Rozprawy doktorskie na temat „Modèles membranaires lipidiques”

Les canaux mécanosensibles de large conductance (MscL) sont des protéines membranaires intégrales permettant à la bactérie de survivre lors de chocs hypo-osmotiques. Leur principale caractéristique est de s'ouvrir en réponse à un stress mécanique : une tension de la membrane. La compréhension de leur mode d'activation est un prérequis pour élaborer un modèle global de la sensibilité à la tension membranaire. Nous avons étudié les premières étapes du mécanisme d'ouverture du MscL induites par une diminution de l'épaisseur membranaire, ainsi que les interactions gouvernant ces changements conformationnels par des simulations de dynamique moléculaire. La comparaison des analyses en composantes principales des trajectoires et en modes normaux nous a permis de mettre en évidence l'influence de la membrane sur la dynamique intrinsèque du canal. Nous avons ensuite étudié des canaux MscL issus de différents organismes et présentant des sensibilités mécaniques différentes. Des différences significatives de comportement des deux systèmes plongés dans des membranes d'épaisseur variable ont été mises en évidence. Ces différences nous ont conduits à exploré le rôle des différentes régions et notamment le rôle des boucles périplasmiques en construisant des canaux hybrides par combinaison de régions provenant d'organismes différents. Les résultats obtenus confirment le rôle primordial des boucles périplasmiques dans la sensibilité du MscL
Mechanosensitive channels of large conductance are integral membrane proteins that permit the bacterium to survive when hypo-osmotic shock occurs. Their principal characteristic is to open in response to a mechanical stress : a tension of the membrane. Understanding their mode of activation is necessary to work out a global model of the mechanism of sensitivity to membrane tension. We studied the first stages of the gating mechanism of MscL induced by membrane thinning, as well as the interactions controlling these conformational changes by moleculardynamics simulations. The comparison of principal component analysis of the trajectories and the directions given by the normal modes enabled us to highlight the influence of the membrane on the intrinsic dynamics of the channel. We then studied MscL channels from various organisms and having different sensitivities. Significant differences between the behaviours of the two Systems plunged in membranes of variable thickness were highlighted. These differences led us to explore the role of the various domains and in particular the role of the periplasmic loops by building hybrid channels by combination of domains from different organisms. The results obtained confirm the fundamental role of the periplasmic loops in the sensitivity of the MscL

La formation de bicouches lipidiques supportées est réalisée sur la surface des pores d’une électrode d’alumine nanoporeuse. Trois types de modèles membranaires ont été étudiés : une membrane reposant directement sur l’alumine et deux modèles découplés du support, soit par un assemblage biotine/streptavidine, soit par des polymères de PEG2000. La formation au sein des pores des différents modèles passe par l’utilisation de liposomes et une fusion déclenchée par l’emploi d’un agent fusogène. La caractérisation de la membrane est alors suivie par la réduction électrochimique d’ubiquinone incorporée dans les liposomes. L’emploi du modèle supporté par PEG2000 dans l’électrode en tant que biocapteur potentiel est montré pour la détection de molécules membranotropes. Finalement, la reconstitution fonctionnelle du cytochrome bc1 de Rhodobacter sphaeroides dans les modèles supportés a été testée
The realization of supported lipid bilayers was realized inside the pores of a nanoporous alumina electrode. Three kinds of model membranes were studied: an alumina supported bilayer and a biotine/streptavidin or a PEG2000 tethered bilayer. The bilayer formation inside the pores was accomplished by a PEG8000-triggered fusion of liposomes. The lipid bilayer characterization was then followed by electrochemical reduction of ubiquinone incorporated in the liposomes. The PEG2000 tethered model inside the nanoporous electrode was shown to behave as a biosensor for membranotropic molecules. At last, we tested the reconstitution of the Rhodobacter sphaeroides cytochrome bc1 inside the tethered model

Les membranes biologiques jouent un rôle crucial pour les cellules. Elles constituent leurs barrières externes et internes. Ces membranes régulent les flux de matière, d'information et d'énergie au sein des cellules. Les fonctions d'une membrane sont intimement liées à sa composition, altérer de cette composition peut altérer les fonctions membranaires. Un tel changement de composition peut être du à l'ajout de molécules exogènes, tels des médicaments ou des polluants. L'effet de ces molécules sur les membranes n'est pas toujours compris. De plus, l'environnement chimique d'une molécule affecte son comportement ; ainsi, une membrane lipidique affecte les molécules exogènes qui y sont intégrées. Les détails moléculaires de ce phénomène restent méconnus. Ici, j'ai utilisé des simulations de dynamique moléculaire pour étudier l'effet de nanoparticules de carbone sur des modèles membranaires, ainsi que l'effet des membranes sur les nanoparticules. Je montre que des nanoparticules de polystyrène altèrent des propriétés membranaires, notamment l'organisation latérale des lipides. Cette organisation est affectée par d'autres molécules hydrophobes dont le fullerene C60. Cet effet dépend des molécules en jeu : les molécules aromatiques stabilisent la séparation des lipides tandis que les molécules aliphatiques mélangent les lipides. Je montre aussi que le fullerene C60 déstabilise le surfactant pulmonaire. Dans un second temps, je montre que les membranes lipidiques affectent la dimérisation de peptides transmembranaires ; puis je caractérise comment le fullerene C60 tend moins à s'agréger dans une membrane lipidique que dans des alcanes pourtant similaires chimiquement
Biological membranes have a crucial role in cells as they form their outer boundary with the plasma membrane, but also the inner boundaries as they border the organelles. Membranes regulate the flow of matter, information, and energy in all cell compartments. A membrane functions are tightly attached to its composition, so alterations of a membrane composition can alter the membrane function. Such change in composition can be due to the addition of exogenous molecules as drugs or pollutants. How these exogenous molecules alter membrane properties is not always known nor understood. In addition, the chemical environment of a molecule affects the its behavior; therefore, exogenous molecules embedded in a lipid membrane can be affected by the membrane. The molecular details of this effect on small molecules are not fully understood. In this thesis, I used molecular dynamics simulations to investigate the effect of carbon nanoparticules on the properties of membrane models, and the effect of these membranes on nanoparticules. I showed that polystyrene nanoparticules alter some membrane properties, especially the lipid lateral organization. Other hydrophobie molecules affect lipid lateral organization. This effect depends on the molecule: aromatic molecules, including C60 fullerene, stabilize the separation of the lipids; on the contrary, aliphatic molecules mix the lipids. C60 fullerene also destabilize lung surfactant. I investigated the effect of membrane properties on the dimerization of transmembrane peptides. Finally I characterized how C60 fullerene aggregate less in a lipid membrane than in chemically similar bulk alkanes

