Gotowa bibliografia na temat „Lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL)”

Les protéines de chocs thermiques (HSP) sont des protéines très conservées au cours de l’évolution des espèces. Ce sont des chaperons moléculaires impliqués dans le repliement des protéines nouvellement synthétisée ou dénaturées. Les HSP sont fortement exprimées dans les cellules cancéreuses, où elles contribuent à la résistance à l’apoptose et aux chimiothérapies. Parmi les HSP, HSP110 est jusqu’à présent peu étudiée. Cependant, HSP110 a été récemment associée au lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL). Le DLBCL est le syndrome lympho-prolifératif agressif le plus fréquent chez l’adulte (30% des lymphomes non-Hodgkinien). Il existe trois principaux sous-type de DLBCL : le type B activé (ABC-DLBCL), le type centre germinatif (GC-DLBCL) et le type lymphome primaire du médiastin (PMBL). La forme activée est celle associée au plus mauvais pronostic clinique. Bien que les thérapies classiques de chimiothérapies associées aux anti-CD20 aient permis d’augmenter le pronostic de survie des patients souffrant de l’ABC-DLBCL, nombreux sont ceux qui développent des résistances ou qui ne répondent pas aux traitements. L’identification de nouvelles cibles thérapeutiques est donc nécessaire.Mes travaux présentent un rôle de HSP110 dans l’activité d’une voie oncogénique du lymphome ABC-DLBCL. En effet, ces travaux démontrent une forte expression d’HSP110 dans les échantillons patients ABC-DLBCL. De plus, ces travaux in vitro sur des lignées ABC-DLBCL montrent une interconnexion entre HSP110 et Myd88 L265P, protéine mutée responsable de l’activation de la voie NF-kB. HSP110 stabilise l’oncogène Myd88 L265P, et participe à l’amplification de la voie NFkB dans le lymphome ABC, voie responsable de la survie et de la prolifération des cellules ABC-DLBCL.Par le biais d’une collaboration, nous avons pu obtenir récemment des inhibiteurs de HSP110. Ainsi, mon travail à également consisté aux criblages in vitro de ces inhibiteurs pour évaluer leur capacité d’inhibition de HSP110. Deux composés ont alors été identifiés comme candidats inhibiteurs d’HSP110. Je me suis ensuite intéressé à l’utilisation de ces inhibiteurs in vitro dans l’ABC-DLBCL. Mes résultats tendent à montrer que ces inhibiteurs ont une action similaire à ceux observés lors de l’inhibition de HSP110 par siRNA ou shRNA.Mes travaux de thèse présente donc HSP110 comme une cible moléculaire potentielle de l’ABC DLBCL<br>Heat shock proteins (HSPs) are highly conserved protein across species, and are expressed in all cell type. HSPs are molecular chaperones involved in the folding of newly synthesized or denaturated proteins. HSPs are overexpressed in cancer cells, where they contribute to cancer resistance to chemotherapies. Among HSPs, roles and functions of HSP110 are less described. Interestingly, HSP110 was recently associated with lymphoma aggressiveness in Diffuse Large B Cell Lymphoma (DLBCL). DLBCL is the most lymphoproliferative disease diagnosed in adult (30% of Non-Hodgkin Lymphoma). Three main subtypes of DLBCL are described: Activated-B-Cell lymphoma (ABC-DLBCL), Germinal Center lymphoma (GC-DLBCL), and Primary Mediastinal B Lymphoma (PMBL). ABC-DLBCL is the most aggressive form associated with a poor prognosis. Even if R-CHOP therapies had improve patient’s survival over the last decades, most of patients experiences relapses or treatment resistances. New molecular target are now necessary to treat efficiently these subtypes.My PhD work has highlighted the role of HSP110 in the NFkB signaling pathway, which is an oncogenic pathway in ABC-DLBCL. First, we show that HSP110 is overexpressed in ABC-DLBCL patient sample. We also show an interaction between HSP110 and Myd88 L265P, that is an oncogenic protein responsible for NFkB pathway activation. Consequently, HSP110 stabilizes Myd88 L265P, leading to a sustain NFkB pathway activation in lymphoma cells, and promoting ABC-DLBCL cell survival and proliferation.Finally, our team recently characterized the first known HSP110 inhibitors. I took the opportunity to test these putative inhibitors in my study. My results suggest that these compounds have similar effects than siRNA or shRNA inhibition of HSP110 on ABC-DLBCL survival. This result provide a ground for future in vivo testing of chemical inhibitors of HSP110.In conclusion, my work highlight HSP110 as a potential therapeutic target in ABC-DLBCL

