Rozprawy doktorskie: „Interactions protéine-RNA”

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Corsi, Flavia. "Towards the in silico reconstruction of protein interaction networks : identification of DNA- and RNA-protein interfaces, and construction of a database of multiple interactions of proteins". Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2019. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2019SORUS452.pdf.

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Cette thèse porte sur la caractérisation et la prédiction des interfaces protéine-ADN et -ARN, et des comparaisons avec les interfaces protéine-protéine. Nous avons créé un ensemble non-redondant et représentatif de 187 complexes protéine-ADN à haute résolution, comprenant aussi les conformations non liées de 82 protéines. Cette base de données peut servir de référence dans le domaine. Nous avons mené une analyse exhaustive des propriétés de séquence et structurels des interfaces protéine-ADN/ARN et nous les avons comparé avec les propriétés des interfaces protéine-protéine et celles des régions protéiques non-interagissantes. Nous avons développé JET2DNA et JET2RNA, nouvelles méthodes pour la prediction des sites de liaison protéine-ADN/ARN à la surface des protéines. En combinant quatre descripteurs biologiquement pertinents, elles surpassent des méthodes par apprentissage machine. Elles permettent aussi de découvrir des sites de liaison alternatifs avec l'ADN/ARN et de déchiffrer leurs propriétés. Afin de donner un aperçu global de la plasticité des protéines interagissant avec l'ADN, nous avons construit la base de données protéine-(protéine)-ADN (P(P)DNAdb). Elle inclut les 187 complexes protéine-ADN de notre ensemble de référence, les forme libres des protéines et les structures des autres complexes où ces protéines, ou des homologues proches, sont impliqués. L'utilisateur peut accéder aux propriétés des interfaces, visualiser les changements de conformation associés à la liaison avec des partenaires différents et localiser les résidus interagissants avec l'ADN dans les autres structures de la même protéine
This thesis focuses on the characterization and prediction of DNA- and RNA-binding sites on protein structures, with some comparisons with protein-protein ones. We compiled and manually curated a non-redundant and representative set of 187 high resolution protein-DNA complexes, with the available 82 protein unbound conformations, that could be used as a reference benchmark. We conducted a comprehensive analysis of sequence- and structure-based properties of protein-DNA/RNA interfaces and compared them with respect to protein-protein interfaces and to non-interacting protein regions. We developed JET2DNA and JET2RNA, new methods for predicting DNA- and RNA-binding sites on protein surfaces. Combining four biologically meaningful descriptors, they outperform other machine-learning methods, in terms of predictive power and robustness to conformational changes. Our tools demonstrated to be instrumental in discovering alternative DNA/RNA-binding sites and in deciphering their properties. This could be very helpful for drug design and repurposing. To give a comprehensive view of plasticity of DNA-binding proteins and structural information on their multiple interactions, we constructed the Protein-(Protein)-DNA database (P(P)DNAdb). It comprises the 187 protein-DNA complexes in our benchmark, protein unbound forms and structures of other complexes where the proteins, or closed homologs, were in contact with other proteins. The user can access properties of the interfaces, visualize conformational changes associated to the binding of different partners and the location of the DNA-binding residues on the unbound structures and on the complexes with the other protein partners

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Ribeiro, Diogo. "Discovery of the role of protein-RNA interactions in protein multifunctionality and cellular complexity". Thesis, Aix-Marseille, 2018. http://www.theses.fr/2018AIXM0449/document.

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Au fil du temps, la vie a évolué pour produire des organismes remarquablement complexes. Pour faire face à cette complexité, les organismes ont développé une pléthore de mécanismes régulateurs. Par exemple, les mammifères transcrivent des milliers d'ARN longs non codants (ARNlnc), accroissant ainsi la capacité régulatrice de leurs cellules. Un concept émergent est que les ARNlnc peuvent servir d'échafaudages aux complexes protéiques, mais la prévalence de ce mécanisme n'a pas encore été démontrée. De plus, pour chaque ARN messager, plusieurs régions 3’ non traduites (3’UTRs) sont souvent présentes. Ces 3’UTRs pourraient réguler la fonction de la protéine en cours de traduction, en participant à la formation des complexes protéiques dans lesquels elle est impliquée. Néanmoins, la fréquence et l’importance ce mécanisme reste à aborder.Cette thèse a pour objectif de découvrir et comprendre systématiquement ces deux mécanismes de régulation méconnus. Concrètement, l'assemblage de complexes protéiques promus par les ARNlnc et les 3'UTRs est étudié avec des données d’interactions protéines-protéines et protéines-ARN à grande échelle. Ceci a permis (i) de prédire le rôle de plusieurs centaines d'ARNlnc comme molécules d'échafaudage pour plus de la moitié des complexes protéiques connus, ainsi que (ii) d’inférer plus d’un millier de complexes 3'UTR-protéines, dont certains cas pourraient réguler post-traductionnellement des protéines moonlighting aux fonctions multiples et distinctes. Ces résultats indiquent qu'une proportion élevée d'ARNlnc et de 3'UTRs pourrait réguler la fonction des protéines en augmentant ainsi la complexité du vivant
Over time, life has evolved to produce remarkably complex organisms. To cope with this complexity, organisms have evolved a plethora of regulatory mechanisms. For instance, thousands of long non-coding RNAs (lncRNAs) are transcribed by mammalian genomes, presumably expanding their regulatory capacity. An emerging concept is that lncRNAs can serve as protein scaffolds, bringing proteins in proximity, but the prevalence of this mechanism is yet to be demonstrated. In addition, for every messenger RNA encoding a protein, regulatory 3’ untranslated regions (3’UTRs) are also present. Recently, 3’UTRs were shown to form protein complexes during translation, affecting the function of the protein under synthesis. However, the extent and importance of these 3’UTR-protein complexes in cells remains to be assessed.This thesis aims to systematically discover and provide insights into two ill-known regulatory mechanisms involving the non-coding portion of the human transcriptome. Concretely, the assembly of protein complexes promoted by lncRNAs and 3’UTRs is investigated using large-scale datasets of protein-protein and protein-RNA interactions. This enabled to (i) predict hundreds of lncRNAs as possible scaffolding molecules for more than half of the known protein complexes, as well as (ii) infer more than a thousand distinct 3’UTR-protein complexes, including cases likely to post-translationally regulate moonlighting proteins, proteins that perform multiple unrelated functions. These results indicate that a high proportion of lncRNAs and 3’UTRs may be employed in regulating protein function, potentially playing a role both as regulators and as components of complexity

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Mahmoudi, Ikram. "Structural and evolutionary analysis of protein-RNA interfaces and prediction perspectives". Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASQ024.

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Les interactions protéine-ARN sont cruciales dans de nombreuses voies cellulaires et pathologiques. La connaissance de leurs structures 3D est essentielle pour comprendre leurs fonctions, mais leur détermination expérimentale reste difficile. Le manque de données structurales et la flexibilité de ces complexes ont entravé la prédiction structurale des interfaces protéine-ARN. En parallèle, la prédiction des interactions protéine-protéine a connu d'énormes progrès récents grâce aux informations évolutives et à l'apprentissage profond.Ma thèse s'est concentrée sur une analyse évolutive détaillée des structures d'interfaces protéine-ARN. J'ai d'abord identifié 2 022 paires d'interfaces structuralement homologues. J'ai étudié la conservation des contacts d'interface au sein de ces paires, identifiant une conservation élevée des contacts de proximité et apolaires, même dans des homologues lointains. Les liaisons hydrogène, les ponts salins et les interactions π-stacking sont plus versatiles. J'ai étudié les mécanismes de compensation des interactions non conservées. J'ai contribué au développement d'une interface web permettant à la communauté d'explorer nos données structurales et évolutives. J'ai également participé à un projet collaboratif avec des biologistes pour un cas d'étude d'interface protéine-ARN.Ensuite, j'ai étudié comment incorporer des signaux évolutifs dans les méthodes de modélisation structurale protéine-ARN en utilisant des modèles d'apprentissage automatique, notamment la régression logistique et les classificateurs CatBoost. J'ai évalué la capacité de ces modèles à apprendre comment transférer des contacts à partir d'interologues lointains et à généraliser en évitant le surapprentissage. Enfin, j'ai exploré le développement de fonctions basées sur les propensions de contact pour évaluer les poses d'amarrage protéine-ARN. Ces travaux constituent une étape vers l'amélioration de la prédiction de la structure protéine-ARN
Protein-RNA interactions are crucial in numerous cellular pathways and pathologies. Knowledge of their 3D structures is critical for understanding their functions, yet their experimental determination remains challenging. The scarcity of structural data and the inherent flexibility of these complexes have hindered the advancement of protein-RNA interface structural prediction. At the same time, tremendous progress has been made recently for protein-protein interaction prediction thanks to methods leveraging evolutionary information and deep learning.My thesis focused on a detailed evolutionary analysis of protein-RNA interface structures. I first identified 2,022 pairs of structurally homologous interfaces. I explored the conservation of interface contacts among these pairs, discovering a high conservation rate for distance-based and apolar contacts, even in distant homologs. Hydrogen bonds, salt bridges, and π-stacking interactions displayed higher versatility. I investigated mechanisms compensating for non-conserved interactions. I contributed to developing a web interface allowing the community to explore evolutionary structural insights in our datasets. I also participated in a collaborative project with biologists to study a specific protein-RNA interface.Then, I investigated how to incorporate evolutionary signals into protein-RNA structural modeling methods using machine learning models, including logistic regression and CatBoost classifiers. I assessed these models' ability to learn how to transfer contacts from remote interologs and generalize across datasets while mitigating overfitting. Lastly, I explored developing functions based on contact propensities to score protein-RNA docking poses. These efforts constitute a step towards improving protein-RNA structure prediction

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Michaux, Charlotte. "Identification et caractérisation fonctionnelle de petits ARN non codants chez Enterococcus faecalis et analyse d'une protéine "RNA-binding"". Caen, 2013. http://www.theses.fr/2013CAEN2094.

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Chevrollier, Nicolas. "Développement et application d’une approche de docking par fragments pour modéliser les interactions entre protéines et ARN simple-brin". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019SACLS106/document.

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Les interactions ARN-protéine interviennent dans de nombreux processus cellulaires fondamentaux. L'obtention de détails à l'échelle atomique de ces interactions nous éclaire sur leurs fonctions, mais permet également d'envisager la conception rationnelle de ligands pouvant les moduler. Lorsque les deux techniques majeures que sont la RMN et la cristallographie aux rayons X ne permettent pas d'obtenir une structure 3D entre les deux partenaires, des approches de docking peuvent être utilisées pour apporter des modèles. L'application de ces approches aux complexes ARN-protéine se heurtent cependant à une difficulté. Ces complexes résultent en effet souvent de la liaison spécifique d'une courte séquence d'ARN simple-brin (ARNsb) à sa protéine cible. Hors, la flexibilité inhérente aux segments simples-brins impose dans une approche classique de docking d'explorer un large ensemble de leur espace conformationnel. L'objectif du projet est de contourner cette difficulté par le développement d'une approche de docking dite "par fragments". Ce dernier s'est fait à partir de domaines de liaison à l'ARN très représentés dans le monde du vivant. Les résultats ont montré une excellente capacité prédictive de l'approche à partir de la séquence de l'ARN. Ils ont de plus montré un potentiel intéressant dans la prédiction de séquences d'ARN simple-brin préférentiellement reconnues par des domaines de liaisons à l'ARN
RNA-protein interactions mediate numerous fundamental cellular processes. Atomic scale details of these interactions shed light on their functions but can also allow the rational design of ligands that could modulate them. NMR and X-ray crystallography are the 2 main techniques used to resolve 3D highresolution structures between two interacting molecules. Docking approaches can also be utilized to give models as an alternative. However, the application of these approaches to RNA-protein complexes is hampered by an issue. RNA-protein interactions often relies on the specific recognition of a short singlestranded RNA (ssRNA) sequence by the protein. The inherent flexibility of the ssRNA segment would impose, in a classical docking approach, to explore their resulting large conformation space which is not computationally reliable. The goal of this project is to overcome this barrier by using a fragment-based docking approach. This approach developed from some of the most represented RNA-binding domains showed excellent results in the prediction of the ssRNA-protein binding mode from the RNA sequence and also a great potential to predict preferential RNA binding sequences

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Angius, Federica. "Molecular basis of membrane protein production and intracellular membranes proliferation in E. coli". Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2017. http://www.theses.fr/2017USPCC217/document.

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Le système d’expression le plus utilisé pour la production des protéines membranaires, est le système basé sur l’ARN polymérase T7 (ARNpol T7) (Hattab et al., 2015). L'inconvénient de ce système est néanmoins que la vitesse de transcription de l’ARNpol T7 est dix fois plus rapide que celle de l’enzyme bactérienne. Depuis l’isolement de mutants spontanés, notamment C41 (DE3) et C43 (DE3) (Miroux et Walker, 1996) et l’identification de leurs mutations dans le génome, il apparaît clairement que la toxicité provoquée par la surproduction des protéines membranaires est liée à la quantité trop élevée d’ARNpol T7 dans la cellule (Wagner et al., 2008 ; Kwon et al., 2015). Les protéines membranaires ont besoin d’une vitesse de transcription/traduction plus basse pour se replier correctement dans la membrane de la bactérie. Le premier objectif de ma thèse était d’étendre l’amplitude du promoteur du système T7 sur laquelle est basée l’expression des protéines. Pour cela, nous avons isolé et caractérisé de nouvelles souches bactériennes dans lesquelles le niveau d’ARNpol T7 était efficacement régulé par un mécanisme non transcriptionnel très favorable à l’expression des protéines membranaires (Angius et al., 2016). Le deuxième objectif était de comprendre la prolifération des membranes intracellulaires chez E. coli suite à la surexpression de la protéine AtpF, une sous unité membranaire du complexe de l’ATP synthétase (Arechaga et al., 2000). Pour mieux comprendre les voies métaboliques impliquées dans la biogenèse, la prolifération et l’organisation des membranes, nous avons utilisé une approche de séquençage d’ARN à haut débit à différents temps après induction de la surexpression de la sous-unité AtpF dans la souche C43 (DE3). Ensuite, et en collaboration avec Gerardo Carranza and Ignacio Arechaga (Université de Cantabria, Espagne), nous avons construit et étudié des mutants de C43 (DE3) déficients pour les trois gènes codants pour des enzymes de la biosynthèse des cardiolipides afin d’évaluer leur participation dans la biogénèse des membranes intracellulaires
The most successful expression system used to produce membrane proteins for structural studies is the one based on the T7 RNA polymerase (T7 RNAP) (Hattab et al., 2015). However, the major drawback of this system is the overtranscription of the target gene due to the T7 RNAP transcription activity that is over ten times faster than the E. coli enzyme. Since the isolation of spontaneous mutants, namely C41(DE3) and C43(DE3) (Miroux and Walker, 1996) and the identification of their mutation in the genome, it becomes clear that reducing the amount of the T7 RNAP level removes the toxicity associated with the expression of some membrane proteins (Wagner et al., 2008; Kwon et al., 2015). Also, some membrane proteins require a very low rate of transcription to be correctly folded at the E. coli membrane. The first objective of my PhD was to extend the promoter strength coverage of the T7 based expression system. We used genetic and genomic approaches to isolate and characterize new bacterial strains (Angius et al., 2016) in which the level of T7 RNAP is differently regulated than in existing hosts. A second objective was to understand intracellular membrane proliferation in E. coli. Indeed it has been shown that over-expression of membrane proteins, like overexpression of AtpF of E. coli F1Fo ATP synthase is accompanied by the proliferation of intracellular membranes enriched in cardiolipids (Arechaga et al., 2000). To understand metabolic pathways involved in membrane biogenesis, proliferation and organization, we used a RNA sequencing approach at several time point upon over-expression of the F-ATPase b subunit in C43(DE3) host. On the other hand, in collaboration with Gerardo Carranza and Ignacio Arechaga (University of Cantabria, Spain) we studied C43(DE3) cls mutants, in which the cardiolipids genes A, B and C are deleted, to test how they participate to intracellular membranes structuration

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Capozi, Serena. "Dynamique d'interaction entre la protéine SRSF1 et l'ARN et cinétique de formation du spliceosome". Thesis, Montpellier, 2016. http://www.theses.fr/2016MONTT067.

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La protéine SRSF1, aussi appelée ASF/SF2, fait partie de la famille des protéines SR, une famille de protéines liant l’ARN très conservées. Ces protéines jouent un rôle régulateur de l’épissage, également lors de l’épissage alternatif. Une centaine d’ARN cible ont été décrits pour SRSF1 mais la manière dont SRSF1 sélectionne ses cibles parmi tous les pré-ARNm est mal comprise. Des études in vitro et in vivo ont montré que les protéines SR reconnaissent un petit motif dégénéré qui est souvent présent en plusieurs copies dans les ESE («enhancer splicing element »). Bien que les protéines SR lient ces motifs avec une faible spécificité, la définition des exons se fait avec une grande fidélité. Afin de mieux comprendre le mécanisme d’action de SRSF1, j’ai réalisé une étude cinétique des interactions SRSF1-ARN dans les cellules vivantes par des techniques de microscopies avancées. Grâce au système CRISPR, j’ai pu étiqueter la protéine SRSF1 avec la protéine Halo puis j’ai combiné une technique de photo-blanchiment (FRAP) et une technique de suivi de particule unique (« single particle tracking, SPT) pour mesurer la diffusion de SRSF1 et son affinité pour l’ARN. J’ai mesuré la durée de vie des événements de liaison individuellement aussi bien sur le pool global de pré-ARNm que sur des cibles spécifiques. Nos résultats indiquent que la liaison de SRSF1 ne dépasse pas quelques secondes, même sur les cibles de haute affinité. Cette cinétique rapide permet à SRSF1 d’être en contact avec l’ensemble des transcrits naissants qui est produit en permanence dans la cellule. De plus, mon travail apporte une analyse cinétique de la dynamique des snRNP à la résolution de la molécule unique dans le nucléoplasme des cellules vivantes. Nous avons déterminé les coefficients de diffusion des snRNP et la durée de leur association à l’ARN dans ces cellules
SRSF1, formerly known as ASF/SF2, belongs to the SR protein family, which is a conserved family of RNA-binding protein that plays essential roles as regulators of both constitutive and alternative splicing. Hundreds of RNA targets have been described for SRSF1 but how SRSF1 selects its targets from the entire pool of cellular pre-mRNAs remains an open question. In vitro and in vivo studies have shown that SR proteins recognize short degenerated motifs often present in multiple copies at ESEs. Similar cryptic motifs are however frequently present in pre-mRNAs, and this low specificity of binding contrasts with the great fidelity of exon definition. To better understand the mechanism of action of SRSF1, I performed a kinetic study of SRSF1-RNA interactions in live cells using advanced microscopic techniques. Taking advantage by the CRISPR system, I tagged endogenous SRSF1 with Halo protein, and I combined photobleaching (FRAP) and single particle tracking (SPT) techniques to estimate diffusion and binding rates of SRSF1. I measured the duration of individual binding events, both on the cellular pool of pre-mRNAs and on specific targets. Our results indicate that binding of SRSF1 does not exceed few seconds, even on high-affinity targets. This rapid kinetics allows SRSF1 to rapidly sample the entire pool of nascent RNAs continuously produced in cells. Moreover, we provided a kinetic analysis of snRNP dynamics at a single-molecule resolution in the nucleoplasm of living cells. Our results enabled us to determine diffusion coefficients of snRNPs and their RNA binding duration in vivo

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Robert-Paganin, Julien. "Étude structurale et fonctionnelle de la régulation de l’hélicase Prp43". Thesis, Paris 5, 2014. http://www.theses.fr/2014PA05P633/document.

