Rozprawy doktorskie na temat „Living Cells - Fluorescence Correlation Spectroscopy”

Ziel dieser Arbeit ist es eine Toolbox zur Charakterisierung der anomalen Diffusion von Tracerpartikeln in dicht gepackten Systemen mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) zur Verfügung zu stellen. Es wird gezeigt, dass die robusten Informationen über die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion (PDF) der Verschiebung des Tracers im asymptotischen Verhalten der FCS-Kurven auf langen, sowie auf kurzen Zeitskalen enthalten sind. So liefert die Analyse des Kurzzeitverhaltens zuverlässige Aussagen über die Werte des Exponenten der anomalen Diffusion, des Diffusionskoeffizienten und der niedrigeren Momente der PDF. Dies erlaubt es eine Gaußverteilung zu bestätigen oder zu widerlegen. Der Test auf Gaußverteilung könnte als Index verwendet werden, um die richtige Form der PDF aus einer Reihe von konkurrierenden Ergebnissen zu erraten. Darüber hinaus untersuchen wir die Konsequenz der nicht skalierenden PDF auf Ergebnis der FCS-Kurven. Wir berechnen die FCS für ein Continuous Time Random Walk Modell mit Wartezeiten gemäß einer Lévy-stabilen Verteilung mit exponentiellem cut-off. Die Ergebnisse zeigen, dass obwohl die Abweichungen vom Gauß’schen Verhalten bei der asymptotischen Analyse erkannt werden können, ihre Körper immer an Formen für die normale Diffusion perfekt angepasst werden können. Schließlich schlagen wir einen alternativen Ansatz für die Durchführung von Spot Variation FCS mit dem gewöhnlichen FCS-Setup vor. Wir führen eine nicht-lineare Transformation ein, die auf das mit Binning oder Kernel smoothing method geglättete Intensitätsprofil der detektierten Fluoreszenzphotonen angewendet wird. Ihre Autokorrelation imitiert die FCS-Kurven für die Größen des Laserspots, die im Experiment effektiv kleiner als die anfängliche Größe sind. Die erhaltenen FCS-Kurven werden verwendet, um künstliche dicht gepackte Systeme sowie lebende Zellen auf Nano-Domänen oder Barrieren hin zu untersuchen.
The objective of this thesis is to provide a toolbox for characterization of anomalous diffusion of tracer particle in crowded systems using fluorescence correlation spectroscopy (FCS). We discuss that the robust information about the probability density function (PDF) of the particle’s displacement is contained in the asymptotic behaviour of the FCS curves at long and short times. Thus, analysis of the short-time behaviour provides reliable values of exponent of anomalous, diffusion coefficient and lower moments of the PDF. This allows one to to confirm or reject its Gaussian nature. The Gaussianity test could be then used to guess the correct form of the PDF from a set of competing models. We show the applicability of the proposed analysis protocol in artificially crowded systems and in living cell experiments. Furthermore, we investigate the consequence of non-scaling PDF on the possible results of the FCS data. As an example of such processes, we calculate the FCS curve for a continues time random walk model with waiting times delivered from Lévy-stable distribution with an exponential cut-off in equilibrium. The results indicate that, although the deviations from Gaussian behaviour may be detected when analyzing the short- and long-time asymptotic of the corresponding curves, their bodies are still perfectly fitted by the fit form used for normal diffusion. Finally, we propose an alternative approach for performing spot variation FCS using an ordinary FCS set-up. We introduce a non-linear transformation which applies on the smoothed intensity profile of the detected fluorescence photons with binning or smoothing kernel method. Autocorrelation of the generated intensity profiles mimic the FCS curves for the sizes of laser spots which are effectively smaller than the initial one in the experiment. The obtained FCS curves are used to investigate the presence of nano-domains or barriers in artificially crowded systems and in living cells.