Les lymphomes diffus à grandes cellules B (DLBCL) sont la forme de lymphomes non–Hodgkiniens agressifs la plus fréquente chez l’adulte, et sont très hétérogènes à la fois sur le plan biologique et clinique. Bien que plus de la moitié des patients peuvent être guéris avec le traitement standard R-CHOP (combinant la polychimiothérapie CHOP aux anti-CD20 comme le rituximab) 30 à 40 % des patients échappent ou sont réfractaires au traitement, déterminant des morbidités et mortalités importantes liées au nombre limité d’alternatives thérapeutiques. L’objectif des travaux de cette thèse était centré sur les mécanismes de résistance thérapeutique dans ces lymphomes, et plus particulièrement les résistances au rituximab. Dans une première partie de la thèse, nous avons étudié le rôle de facteurs endogènes neuropeptidiques, les neurotrophines (NTs), et l’implication de leur signalisation dans la survie des cellules tumorales et leur sensibilité à l’apoptose induite par le rituximab. Nous avons montré dans un premier temps que les cellules B tumorales des patients présentaient des taux parfois élevés de neurotrophines (NGF, BDNF) et de leurs récepteurs de haute (Trk) et de basse affinité p75NTR. Puis les résultats obtenus in vitro sur des lignées cellulaires humaines de DLBCL et in vivo (xénogreffes tumorales) ont mis en évidence l’existence d’un axe de survie BDNF/TrkB/p75NTR pouvant interférer avec l’efficacité de l’immunothérapie. Cet axe contribue à la survie des cellules tumorales et pourrait aussi participer à la résistance thérapeutique aux anti-CD20 en modulant l’expression du CD20 à la surface des exosomes. En effet ces microvésicules, sécrétées en grande quantité par les cellules B tumorales, expriment le CD20 à leur surface et seraient à ce titre impliquées dans l’échappement thérapeutique en réalisant des « récepteurs –leurres » vis-à-vis des anticorps thérapeutiques. Dans une 2e partie de cette thèse, nous avons évalué dans les DLBCL le rôle potentiel de nouvelles cibles émergentes en oncologie, les prohibitines (PHBs) et le facteur d’initiation de la traduction eIF4A. Pour cela, nous avons utilisé un ligand de ces acteurs cellulaires de la famille des flavaglines, le FL3. Nous avons montré que le FL3 présente un effet apoptotique très important in vitro sur les lignées cellulaires de DLBCL et in vivo sur les tumeurs induites chez la souris. Nos travaux ont permis d’en préciser les mécanismes moléculaires, mettant en évidence le rôle des PHBs en lien notamment avec l’activation d’Erk1/2, et la formation et l’activité du complexe eIF4F dans la survie des cellules de DLBCL. Les données préliminaires obtenues à partir des biopsies de patients montrent, de plus, que la forte expression de PHB1 pourrait avoir une valeur pronostique dans ces lymphomes. L’ensemble de nos travaux ont permis de mettre en évidence de nouvelles voies de survie et d’échappement thérapeutique dans les DLBCL, qui pourraient permettre d’identifier aussi de nouveaux marqueurs biologiques à valeur diagnostique et/ou pronostique pour le choix de thérapies ciblées<br>Diffuse large B cell Lymphomas (DLBCL) are the most aggressive and heterogeneous biological and clinical form of non-Hodgkin lymphomas in adults. Although more than 50% of patients can be cured with standard therapy R-CHOP (combining the CHOP chemotherapy to the anti-CD20 as rituximab) 30 to 40% of patients exhibit primary refractory disease or relapse after initial response to therapy, determining morbidities and significant mortality related to the limited number of treatment options. The aim of this thesis was focussed on therapeutic resistances of these lymphomas, notably those of rituximab. In the first part of this thesis, we have evaluated the role of endogenous factor signaling, the neurotrophins (NTs), in DLBCL cell survival and sensitivity to the cytotoxicity of rituximab. We showed first that a high expression of neurotrophines (NGF, BDNF) and their high (Trk) and low (p75NTR) affinity receptors was often found in tumor B cells of DLBCL patients. Results obtained in vitro, on human cell lines of DLBCL, but also in vivo (xenografts) showed evidence of a survival BDNF/TrkB/p75NTR axis that can interfere with the efficacy of immunotherapy. This axis promotes survival of tumor cells and may also participate in rituximab resistance in regulating CD20 expression at the surface of exosomes. Indeed, these microvesicles, secreted in large amounts by the tumoral B cells, express the CD20 and would be involved in the therapeutic escape acting as decoy receptors upon rituximab exposure. In the second part of the thesis, we evaluated in DLBCL the potential role of new oncogenic targets, PHBs proteins and the initiation factor of translation eIF4A. To this end, we used one of their ligands, a synthetic flavagline named FL3. We showed that FL3 determines a strong apoptosis in vitro on DLBCL cell lines and in vivo on tumors induced in mice (xenografts). Our works have clarified the molecular mechanisms, demonstrating involvement of PHBs, in correlation with ERK1/2 activation, and eIF4F complex formation and activity. Preliminary data obtained in patient biopsies showed a high expression of PHB1 in tumor B cells that may be decisive for cell survival and patient outcome lymphomas.Overall, present results show evidence of new survival and rituximab escape mechanisms in DLBCL, that should allow to identify new diagnostic and prognostic biomarkers for alternative therapeutic options