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Les hélicases à ARN de la famille DEAH/RHA sont impliquées dans la plupart des processus essentiels à la vie tels que l'épissage, la biogenèse des ribosomes, la réplication, la transcription ou encore la détection d’ARN viraux. Ces enzymes sont capables de catalyser la dissociation de duplexes d'ARN, la réorganisation de structures secondaires ou de remodeler des complexes ARN-protéines. L'hélicase DEAH/RHA Prp43 présente la particularité d'être bifonctionnelle. Prp43 est impliquée dans l'épissage des Pré-ARNm, où elle assure le recyclage du spliceosome et du lasso, mais aussi dans la biogenèse des ribosomes où elle est impliquée dans la maturation des deux sous-unités. Prp43 est activée et régulée par cinq partenaires protéiques : Ntr1, Gno1, Pfa1, RBM5 et GPATCH2. Ces partenaires protéiques présentent tous un domaine G-patch et sont capables de stimuler les activités hélicase et ATPase de Prp43. La structure cristallographique de Prp43 en complexe avec l'ADP a été résolue au laboratoire. Cette structure a mis en évidence un mode de fixation du nucléotide inédit chez les autres hélicases, notamment au niveau de la base qui s'empile entre la phénylalanine 357 (F357) du domaine RecA2 et l'arginine 159 (R159) du domaine RecA1. Les déterminants de l'activation de Prp43 par les protéines à domaine G-patch demeurent méconnus. Dans ce travail, nous avons cherché à déterminer quel était le rôle de l’empilement de la base dans l’activation de Prp43. Nous présentons ici plusieurs structures cristallographiques de Prp43 en complexe avec tous les nucléotides diphosphates(NDP) et les désoxynucléotides triphosphates (dNDP). Ces structures ont permis de conclure qu'il y avait des différences dans l’empilement de la base selon le (d)NDP considéré. Des dosages d'activité NTPase de Prp43 avec et sans son partenaire protéique Pfa1 montrent que lorsque la base ne s'empile pas avec la F357 et la R159, l'activité de l'enzyme n'est pas correctement régulée par son partenaire protéique. Les dosages d’activité enzymatique sur les mutants ponctuels F357A et R159A révèlent que le résidu F357 permet de moduler l’activité de Prp43. Tous ces résultats nous ont permis de mettre en évidence un modèle de la régulation de Prp43 par les protéines à domaines G-patch et d'expliquer l'importance du mode de fixation de la base à l'enzyme dans cette régulation
RNA helicases from the DEAH/RHA family are involved in most of essential processes of life such as pre-mRNA splicing, ribosome biogenesis, replication, transcription or viral RNA sensing. These enzymes are able to catalyze RNA unwinding, secondary structures reorganization or RNA-protein complexes remodeling. The DEAH/RHA helicase Prp43 is remarkable because it is bifunctional, as it is involved both in pre-mRNA splicing, where it is responsible of spliceosome and lariat recycling and in the biogenesis of the two ribosomal subunits. Prp43 is activated by five protein partners: Ntr1, Gno1, Pfa1, RBM5 and GPATCH2. These protein partners all possess a G-patch domain and are able to stimulate helicase and ATPase activity of Prp43. The structure of Prp43 in complex with ADP has been solved by X-ray crystallography. The structure reveals that the nucleotide is bound to the enzyme in a novel mode that has never been observed in other known helicase structures. The specific feature of this binding mode is the base, stacked between phenylalanine (F357) from RecA2 domain and an arginine (R159) from RecA1 domain. Features of the activation of Prp43 by G-patch proteins are unclear. In this work, we investigated the role of base stacking in the activation of Prp43. We present several structures of Prp43 bound to all the nucleotide diphosphates (NDP) and deoxynucleotide diphosphates (dNTP). These results indicate that there are differences in stacking according to the (d)NDP bound to the enzyme. NTPase activity assays revealed that when stacking is weakened, Prp43 activity cannot be properly regulated by its protein partner Pfa1. Moreover, point mutations F357A and R159A show that stacking of F357 permits to modulate Prp43 activity. All these results allow us to propose a model of NTPase activity activation of Prp43 by G-patch proteins and to highlight the importance of base stacking in this regulation

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Paternina, Osorio J. Antonio. "Biocomputational tools for transcriptome-wide analyses of RNA-binding proteins". Electronic Thesis or Diss., Université Paris sciences et lettres, 2020. http://www.theses.fr/2020UPSLE058.

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La régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes est un réseau d’interactions impliquant de nombreuses protéines de liaison à l’ARN et des ARN non-codants afin d’orchestrer la vie complexe des ARN messagers (ARNm). Chez les métazoaires, le complexe EJC (Exon Junction Complex) est un complexe multiprotéique déposé sur la jonction exonique des ARNm pendant l’épissage. L’EJC interagit avec de nombreux facteurs et est important pour le couplage fonctionnel entre l’épissage et l’export du noyau, la localisation, la traduction et la dégradation des ARNm. Malgré son rôle central dans la régulation génique et le développement de l’organisme, aucune carte exhaustive des sites de liaison de l’EJC n’a encore été établie. La méthode de CLIP (Cross-Linking and Immunoprécipitation) associée au séquençage à haut-débit (CLIP-seq) permet d’identifier les sites de liaison protéine à l’ARN in vivo. Cependant, les analyses des données de CLIP-seq ont permettent aujourd’hui d’obtenir une vue globale plutôt qu’une caract érisation individuelle des sites de liaison d’une protéine. En effet, les détecteurs de pics conventionnels appliqués aux données de CLIP de l’EJC produisent des résultats dont la reproductibilité et la sensibilité sont limitées. Durant ma thèse, nous avons développé une stratégie dédiée à la détection du signal de l’EJC au niveau exonique. En agrégeant les informations de différents réplicas, nous avons généré une liste de gènes reproductibles. Au sein de ces gènes, nous avons trouvé une forte corr élation entre la robustesse de détection des exons et le contenu en thymidine (T) au niveau des sites de liaison. Posant l’hypothèse que ceci est un effet du photopontage, nous avons corrigé le score de robustesse par le contenu en T et avons ainsi clairement montré que l’EJC est déposé sur certains exons et pas sur d’autres. Par conséquent, le complexe EJC est déposé de manière diff érentielle le long d’un mˆeme transcrit. Nous avons ainsiétabli une carte des sites de liaisons de l’EJC sans précédent. L’intégration de données supplémentaires a montré que le dépôt de l’EJC est indépendant de l’abondance du transcrit et n’est pas expliqué par des annotations fonctionnelles connues du gène. Bien que ce travail n’a pas permis à ce stade d’identifier les raisons de ce dépôt différentiel, nous présentons une première méthode d’analyse spécifique et reproductible des exons liés à un EJC par CLIP-seq. Les deux contributions principales de ce travail sont donc les suivantes. Premièrement, nous proposons une méthode robuste pour détecter l’enrichissement du signal de l’EJC à l’échelle de l’exon, en démontrant quantitativement que celleci est plus reproductible et plus sensible que les solutions offertes par les outils actuels. Deuxièmement, nous prouvons que, au sein d’un mˆeme transcrit, l’EJC peut être présent sur des exons, et absent d’autres, suggérant que le dépôt de l’EJC est un processus régulé suivant un code qui reste à découvrir
Post-transcriptional Gene Expression Regulation is a complex network that involves RNA-binding proteins and non-coding RNAs to orchestrate the complex life of mRNAs. In metazoans, the Exon Junction Complex (EJC) is a multi-protein complex deposited onto mRNAs exon junctions during splicing. The EJC interacts with numerous factors and is important for coupling pre-mRNA splicing with mRNA nuclear export, localization, translation, and decay. Despite its central role in gene expression and in organism development, the comprehensive map of EJC binding sites is lacking. Crosslinking and immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (CLIP-seq) aims to identify transcriptome-wide RNAprotein interactions in vivo. Yet, current trends in CLIP-seq data analysis gravitate towards painting a global landscape rather than characterizing individual binding sites. However, we observed that current peak callers applied to EJC CLIP data yield results with limited reproducibility and sensibility. During my PhD, we developed a dedicated strategy to detect EJC signal enrichment at the exon level. By aggregating data from several replicates, we built a list of robust genes with reproducible EJC loading rate. Within robust genes, we assigned a robustness score to each exon according to frequency of detection across replicates. We found that the exon robustness score was correlated to the thymidine (T) content of EJC binding sites. Assuming this was due to cross-linking chemistry, we corrected the score for the T content and found exons with either high or low detection rates. The last suggests that EJC loading is not homogeneous along a transcript, but rather differential. Thus, we established an unprecedented binding site map of the EJC in living cells validated by statistical tools. Crossing this map with other information showed that EJC loading is independent of transcript expression levels or known gene functional annotations. Although the scope of this work does not include possible explanations for this differential loading, it presents a first reproducible and specific data analysis pipeline to detect EJC-loaded exons. Altogether, our contribution is twofold. First, we proposed a robust way to detect EJC signal enrichment at the exon level and demonstrated quantitatively that our approach is more reproducible and more sensitive compared to conventional tools. Second, we proved that the EJC can be present on some, and absent on other exons of the same transcript suggesting that EJC loading is a regulated process following a code that remains to be discovered

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Ben, ouirane Kaouther. "Apport des approches in silico aux études structure-fonction de la polymérase du virus de l'hépatite C". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018SACLS323.

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Le virus de l'hépatite C (HCV) est un virus à ARN qui synthétise ses nouveaux génomes dans les cellules hôtes infectées grâce à une ARN polymérase ARN dépendante (RdRp), appelée NS5B. Cette polymérase a été pendant longtemps une cible majeure dans la recherche d'antiviraux contre l'hépatite C. Aujourd'hui, de nombreux antiviraux ont été approuvés dans le traitement de l’hépatite C ciblant différentes protéines virales, entre autre, NS5B. Le sofosbuvir qui cible le site actif de NS5B est un antiviral qui a démontré une efficacité extraordinaire dans le traitement anti-HCV.Durant ces dernières années, les recherches sur NS5B ont permis de caractériser cette protéine, à la fois structuralement et biochimiquement. La richesse des connaissances ainsi accumulées fait de NS5B un excellent modèle pour les RdRp des virus à ARN.Toutefois, peu d'études portent sur le mécanisme d’acheminement et de sélection des ribonucléotides au site actif de NS5B, et de façon générale, sur la description atomique du mécanisme de réplication assuré par NS5B, qui implique deux dications magnésium pour la catalyse comme chez toutes les polymérases de cette famille.Durant ce travail, nous avons exploité les données structurales issues de complexes ternaires (NS5B+RNA+nucleotide) obtenus en 2015 par cristallographie à l'échelle atomique. Nous avons utilisé ces structures pour mener des études de modélisation moléculaire, essentiellement par dynamique moléculaire afin d’aborder la question de l'acheminement des nucléotides vers le site actif de NS5B.Nous avons eu recours à la fois à des méthodes de dynamiques moléculaires classiques et des méthodes de dynamiques moléculaires dites biaisées telles que différentes méthodes de dynamiques moléculaires dirigées (SMD et TMD) et la dynamique moléculaire accélérée (aMD).Nos résultats indiquent que l’acheminement du nucléotide au site actif associé à un magnésium Mg(B) est contrôlé tout au long du tunnel par différents éléments de NS5B. Initialement, le nucléotide se lie à une région proche de la boucle qui surplombe le tunnel lui permettant, grâce aux interactions qu’il établit avec sa partie triphosphate, de s’orienter base en avant. Ensuite, le nucléotide atteint un point de contrôle formé essentiellement par le motif F3 (R158) et le motif F1(E143). Le nucléotide reste lié à ce site jusqu’à l’arrivée du second dication magnésium (Mg(A)) qui provoque des réarrangements structuraux, notamment au niveau du motif F3, entrainant l’avancée du nucléotide vers le site actif. Une fois ce point de contrôle passé, le nucléotide interroge alors la base du brin d’ADN matrice sans s’insérer entièrement dans le site actif.Nos simulations ont clairement établi que les dernières étapes d’entrée du nucléotide sont finement régulées par l’arrivée du second dication magnésium qui a donc un rôle de coordinateur en plus de son rôle connu dans la catalyse.Ce mécanisme d’entrée semble être spécifique aux RdRp virales et permet de comprendre pourquoi les analogues de nucléotides peuvent être aussi efficaces contre les virus à ARN
The hepatitis C virus is an RNA virus that synthesises its new genomes in the infected host cells thanks to an RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) termed NS5B. This polymerase has been a prime target for antiviral therapy. Numerous direct antiviral drugs are now approved in the HCV treatment and allow very high rates of treatment success. These drugs target among others the HCV NS5B RdRp with the sofosbuvir being one of the most successful drugs.Tremendous efforts have been made in the past decades to characterize NS5B, in particular structurally and biochemically. However, there is little information about the molecular mechanisms of NS5B ribonucleotides entry and selection and in general on the atomistic details of the RNA replication mechanism, although the involvement of two magnesium dications in catalysis is well established in this family of polymerases. Since 2015, structures of ternary complexes of NS5B have been resolved by crystallography offering very valuable details about the binding of nucleotides at the NS5B active site.In this work, we took advantage of these structural data to address the ribonucleotides entry and to further explore the nucleotide addition cycle in NS5B using molecular modelling and molecular dynamics simulations. We used both conventional molecular dynamics techniques and biased simulations that enhance sampling such as Steered Molecular Dynamics (SMD), Targeted Molecular Dynamics (TMD) or accelerated Molecular dynamics (aMD).Based on our modelling results, we found that the access to the active site through the nucleotides tunnel is checked by successive NS5B elements. First, the entering ribonucleotide together with an associated magnesium Mg(B) binds next to a loop that overhangs the nucleotide tunnel and interactions with its triphosphate moiety orient it base-first towards the active site. Second, the ribonucleotide encounters a checkpoint constituted by the residues of motif F3(R158) and motif F1(E143) where it is blocked until the arrival of a second magnesium ion, the Mg(A). This allowed the motif F3 to undergo small structural rearrangements leading to the advancement of the nucleotide towards the active site to interrogate the RNA template base prior to the complete nucleotide insertion into the active site.Our simulations pointed out that these dynamics are finely regulated by the second magnesium dication, thus coordinating the entry of the correct magnesium-bound nucleotide with shuttling of the second magnesium necessary for the two-metal ion catalysis. This entry mechanism is specific to viral RdRps and may explain why modified ribonucleotides can be so successful as drugs against RNA viruses

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Bulfoni, Manuel. "Exploring new paradigms of translational control in eukaryotes". Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2018. https://theses.md.univ-paris-diderot.fr/Bulfoni_Manuel_2_complete_20181129.pdf.

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La régulation de la synthèse des protéines est une étape clé de la régulation de l'expression des gènes dans de nombreux processus cellulaires, permettant à la cellule de s'adapter rapidement au changement d’environnement en particulier en réponse à des stimuli externes et au stress. La majeure partie de la régulation de la traduction se produit à l'étape d'initiation, lorsque les ribosomes sont recrutés sur les ARNm, en perturbant eIF4F, le complexe fixé à l’extrémité 5' de l’ARNm via eIF4E, ou en réduisant la disponibilité du complexe ternaire lié au facteur d’initiation eIF2 (eIF2-GTP-Met-tARNMet). Au cours de ma thèse, j’ai montré comment ces étapes universelles sont régulées pour moduler spécifiquement les taux de traduction de différents ARNm.Nous avons montré qu'Angel1, une protéine interagissant avec eIF4E, est spécifiquement localisée dans le compartiment périnucléaire où elle régule la traduction d’ARNm spécifiques. Nous avons aussi décrit un nouvel opéron ARN caractérisé par la liaison spécifique de Hek2, une protéine de type hnRNP K de levure, à un sous-ensemble d'ARNm codant pour les pores nucléaires et régulant leur traduction. De plus, nous avons montré que la liaison de Hek2 à l'ARNm est empêchée par SUMOylation, une modification post-traductionnelle qui est contrecarrée par Ulp1, une SUMO protéase. Enfin, nous avons observé que la perturbation de l'intégrité des pores nucléaires suite à des mutations ou à un stress induisait l'accumulation de la forme SUMOylée de Hek2. Hek2-SUMO est incapable de se lier aux ARNm, dont la traduction se trouve ainsi augmentée dans un processus de rétroaction.Dans la dernière partie de ma thèse, nous avons réalisé la toute première étude de traductome d'une lignée de cellules β pancréatiques humaines en réponse à une stimulation par le glucose. Nous avons observé que le glucose stimule la traduction d'un ensemble défini d'ARNm pour lesquels nous avons identifié des caractéristiques spécifiques. Ces avancées sont importantes pour mieux comprendre la régulation de l’expression des gènes par le glucose.L’ensemble de nos résultats nous ont permis d’établir de nouveaux paradigmes de régulation traductionnelle
Regulation of protein synthesis is a key regulatory step of gene expression of many cellular processes allowing the cell to quickly adapt to the changing environment including external stimuli and stresses. Most of the translational regulation occurs at the the initiation step when ribosomes are recruited to the mRNAs, by disrupting eIF4F, the complex bound to the 5’ mRNA extremity through eIF4E, or by reducing the availability of the eIF2 ternary complex (eIF2-GTP-Met-tRNAMet). During my thesis I showed how these universal steps are regulated to specifically modulate the translation rates of different mRNAs.We showed that Angel1, an eIF4E interacting protein, is specifically localized to the perinuclear compartment where it regulates mRNA translation of specific mRNAs.We also described a novel RNA operon characterized by the specific binding of Hek2, a yeast hnRNP K-like protein, to a subset of nuclear-pore-encoding mRNAs regulating their translation. Moreover, we showed that Hek2 binding to the mRNA is impeded by the SUMOylation, a post-translational modification which is counteracted by Ulp1, a SUMO-protease. Finally, we reported that perturbation of the nuclear pore integrity by either mutations or stress, induced the accumulation of the SUMOylated form of Hek2. Hek2-SUMO is unable to bind to the mRNAs whose translation is thereby enhanced in a feedback process.In the last part of my thesis, we performed the first ever translatome study of a human pancreatic β cell line in response to glucose stimulation. We report that glucose stimulates translation of a defined set of mRNAs and identified their specific features providing important advances to better understand regulation of gene expression by glucose. Taken together our results allowed us to establish new paradigms of translational regulation

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Kravchenko, Anna. "Fragment-based modelling of protein-RNA complexes for protein design". Electronic Thesis or Diss., Université de Lorraine, 2023. http://www.theses.fr/2023LORR0370.