La spectroscopie de fluorescence de molécule individuelle a révolutionné le domaine des sciences biophysiques, en permettant la visualisation des interactions moléculaires dynamiques et des caractéristiques nanoscopiques avec une haute résolution spatio-temporelle. Le contrôle des réactions enzymatiques et l'étude de la dynamique de diffusion de molécules individuelles permet de comprendre l'influence et le contrôle de ces entités nanoscopiques sur plusieurs processus biophysiques. La nanophotonique basée sur la plasmonique offre des nouvelles opportunités de suivi d'évènements à molécule unique, puisque il est possible de confiner des champs électromagnétiques dans les hotspots à nano-échelle, à dimensions spatiales comparables à une molécule unique. Dans ce projet de thèse, nous explorons plusieurs plateformes de nanoantennas photoniques avec des hotspots, et nous avons démontré les applications dans l'amélioration de la spectroscopie de fluorescence de molécule individuelle. En utilisant la fluorescence burst analysis, l'analyse de fluctuations temporelle de fluorescence,TCSPC, nous quantifions les facteurs d'amélioration de fluorescence, les volumes de détection de nanoantennas; ainsi, nous discutons l'accélération de fluorescence photo dynamique. En alternative aux structures plasmoniques, des antennes diélectriques basées sur les dimères en silicone ont aussi démontré d'améliorer la détection de fluorescence à molécule unique, pour des concentrations micro molaires physiologiquement pertinentes. En outre, nous explorons des systèmes planaires antennas in box pour l'investigation de la dynamique de diffusion de la PE et de la SM dans les membranes des cellules vivantes
Single-molecule fluorescence spectroscopy has revolutionized the field of biophysical sciences by enabling visualization of dynamic molecular interactions and nanoscopic features with high spatiotemporal resolution. Monitoring enzymatic reactions and studying diffusion dynamics of individual molecules help us understand how these nanoscopic entities influence and control various biochemical processes. Nanophotonic antennas can efficiently localize electromagnetic radiation into nanoscale spatial dimensions comparable to single bio-molecules. These confined illumination hotspots there by offer the opportunity to follow single-molecule events at physiological expression levels. In this thesis, we explore various photonic nanoantenna platforms and demonstrate their application in enhanced single-molecule fluorescence detection. Using fluorescence burst analysis, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), time-correlated TCSPC measurements, and near field simulations, we quantify nanoantenna detection volumes, fluorescence enhancement factors and discuss the fluorescence photodynamic accelerations mediated by optical antennas. Further, using resonant planar antenna-in-box devices we investigate the diffusion dynamics of phosphoethanolamine and sphingomyelin on the plasma membrane of living cells and discuss the results in the context of lipid rafts. Together with cholesterol depletion experiments, we provide evidence of cholesterol-induced nanodomain partitioning within less than 10~nm diameters and characteristic times being ~100 microseconds

Single-molecule fluorescence spectroscopy has revolutionized the field of biophysical sciences by enabling visualization of dynamic molecular interactions and nanoscopic features with high spatiotemporal resolution. Monitoring enzymatic reactions and studying diffusion dynamics of individual molecules (such as lipids and proteins) help us understand how these nanoscopic entities influence and control various biochemical processes. Nanophotonic antennas can efficiently localize electromagnetic radiation into nanoscale spatial dimensions comparable to single bio-molecules (<10 nm). These ultra-confined illumination hotspots thereby offer opportunity to follow single-molecule events at physiological expression levels. In this thesis, we explore various photonic nanoantenna platforms (double nanohole apertures, dimer nanogap antennas and planar "antenna-in-box'') and demonstrate their application in enhanced single-molecule fluorescence detection. Using fluorescence burst analysis, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), time-correlated TCSPC measurements, and near field simulations, we quantify nanoantenna detection volumes, fluorescence enhancement factors and discuss the fluorescence photodynamic accelerations mediated by optical nanoantennas. An alternative to plasmonic structures, all-dielectric nanoantenna based on silicon nanogap is also demonstrated to enhance the fluorescence detection of single molecules diffusing in concentrated solutions. Further, using resonant planar "antenna-in-box'' devices we investigate the diffusion dynamics of phosphoethanolamine and sphingomyelin on the plasma membrane of living cells and discuss the results in the context of lipid rafts. Together with cholesterol depletion experiments, we provide evidence of cholesterol-induced nanodomain partitioning within less than 10 nm diameters and characteristic times being ~100 microseconds
