Rozprawy doktorskie na temat „Imagerie confocale cellules vivantes”

La distribution des marqueurs moleculaires et des medicaments fluorescents dans le cellules vivantes a ete etudiee par microscopie confocal a balayage (laser scanning confocal fluorescence microscopy - lscfm). En particulier, la distribution intracellulaire de la doxorubicine dans des cellules (k562 et mcf-7) sensibles et resistantes a permis d'etudier le phenomene de la resistance multiple (multidrug resistance, mdr). L'utilisation d'une detection a contage de photon sur le lscfm a permis de reduire la concentration de medicament et aussi la puissance du laser d'excitation afin de garantir la survivance des cellules. La distribution de doxorubicine dans des cellules vivantes est differente de celle dans des cellules fixees. Dans les cellules sensibles la doxorubicine est localisee dans l'appareil de golgi et dans les vesicules acides, tandis que dans les cellules resistantes la cible de la doxorubicine est localisee dans des organelles ponctuels, appeles punctate pattern. Cette distribution ne peut pas correspondre a l'appareil de golgi et non plus aux vesicules acides ou aux lysosomes comme montre dans la these par un etude avec la c6-nbd-ceramide et l'acridine orange. Pour etablir l'origine de la distribution ponctuelle, on a effectuee une etude des mitochondries avec la rhodamine 123, marqueur potentiometrique des mitochondries dans les cellules vivantes. A ete trouve que deux differentes populations de mitochondries caracterisent les cellules sensibles et les resistantes. Une population de mitochondries avec le forme en s habituelle est active dans les cellules sensibles, tandis que seulement une population de mitochondries ponctuels peut etre observee dans la region sous-membranaire des cellules resistantes. Pour mieux comprendre la difference dans les deux populations on a entrepris une etude par lscfm et par microspectrofluorimetrie avec du bromure d'ethidium qui est bien connu pour etre un marqueur des mitochondries dans les cellules vivantes.

Le virus de l'hépatite C (HCV) infecte environ 180 millions de personnes à travers le monde. De nouveaux antiviraux ont récemment été mis sur le marché mais ils présentent des effets indésirables. La recherche de nouvelles cibles thérapeutiques reste donc d'actualité. Mes principaux travaux ont consisté à développer des approches de biochimie et d'imagerie sur cellules vivantes pour étudier les mécanismes moléculaires d'action des antiviraux silibinine (SbN) et arbidol (ARB) sur HCV. Nous avons montré que SbN et ARB inhibent des vésicules entourées de clathrine et ne sont pas délivrés aux endosomes précoces. SbN et ARB inhibent également l'infection d'autres virus entrant par endocytose clathrine-dépendante, ce qui expliquerait leur activité à large spectre. J'ai également contribué à un projet initié depuis quelques mois au sein de l'équipe. L'hypothèse était qu'un élément présent dans le microenvironnement hépatique (MEH) jouerait un rôle essentiel dans l'infection par HCV. Nous nous sommes intéressés au syndécan-1 (SDC1) car il est fortement exprimé à la surface des hépatocytes. Nos travaux montrent que la déplétion de SDC1 diminue fortement l'infection. SDC1 colocalise à la surface des hépatocytes non infectés avec CD81, un récepteur connu de HCV. Dans les jours suivant l'infection, cette colocalisation est perturbée. Ces données suggèrent que SDC1 serait un co-facteur d'entrée de HCV, agissant en combinaison avec CD81, et que l'infection réorganiserait les molécules du MEH, ce qui pourrait à long terme contribuer à la persistance de l'infection
Hepatitis C virus (HCV) is a global health concern infecting 170 million people worldwide. New antivirals recently received the approval for the treatment against HCV infection but they display many side effects. Research for new therapeutic targets therefore remains an important topic. My main work was to develop approaches in biochemistry and live cell imaging to study the molecular mechanisms of action of antivirals silibinin (SbN) and arbidol (ARB) on HCV infection. We show that SbN and ARB alter clathrin-mediated endocytosis. Viral particles are trapped in clathrin-positive structures and cannot be delivered to the early endosomal compartment, thereby preventing infection. SbN and ARB also prevent cell infection by viruses that enter through clathrin-mediated endocytosis, which could explain their broad spectrum activity. I also contribute to a project initiated for a few months in the lab. We hypothsized that a molecule present in the immediate surrouding of the hepatocyte microenvironment could play a role in HCV infection. We focused on the syndecan-1 (SDC1) because it is essentially anchored on the surface of hepatocytes. We show that SDC1 depletion leads to a drastic decrease of the viral infectivity. SDC1 colocalizes on the unfected hepatocyte surface with the already identified HCV recptor CD81. This colocalization vanished within days in infected cells. These data suggest that SDC1 could act as a cellular co-factor for HCV entry, in combination with CD81; thus infection could reorganized molecules of the hepatocyte microenvironment and contribute to HCV hepatotropism and the peristence of infection

La précision de la réplication de l'ADN assure la fidélité de la transmission génétique. Les dommages causés par des facteurs externes ou internes menacent l'intégrité génomique. Les Actinobactéries, dépourvues des protéines majeur de la Réparation des Mésappariements (MMR) canonique, possèdent NucS (EndoMS), une enzyme qui répare ces erreurs indépendamment de l'ATP. Bien que l'activité de NucS dans ce mécanisme soit étudiée, sa fonction in vivo et dans d’autres systèmes de réparation de l'ADN conservent des zones d’ombre.Cette étude vise à caractériser la fonction de NucS dans la réparation des cassures double brin (DSB). Nos résultats montrent que mScarlet1-NucSD144A forme des foyers polaires en réponse aux dommages de l'ADN, particulièrement les DSB. Chez Corynebacterium glutamicum, les cellules CglΔnucS présentent une activation plus élevée de la Recombinaison Homologue (HR) et un nombre accru de DSB par rapport aux CglWT, indiquant un rôle de NucS dans l'efficacité et la sélectivité de la réparation des DSBs. Les bactéries CglΔnucS présentent un avantage de croissance en présence de stress génotoxiques, probablement en raison de mécanismes de réparation des DSB altérés. Nos analyses bioinformatiques prédisent l’interaction de NucS avec des enzymes clés de la RH et d'autres voies de réparation de l'ADN, ainsi que des gènes impliqués dans la réparation des dommages, le métabolisme et la régulation énergétique.NucS pourrait stabiliser les extrémités libres de l'ADN générées par les DSBs rapidement après leur formation, favorisant leur réparation par une voie alternative telle que la Jonction des Extrémités par Microhomologie (MMEJ). Les études futures devraient explorer les modifications post-traductionnelles et les conditions métaboliques régulant l'activité de NucS et son activité in vitro sur les DSB et les intermédiaires de HR
DNA replication accuracy ensures proper genetic transmission. Damage from external factors or internal events threatens genomic integrity. Actinobacteria, lacking canonical MMR proteins, possess NucS (EndoMS), an ATP-independent enzyme involved in a non-canonical mismatch repair pathway. While NucS's activity on mismatches is documented, its in vivo role and implications in DNA Damage Repair systems require further understanding.This study aims to characterise NucS's role in Double-Strand Break Repair (DSBR). Our findings show that mScarlet1-NucSD144A forms polar foci in response to DNA damage, especially DSBs and complex recruitment in apoptosis-like cells.Corynebacterium glutamicum, CglΔnucS bacteria exhibits higher homologous recombination (HR) activation and increased DSBs compared to CglWT, indicating NucS's role in DSBR efficiency and regulation. CglΔnucS bacteria have a growth advantage under genotoxic stress, likely due to altered DSBR mechanisms. Bioinformatic analyses predict NucS interactions with key enzymes of RH and other DNA repair pathways and metabolism and energy regulation.NucS may bind and stabilise free DNA ends generated by DSBs, balancing HR and participating in DSB repair through microhomology-mediated end joining (MMEJ). Future studies should explore post-translational modifications and metabolic conditions regulating NucS reponse and its in vitro activity on DSBs and HR intermediates