Les maladies neurodégénératives, telles que les maladies d'Alzheimer et de Parkinson, affectent les fonctions cognitives et motrices. Elles se caractérisent par une perte progressive de neurones, sans possibilité de régénération. Avec le vieillissement de la population, ces pathologies, principalement liées à l'âge, représentent un enjeu sociétal majeur. L'absence de diagnostic précoce, de traitements efficaces et la méconnaissance des mécanismes en jeu soulignent la nécessité d'en approfondir la compréhension. Les patients atteints de ces maladies présentent des accumulations de protéines anormales sous forme d’agrégats insolubles, dans ou à proximité des cellules cérébrales. Bien que chaque protéinopathie présente des agrégats spécifiques, elles partagent des caractéristiques communes, notamment leur structure appelée amyloïde. Ces amyloïdes, formés par l’auto-assemblage de monomères protéiques mal conformés par empilement, adoptent une structure caractéristique dite en cross-β. Plusieurs protéines amyloïdes pathogènes ont été identifiées et sont associées à diverses maladies neurodégénératives. La protéine Tau, impliquée dans la maladie d'Alzheimer et plus largement dans un groupe de démences appelées tauopathies, est principalement localisée dans les neurones, où elle stabilise les microtubules, éléments structurants du cytosquelette cellulaire. Toutefois, dans des conditions pathologiques, Tau se dissocie des microtubules, devient hyperphosphorylée et forme des agrégats amyloïdes fibrillaires. Les mécanismes exacts de cette agrégation restent mal compris. L'étude de l'agrégation de Tau repose sur la production in vitro de fibres amyloïdes. En raison de sa solubilité élevée liée à sa charge positive, la formation de ces fibres nécessite l’ajout de molécules polyanioniques, appelées cofacteurs, telles que l’héparine (un polysaccharide), des ARN ou des lipides. Cependant, des incertitudes demeurent quant au rôle précis de ces cofacteurs : catalysent-ils simplement l'agrégation ou sont-ils intégrés dans la structure des fibres ? Si tel est le cas, quel impact cela a-t-il sur la morphologie des agrégats ? La capacité de Tau à s'agréger en présence de lipides suscite des interrogations sur son comportement vis à vis des différentes membranes des neurones. L’interaction de Tau avec les membranes plasmiques a été démontrée, et pourrait jouer un rôle autant dans des processus physiologiques que pathologiques. Tau, en présence de lipides anioniques, altère-t-elle l’intégrité membranaire ? Qu'en est-il des lipides non anioniques ? Pour répondre à ces questions, ce projet de thèse combine plusieurs approches biophysiques : spectroscopie infrarouge à réflexion totale atténuée (ATR-FTIR), microscopie à force atomique (AFM), microscopie électronique à transmission (MET) et résonance plasmonique de surface par ondes guidées (PWR). L’étude est structurée autour de deux axes principaux : (i) caractériser l’agrégation de Tau en présence de différents cofacteurs anioniques (héparine, ARN, phospholipides) et étudier l'impact sur la morphologie des fibres ; (ii) évaluer l’effet de l’interaction de Tau avec des membranes lipidiques de différentes compositions sur leur intégrité. Les résultats de cette thèse apportent de nouvelles perspectives sur les mécanismes pathogéniques de Tau et pourraient contribuer à une meilleure compréhension des tauopathies, ainsi qu'au développement de stratégies thérapeutiques
Neurodegenerative diseases, such as Alzheimer’s and Parkinson’s, affect cognitive and motor functions. They are characterized by a progressive loss of neurons, with no possibility of regeneration. With an aging population, these predominantly age-related diseases represent a major societal challenge. The lack of early diagnosis, effective treatments, and understanding of the underlying mechanisms highlights the need for further investigation. Patients suffering from these diseases exhibit abnormal protein accumulations in the form of insoluble aggregates, within or near brain cells. Although each proteinopathy presents specific aggregates, they share common features, notably their amyloid structure. These amyloids, formed by the misfolded protein monomers’ self-assembly through stacking, adopt a characteristic cross-β structure. Several pathogenic amyloid proteins have been identified and are associated with various neurodegenerative diseases. The Tau protein, implicated in Alzheimer’s disease and more broadly in a group of dementias known as tauopathies, is primarily located in neurons, where it stabilizes microtubules, structural elements of the cellular cytoskeleton. However, under pathological conditions, Tau dissociates from the microtubules, becomes hyperphosphorylated, and forms fibrillar amyloid aggregates. The exact mechanisms of this aggregation remain poorly understood. The study of Tau aggregation relies on the in vitro production of amyloid fibers. Due to its high solubility associated with its positive charge, fiber formation requires the addition of polyanionic molecules, called cofactors, such as heparin (a polysaccharide), RNA, or lipids. However, uncertainties remain regarding the exact role of these cofactors: do they simply catalyze aggregation, or are they integrated into the fiber structure? If so, what impact does this have on the morphology of the aggregates? Tau's ability to aggregate in the presence of lipids raises questions about its behavior in relation to the different membranes of neurons. Tau’s interaction with plasma membranes has been demonstrated and may play a role in both physiological and pathological processes. Does Tau, in the presence of anionic lipids, compromise membrane integrity? What about non-anionic lipids? To address these questions, this thesis project combines several biophysical approaches: attenuated total reflection Fourier-transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR), atomic force microscopy (AFM), transmission electron microscopy (TEM), and plasmon waveguide resonance (PWR). The study is structured around two main axes: (i) characterizing Tau aggregation in the presence of different anionic cofactors (heparin, RNA, phospholipids) and studying their impact on fiber morphology; (ii) assessing the effect of Tau's interaction with lipid membranes of varying compositions on membrane integrity. The results of this thesis provide new insights into the pathogenic mechanisms of Tau and may contribute to a better understanding of tauopathies as well as the development of therapeutic strategies

Notre travail a apporte une contribution a l'etude des phenomenes de transfert photoinduit de charges electriques par des porphyrines metallees face face. L'incorporation de ces centres reactionnels modeles dans des membranes lipidiques bimoleculaires planes favorise une superstructure permettant de donner au systeme modele l'asymetrie necessaire a l'expresion de sa fonction de fil a electrons. Cette propriete est alors mise en evidence par l'intermediaire d'une grandeur detectable (flux de charges electriques, potentiel electrique. . . ). Le flux de transfert de charges electriques transmembranaire est compose d'un flux purement electronique du a la photoexcitation des chromophores et d'un flux d'ions couple. A partir des donnees physicochimiques et phototphysiques, un mecanisme cinetique du transfert photoinduit d'electrons par les porphyrines est propose. Il repose sur la photooxydation des porphyrines a l'interface membrane solution acceptrice d'electron suivi d'un deplacement d'electron intramoleculaire et transmembranaire. Ce modele rend compte de l'essentiel des formes des signaux photoelectriques issues de l'experience