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Les complexes protéine-ARN jouent un rôle crucial dans la régulation cellulaire. La prédiction de leur structure 3D a des applications dans la conception de protéines et de médicaments. Le projet ITN RNAct visait à combiner des méthodes expérimentales et informatiques pour concevoir de nouveaux "motifs de reconnaissance de l'ARN" (RRM) - domaines protéiques interagissant avec l'ARN simple brin (ARNsb) - pour la biologie synthétique et la bioanalyse. La modélisation des complexes protéine-ARNsb (amarrage) est ardue car l'ARNsb n'a pas de structure propre dans sa forme libre. L'amarrage traditionnelle échantillonne les positions relatives (poses) de 2 structures moléculaires et les note pour sélectionner les plus probables. Il n'est pas directement applicable ici en raison de l'absence de structures libres d'ARNsb, pas plus que l'apprentissage profond en raison du nombre trop faible de structures connues. L'amarrage par fragments, état de l'art pour l'ARNsb, amarre toutes les conformations possibles de fragments d'ARN sur une protéine et assemble les poses les mieux notées de manière combinatoire. Notre méthode ssRNA'TTRACT utilise le logiciel d'amarrage ATTRACT et sa représentation gros grain qui remplace des groupes d'atomes par une bille. Cependant, les paramètres ARN-protéine de sa fonction de notation (ASF) ne sont pas spécifiques à l'ARNsb et peuvent être optimisés. De plus, des caractéristiques spécifiques aux RRM peuvent être apprises et guider l'amarrage. Nous avons développé un pipeline d'amarrage RRM-ssRNA basé sur les données, pour actualiser une stratégie existante. Les RRM ont 2 acides aminés aromatiques de position conservée, chacun liant par empilement un nucléotide de l'ARN. Mon collègue H. Dhondge a regroupées les structures RRM-ARNsb connues sur critère géométrique et obtenu un ensemble de prototypes de coordonnées 3D de tels empilements dans les RRM. J'ai créé un pipeline qui prend en entrée une séquence de RRM et d'ARN et l'identification des nucléotides empilés, récupère la structure du RRM dans AlphaFoldDB, identifie les positions 3D possibles des nucléotides empilés et exécute ssRNA'TTRACT avec des contraintes de distance maximales vers chaque position. En parallèle, nous avons dérivé HIPPO (HIstogram-based Pseudo-POtential), un potentiel de notation pour les poses gros-grain RRM-ARNsb basé sur la fréquence des distances bille-bille dans les poses quasi-natives versus erronées. HIPPO combine 4 ensembles de paramètres en une note consensus, afin de prendre en compte les divers modes de liaison RRM-ARNsb. Testé dans une approche "leave-one-out", il atteint un enrichissement d'un facteur 3 en quasi-natives dans les 20% de poses mieux notées pour ½ des cas contre ¼ avec ASF, et 'un facteur 4 pour ⅓ des cas contre 7% avec ASF. Surprenamment, HIPPO obtient aussi de meilleurs résultats qu'ASF sur un ensemble test de protéines sans RRM, bien que entraîné sur des RRM. Les approches par fragment rencontrent un problème intrinsèque de notation car certains fragments se lient plus spécifiquement/fortement que d'autres. Or nous avons constaté que, pour le fragment le mieux noté par complexe, HIPPO sélectionne systématiquement plus de quasi-natifs qu'ASF. Cela nous a inspiré une approche d'amarrage incrémentale: chacune des poses bien notées d'un fragment sont utilisées comme graine pour construire une chaîne d'ARN complète de manière incrémentale. Cette stratégie élimine le besoin de contacts conservés connus, jusqu'alors nécessaires pour obtenir des modèles précis, ce qui la rend généralisable aux protéines sans RRM. Nos recherches futures visent à identifier le Η le plus performant pour chaque fragment, potentiellement par apprentissage automatique (profond). Notre approche pour dériver des paramètres de notation est en principe applicable à tout type de protéine/ligand et nous prévoyons de l'étendre à d'autres domaines de protéines liant l'ARN, ainsi qu'à l'ADNsb et aux peptides longs
Protein-RNA complexes play crucial roles in cell regulation. Predicting their 3D structure has applications in protein design and drug development. The ITN project RNAct aimed to combine experimental and computational methods to design new "RNA recognition motifs" (RRM) - protein domains interacting with single-stranded RNA (ssRNA) - for applications in synthetic biology and bioanalysis. Modelling protein-ssRNA complexes (docking) is an arduous task due to the flexibility of ssRNA, which lacks a proper structure in its free form. Traditional docking methods sample the relative positions (poses) of 2 molecular structures and score them to select the correct (near-native) ones. It is not directly applicable here due to the absence of free ssRNA structures, nor is deep learning due to the too low number of known structures for training. Fragment-based docking (FBD), the state-of-the-art approach for ssRNA, docks all possible conformations of RNA fragments onto a protein and assembles their best-scored poses combinatorially. ssRNA'TTRACT, our FBD method, uses the well-known ATTRACT docking software, with its coarse-grained representation that replaces atom groups by one bead. Yet the RNA-protein parameters of ATTRACT scoring function (ASF) are not ssRNA-specific and require optimisation. Additionally, RRM-specific features can be learned and used to guide the docking. With my colleague H. Dhondge, we have developed a data-driven FBD pipeline for RRM-ssRNA complexes, as an updated version of an existing strategy. RRMs have two aromatic amino acids (aa) in conserved positions, each stacking with a nucleotide of the bound ssRNA. H. Dhondge collected all known RRM-ssRNA structures with such stacking and clustered them to obtain a set of prototypes for the 3D coordinates of such interactions in RRM. I then set up a docking pipeline with as input the RRM and RNA sequences and the identification of the stacked nucleotides. The pipeline retrieves the RRM structure from AlphaFoldDB, identifies possible 3D positions of the stacked nucleotides and runs ssRNA'TTRACT with maximal distance restraints toward each position. In parallel, we addressed the weakness of ASF for ssRNA by deriving HIPPO (HIstogram-based Pseudo-POtential), a new scoring potential for ATTRACT poses of ssRNA on RRM, based on the frequency of bead-bead distances in near-native versus wrong poses. It combines 4 distinct parameter sets (four Η) into a consensus scoring, to better account for the diverse RRM-ssRNA binding modes. Tested in a leave-one-out approach, HIPPO reaches a 3-fold enrichment of near-natives in 20% top-scored poses for ½ of the ssRNA fragments, versus ¼ with ASF. It even reaches a 4-fold enrichment for ⅓ of the fragments, versus 7% of the fragments with ASF. Surprisingly, HIPPO performed better than ASF also on a benchmark of non-RRM proteins, while trained only on RRMs. Most FBD approaches encounter inherent scoring issues, probably due to some fragments binding more specifically/strongly than others. To address this point, we examined the best-scored fragment per complex and found that HIPPO consistently selects more near-natives than ASF for this fragment. This inspired an incremental docking approach: the top-ranked poses of one fragment are used as a starting point to build a full RNA chain incrementally. This strategy eliminates the need for known conserved contacts, which have been required so far to obtain accurate models, making it generalizable to non-RRM proteins. Future research aims to identify the best-performing Η for each fragment, potentially using (deep) machine learning. Our workflow to derive scoring parameters is in principle applicable to any protein/ligand type and we plan to expand it to other RNA-binding protein domains, as well as ssDNA and long peptides

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Hipper, Clémence. "Nature du complexe viral impliqué dans le mouvement à longue distance du virus de la jaunisse du navet". Thesis, Strasbourg, 2013. http://www.theses.fr/2013STRAJ063/document.

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Le projet de thèse consistait à étudier le mouvement du Virus de la jaunisse du navet (TuYV) dans le système vasculaire. Le premier objectif était d’identifier la nature du complexe viral cheminant dans les tubes criblés : virions et/ou complexes ribonucléoprotéiques. L’analyse du mouvement de mutants viraux dans différentes espèces végétales, en absence ou en présence de protéines de capside de type sauvage apportées en trans, a permis de démontrer une étroite relation entre la formation de virions et le transport à longue distance. Le second objectif de cette étude portait sur l’identification de partenaires cellulaires de la protéine P4 du TuYV. Deux protéines ont été identifiées par un criblage de banques d’ADNc d’A. thaliana par le système du double hybride dans la levure, et l’analyse de leur implication dans le cycle viral a été amorcée par des expériences de localisation subcellulaire et de validation fonctionnelle in planta
In the project, Turnip yellows virus (TuYV) transport in the phloem was analysed. The first objective was to identify the nature of the viral complex involved in vascular movement: virions and/or ribonucleoprotein complexes. Mutant viruses were modified in the capsid protein gene to inhibit formation of virions. By analyzing their movement in different host plants, in the absence or in the presence of the wild-type capsid proteins brought in trans, we demonstrated a strong relation between virion formation and virus long-distance movement. The second objective was to identify cellular partners of the TuYV-P4 protein, a putative movement protein which is host-specific. Two proteins were identified by screening a cDNA library of A. thaliana using the yeast two hybrid technique, and their function in the virus cycle was assessed by performing sub-cellular localizations and infection of A. thaliana KO mutants

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Collet, Axelle. "Caractérisation des enzymes de formation de la coiffe du virus du Nil Occidental et du métapneumovirus humain". Thesis, Aix-Marseille, 2015. http://www.theses.fr/2015AIXM4087.

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Ma thèse a porté sur l’étude des activités enzymatiques impliquées dans la formation de la coiffe de deux virus à ARN: le virus du Nil Occidental (WNV) et le métapneumovirus humain (hMPV). Ces virus codent pour des enzymes assurant l’ajout de la coiffe de type-1 (m7GpppN2’Om) à l’extrémité 5’ de leur ARNm.Le domaine N-terminal de la protéine NS5 (NS5MTase) du WNV porte les activités N7- et 2’O-méthyltransférases (N7- et 2’O-MTases) et il a été proposé que NS5MTase puisse également porter l’activité guanylyltransférase (GTase). J’ai identifié in vitro des résidus clés impliqués dans l’interaction entre NS5MTase et des ARN substrats de chaque activité MTase. Nos résultats démontrent que le site de fixation de la coiffe est nécessaire lors de la 2’O-méthylation et ne l’est pas pour la N7-méthylation. En parallèle, j’ai recherché des résidus catalytiques de la GTase par la méthode de génétique inverse. Des résultats préliminaires indiquent que la mutation K29A induit un défaut de réplication. Ce résidu pourrait donc être impliqué dans l’activité GTase de NS5MTase.Concernant hMPV, j’ai effectué une analyse fonctionnelle du domaine CR-VI+ de la protéine L. J’ai démontré que CR-VI+ possède les activités N7- et 2’O-MTases et j’ai identifié les résidus impliqués dans le recrutement de l’ARNm. L’ordre de méthylation est non canonique avec la 2’O-méthylation qui précède la N7-méthylation. Enfin, j’ai également démontré que CR-VI+ possède une activité d’hydrolyse du GTP.Ce travail démontre que ces MTases possèdent 2 voire 3 des activités enzymatiques nécessaires à la formation de la coiffe, et représentent donc une cible de choix pour le développement d’inhibiteurs
My PhD project is focus on the study of the enzymatic activities involved in the RNA capping pathway of two RNA viruses: the West Nile Virus (WNV) and the human metapneumovirus (hMPV). These viruses encode for enzymes allowing the addition of a cap-1 structure (m7GpppN2’Om) to their mRNA 5’ ends. The NS5 N-terminal domain (NS5MTase) of WNV harbours the N7- and 2’O-methyltransferase activities (N7- and 2’O-MTase); and it has been proposed that NS5MTase also bears a guanylyltransferase activity (GTase). I have identified residues involved in the NS5MTase interaction sites with their RNAs substrate. My assays demonstrate the importance of the cap-binding site for the 2’O-methylation but not for the N7-methylation. In parallel, I have tried to identify putative catalytic residues of the GTase activity by reverse genetics. Preliminary results suggest that NS5MTase K29 could be a catalytic residue.Concerning hMPV, I performed a functional analysis of CR-VI+ domain of the protein L. I demonstrated that the CR-VI+ domain harbours the N7- and 2’O-MTase activities and identified the residues involved in the mRNA recruitment. I showed that the methylation order is not canonical with the 2’O-methylation preceding the N7-methylation. Finally, I showed that the domain harbours an additional GTP hydrolysis activity, representing the first step of RNA cap formation for Mononegavirales.This work demonstrates that this MTase domains harbour 2 or 3 of the enzymatic activities required for viral RNA cap synthesis and represent attractive targets for the development of antivirals

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Jarrige, Domitille. "Déchiffrer le "code OPR" pour une meilleure compréhension du rôle physiologique des protéines OPR". Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS632.

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À la suite de l’endosymbiose, le génome chloroplastique a rétréci et dépend maintenant du génome nucléaire pour son expression. Chez Chlamydomonas reinhardtii, les protéines Octotricopeptide repeat (OPR), codées dans le noyau, contrôlent l’expression d’ARNm chloroplastiques spécifiques. La répétition OPR est un motif dégénéré de 38 acides aminés, qui forme un tandem d’hélices α antiparallèles qui lient l’ARN. Une répétition OPR est prédite pour interagir avec un nucléotide spécifique grâce à des résidus variables à des positions précises. La succession de répétitions permet aux protéines OPR de se lier à une séquence donnée. En partant d’un « code OPR » théorique, j’ai cherché à étudier cette spécificité de reconnaissance. J’ai mute in vivo les cibles chloroplastiques de facteurs OPR pour empêcher l’interaction OPR/ARN, puis j’ai tenté de la restaurer en mutant les résidus conférant la spécificité dans les répétitions correspondantes. Étonnamment, les interactions OPR/ARN sont très résilientes, ce qui a complétement changé notre vision de ces interactions in vivo. Des études fonctionnelles complémentaires que j’ai réalisées sur les facteurs OPR MDB1 and MTHI1 ont révélé que l’expression des gènes chloroplastiques dépend probablement de systèmes de facteurs nucléaires. En coopérant ces facteurs auraient une affinité combinée plus forte et seraient ainsi plus résilients
Following endosymbiosis, the chloroplast genome shrunk and became reliant on the host genome for its expression. In Chlamydomonas reinhardtii, Octotricopeptide repeat proteins (OPR), encoded in the nucleus, control the expression of a specific organellar mRNA. The OPR repeat is a degenerate motif of 38 amino-acids, folding into a tandem of antiparallel α-helices which can bind to RNA. An individual OPR repeat is predicted to interact with one given nucleotide thanks to specificity-conferring residues at defined positions within the repeat. OPR proteins contain tracks of successive OPR motifs, thus they can bind to a specific RNA “target” sequence and act on it. I aimed to study this specificity, called the “OPR code”, starting with a draft code based on known OPR protein/mRNA couples. I mutated in vivo the chloroplast targets of some OPR factors to disrupt the OPR/RNA interaction, and then tried to restore it by mutating the specificity-conferring residues in the corresponding repeats. Surprisingly, OPR/RNA interactions seem very resilient, challenging our view of how the specificity is established in vivo. Complementary functional studies that I performed on the OPR factors MDB1 and MTHI1 revealed that chloroplast gene expression might rely on complex networks of nuclear factors. By cooperating those putative systems would be both more specific and more resilient

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D'Ascenzo, Luigi. "Etude des réseaux de reconnaissance biomoléculaire à l'échelle atomique pour les systèmes ARN et ARN/protéines". Thesis, Strasbourg, 2016. http://www.theses.fr/2016STRAJ108/document.

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Mis à part les liaisons hydrogène, d’autres interactions non covalentes participent dans les réseaux de reconnaissance ARN et ARN protéines. Parmi celles-ci, j’ai étudié les interactions oxygène-pi. Cette interaction prend la forme phosphate-pi dans les U turns et O4'-pi dans les motifs ARN-Z. Je propose une nouvelle classification des boucles de quatre nucléotides, décrivant les U turn et les Z turn à partir d’interactions oxygène-pi. De plus, les motifs "Z like" présents dans tous les ARN, sont aussi reconnus par certaines protéines immunologiques. Pour mieux comprendre les réseaux de reconnaissance biomoléculaire, nous avons examiné les interactions entre cations/anions et ARN. Nous avons trouvé de nombreuses erreurs dans les structures de la PDB et proposé des règles pour améliorer l'attribution d’espèces ioniques. Les résultats de cette thèse amélioreront notre connaissance des réseaux de reconnaissance biomoléculaire et aideront aux techniques de modélisation structurale des ARN
Together with hydrogen bonds, uncommon non-covalent interactions are fundamental for recognition networks in RNA and RNA-protein systems. Among them, I focused on oxygen-pi stacking. This interaction takes the form of phosphate-pi within U-turns and of ribose O4’-pi within “Z-RNA” motifs. In that respect, a novel classification of tetraloops is proposed, defining U-turns and Z-turns based on their oxygen-pi stacking properties. Further, “Z-like” motifs are found to pervade small and large RNAs, being also a recognition pattern for immunology-related proteins. To better understand biomolecular recognition networks, we reviewed the binding of metal ions and anions within RNA, finding many examples of ions misattribution in PDB structures. We propose rules to avoid attribution errors. The results of this thesis will improve our knowledge and understanding of biomolecular recognition networks, as well as assist structural determination and structural modelling techniques of RNA systems

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El, Meshri Salah Edin. "Etude du trafic intracellulaire de la protéine Gag du VIH et rôle de son domaine NCp7". Thesis, Strasbourg, 2015. http://www.theses.fr/2015STRAJ025/document.

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La polyprotéine de structure Gag du VIH-1 est responsable de l’assemblage des particules virales dans les cellules infectées. Au niveau moléculaire, cette protéine s’oligomérise en formant des complexes Gag-Gag autour de deux plates-formes moléculaires, d'une part l'ARN génomique via son domaine NCp7 (NucleoCapsid protein 7) et d'autre part, la membrane plasmique via son domaine MA (Matrice). De plus, lors du trafic de Gag dans la cellule, Gag détourne les protéines ESCRT comme TSG101 et ALIX de la machinerie cellulaire afin de bourgeonner et d’être libérées dans le milieu extracellulaire. Dans cette thèse, nous avons étudié le rôle du domaine NCp7 seul ou au sein de Gag (GagNC) dans les interactions Gag-Gag et Gag-TSG101 en utilisant des approches biochimiques et de la microscopie de fluorescence quantitative. Les résultats ont montré que l'absence du domaine NCp7 affecte l’oligomerisation de Gag qui s’accumule alors dans le cytoplasme sous forme d’agrégats de taille importante. Par ailleurs, le trafic intracellulaire de Gag est affecté par les mutations dans le domaine GagNC avec une augmentation importante de temps nécessaire à Gag pour arriver à la membrane plasmique. Enfin, nous avons montré que GagNC i) renforce l’interaction entre le domaine p6 de Gag et TSG101 et ii) par sa fonction dans le trafic de Gag, est responsable de la localisation de TSG101 à la PM. Sur la base de ces résultats, des études sont maintenant en cours pour développer des tests afin d’identifier des molécules possédant un potentiel anti virale
The Gag structural polyprotein of HIV-1 orchestrates viral particle assembly in producer cells, in a process that requires two platforms, the genomic RNA on the one hand and a membrane with a lipid bilayer, on the other. During its transportation from translating ribosomes to plasma membrane, Gag hijacks cellular proteins of the cytoskeleton and the ESCRT proteins like TSG101, Alix, etc., to egress viral particles. However, a number of questions remain to be answered before they are clearly apprehended. In this thesis, , we studied the role of the NC domain alone or as part of Gag (GagNC) in Gag-Gag and Gag-TSG101 interactions, which are essential for the assembly and budding of HIV-1 particles using quantitative fluorescent microscopy and biochemical approach. Results, showed that the absence of NC domain lead to (1) an accumulation of Gag as large aggregates that are dispersed in the cytoplasm, (2) a decrease of Gag-Gag condensation and (3) a delay for Gag-Gag complexes in reaching the PM, (4) improved interaction between Gag and TSG101, and (5) by its virtue in Gag trafficking docks TSG101 to the PM. This regulatory effect of NCp7 domain in either TSG101 or Gag or both protein- regulated pathways during virus budding can be exploited to develop inhibitors targeting HIV-1

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Schelcher, Cédric. "Détermination du mode d'action et des substrats de RNases P protéiques chez Arabidopsis thaliana". Thesis, Strasbourg, 2017. http://www.theses.fr/2017STRAJ044/document.

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L’activité RNase P est l'activité essentielle qui élimine les séquences 5' supplémentaires des précurseurs d'ARN de transfert. "PRORP" (PROteinaceous RNase P) définit une nouvelle catégorie de RNase P uniquement protéique. Avant la caractérisation de PRORP, on pensait que les enzymes RNase P étaient universellement conservées sous forme de ribonucléoprotéines (RNP). La caractérisation de PRORP a révélé une enzyme avec deux domaines principaux, un domaine N-terminal contenant plusieurs motifs PPR et un domaine NYN C-terminal portant l’activité catalytique. Nous avons utilisé une combinaison d'approches biochimiques et biophysiques pour caractériser le complexe PRORP / ARNt. La structure du complexe en solution a été déterminée par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) et les Kd des interactions de différents mutants de PRORP avec l’ARNt ont été déterminées par ultracentrifugation analytique. Notre analyse révèle un cas intéressant d'évolution convergente. Il suggère que PRORP a développé un processus de reconnaissance de l'ARN similaire à celui des RNase P RNP. Par ailleurs, nous avons mis en place une approche de co-immunoprécipitation de PRORP avec l’ARN afin de définir le spectre de substrats des RNase P protéiques
RNase P is the essential activity that removes 5'-leader sequences from transfer RNA precursors. “PRORP” (PROteinaceous RNase P) defines a novel category of protein only RNase P. Before the characterization of PRORP, RNase P enzymes were thought to occur universally as ribonucleoproteins (RNP). The characterization of PRORP revealed an enzyme with two main domains, an N-terminal domain containing multiple PPR motifs and a C-terminal NYN domain holding catalytic activity. We used a combination of biochemical and biophysical approaches to characterize the PRORP / tRNA complex. The structure of the complex in solution was determined by small angle X-ray scattering and Kd values of the PRORP / tRNA interaction were determined by analytical ultracentrifugation. We also analyzed direct interaction of a collection of PPR mutants with tRNA in order to determine the relative importance of individual PPR motifs for RNA binding. This reveals to what extent PRORP target recognition process conforms to the mode of action of PPR proteins interacting with linear RNA. Altogether, our analysis reveals an interesting case of convergent evolution. It suggests that PRORP has evolved an RNA recognition process similar to that of RNP RNase P. Moreover, we also implemented a PRORP-RNA co-immunoprecipitation approach to determine the full extent of PRORP substrates

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Malabirade, Antoine Baptiste. "Auto-assemblage de la protéine bactérienne Hfq, actrice du métabolisme de l’ARN : rôle structural du domaine C-terminal". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLS234/document.