La espectroscopia de fluorescencia de una sola molecula ha revolucionado el campo de las ciencias biofisicas, permitiendo la visualizacion de interacciones moleculares dinamicas y caracteristicas nanoscopicas con alta resolucion espaciotemporal. La monitorizacion de las reacciones enzimaticas y el analisis de la dinamica de difusion de moleculas individuales (como lipidos y proteinas) nos ayudan a comprender como estas entidades nanoscopicas influyen y controlan diversos procesos bioquimicos. Las antenas nanofotonicas pueden localizar eficientemente la radiacion electromagnetica en dimensiones espaciales en nanoescala, comparables a biomoleculas unicas (<10 nm). Estos hotspots de iluminacion ultra configurados ofrecen de este modo la oportunidad de monitorizar eventos de molecula unica a niveles de expresion fisiologica. En esta tesis, exploramos varias plataformas fotonicas de nanoantenas (double nanohole aperture, dimero nanogap antenas y "antenna-in-box" planares) y demostramos su aplicacion en la mejora de la deteccion una sola molecula de fluorescencia. Utilizando el analisis por explosion de fluorescencia, espectroscopia de correlacion de fluorescencia (FCS), medidas TCSPC correlacionadas en el tiempo y simulaciones de campo cercano, cuantificamos volumenes de deteccion de nanoantenas, factores de mejora de fluorescencia y discutimos las aceleraciones fotodinámicas de fluorescencia mediada por nanoantennas opticas. Las nanoantennas dielectricas basadas en nanogaps de silico se han propuesto como una alternativa en el realce de la deteccion de fluorescencia de difusion de moleculas unicas en soluciones concentradas. Ademas, utilizando dispositivos resonantes planares de "antenna-in-box", investigamos la dinamica de difusion de la fosfoetanolamina y la esfingomielina en la membrana plasmatica de las celulas vivas y discutimos los resultados en el contexto de las balsas lipidicas. Junto con experimentos de dismincion de colesterol, proporcionamos pruebas de division inducida por colesterol en el nanodominio dentro de diametros menors de 10 nm y con tiempos caracteristicos de ~100 microsegundos.
La spectroscopie de fluorescence d'une seule molécule a révolutionné le domaine des sciences biophysiques, permettant la visualisation d'interactions moléculaires dynamiques et de caractéristiques nanoscopiques à haute résolution spatio-temporelle. Le suivi des réactions enzymatiques et l'analyse de la dynamique de diffusion des molécules individuelles (telles que les lipides et les protéines) nous aident à comprendre comment ces entités nanoscopiques influencent et contrôlent divers processus biochimiques. Les antennes nanophotoniques peuvent localiser efficacement le rayonnement électromagnétique à des dimensions spatiales nanométriques, comparables à des biomolécules uniques (<10 nm). Ces hotspots d'éclairage ultra-configurés offrent la possibilité de surveiller les événements de molécules uniques à des niveaux d'expression physiologiques. Dans ce mémoire, nous examinons plusieurs plates-formes photoniques nanoantennas (nanotrou à double ouverture, I antennes Dimer nanoespace et plane « antenne-in-box ») et de démontrer son application dans l'amélioration de la détection d'une fluorescence seule molécule. Utilisation de l'analyse par spectroscopie de fluorescence d'explosion corrélation de fluorescence (FCS), les mesures TCSPC corrélées dans le temps et proches des simulations champ quantifier les volumes de détection de nanoantennas, les facteurs d'amélioration fluorescence et discuter des accélérations photodynamiques fluorescence médiée nanoantennas opticas. Des nanoantennas diélectriques à base de nanogap silico ont été proposées comme alternative dans l'amélioration de la détection par fluorescence de la diffusion de molécules uniques dans des solutions concentrées. En outre, l'utilisation de "plan d'antenne-in-box" dispositifs de résonance, nous étudions la dynamique de diffusion de phosphoéthanolamine et sphingomyéline dans la membrane plasmique des cellules vivantes et de discuter des résultats dans le contexte des radeaux lipidiques. Conjointement avec des expériences de réduction du cholestérol, nous fournissons des tests de division induits par le cholestérol dans le nanodomaine dans des diamètres plus petits de 10 nm et avec des temps caractéristiques de ~ 100 microsecondes.