Les espèces réactives de l’oxygène (EROs) sont essentielles à la survie des cellules car elles interviennent dans divers processus physiologiques comme la défense immunitaire ou encore la régulation de voies de signalisation cellulaires. Cependant, un excès d’EROs peut créer un déséquilibre de la balance EROs/antioxydants appelé « stress oxydant ». Le stress oxydant étant impliqué dans l’étiologie de plus de 200 pathologies, l’action des antioxydants est cruciale pour limiter les effets délétères des EROs. Les antioxydants utilisés par les cellules peuvent être de nature chimique. Parmi ceux-ci, l’α-phenyl-N-tert-butyl nitrone (PBN) est particulièrement efficace en milieu biologique pour piéger les radicaux. Cependant, comme cette molécule présente le désavantage majeur de mal cibler les membranes, des nitrones amphiphiles dérivées de la PBN ont été synthétisées. Le premier chapitre décrit l’étude des interactions de nitrones dérivées du cholestérol avec les lipides membranaires. Ces travaux ont souligné l’influence du groupement polaire sur la nature des interactions avec les lipides membranaires. Aussi, l’étude des propriétés antioxydantes a permis de mettre en évidence l’importance de la localisation membranaire et l’influence de l’orientation du groupement PBN sur l’activité protectrice des dérivés. Le second chapitre décrit les résultats des expériences menées avec une deuxième série de dérivés amphiphiles, présentant la particularité d’avoir une chaîne perfluorée comme groupement hydrophobe. Bien que la localisation membranaire de ces dérivés soit nécessaire pour obtenir un effet protecteur significatif, la nature de l’antioxydant semble être ici le paramètre le plus important. Enfin, la combinaison d’antioxydants de nature différente sur une même molécule semble être une stratégie prometteuse pour améliorer l’efficacité antioxydante et créer un effet de synergie. En outre, pour se défendre, les cellules utilisent aussi des antioxydants issus de l’alimentation, en particulier des fruits et légumes. Parmi ces derniers, les composés phénoliques sont reconnus pour leurs effets bénéfiques sur la santé. Les flavonoïdes, les acides phénoliques, les stilbènes et les lignanes constituent les 4 classes principales de composés phénoliques. Les lignanes sont particulièrement présents dans les graines de lin (Linum usitatissimum). Le lin est la plante qui contient le plus de secoisolaricirésinol diglucoside. Afin de mieux comprendre leur fonctionnement et leurs interactions avec les lipides membranaires, plusieurs molécules appartenant à cette classe de composés ainsi que des acides hydroxycinnamiques ont été purifiées à partir du lin. Le troisième chapitre décrit les résultats des expériences menées avec les composés phénoliques extraits du lin. De manière générale, les composés testés se sont avérés efficaces pour protéger les lipides membranaires de l’oxydation. L’étude de leurs interactions avec les lipides membranaires a permis de montrer que le mode d’action des lignanes, qui pénètrent les membranes, est plus efficace que celui des acides hydroxycinnamiques
Reactive oxygen species (ROS) are essential in living cells as they intervene in several physiological processes like the immune system and signaling pathways. However, an excess of the production of ROS can alter the equilibrium with antioxidants. This imbalance is called oxidative stress. As oxidative stress has been reported to be implicated in more than 200 diseases, the action of antioxidants to limit the deleterious effects of ROS is crucial. The antioxidants used by the cells can be chemical. Among them, α-phenyl-N-tert-butyl nitrone (PBN) is widely used in biological systems to neutralize ROS. Because this molecule possesses a poor ability to target membranes, our collaborators synthesized amphiphilic nitrones bearing a PBN moiety. The first chapter describes the interactions of cholesterol derived PBN derivatives with the membrane. Results underlined the influence of the polar moiety on the nature of their interactions with membrane lipids. In addition, the evaluation of the antioxidant properties revealed the importance of the membrane localization of the nitrone moiety on the protective activity of the derivatives. The second chapter deals with a second set of amphiphilic nitrones that have the particularity of bearing a perfluorinated chain that constitutes the hydrophobic moiety. We noticed the membrane localization is important for the antioxidant efficiency; however the nature of the antioxidant moiety remains the most important parameter in this case. Finally, the strategy of grafting two different antioxidants on the same carrier seems to be promising to enhance the protective effect and create a synergistic antioxidant effect. However, cells also use natural antioxidants to defend themselves. These antioxidants come from food, especially from vegetables and fruits. Among them, phenolic compounds are known for their beneficial effects on health. Flavonoïds, phenolic acids, stilbenes and lignans constitute the 4 main classes of phenolic compounds. Lignans are particularly present in flaxseed (Linum usitatissimum). Flaxseed is the plant that possesses the highest quantity of secoisolariciresinol diglucoside. In order to understand their mechanisms of action and their interactions with membranes, lignans as well as hydroxycinnamic acids were purified from flaxseed. The third chapter describes the results obtained on model membranes. Generally speaking, both classes of compounds are efficient against lipid oxidation. Studying their interactions with membrane lipids allowed us to show that the mechanism of lignans, that penetrate membranes, is more efficient than the mechanism of hydroxycinnamic acids

Mon travail de thèse concerne l’étude des leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T). Il se décline en deux projets. Le premier, Le Saracatinib affecte les LAL-T humaines en ciblant la kinase LCK dans les cellules riches en radeaux lipidiques, nous a permis d’identifier une nouvelle voie métabolique importante pour la prolifération des cellules leucémiques. Nous avons montré que la kinase LCK est intégrée dans les radeaux lipidiques et impliquée dans la croissance des cellules leucémiques. L’inhibiteur de LCK Saracatinib affecte les cellules de LAL-T in vitro et in vivo en ciblant particulièrement les cellules les plus agressives ayant beaucoup de radeaux lipidiques à leur surface. Ces résultats permettent d’envisager une nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter les LAL-T et ont fait l’objet d’une publication parue dans Leukemia en janvier 2018. Le second projet, Les leucémies aiguës lymphoblastiques T produisent l’interleukine 7 de manière autocrine, démontre pour la première fois que pour la plupart des LAL-T, les cellules sont capables de sécréter elles-mêmes la cytokine IL-7. Nous avons complété cette étude par une analyse des mécanismes épigénétiques impliqués dans la régulation de cette sécrétion autocrine. Nos résultats montrent qu’elle est activée par la fixation des facteurs de transcription IRF-1 (Interferon Regulatory Factor 1) et IRF-2 au niveau du promoteur du gène IL 7, lorsque celui-ci est peu méthylé. Grâce à l’inactivation du gène IL-7 dans un de nos modèles de LAL-T, nous avons pu démontrer que la sécrétion autocrine favorise le développement de la leucémie chez la souris xénogreffée en impactant la prise de greffe et le nombre de cellules initiatrices de leucémie. Ainsi, la régulation épigénétique de la sécrétion autocrine d’IL-7 pourrait être impliquée dans les premières étapes de la leucémogenèse des LAL-T
My PhD work concerns T-cells acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) and includes two projects. The first one, Saracatinib impairs maintenance of human T-ALL by targeting the LCK tyrosine kinase in cells displaying high level of lipid rafts, allow us to identify a new signaling pathway important for the proliferation of T-ALL cells. We showed that LCK is localized into lipid rafts and is involved in the growth of T-ALL cells. The LCK inhibitor Saracatinib affects T-ALL cells in vitro and in vivo by targeting the most aggressive cells displaying high level of lipid rafts. These results highlight a new therapeutic strategy to treat T-ALL and were published in Leukemia in January 2018. The second project, T cell acute lymphoblastic leukemia produces autocrine interleukin 7, demonstrated for the first time that T-ALL cells are able to produce IL-7 cytokine. We performed an analysis of epigenetic mechanisms involved in the regulation of this autocrine secretion. Our results showed that when the IL-7 gene promoter is low methylated, Interferon Regulatory Factor 1 (IRF-1) and (IRF-2) transcription factors bind IRF-E sequence and upregulate IL-7 gene transcription. Thanks to IL 7 gene inactivation in one of our T ALL models, we demonstrated that autocrine secretion promotes leukemia development on xenografted mice through increasing engraftment cells capacity and leukemia initiating cells number. Thus, epigenetic regulation of IL-7 autocrine secretion may be involved in the leukemogenesis of T-ALL