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La régulation de l’expression génique par des ARNs permet une réponse rapide et polyvalente des cellules à des changements environnementaux. Cependant, elle nécessite souvent des partenaires protéiques. La protéine bactérienne Hfq en est un bon exemple. Facteur de virulence, elle est présente chez une variété de procaryotes et intervient dans nombre de circuits de régulation. Structurellement, Hfq adopte un repliement caractéristique, le repliement Sm. Ainsi, Les feuillets β qui la constituent se regroupent et forment un hexamère toroïdal. Outre cette région N-terminale, il existe aussi parfois une région C-terminale (CTR) de séquence et de longueur variables. Chez E. coli, cette région comprend une trentaine de résidus et est prédite comme non-structurée. Jusqu’à présent, son rôle n’a été que peu étudié.Ce travail de thèse met en lumière de nouvelles pistes quant à la fonction du CTR. Nous avons constaté sa capacité à former des fibres amyloïdes, expliquant la formation de structures auto-assemblées in vivo. De plus, la protéine est capable de lier l’ADN et de le condenser fortement in vitro. Cette compaction est complètement dépendante de la présence du CTR, qui permet de ponter les brins d’ADN. Ce résultat suggère une nouvelle fonction de Hfq dans la structuration du chromosome. Enfin, nous avons démontré que ce domaine permet aussi à Hfq de s’assembler à la surface d’une bicouche lipidique, expliquant sa localisation membranaire. La désorganisation de la membrane qui en résulte pourrait permettre le passage d’ARNs dans le milieu extracellulaire, avec d’importantes implications sur la capacité de la bactérie à interagir avec ses voisines et son environnement
RNA-based regulations of gene expression allow quick and versatile responses from cells to changing environmental conditions. However, these regulations are often protein-mediated. The bacterial protein Hfq is one of the most studied RNA-based regulation partner. Found in various prokaryotes, it is an important virulence factor involved in many cellular processes. Hfq’s structure resembles a torus, formed by multiple β-sheets. Apart from this N-terminal region (NTR), a supplemental C-terminal region (CTR) with variable lengths and sequences may exist in some species. In E. coli, this specific region measures around 30 residues and is predicted as intrinsically disordered. Few studies focused on Hfq-CTR until recently.This work highlights new potential roles for Hfq-CTR. First, this region is able to self-interact and forms amyloid fibers which explains the self-assembled Hfq superstructures observed in vivo. Second, the protein can bind and efficiently condense DNA in vitro, strengthening the suggested role of Hfq in shaping the bacterial chromosome. This compaction is fully dependent on the CTR which is responsible for DNA bridging. Third, the CTR also gives to Hfq the ability to self-assemble on a lipid bilayer, explaining its membrane-localized fraction observed in vivo. The subsequent membrane reorganization might facilitate the release of RNAs in the extracellular medium, with potential implications on bacterial communication and interaction with surrounding cells and environment

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Rekad, Zeinab. "Rôle de la protéine de liaison aux ARNs SAM68 dans l'adhésion des cellules endothéliales et la genèse de leur matrice extracellulaire". Electronic Thesis or Diss., Université Côte d'Azur, 2023. http://www.theses.fr/2023COAZ6006.

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L'angiogenèse est le processus de formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Ce processus repose sur la modification des propriétés adhésives des cellules endothéliales vasculaires ainsi que sur la production et l'assemblage de leur matrice extracellulaire (MEC) spécialisée, appelée membrane basale. L'adhésion des cellules endothéliales est médiée par des interactions entre les composants de la matrice extracellulaire (MEC) et les récepteurs transmembranaires (intégrines) qui, une fois engagés, entraînent la formation de complexes d'adhésion multimoléculaires dynamiques qui régulent l'organisation du cytosquelette et la transmission des forces (mécanotransduction) pour la migration et la fonction des cellules. Des études récentes suggèrent que la production locale de protéines aux sites d'adhésion contribue à leur consolidation et à leur maturation.Récemment, les cribles protéomiques réalisés sur les sites d'adhésion ont identifié la présence de protéines de liaison à l'ARN (RBP) ayant des fonctions de régulation de l'expression génétique. SAM68 (Src associated in mitosis, of 68 kDa), un membre de la famille STAR (signal transduction and activation of RNA metabolism), est l'une de ces protéines connues pour réguler à la fois la biogenèse de l'ARN et la transduction du signal en jouant un rôle d'échafaudage après l'activation du récepteur à la surface de la cellule. En effet, il a été démontré que SAM68 s'associe à la kinase Src et participe à l'épissage alternatif des gènes codant pour la MEC et les protéines associées à la MEC, comme la tenascine-C et la glycoprotéine de surface cellulaire CD44 impliquée dans l'adhésion/migration. Dans le contexte de l'angiogenèse et de l'adhésion des cellules endothéliales, nous avons émis l'hypothèse que la RBP SAM68 pourrait constituer un relais moléculaire pendant la mécanotransduction (médiée par les intégrines) en participant à la formation d'adhésions focales et aux réponses transcriptionnelles/post-transcriptionnelles en aval qui régule le phénotype angiogénique.En utilisant des cultures de cellules endothéliales primaires en 2 et 3 dimensions, nous avons montré que la RBP SAM68 participe à l'établissement d'adhésions focales par sa contribution à l'approvisionnement localisé d'ARNm (y compris le transcrit β-actine) requis pour la maturation des adhésions focales. De plus, nous avons démontré que SAM68 régule l'expression de gènes codant pour les protéines de la membrane basale, notamment via la régulation du promoteur du gène FN1, conditionnant ainsi la matrice sous-endothéliale et le phénotype angiogénique des cellules. En effet, dans un contexte tridimensionnel, nous avons constaté que la déplétion de SAM68 entrave le bourgeonnement des cellules endothéliales ainsi que leur organisation en pseudo-capillaires.Ces travaux ouvrent la voie à l'exploration du rôle d'autres protéines de liaison à l'ARN en tant que régulateurs de la signalisation d'adhésion et à l'évaluation de leur fonction dans les processus d'angiogenèse physiologiques et pathologiques
Angiogenesis is the process underlying the formation of new blood vessels from pre-existing ones. This process relies on the modification of the adhesive properties of vascular endothelial cells as well as the production and assembly of their specialized extracellular matrix (ECM) known as the basement membrane. Endothelial cell adhesion is mediated by interactions between extracellular matrix (ECM) components and transmembrane receptors (integrins) that, upon engagement, drive the formation of dynamic multimolecular adhesion complexes that regulate cytoskeletal organization and force transmission (mechanotransduction) for cell migration and function. Recent studies suggest that local protein production at adhesion sites contributes to their consolidation and maturation.Proteomics screens performed on adhesion sites have identified the presence of RNA-binding proteins (RBP) with gene expression regulatory functions. SAM68 (Src associated in mitosis, of 68 kDa), a member of the STAR (signal transduction and activation of RNA metabolism) family of RBPs, is one such protein known to regulate both RNA biogenesis and signal transduction by playing a scaffolding role following receptor activation at the cell surface. Indeed, SAM68 has been shown to associate with Src kinase following receptor activation and to participate in alternative splicing of genes encoding ECM and ECM-associated proteins, such tenascin-C and the cell surface glycoprotein CD44 involved in adhesion/migration. In the context of angiogenesis and endothelial cell adhesion, we hypothesized that the RBP SAM68 may constitute a molecular relay during integrin-mediated mechanotransduction at adhesion sites by participating in the formation of focal adhesions and downstream transcriptional/post-transcriptional responses that regulates the angiogenic phenotype.Using 2- and 3-D cultures of primary endothelial cells, we showed that the RBP SAM68 participates in the establishment of focal adhesions through its contribution to the localized supply of mRNAs (including the β-actin transcript) required for adhesion site maturation. Further, we demonstrated that SAM68 regulates the expression of genes encoding basement membrane proteins, in particular via regulation of the promoter of the FN1 gene, thus conditioning the sub-endothelial matrix and angiogenic phenotype of cells. Indeed, in a 3-D context, SAM68-depletion was found to hamper endothelial cell sprouting activity and capillary-like tube formation.This work paves the way to explore the role of other RNA-binding proteins as regulators of adhesion signaling and assessment of their function in physiological and pathological angiogenesis processes

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Chabrolles, Hélène. "Interaction de la protéine Core du virus de l’Hépatite B avec les protéines de liaison aux ARN : effets sur la réplication virale et perspectives thérapeutiques". Thesis, Lyon, 2018. http://www.theses.fr/2018LYSE1321.

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Plusieurs données expérimentales suggèrent que la protéine Core du virus de l’Hépatite B (HBV), en plus de ses fonctions structurales pour la formation des nucléocapsides dans le cytoplasme, pourrait avoir des fonctions régulatrices importantes dans le noyau des hépatocytes infectés. En effet, Core s’associe à l’ADNccc et aux promoteurs de certains gènes cellulaires dans le noyau des hépatocytes infectés et pourrait ainsi contrôler leur régulation transcriptionnelle. De plus, de par sa capacité à lier les ARN, elle pourrait également participer au métabolisme post-transcriptionnel de gènes viraux et/ou cellulaires. Pour caractériser ces fonctions, nous avons réalisé une analyse protéomique des facteurs cellulaires qui interagissent avec la protéine Core dans le noyau d’hépatocytes humains. Cet interactome a mis en évidence un grand nombre de protéines de liaison aux ARN (RBP), qui participent au métabolisme des ARN et en particulier aux mécanismes d’épissage. Deux interactants majeurs de Core ont été plus particulièrement étudiés, SRSF10 et RBMX, impliqués notamment dans l’épissage et la réparation de l’ADN. Une analyse fonctionnelle effectuée par une approche siRNA a montré que SRSF10 et RBMX affectent différemment le niveau des ARN viraux, vraisemblablement en agissant à des étapes différentes du cycle viral. De même, un composé ciblant l’activité de certaines RBP diminue fortement la réplication d’HBV en affectant l’accumulation des ARN viraux. Ainsi, ces résultats suggèrent que Core pourrait interagir avec certaines RBP pour contrôler le destin des ARN viraux et/ou cellulaires, une piste intéressante pour le développement de nouvelles stratégies antivirales ciblant l’hôte
Converging evidences suggest that the Hepatitis B virus (HBV) core protein, beside its well-known structural role to form nucleocapsids in the cytoplasm, could have important regulatory functions in the nucleus of infected hepatocytes. Indeed, nuclear Core was shown to associate with the cccDNA and to the promoters of some cellular genes, suggesting that Core may control viral and/or cellular gene expression. In addition, Core has the capacity to bind RNA, and may thus regulate HBV RNA metabolism. To elucidate these functions, we performed a proteomic analysis of the cellular factors interacting with nuclear Core in human hepatocytes. This interactome revealed a majority of highly interconnected RNA-binding proteins (RBPs), which participate in several steps of mRNA metabolism, including transcription, splicing and nuclear egress. We focused on two major Core-interacting factors, SRSF10 and RBMX that were previously involved in splicing and DNA repair. Functional analyses performed by a siRNA approach indicated that RBMX and SRSF10 were able to differentially regulate the levels of all viral RNAs most likely by acting at different steps of the viral life-cycle. Similarly, a small compound, affecting the activity of selected RBPs, severely impaired HBV replication by strongly reducing viral RNA accumulation. Altogether, these results strongly suggest that Core interacts with some selected RBPs to control the fate of viral and/or cellular RNAs and provide new critical information for the development of novel host-targeting antiviral agents (HTA)

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Raoelijaona, Raivoniaina. "Compréhension des rôles des complexes Nob1/Pno1 et RPS14/Cinap dans la maturation cytoplasmique de la petite sous-unité ribosomique (pré-40S) chez les eucaryotes". Thesis, Bordeaux, 2019. http://www.theses.fr/2019BORD0221/document.

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Les ribosomes sont des complexes nucléoproétiques responsables de la traduction. Chez les eucaryotes, la biogenèse du ribosome est un processus complexe très régulé qui fait intervenir un nombre important de facteurs d’assemblages (~200). La construction d’un ribosome est initiée dans le nucléole puis continue dans le nucléoplasme et se termine dans le cytoplasme. La maturation cytoplasmique de la petite sous-unité ribosomale implique la dissociation séquentielle des facteurs d’assemblage tardifs et la maturation finale de l’ARNr 18S. Ce processus est catalysé par l’endonucléase Nob1 qui assure la coupure de l’extrémité 3’ du précurseur de l’ARNr 18S (pré-18S) aboutissant à sa forme mature. Ce mécanisme est coordonné par la protéine Pno1 qui est le partenaire de Nob1. Des informations détaillées sur l’architecture des particules pré-ribosomiques nous ont permis de mieux comprendre les différents intermédiaires de la biogenèse. Cependant, certains aspects fonctionnels comme la conformation adoptée par Nob1 pour assurer la coupure du site D du pre-18S reste encore flou. L’objectif de mon travail a été de mieux comprendre les aspects très tardifs de la maturation cytoplasmique du ribosome. Pour ce faire, nous avons redéfini l’organisation modulaire de l’endonucléase Nob1 chez les eucaryotes pour ensuite étudier son mode d’interaction avec son partenaire Pno1. Des tests fonctionnels in vitro ont été effectués pour étudier le rôle de Pno1 dans la régulation de la coupure par Nob1.Nos résultats nous ont permis de montrer que le domaine catalytique de Nob1 adopte une conformation atypique. En effet le domaine PIN est composé de deux fragments (res 1-104 and 230-255) séparé par une boucle interne qui est importante pour la reconnaissance avec son partenaire Pno1. Nos études nous ont également montré que Pno1 inhibe l’activité de Nob1 probablement en reconnaissant directement l’ARNr substrat, masquant ainsi le site de coupure de l’endonucléase. Ces résultats sont complémentaires et cohérents avec les données structurales de cryo-EM de la particule pré-40S humaine récemment publiées. En effet, Nob1 est dans une conformation incapable de couper le pré-ARNr puisque son domaine catalytique se retrouve à une distance d’environ 30Å de son ARN substrat. Ce phénomène implique donc des changements de conformations ou encore la nécessité de protéine accessoire pour déplacer certains facteurs. La protéine Cinap est impliqué dans la maturation de l’ARNr 18S. Nos études d’interaction avec les protéines localisées au niveau de la plateforme (à savoir RPS14, RPS26, le complexe Nob1/Pno1) ont permis de montrer que Cinap pouvait former un complexe tripartite avec l’endonucléase Nob1 et son partenaire Pno1. De plus, Cinap est capable de reconnaitre RPS26 dans un complexe RPS14-dépendant. Il est important de noter que RPS26 est un composant de la petite sous-unité qui remplace Pno1 dans le ribosome mature. De ce fait le recrutement de RPS26 au sein du pré-ribosome nécessite la dissociation de Pno1 et cet échange serait assurée par Cinap. Sur la base des travaux effectués, nous pouvons proposer un modèle de maturation où la formation du complexe Cinap/Pno1 induirait un changement de conformation permettant à Nob1 de reconnaitre son substrat et donc de catalyser la coupure du site D qui aboutit à la maturation de l’ARNr 18S et donc à la production de la sous-unité 40S mature
Ribosomes are translational machineries universally responsible of protein synthesis. In eukaryote, ribosome assembly is a complex and highly regulated process that requires coordinated action of more than 200 biogenesis factors. Ribosome assembly is initiated in the nucleolus, continues in the nucleoplasm and terminates in the cytoplasm. The cytoplasmic maturation events of the small ribosomal subunit are associated with sequential release of the late assembly factors and concomitant maturation of the pre-rRNA. During final maturation of the small subunit, the pre-18S rRNA is cleaved off by the endonuclease Nob1, which activity is coordinated by its binding partner Pno1. Detailed information on pre-ribosomal particle architectures have been provided by structural snapshots of maturation events. However, key functional aspects such as the architecture required for pre-rRNA cleavage have remained elusive. In order to better understand these late steps of cytoplasmic pre-40S maturation, we first redefine the domain organization of Nob1, then study its binding mode with Pno1 using different tools such as sequence analysis, structure prediction and biochemical experiments and, we then performed functional assay to elucidate the role played by Pno1 during the pre-18S rRNA maturation.Our results have shown that eukaryotic Nob1 adopts an atypical PIN domain conformation: two fragments (res 1-104 and 230-255) separated by an internal loop, which is essential for Pno1 recognition. We also found out that Pno1 inhibits Nob1 activity likely by masking the cleavage site. Our findings further support the recently published cryo-EM structure of the pre-40S, where Nob1 displays an inactive conformation. Moreover, 18S rRNA 3’-end cleavage has to happen and this implies structural rearrangement or requirement of some accessory proteins such as Cinap, an atypical kinase involved in pre-18S processing. Studying the interplay between proteins localized in the pre-40S platform (RPS14, RPS26, Nob1/Pno1 complex) has shown that Cinap is able to form a trimeric complex with Nob1 and its binding partner Pno1. Furthermore, Cinap can recognize RPS26 in a RPS14-dependent manner, which had already been studied with its yeast counterpart. It is important to note that RPS26 is the ribosomal protein replacing Pno1 in the mature ribosome. Our finding clearly suggests a mechanism where RPS26 recruitment to the ribosome requires Pno1 dissociation. This exchange would be carried out by Cinap. Therefore, we can suggest a simplified model as follow: upon binding with Pno1, the newly formed complex (Cinap/Pno1) will trigger a conformational change, which will allow the endonuclease Nob1 to reach its substrate (D-site) and perform its cleavage resulting in mature 18 rRNA generation

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Genovese, Sara. "Emergence and regulation of cell hierarchy in a Drosophila model of neuro-developmental tumor". Thesis, Aix-Marseille, 2018. http://www.theses.fr/2018AIXM0482.

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Dans les tumeurs hiérarchiques, les cellules souches du cancer (CSC), au sommet de la hiérarchie tumorale, peuvent s'auto-renouveler et se différencier en progéniteurs amplificateurs transitoires (TAP) avec un potentiel d'auto-renouvellement limité. Au cours du développement, les cellules souches neurales de Drosophile, appelées neuroblastes (NB), expriment en séquence deux protéines antagonistes se liant à l'ARN, Imp et Syncrip (Syp), qui respectivement favorise et réprime l'auto-renouvellement des NB. La perturbation de mécanismes de division asymétrique des NB peut générer leur amplification illimitée induisant de véritables tumeurs. À l’aide d’une analyse clonale et de modélisations mathématiques, nous avons démontré que les progéniteurs Imp+ dans les tumeurs agissent comme des cellules semblables aux CSC, capables de se renouveler indéfiniment et de se différencier en progéniteurs Syp+, qui, à l’instar des TAP, ont un potentiel d’auto-renouvellement limité et une forte tendance à entrer en quiescence. De plus, nous avons démontré que les tumeurs du NB suivent une organisation hiérarchique rigide dans laquelle la transition Imp-Syp est irréversible. Fait intéressant, en utilisant l’analyse transcriptomique, nous avons constaté que la transition Imp à Syp dans les NB de tumeurs induit une régulation négative des gènes glycolytiques et respiratoires, épuisant vraisemblablement la capacité de croissance et d’auto-renouvellement des progéniteurs Syp+. La conservation frappante de ces protéines de liaison à l'ARN ouvre la possibilité passionnante que des hiérarchies analogues puissent exister dans les cancers humain
In hierarchical tumors, cancer stem cells (CSCs), at the top of the tumor hierarchy, can self-renew and differentiate in transient-amplifying progenitors (TAPs), with a limited self-renewal potential. Understanding the molecular mechanisms that drive tumor hierarchy and heterogeneity is crucial to develop effective therapies to eliminate CSCs. During development, Drosophila asymmetrically-dividing neural stem cells, called neuroblasts (NBs), sequentially express two antagonistic RNA-binding proteins, Imp and Syncrip (Syp), that respectively promote and repress NB self-renewal. Genetic perturbation of NB asymmetric division cause NB amplification and malignant tumors. By using lineage tracing, clonal analysis and stochastic mathematical modeling of tumor growth, we demonstrated that Imp+ progenitors act as CSCs. They are able to self-renew endlessly and differentiate in Syp+ progenitors, that have a limited self-renewal potential and the high tendency to undergo quiescence. NB tumors follow a rigid hierarchical organization, where the Imp-to-Syp transition is irreversible. Hence, Syp+ progenitors cannot revert to an Imp+ malignant state. Transcriptomic analysis revealed that the Imp-to-Syp transition in tumors induces a downregulation of glycolytic and respiratory genes that exhausts the growth and self-renewing potential of Syp+ progenitors. The striking conservation of these RNA-binding proteins opens the exciting possibility that analogous Imp-Syp hierarchies may exist in human cancers

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Takeuchi, Akiko. "RNA-protein interaction in the selenoprotein synthesis machinery". Strasbourg, 2009. http://www.theses.fr/2009STRA6054.