"L'étude des cellules vivantes et la dentine humaine par microscopie confocale Raman" La microscopie confocale Raman est utilisée pour suivre des médicaments et des nanoparticules dans les cellules et dans les tissus durs. La microscopie Raman est non-invasive, ne nécessite aucun marqueur et permet une imagerie à haute résolution. Dans la première partie de l'étude cette méthode est utilisée pour suivre un médicament anticancéreux, le paclitaxel, au sein d'une lignée de cellules cancéreuses vivantes Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7). Les images Raman ont été traitées par un algorithme de partitionnement des données par k-moyennes pour détecter le paclitaxel dans les cellules. La distribution du paclitaxel dans les cellules est vérifiée par le calcul du coefficient de corrélation de Pearson entre le spectre de référence du traitement et les spectres de l'image entière. Le temps progressif de diffusion du paclitaxel dans toute la cellule est observé. Cette observation demande une étude complémentaire sur l'action pharmaceutique du produit, basé sur la liaison rapide de la tubuline libre au paclitaxel cristallisé. L'apoptose dans les cellules a été suivies par partitionnement de données et par corrélation. Le partitionnement de données a été utilisé pour déterminer la position de mitochondries dans les cellules ; le cytochrome C de distribution à l'intérieur des cellules est basé sur l'analyse de corrélation. L'apoptose des cellules est défini par le cytochrome C dans le cytoplasme de diffusion. Le cytochrome C agit comme un déclencheur pour l'activation en cascade des caspases, et sa libération par les mitochondries est un signe d'apoptose. La Co-localisation de cytochrome C est effectuée après incubation de cellules avec une concentration différente de paclitaxel. L'autre produit étudié est le dioxyde de titane. Le titane est largement utilisé pour les matériaux orthopédiques et dentaires implantés dans le corps humain. Il est inévitable que le sang prenne contact avec la surface de l'implant et des nanoparticules. Les nanoparticules de dioxyde de titane ont été suivies en intracellulaire dans les cellules MCF-7 et TERT épithéliales humaines (lignée orale cellulaire de kératinocytes OKF6/TERT-2). La détection des nanoparticules et leur toxicité ont été étudiées en utilisant deux méthodes d'analyse. La microscopie confocale Raman a également été utilisée pour réaliser l'analyse structurale et chimique de la jonction émail-dentine-résine et de la carie dentaire, grâce à une analyse précise des constituants minéraux et organiques. La microscopie Raman associée à des méthodes d'analyse de données ouvre de nouvelles portes pour la recherche en biologie-santé et en particulier en odontologie
"The Study of living cells and human dentin by confocal Raman microscopy"Confocal Raman microscopy is employed to trace drugs and nanoparticles intracellular and in hard tissues. Raman spectroscopy a non-invasive, label-free and high spatial resolution imaging technique in first part of the study is being used to trace the anticancer drug paclitaxel in living Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7) cells. An analytical method was developed and applied to Raman data acquired. The Raman images were treated by K-mean cluster analysis to detect the drug in cells. Distribution of paclitaxel in cells is verified by calculating the Pearson correlation coefficient between the reference spectrum of the drug and the whole Raman image spectra. A time dependent gradual diffusion of paclitaxel all over the cell is observed suggesting a complementary picture of the pharmaceutical action of this drug based on rapid binding of free tubulin to crystallized paclitaxel. The apoptosis in the cells were followed by post-measurement analysis including K-mean clustering and Pearson correlation coefficient. K-mean clustering was used to determine mitochondria position in cells and cytochrome c distribution inside the cells was based on correlation analysis. Cell apoptosis is defined as cytochrome c diffusion in cytoplasm. Cytochrome c acts as a trigger for the activation of the caspase cascade, and its release from mitochondria is a sign of apoptosis. Co-localization of cytochrome c is done after cell incubation with different concentration of paclitaxel. The other product used was titanium dioxide. Titanium has been widely used for orthopedic and dental implant materials. When biomaterial is implanted into the human body, it is unavoidable that blood will contact the implant surface and nanoparticles. The question is: do these nanoparticles cause toxicity? Titanium dioxide nanoparticles were followed intracellular in MCF-7 cells and TERT epithelial human oral keratinocyte cell line (OKF6/TERT-2). Detection of nanoparticles and their toxicity were studied using two analytical methods. Confocal Raman microscopy were also used to obtain Structural analysis and chemical profile of Enamel – Dentine- Resin and Raman map of decay and sound dentin samples, through accurate analysis of the mineral and organic components. The Raman spectroscopy combined with this novel method developed in this study, will provide accurate finger prints of chemical composition and by post-measurement analysis of the data acquired more information would be obtained, which might open new gates in pharmaceutical and dentistry researches