Le stress oxydant dans les systèmes biologiques est contrôlé par un équilibre entre les espèces pro- et antioxydantes. L'activité des molécules antioxydantes est cruciale pour préserver les fonctions des biomolécules qui peuvent être dégradées par le stress oxydant. L'ADN, les protéines et les lipides en sont les cibles privilégiées. L'efficacité des antioxydants peut dépendre du substrat oxydable et de la localisation cellulaire : sur le lieu de production d'EROs ou à proximité des cibles moléculaires de l'attaque oxydante. Les polyphénols sont des antioxydants naturels très abondants dans le règne végétal et dans notre alimentation. Leur rôle dans la prévention de maladies liées au stress oxydant constitue un domaine de recherche émergent. Nous avons étudié cinq polyphénols de différentes classes (acides phénoliques, flavonoïdes, lignanes), afin d'établir une relation entre leur structure chimique, leur insertion membranaire et leur efficacité antioxydante contre la peroxydation lipidique. Nous avons étudié l'interaction des polyphénols avec des membranes lipidiques à l'aide de modèles tels que les liposomes et les monocouches de Langmuir. Nous avons mis en évidence les différents paramètres impliqués dans leur activité. Grâce à leur structure, les polyphénols piègent efficacement les radicaux libres. Ils sont capables de s'insérer spontanément dans des vésicules lipidiques. Ainsi, leur localisation au niveau des têtes polaires des phospholipides ainsi que leur capacité à augmenter l'ordre lipidique en phase fluide leur permettrait d'améliorer leur efficacité. De plus, les polyphénols seraient capables de s'insérer dans les membranes biologiques sans modifier leurs propriétés physico-chimiques et présentent une plus grande affinité pour les lipides insaturés, cibles de l'oxydation. Enfin, nous avons montré que l'efficacité antioxydante des polyphénols contre la peroxydation lipidique s'expliquait généralement par une complémentarité des fractions membranaires et extramembranaires
Oxidative stress in biological systems is controlled by the balance between pro- and antioxidants. The protective effect of antioxidant molecules is crucial to preserve the functions of biomolecules that can be degraded by an oxidative stress. DNA, proteins and lipids are the major targets. The protective efficiency of antioxidant may then depend on the oxidizable substrate and their cellular location : near areas where prooxidants are produced or near the biomolecular targets of oxidant attacks. Polyphenols are natural antioxidants commonly distributed in the plant-kingdom and our diet. Their role in the prevention of degenerative diseases associated with oxidative stress constitutes an emerging field of research. We studied some polyphenols belonging to different classes (phenolic acids, flavonoids, lignans) to establish a relationship between structure, membrane insertion and antioxidant activity. To better understand their biological activity, we investigated the ability of polyphenols to interact with lipid membranes by using models such as liposomes and Langmuir monolayers. We highlighted the different parameters involved in their activity. Thanks to their structure, polyphenols scavenge free radicals efficiently. They are able to insert spontaneously into lipid vesicles. Thus, their location at the polar headgroups of phospholipids and their ability to increase lipid order in fluid phase would enable them to improve their efficacy. Furthermore, polyphenols would insert into biological membranes without altering their physicochemical properties and exhibit a greater affinity for unsaturated lipids, which are the targets of the oxydation. Finally, the antioxidant efficacy of polyphenols against lipid peroxidation would be explained by the activty of molecules found both in the membrane and in the external compartment

Nous avons développé un nouveau modèle de biomembrane de type bicelle, dont la normale n, s’oriente parallèlement au champ magnétique B0, sans ajout d’ions paramagnétiques. Ces nouveaux objets, de forme bicouche discoïdale, ont pu être observés par microscopie électronique et un diamètre moyen de 800 Å a été statistiquement déterminé. Ce système est constitué d'un mélange approprié de lipides à chaînes courtes (DCPC) et à chaînes longues, le 1-Tétradécanoyl-2-(4-(4-Biphényl)Butanoyl)-sn-glycero-3-PhosphatidylCholine (TBBPC). La présence de deux cycles phényles sur l’une des chaînes aliphatiques confère au TBBPC une anisotropie de susceptibilité magnétique positive, à l’origine de l’orientation spécifique n//B0 des bicelles TBBPC/DCPC. Cette orientation a été caractérisée par diffusion des rayons X aux petits angles et par RMN des solides 31P, 2H et 14N. Les domaines d’existence de ces bicelles en fonction de la composition lipidique, de la température et de l’hydratation, ont ainsi pu être déterminés et comparés à ceux du système DMPC/DCPC, dont la normale s’oriente perpendiculairement à B0. Par l’analyse RMN-2H du TBBPC-2H27, nous avons évalué la dynamique des bicelles biphényles, qui est équivalente à celle des bicelles saturées. Nous avons également montré par diffusion des rayons X, que ces bicelles TBBPC/DCPC conservent leur orientation spécifique n//B0 pendant plusieurs jours en dehors du champ magnétique, ce qui peut trouver de nombreuses applications dans des études biophysiques. Enfin, ces nouveaux modèles membranaires présentent des avantages pour l’étude structurale et orientationnelle (par RMN-15N) de biomolécules telles que des peptides amphipatiques.

Les canaux mécanosensibles de large conductance (MscL) sont des protéines membranaires intégrales permettant à la bactérie de survivre lors de chocs hypo-osmotiques. Leur principale caractéristique est de s'ouvrir en réponse à un stress mécanique : une tension de la membrane.
La compréhension de leur mode d'activation est un prérequis pour élaborer un modèle global du mécanisme de sensibilité à la tension membranaire.
Nous avons étudié ici les premières étapes du mécanisme d'ouverture du MscL induites par une diminution de l' épaisseur membranaire, ainsi que les interactions gouvernant ces changements conformationnels par des simulations de dynamique moléculaire. La comparaison de l'analyse en composante principale des tra jectoires et des directions données par l'analyse en modes normaux nous a permis de mettre en évidence l'influence de la membrane sur la dynamique intrinsèque du canal. Nous avons ensuite étudié des canaux MscL issus de différents organismes et présentant des sensibilité mécaniques différentes. Des différences significatives entre les comportements des deux systèmes plongés dans des membranes d' épaisseur variable ont été mises en évidence.
Ces différences nous ont conduit à explorer le rôle des différentes régions et notamment le rôle des boucles périplasmiques en construisant des canaux hybrides par combinaison de régions issues d'organismes différents. Les résultats obtenus confirment le rôle primordial des boucles periplasmiques dans la sensibilité du MscL.