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La sélénocystéine est incorporée co-traductionnellement dans les sélénoprotéines en réponse à un codon UGA habituellement l’un des 3 codons stop. La protéine SBP2 joue un rôle majeur dans ce mécanisme de recodage en se liant à une structure en tige-boucle (SECIS) située dans la région 3’UTR de l’ARNm des sélénoprotéines. Nous avons isolé et caractérisé fonctionnellement SBP2 de Drosophila melanogaster. Par comparison avec SBP2 humaine, nous avons identifié un domaine de liaison à l’ARN additionnel essentiel à la liaison au SECIS et à la sous-unité ribosomique 60S et permettant une sélectivité structurale du SECIS. Des prédictions structurales et des analyses biophysiques ont établi que SBP2 était une protéine globalement désordonnée ou “Intrinsically Disordered Protein” qui ne se replie qu’en présence de partenaires. Enfin, nous avons établi que l’assemblage des mRNP de sélénoprotéines faisait appel à des facteurs communs et présentait de multiples similarités avec celui des sn/snoRNP
The 21st amino acid selenocysteine is encoded by a UGA codon that usually signifies translational termination. Selenoprotein synthesis therefore requires specialized factors. Among these is SBP2 that binds the SECIS, a stem-loop structure in the 3’UTR of selenoprotein mRNAs. In structural analyses of SBP2, we isolated and functionally characterized Drosophila melanogaster SBP2. By comparing it with human SBP2, we identified an additional RNA binding domain that is essential for SECIS and 60S ribosomal subunit binding, and also enables SECIS structure selectivity. In addition, computational and biophysical analyses established that SBP2 is globally unfolded, supporting our hypothesis that SBP2 is an Intrinsically Disordered Protein and becomes folded in the presence of partners yet to be identified. Finally, we searched for potential partners of SBP2 and our results showed that the molecular assembly of selenoprotein mRNPs has many similarities with that of sn/snoRNPs

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Munoz-Ruiz, Raphaël. "Novel aspects of TDP-43's interaction with ALS-related autophagy genes". Thesis, Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS268.

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La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie dégénérative des neurones moteurs. Sa signature est la présence d’inclusions cytoplasmiques ubiquitinées (synonyme de protéostasie défaillante) majoritairement positives pour TDP-43, une protéine de liaison aux ARNs. Les altérations de l’autophagie et du métabolisme des ARNs sont particulièrement étudiées dans la SLA. Cette thèse explore le rôle de TDP-43 dans la régulation de l’autophagie et particulièrement sur les récepteurs de l’autophagie p62 et OPTN ainsi que leur kinase activatrice TBK1. Chez l’embryon de poisson zèbre, la sous-expression de tardbp (codant pour tdp-43) conduit à un phénotype moteur altéré que nous associons à une régulation négative de tbk1. De l’ARN humain de TBK1 améliore ce phénotype. Sur des cellules SH-SY5Y, une sous-expression de TARDBP conduit à un profil d’expression de gènes clés de l’autophagie contradictoire à celui du poisson zèbre. Cependant, activer l’autophagie basale grâce à la Torine 1 conditionne l’effet d’une déplétion de TDP-43 sur l’expression de p62/SQSTM1 et TBK1. De plus, la Torine 1 inhibe les liaisons de TDP-43 aux ARNs de RAPTOR et OPTN mais promeut celles avec p62/SQSTM1 et TBK1. Dans ces cellules, la surexpression progressive de TDP-43 conduit potentiellement à des effets antagonistes sur p62/SQSTM1. Plus globalement, moduler TARDBP se traduit par une apparition de phénomènes caractéristiques de la protéinopathie TDP-43 chez les patients SLA. Parallèlement, des techniques de visualisation des ARNs in vivo et in vitro sont développées. Ce travail met en lumière la faculté de TDP-43 à s’adapter au contexte cellulaire et d’influer différemment sur l’autophagie
Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a degenerative disease of motoneurons. Its histological hallmark is the presence of ubiquitin-positive cytoplasmic inclusions in motor neurons of patients which indicates defective proteostasis. In the majority of cases, these inclusions are positive for TDP-43, an RNA-binding protein. Alterations of autophagy and RNA metabolism are widely investigated in ALS. This thesis explores the role of TDP-43 on autophagy regulation with a focus on autophagy receptors p62 and OPTN and their upstream activator TBK1. In the zebrafish embryo, knockdown of tardbp leads to an altered motor phenotype and correlates with a downregulation of tbk1. Human TBK1 RNA ameliorates this phenotype in a significant manner. In SH-SY5Y cells, knockdown of TARDBP leads to a profile of expression of key autophagy genes that is in opposition with the one obtained in the zebrafish. However, activating basal autophagy through Torin 1 treatment unveils conditional effect of TDP-43 on p62/SQSTM1 and TBK1. Moreover, Torin 1 treatment inhibits binding of TDP-43 to RAPTOR and OPTN mRNAs but promotes novel binding to p62/SQSTM1 and TBK1 mRNAs. In these cell lines, increasing overexpression of TARDBP also seems to affect p62/SQSTM1 in different manners. Overall, modulating TARDBP expression is accompanied by the appearance of characteristic traits of TDP-43 pathology in ALS. In parallel, techniques to visualize target RNAs in vivo and in vitro are being developed. This work highlights TDP-43 ability to adapt to cellular context and affect autophagy in different manners

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Ferhadian, Damien. "Structure de l'ARN au sein des ribonucléoprotéines des Influenzavirus A". Thesis, Strasbourg, 2018. http://www.theses.fr/2018STRAJ066.

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Le génome des Influenzavirus A est constitué de huit segments d’ARN de polarité négative formant des ribonucléoprotéines virales (RNPv). La segmentation du génome complique l’empaquetage du génome, puisqu’un jeu complet de segments est nécessaire à l’infectiosité des virus. Il est aujourd’hui admis que le mécanisme d’empaquetage est sélectif et fait intervenir des interactions entre les ARN des différentes RNPv, qui dépendent vraisemblablement de la structure de l’ARN. Notre but a été de caractériser la fixation de la protéine virale NP, composant majeur des RNPv, sur l’ARN in vitro. Nous avons également mis en place une stratégie expérimentale afin de déterminer la structure de l’ARN au sein des particules virales. Ces deux aspects du projet ont été abordés par la cartographie chimique qui permet d’interroger la flexibilité de chaque nucléotide de l’ARN. Nos résultats démontrent une activité chaperone de la protéine NP ainsi que des sites préférentiels de fixation. Notre approche in viro a démontré que l’utilisation de deux sondes chimiques permet de discriminer les interactions ARN-ARN des interactions ARN-NP
The Influenzavirus genome comprises eight segments of single-stranded RNA of negative polarity packaged in viral ribonucleoproteins (vRNP). Genome segmentation complicates packaging as a full set of vRNPs is required needed for virus infectivity. It is now accepted that packaging is selective and involves interactions between the RNA components of vRNPs that likely depend on the RNA structure. Our goal was to characterize the binding of the viral protein NP, the major component of the vRNP, on in vitro transcribed RNA. We also developed an experimental strategy to determine the RNA structure inside the viral particles. Both parts of the project were addressed with chemical mapping experiments, that interrogates the flexibility of each nucleotide in the RNA structure. Our results show that NP possess an RNA chaperone activity and binds preferential sites. Our in viro approach demonstrate that using two chemical probes allow us to discriminate between RNA-RNA and RNA-NP interactions

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Tabet, Ricardos. "Bases moléculaires de la physiopathologie du syndrome de l'X fragile". Thesis, Strasbourg, 2013. http://www.theses.fr/2013STRAJ090.

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Le syndrome de l’X fragile représente la première cause de déficience intellectuelle héréditaire. Ce syndrome résulte de l’absence de la protéine FMRP. FMRP est proposée réguler, sous contrôles des mGluR-I et d’autres récepteurs, l’expression de protéines importantes pour la plasticité synaptique en se fixant spécifiquement sur leur ARNm et en modulant leur traduction. Des milliers d’ARNm cibles ont déjà été proposées dans la littérature, mais très peu ont pu être validées. Par approche de pontage covalent aux UV et immunoprecipitation (CLIP) couplé à une analyse microarray, nous avons identifié un ARNm comme cible unique de FMRP dans les neurones corticaux. Cet ARNm code pour une kinase contrôlant le niveau de deux seconds messagers lipidiques importants pour le remodelage des épines dendritiques. De plus, nous avons montré que l’activation mGluR-I dépendante de la kinase est absente dans les neurones Fmr1 KO, avec pour conséquence une altération de plusieurs espèces lipidiques du neurone. Ces défauts peuvent expliquer les altérations morphologiques et fonctionnelles des épines dendritiques, cause principale proposée du syndrome de l’X fragile
Fragile X syndrome is the leading cause of inherited intellectual disability and is due to the absence of the RNA binding protein FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein). FMRP is proposed to bind and regulate synaptic expression of mRNA targets upon mGluR-I activation. Thousands of mRNA targets have already been proposed in the literature, but only a few have been validated leaving unsolved the question of the genes mostly affected by the absence of FMRP in the brain of fragile Xpatients. The main project of the thesis was to identify the mRNAs associated with FMRP in cortical neurons by performing cross-linking immunoprecipitation approach (CLIP). We found that FMRP principally targets one unique mRNA which encodes an important synaptic kinase. This enzyme controls the level of two second lipid messengers important for remodeling of dendritic spines. Consequently, the mGluR-I-dependant activation of the enzyme is lost in absence of FMRP, leading to several lipid species alterations in the neuron. These defects may explain the morphological and functional alterations of dendritic spines, the hallmark of fragile X syndrome

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Gilbert, Agathe. "Impact of protein-protein interactions and phosphorylation on RNA decapping for nonsense mediated mRNA decay (NMD)". Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2022. http://www.theses.fr/2022SORUS386.

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Chez Saccharomyces cerevisiae, la voie de dégradation majoritaire des ARN messagers passe par le clivage de la liaison pyrophosphate entre l’ARNm et la structure de la coiffe à l’extrémité 5’. Cette étape, importante pour la dégradation de l’ensemble des ARNm, est particulièrement clé dans la dégradation d’une classe d’ARN instables, cibles de la voie de dégradation nommée nonsense-mediated mRNA decay (NMD). Cette-dernière permet la dégradation de transcrits contenant un codon STOP prémature et donc dépend de la traduction. D’abord considérée comme une voie de dégradation présente à travers les eucaryotes à cause de la grande conservation de ses facteurs principaux – les protéines Upf -, la découverte des protéines Smg dans C. elegans (Page et al., 1999) et la description du mécanisme SURF/DECID dépendant de la phosphorylation d’Upf1 (Kashima et al., 2006) semblaient indiquer des différences majeures entre les organismes. Récemment, notre laboratoire a décrit l’architecture des complexes NMD chez la levure. Ces-derniers sont centrés autour d’Upf1 et ont été nommés Détecteur et Effecteur. Dans le second, nous avons pu identifier la protéine kinase Hrr25 comme un membre du complexe Upf1 avec les protéines du decapping, Dcp2, Dcp1 et Edc3 (Dehecq et al., 2018). Cette protéine conservée est l’analogue des caséines kinases 1 chez l’humain - CK1delta and CK1epsilon - et elle est impliquée dans de nombreux processus majeurs de la cellule, comme la modification des ARNt, la biogénèse des ribosomes, l’élongation de la transcription et la méiose (Abdel-Fattah et al., 2015 ; Ghalei et al., 2015 ; Ye et al., 2016 ; Nemec et al., 2019). J’ai montré que l’activité kinase de Hrr25 a un rôle dans le NMD qui est indépendant de ses fonctions dans la traduction de l’ARNm mais aussi dans la transcription de l’ADN. Nous avons aussi montré que l’association de Hrr25 avec Upf1 s’appuie sur l’activité kinase de Hrr25 et sur la présence de la protéine portant l’activité decapping, Dcp2. Nous avons pu identifier des résidus Sérine très conservées dans la région C-terminal d’Upf1 levure dont la phosphorylation dépend de Hrr25 et dont la régulation, à l’image de celle impliquée dans d’autres organismes, dépend de la présence d’autres facteurs NMD comme Upf2 et Ebs1 (l’équivalent de Smg5/7). Ces résultats indiquent que les protéines kinase peuvent moduler le NMD par des interactions directes avec les enzymes impliquées dans la dégradation des ARN. Ils suggèrent également que, contrairement à ce que l’on pouvait croire, des protéines kinase sont requises de manière universelle pour le NMD
In yeast, mRNA degradation is mainly initiated through the cleavage of the pyrophosphate bond between the mRNA and the cap structure at its 5’-end. While this step is important for the decay of most mRNAs, it is particularly critical to initiate the degradation of unstable RNA, targets of the NMD machinery. This pathway allows degradation of transcripts that contain a premature termination codon and thus is entirely dependent on translation. First considered as conserved throughout eucaryotes due to high sequence similarity of its core factors – the Upf proteins -, the discovery of the Smg proteins in C. elegans (Page et al., 1999) and the description of the SURF/DECID mechanism depending on phosphorylation of Upf1 (Kashima et al., 2006) indicated a divergence of NMD mechanisms between organisms. However, recently our laboratory described two NMD complexes revolving around Upf1 – named Detector and Effector - and identified the protein kinase Hrr25 as a member of a Upf1-decapping complex (Dehecq et al., 2018). The conserved protein kinase Hrr25 is the yeast equivalent of mammalian casein kinase 1 (CK1delta and CK1epsilon) and is involved in major cellular processes, including tRNA modification, ribosome biogenesis, transcription elongation and meiosis (Abdel-Fattah et al., 2015; Ghalei et al., 2015; Ye et al., 2016; Nemec et al., 2019). I demonstrated that the Hrr25 kinase activity has a role in NMD that is independent of its function in mRNA translation and DNA transcription. The association of Hrr25 to Upf1 was dependent on the kinase activity of the protein and on the presence of the decapping enzyme Dcp2. We identified conserved serine residues located in the C-terminal region of yeast Upf1 whose phosphorylation was dependent on Hrr25 and was modulated, like the phosphorylation of Upf1 in other organisms, by the presence of other NMD factors, such as Upf2 and Ebs1 (SMG5/7 equivalent). These results indicate that protein kinases can modulate NMD by direct interactions with the enzymes involved in RNA degradation and suggest that, contrary to previous beliefs, protein kinases are universally required for NMD

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Boudoukha, Selim. "Étude de la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes par la protéine de liaison à l’ARN IMP-2 au cours de la myogenèse". Thesis, Paris 11, 2011. http://www.theses.fr/2011PA11T095/document.

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Les rhabdomyosarcomes embryonnaires et aléolaires (RMS) appartiennent aux tumeurs des tissus mous les plus fréquentes chez les enfants dont elles représentent 2/3 des cas. Plusieurs données suggèrent que la dérégulation des cellules progénitrices du muscle squelettique pourrait jouer un rôle dans l'émergence des cellules de RMS qui ont aussi bien perdu le contrôle de la régulation de la prolifération cellulaire que la capacité à se différencier.Néanmoins les mécanismes de développement des RMS restent à caractériser. La famille des IMPs et notamment IMP-2, protéines liant les ARN, sont à la fois fortement exprimées dans le muscle en régénération in vivo mais aussi dans les cellules de RMS.Au cours de ma thèse, j’ai pu mettre en évidence le rôle d’IMP-2 dans la motilité des cellules de RMS et dans les cellules musculaires ainsi que dans le contrôle de l’intégrité du cytosquelette de microtubules (MTs) et dans le remodelage des adhésions focales. En effet, IMP-2 est impliqué à la fois dans la régulation de l’expression de MuRF-3, une protéine lié àla stabilisation des MTs et de Pinch-2, un important médiateur de l’adhésion cellulaire
The RNA-binding proteins IMPs (IGF-II mRNA binding protein) first discovered in rhabdomyosarcoma cells (RMS) are expressed during embryonic development but their expression is decreased in adult tissues.We showed that IMPs and particularly IMP-2 are strongly expressed in mouse myoblatsts, during early regeneration of skeletal muscle in vivo and in and RMS. IMP-2 loss of function experiments using siRNA have shown that IMP-2 is necessary for microtubules stability(MTs), cell motility and invasion of myoblasts and RMS.Expression of IMP-2 specifically increases MTs stability by an enrichment of detyrosinated tubulin Glu-tubulin. Detyrosination is indispensable for myogenic differentiation and plays substantial role in tumor growth. Additionaly, MTs stabilization play an important role in focal adhesion remodeling, in cytoskeleton integrity, cell adhesion and cell motility.To get new insight into molecular mechanism underlying the function of IMP-2 in MTs stability and cell motility, full ranscriptome analysis was performed between IMP-2 knockdown (KD) myoblasts and control myoblatsts. We have further shown that IMP-2 controls the mRNA levels of many important mediators of cell adhesion such as PINCH-2, as well as multiple cytoskeleton remodeling, such as MuRF-3.We have identified a number of functionally relevant protein partners of IMP-2.Moreover subsequent RNAi screens have revealed the importance of IMP-2 regulated transcripts involved in cell motility and cell adhesion In conclusion, we show that IMP-2 dependent regulation of mRNA such as MuRF3 and PINCH2 largely contributes to the motility –deficient in IMP-2 KD cells. Moreover these results indicate clearly, that further analysis of IMP2 protein partners and RNA targets regulated by IMP-2 will help to characterized the function of IMP-2 and to propose a model of IMP-2 transcriptional regulation of gene expression in myoblasts and RMS cells

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Martin, Sophie. "Le composant des granules de stress G3BP : caractérisation phénotypique de souris KO, et identification de son interactome ribonucléoprotéique dans le cerveau de souris". Thesis, Montpellier 2, 2012. http://www.theses.fr/2012MON20247.

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Les protéines capables de lier des ARNs sont essentielles pour les différentes étapes de maturation de l'ARN messager (ARNm), en dirigeant leur localisation et leur devenir dans la cellule, et en formant avec les ARNs des particules ribonucléoprotéiques (mRNPs). Les mRNPS peuvent former des structures cellulaires dynamiques qui sont adressées vers des fonctions spécifiques. Ces granules, tels que les granules de stress formés suite à un stress cellulaire, contiennent des ARNm dont la traduction est inhibée et qui sont stockés transitoirement. Ma thèse a consisté en la caractérisation fonctionnelle de G3BP (RasGAP SH3 binding protein), une RBP exprimée de façon ubiquitaire chez l'homme et la souris, et impliquée dans l'assemblage des granules de stress. Par recombinaison homologue classique, des souris knock-out pour G3BP ont été générées. Ces souris ont une espérance de vie faible et des défauts du comportement associés au Système Nerveux Central, en particulier un phénotype de type ataxie. Des expériences d'électrophysiologie ont aussi montré une altération de la plasticité synaptique dans l'hippocampe des souris KO. J'ai donc réalisé des expériences d'immunoprécipitation après cross-link (Cross-Linking and Immunoprecipitation, CLIP) pour purifier à partir de cerveau de souris un complexe stable contenant G3BP, et les ARNs associés ont été identifiés par séquençage haut débit (High-Throughput Sequencing, HITS-CLIP). De façon surprenante, la plupart des cibles de G3BP correspondent à des transcrits codants mais qui contiennent des séquences introniques, et des ARNs non codants. De plus, mes résultats ont montré que l'absence de G3BP1 affecte la stabilité de ces transcrits pré-matures spécifiquement dans le cervelet, ce qui peut être corrélé au phénotype d'ataxie des souris KO G3BP1. Cela suggère un nouveau mécanisme de régulation qui passe par la stabilisation de transcrits pré-matures, qui pourraient être convertis en transcrits matures par exemple lors d'un stress et de la séquestration de G3BP dans les granules
RNA binding proteins (RBPs) are essential in the different steps of processing of the messenger RNAs (mRNAs), directing their localization and fate within the cell, and forming with them the ribonucleoprotein particles (mRNPs). mRNPs can assemble into dynamic cellular structures in which they are routed towards specific functions. RNA granules such as stress granules (SGs) contain translationally silenced mRNPs storing transiently repressed mRNAs.My thesis work consisted in the functional characterization of G3BP (RasGAP SH3 binding protein), an RBP that is expressed ubiquitously in both humans and mice and is involved in the assembly of SGs. Using classical homozygous recombination, viable G3BP1 knock out mice were generated that demonstrated short lifespan.and behavioral defects linked to the Central Nervous System (CNS), notably an ataxia phenotype. Electrophysiology experiments showed an alteration of synaptic plasticity in the hippocampus of KO mice. Therefore, I used Cross-Linking and Immunoprecipitation (CLIP) to purify from mouse brain a stable complex containing G3BP, and performed High-Throughput Sequencing (HITS-CLIP) to identify associated RNAs. Strikingly, most of the G3BP targets correspond to intron sequence-retaining transcripts and non-coding RNAs. My results also showed that G3BP1 depletion influences the stability of these premature transcripts in the cerebellum, which can be correlated to the ataxia phenotype of the G3BP1 KO mice. This comprehensive analysis suggests a new mechanism of gene regulation based on stabilization of silenced premature transcripts which might be converted to mature transcripts under stress condition and sequestration of G3BP in SGs

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Bernard, Laure. "Regulation of heterochromatin by a pluripotency-associated long non coding RNA in mouse embryonic stem cells and in oocytes : implications for early embryogenesis". Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2021. http://www.theses.fr/2021SORUS179.