Les tissus animaux constituent des systèmes biologiques hautement organisés, où les échelles cellulaire et multicellulaire sont en corrélation constante. Non seulement les cellules régulent leur comportement au moyen de signaux biochimiques : elles transmettent aussi des stimuli mécaniques, via le cytosquelette et les complexes d'adhésion, ce qui conduit à la formation d'une organisation collective tridimensionnelle où cellules et tissu se contraignent mutuellement. Afin d'étudier les aspects mécaniques et géométriques des interactions entre cellules, nous avons cultivé des tissus épithéliaux sur des micro-environnements artificiels. Nous avons fabriqué des substrats microstructurés en polyacrylamide et en polydiméthylsiloxane, de rigidité et de géométrie définies, sur lesquels nous avons fait croître un épithélium de MDCK. Nous avons également modifié les propriétés adhésives de ces substrats pour y confiner une seule cellule et simuler ainsi les contraintes topologiques du tissu sur une cellule individuelle. Après avoir marqué les composants internes gouvernant l'architecture cellulaire, nous avons pu en obtenir des images 3D en microscopie confocale et quantifier la morphologie des cellules. Les distributions de volume des cellules et des noyaux mesurées diffèrent en fonction de leur localisation au sein du tissu, ainsi que de la géométrie et de la rigidité de l'environnement. En modifiant ces paramètres expérimentaux, nous avons pu observer l'effet de contraintes externes sur la morphologie cellulaire. Enfin, nous avons remarqué que le relief du tissu dépendait de la topographie du substrat, et nous en avons proposé un modèle qui lie les deux échelles d'organisation
Animal tissues constitute highly organized biological Systems, where the cellular and rmulticellular levels are in constant interrelation. Not only do cells regulate their behaviour via biochemical signalling: they also transmit mechanical stimuli, through the cytoskeleton and adhesion complexes, which leads to the formation of a tridimensional collective organization where cells and tissues constrain each other. To investigate the mechanical and geometrical aspects of intercellular interactions, we cultivated epithelial tissues on artificial micro-environments. We manufactured polyacrylamide and polydimethylsiloxane microstructured substrates with precise stiffness and geometry, which we grew MDCK epithelia on. We also modulated the adhesive properties of these substrates in order to confine a single cell and simulate the topological constraints of the tissue on an individual cell. After staining the internal components which govern cell architecture, we were able to obtain 3D images using confocal microscopy and to quantify the morphology of the cells. The measured volume distributions of cells and nuclei differed according to their localization within the tissue, as well as to the geometry and stiffness of the environment. Modifying these experimental parameters made it possible to observe the effect of external constraints on cell morphology. Finally, we found that the tissue profile depended on the topography of the substrate, and we suggested a mode! which correlates both organizational levels

L’ADN est constamment soumis à de nombreux stress, menaçant son intégrité et, par conséquent, le bon fonctionnement cellulaire. Pour y faire face, la cellule dispose de tout un arsenal de voies de réparation. L’une des altération du génome les plus fréquentes est l’oxydation de la guanine en 8-oxoguanine (8-oxoG). La 8-oxoG possède un fort potentiel mutagène du fait de son appariement préférentiel avec l’adénine au lieu de la cytosine lors de la réplication. Ainsi, elle doit être détectée et réparée à temps pour éviter la fixation dans le génome de mutation par transversion G:C vers T:A. Cette lésion appairée à une cytosine est détectée et excisée par la 8-oxoguanine ADN-glycosylase (OGG1), ce qui initie la réparation par excision de base. Si le fonctionnement d’OGG1 a été largement étudié in vitro et que de nombreuses données structurales sont disponibles, très peu d’études se sont penchées sur la dynamique de cette protéine au sein du noyau cellulaire. Le but de ma thèse était donc de caractériser la dynamique de recherche de la 8-oxoG par OGG1 et d’identifier les éléments (résidus ou fonctions) régulant cette dynamique. Ainsi, j’ai pu montrer que l’interaction avec l’ADN était un élément majeur de la recherche de la 8-oxoG par OGG1, et que muter les résidus impliqués dans l’interaction avec l’ADN perturbait la dynamique d’OGG1 et sa capacité à trouver et exciser la 8-oxoG. De même, la reconnaissance de la 8-oxoG, mais également celle de la cytosine lui faisant face, jouent toutes deux un rôle important dans le fonctionnement de l’ADN-glycosylase et son recrutement à la zone de dommages. Enfin, le motif NNN, très conservé mais très peu caractérisé jusqu’ici semble être essentiel à l’association spécifique avec la 8-oxoG mais pas à la dynamique de recherche
DNA is constantly subjected to various stress, threatening its integrity, and consequently, the proper functioning of the cell. In order to preserve the genomic integrity, the cell can activate a large set of repair pathways. One of the most common genomic alteration is the base modification 8-oxoguanine (8-oxoG), an oxidized form of guanine. It is highly mutagenic, due to its tendency to pair with adenine instead of cytosine during replication. Thus, it needs to be detected and repaired on time to avoid G:C to T:A transversions. 8-oxoG paired with cytosine is recognized and excised by the 8-oxoguanine DNA-glycosylase (OGG1), which initiates the base excision repair pathway. Although OGG1 has been widely studied in vitro and many structural data are available, many questions remain concerning the dynamics of the protein within the cell nucleus. Hence, the goal of my PhD project was to characterize the dynamics of OGG1 searching for 8-oxoG and get new insights about the residues or functions of OGG1 that regulate these dynamics. I was able to show that the interaction between OGG1 and DNA is crucial for the efficient search of 8-oxoG, and that mutating the residues involved in such interaction impairs OGG1 dynamics and its ability to detect and excise 8-oxoG. Similarly, 8-oxoG detection, but also that of the facing cytosine, both play an important role in the function of the DNA-glycosylase and in its ability to accumulate at the sites of damage. Finally, the NNN motif, which is highly conserved but very poorly characterized, seems to be essential to the specific association with 8-oxoG, but not for the nuclear exploration by OGG1

Le design d’un dispositif optique sans lentille et portatif est basé sur la microscopie holographique numérique pour des applications de terrain ou de point-of-care. L’appareil développé repose sur cette technique de microscopie car elle permet de reconstruire le front d’onde diffracté (phase et intensité) par un échantillon biologique observé. Le dimensionnement de cet appareil dépend de l’illumination utilisée ainsi que des contraintes physiques associées à la détection. Afin de maximiser l’information pertinente et enregistrable d’échantillons faiblement diffusants, des simulations FDTD sont utilisées. La propagation des champs diffractés à l’aide d’outils fidèles permet de générer des hologrammes échantillonnés à la façon d’un détecteur et de reconstruire les spécimens avec un grossissement. Par exemple, la reconstruction numérique de l’hologramme associé à la diffraction d’une bille de diamètre de 5 mm simulée via la méthode FDTD, et grossie selon un grandissement Gy = 20, est de 107.22 mm pour la méthode de propagation du spectre angulaire DFFT. La procédure proposée ouvre donc la voie à l’étude du champ diffracté utilisable dans un contexte d’holographie numérique, et ce pour des échantillons numériques pouvant modéliser des spécimens biologiques. D’ailleurs, le dispositif sans lentille mis sur pied à partir d’un coupleur de fibre optique offre une visibilité atteignant V = 0:8435 pour une configuration hors axe et cette dernière est limitée par le bruit cohérent de la source laser utilisée. L’étude du grossissement et de la résolution du dispositif montrent que le microscope holographique portatif est limité par l’échantillonnage du capteur utilisé, et ce, bien que la méthode d’indexation de zéros permette d’interpoler et de résoudre des détails plus fins que la taille d’un pixel pour la propagation DFFT. Finalement, l’appareil conçu est capable d’effectuer de l’imagerie de phase quantitative. L’épaisseur reconstruite d’une cible de verre (n = 1:52) est de 149±23 nm et concorde avec la valeur attendue de 150 nm.
ompact off-axis holographic lensless microscope capable of non-invasively imaging weakly scattering biological samples for on the field applications is designed. The technique allows to reconstruct both the phase and intensity of a sample-diffracted wavefront. The dimensioning of the proposed device depends on both the illumination shining the sample and the physical constraint associated with acquisition device. Hence, FDTD simulations are used in order to ascertain the smallest usable scattered field. Using proper propagation methods, the diffracted field is used to generate a numerical hologram emulating the sensor’s sampling rate. Such hologram is then numerically reconstructed in order to retrieve the object and compare it with the former. For instance, a 5 mm diameter bead diffraction field is obtained via FDTD simulation. As it is magnified by a factor Gy = 20, its reconstruction retrieves a magnified bead of 107.22 mm in diameter. The proposed pipeline thus paves the way for the study of modelled biological sample usable scattered field for holographic applications. Moreover, the proposed compact lensless device using an optical fiber coupler attains an off-axis visibility of V = 0:8435 as this last is limited by coherent noise. The study of the microscope attainable magnification and resolution shows that it is limited by the sampling rate of the used acquistion device, and that is, albeit zero-padding interpolation could provide smaller than a pixel size detail resolution for DFFT propagation. Lastly, the designed device is capable of quantitative phase imaging. The reconstructed thickness of a glass phase target (n = 1:52) is of d = 149±23 nm which is in good agreement with the expected value of 150 nm.