Après le génome, le nouveau défi est celui du protéome. Nous avons progressé vers la mise au point de la séparation électrophorétique des protéines membranaires dans un milieu qui leur conviendrait, type bicouche lipidique supportée. La grandeur principale, mesurée par FRAPP, a été le coefficient de diffusion de lipides ainsi que des protéines. L'étude du comportement de la bicouche supportée a permis de mettre en évidence, pour certains supports et dans certaines conditions de température, la formation d'une phase ondulée (ou ripple) malgré la proximité du support. La diminution de la portée des interactions coulombiennes par adjonction de sel se traduit par une augmentation de plusieurs ordres de grandeur du coefficient de diffusion, approchant au final le comportement d'une bicouche libre, tout en conservant les étapes caractéristiques de la transition gel/fluide. L'ordre de grandeur de ces énergies d'interactions a été estimé à partir des courbes D= f(T) et validé par une étude préliminaire originale de DSC sur des bicouches lipidiques supportées. L'α-Hémolysine s'insère spontanément sous forme d'un pore heptamérique dans nos bicouches supportées et diffuse librement. En l'incubant en phase mixte (zones gel+ zones fluide), nous observons la formation de complexes de protéines. La dépendance du coefficient de diffusion avec la taille de l'objet est en 1/R2, R étant le rayon équivalent de la partie insérée de l'objet. L'application d'un champ électrique montre un transport électrophorétique dont la direction et l'importance sont modulées par la charge de l'objet. La mobilité électrophorétique varie également en 1/R2
After the genome, the new challenge is the proteome. We have progressed toward electrophoretic separation of membrane proteins in a medium that they love, a supported lipid bilayer. The main parameter, measured by FRAPP, was the diffusion coefficient of different objects (lipids, proteins). Studying bilayer behaviour has showed that, on particular supports and in a given temperature range, ripple phase can exist, despite the proximity of the support. Adding salt decreases coulombic interactions which turns to increase the diffusion coefficient over several orders of magnitude, reaching the value for a free-standing bilayer in the fluid phase, meanwhile the main characteristic steps of the global gel/fluid transition are still observed. Estimation of the value of the interaction energy has been made and compared to results of a preliminary DSC study. α-Hémolysin self-inserts spontaneously as an heptameric pore in supported bilayers and diffuses freely. Incubating in a gel/fluid mixture leads to protein complex formation. Diffusion varies with size as 1/R2, R being the equivalent radius of the inserted part of the object. Applying an electric field results in an electrophoretic motion where direction and magnitude are modulated by the charge of the object. Electrophoretic mobility varies also as 1/R2. Size dependence, magnitude of mobilities and a simple building protocol allow to hope carrying out soon a real electrophoretic separation of a protein mixture

Après le génome, le nouveau défi est celui du protéome. Nous avons progressé vers la mise au point de la séparation électrophorétique des protéines membranaires dans un milieu qui leur conviendrait, type bicouche lipidique supportée. La grandeur principale, mesurée par FRAPP, a été le coefficient de diffusion des objets d'un système biomimétique modèle (lipides, protéines). L'étude du comportement de la bicouche supportée a permis de mettre en évidence, pour certains supports et dans certaines conditions de température, la formation d'une phase ondulée (ou ripple) malgré la proximité du support. La diminution de la portée des interactions coulombiennes par adjonction de sel se traduit par une augmentation de plusieurs ordres de grandeur du coefficient de diffusion, approchant au final le comportement d'une bicouche libre, tout en conservant les étapes caractéristiques de la transition gel/fluide. L'ordre de grandeur de ces énergies d'interactions a été estimé à partir des courbes D= f(T) et validé par une étude préliminaire originale de DSC sur des bicouches lipidiques supportées. L'α-Hémolysine s'insère spontanément sous forme d'un pore heptamérique dans nos bicouches supportées et diffuse librement. En l'incubant en phase mixte (zones gel+ zones fluide), nous observons la formation de complexes de protéines. La dépendance du coefficient de diffusion avec la taille de l'objet est en 1/R2, R étant le rayon équivalent de la partie insérée de l'objet. L'application d'un champ électrique montre un transport électrophorétique dont la direction et l'importance sont modulées par la charge de l'objet. La mobilité électrophorétique varie également en 1/R2. La dépendance en taille, les valeurs obtenues et le mode opératoire simple permettent d'espérer la réalisation prochaine d'une véritable séparation électrophorétique pour un mélange de protéines.

Les membranes biologiques sont impliquées dans divers mécanismes comme la reconnaissance moléculaire ou encore la fusion membranaire. Les lipides, principaux composants des membranes, sont inhérents à ces processus cellulaires, mais leur organisation et leur rôle fonctionnel au sein de ces systèmes sont très complexes. Dans ce travail, nous avons utilisé des modèles membranaires mimant ces systèmes biologiques pour identifier les interactions mises en jeu avec divers agents exogènes (AEs), en utilisant la microscopie à force atomique (AFM). Nous avons donc travaillé sur deux AEs différents qui interagissent potentiellement avec ces membranes. Le premier intervient directement dans le cadre de l'étude du paludisme. Le mécanisme moléculaire de cette maladie (impliquant probablement des structures lipidiques) n'étant pas clair, la compréhension de celui-ci faciliterait le développement de nouvelles molécules antipaludiques et/ou cibles thérapeutiques. Parallèlement notre étude s'est portée sur l'interaction des nanoparticules (NPs) de TiO2, notre second AE, avec les membranes. Très utilisées dans l'industrie, ces NPs de TiO2 pourraient avoir un impact sur la santé humaine, en interagissant notamment avec les membranes cellulaires. Des techniques biophysiques classiques ont tout d'abord été utilisées pour évaluer l'interaction de l'AE avec des systèmes biomimétiques. Ensuite, lorsque celle-ci est prouvée, l'AFM est utilisée pour visualiser les changements morphologiques des modèles membranaires en présence de ces AEs. Ainsi, pour chaque AE, nous avons finalement suggéré un mécanisme d'interaction afin de répondre aux problématiques soulevées.