A l’instar du lymphome de Burkitt (LB) avec la translocation de MYC, les lymphomes diffus à grandes cellules B (DLBCL) par d'autres mécanismes (mutation, amplification, dérégulation du promoteur) sont associés à une dérégulation de c-Myc, facteur de transcription maitre de la prolifération. Les DLBCL sont classés en deux sous-groupes: « centre germinatif » (GCB) et « cellule B activée » (ABC) avec activation constitutive de NF-κB. Cette activation constitutive de NF-κB peut être le résultat d'altérations génétiques (MYD88, A20, TRAF2 et TRAF5) ou de l'activation du BCR ou CD40. Ces caractéristiques soulèvent la question de la synergie d’action entre NF-κB et c-Myc dans les ABC-DLBCL. Nous avons analysé l’effet d'une activation continue de c-Myc dans un contexte de sur-activation de NF-κB par plusieurs inducteurs. Nos résultats montrent que la surexpression de c-Myc dans un contexte d'induction de NF-κB, i) par le programme EBV latence III, apporte un avantage sélectif à ces cellules (expression génique en faveur d'un métabolisme élevé, prolifération intense et protection contre apoptose), ii) par le TLR9 (modèle in vivo et in vitro), augmente la survie et la prolifération des lymphocytes B des souris λc-Myc (augmentation des cellules B activées, splénomégalie, augmentation de la prolifération des lymphocytes B, modification du microenvironnement tumoral), et iii) par CD40, induit une lymphomagenèse B très agressive dans les souris doubles transgéniques CD40/Myc, les tumeurs ont un phénotype proche des ABC-DLBCL. Ces résultats suggèrent que c-Myc est un événement co-transformant dans les lymphomes agressifs avec un phénotype activé par NF-κB, tel que les ABC-DLBCL<br>Not only Burkitt lymphoma (BL) with the translocation of MYC, but also diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) by other mechanisms (mutation, amplification, promoter dysregulation…) are associated with dysregulation of c-Myc, the master transcription factor for proliferation. DLBCL’s are classified in two subgroups: “Germinal center B-cell” (GCB) without and “activated B-cell” (ABC) with constitutive NF-κB activation. This constitutive activation of NF-κB can be the result of genetic alterations (MYD88, A20, TRAF2, and TRAF5) or the activation of B-cell receptor or CD40. These features raise the question of the synergy of action between NF-κB and c-Myc in ABC-DLBCL. We analyzed the effect of a continuous activation of c-Myc in a context of over-activation of NF-κB by several inductors. Our results show that overexpression of c-Myc in the context of induction of NF-κB, i) by EBV latency III program, provides a selective advantage to those cells (gene expression in favor of a high metabolism, intense proliferation and protection against apoptosis), ii) by TLR9 (in vivo and in vitro model) increases the survival and proliferation of B lymphocytes of λc-Myc mice (increase of activated B cells, splenomegaly, increased B cells proliferation, modification of tumor microenvironment), and iii) by CD40, induces a very aggressive B lymphomagenesis in CD40/Myc double transgenic mice, the tumors have a phenotype close to ABC-DLBCL. These results suggest that c-Myc is an NF-κB co-transforming event in aggressive lymphomas with an activated phenotype by NF-κB, such as ABC-DLBCL

Les facteurs de transcription de NF-κB jouent un rôle crucial dans la prolifération et la survie cellulaire, et la physiopathologie de nombreux cancers. La dérégulation de la voie classique de NF-κB est connue pour être impliquée au moins dans le sous-groupe ABC du lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL). Cependant, l'état d'activation de la sous-unité RelB de la voie alternative de NF-κB et son rôle restent inconnus. Nous avons démontré un engagement fréquent de RelB dans des lignées cellulaires humaines dérivées de DLBCL. L'activation RelB protège les cellules des dommages à l'ADN et de l'apoptose induites par la doxorubicine, le principal médicament utilisé dans le traitement du DLBCL. RelB a également contrôlé l'expression de la protéine anti-apoptotique cIAP2. Dans une cohorte de 66 patients atteints de DLBCL de novo, nous avons évalué directement l'activité de liaison à l'ADN de toutes les sous-unités de NF-κB par EMSA couplé à des supershifts. L'activation de RelB était présente dans 66,6% des cas, quelle que soit la classification ABC ou GCB, et constituait un prédicteur indépendant d’un mauvais pronostique. Le statut d’activation de RelB établi par l’EMSA a permis de définir une signature d’expression génique liée à RelB capable de confirmer l’impact négatif de RelB sur l’évolution des patients, lorsque étendue à une cohorte plus grande. Finalement, notre étude indique que RelB est potentiellement