Le but de notre travail est de développer une imagerie des déclins de fluorescence et d'en démontrer les potentialités pour l'étude de la dynamique macromoléculaire et des interactions entre macromolécules en cellules vivantes. Notre approche repose sur la mesure de la corrélation temporelle de photons uniques de fluorescence (TCSPC) simultanément à la détermination de la localisation spatiale (le long d'une ligne) de la région d'émission. Des images monodirectionnelles de déclins de fluorescence ont ainsi été obtenues représentant la cinétique de fluorescence en différentes régions subcellulaires. Nous avons également mis au point la mesure de déclins d'anisotropie de fluorescence provenant d'un petit volume subcellulaire (1 µm3) sous microscope en mode confocal. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent l'intérêt de cette approche technologique pour des problématiques de biologie cellulaire. Le marquage fluorescent endogène de protéines a été réalisé en les fusionant à la GFP ou un de ses variants spectraux. Les interactions protéine-protéine ont été étudiées soit par hétéroFRET en mesurant la diminution de la durée de vie de fluorescence du chromophore donneur, soit par homoFRET en mesurant la cinétique de dépolarisation de la fluorescence. Nous avons mis en évidence (i) la formation d'hétérodimères de p45 du facteur de transcription NF-E2 avec deux partenaires dans différents compartiments subcellulaires par hétéroFRET, et (ii) l'homodimérisation de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex type 1 de façon plus concluante par homoFRET que par hétéroFRET. Par ailleurs, la mesure des déclins d'anisotropie de fluorescence de l'éthidium comme sonde de la dynamique torsionnelle de l'ADN a révélé l'existence d'une très forte restriction de cette dynamique dans la chromatine non perturbée. Les développements supplémentaires de notre système pour une imagerie bi-dimensionnelle puis tri-dimensionnelle sont prometteurs.

Le but de notre travail est de developper une imagerie des declins de fluorescence et d'en demontrer les potentialites pour l'etude de la dynamique macromoleculaire et des interactions entre macromolecules en cellules vivantes. Notre approche repose sur la mesure de la correlation temporelle de photons uniques de fluorescence (tcspc) simultanement a la determination de la localisation spatiale (le long d'une ligne) de la region d'emission. Des images monodirectionnelles de declins de fluorescence ont ainsi ete obtenues representant la cinetique de fluorescence en differentes regions subcellulaires. Nous avons egalement mis au point la mesure de declins d'anisotropie de fluorescence provenant d'un petit volume subcellulaire (1 m 3) sous microscope en mode confocal. Les resultats presentes dans ce memoire demontrent l'interet de cette approche technologique pour des problematiques de biologie cellulaire. Le marquage fluorescent endogene de proteines a ete realise en les fusionant a la gfp ou un de ses variants spectraux. Les interactions proteine-proteine ont ete etudiees soit par heterofret en mesurant la diminution de la duree de vie de fluorescence du chromophore donneur, soit par homofret en mesurant la cinetique de depolarisation de la fluorescence. Nous avons mis en evidence (i) la formation d'heterodimeres de p45 du facteur de transcription nf-e2 avec deux partenaires dans differents compartiments subcellulaires par heterofret, et (ii) l'homodimerisation de la thymidine kinase du virus de l'herpes simplex type 1 de facon plus concluante par homofret que par heterofret. Par ailleurs, la mesure des declins d'anisotropie de fluorescence de l'ethidium comme sonde de la dynamique torsionnelle de l'adn a revele l'existence d'une tres forte restriction de cette dynamique dans la chromatine non perturbee. Les developpements supplementaires de notre systeme pour une imagerie bi-dimensionnelle puis tri-dimensionnelle sont prometteurs.