Il est aujourd'hui bien connu qu'il existe des compartimentations latérales au sein même de la membrane, définissant des domaines. Une grande attention a été portée ces dernières années à des domaines membranaires particuliers, les " rafts ". Ces domaines enrichis en cholestérol et sphingolipides seraient impliqués dans certains processus de signalisation cellulaires qui nécessitent un transfert de l'information à la fois spécifique et efficace, comme c'est le cas notamment des RCPG. Dans cette étude, le rôle de l'environnement lipidique sur l'activité de deux RCPG, les récepteurs humains µ et d aux opioïdes (hMOR et hDOR) a été recherché. Des fractions enrichies en cholestérol (DRM) ont été analysées après extraction à froid en TX-100 de membranes cellulaires et la présence des récepteurs hMOR ou hDOR a été recherchée. Les données indiquent que peu de hDOR et hMOR sont retrouvés dans ces fractions à l'état basal, mais la redistribution d'une partie de ces récepteurs dans les DRM, dépendante de l'association des récepteurs aux protéines G, est observée après activation par leur ligand agoniste. Les données de pharmacologie obtenues après modulation de la teneur en cholestérol des membranes contenant ces récepteurs ont montré clairement un effet de la déplétion en cholestérol sur la fonctionnalité de hMOR et hDOR. Enfin, pour mieux cerner le rôle du cholestérol dans la distribution et l'activité des récepteurs, l'influence d'un autre stérol, l'ergostérol, a été étudié. Une modulation éventuelle de l'activité du récepteur hDOR par l'épaisseur de la membrane a été analysée en reconstituant le récepteur dans des liposomes ayant des lipides de longueur de chaînes variables
Numerous evidences show the existence of lateral heterogeneities within the plasma membranes defined as lipid domains. Among these, lipid rafts, have been extensively studied. They are characterised by an enrichment in cholesterol and sphingolipids, and are depicted as fluid plaforms that segregate membrane components involved in a particular signaling process, like signal transduction of GPCR, promoting the specificity and the efficiency of the response. Here we study the role of the lipidic environment on the activity of two GPCRs, namely human mu and delta opioid receptors (hMOR and hDOR). Cholesterol, which is a main component implicated in the formation of rafts, was here the subject of a particular interest. Membranes fractions that were enriched in cholesterol (DRM) were analysed after cold extraction by TX-100 of cellular membranes. The data we obtained show that hMOR and hDOR are found in DRM at a basal state. In contrast, when activated by an agonist, a relocalisation of a fraction of these receptors is observed in DRM and we show that this phenomenon is dependant of the association of these receptors with G-proteins. The analysis of pharmacological properties of hDOR and hMOR upon cholesterol depletion show clearly that some pool of receptors need cholesterol for function. To complete these data, we next examined whether this effect was due to direct interactions of the receptors with cholesterol or membrane thickness. To test this assumption, we have investigate the effect of ergosterol on hMOR and hDOR pharmacology and the acyl-chain length of the phospholipids on the function of the reconstituted hDOR

Ma thèse aura porté son attention sur deux des acteurs centraux des voies de réponses aux stress d'enveloppe chez E coli : la protéase - chaperon périplasmique DegP et l'histidine kinase CpxA. Dans un premier temps, j'ai isolé et étudié des complexes formés in vivo entre un variant protéolytiquement inactif de DegP et des substrats physiologiques (les porines OmpC et OmpF). Ces études m'ont permis de déterminer que l'interaction de DegP avec ses substrats nécessite une réorganisation de la structure oligomérique. J'ai également caractérisé l'activité protéase de DegP et déterminé la spécificité de clivage. Enfin, j'ai étudié l'effet chaperon de DegP, in vivo comme in vitro, sur des mutants de la protéine périplasmique MalE affectés dans leur repliement. Ces données suggèrent qu'un même substrat peut à la fois être la cible de l'activité protéase et chaperon. J'ai également caractérisé la structure oligomérique de l'histidine kinase membranaire CpxA en détergent par ultracentrifugation analytique. Ces résultats démontrent que CpxA existe sous différents oligomères dont le trimère de dimère serait la forme majoritaire. Afin de poursuivre une étude fonctionnelle plus détaillée, j'ai reconstitué le système Cpx in vitro dans un modèle mimétique de membrane : le nanodisc. Réinsérée dans une bicouche lipidique, la protéine est plus « fonctionnelle » que dans des micelles de détergents et le phosphotransfert de CpxA vers son régulateur de réponse CpxR est inhibé par la présence de CpxP, un effet non observé en détergent. Ces études devraient permettre de caractériser plus finement les différentes activités contrôlées par CpxA sans l'effet délétère du détergent
During my PhD, I have conducted biochemical analysis on two major proteins involved in the extracytoplasmic stress responses in E coli : the periplasmic chaperone - protease DegP and the histidine kinase CpxA. In the first part of the project, I have isolated complexes made in vivo between a proteolytic defective mutant of DegP and the porine OmpC and OmpF. This allowed me to determine that DegP needs a complete oligomeric restructuration to interact with its substrates. I have also caracterized DegP protéase activity and determine its cleavage specificity. Finally, I have studied DegP chaperon activity towards Maltose Binding Protein folding mutants both in vivo and in vitro. Depending of their ability to fold, I showed that a same substrate can be both the target of DegP protease or chaperon activity. In the second part of the project, I have determined the oligomeric structure of CpxA in detergent micelles by analytical ultracentrifugation. These results showed that CpxA in solution exists as different oligomers with the trimer of dimer being the main species. To get insight into CpxA enzymatic activities, I reconstitued the Cpx System in vitro using the nanodiscs technology. Inserted in this membrane mimetic environment, CpxA activity is inhibited by CpxP, an effect which was not observed in detergent. This study should be the beginning of a more detailed analysis of the enzymatic mechanisms involved in this important class of bacterial transducing pathway, without the deleterious effect of detergents

Les résultats obtenus dans ce travail ont permis de démontrer que chez les deux bactéries lactiques modèles, L. lactis subsp. cremoris et O. oeni, la transcription du gène cfa, codant pour la Cfa synthase, est stimulée lorsque les cellules entrent en phase stationnaire de croissance ou lorque que les cellules sont cultivées en conditions de stress (milieu acide ou présence d'éthanol dans le milieu). Le rôle des CFA a pû être appréhendé par l'analyse physiologique comparative de la souche parentale L. lactis subsp. cremoris et du mutant Δcfa généré chez cette souche. Les forts pourcentages de survie obtenus chez les souches cultivées à pH 5,0, puis subissant un stress acide (pH 3,0), prouvent que la cyclopropanation des acides gras insaturés n'est pas indispensable à la survie de L. lactis subsp. cremoris en conditions de stress acide. En outre, les données d'anisotropie de fluorescence démontrent que la présence de CFAs membranaires ne permet pas de réguler le niveau de fluidité membranaire, en particulier avec les souches cultivées en présence d'éthanol, où une fluidification membranaire est observée dans tous les cas. L'hypothèse d'un équilibre entre les acides palmitoléique / cis-vaccénique / lactobacillique pour réguler la fluidité membranaire chez L. lactis subsp. cremoris est avancée. L'étude du rôle physiologique des CFA chez O. oeni nécessite l'expression du gène cfa de la bactérie en système hétérologue. Les résultats obtenus confirment la fonctionnalité du gène chez la bactérie hôte L. lactis subsp. cremoris, cependant la cyclisation du précurseur acide cis-vaccénique, reste partielle chez la souche mutante complémentée. Un travail de caractérisation biochimique in vitro de l'enzyme Cfa synthase de O. oeni a donc été entrepris afin d'expliquer la faible efficacité de l'enzyme de O. oeni chez la bactérie hôte. Les travaux réalisés ont permis la surproduction et la purification de l'enzyme. Une technique de mesure d'activité in vitro a été également développée. Une stratégie d'expression du gène cfa de O. oeni en système hétérologue dans la bactérie hôte E. coli BL21 Star a permis la surpoduction d'une protéine d'environ 45 kDa, en accord avec la masse moléculaire théorique de la Cfa synthase de O. oeni. A partir de l'extrait protéique, une purification a été réalisée par chromatographie d'affinité sur colonne d'agarose nickel. Les tests d'activité enzymatique in vitro ont pu été réalisés. La température optimale de l'enzyme est de 35,8°C. Son pH optimal est de 5,6. Même en se plaçant dans les conditions physico-chimiques optimales de l'enzyme, nous constatons que la cyclisation in vitro de l'acide cis-vaccénique issu des phospholipides membranaires du mutant L. lactis subsp. cremoris Δcfa reste partielle. Ceci induit une détermination expérimentale de valeurs de KM et Vmax largement supérieures aux données citées dans la littérature. La différence, entre les deux bactéries modèles, de nature et de répartition des phospholipides membranaires pourrait expliquer l'action partielle de la Cfa synthase de O. oeni.