The object of this thesis is to develop a new extension of Image Correlation Spectroscopy (ICS) that can measure velocity vectors for flowing protein populations in living cells. This new technique, called Spatio-Temporal Image Correlation Spectroscopy (STICS), allows measurement of both diffusion coefficients and velocity vectors (magnitude and direction) from fluorescence microscopy image time series of fluorescently labeled cellular proteins via monitoring of the time evolution of the full space-time correlation function of the intensity fluctuations. By using filtering in Fourier space to remove frequencies associated with immobile or slow components, it is possible to measure the protein transport even in the presence of a large fraction of immobile species that are static in the image series. The STICS method can generate complete transport maps of proteins within sub-regions of the basal membrane even if the protein concentration is too high to perform single particle tracking measurements, and it can be applied to any type of fluorescence microscopy image time series. This thesis presents the background theory, computer simulations, and analysis of measurements on fluorescent microspheres and fixed cell samples to demonstrate proof of principle, capabilities, and limitations of the method. Visible fluorescent proteins (VFPs) were used to label a variety of the proteins involved in cell-to-extra-cellular-matrix adhesions, including focal adhesion kinase, paxillin, alpha-actinin, alpha5-integrin, talin, vinculin and actin. Various fusion protein pairs were transfected in living cells and imaged using both laser scanning microscopy and total internal reflection microscopes. Using STICS analysis, co-transport maps of proteins were generated within protruding sub-regions of the basal membrane. The new space time image correlation method can probe the mechanistic details of the hypothesized molecular clutch that regulates the extra cellular matrix/cytoskeletal interactions during migration. The technique was also applied to mapping fluid flow in migrating keratocytes in order to elucidate the role that fluid flow plays in migrating cells.

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is an ultra-sensitive optical technique to investigate the dynamic properties of ensembles of single fluorescent molecules in solution. It is in particular suited for measurements in biological samples. High sensitivity is obtained by employing confocal microscopy setups with diffraction limited small detection volumes, and by using single-photon sensitive detectors, for example avalanche photo diodes (APD). However, fluorescence signal is hence typically collected from a single focus position in the sample only, and several measurements at different positions have to be performed successively. To overcome the time-consuming successive FCS measurements, we introduce electron multiplying CCD (EMCCD) camera-based spatially resolved detection for FCS. With this new detection method, multiplexed FCS measurements become feasible. Towards this goal, we perform FCS measurements with two focal volumes. As an application, we demonstrate spatial cross-correlation measurements between the two detection volumes, which allow to measure calibration-free diffusion coefficients and direction-sensitive processes like molecular flow in microfluidic channels. FCS is furthermore applied to living zebrafish embryos, to investigate the concentration gradient of the morphogen fibroblast growth factor 8 (Fgf8). It is shown by one-focus APD-based and two-focus EMCCD-based FCS, that Fgf8 propagates largely by random diffusion through the extracellular space in developing tissue. The stable concentration gradient is shown to arise from the equilibrium between a local morphogen production and the sink function of the receiving cells by receptor-mediated removal from the extracellular space. The study shows the applicability of FCS to whole model organisms. Especially in such dynamically changing systems in vivo, the perspective of fast parallel FCS measurements is of great importance. In this work, we exemplify parallel, spatially resolved FCS by utilizing an EMCCD camera. The approach, however, can be easily adapted to any other class of two-dimensional array detector. Novel generations of array detectors might become available in the near future, so that multiplexed spatial FCS could then emerge as a standard extension to classical one-focus FCS
Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) ist eine hochempfindliche optische Methode, um die dynamischen Eigenschaften eines Ensembles von einzelnen, fluoreszierenden Molekülen in Lösung zu erforschen. Sie ist insbesondere geeignet für Messungen in biologischen Proben. Die hohe Empfindlichkeit wird erreicht durch Verwendung konfokaler Mikroskop-Aufbauten mit beugungsbegrenztem Detektionsvolumen, und durch Messung der Fluoreszenz mit Einzelphotonen-empfindlichen Detektoren, zum Beispiel Avalanche-Photodioden (APD). Dadurch wird das Fluoreszenzsignal allerdings nur von einer einzelnen Fokusposition in der Probe eingesammelt, und mehrfache Messungen an verschiedenen Positionen in der Probe müssen nacheinander durchgeführt werden. Um die zeitaufwendigen, aufeinanderfolgenden FCS-Einzelmessungen zu überwinden, entwickeln wir in dieser Arbeit Elektronenvervielfachungs-CCD (EMCCD) Kamera-basierte räumlich aufgelöste Detektion für FCS. Mit dieser neuartigen Detektionsmethode werden Multiplex-FCS Messungen möglich. Darauf abzielend führen wir FCS Messungen mit zwei Detektionsvolumina durch. Als Anwendung nutzen wir die räumliche Kreuzkorrelation zwischen dem Signal beider Fokalvolumina. Sie ermöglicht die kalibrationsfreie Bestimmung von Diffusionskoeffizienten und die Messung von gerichteter Bewegung, wie zum Beispiel laminarem Fluss in mikrostrukturierten Kanälen. FCS wird darüber hinaus angewendet auf Messungen in lebenden Zebrafischembryonen, um den Konzentrationsgradienten des Morphogens Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8 (Fgf8) zu untersuchen. Mit Hilfe von APD-basierter ein-Fokus FCS und EMCCD-basierter zwei-Fokus FCS zeigen wir, dass Fgf8 hauptsächlich frei diffffundiert im extrazellulären Raum des sich entwickelnden Embryos. Der stabile Konzentrationsgradient entsteht durch ein Gleichgewicht von lokaler Morphogenproduktion und globalem Morphogenabbau durch Rezeptor vermittelte Entfernung aus dem extrazellulären Raum. Die Studie zeigt die Anwendbarkeit von FCS in ganzen Modell-Organismen. Gerade in diesen sich dynamisch ändernden Systemen in vivo ist die Perspektive schneller, paralleler FCS-Messungen von großer Bedeutung. In dieser Arbeit wird räumlich aufgelöste FCS am Beispiel einer EMCCD Kamera durchgeführt. Die Herangehensweise ist jedoch einfach übertragbar auf jede andere Art von zwei-dimensionalem Flächendetektor. Neuartige Flächendetektoren könnten in naher Zukunft verfügbar sein. Dann könnte räumlich aufgelöste Multiplex-FCS eine standardisierte Erweiterung zur klassischen ein-Fokus FCS werden

Rigidité ou raideur des tissus affecte de nombreux processus biologiques dans le développement embryonnaire et la physiologie des adultes et sont impliqués dans de nombreuses maladies. Rigidité de détection par les cellules et comment les cellules répondent à elle , sont donc des aspects essentiels de la biologie et de la médecine. Cellules souches mésenchymateuses présentent des propriétés uniques que leur sort est régi par la rigidité de la matrice extra-cellulaire (ECM ). Les adhésions focales ( AF ) sont les éléments mécano qui relient la cellule à son environnement mécanique. Parce aperçu apparaît que les processus dynamiques intrinsèques à AF et du cytosquelette serait décisif dans la transduction des stimuli mécaniques en signaux biochimiques , nous abordons la relation entre la diffusion et propriétés de liaison des protéines AF et de la rigidité de détection dans les cellules souches mésenchymateuses humaines ( hMSC ). Nous avons mis en culture primaire hMSC dérivées de moelle osseuse , sur gels de polyacrylamide' revêtus de collagène de raideur définie et contrôlée. Adhérences et / ou adhésions naissantes à la pointe de monter et démonter ou deviennent des plus grandes autorités fédérales afin de soutenir des forces contractiles plus élevés qui ont lieu à plus de rigidité de l'ECM. Pour déterminer si le chiffre d'affaires et la croissance des AF dans hMSC dépend de la rigidité de l' ECM , et de déchiffrer le rôle de la dynamique et des interactions de la signalisation des protéines d'échafaudage dans ces processus , nous avons suivi la diffusion et propriétés de liaison de FAK , paxillin , talin et vinculine dans les cellules NCSM. Nos études basées sur la microscopie de fluorescence des approches différentes FRAP ( Fluorescence Recovery après photoblanchiment ) , F ( C ) CS ( Fluorescence ( Cross) Correlation Spectroscopy ) et FRET ( de Fluorescence Resonance Energy Transfer ) par FLIM ( Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) , tous ensemble ont révélé ce que le temps de séjour de ces protéines au sein de structures FA augmente en même temps que la rigidité du substrat. Cette propriété est en corrélation avec la dynamique et l'instabilité de la composition complexe FA elle-même , ainsi que avec le comportement cellulaire dynamique , propriétés qui sont donc régis par la rigidité du substrat. En outre, nos données montrent l'existence d' embrayage moléculaire intracellulaire à plusieurs niveaux à l'échafaud FA , y compris plusieurs liaisons moléculaires rigidité dépendante avec des cinétiques différentes (ce qui signifie lien moléculaire probable avec force différente ). Surtout , nous avons montré que les monomères de Talin et vinculine se lient à l'échafaud avec plusieurs taux de dissociation rigidité dépendante et interagissent entre eux seulement quand elle est immobilisée. La proportion des espèces en interaction talin - vinculine immobilisés (pour le type sauvage vinculine ainsi que mutant constitutivement active ) était faiblement dépendante de la rigidité de l'ECM , mettant l'accent sur le rôle des protéines dynamique au lieu de proportion d'immobilisation de la rigidité mécanisme de détection. Fait intéressant , la stabilisation de talin sur le site FA par un mutant constitutivement actif vinculine est beaucoup plus forte à faible rigidité que à haute rigidité de l'ECM , révélant une puissance élevée de signalisation réglementation à faible rigidité dans ce type de cellules. Plus précisément , notre étude a porté sur la dynamique et l'organisation des autorités fédérales , considérée comme capteurs mécaniques de ECM rigidité et donc susceptibles adaptée pour soutenir les premières étapes de processus de différenciation hMSC rigidité dépendante