un nouveau biomarqueur pour le DLBCL et met en évidence son rôle important dans la biologie cellulaire de DLBCL<br>NF-κB transcription factors play critical role in cell proliferation, cell survival and the physiopathology of numerous cancers. Deregulation of the classical NF-κB pathway is known to be involved in at least the ABC subset of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). However, the activation status of RelB NF-κB alternative pathway subunit and its role remain unclear. We have demonstrated a frequent engagement of RelB in human DLBCL-derived cell lines. RelB activation protected cells from DNA damage and apoptosis induced by doxorubicin, the main drug in DLBCL treatment. RelB also controlled the expression of the anti-apoptotic protein cIAP2. In a cohort of 66 de novo DLBCL patients, we have directly assessed the DNA binding activity of all NF-κB subunits by EMSA coupled with supershift. RelB activation was present in 66.6% of cases regardless of ABC or GCB classification and was an independent predictor of worse outcome. RelB activation status by EMSA allowed the definition of a RelB gene expression signature that was able to confirm RelB’s negative impact on patient outcome when extended to a larger cohort. Altogether, our study indicates that RelB is a potential new biomarker for DLBCL and sheds light on its important role in DLBCL cell biology

Le facteur de transcription Rel/NF-kB inclut 5 sous-unités (SU), p50, p52, c-Rel, RelA et RelB qui s'associent en dimères. NF-κB est au cœur de l'ontogénie des lymphocytes B matures dans les centres germinatifs (CG) pour c-Rel et RelB et lors de la différentiation en plasmocyte pour RelA. Le lymphome diffus à grandes cellules (DLBCL) représente plus de 80% des lymphomes B agressifs. Nous avons publié que les SU NF-kB doivent être prises en compte de façon différentielle, tel que RelB est un marqueur de mauvais pronostic, RelA est la SU du sous-type moléculaire ABC (activated B cell) et cRel celle des GCB (germinal center B cell)-DLBCL avec une signature transcriptomique nouvelle propre. Le présent projet consiste à comprendre mécanistiquement comment c-Rel induit la transformation d'un lymphocyte B du CG. Nous avons établi un nouveau modèle murin de surexpression de c-Rel (avec YFP) dans quelques lymphocytes B du CG (tdTomato-AID-Creert2) et testons l'émergence clonale d'une tumeur. L'originalité de ce modèle inductible tient au fait qu'il permet de suivre la compétition entre les B des CG surexprimant c-Rel (tdTomato et YFP) par rapport à leur contrepartie normale (tdTomato)<br>The transcription factor Rel/NF-kB includes 5 subunits (SU), p50, p52, c-Rel, RelA and RelB which associate into dimers. NF-κB is at the heart of the ontogeny of mature B lymphocytes in the germinal centers (GC) for c-Rel and RelB and during plasma cell differentiation for RelA. Diffuse large cell lymphoma (DLBCL) represent more than 80% of aggressive B-cell lymphomas. We have published that NF-kB SUs must be taken into account differentially, such that RelB is a marker of poor prognosis, RelA is the SU of the ABC molecular subtype (activated B cell) and cRel that of GCB (germinal center B cell)-DLBCL with a novel clean transcriptomic signature. This project consists of understanding mechanistically how c-Rel induces the transformation of a GC B lymphocyte. We have established a new mouse model of c-Rel overexpression (with YFP) in some CG B lymphocytes (tdTomato-AID-Creert2) and are testing the clonal emergence of a tumor. The originality of this inducible model relies in the fact that it makes it possible to follow the competition between the B of the GCs on expressed c-Rel (tdTomato and YFP) compared to their normal counterpart (tdTomato)

Le lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL) est le sous-type le plus fréquent de lymphome non hodgkinien (NHL), caractérisé par une prolifération anormale de cellules B matures. C'est une maladie agressive pour laquelle les stratégies thérapeutiques actuelles sont insuffisantes. Le microenvironnement tumoral (TME) est un réseau dynamique de cellules, molécules et des autres éléments qui entourent une tumeur. Ceux-ci tiennent un rôle prépondérant dans le développement du cancer, la réponse au traitement et la survie des patients. Étudier le TME chez les patients atteints de DLBCL est essentiel pour découvrir de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaire impliqués dans progression de la maladie et identifier des biomarqueurs pronostiques. Cependant, sa structure tissulaire diffuse rend difficile l'étude précise de l'organisation et des interactions cellulaires au sein du TME.L'objectif de ce projet de thèse est de réaliser une caractérisation multimodale complète des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral du DLBCL. Pour faciliter l'accès aux échantillons humains, j'ai développé et mis en place un