Des mutations dans les gènes codant pour des myotubularines (MTM) sont responsables de maladies neuromusculaires telles que la XLCNM (MTM1) ou la CMT4 (MTMR2 & MTMR13). Les MTMs sont des phosphatases à phosphosinositides (PPIn), des messagers lipidiques essentiels pour la régulation spatio-temporelle de fonctions cellulaires vitales.La présence de 14 paralogues de MTMs chez l'Homme complique l'analyse de la fonction cellulaire d'un seul membre de la famille. La levure Saccharomyces cerevisiae, dont l'organisation cellulaire est comparable à une cellule humaine, ne compte en revanche qu'un seul homologue de MTM (YMR1), pour lequel nous disposons de mutants de délétion viables.L'expression de MTM1 sauvage ou mutants de patients dans la levure montre seules les myotubularines enzymatiquement actives induisent une morphologie anormale du compartiment lysosomal et un défaut du trafic membranaires endocytique.Nos résultats suggèrent que l'activité phosphatase de MTM1 ne serait pas à elle seule responsable de la XLCNM mais que d'autres mécanismes, tels que les interactions protéiques, pourraient prendre part au développement de la maladie.

Deux membres des Visinin-Like Proteins (VILIPs), VILIP-1 et VILIP-3, ont été étudiés à l'aide de deux modèles membranaires biomimétiques, les monocouches de Langmuir couplées à la microscopie à l'angle de Brewster (BAM) et les bicouches lipidiques supportées (SLB) visualisées par microscopie à force atomique (AFM). A l'aide de ces deux modèles, nous avons pu montrer que les VILIPs, protéines N-myristoylées et possédant quatre mains-EF, ont une cinétique d'interaction membranaire qui augmente en présence de calcium, probablement dû à la présence d'un mécanisme type « switch calcium-myristoyle ». En revanche, l'utilisation de protéines mutées, non myristoylées, a révélé que la présence du groupement myristoyle n'est pas le seul facteur nécessaire pour que ces protéines interagissent avec la membrane. La présence d'une région N-terminale riche en résidus lysine permettrait à cette famille de protéines d'interagir via des interactions électrostatiques avec des membranes possédant des lipides anioniques et plus particulièrement du phosphatidylinositol-4,5-biphosphate (PIP2). La présence d'un faible pourcentage de ce phosphoinositide dans la membrane est responsable de l'accélération de la vitesse d'interaction membranaire des VILIPs, ce qui est cohérent avec leur location subcellulaire in cellulo. Enfin, un nouveau modèle membranaire de bicouches lipidiques suspendues sur des pilotis peptidiques (pep-tBLM) greffés sur une surface d'or a été ensuite développé. La méthode présentée dans ce manuscrit permet de créer des tBLM, de la composition lipidique souhaitée, en utilisant un peptide pilotis spécifiquement conçu durant cette thèse. La création de ce modèle a été suivie en temps réel par imagerie de résonance plasmonique de surface (SPRi) et caractérisé par AFM et par microscopie de fluorescence
Two members of the Visinin-Like Proteins (VILIPs) family, VILIP-1 and VILIP-3, have been studied using two biomimetic membrane models, the Langmuir monolayers coupled to the Brewster angle microscopy (BAM) and the supported lipid bilayers (SLB) visualized by atomic force microscopy (AFM). Using these two models, we have shown that VILIPs, N-myristoylated proteins with four EF-hands, have a membrane interaction kinetic that increases in the presence of calcium, probably due to the presence of a "calcium-myristoyl switch" mechanism. Tn contrast, the use of unmyristoylated proteins revealed that the presence of the myristoyl group is not the only factor necessary for the interaction of these proteins with the membrane. The presence of a N- terminal lysine-rich region allows this family of proteins to interact through electrostatic interactions with membranes containing anionic lipids and particularly the phosphatidylionisitol-4,5-biphosphate (PIP2). The presence of a small percent of phosphoinositide in the membrane is responsible for the acceleration of the binding rate of VILIPs, which is consistent with their subcellular location in cellulo. Finally, a new membrane model of peptide tethered lipid bilayers (pep-tBLM) grafted onto a gold surface was developed. The method described in this manuscript allows the formation of tBLM, containing the desired lipid composition, by using a home-designed peptide as tether. The formation is followed in real time by surface plasmon resonance imaging (SPRi) and has been characterized by AFM and fluorescence microscopy

La membrane plasmique est souvent décrite comme une structure délimitant et protégeant la cellule de son environnement. Son rôle est bien plus complexe et multifonctionnel, c’est une plateforme d’échange et de contact incontournable entre les milieux externes et internes des cellules. De nombreuses fonctions cellulaires lui sont étroitement liées comme la migration, le transport de molécules, certaine voie de signalisation ou le contact avec des micro-organismes. Les travaux de cette thèse se focalisent sur l’étude de processus cellulaires s’orchestrant au niveau membranaire par un système mimant les propriétés des bicouches lipidiques : les liposomes. Ce modèle in vitro, permettant un contrôle fin des conditions expérimentales, représente une alternative aux analyses sur cellules entières souvent peu concluantes, faute de pouvoir cibler suffisamment précisément un processus membranaire en particulier. Les liposomes permettent la focalisation sur une fonction ou un constituant en particulier. Dans cette thèse, l’utilisation du modèle biomimétique a été déclinée pour l’étude de plusieurs processus. Les mécanismes d’adhésion de bactéries flagellées sur les bicouches lipidiques ont été étudiés. Ces informations obtenues sont de haute importance dans le contexte de résistance aux traitements, nous permettant d’avoir plus de données pour le développement de thérapies alternatives aux traitements antibactériens actuels. Le modèle de liposomes a également été utilisé comme base pour la formation de protéoliposomes dans l’étude d’une protéine transmembranaire, MRP4 (multidrug resistance associated protein 4). L’étude de cette protéine constitue un enjeu dans le cadre des traitements multi-médicamenteux car elle est au centre des interactions médicamenteuses. Et enfin, le modèle a été utilisé pour la caractérisation de l’interaction des bicouches de lipides avec des molécules à fort potentiel thérapeutique : les polyphénols. L’ensemble de ces travaux a été réalisé dans le cadre d’une collaboration avec l’équipe du Pr. Patrick Trouillas (Equipe INSERM U1248, CHU de Limoges) qui s’intéresse au développement de modèles cellulaires biomimétiques in silico
The plasma membrane was often described as a structure delimiting and protecting the cell from its external environment. However, his role is much more complex and multifunctional. The membrane is an exchange platform at the cellular external and internal environments. Many cellular functions are closely related to it, such as migration, transport of molecules, some pathways of metabolic signaling, or the contact with micro-organisms. This thesis focuses on the study of some cellular processes occurring at the membrane interface using a system that can mimic the lipid bilayer properties. This membrane models that allow a precise control of the in vitro conditions, represent a good alternative to the often inconclusive studies on whole cells. Liposomes allow focusing on a particular function or constituent. In this thesis, the use of the biomimetic model was declined for the study of several processes. The mechanisms of adhesion of flagellated bacteria to lipid bilayers were studied as a function of the physical properties of the lipid bilayers. This information is of paramount importance in the context of antibiotic resistance, giving more information for the potential development of alternative therapies. The liposome model was also used for forming proteoliposomes to study of a transmembrane protein, MRP4 (multidrug resistance associated protein). The study of this protein is an issue in multi-drug treatments. Indeed, this protein is widely involved in drug interactions. Finally, the liposome model was used to characterize the interaction with lipid bilayers of molecules with high therapeutic potential: polyphenols. All of this work was done in collaboration with the team of the Prof Patrick Trouillas (INSERM U1248 team, Limoges University Hospital) working on the development of biomimetic cell models in silico