Tissue rigidity or stiffness affects many biological processes in embryonic development and aduit physiology and are involved in numerous diseases. Rigidity sensing by cells and how cells respond to it, are thus crucial aspects in biology and medicine. Mesenchymal stem cells present unique properties as their fate is regulated by the stiffness of extra cellular matrix (ECM). Focal adhesions (FAs) are the mechanosensitive elements that connect the cell to its mechanical environment. Because insight emerges that the dynamic processes intrinsic to the FAs and cytoskeleton would be decisive in the transduction of mechanical stimuli into biochemical signais, we address the relationship between the diffusion and binding properties of FAs proteins and rigidity sensing in human mesenchymal stem cells (hMSC). We cultured primary hMSC derived from bone marrow, on collagen-coated polyacrylamide gels of defined and controlled stiffness. Nascent adhesions and/or adhesions at the leading edge assemble and disassemble or mature into bigger FAs to sustain higher contractile forces which take place at higher ECM rigidity. To determine whether the turnover and growth of FAs in hMSC depends on the stiffness of the ECM, and to decipher the role of the dynamics and interactions of signaling scaffolding proteins in these processes, we monitored the diffusion and binding properties of FAK, paxillin, talin and vinculin within hMCS cells. Our studies based on different fluorescence microscopy approaches as FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching), F(C)CS (Fluorescence (Cross) Correlation Spectroscopy) and FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) by FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), ail together revealed that that the residence time of these proteins within FA structures increases along with the substrate rigidity. This property is correlated with the dynamics and instability of the FA complex membership itself, as well as with the dynamical cell behavior, properties that are therefore regulated by the substrate rigidity. In addition, our data show the existence of intracellular multitiered molecular clutch at the FA scaffold, including several rigidity-dependent molecular bindings with different kinetics (meaning likely molecular linkage with different strength). Especially, we showed that monomers of talin and vinculin bind to the scaffold with several rigidity-dependent dissociation rates and interact between each other only when immobilized. The proportion of immobilized talin-vinculin interacting species (for wild type vinculin as well as constitutively active mutant) was weakly dependent on the ECM rigidity, emphasizing the role of proteins dynamics instead of proportion of immobilization in rigidity sensing mechanism. Interestingly, the stabilization of talin at the FA site by a constitutively active vinculin mutant is much stronger at weak rigidity than at high rigidity of ECM, revealing a high potency of signaling regulation at weak rigidity in this type of cells. Specifically, our study focused on the dynamics and organization of FAs, seen as mechanical sensors of ECM rigidity and thus likely suited to support the initial steps of rigidity-dependant hMSC differentiation processes

The cell cycle culminates with the segregation of sister chromatids, which is a fundamental step in ensuring the transmission of unaltered genetic material. Chromosome segregation is carried out by the mitotic spindle, which captures and pulls sister chromatids towards the opposite poles. Anaphase starts when the correct bipolar attachment is achieved. Chromosomes migrate evenly to the two daughter cells, both inheriting the same genetic material. The presence of unattached kinetochore at anaphase onset is dangerous, since it may lead to unbalanced ploidy of daughter cells, with severe consequences for their survival. For this reason, improperly attached chromosomes activate the mitotic checkpoint that arrests cell division before anaphase. Cells can maintain an arrest for several hours but eventually will resume proliferation, a process we refer to as adaptation. Whether adapting cells bypass an active block or whether the block has to be removed to resume proliferation is not clear. Likewise, it is not known whether all cells of a genetically homogeneous population are equally capable to adapt. Here, we show that the mitotic checkpoint is operational when yeast cells adapt and that each cell has the same propensity to adapt. Our results are consistent with a model of the mitotic checkpoint where adaptation is driven by random fluctuations of APC/CCdc20 , the molecular species inhibited by the checkpoint. Our data provide a quantitative framework for understanding how cells overcome a constant stimulus that halts cell cycle progression.