protocole de recherche clinique permettant un accès à des biopsies de patients suivis à l'hôpital Saint-Louis, et garantissant que la cohorte de patients reflète l'hétérogénéité de la maladie.Tout d'abord, j'ai réalisé une caractérisation en profondeur des lymphocytes T infiltrant la tumeur (TILS). Pour ce faire, j'ai utilisé des technologies innovantes de cytométrie en flux et spectrale multiparamétrique pour étudier finement la diversité de cellules T dans les biopsies de DLBCL ainsi que leurs réseaus de communication avec les autres cellules immunitaires. Une analyse non supervisée a pu mettre en évidence la présence de nouveaux sous-types de cellules T, par comparaison aux tissus contrôle. De plus, l'analyse de l'expression ligand-récepteur a permis d'étudier la communication cellulaire de ces sous-populations de cellules T dans le TME.En parallèle de cette étude, j'ai pu caractériser les profils transcriptomiques des cellules immunitaires présents dans le TME. Pour ce faire, j'ai utilisé une technologie de pointe, la transcriptomique spatiale, des outils bio-informatiques innovant pour cartographier l'expression des gènes directement dans des échantillons de biopsies de DLBCL fixés au formol et inclus en paraffine. J'ai ainsi pu identifier des profils d'expression génique distincts et anatomiquement restreints, défiant la notion historique d'une architecture diffuse du TME du DLBCL. Ces profils peuvent être classifiés en écosystèmes, différant de par leurs compositions cellulaires, leurs fonctions et leurs interactions avec les cellules avoisinantes. De façon importante, la prédominance de certains écosystèmes permettent une classification des patients selon leur taux de survie globale, révélant le potentiel pronostique de ces identités cellulaires spatiales.Enfin, j'ai réalisé une évaluation in vitro du mécanisme d'action et de l'efficacité d'un anticorps bloquant développé par la société pharmaceutique Servier. Celui-ci a été développé pour qui perturber un signal inhibiteur entre les cellules NK et les cellules B malignes. Mes résultats montrent que le candidat améliore la cytotoxicité des cellules NK à l'encontre des cellules tumorales dans un système de co-culture in vitro. Ces résultats soulignent l'importance de cibler les interactions cellulaires entre les cellules immunitaires et les cellules B malignes pour le développement de thérapies plus efficaces dans le DLBCL.Ce projet multidisciplinaire, mené sur des échantillons humains, apporte une compréhension approfondie de l'hétérogénéité des cellules immunitaires, de leurs interactions et localisations dans le microenvironnement du DLBCL. Ainsi, ce projet pourrait conduire à la découverte de nouveaux biomarqueurs et de stratégies thérapeutiques plus efficaces pour les patients atteints de DLBCL<br>Diffuse Large B-cell Lymphoma (DLBCL) is the most prevalent subtype of non-Hodgkin's Lymphoma worldwide, characterized by an abnormal proliferation of mature B cells. It is an aggressive B-cell malignancy for which the current therapeutic strategies are still insufficient. The tumor microenvironment (TME) is the dynamic network of cells and all elements surrounding and interacting with the tumor. It plays an important role in cancer development, treatment response, and patient survival. Consequently, investigating the TME in DLBCL patients is crucial to discover the mechanisms leading to relapse and identify prognostic biomarkers. However, its diffuse tissue structure presents a challenge in elucidating the cellular organization and communication within the TME. The objective of my Ph.D. thesis is to conduct a comprehensive multimodal characterization of the immune cells within the DLBCL tumor microenvironment.To facilitate access to human samples, I developed and implemented an ethically approved clinical research protocol and a circuit of tissue and blood samples from patients with DLBCL treated at Saint Louis hospital, ensuring that the patient cohort reflects the heterogeneity of the disease.First, I performed a deep characterization of T lymphocytes, with special focus on describing their role within the DLBCL tissue. Indeed, Tumor-infiltrating T-cells (TILS) are key players in the NHL TME, presenting different subtypes and cell states. I apply multiparametric flow cytometry and high-dimensional spectral cytometry to investigate the complex landscape of T diversity in DLBCL biopsies, as well as their communication patterns with other immune cells in the tissue. The unsupervised analysis approach identified unexpected T-cell subtypes at a protein level, compared to tissue control and other lymphoproliferative disorders. Furthermore, the ligand-receptor expression analysis enabled the cell-cell communication study of those T-cell subpopulations within the TME context. Second, I aimed to characterize transcriptomic immune landscapes at a large scale within DLBCL