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La méthylation de l'histone H3 Lysine 9 (H3K9me) est une marque de l'hétérochromatine progressivement déposée au cours du développement. Elle contribue à la restriction de certains destins cellulaires. Dans les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs), les niveaux de H3K9me augmentent lors de la différentiation, constituant alors une barrière à la reprogrammation à l'état pluripotent. Cependant le couplage entre les niveaux d'H3K9me et la pluripotence n'a encore jamais été formellement étudié. On a ainsi identifié SUV39H1, une methyltransferase responsable de la propagation di/tri H3K9me (H3K9me2/3), comme une cible indirecte du réseau des facteurs de transcription de la pluripotence (pTFs). En effet, le pTF OCT4 active l'expression d'un ARN long non-codant Suv39h1as anti-sens à Suv39h1. Suv39h1as réprime l'expression de Suv39h1 en modifiant la chromatine au locus et possiblement en modulant l'expression de ses isoformes. L'absence de Suv39h1as induit l'augmentation de SUV39H1 ainsi que de H3K9me2/3, menant à une accélération de la spécification irréversible au cours de la différentiation. Ainsi, OCT4, Suv39h1 et Suv39h1as constituent un circuit permettant de coupler les niveaux d'H3K9me à la pluripotence dans les mESCs. De plus, une lignée de souris knock-out pour Suv39h1as a été créée et nous avons démontré que cette régulation est aussi présente dans l'ovocyte
Histone H3 Lysine 9 (H3K9) methylation, a mark of heterochromatin, is progressively implemented during development to contribute to cell fate restriction as differentiation proceeds. For instance, in mouse Embryonic Stem cells (mESCs) the global levels of H3K9 methylation are rather low and increase only upon differentiation. Conversely, H3K9 methylation represents an epigenetic barrier for reprogramming somatic cells back to pluripotency. How global H3K9 methylation levels are coupled with the acquisition and loss of pluripotency remains unknown. Here, we identify SUV39H1, a major H3K9 di- and tri-methylase, as an indirect target of pluripotency Transcription Factors (pTFs). We find that the pTFs OCT4 activates the expression of an antisense long non-coding RNA to Suv39h1, named Suv39h1as. In turn, Suv39h1as downregulates Suv39h1 expression via the modulation of the chromatin status of the locus and a possible alteration of Suv39h1 isoforms. The loss of Suv39h1as expression triggers increased SUV39H1 expression and H3K9me2/3 levels, leading to accelerated commitment into differentiation. We report, therefore, a simple genetic circuitry coupling the global levels of H3K9 methylation to pluripotency in mESCs. We also created a mouse line deleted for Suv39h1as expression and demonstrated that this regulation is also present during mouse oocyte maturation

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Werner, Andreas. "Structural and biophysical studies of RNase P and RNA aptamers". Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2005. https://publication-theses.unistra.fr/restreint/theses_doctorat/2005/WERNER_Andreas_2005.pdf.

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La recherche dans cette thèse de Ph. D. Fait partie d'un effort continu d'améliorer notre compréhension de la structure et de la stabilité de l'ARN : Dans la première partie, un aptamer d'ARN est étudié en complexe avec sa cible, le domaine Sec7 de la protéine intracellulaire cytohesin-1. Aptamers sont des molécules d'ARN sélectionnées in vitro qui ont une affinité rivalisant celle des anticorps monoclonaux, qui possèdent des propriétés pharmacologiques intéressantes et sont un outil puissant pour l'analyse fonctionnelle in vivo. Nous présentons également une recherche structurale systématique sur la façon dont les aptamers et leurs analogues naturelles se fixent sur leurs ligands afin de tracer des principes communs. Dans la deuxième partie, nous étudions le repliement de la RNase P prokaryotique induit par les counterions en utilisant la technique des fontes UV, avec comme but l'optimisation de la structure secondaire et tertiaire en vue de la cristallisation. Nous démontrons l'utilité de cette méthode tout d'abord dans deux cas d'exemple: Premièrement, des paramètres thermodynamiques sont extraits à partir du complexe dit de 'kissing', une interaction tertiaire typique présent dans de nombreux ARNs structurés. Ceci mène à la découverte que la dépendance de la temperature de fusion de la concentration ionique peut donner des indications sur la nature des transitions structurelles observées. Deuxièmement, nous étudions l'effet de mutations sur un ARN plus complexe, le site d'entrée du ribosome (IRES) du virus de l'hépatite C, et corrélons nos données de fonte UV avec un équilibre dynamique entre deux structures alternatives identifiées par empreinte chimique. Les leçons apprises de ces expériences sont alors appliquées à la RNase P pour perturber des interactions tertiaires spécifiques afin de faciliter la cristallisation. L'effet de ces mutations est étudié en utilisant la fonte UV et une nouvelle technique basée sur des oligonucléotides fluorescentes que nous développons. Finalement, des matrices de cristallisation pour la RNase P sont construits à partir de méthodes de plannification expérimentale, et une nouvelle approche pour la cristallisation en gels est développée
The research in this Ph. D. Thesis is part of an ongoing effort to improve our understanding of RNA structure and stability: In the first part, an RNA aptamer is studied in complex with its target, the Sec7 domain of intracellular protein cytohesin-1. Aptamers are in vitro selected RNA molecules that have an affinity rivaling that of monoclonal antibodies, possess interesting pharmacological properties and are a powerful tool for functional analysis in vivo. We also present a systematic structural investigation of how aptamers and their natural counterparts bind their ligands in order to delineate common principles. In the second part, we study the counterion-induced collapse of prokaryotic RNase P RNAs by UV melting, with the goal of optimizing secondary and tertiary structure for crystallization. We demonstrate the utility of this method in two test cases: First, thermodynamic parameters are extracted from the kissing complex, a typical tertiary interaction found in many RNAs. This leads to the discovery that the ionic strength dependence may give clues about the structural transitions observed. Second, we study the effect of mutations on a more complex RNA, the IRES site of hepatitis C virus, and correlate UV melting data to a dynamic equilibrium between alternative structures. The lessons learned from these experiments are then applied to RNase P to disrupt specific tertiary interactions to facilitate crystallization. The effect of these mutations is investigated using both UV melting and a novel, fluorescence-based approach. Finally, crystallization screens are constructed using methods of experimental design, and a new approach for crystallization in gels is developed

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Blond, Aurélie. "Synthèse orientée vers la diversité de cis-1,3-diamines pipéridiniques et cyclohexaniques : ligands potentiels d’ARN". Thesis, Paris 5, 2014. http://www.theses.fr/2014PA05P617.

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Moissiard, Guillaume. "Induction, suppression, amplification of RNA silencing during viral infection". Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2007. http://www.theses.fr/2007STR13023.

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L’ARN silencing est un mécanisme de régulation négative de l’expression des gènes par des interactions entre molécules d’ARN. Un ARN double-brin est découpé par Dicer en “short-interfering (si)RNA” de 21 à 24-nt incorporant un “RNA-Induced Silencing Complex”, pour guider le clivage d’ARNm cible de manière séquence spécifique. Le silencing joue un rôle important dans la lutte antivirale chez les plantes. De plus, la plupart des phytovirus produisent des protéines suppresseurs de silencing. Le silencing peut être amplifié par l’activité d’ARN-dépendante ARN polymérases (RDR) cellulaires. Nous avons étudié l’ARN silencing au cours de l’infection par le Cauliflower mosaic virus (CaMV) et montré que les quatre protéines Dicer-like (DCLs) d’Arabidopsis étaient impliquées dans ce mécanisme. Nous avons analysé les interactions entre cinq suppresseurs et l’activité de RDR6 et identifié les DCLs associés à RDR6. Nous avons découvert que dans certains cas, RDR6 utilise le siRNA comme une amorce
RNA silencing is a mechanism involved in the suppression of gene expression through nucleotide sequence-specific interactions mediated by RNA. A double-stranded RNA is processed by Dicer into 21- to 24-nt RNAs, called short-interfering (si)RNA that incorporate into a RNA-Induced Silencing Complex, to guide cleavage target mRNA in a sequence-specific manner. RNA silencing plays important antiviral role in plants. In parallel, most of phytoviruses produce suppressor proteins to counteract RNA silencing. RNA silencing can be amplified through the activity of the cellular RNA-dependent RNA polymerase (RDR). We studied RNA silencing during Cauliflower mosaic virus (CaMV) infection. We found that the four Arabidopsis Dicer-like (DCLs) proteins are involved to produce two classes of viral siRNAs. Then, we analysed the interactions between five silencing suppressors and RDR6 and identified the DCLs associated to RDR6. We also showed that, at least in some cases, RDR6 uses small RNAs as primers

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Mamigonian, Bessa Luíza. "Investigation of the hepatitis C virus RNA polymerase NS5B in solution by nuclear magnetic resonance and its interaction with intrinsically disordered domain 2 of the NS5A protein". Thesis, Lille 1, 2017. http://www.theses.fr/2017LIL10117/document.

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NS5B est l’ARN polymérase du virus de l’hépatite C (VHC). Sa structure a beaucoup été étudiée par radiocristallographie, elle contient trois sous-domaines appelés doigts, paume et pouce. Cependant, les études structurales de cette protéine en solution sont très limitées. La résonance magnétique nucléaire (RMN) a été utilisée pour étudier NS5B en solution ainsi que son interaction avec différents partenaires. L’emploi d’un échantillon de NS5B (65kDa) perdeuterée et sélectivement enrichie au niveau des méthyles 1 des résidus d’isoleucines a permis d’obtenir un spectre simplifié et de bonne qualité. Cette étude a confirmé la présence d’une dynamique particulière dans le pouce et a permis de mettre en évidence des effets à longues distances que se transmettent aux autres sous-domaines. Cette approche a alors été utilisée pour étudier l’interaction entre NS5B et le domaine 2 de la protéine NS5A (NS5A-D2) du VHC. Celui-ci est un domaine intrinsèquement désordonné qui interagit directement avec NS5B in vitro. Nous avons identifié que NS5A-D2 se lie via deux sites d’interaction sur le sous-domaine du pouce. Puisqu’un de ces sites est le site de liaison de l’inhibiteur allostérique filibuvir, nous avons étudié la liaison de cette molécule à la polymérase. Sa liaison cause des effets à longues distances tout au long de NS5B. Enfin, nous avons caractérisé la liaison d’un ARN simple brin à NS5B et nous avons identifié que NS5A-D2 et filibuvir réduisent mais ne suppriment pas l’interaction de NS5B avec l’ARN. L’analyse de NS5B par RMN en solution a permis d’étudier des interactions et d’accéder à des paramètres dynamiques très complémentaires des études cristallographiques
NS5B is the hepatitis C virus (HCV) RNA-dependent RNA polymerase. This protein has been extensively studied by X-ray crystallography and shows an organization in three subdomains called fingers, palm and thumb. Whereas static crystallographic data are abundant, structural studies of this protein in solution are limited. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy was used to study the 65 kDa NS5B in solution as well as its interaction with binding partners. It was characterized using selective isotopic labeling of isoleucine side-chain methyl groups, which gives rise to a simplified NMR spectrum with an improved signal-to-noise ratio. This characterization confirmed the presence of particular dynamics in the subdomains, especially in the thumb, as well as long-range effects that are transmitted through to other subdomains. Furthermore, this system was used to investigate the binding of the domain 2 of NS5A (NS5A-D2), a disordered domain of another HCV protein that has been shown to directly interact with NS5B in vitro. With paramagnetic relaxation enhancement experiments we showed that NS5A-D2 binds to NS5B via, at least, two binding sites on the thumb subdomain. As one of these sites was the binding site of allosteric inhibitor filibuvir, we characterized the binding of this small molecule to NS5B by NMR and found long-range effects of its binding throughout the polymerase. Finally, we studied the binding of a small RNA template strand to NS5B and found that both NS5A-D2 and filibuvir reduce but do not abolish the interaction between the polymerase and RNA. In sum, NMR spectroscopy was used to study dynamic properties of NS5B and its interactions with binding partners

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Cattelin, Céline. "Exploration de la diversité des protéines à solénoïdes alpha, régulatrices de l'expression des gènes des organites dans les lignées eucaryotes photosynthétiques et étude de la dynamique conformationnelle des protéines à "PentatricoPeptide Repeats"". Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2023. http://www.theses.fr/2023SORUS158.

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Au sein des Archaeplastida (eucaryotes photosynthétiques ayant acquis un chloroplaste suite à une endosymbiose avec une cyanobactérie ancestrale) les génomes chloroplastiques et mitochondriaux des algues vertes et des plantes terrestres sont régulés de manière post-transcriptionnelle, principalement par des protéines à solénoïde alpha codées dans le noyau. Ces facteurs nucléaires sont composés de motifs répétés dégénérés (protéines PPR et OPR, respectivement pentatricopeptide repeat et octatricopeptide repeats) interagissant de façon spécifique avec une partie de la séquence de leur ARN cible et forment de grandes familles de paralogues. Les protéines PPR sont très abondantes chez les plantes terrestres tandis que les OPR le sont chez les algues vertes. Ces expansions différentielles, en parallèle de l'évolution du métabolisme des ARN dans les organites pourraient refléter des adaptations génétiques préservant la phototrophie dans diverses conditions et niches écologiques. Chez les autres Archaeplastida (algues rouges et Glaucophytes) et chez les eucaryotes issus d'une endosymbiose avec une microalgue ancestrale comme les Diatomées, la régulation des génomes des organites reste peu explorée. Un premier objectif de ma thèse a été de décrire la diversité et la dynamique évolutive des protéines à solénoïde alpha connues ou candidates pour la régulation de l'expression du génome des organites et ce, dans l'ensemble des eucaryotes photosynthétiques. Pour les identifier, j'ai développé une approche combinant détection d'homologie lointaine de séquence et classification indépendante de la similarité entre séquences. J'ai validé cette approche en retrouvant et complétant les familles OPR et PPR connues chez les espèces modèles Chlamydomonas reinhardtii et Arabidopsis thaliana. J'ai montré que les expansions d'OPR étaient restreintes au sein des Chlorophytes et qu'en dehors des algues vertes et des plantes terrestres, les protéines à PPR et à OPR étaient peu nombreuses, suggérant que d'autres acteurs de la régulation de l'expression des génomes des organites restent à découvrir. J'ai également identifié plusieurs dizaines d'autres familles de protéines à solénoïde alpha adressées aux organites dans tous les protéomes étudiés, certaines aux fonctions encore inconnues et dont la caractérisation expérimentale dans des organismes modèles serait pertinente. Dans un second temps, j'ai utilisé des approches de dynamique moléculaire pour mieux comprendre l'affinité et la spécificité des liaisons entre les PPR et leurs ARN cibles. J'ai notamment étudié la dynamique des motifs répétés et la géométrie des sites de liaison des nucléotides en fonction de leur position dans la séquence des motifs PPR, y compris les effets du nombre de répétitions et de la présence ou non des domaines N- et C-terminaux, en plus de l'évolution de la conformation globale de la protéine. Nos résultats suggèrent le rôle de la flexibilité des protéines PPR, tant au niveau de la protéine que du motif dans la liaison à sa cible ARN et sa pertinence pour l'affinité et la spécificité de la reconnaissance des nucléotides
In Archaeplastida (photosynthetic eukaryotes that acquired a chloroplast following endosymbiosis with an ancestral cyanobacterium) the chloroplast and mitochondrial genomes of green algae and land plants are regulated post-transcriptionally, mainly by alpha-solenoid proteins encoded in the nucleus. These nuclear factors are composed of degenerate repeat motifs (PPR and OPR proteins, respectively pentatricopeptide repeat and octatricopeptide repeats) that interact specifically with part of their target RNA sequence and form large families of paralogs. PPR proteins are very abundant in terrestrial plants while OPRs are abundant in green algae. These differential expansions, in parallel with the evolution of RNA metabolism in organelles, may reflect genetic adaptations that preserve phototrophy under different conditions and ecological niches. In other Archaeplastids (red algae and Glaucophytes) and in eukaryotes that originate from endosymbiosis with an ancestral microalga such as the Diatoms, the regulation of organelle genomes remains poorly explored. A first objective of my thesis was to describe the diversity and evolutionary dynamics of known or candidate alpha-solenoid proteins for the regulation of organelle genome expression in all photosynthetic eukaryotes. To identify them, I developed an approach that combines distant sequence homology detection and sequence similarity independent classification. I validated this approach by finding and completing the known OPR and PPR families in the model species Chlamydomonas reinhardtii and Arabidopsis thaliana. I showed that OPR expansions were restricted within Chlorophytes and that outside of green algae and land plants, PPR and OPR proteins were few in number, suggesting that other players in the regulation of organelle genome expression remain to be discovered. I also identified several dozen other families of organelle-addressed alpha-solenoid proteins in all the proteomes studied, some of which have as yet unknown functions and whose experimental characterisation in model organisms would be relevant. In a second step, I used molecular dynamics approaches to better understand the affinity and specificity of binding between PPRs and their target RNAs. In particular, I studied the dynamics of the repeat motifs and the geometry of the nucleotide binding sites as a function of their position in the PPR motif sequence, including the effects of the number of repeats and the presence or absence of N- and C-terminal domains, in addition to the evolution of the overall conformation of the protein. Our results suggest the role of PPR protein flexibility, both at the protein and motif level, in binding to its RNA target and its relevance to the affinity and specificity of nucleotide recognition

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Parmentier, Delphine. "Fonction de la protéine Tex chez Staphylococcus aureus : un lien potentiel avec les ARN régulateurs ?" Thesis, Strasbourg, 2014. http://www.theses.fr/2014STRAJ090/document.

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L’ARNIII de S. aureus est considéré comme un régulateur majeur de la virulence de la bactérie. Il agit au niveau post‐transcriptionnel en interagissant avec ses ARNm cibles, permettant la répression des protéines d’adhésion et l’expression des exotoxines. Des expériences de chromatographie d’affinité ont permis d’identifier deux protéines se liant à l’ARNIII, l’endoribonucléase III (RNase III) et Tex. Alors que la RNase III dégrade les duplexes ARNIII-ARNm, la fonction de Tex n'est pas connue. Tex (Toxin Expression) est l'orthologue de la protéine eucaryote Spt6 impliquée dans la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle. Elle contient deux domaines de liaison à l'ADN (HhH et Hth) et à l'ARN (S1 et YqgF). Afin de déterminer sa fonction chez S. aureus, un variant délété du domaine S1 a été construit (Tex delta S1) et la liaison de Tex et Tex delta S1 aux ARN a été analysée par des techniques in vitro. Nous avons montré que Tex se lie aux motifs simples brins riches en A/U de plusieurs ARN régulateurs et que le domaine S1 constitue en soi, le domaine de liaison aux ARN. Des données préliminaires suggèrent que d’autres domaines seraient aussi impliqués dans ces interactions. La fonction de Tex a ensuite été étudiée par la construction de mutants d'insertion. Les souches sauvages et mutées montrent une croissance identique en milieu riche et minimum, indiquant que Tex n’est pas essentielle pour S. aureus. Les mutants produisent plus de biofilms que les sauvages, indiquant un rôle de Tex dans la virulence. Des expériences d’immunoprécipitation et protéomique ont montré un rôle de Tex dans la régulation transcriptionelle et/ou post‐transcriptionnelle des facteurs de virulence précoces, lors de la phase de transition de la colonisation à la dissémination dans l’hôte
S. aureus RNAIII is considered as a master regulator of virulence gene expression. The RNA regulates gene expression at the post-transcriptional level allowing repression of surface proteins and activation of exotoxins. In vitro pulled-down experiments led to the identification of two proteins interacting with RNAIII, the endoribonuclease III (RNase III), known to degrade RNAIII‐mRNA duplexes and Tex. Tex (Toxin Expression) is an ortholog of the eukaryotic protein Spt6, known to be involved in transcriptional and post‐transcriptional regulation. It is composed of two DNA binding domains (HtH and HhH) and two RNA binding domains (S1 and YqgF). To decipher the RNA binding capacity of Tex, we have constructed a variant of the protein lacking the putative RNA‐binding domain S1 (TexΔS1), and analyzed the binding properties of both the wild type and the Tex‐ΔS1 protein by different in vitro techniques. Indeed Tex recognizes preferentially unpaired A/U rich sequences of several regulatory RNAs, and that the S1 domain is per se, the RNA‐binding domain. However, other domains of Tex seem to be also involved in RNA binding. To better define the function of Tex in vivo, we inserted an intron into the coding region of tex. Wild type and mutant strains grew at the same rate in rich and minimal media, meaning that Tex is not essential. On the other hand, mutated strains produced more biofilm than the wild type strains, suggesting a role of Tex in virulence. Finally, a combination of immunoprecipitation and proteomics experiments highlighted a possible role of Tex in the regulation of virulence factors expression at the transcriptional and/or posttranscriptional level during the transition from colonisation to invasion of the host

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Floriot, Océane. "Virus de l’Hépatite B et transcription cellulaire : impact de la protéine HBx et de ses interactions avec les ARNs non-codants". Thesis, Lyon, 2018. http://www.theses.fr/2018LYSE1319/document.