La BSP1, principale protéine du plasma séminal bovin, interagit avec les membranes des spermatozoïdes et joue un rôle crucial dans les événements qui conduisent à la fécondité des spermatozoïdes, lors du phénomène de la capacitation. Le but de cette recherche est d’investiguer la nature de ces interactions. Ce travail vise à démontrer l’influence des lipides qui composent les membranes sur l’action de la protéine BSP1. À l’aide de la fluorescence intrinsèque de la protéine, l’affinité de la protéine a été caractérisée pour quatre systèmes lipidiques. Les résultats montrent que la composition lipidique affecte significativement l'affinité de la protéine pour les membranes. Nous avons observé l'ordre suivant : 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC) > POPC/1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (POPE) ≈ POPC/1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phospho-L-sérine (POPS) > POPC/cholestérol. La protéine interagit préférentiellement avec POPC. La présence de POPE, POPS, ou cholestérol dans la membrane diminue systématiquement l’affinité. Il est connu que la présence de POPE ou cholestérol augmente l’empilement des lipides dans les membranes. Cet effet de condensation des chaînes pourrait être défavorable à l’insertion de la partie hydrophobe de la protéine dans les membranes et réduire ainsi l'affinité. La diminution de l’affinité de la protéine induite par la présence de POPS, un lipide chargé négativement, pourrait être associée aux interactions électrostatiques répulsives car la protéine porte une charge globale négative. La littérature mentionne que la BSP1 extrait sélectivement les phospholipides de type choline et le cholestérol lors de son association avec les membranes de spermatozoïdes. Un efflux lipidique est aussi observé avec des membranes modèles. Nous avons désiré caractériser la « solubilisation » des membranes par la BSP1, par diffusion dynamique de la lumière. Comme étape préliminaire, nous avons étudié comment le détergent Triton X-100 solubilise les membranes en utilisant cette technique. Les mesures démontrent que la composition lipidique des membranes (POPC, POPC/POPE, POPC/1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3- [phospho-rac-(1-glycérol)] (POPG)) n’affecte pas le mécanisme général de solubilisation/reconstitution des membranes modèles. Il a été montré qu'il existe trois régions lors des processus de solubilisation pour les différents systèmes lipidiques : i) le détergent se distribue dans les membranes, ii) une coexistence de membranes saturées en détergents et de micelles mixtes de phospholipides/Triton X-100 et iii) exclusivement des micelles mixtes de phospholipides/Triton X-100. Nos résultats montrent que la forme conique de POPE augmente la résistance des membranes à la solubilisation. La présence de POPG, apportant une charge négative à l’interface des membranes, n’induit aucun changement aux processus de solubilisation/reconstitution des membranes par Triton X-100. La diffusion dynamique de la lumière a également permis d’observer si la protéine BSP1 induit des modifications morphologiques des membranes suite à son interaction avec les membranes de POPC. Nos observations n'ont montré aucune variation significative de la taille des particules lors du titrage des vésicules de POPC par la protéine, sur une gamme de rapport molaire de POPC/BSP1 variant de 20 à 0.6. Avec des compositions aussi différentes, on suppose une transition des vésicules saturées en protéine à des complexes de protéine avec un peu de lipides. Cependant, il semble impossible avec la diffusion dynamique de la lumière de différencier ces particules.
BSP1, the main protein in bovine seminal plasma, interacts with sperm membranes and plays a crucial role in events that lead to sperm fertility, during the capacitation. The purpose of this research is to investigate the nature of these interactions. This work aims to demonstrate the influence of the lipids that compose membranes on the action of the BSP1 protein. Using the intrinsic fluorescence of the protein, the affinity of the protein was characterized for four lipid systems. The results show that the lipid composition significantly affects the affinity of the protein for membranes. We observed the following order: 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) > POPC/1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (POPE) ≈ POPC/1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine (POPS) > POPC/cholesterol. The protein interacts preferentially with POPC. The presence of POPE, POPS, or cholesterol in membranes decreases systematically the affinity. It is established that the presence of POPE or cholesterol increases the packing of lipids in membranes. This condensation effect could be detrimental to the insertion of the hydrophobic part of the protein into the membranes and reduces, as a consequence, the affinity. The decrease in protein affinity induced by the presence of POPS, a negatively charged lipid, could be associated with repulsive electrostatic interactions as the protein global charge is negative. The literature mentions that BSP1 selectively extracts choline phospholipids and cholesterol when combined with sperm membranes. A lipid efflux is also observed with model membranes. We characterized membrane "solubilisation" by BSP1, using dynamic light scattering. As a preliminary step, we studied how Triton X-100 detergent solubilizes membranes using this technique. The measurements showed that the lipid composition of the membranes does not affect the general solubilization/reconstitution mechanism of the model membranes (POPC, POPC/POPE, POPC/1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1-rac-glycerol) (POPG)). It is known that three different regions exist during the solubilization process for the different lipid systems: i) the detergent is distributed in the membranes, ii) a coexistence of membranes saturated with detergents and mixed phospholipid/Triton X-100 micelles and iii) exclusively mixed phospholipid/Triton X-100 micelles. Our results show that the conical shape of POPE increases the resistance of the membranes to solubilization. The presence of POPG, bringing a negative charge at the membrane interface, does not induce any change in solubilization/reconstitution processes. Dynamic light scattering also made it possible to observe if the BSP1 protein induces morphological changes in the membranes following its interaction with POPC membranes. Our observations showed no significant variation in particle size during the titration of POPC vesicles by the protein, over a molar ratio range of POPC/BSP1 from 20 to 0.6. Considering such different compositions, a transition from vesicles saturated with protein to protein complexes with some lipids is assumed. However, it appeared impossible with dynamic light scattering to differentiate these particles.