La NADPH oxydase des phagocytes (NOX2) est responsable de la production d’anions superoxydes qui sont les précurseurs des autres formes réactives de l’oxygène. NOX2 est une enzyme majeure de la réponse immunitaire. Les dysfonctionnements de NOX2 sont associés à de nombreuses pathologies et donc il convient d’en comprendre les détails de la régulation. Cette oxydase est composée de cinq sous-unités : deux protéines membranaires, gp91phox et p22phox et 3 protéines cytosoliques p47phox, p67phox et p40phox. D’après les études in vitro avec des protéines purifiées, les protéines cytosoliques sont supposées former un complexe ternaire qui se déplace à la membrane avec une petite protéine G, Rac, au moment l’activation.L’objectif de ce projet est de caractériser les interactions spécifiques entre les sous-unités cytosoliques de NOX2 en cellules vivantes en utilisant le phénomène de transfert résonant d’énergie de type Förster (FRET) entre deux fluorophores, un donneur et un accepteur. Ici les fluorophores seront des protéines fluorescentes de la famille de la GFP. Elles sont fusionnées à deux sous-unités. L’efficacité du FRET dépend de la distance entre les fluorophores et permet ainsi de caractériser les interactions entre les protéines d’intérêt. Une méthode rapide d’identification des situations où le FRET est positif a été mise au point par cytométrie en flux. Des études détaillées et quantitatives ont ensuite été réalisées en utilisant l’imagerie de durée de fluorescence (FLIM) du donneur. Le FLIM, combiné à l’utilisation de donneurs présentant une durée de vie mono-exponentielle, permet de déterminer directement des efficacités de FRET apparentes et moléculaires, qui contiennent, toutes les deux, des informations qualitatives et quantitatives sur l’interaction et la structure des protéines impliquées. De ces données, il est possible d’extraire la fraction des donneurs interagissant avec un accepteur. Les informations obtenues à partir des données de FRET-FLIM permettent une meilleure compréhension de l’organisation et de la régulation de NOX2 tout en permettant une estimation des constantes de dissociation (Kd). Afin de confirmer ces résultats, des expériences de spectroscopie de corrélation de fluorescence à deux couleurs (FCCS) ont été réalisées. Cette méthode complétement indépendante n’est pas basée sur la distance entre fluorophores comme le FRET mais sur leur co-diffusion à travers un petit volume d’observation dans le cytoplasme cellulaire.L’approche FRET-FLIM nous a tout d’abord permis d’observer les interactions entre hétéro-dimères formés de deux sous-unites différentes en cellules vivantes et d’exclure la formation d’homo-dimères entre deux sous-unités identiques. Etant donné la bonne précision des mesures de FLIM, nous avons pu comparer les informations structurales obtenues en cellules avec les données structurales issues d’études sur les protéines purifiées in vitro et nous avons constaté qu’elles sont en bon accord. Nous avons ensuite aligné les structures disponibles pour proposer un premier modèle 3D du complexe cytosolique de la NADPH oxydase au repos dans le cytosol cellulaire.Les fractions de protéines en interaction sont pour tous les hétéro-dimères autour de 20% ce qui n’est pas en accord avec l’hypothèse courante qui propose que toutes les sous-unités cytosoliques soient sous forme de complexe. Toutefois nos premiers résultats de FCCS confirment ce résultat extrait des données de FRET-FLIM. Nous proposons donc que la complexation des sous-unités cytosolique pourrait être impliquée dans la régulation de la NADPH oxydase. Des études complémentaires seront nécessaires pour valider cette nouvelle hypothèse. Les constantes de dissociation Kd estimées à partir de nos résultats sont micromolaires et donc un ordre de grandeur plus élevé que les valeurs nanomolaires déterminées in vitro. Des mesures plus détaillées de FCCS pourront compléter et valider ces résultats
The phagocyte NADPH oxidase (NOX2) is a key enzyme of the immune system generating superoxide anions, which are precursors for other reactive oxygen species. Any dysfunctions of NOX2 are associated with a plethora of diseases and thus detailed knowledge about its regulation is needed. This oxidase is composed of five subunits, the membrane-bound gp91phox and p22phox and the cytosolic p47phox, p67phox, and p40phox. The latter are assumed to be in a ternary complex that translocates together with the small GTPase Rac to the membranous subunits during activation.Our aim was to discover and to characterize specific interactions of the cytosolic subunits of NOX2 in live cells using a Förster Resonance Energy Transfer (FRET) based approach: Since FRET depends on the distance between two fluorophores, it can be used to reveal protein-protein interactions non-invasively by studying fluorescent protein tagged subunits. To have a rapid method on hand to reveal specific interactions, a flow cytometer based FRET approach was developed. For more detailed studies, FRET was measured by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), because it allows a direct determination of the apparent and molecular FRET efficiency, which contains both qualitative and quantitative information about the interaction and the structure of the interacting proteins. Furthermore, the FRET-FLIM approach enables an estimation of the fraction of bound donor. This information itself is important for a better understanding of the organisation and regulation of the NOX2, but it is also necessary for the calculation of the dissociation constant Kd from the FRET-FLIM data. To confirm the findings obtained by FRET-FLIM fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) experiments were performed. This completely independent method is not based on distances like FRET but on the observation of the co diffusion of the fluorescently labelled samples when they move across a small observation volume inside the cells.The FRET-FLIM approach allowed us in a first step to discover heterodimeric interactions between all cytosolic subunits in live cells. Due to the good precision of the results, we were able to extract structural information about the interactions and to compare them with available structural data obtained from in vitro studies. The information from FRET-FLIM was coherent with in vitro data. We then aligned the available structures leading to the first 3D model of the cytosolic complex of the NADPH oxidase in the resting state in live cells.Additionally, the bound fraction for all heterodimeric interactions derived by FRET-FLIM is around 20 %, which is in contrast to the general belief that all cytosolic subunits are bound in complex. The first FCCS results support our findings. Therefore, we believe that the complexation of the cytosolic subunits could be involved in the regulation of the NADPH oxidase and should be investigated further. The estimated Kd derived from the FRET-FLIM approach is in the low micomolar range, which is an order of a magnitude higher than the nanomolar range of in vitro studies.In conclusion, we showed that our quantitative FRET-FLIM approach is not only able to distinguish between specific and unspecific protein-protein interactions, but gives also information about the structural organisation of the interacting proteins. The high precision of the FRET-FLIM data allow the determination of the bound fraction and an estimation of the Kd in live cells. FCCS is a complementary method, which can verify these quantitative findings. However, it cannot replace FRET-FLIM completely as it does not give any structural information.With respect to the biological outcome of this project, we can propose for the first time a 3D-model of the cytosolic complex of the NADPH oxidase covering the in vitro as well as the live cell situation. Additionally, the small bound fraction found here may raise new ideas on the regulation of this vital enzyme

De nombreux processus cellulaires élémentaires (migration, différentiation, mort) sont contrôlés par des ensembles d'acteurs reliés entre eux par des réactions en cascade. Certains de ces réseaux de signalisation convertissent des signaux mécaniques extérieurs à la cellule en signaux biochimiques internes, processus appelé mécanotransduction. Nous cherchons à étudier ces réseaux dans une approche de traitement du signal, pour déterminer expérimentalement un analogue de la fonction de transfert en espace et temps pour la mécanotransduction.Le contrôle de la variable d'entrée mécanique est assuré par différents types de substrats 2D que nous avons mis en place, comme la simple surface de verre, des motifs géométriques d'adhérence, et des substrats magnéto-actifs (composés de micro-piliers insérés dans un élastomère) pouvant stimuler localement et dynamiquement les cellules.La mesure de la variable de sortie biochimique est assurée par des biosenseurs FRET. La fluorescence qu'ils émettent est collectée à travers un microscope de fluorescence en champ large inversé. Nous avons mis en place le calcul de l'efficacité de FRET quantitative à partir de cette fluorescence sans l'utilisation de standards de FRET. Elle donne accès à l'activité en espace et en temps de certaines molécules des réseaux de signalisation.Quelques outils sont enfin présentés comme potentiels candidats pour réaliser la fonction de transfert, parmi lesquels des combinaisons de méthodes de corrélations, et la décomposition en valeurs singulières utilisée en acousto-optique. La combinaison de ces outils et méthodes reste complexe, notamment pour mettre en évidence un comportement biologique à partir d'une grandeur quantitative. Les premiers usages de ces outils ne présentent pas de résultat biologique majeur, mais sont prometteurs pour étudier la mécanotransduction
Many elementary cellular processes (migration, differentiation, death) are controled by a set of agents linked together by cascade reactions. Some of these signaling networks convert mechanical signals external to the cell into internal biochemical signals, a process called mechanotransduction. We seek to study these networks through a signal processing approach, in order to experimentally determine an analogous of the transfer function in time and space for mechanotransduction.Controlling the input variable is done by different type of 2D substrates which have been developped, from the simple glass surface, the adherent geometrical patterns, to the magneto-active substrates (composed of micro-pillars inserted into an elastomer) capable of stimulating locally and dynamically the cells.Measuring the biochemical output variable is done by FRET biosensors. The fluorescence emitted is collected through an inverted widefield fluorescence microscope. We set up the quantitative FRET efficiency calculus from this fluorescence without using FRET standards. It gives access to the activity in space and time of some molecules of network signalisation.Some tools are finally presented as potential candidates to perform the transfer function, among them are combination of correlation methods, and singular value decomposition used in acousto-optics. Combiantion of these tools and methods remains complex, particularly to highlight a biological behaviour from a quantitative quantity. The first use of these tools do not give any biological result, but are promising to study mechanotransduction