tissue. However, RNA sequencing technologies characterize isolated cells from dissociated tissues with a loss of spatial context. I applied spatial transcriptomics, a cutting-edge technology that enables gene expression mapping in formalin-fixed paraffin-embedded samples of DLBCL biopsies, thus preserving their morphological information. I identified distinct anatomically restricted gene expression profiles in DLBCL samples, defying the historical notion of DLBCL diffuse architecture. These profiles can be classified into ecosystems that differ in cellular composition, functional patterns, and neighborhood characteristics. Moreover, their spatially resolved signatures classify patients with different overall survival revealing the prognostic potential of these spatial identities.Third, I evaluated the effects of altering the communication between NK cells and malignant B cells in DLBCL. I performed a functional in vitro assessment of a blocking antibody developed by the pharmaceutical company Servier. The functional assays demonstrated the effect of the molecular candidate in co-culture settings by improving cytotoxic functions of NK cells against tumor cells. These findings highlight the importance of targeting the interaction between effector cells and malignant B cells to develop effective therapies for DLBCL.This multidisciplinary project carried out on human samples provides a deep understanding of the heterogeneity of immune cells in DLBCL microenvironment at a protein and transcriptomic level while considering their spatial organization. Hence, this project holds significant therapeutic potential, by gaining insights into the disease heterogeneity and its impact on clinical outcome. This project could eventually lead to the discovery of new potential biomarkers and effective therapeutic strategies for DLBCL patients

Le lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL, Diffuse Large B-Cell Lymphoma) constitue le lymphome non Hodgkinien le plus fréquemment diagnostiqué. Les DLBCL sont composés principalement de deux sous groupes : l’entité nommée ABC (Activated B Cell-like) qui est la plus agressive, avec un taux de survie de 30% après traitement, et l’entité GCB (Germinal-Center B Cell). Contrairement aux GCB DLBCL, les ABC DLBCL se caractérisent par une signature génique similaire aux lymphocytes B activés par leur récepteur antigénique (BCR, B Cell Receptor) à cause de l'accumulation de mutations génétiques. Ceci a pour conséquence une activation constitutive du facteur de transcription NF-κB pour laquelle les lymphomes ABC DLBCL ont développé une profonde addiction. Toutefois, la nature pléiotrope de NF-κB rend son ciblage thérapeutique inenvisageable. Mon projet de thèse visait à caractériser de nouveaux régulateurs de la voie d’activation du facteur NF-κB par les récepteurs antigéniques en condition physiologique et pathologique. Dans un premier temps, grâce à un crible protéomique par spectrométrie de masse, nous avons identifié un complexe ternaire nommé LUBAC (Linear Ubiquitin Chain Assembly Complex) comme un acteur majeur de l’activation de NF-κB par le TCR et le BCR, et de la survie des lymphomes ABC DLBCL. Dans un second temps, le crible d’une librairie de mille deux cents molécules chimiques nous a permis d’isoler un composé sélectivement toxique in vitro pour les lymphomes ABC DLBCL. Nous montrons que ce composé entraine la mort apoptotique des ABC DLBCL sans toutefois affecter la signalisation NF-κB. Un tel composé pourrait, dans le futur, être utilisé comme une nouvelle molécule thérapeutique pour le traitement du lymphome ABC DLBCL<br>The diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) is the most common non Hodgkinien lymphoma. Two main different entities composed the DLBCL : the Activated B Cell-like subtype (ABC DLBCL) witch is the most aggressive and associated with a poor survival prognostic, and the Germinal-Center B Cell subtype (GCB DLBCL). Unlike the GCB DLBCL, ABC DLBCL are characterized by a genetic signature similar to activated B lymphocytes stimulated by their antigen receptor (BCR, B cell receptor) which results from mutations accumulation. As a consequence, ABC DLBCL survival and proliferation requires the constitutive activation of NF-κB transcription factors. Because NF-κB has pleiotropic effect on different tissues, strategies aiming at targeting NF-κB heterodimers might have deleterious consequences on an organism.My project focuses on identifying new modulators involved in antigen receptor mediated NF-κB activation in physiological and pathological condition.We first performed a mass spectrometry analysis and identified the LUBAC (Linear Ubiquitin Chain Assembly Complex) as a new regulator of antigen receptor mediated a NF-κB ctivation and ABC DLBCL survival. Then, we screened a library of one thousand two hundred chemical compounds on DLBCL viability and identified one compound selectively toxic in vitro for the ABC DLBCL subtype. This compound induced ABC DLBCL apoptosis without affected NF-κB signaling. In the future, this compound could be used as a new therapeutic compound for ABC DLBCL

