molecular-based tests have been recently developed for early detection of drug resistance-associated mutations. Up to now, except whole genome sequencing (not ready for routine diagnostic in low and middle-income countries), no test has the capacity to simultaneously detect the different types of drug resistance to first- and second-line drugs in one reaction. Based on the literature and previous works carried out in Vietnam, Laos and Cambodia, in this study, a DNA chip was developed able to detect 184 main mutations conferring resistance to both first- and second-line drugs. Compared to DST, the DNA chip showed high sensitivity (between 84.3% and 100%) and high specificity (between 89.2% and 100%). Compared to sequencing, the DNA chip showed comparable accuracy, with sensitivity between 90% and 100% and specificity between 98.2% and 100%. The DNA chip showed a better coverage than the WHO endorsed molecular tests since it enables the detection of both first- and second-line drug resistances in one test. The turn-around time is about 6-7h from cultured isolates reducing considerably the diagnostic time compared to cultured-based DST. Finally, the DNA chip has been successfully developed, even if certain technical aspects need to be improved to make an affordable and easy-to-use diagnostic tool

Mycobacterium abscessus est une mycobactérie non-tuberculeuse responsable d’infections pulmonaires difficiles à traiter en clinique. Le traitement actuellement recommandé est associé à un taux d’échec élevé et à l'émergence de résistances à la plupart des antibiotiques. Dans le contexte actuel, avec un faible nombre de nouveaux antibiotiques mis sur le marché, il est important de d’optimiser l’utilisation des antibiotiques à notre disposition par des approches pharmacocinétique/pharmacodynamiques (PK/PD). Dans les infections pulmonaires, l'administration directe de médicaments à faible perméabilité tels que la céfoxitine (FOX) et l'amikacine (AMK) dans les poumons sous forme d'aérosols devrait accroître leur efficacité au site d’infection tout en diminuant la toxicité systémique responsable des effets indésirables, particulièrement dans le cas des traitements prolongés. De plus, l'utilisation d'antibiotiques en combinaison pourrait réduire le risque de développement de résistance. Plusieurs points ont été abordés dans cette thèse : 1. Études biopharmaceutiques sur AMK et FOX : Il a été démontré qu'après la nébulisation d'AMK et de FOX, les concentrations pulmonaires étaient presque 1000 fois plus élevées qu'après l'administration intraveineuse des deux antibiotiques, ce qui en fait de bons candidats pour la nébulisation. 2. Étude PK/PD de céfoxitine : un modèle PK/PD semi-mécanique a été mis au point à partir de données pharmacocinétiques in vitro, permettant d'identifier les relations concentration-effet pour deux sous-populations de bactéries tout en tenant compte de la dégradation de la céfoxitine.3. Étude pharmacocinétique et pharmacodynamique de la bi-combinaison : à l'aide d'un modèle mathématique basé sur un mécanisme et de données obtenues à partir données in vitro, il a été démontré que l'effet combiné d'AMK et de FOX était additif et/ou synergique selon les différentes concentrations.4. Bi- ou tri-combinaisons : plusieurs tri-combinaisons incluant AMK, FOX et un 3ème antibiotique (incluant clarithromycine, linézolide, clofazimine, ciprofloxacine, moxifloxacine, rifampicine et rifabutine) ont été testés contre une souche de référence, un isolat clinique résistant à la clarithromycine (Ma1611) et un isolat clinique multirésistant (T28). Toutes les tri-combinaisons étaient actives contre la souche de référence. Les combinaisons étaient également actives sur la souche Ma1611 sauf pour les associations avec la clofazimine et la clarithromycine. Aucune combinaison n'était active contre T28. Les bi-combinaisons avec de plus fortes concentrations de FOX et les fluoroquinolones ou les rifamycines étaient efficaces contre T28. Cela suggère une optimisation du schéma thérapeutique pour le traitement des infections pulmonaires à M. abscessus. 5. La tri-combinaison comprenant AMK, FOX et moxifloxacine (MXF) jusqu'à 21 jours contre un isolat clinique résistant à la clarithromycine Ma1611 n'a montré aucun effet supplémentaire de l'utilisation de MXF car la tri-combinaison n'était pas plus efficace que la bi-combinaison d'AMK et FOX
Mycobacterium abscessus is rapidly growing non-tuberculous mycobacteria responsible for difficult-to-treat pulmonary infections in humans. Current recommended treatment is associated with high treatment failure and emergence of resistance to most of the antibiotics. Also, with only a few new antibiotic drugs active against multidrug-resistant bacteria approved every year, it is important to optimize the use of already existing antibiotics using biopharmaceutical approach like Pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD). In pulmonary infections, direct administration of low permeability drugs such as cefoxitin (FOX) and amikacin (AMK) into lungs as therapeutic aerosols should increase their efficiency and minimize whole body exposure responsible for adverse effects, particularly in the case of prolonged treatments. Moreover, the use of antibiotics in combination may reduce the risk of resistance. Several points have been addressed in this thesis: 1. Biopharmaceutical studies of AMK and FOX: It was shown that after nebulization of AMK and FOX, pulmonary concentrations were almost 1000-fold higher than after intravenous administration for both antibiotics, making them a good candidate for nebulization. 2. Pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) study of cefoxitin: a semi-mechanistic PK/PD model was developed from in vitro time kill-kinetics assay data, enabling identification of concentration-effect relationships for two bacterial sub-populations while taking into account the unstability degradation of cefoxitin.3. PK/PD study of bi-combination: Using a mechanism-based mathematical model and data obtained from time kill-kinetics study, it was shown that the combined effect of AMK and FOX was additive to synergistic at different concentration.4. Bi-or tri-combinations: several tri-combinations including AMK, FOX and a 3rd antibiotic (including clarithromycin, linezolid, clofazimine, ciprofloxacin, moxifloxacin, rifampicin and rifabutin) were tested against reference strain, clarithromycin resistance-clinical isolate (Ma1611) and multidrug-resistance-clinical isolate (T28). All tri-combinations were active against reference strain. Similar observation was made with Ma1611 except combination with clofazimine and clarithromycin. Any combination was active against T28. Bi-combination with highest concentrations of FOX and rifamycins were effective against T28. The synergy between FOX and fluoroquinolones or rifamycins suggests a potent role of these combinations that may warrant further optimization of treatment regimen for the treatment of M. abscessus pulmonary infections. 5. Tri-combination including AMK, FOX and moxifloxacin (MXF) up to 21 days against clarithromycin-resistance clinical isolate has shown no importance of using MXF as tri-combination was not more effective than the bi-combination of AMK and FOX