Les travaux menés au sein de notre laboratoire depuis plusieurs années, ont permis de perfectionner un nouveau modèle murin permettant l'étude de la réendothélialisation. Contrairement au modèle classique de agression endovasculaire, qui induit une désendothélialisation stricte de la carotide, le agression périvasculaire, réalisé par l'application d'un champ électrique, induit une décellularisation totale de l'artère. Notre laboratoire a démontré que le 17beta-oestradiol (E2) induisait une accélération de la réendothélialisation et que cet effet était médié par le récepteur alpha des oestrogènes (ER-alpha). La première partie de mon travail a consisté à comparer ces deux modèles : endovasculaire et périvasculaire. Nous avons ainsi démontré que malgré leurs nombreuses différences, dont la présence ou non de cellules musculaires lisses, la réendothélialisation se réalise aussi efficacement. De plus, grâce à l'application de l'imagerie confocale dite " en face ", nous avons décrit les évènements précoces et tardifs de cette cicatrisation endothéliale. L'E2 accélère précocement la migration et augmente la prolifération des cellules endothéliales dans la zone en amont du stress. Trois jours après la lésion périvasculaire, la zone réendothélialisée et la zone en amont du stress sont élargies par l'E2. Enfin, par l'utilisation de souris déficientes pour le domaine transactivateur 1 (AF1), nous avons démontré pour la première fois in vivo, que ce domaine était indispensable aux effets de l'E2. La seconde partie de ma thèse a consisté à déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires, impliqués dans ce processus de réendothélialisation. Afin de comprendre si ce processus de cicatrisation était uniquement un phénomène mettant en jeu des cellules locales, nous avons réalisé le même type d'expériences mais dans un modèle de souris chimères. En greffant de la moelle de souris déficientes en ER-alpha a des souris sauvages, et vice et versa, nous avons ainsi pu mettre en évidence, pour la première fois, qu'une coopération entre la moelle osseuse et les cellules locales était indispensable. .
Although 17ß-estradiol (E2) accelerates reendothelialization through estrogen receptor alpha (ER-alpha), the molecular and cellular mechanisms underlying this effect are poorly understood. We employed "en face" confocal microscopy (EFCM) to visualize the endothelial regeneration in the conventional endovascular and in a perivascular electric injury model. Healing kinetics and E2 effects were similar in both models. Endothelial cell migration preceded cell proliferation (BrdU-positive cells) and E2 anticipated both processes. EFCM analyses demonstrated the involvement of an adjacent uninjured endothelial zone, which was enlarged by E2, as was the reendothelialized area. Chimeric mice deficient in ER-alpha either in the bone marrow (BM) or in the non-BM compartment revealed an abolition of the E2 effect on reendothelialization as well as on cell proliferation. In mutant mice expressing the 46kD ER-alpha isoform, that is lacking the N-terminal A/B region, E2 accelerated reendothelialization as in wild type mice, providing the first in vivo observation of an E2 effect dependent of ER-alpha that does not require activation function 1. Thus, the acceleration of reendothelialization by E2 relies on the enlargement of the retrograde commitment of endothelial cells to migrate and proliferate, a cooperative effect between BM and non-BM ER-alpha, whereas the A/B region of ER-alpha is dispensable

Le développement des techniques de microscopie de fluorescence offre de nouvelles perspectives dans l'étude des processus cellulaires. La possibilité de suivre en temps réel des interactions protéiques en cellules vivantes conduit à une vision plus dynamique des mécanismes moléculaires mis en place tout au long de la vie d'une cellule. Le but de l'étude menée au cours de ma thèse consiste à étudier l'interaction entre l'histone H4 acétylée et le double bromodomaine de la protéine TAFII250. Cette interaction a été analysée par une technique de microscopie de fluorescence, FLIM par FRET, développée au sein du laboratoire et permettant d'obtenir à une haute résolution spatio-temporelle un suivi en temps réel de l'interaction en cellules vivantes. Cette interaction, dépendante du niveau d'acétylation de l'histone H4, semble être très dynamique et s'effectuer de façon très localisée au niveau de la chromatine, sur des domaines de 0,7\im de diamètre. De la même manière, l'analyse des déclins de fluorescence de la protéine EGFP fusionnée à l'histone H4 nous révèle des fluctuations de la durée de vie de fluorescence de ce fluorophore. Les analyses que nous avons effectuées nous conduisent à interpréter ces fluctuations comme étant la conséquence des variations du microenvironnement local dans lequel se situe l'EGFP, traduisant ainsi des variations de l'état supra-nucléosomal de la chromatine. Nous montrons que l'interaction entre le double bromodomaine de TAFII250 et l'histone H4 est conditionnée par ces fluctuations de l'état supra-nucléosomal. De façon plus générale, nous pensons que ces fluctuations moduleraient l'accessibilité de la chromatine aux facteurs protéiques
Fluorescence microscopy is rapidly evolving and the development of novel techniques offers new prospects in thé study of the cellular processes. The possibility of following protein interactions in real-time and in living cells leads to a more dynamic vision of the molecular mechanisms occurring throughout the life of a cell. The purpose of my thesis was to study the interaction between the acetylated histone H4 and the double bromodomain of protein TAFII250. This interaction was analyzed by a technique of fluorescence microscopy, FLIM by FRET, developed within the laboratory and making possible to obtain in real-time, with a high space and time resolution, a follow-up of the interaction in living cells. This interaction, dependent on the histone H4 acetylation rate, seems to be very dynamic and to be carried out in a very localized way on the chromatin, on the domains of 0,7}in of diameter. Similarly, the analysis of the fluorescence of the protein EGFP-H4 reveals fluctuations of the fluorescence lifetime of this fluorophore. Further analyses strongly argue that these fluctuations are due to the variations of the microenvironment of the EGFP and thus reflecting the variations of the supra-nucleosomal state of chromatin. Also, we show that the interaction between the double bromodomain of TAFII250 and the histone H4 is driven by these fluctuations of the supra-nucleosomal state. In a more general way, we propose that these fluctuations would modulate the accessibility of chromatin to the protein factors