Le lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL) est un des lymphomes B non-Hodgkiniens le plus agressif et le plus fréquent chez l’adulte avec deux sous-groupes principaux (GCB et ABC) sur le plan biologique et clinique.Malgré les avancées thérapeutiques apportées par l’immunochimiothérapie R-CHOP (anti-CD20, rituximab, associé à la chimiothérapie CHOP), 30 à 40 % des patients échappent ou sont réfractaires au traitement. Des données récentes montrent que des petites vésicules extracellulaires, « small EVs » libérées par les cellules de DLBCL portent l'antigène CD20 jouant le rôle de « récepteur leurre » vis-à-vis de l'immunothérapie. L’objectif de cette thèse était d’étudier la production de ces « small EVs », dont font parti les exosomes, de façon comparative par les cellules de type GCB et ABC, ainsi que leur rôle dans l’échappement des cellules tumorales à la cytotoxicité du rituximab dépendante de l’activation du complément (CDC). Nous avons de plus poursuivi les travaux précédents de l’équipe sur le rôle de la voie de signalisation BDNF/TrkB dans ce processus. Dans ce contexte, nous avons analysé la production des « small EVs », et leur niveau d’expression du CD20, par les cellules traitées avec un agoniste de TrkB, le 7,8-DHF. Aucune différence significative de taille et de concentration de ces vésicules des lignées de type GCB et ABC n'a été observée. Le niveau de CD20 dans les « small EVs » était corrélé à l'expression du CD20 membranaire des cellules parentales, indépendamment du sous-type de DLBCL. De manière intéressante, une expression plus élevée du CD20 au sein de ces vésicules et de la concentration en « small EVs » ont été observées dans les cultures traitées au 7,8-DHF comparativement aux cultures contrôles. Nous avons montré in vitro et in vivo (xénogreffe de SUDHL4 chez des souris SCID) que l'association de « small EVs » autologues ou hétérologues au rituximab protégeait les cellules tumorales et les tumeurs de la cytotoxicité du rituximab. De plus, la protection était significativement améliorée lorsque les exosomes étaient produits par des cellules traitées au 7,8-DHF. Enfin, une étude préliminaire a été initiée sur la signification clinique des « smallEVs », dont les exosomes plasmatiques et leur niveau d’expression du CD20 chez des patients atteints de DLBCL comparativement à des volontaires sains (VS). Nous montrons pour la première fois dans le DLBCL une augmentation de leur concentration périphérique par rapport aux VS. L’ensemble des travaux confirment in vivo le rôle des « small EVs » dans l'échappement à l’immunothérapie des tumeurs de DLBCL, et mettent en évidence à travers la voie BDNF/TrkB l’influence de circuits de régulations sur ce processus. Finalement ils apportent des arguments sur l’utilisation potentielle des « small EVs », dont les exosomes, comme biomarqueurs non-invasifs de la charge tumorale et de l’expression de cibles thérapeutiques comme le CD20, dans le suivi de la maladie et l’orientation thérapeutique<br>Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is one of the most aggressive and common non-Hodgkin B lymphomasin adults with two major biologically and clinically subgroups (GCB and ABC). Despite the therapeutic advances provided by R-CHOP immunochemotherapy (combination of an anti-CD20, rituximab, with CHOP chemotherapy), 30 to 40% of patients escape or are refractory to treatment. Recent data show that small extracellular vesicles, “small Evs”, released by DLBCL cells carry the CD20 antigen playing as a "decoy receptor" for immunotherapy. The objective of this thesis was to study comparatively the production of these “small EVs” including exosomes, by GCB and ABC cell lines, as well as their role in the escape of tumor cells from complement dependent cytotoxicity (CDC) of rituximab. We have further extended the team's previous work in analyzing the role of the BDNF/TrkB pathway in this process. In this context, production of “small Evs” and their CD20 level were studied in cells treated or not with a TrkB agonist, 7,8-DHF. No significant difference in size and concentration of these vesicles of GCB and ABC type lines was observed. The level of CD20 in “small Evs” was correlated with CD20 surface expression in parental cells, independently of the DLBCL subtype. Interestingly, higher expression of CD20 within these vesicles and the concentration of "small Evs” were found in cultures treated with 7,8-DHF compared to control cultures. We demonstrated in vitro and in vivo (SUDHL4 xenograft in SCID mice) that combination of autologous or heterologous “small Evs” with rituximab protects tumor cells and tumors from the rituximab