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Le virus de l'hépatite B (VHB) reste un problème de santé majeur dans le monde malgré la disponibilité du vaccin. Le VHB n’est pas éradiqué par les thérapies actuelles et 240 millions de personnes infectées chroniquement restent à risque de développer une cirrhose du foie et un carcinome hépatocellulaire (CHC).Le VHB est un petit virus hépatotrope doté d'un génome à ADN double brin partiel (ADNrc). Après infection l'ADNrc est converti en ADN épisomal (ADNccc) qui est ensuite organisé en minichromosome viral, qui est le modèle pour la transcription et qui initie la réplication. La protéine de l'hépatite B x (HBx) est recrutée sur l'ADNccc pour initier et maintenir la transcription de l'ADN ccc. HBx cible aussi directement des gènes cellulaires impliqué dans le développement du CHC.Nous avons utilisé une approche ChIP-Seq pour identifier toutes les cibles génomiques de HBx dans les cellules qui répliquent le VHB. Les cibles HBx sont à la fois des gènes codant les protéines et des ARNnc (75 miARN et 34 lncRNA). Nous avons montré que HBx réprimait un sous-ensemble de miARNs qui réguleraient négativement la réplication virale (ex : miR-24) et des miARNs impliqués dans le développement du CHC (ex : miR-21). Parmi les lncARNs ciblés pour HBx, nous avons étudié DLEU2, qui est fortement surexprimé dans l’infection par le VHB et le CHC. Nous avons en outre montré que DLEU2 lie à la fois HBx et l’histone méthyltransférase Ezh2, la sous-unité catalytique du complexe répressif PRC2. L'interaction avec DLEU2 et HBx relie les fonctions Ezh2/PRC2 conduisant à l'activation constitutive d'un sous-ensemble de gènes cibles d'Ezh2 qui sont normalement conservés dans un état réprimé. Nous avons également montré que l’interaction de HBx avec DLEU2 se produisait sur le minichromosome de l’ADNccc où elle stimulait la transcription/réplication du virus. Enfin, nous avons caractérisé par ATAC-Seq les changements d'accessibilité de la chromatine imposés par HBV dans les hépatocytes humains primaires
Hepatitis B virus (HBV) remains a major health problem worldwide despite the availability of the vaccine. No cure is available for the 240 million peoples chronically infected with HBV that are at risk to develop liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). Viral suppression, achieved by long term treatment with nucleotides analogues (NUCs), impacts on liver fibrosis and prevents liver decompensation but HCC risk is not reduced in the first 5 years of treatment. HBV is a small hepatotropic virus with a partially double strand DNA (rcDNA) genome. After hepatocyte infection the rcDNA is converted into the cccDNA episome that is then organized into a viral minichromosome that is the template for all viral transcripts and initiates replication. The hepatitis B x protein (HBx) is recruited on the cccDNA and is required to launch and maintain cccDNA transcription. HBx has also been shown to directly target cellular genes and this has been related to HCC development.We used a ChIP-Seq approach to determine the full repertoire of HBx genomic targets in HBV replicating cells. HBx targets include both protein coding genes and ncRNA (75 miRNAs and 34 lncRNAs). We showed that HBx represses a subset of miRNAs that would negatively regulate viral replication (i.e. miR-24) and miRNAs involved in HCC development (i.e. miR-21). Among the HBx targeted lncRNAs we focused DLEU2, which is strongly upregulated in HBV infection and HCC. We further showed that DLEU2 binds both HBx the Ezh2 histone methyltransferase, the catalytic subunit of the repressive PRC2 complex. The interaction with DLEU2 and HBx re-wires Ezh2/PRC2 functions leading to the constitutive activation of a subset of Ezh2 target genes that are normally kept in a repressed state. We also showed that HBx interaction with DLEU2 occurs on the cccDNA minichromosome where it boosts HBV transcription/replication. Finally, we characterized by ATAC-Seq HBV imposed changes of chromatin accessibility in primary human hepatocytes

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Uchikawa, Emiko. "A structural approach of RNA-protein recognition and kinetics of binding in two examples : tRNA aminoacylation by arginyl-tRNA synthetase and 7SK stabilization by LaRP7". Strasbourg, 2011. http://www.theses.fr/2011STRA6052.

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Dans la cellule, les interactions ARN-protéines jouent un rôle fondamental dans divers processus impliqués dans la régulation de l'expression du message génétique. Si l'épissage de l'ARN pré-messager, la polyadénylation, le transport et l'adressage, la stabilité et la traduction sont des régulations de type post-transcriptionnel, les interactions ARN-protéines ont également un rôle-clé dans le domaine de la transcription. Effectivement, en addition aux capacités de codage, qui font de l'ADN et de l'ARN des supports de l'information génétique, la grande variabilité de structures et la flexibilité de l'ARN créent de nombreux sites uniques et le potentiel pour des régulations complexes. Les protéines se liant à l'ARN utilisent une bibliothèque de motifs structuraux pour reconnaître la séquence et la structure de leurs ARN cibles, ce qui conduit à un large éventail d'interactions, de labiles à stables. Ce manuscrit décrit nos travaux consistant à révéler les détails d'interactions RNA-protéines au niveau moléculaires, dans différents exemples concernant deux champs de la biologie cellulaire, la traduction et la transcription du code génétique. Nos cibles ont été choisies afin d'apporter des informations sur des interactions critiques pour la survie cellulaire et représentent différents modes de liaison de protéines à des ARN. Nous avions pour but d'utiliser la cristallographie aux rayons X, qui est une méthode fiable et reconnue pour la finesse des informations à l'échelle atomique que l'on peut en obtenir, et nous avons développé pour chaque cible un protocole de purification conduisant à une préparation homogène et cristallisable. Nous décrivons également les divers tests biophysiques et biochimiques ayant été utilisés pour caractériser nos échantillons
In the cell, RNA-protein interactions are fundamental to many processes involved in the regulation of gene expression, including pre-mRNA splicing, polyadenylation, editing, transport, cytoplasmic targeting, mRNA turnove and translation. In addition to these post-transcriptional processes, RNA-prote in interactions may also play a key rôle in transcription. Indeed, in addition to its coding capacity, which makes both DNA and RNA recipients of the genetic message, the high variability and conformationnal flexibility of RNA structure creates a number of unique binding sites and the potential for complex regulation by RNA binding proteins. These use a large Iibrary of structural modules in order to recognize RNAs in a combination of sequence- or structure-dependent ways, leading to a wide range of transient to more stable interactions. This manuscript describes our endeavour to reveal the details of RNAprotein interactions at the molecular level in several examples taken in two different fields of cell biology, transcription and translation. Our targets were chosen to better understand the molecular foundation of interactions critical for the cell survival, and represent different binding modes ofproteins to RNA. Aiming to use X-ray crystallography, a well-accepted and reliable mean to analyze recognition details at atomic resolution, we developed for each target a purification protocolleading to homogeneous preparations that were used for crystallization and subjected to various anai}'ses, including functional assays and biophysical characterization

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Nguyen, Chi Mai. "Post-transcriptional regulation during spermatogenesis : Role of the RNA-binding protein hu". Toulouse 3, 2008. http://thesesups.ups-tlse.fr/365/.

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La spermatogenèse est un processus élaboré permettant d'une part le maintien de cellules souches par divisions mitotiques et d'autre part la production de spermatozoïdes par différenciation. Au cours des dernières étapes de la différenciation, la chromatine se compacte, ne laissant plus à la cellule la possibilité de transcrire ses gènes. Du fait de l'arrêt brutal de la transcription, bien avant la fin du processus de différenciation, la cellule germinale utilise le stock d'ARN messagers (ARNm) préexistants pour finaliser sa différenciation. Ce phénomène repose sur la régulation fine du stockage et de la traduction des ARNm au cours du temps, deux régulations post-transcriptionnelles encore très peu documentées dans les cellules germinales. Au cours de ma thèse je me suis intéressée au rôle potentiel de deux protéines de liaison à l'ARN exprimées dans le testicule de souris: HuR/ELAVL1 et AUF1/hnRNP D. Dans les cellules somatiques, ces protéines lient les séquences riches en adénines et uridines (AU-rich element ou ARE) localisées dans la région 3' non codante de certains ARNm (ARN à ARE). HuR protége de la dégradation ses ARN à ARE cibles et favorise leur traduction, alors qu'AUF1 induit leur dégradation. Afin d'étudier la contribution d'HuR et d'AUF1 aux mécanismes post-transcriptionnels indispensables au bon déroulement de la spermatogénèse, nous avons dans un premier temps examiné leur patron d'expression. Nous avons montré que l'expression d'HuR est étroitement régulée au cours de la spermatogénèse, alors que celle d'AUF1 est ubiquitaire. Dans un second temps, nous avons utilisé des lignées de souris transgéniques surexprimant HuR (HuRtg) ou AUF1 (AUF1tg) établies au laboratoire et montré que la surexpression d'HuR et non celle d'AUF1 altère la spermatogenèse, entraînant leur stérilité dans 25% des cas (Sertoli Cells Only syndrome). Par la suite, nous avons mis évidence que de nombreux ARN à ARE, naturellement abondamment exprimés dans le testicule, sont dérégulés dans les cellules germinales HuRtg et AUF1tg. Une étude approfondie des ARN cibles d'HuR et d'AUF1, a révélé que ces deux protéines ont une activité différente car elles s'associent à des ARN différents dans les cellules germinales. .
Spermatogenesis, the elaborate process by which sperm are produced, is marked by dramatic proliferation and differentiation. During the late steps of spermatogenesis, transcription suddenly ceases prior the end of differentiation, because of drastic epigenetic modifications that result in chromatin compaction. Thus, haploid germ cells make use of extensive temporal mRNA storage and translation regulation to ensure stage-specific protein synthesis. Factors and cellular compartments involved in these post-transcriptional controls are still poorly understood. During my PhD, I hypothesized that the two RNA binding proteins HuR/ELAVL1 and AUF1/hnRNP D, might play a role in these controls. They bind AU-rich element-containing mRNAs (ARE-mRNAs) in somatic cells and regulate their stability and translation: HuR protects ARE-mRNAs from degradation and favours their translation, whereas AUF1 usually induces their degradation. First, to investigate the contribution of HuR and AUF1 to the post-transcriptional mechanisms occurring in germ cells, I used transgenic mice derived in our laboratory overexpressing HuR (HuRtg) and AUF1 (AUF1tg) in their testes. Strikingly, whereas spermatogenesis proceeded normally in AUF1tg mice, HuR overexpression impaired spermatogenesis, revealing the importance of a regulated expression of HuR to fulfill male germ cell differentiation. The comparative analysis of AU-transcriptome of pre-pubertal wild type testes with that of HuRtg and AUF1tg testes, combined with computational analyses and RNA/Protein immunoprecipitation experiments, revealed that these two proteins regulate different targets mRNAs and thus exhibit different activities. .

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Frenal, Karine. "Caractérisation structurale et fonctionnelle de TgDRE : une enzyme de réparation de l' ADN du parasite Toxoplasma gondii". Paris 6, 2006. http://www.theses.fr/2006PA066031.

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Sgro, Jean-Yves. "Etude structurale du RNA et de la protéine du virus de la mosai͏̈que du brome et de leur interaction par pontage covalent". Grenoble 1, 1986. http://www.theses.fr/1986GRE10047.

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Subissi, Lorenzo. "Biochemical insights into SARS-CoV replication". Thesis, Aix-Marseille, 2014. http://www.theses.fr/2014AIXM5002.

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Mon travail de thèse s'est focalisé sur la machinerie enzymatique impliquée dans la réplication du génome ARN du Syndrome Respiratoire Aigu Sévère-Coronavirus (SRAS-CoV). J'ai montré in vitro que l'activité ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp) portée par nsp12 nécessite le complexe nsp7/nsp8, qui agit comme facteur de processivité. Grâce à ce complexe polymérase hautement actif, j'ai pu en suite étudier le mécanisme de "proofreading" (correction d'épreuve) associé aux coronavirus, pour lequel seulement des preuves indirectes avaient été assemblées. En effet, les coronavirus codent pour une activité exonucléase 3'-5' (nsp14-ExoN) qui lorsqu'elle est absente, entraine 14-fois plus d'erreurs de réplication en contexte cellulaire. In vitro, nous avons pu montrer que nsp14-ExoN est capable d'exciser l'ARN double brin ainsi qu'un nucléotide mésapparié en 3' de l'ARN en cours d'élongation. J'ai pu apporter pour la première fois une preuve directe de l'existence d'un système de réparation des erreurs au cours de la synthèse, mené par le complexe nsp7/nsp8/nsp12/nsp14. En effet, le complexe nsp7/nsp8/nsp12 ralentit jusqu'à 30-fois quand il rajoute une base mésappariée. Par sequençage, nous avons pu montrer la réparation de cette base mésappariée en presence de nsp14. Enfin, grâce à ce système in vitro nous avons une base pour comprendre l'inefficacité de la ribavirine sur des patients atteints du SRAS. En effet, la ribavirine, incorporée par le complexe polymérase, serait également excisée par nsp14, annihilant tout potentiel effet mutagenique. En conclusion, ce système va permettre de guider le développement d'antiviraux de type nucleoside analogues contre les coronavirus
This work focused on the enzymatic machinery involved in Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus (SARS-CoV) RNA replication and transcription. Firstly, I established a robust in vitro polymerase assay with the canonical SARS-CoV RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) nsp12. I showed that nsp12, in order to engage processive RNA synthesis, needs two viral proteins, i.e. nsp7 and nsp8. This nsp7/nsp8 complex not only activates nsp12-RdRp, but also acts as a processivity factor. Thus, using this processive polymerase complex, I could investigate SARS-CoV proofreading for which only indirect evidences were reported. Indeed, coronaviruses encode for a 3'-5' exonuclease (nsp14-ExoN), putatively involved in a mechanism that proofreads coronavirus RNA during viral replication. We first showed in vitro that nsp14-ExoN, which is stimulated by nsp10, is able to excise specifically dsRNA as well as all primer/templates bearing a 3' mismatch on the primer. Moreover, we could confirm by sequencing that a RNA 3' mismatch was indeed corrected in vitro by the nsp7/nsp8/nsp12/nsp14 complex. We provide for the first time direct evidence that nsp14-ExoN, in coordination with the polymerase complex, is able to proofread RNA. Interestingly, using this in vitro system we found an element that could possibly explain the inefficacy of ribavirin therapeutic treatment on SARS-patients: ribavirin, which is incorporated by the SARS-CoV polymerase complex, would also be excised by nsp14. In conclusion, this system will drive future development of antivirals, particularly of the nucleoside analogue type, against coronaviruses

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Richard, Charles-Adrien. "La protéine M2-1 du virus respiratoire syncytial : structure et interactions avec des partenaires viraux et cellulaires". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLV029.

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Le Virus Respiratoire Syncytial (VRS) est le principal agent responsable d’infections respiratoires sévères chez les nourrissons et les veaux. Le génome du VRS est constitué d’un ARN simple brin de polarité négative qui est répliqué et transcrit par le complexe ARN-polymérase viral (RdRp). Ce complexe est composé de la nucléoprotéine N, de la polymérase L, de la phosphoprotéine P et du facteur anti-terminateur de transcription M2-1. Le but de ce travail était de mieux caractériser la structure et le fonctionnement de deux protéines du complexe RdRp: P et M2-1.M2-1 est un tétramère constitué de 4 domaines : un « doigt de zinc », un domaine d’oligomérisation hélicoïdal, une région flexible, un domaine globulaire interagissant avec l'ARN et P, et une région C-terminale désordonnée. À partir de la structure cristalline de M2-1 pleine longueur, j'ai identifié des résidus critiques sur le doigt de zinc et la région flexible pour l'activité d'anti-terminaison de transcription de M2-1.Par la suite j'ai identifié une région de P critique pour l’interaction P - M2-1 et montre qu’elle est nécessaire au recrutement de M2-1 dans des corps d’inclusion cytoplasmiques. Je montre également que la déphosphorylation de M2-1, nécessaire à la transcription virale, est modulée par un complexe formé entre P et la phosphatase cellulaire PP1.Enfin, la cyclopamine, composé chimique naturel, inhibe la réplication du VRS. Je démontre qu'une seule mutation R151K sur M2-1 est suffisante pour conférer une résistance virale à la cyclopamine. Ces données ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement de futures thérapies contre le VRS
Respiratory syncytial virus (RSV) is the leading cause of lower respiratory tract illness in infants and calves. The RSV genome consists of a single strand, negative-sense RNA, which is replicated and transcribed by the viral RNA-dependent RNA polymerase complex (RdRp). This complex is composed of the nucleoprotein N, the large protein L, the phosphoprotein P and the transcription anti-terminator M2-1. The aim of this work was to better characterize the structure and function of P and M2-1.M2-1 is a tetramer with 4 domains: a zinc-finger, a helical oligomerization domain, a flexible region, a RNA and P binding core domain and a C-terminal disordered region. Based on the crystal structure of the full-length M2-1 protein, I identified residues in the zinc-finger and the flexible loop critical for M2-1 antitermination activity.Then I identified a region of P critical for P – M2-1 interaction and show that it is required for the recruitment of M2-1 to cytoplasmic inclusion bodies. I also show that M2-1 dephosphorylation, which is critical for viral transcription, is modulated by a complex formed by P and the cellular phosphatase protein-1 (PP1).Finally cyclopamine, a natural chemical compound, inhibits the RSV replication. I show that a single R151K mutation in M2-1 is sufficient to confer virus resistance to cyclopamine. These data open a new avenue for the development of future therapies against RSV infection

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Meznad, Koceila. "Interaction entre l’oncoprotéine E6 d’HPV16 et le métabolisme des ARN messagers". Thesis, Bourgogne Franche-Comté, 2018. http://www.theses.fr/2018UBFCE012.