Semiconductor quantum dots (QDs) have emerged as a new class of fluorescent probes and labeling agents for biological samples. QDs are bright, highly photostable and allow simultaneous excitation of multiple emissions. Owing to these properties, QDs hold exceptional promise in enabling intracellular biochemical studies and diagnosis with unprecedented sensitivity and accuracy. However, use of QD probes inside living cells remains a challenge due to difficulties in delivery of nanoparticles without causing aggregation and imaging single nanoparticles inside living cells. In this dissertation, a systematic approach to deliver, image and locate single QDs inside living cells is presented and the properties of molecular motor protein driven QD transport are studied. First, spectroscopic and imaging methods capable of differentiating single nanoparticles from the aggregates were developed. These technologies were validated by differentiating surface protein expression on viral particles and by enabling rapid counting of single biomolecules. Second, controlled delivery of single QDs into living cells is demonstrated. A surprising finding is that single QDs associate non-specifically with the dynein motor protein complex and are transported to the microtubule organizing center. Accurate localization and tracking of QDs inside cell cytoplasm revealed multiple dynein motor protein attachment resulting in increased velocity of the QDs. Further, spectrin molecule which is known to recruit dynein motor protein complex to phospholipid micelles was found to associate with the QDs. These results may serve as a benchmark for developing new QD surface coatings suitable for intracellular applications. Since, nanoparticles are similar in size to viral pathogens; better understanding of nanoparticle-cell interactions should also help engineer nanoparticle models to study virus-host cell interactions. (Contains AVI format multimedia files)

Les biofilms sont des communautés de microorganismes incorporés dans une matrice exo-polymérique complexe. Ils sont reconnus pour jouer un rôle important comme barrière de diffusion dans les systèmes environnementaux et la santé humaine, donnant lieu à une résistance accrue aux antibiotiques et aux désinfectants. Comme le transfert de masse dans un biofilm est principalement dû à la diffusion moléculaire, il est primordial de comprendre les principaux paramètres influençant les flux de diffusion. Dans ce travail, nous avons étudié un biofilm de Pseudomonas fluorescens et deux hydrogels modèles (agarose et alginate) pour lesquels l’autodiffusion (mouvement Brownien) et les coefficients de diffusion mutuels ont été quantifiés. La spectroscopie par corrélation de fluorescence a été utilisée pour mesurer les coefficients d'autodiffusion dans une volume confocal de ca. 1 m3 dans les gels ou les biofilms, tandis que les mesures de diffusion mutuelle ont été faites par cellule de diffusion. En outre, la voltamétrie sur microélectrode a été utilisée pour évaluer le potentiel de Donnan des gels afin de déterminer son impact sur la diffusion. Pour l'hydrogel d'agarose, les observations combinées d'une diminution du coefficient d’autodiffusion et de l’augmentation de la diffusion mutuelle pour une force ionique décroissante ont été attribuées au potentiel de Donnan du gel. Des mesures de l'effet Donnan (différence de -30 mV entre des forces ioniques de 10-4 et 10-1 M) et l'accumulation correspondante d’ions dans l'hydrogel (augmentation d’un facteur de 13 par rapport à la solution) ont indiqué que les interactions électrostatiques peuvent fortement influencer le flux de diffusion de cations, même dans un hydrogel faiblement chargé tel que l'agarose. Curieusement, pour un gel plus chargé comme l'alginate de calcium, la variation de la force ionique et du pH n'a donné lieu qu'à de légères variations de la diffusion de sondes chargées dans l'hydrogel. Ces résultats suggèrent qu’en influençant la diffusion du soluté, l'effet direct des cations sur la structure du gel (compression et/ou gonflement induits) était beaucoup plus efficace que l'effet Donnan. De même, pour un biofilm bactérien, les coefficients d'autodiffusion étaient pratiquement constants sur toute une gamme de force ionique (10-4-10-1 M), aussi bien pour des petits solutés chargés négativement ou positivement (le rapport du coefficient d’autodiffusion dans biofilm sur celui dans la solution, Db/Dw ≈ 85 %) que pour des nanoparticules (Db/Dw≈ 50 %), suggérant que l'effet d'obstruction des biofilms l’emporte sur l'effet de charge. Les résultats de cette étude ont montré que parmi les divers facteurs majeurs qui affectent la diffusion dans un biofilm environnemental oligotrophe (exclusion stérique, interactions électrostatiques et hydrophobes), les effets d'obstruction semblent être les plus importants lorsque l'on tente de comprendre la diffusion du soluté. Alors que les effets de charge ne semblaient pas être importants pour l'autodiffusion de substrats chargés dans l'hydrogel d'alginate ou dans le biofilm bactérien, ils ont joué un rôle clé dans la compréhension de la diffusion à travers l’agarose. L’ensemble de ces résultats devraient être très utiles pour l'évaluation de la biodisponibilité des contaminants traces et des nanoparticules dans l'environnement.
Biofilms are primarily communities of microorganisms embedded in a complex exopolymer matrix. They are thought to play an important role as diffusive barriers in environmental systems and human health, resulting in increased resistance to disinfectants and antibiotics. Since mass transport in a biofilm is primarily due to molecular diffusion, it is critical to understand the main parameters influencing diffusive fluxes in a biofilm. In this thesis, a Pseudomonas fluorescens biofilm and two model hydrogels, (agarose and calcium alginate), were investigated. Both self-diffusion (Brownian motion) and mutual diffusion coefficients were quantified. Fluorescence correlation spectroscopy was used to measure the self-diffusion coefficients in a ca. 1 m3 confocal volume in the gels or biofilms, whereas a diffusion cell setup was employed for mutual diffusion measurements. In addition, microelectrode voltammetry was used to evaluate Donnan potential of the gels in order to determine its impact on diffusion. For the agarose hydrogel, the combined observations of a decreasing self-diffusion coefficient coupled with increasing mutual diffusion as a function of a decreasing ionic strength have been attributed to the gel’s Donnan potential. Measurements of the Donnan effect (difference of -30 mV between ionic strengths of 10-4 and 10-1 M) and the corresponding accumulation of ions in the hydrogel (13x enhancement with respect to the bulk solution) indicated that electrostatic interactions can strongly influence the diffusive flux of cations, even in a weakly charged hydrogel, such as agarose. Somewhat surprisingly, for a more highly charged gel such as calcium alginate, varying ionic strength and pH resulted in only small changes to the diffusion of charged probes in the hydrogel. These results suggested that the direct effect of the cations on gel structure (due to an induced swelling or compression) was much more effective than the Donnan effect when influencing solute diffusion. Similarly, for a bacterial biofilm, self-diffusion coefficients were virtually constant across a range of examined ionic strengths (10-4-10-1 M) for both negatively and positively charged small solutes (Db/Dw≈85%) and nanoparticles (Db/Dw≈50%), suggesting that the obstruction effect of the biofilms again overwhelmed the charge effect. The results of this work indicated that among the various major factors affecting diffusion in an oligotrophic environmental biofilm (steric exclusion, hydrophobic and electrostatic interactions), obstruction effects appeared to be the most important when attempting to understand the solute diffusion. While charge effects did not appear to be important to the self-diffusion of charged substrates in the alginate hydrogel or bacterial biofilm, they were key to understanding diffusion through another gel, with numerous biomedical and environmental applications, i.e. agarose. These results should be extremely useful when evaluating the bioavailability of the trace contaminants and nanoparticles in the environment.

My Ph.D. thesis regards the development and combination of advanced experimental approaches and techniques to investigate how mechanical signals are sensed by cells, how they propagate inside the cell, from the external membrane to the cell’s cytoskeleton, and how they eventually translate into changes in biochemical signalling and gene expression. To this end, I designed and implemented an optical setup which combines optical tools to manipulate single cells with microscopy techniques to measure the propagation of mechanical and biochemical signals inside them.