cytotoxicity. In addition, protection was significantly improved when ”small Evs” were produced by cells treated with 7,8-DHF. Finally, a preliminary study was initiated on the clinical significance of plasma “small Evs” including exosomes, and their CD20 level in patients with DLBCL compared to healthy volunteers (VS). We show for the first time in DLBCL an increase in their peripheral concentration compared to VS. Altogether, our results confirm in vivo the role of “small Evs” in DLBCL cell evasion from immunotherapy that could be modulated by environmental factors as shown in the present study for BDNF/TrkB pathway. Finally, they argue that “small Evs” incliding exosomes could be used as non-invasive biomarkers of tumor burden and expression of therapeutic targets such as CD20, for disease monitoring and therapeutic orientation

Le principal cancer hématologique est le lymphome B non-hodgkinien (LNH) dont la forme la plus courante est le lymphome B diffus à grande cellule (DLBCL). La présence d'un infiltrat lymphocytaire T dans le micro-environnement d'un LNH-B nodal a été clairement associée à un bon pronostic vital des patients. Le LNH-B peut se développer dans divers tissus dont certains organes immunologiquement privilégiés, comme les yeux et le cerveau, où les réponses immunitaires sont inhibées ou retardées. Mon projet de thèse a consisté à étudier les interactions tumeur-micro-environnement immunitaire dans des sites de privilège immunitaire. Nous avons comparé les infiltrats immunitaires de lymphomes B murins à grandes cellules intra-splénique, intra-cérébral et intra-oculaire par cytométrie en flux. Les lymphocytes T (LT), majoritairement CD4+, infiltrent les lymphomes B quelles que soient leurs localisations. Les Th17, une sous-population lymphocytaire CD4+ produisant de l'IL-17, sont présents dans les 3 sites tumoraux et nous avons démontré leur rôle anti-tumoral dans le lymphome intra-oculaire. Cependant, nous avons mis en évidence l'impact suppresseur des Treg sur les LT effecteurs dans les organes immunologiquement privilégiés uniquement, par stimulation ex vivo des LT et déplétion in vivo des Treg. Lorsque cette inhibition est levée, la progression tumorale est ralentie et d'autres sous-populations T CD4+ sont favorisées en fonction de la localisation de la tumeur : les Th2 dans l'œil et les Th17 dans le cerveau. L'ensemble de ces données montre l'importance des LT effecteurs dans le contrôle du développement du lymphome B à grandes cellules y compris dans les sites immunologiquement privilégiés. Une piste importante à explorer serait de stimuler les LT effecteurs en tenant compte de la localisation pour améliorer le traitement des DLBCL.

Cette étude visait à évaluer la fonctionnalité des neurotrophines dans les DLBCL et leur possible implication dans l’hétérogénéité clinique des patients, notamment les phénomènes de résistance thérapeutique. Pour cela, des travaux ont été initiés in vitro à partir de lignées humaines issues des 2 principaux sous-types de DLBCL (GCB et ABC), et ex vivo par des analyses réalisées sur des biopsies issues d’une cohorte de 33 patients (17 GCB et 16 ABC). Les études réalisées sur les lignées ont révélé l’expression et la fonctionnalité des récepteurs de survie Trk des NTs pour les deux sous-types. De manière intéressante, l’inhibition pharmacologique des Trk permet d’induire l’apoptose de lignées ABC, résistantes au rituximab, et potentialise l’apoptose induite par le rituximab. De plus, ces effets cytotoxiques sont sensiblement augmentés dans des conditions d’hypoxie. La modulation de la signalisation des NTs (anticorps bloquants, NTs exogènes) nous a permis de mettre en évidence un axe BDNF/TrkB/p75NTR impliqué dans la survie, et plus particulièrement celle des cellules de type GCB. Par ailleurs, nos travaux démontrent pour la première fois dans ces cellules tumorales B un lien entre l’activation des récepteurs Trk et la sécrétion de VEGF dont la production est aussi modulée par le rituximab. Ces résultats sont confortés par des données très préliminaires obtenues après transfection des cellules SUDHL4 par des shRNA ciblant BDNF. Enfin, l’étude rétrospective menée sur les biopsies de patients révèle des différences d’expression des neurotrophines et de leurs récepteurs. De façon intéressante, la forte expression d’NGF et de TrkB a été corrélée au profil histologique (ABC) des patients. De même, une forte expression de p75NTR est associée significativement au stade clinique (IPI). Ces données, en concordance avec celles obtenues sur les lignées cellulaires, suggèrent fortement un rôle pro-survie des NTs impliqué dans l’agressivité des DLBCL. Finalement, des résultats très préliminaires obtenus à partir de xénogreffes d’une lignée GCB sur des souris SCID semblent conforter cette hypothèse et le potentiel thérapeutique d’un ciblage de ces facteurs de croissance dans ces pathologies.