Au cours de cette étude, j'ai recherché quel était le rôle des différentes isoformes de la triadine, Trisk 95, Trisk 51, Trisk 49 et Trisk 32 dans les cellules musculaires. Dans un premier temps, j'ai étudié le rôle des triadines Trisk 95 et Trisk 51. Pour se faire, j'ai induit leur surexpression grâce à des vecteurs viraux, soit dans des cultures primaires, soit chez la souris nouveau-née. Trisk 95 et Trisk 51 sont associées au RyR et la surexpression de Trisk 95 peut bloquer la libération de calcium induite par dépolarisation, alors que dans les mêmes conditions, la surexpression de Trisk 51 n'a pas d'effet. J'ai aussi étudié l'effet de la surexpression de Trisk 95 sur l'entrée capacitive, qui est le mécanisme par lequel une entrée de Ca2+ extracellulaire sera induite pour remplir les stocks intracellulaires vidés. La surexpression de Trisk 95 diminue l'entrée capacitive dans des cultures primaires. La surexpression à long terme de Trisk 95 et Trisk 51 chez l'animal n'a que peu d'effet sur les autres protéines du complexe de mobilisation du Ca2+. Par contre, elle perturbe la localisation de la cavéoline-3, une protéine de structure impliquée dans la formation des triades. Dans un second temps, j'ai caractérisé la localisation et les partenaires de Trisk 49 et de Trisk 32 par des marquages immunofluorescents et de la microscopie confocale. Ces deux isoformes ne sont pas localisées à la triade. Les expériences d'immunoprécipitation montrent que Trisk 32 pourrait à la fois être associée au RyR et à un autre type de canal intracellulaire de libération de Ca2+, le récepteur de l'inositol 1,4,5-tris-phosphate (IP3R). Ainsi, les triadines pourraient constituer une famille de protéines, impliquées dans la régulation de différents types de canaux intracellulaires, et pourraient jouer un rôle dans la formation et le maintien de certains compartiments du RS
Ln the present study, I searched for the role of the different triadin isoforms Trisk 95, Trisk 51, Trisk 49 and Trisk 32. First, I studied the role of Trisk 95 and Trisk 51. I induced their over-expression with viral vectors in primary cultures or in new-born mice. Both isoforms are associated to RyR1. Over-expression of Trisk 95 can block the depolarisation induced Ca2+ release in primary myotube cultures, while in the same conditions, Trisk 51 overexpression had no effect. Trisk 95 over-expression also decreases store operated-calcium entry, a process that allows ce Ils to replenish depleted stores with extracellular Ca2+. Triadin long-term over-expression by adenovirus injections of Trisk 95 and Trisk 51 in newborn mice was also studied. Their over-expression only slightly affected the expression of proteins involved in the calcium release complex. However, their overexpression affected the localization of caveolin-3, a structural protein involved in triad formation. These results open new perspectives concerning the respective function of each isoform on Ca2+ release complexes and their targeting to triads. The second part of my work was to characterize the localization and the partners of Trisk 49 and Trisk 32. Using immunofluorescent labelling and confocal microscopy on longitudinal muscle sections, I showed that the two isoforms Trisk 49 and Trisk 32 are not localized at the triad, suggesting a specific function, distinct from the calcium release complex. Immunoprecipitation experiments showed that Trisk 32 is associated to RyR, but also to another type of intracellular Ca2+ release channels, inositol 1,4,5-tris-phosphate receptors (IP3R). Altogether, these results suggest that triadins could be involved in regulating different types of calcium release channels and that they cou Id participate in maintaining the structure of different SR compartments

Cette étude vise à définir l'effet des lipoprotéines de basses densité natives (LDL) et oxydées (ox-LDL) sur les fonctions des cellules endothéliales en relation avec les processus physiopathologiques de l'athérosclérose. Le microscope à force atomique (AFM) fut utilisé en combinaison avec les méthodes biochimiques traditionnelles afin d'acquérir de l'information sur les propriétés biomécaniques des cellules endothéliales. L'AFM est un outil permettant l'acquisition d'images et de mesures de forces quantitatives concernant les propriétés viscoélastiques des cellules vivantes selon leur exposition aux LDL ou ox-LDL. L'AFM rassemble localement des informations sur la membrane cellulaire et le cytosquelette des cellules et ce, de manière non invasive. Il est ensuite possible de corréler les résultats obtenus avec les marquages immunohistochimiques afin d'évaluer la réponse cellulaire suite à une exposition à des LDL ou ox-LDL. Ces données recueillies, les protocoles étant au point, il ne restera plus qu'à effectuer les tests avec les antioxydants afin de déterminer les agents et les dosages appropriés permettant une protection salutaire de l'endothélium. Ce travail amène donc de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires fondamentaux de la dysfonction endothéliale en vue éventuellement de développer de nouvelles thérapies cytoprotectrices efficaces. Une méthode d'imagerie des LDL a également été mise au point en utilisant l'AFM. Il est maintenant possible d'obtenir des images de bonne qualité permettant aussi de mesurer les dimensions de LDL individuelles. Cette technique pourrait entre autre servir à évaluer des pathologies touchant les LDL comme le diabète.