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Les papillomavirus humains (HPV) sont des virus à ADN double brin qui infectent la peau et les muqueuses. Les infections par les HPV, bien que majoritairement asymptomatique, provoquent des défauts de prolifération cellulaire pouvant parfois générer des cancers. Selon leur pouvoir carcinogène, on distingue les HPV à bas risque oncogène (HPV-BR) provoquant des lésions bénignes, et les HPV à haut risque (HPV-HR) responsables de l’apparition de nombreux cancers ano-génitaux et de certains cancers des voies aéro-digestives supérieures. Parmi les HPV-HR, HPV16 est le plus prévalent. La carcinogenèse induite par les HPV-HR est corrélée à l’expression des protéines virales E6 et E7, qui dérégulent de nombreux processus cellulaires. L’expression des gènes viraux, réalisée par la machinerie de la cellule hôte, est finement régulée particulièrement au niveau posttranscriptionnel. En outre, l’épissage alternatif génère une vingtaine de transcrits viraux, permettant l’expression des protéines virales. L’épissage au sein de la région codante E6 permettant de former l’isoforme E6*I est présent uniquement chez les HPV-HR, mais pas chez les HPV-BR, ce qui suggère son implication dans la carcinogenèse induite par les HPV-HR. Toutefois, le rôle biologique de la protéine E6*I produite par les HPV-HR est encore controversé.Afin de mieux appréhender les mécanismes de la carcinogenèse induite par les HPV-HR, nous nous sommes intéressés à : (i) l’étude des fonctions biologiques de l’isoforme E6*I, et (ii) aux mécanismes impliqués dans la régulation de l’expression de E6 et E7.Pour appréhender le rôle biologique d’E6*I d’HPV16, nous avons utilisé le séquençage de l’ARN afin d’identifier des cibles dérégulées par son expression ectopique. L’expression des isoformes E6 et E6*I d’HPV16 dans des cellules HPV négatives dérégule des transcrits impliqués dans des processus biologiques relatifs à l’expression des gènes viraux, la carcinogenèse virale, la transduction du signal et la traduction. L’expression d’E6*I seule, dérégule des transcrits impliqués dans l’organisation de la matrice extracellulaire, des voies de signalisation et d’adhérence cellulaire. De façon intéressante, il a été montré que ces gènes dérégulés par l’expression d’E6*I sont communément affecté par le niveau intracellulaire de ROS (espèces réactives de l’oxygène). Cela corrobore le rôle d’E6*I dans l’augmentation de la production de ROS. Le stress oxydatif associé aux ROS pourrait favoriser l’intégration du génome viral à celui de la cellule hôte, caractéristique de carcinogenèse associée aux HPV-HR. En somme, E6*I pourrait avoir un rôle oncogénique indépendant de celui d’E6, et interviendrait dans la carcinogenèse associée aux HPV-HR.Nous avons aussi étudié le rôle du complexe de jonction des exons (EJC), dans la régulation posttranscriptionnelle de l’expression d’E6 et E7. L’EJC est un complexe multiprotéique déposé sur les ARNm via l’épissage influençant ainsi leur devenir. Nous avons montré qu’un facteur de l’EJC, eukaryotic initiation factor 4A3 (eIF4A3), se liait aux ARNm viraux. Par ailleurs, nous avons observé que les composants de l’EJC affectent, certes de différentes façons, l’expression d’E6 et E7. Enfin, nous avons aussi étudié l’effet du nonsense-mediated mRNA decay (NMD), un mécanisme lié à l’EJC, sur l’expression d’E6 et E7. Non seulement nos résultats suggèrent que le NMD inhibe l’expression d’E6 et E7, mais nous avons aussi observé que la protéine E6 d’HPV16 réduit l’activité du NMD. Cette inhibition permettrait à HPV16 d’avoir un contrôle sur ses transcrits mais d’affecter aussi des cibles cellulaires du NMD. Etant donné l’implication des gènes régulés par le NMD dans le maintien de l’homéostasie et l’adaptation cellulaires, il serait intéressant d’appréhender le rôle de cette nouvelle activité d’E6 dans la carcinogenèse associée aux HPV-HR
Human papillomaviruses (HPV) are double strand DNA viruses that infect skin and mucosa. HPV infections, although mostly asymptomatic, cause cell proliferation defects that can sometimes give rise to cancer. According to their carcinogenic potential, we distinguish low-risk HPVs (lr-HPV) causing benign lesions, and high-risk HPV (hr-HPV) responsible for the appearance of numerous anogenital and some head and neck squamous-cell cancers. Among the hr-HPV, HPV16 is the most prevalent. Hr-HPV-induced carcinogenesis is correlated with the expression of the viral oncoproteins, E6 and E7, which deregulate many cellular processes. Viral gene expression, performed by the host cell machine, is finely regulated particularly at the post-transcriptional level. Besides, alternative splicing generates about twenty viral transcripts, leading to the expression of viral proteins. The splicing within the E6 open reading frame that generates an E6*I mRNA only in hr-HPV, but not in the lr-HPV, suggests its involvement in hr-HPV-induced carcinogenesis. However, the biological role of E6*I protein produced by HPV-HR is still controversial.In order to better understand the mechanisms of hr-HPV-induced carcinogenesis, we have interested in: (i) the study of the biological functions of the E6*I isoform, and (ii) the mechanisms involved in the regulation of E6 and E7 expression.To get insight the biological role of HPV16 E6*I, we used RNA sequencing to identify targets deregulated by its ectopic expression. Expression of HPV16 E6 and E6*I isoforms in negative HPV cells deregulate several transcripts involved in biological processes related to viral gene expression, viral carcinogenesis, signal transduction and translation. The expression of E6*I alone, deregulates transcripts involved in the organization of the extracellular matrix, signaling pathways and cell adhesion. Interestingly, it was shown that the genes deregulated by E6*I expression are commonly affected by the intracellular level of ROS (reactive oxygen species). These results support the role of E6*I in increasing ROS production. The ROS-associated oxidative stress could favor viral genome integration with that of the host cell, a characteristic of hr-induced carcinogenesis. In sum, E6*I may have an oncogenic role independent of E6, and intervene in the carcinogenesis associated with hr-HPV.We also studied the role of the exon junction complex (EJC) in the posttranscriptional regulation of E6 and E7 expression. EJC is a multiprotein complex deposited on mRNAs via splicing, thus influencing their fate. We have shown that a factor of EJC, eukaryotic initiation factor 4A3 (eIF4A3), binds to viral mRNAs. Moreover, we have observed that the components of the EJC affected, in different ways, the expression of E6 and E7. Finally, we also studied the effect of nonsense-mediated mRNA decay (NMD), a mechanism linked to the EJC, on the expression of E6 and E7. Our results suggest that not only NMD inhibits the expression of E6 and E7, but we have also observed that HPV16 E6 protein reduces NMD activity. This inhibition would allow HPV16 to have control over its transcripts but also to affect NMD cellular targets. Given the involvement of NMD-regulated genes in the maintenance of cellular homeostasis and adaptation, it would be interesting to understand the role of this new E6 activity in carcinogenesis associated with HPV-HR

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Sourimant, Julien. "Caractérisation structurale et fonctionnelle de la polymérase du virus respiratoire syncytial". Thesis, Versailles-St Quentin en Yvelines, 2015. http://www.theses.fr/2015VERS019V.

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Le virus respiratoire syncytial (VRS) est le principal agent responsable desbronchopneumonies du jeune veau et des bronchiolites du nourrisson. Il n’existe pas devaccin ni d’antiviraux spécifiques pour l’homme. La réplication du génome et la transcriptiondes gènes viraux sont assurées par un ensemble de protéines virales constituant le complexeARN polymérase ARN-dépendant : la nucléoprotéine N, la phosphoprotéine P, le facteur detranscription M2-1 et la grosse sous-unité L. L’objectif principal de ma thèse était d’obtenirde nouvelles données structurales et fonctionnelles sur le complexe ARN-polymérase ARNdépendante(RdRp) du VRS, en particulier sur le couple P-L. Pour ceci j’ai tout d’aborddéveloppé un protocole de production et purification de la protéine L sous formerecombinante en cellules d’insecte. Ceci m’a permis ensuite de cartographier le sited’interaction de P avec L. J’ai ainsi mis en évidence que la protéine L interagit avec la partieC-terminale de la protéine P, au-niveau des résidus 216 à 239. Les données obtenuessuggèrent que ce domaine peut former un nouvel élément de reconnaissance moléculaire(« MoRE ») se structurant en hélice alpha lors de l’interaction avec la protéine L. De plus, lacartographie de ce domaine d’interaction m’a permis d’identifier entre les résidus 164 et 205de P une nouvelle région impliquée dans le recrutement de la protéine L aux corpsd’inclusions viraux. Ces nouvelles données ouvrent la voie à de nouvelles études structuralesde l’ARN-polymérase du VRS et nous permettent d’envisager de nouvelles stratégiesantivirales ciblant ce complexe
Respiratory syncytial virus (RSV) is the leading cause of calves bronchopneumonia andinfants bronchiolitis. Neither vaccine nor antiviral treatments are currently available for use inhumans. Viral genome is replicated and transcribed by a set of viral proteins constituting theviral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) complex: the nucleoprotein (N), thephosphoprotein (P), the transcription factor (M2-1) and the large subunit (L). This workaimed to unveil new structural and functional data regarding the viral RdRp, especially the PLcouple. With this aim in view, I have first conceived a protocol to produce and purifyrecombinant L and P proteins expressed in insect cells. This tool enabled the fine mappingand characterization of the L binding domain of the RSV phosphoprotein. This highlightedthe interaction between the L protein and the C-terminal region of the P protein, especiallyresidues 216 to 239. Further data suggests that this area constitutes an alpha helix formingmolecular recognition element (« MoRE ») during P-L interaction. Furthermore, this studyunveiled a new region of the P protein encompassing residues 164 to 205, involved in therecruitment of L protein to viral inclusion bodies. These new results open the way toupcoming structural studies of RSV RdRp and allow us to define a new target for thedevelopment of antiviral drugs against RSV

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Bruzzone, Lucía. "A crosstalk between the RNA binding protein Smaug and the Hedgehog pathway links cell signaling to mRNA regulation in drosophila". Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2018. https://theses.md.univ-paris-diderot.fr/BRUZZONE_Lucia_1_va_20180319.pdf.

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La régulation post-transcriptionnelle de l'expression génique joue un rôle essentiel dans divers processus cellulaires pendant le développement. Les protéines de liaison à l'ARN (RBP) sont des médiateurs fondamentaux des régulations post-transcriptionnelles qui contrôlent l'expression de l'ARNm en reconnaissant des séquences spécifiques dans les transcrits cibles. Smaug est une protéine de liaison à l'ARN conservée de la levure jusqu’à l’homme qui est essentielle pendant l'embryogenèse précoce de la drosophile. Smaug reconnaît et lie des éléments de reconnaissance de Smaug (SRE) dans ses ARNm cibles et recrute des facteurs supplémentaires, via des interactions protéine-protéine, qui régulent l'ARNm lié. Un concept qui émerge est celui des voies de signalisation pouvant moduler l'activité des RBP par des modifications post-traductionnelles, en ajoutant ainsi une couche supplémentaire dans le contrôle de l'expression des gènes.Au cours de mon travail de thèse, j'ai cherché à mettre en évidence que la voie de signalisation Hedgehog régule Smaug en favorisant sa phosphorylation. Mon travail montre que la signalisation HH diminue les niveaux de protéines Smaug affectant sa capacité à réprimer la traduction de l'ARNm. Cet effet négatif semble dépendre de l'interaction entre Smaug et le transducteur de signal HH, Smoothened. De plus, Smaug est constitutivement phosphorylée dans son domaine de liaison à l'ARN, ce qui semble être nécessaire pour la formation des foci cytoplasmiques de Smaug
Post-transcriptional regulation of gene expression plays a critical role in a variety of cellular processes during development. RNA binding proteins are fundamental mediators of post-transcriptional regulations that control mRNA expression by recognizing specific cis acting elements within the target transcripts. Smaug is a highly conserved sequence specific RNA-binding protein that is essential during Drosophila early embryogenesis. Smaug binds Smaug Recognition Elements (SRE) in the target mRNA and recruits additional factors, via protein-protein interactions, that regulate the bound mRNA. An emergent concept that signaling pathways can modulate RBP activity by post-translation modifications adds a new layer in the control of gene expression. During my thesis work, I sought to understand how the Hedgehog pathway regulates Smaug by promoting its phosphorylation. My work shows that HH signaling downregulates Smaug protein levels affecting its ability to repress mRNA translation. This negative effect seems to be dependent on the interaction between Smaug and the HH signal transducer Smoothened. Moreover, Smaug is constitutively phosphorylated in its RNA binding domain, which appears to be necessary for cytoplasmic Smaug foci formation

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Seissler, Tanja. "Inhibition traductionnelle du facteur de restriction APOBEC3G par la protéine Vif du VIH-1 : rôle d'une uORF dans la 5'-UTR de l'ARNm d'A3G et identification de facteurs cellulaires". Thesis, Strasbourg, 2019. http://www.theses.fr/2019STRAJ028.

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La protéine Vif du VIH-1 contrecarre le facteur de restriction APOBEC3G (A3G) en diminuant son niveau d'expression dans les cellules infectées. Ceci est mis en œuvre entre autres par l'inhibition de sa traduction, un mécanisme encore peu compris. La première partie de ma thèse contribue à la caractérisation d'une petite ORF (uORF) qui se situe dans la 5'-UTR de l'ARNm d'A3G et d'A3F en amont de leurs ORF respectives. Cette uORF s'est révélée cruciale pour la régulation de la traduction d'A3G en présence et absence de Vif. Dans la deuxième partie de cette thèse, différents protocoles ont été mis en œuvre pour identifier les protéines associées avec l'ARNm d'A3G, qui pourraient jouer un rôle dans le mécanisme d'inhibition traductionnelle d'A3G par Vif. Ainsi, plusieurs protéines ont été identifiées dont la présence sur l'ARNm d'A3G semble modulée par Vif
The HIV-1 Vif protein counteracts the restriction factor APOBEC3G (A3G) by downregulating its expression level in infected cells. This is achieved in different ways, one of which is translational inhibition, a mechanism that is still poorly understood. The first part of my thesis contributes to the characterization of a small upstream ORF (uORF), that is found in the 5'-UTR of A3G and A3F mRNAs. This uORF has been found to be crucial for regulation of A3G translation and is necessary to allow Vif-mediated translational inhibition. In the second part of this thesis, different protocols have been set up in order to identify A3G mRNA-associated cellular proteins which might play a role in the mechanism of Vif-mediated translational inhibition. Several proteins, whose presence on A3G mRNA seems to be modulated by Vif have been identified

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Delbianco, Alice. "Molecular mechanisms involved in the pathogenesis of beet soil-borne viruses". Phd thesis, Université de Strasbourg, 2013. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01017177.

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The genus Benyvirus includes the most important and widespread sugar beet viruses transmitted through the soil by the plasmodiophorid Polymyxa betae. In particular Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV), the leading infectious agent that affects sugar beet, causes an abnormal rootlet proliferation known as rhizomania. Beet soil-borne mosaic virus (BSBMV) is widely distributed in the United States and, up to date has not been reported in others countries. My PhD project aims to investigate molecular interactions between BNYVV and BSBMV and the mechanisms involved in the pathogenesis of these viruses.BNYVV full-length infectious cDNA clones were available as well as full-length cDNA clones of BSBMV RNA-1, -2, -3 and -4. Handling of these cDNA clones in order to produce in vitro infectious transcripts need sensitive and expensive steps, so Ideveloped agroclones of BNYVV and BSBMV RNAs, as well as viral replicons allowing the expression of different proteins.Chenopodium quinoa and Nicotiana benthamiana plants have been infected with in vitro transcripts and agroclones to investigate the interaction between BNYVV and BSBMV RNA-1 and -2 and the behavior of artificial viral chimeras. Simultaneously I characterized BSBMV p14 and demonstrated that it is a suppressor of posttranscriptional gene silencing sharing common features with BNYVV p14.

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Guerrero, Santiago. "Role of HIV-1 Vif in viral replication : translational regulation of APOBEC3G and RNA chaperone activity". Thesis, Strasbourg, 2013. http://www.theses.fr/2013STRAJ060/document.

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Vif (Viral Infectivity Factor) est une protéine auxiliaire qui augmente le «fitness» viral dans l’hôte infecté. Vif est essentielle à la formation de particules virales infectieuses dans les cellules dites «non-permissives», alors que des virus ΔVif se répliquent efficacement dans des lignées cellulaires T dites « permissives ». Les cellules non-permissives expriment les facteurs de restriction APOBEC3G (APOlipoprotein B mRNA-Editing enzyme Catalytic polypeptide 3G ou A3G) et A3F, deux cytidine désaminases dont l’action hypermutatrice est létale pour le virus. Vif réduit de façon considérable le taux d’expression des protéines A3G/3F par deux mécanismes principaux : (1) en recrutant une E3 ubiquitine ligase, Vif induit la dégradation d’A3G par le protéasome et (2) en se fixant sur l’ARNm, Vif régulant négativement la traduction d’A3G par un mécanisme dépendent de la région 5'-UTR. L'objectif de mon projet a été de déterminer le rôle et le mécanisme de la régulation traductionnelle du facteur de restriction A3G par la protéine Vif du VIH-1 ex vivo. En parallèle, nous nous sommes intéressés à déterminer les domaines de la protéine Vif impliqués dans l’activité chaperonne d'ARN. Par l’analyse des « westerns blots » issus de co-transfections de différents vecteurs d’expression d’A3G en présence ou absence de Vif et d’un dominant négative de la Cullin 5, nous avons démontré ex vivo que Vif requiert les tiges boucles 2 et 3 de la région 5’UTR (de façon simultanée) pour inhiber la traduction d’A3G. La régulation traductionnelle d’A3G par Vif cause 50% de la réduction total d’A3G en présence de Vif. Ensuite, nous avons observé qu’une une petite uORF (Upstream Open Reading Frame), contenue entre ces deux tiges-boucles est nécessaire pour l’inhibition d’A3G par Vif. Les uORFs, présents dans 50 % des gènes eucaryotes, interviennent principalement dans des mécanismes de régulation traductionnelle. Ainsi, nous avons observé in vitro et ex vivo que l’uORF régule négativement la traduction de l’ORF majeure d’A3G. Par l’analyse de l’expression de différents mutants de l’uORF, nous avons démontré ex vivo que 60% des complexes d’initiation de la traduction synthétisent A3G par « leaky scanning » et 40 % sont recrutés dans la traduction de l’uORF, en inhibant ainsi l’expression d’A3G. A partir de ces résultats nous proposons un modèle de l’inhibition d’A3G par Vif. Dans ce modèle, Vif pourrais inhiber l’étape de terminaison de la traduction de l’uORF en causant un « stalling » des ribosomes en empêchant ainsi à des nouveaux complexes d’initiation d’attendre l’ORF majeur. Nous avons aussi déterminé l’impact de la régulation traductionnelle d’A3G par Vif sur l’incorporation d’A3G dans les particules virales et sur l’infectivité virale. Nous avons alors observé que l’inhibition traductionnel d’A3G par Vif réduit l’incorporation d’A3G dans les particules virales avec un profil de diminution d’A3G similaire à celui observé dans les cellules. En utilisant des cellules indicatrices TZM-bl, nous avons ensuite observé que l’inhibition traductionnelle d’A3G par Vif augmente l’infectivité virale de 50%. Finalement, nous avons déterminé les domaines de la protéine Vif impliqués dans l’activité chaperonnes d'ARN. En utilisant des essaies de dimérisation des fragments d’ARN du VIH-1, nous avons pu mettre en évidence que le domaine C-terminal de la protéine Vif était impliqué dans cette activité. Ces résultats nous ont permis de mieux comprendre ce phénomène de restriction cellulaire et pourraient être importants dans le développement de nouvelles stratégies d’inhibition de la réplication virale qui ciblerait spécifiquement l’interaction de Vif avec l’ARNm d’A3G
The HIV-1 viral infectivity factor (Vif) is a small basic protein essential for viral fitness and pathogenicity. Vif allows productive infection of non-permissive cells (including most natural HIV-1 targets) by counteracting cellular cytosine deaminases APOBEC3G (A3G) and A3F by different mechanisms and thus preventing its incorporation into viral particles. The Vif-induced degradation of A3G through the proteasome pathway has been extensively studied, but little is known about the translational repression of A3G mRNA by Vif. After cellular co-transfection of A3G mRNA constructs mutated in their untranslated regions (UTRs) in presence or absence of Vif, and in conditions where the proteasome-induced degradation of A3G was inhibited, we show that the 5’-UTR of A3G mRNA is crucial for the translational inhibition by Vif. The core binding factor, CBF-, required to stabilize the Vif/A3G complex is dispensable for this specific repression. According to our previous secondary structural model of the 5’-UTR, the two distal stem-loop structures are sufficient for a complete translational inhibition of A3G. We show that residue K26 of Vif is critical for A3G neutralization, both for its proteasome-induced degradation and translation inhibition of itsmRNA. Interestingly, we observe a strict correlation between the cellular reduction of A3G through translation inhibition and the quantity of A3G incorporated into viral particles. Both mechanisms account for about 50% decrease of A3G in cell. Thus, we showed for the first time that A3G mRNA translational inhibition by Vif is a 5’-UTR mRNA-dependent mechanism, and that any of these two mechanisms, degradation or translation, is sufficient to restore viral infectivity. Regulating the translation of A3G could thus be considered as a new target to restore a functional expression of A3G and viral restriction

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Rozprawy doktorskie na temat „Interactions protéine-RNA”

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