La fluorescence a révolutionné l’imagerie cellulaire : en améliorant grandement le contraste, elle a permis d’imager des structures et de suivre des dynamiques moléculaires, jusqu’alors inaccessibles. Il existe aujourd’hui un grand nombre de techniques de microscopie optique exploitant les propriétés de molécules fluorescentes. Ces techniques permettent d’observer des structures toujours plus fines, de suivre la dynamique d’un ensemble de molécules (FRAP, PAF) ou de molécules individuelles (SPT, FCS) mais aussi d’étudier en temps réel leurs interactions moléculaires (FCCS, FRET). Toutefois, ces paradigmes expérimentaux sont complexes et de nombreux biais peuvent entacher d’erreurs les résultats obtenus.Dans le but d’interpréter avec précision les expériences d’imagerie de fluorescence sur cellules vivantes, nous avons développé un logiciel de simulation qui prend en compte les paramètres caractéristiques de ces expériences. Ce logiciel possède une interface graphique permettant d’ajuster en temps réel les paramètres de la simulation, et utilise des méthodes de Monte Carlo pour simuler la dynamique Brownienne de molécules individuelles ainsi que la photophysique des fluorophores associés. Ces molécules qui évoluent dans une géométrie définie par l’utilisateur peuvent transiter réversiblement entre un état diffusif rapide et un état diffusif lent, appelé état piégé, dans des compartiments subcellulaires spécifiques. Les fluorophores peuvent exister dans trois états : fluorescent, éteint et photo-blanchi. Des taux de transitions entre ces états sont utilisés pour simuler les expériences de fluorescence.Nous montrons dans un premier temps que les simulations générées par notre algorithme sont en accord avec des modèles théoriques classiquement utilisés pour analyser les expériences d’imagerie de fluorescence. Dans un second temps, nous utilisons le logiciel pour étudier un contact adhésif entre deux cellules COS médié par deux protéines d’adhésion formant un complexe hétérologue : la neurexine et la neuroligine. Des expériences d’imagerie de fluorescence (SPT, FRAP, FCS) ont été réalisées et sont interprétées en utilisant des simulations. Dans cette étude, nous mettons en évidence que les propriétés dynamiques de la neurexine sont modifiées au niveau du contact cellule-cellule, en bon accord avec le modèle
Fluorescence has revolutionized cellular imaging: by deeply increasing contrast, it permits to image cellular structures, and to follow molecular dynamics, which were not achievable by other optical imaging methods. Nowadays, a great number of optical microscopy techniques use the properties of fluorescent dyes and proteins. They have allowed scientists to observe finer and finer structures, to study the dynamics of an ensemble of molecules (FRAP, PAF) or of individual particles (SPT, FCS) but also to investigate the interactions between molecules in live conditions (FCCS, FRET). However, these experimental paradigms are complex and numerous biases can introduce inaccuracy in the obtained results.To the aim of precisely interpreting live cell fluorescence imaging experiments, we have developed a simulation software which takes into account the characteristic parameters of these experiments. This software, which provides a graphical interface to adjust in real time the simulation parameters, utilizes Monte Carlo Methods to simulate the Brownian motion of single molecules and the photophysics of associated fluorophores. These molecules diffuse in a user-defined geometry and can transit between fast and slow diffusion (trapping state), depending on the cellular compartment. Fluorophores can be fluorescent, blinked or photobleached. Transition rates between these states are used to simulate the fluorescence experiments.We show that the simulations generated by the algorithm are in accordance with the theoretical results typically used to analyze fluorescence experiment outputs. Then, we use the software to study an artificial cell-cell junction made up with two COS cells overlapping with each other. This junction, called adhesive contact, is mediated by two adhesion proteins called neurexin and neuroligin which establish a heterologous complex. Fluorescence imaging experiments (SPT, FRAP, FCS) have been performed, and are interpreted using simulations generated by our software. In this study, we show that the dynamic properties of neurexin are modified in the cell-cell contact area in accordance with the model

La transcription est une étape fondamentale dans l'expression des gènes. Cependant, elle reste incomplètement caractérisée dans les cellules vivantes. Pour mieux comprendre la dynamique de la transcription, notre laboratoire a amélioré le système de marquage d'ARN en utilisant la séquence codante pour MS2, facilement fusionnée avec le promoteur d'intérêt et inséré copie unique dans deux lignées cellulaires HeLa cellules. Cette construction permet une vue quantitative de la transcription, a l’échelle de la molécule unique, en temps réel. Nous avons trouvé que le VIH-1 est transcrit par des groupes de polymérases nominés convois. La transcription oscille de manière aléatoire avec des périodes actives (ON) et inactives (OFF) et est contrôlée indépendamment.Sur la base de cette découverte, nous avons étudié: (i) comment l'architecture de différents promoteurs de mammifères contrôle la cinétique transcriptionnelle; et (ii) le rôle du transactivateur transcriptionnel (Tat), le régulateur principal de la transcription du VIH-1, dans les cellules vivantes. Pour traiter ces questions, une nouvelle méthode de modélisation a été établi, combinant l'information des fluctuations transcriptionnelles avec différentes résolutions temporelles. Cela a donné une vue complète et précise du processus stochastique, décrit par le modèle de Markov. Cinq des six promoteurs de mammifères pourraient être définis par trois états, probablement contrôlés par des mécanismes différents. Le passage entre ces états est défini par les constantes de vitesse et l'écart entre eux pourrait potentiellement expliquer la différence dans la quantité d'ARN produit. De manière intéressante, nous avons constaté que les taux de passage entre les états inactifs et profondément silencieux sont la marque distinctive de différents promoteurs, suggérant que les événements cruciaux définissant les profils transcriptionnels sont en fait des événements pré-transcriptionnels.Pour étudier le rôle de Tat, des lignées cellulaires contenant un rapporteur du VIH-1 et une quantité différente de Tat ont été produites. Avec cette approche décrite ci-dessus, nous avons montré que Tat, précédemment caractérisé en tant qu'acteur dominant dans la libération de la polymérase en pause, agit longtemps avant que la transcription soit initiée. Ces résultats frappants apportent de nouvelles perspectives concernant la dynamique transcriptionnelle du VIH-1 contrôlée par Tat
Transcription is a fundamental step in gene expression. However, it is incompletely characterized in single living cells. To address this question, our laboratory developed the improved RNA tagging system using MS2-binding protein that could easily be fused with the promoter of interest inserted in a single copy in HeLa cell lines. This construct allows quantitative, single molecule view of the transcription in a real time. We have found that HIV-1 is transcribed by groups of closely spaced polymerases referred as convoys. The transcription oscillates randomly between active (ON) and inactive (OFF) periods that are controlled independently.On the basis of this discovery, we further investigated: (i) how architecture of different mammalian promoters controls the transcriptional kinetics; and (ii) the role of transcriptional transactivator (Tat), the master regulator of in HIV-1 transcription in living cells. To address this, new pipeline for the quantification was established, combining the information of transcriptional fluctuations with different temporal resolutions. This gave the full and precise view of the stochastic switching, described by the Markov model. Five of six mammalian promoters could be defined by three states, probably controlled by different mechanisms. Switching between them is defined by the rate constants and the discrepancy among them could potentially explain the difference in the amount mRNA produced. Interestingly, we found that switching rates between inactive, deeply silent states are the hallmark of different promoters, suggesting that the crucial events defining the transcriptional profiles are in fact pre-transcriptional events.To address the role of Tat, cell lines containing HIV-1 reporter and different amounts of Tat were produced. With the above described approach, we found that Tat, previously characterized as dominant player in the release of the paused polymerase, actually acts long before the transcription is initiated. These striking results bring new insights of HIV-1 transcriptional dynamics controlled by Tat

Le mélanome est un cancer agressif dont la progression est facilitée par la dégradation de la matrice extracellulaire, à la fois par les fibroblastes et les cellules tumorales. Cette dégradation génère des peptides d’élastine, notamment responsables de la prolifération des cellules saines et cancéreuses. Le peptide d’élastine (VGVAPG)3 accélère la reprise et le déroulement du cycle cellulaire de fibroblastes normaux et de cellules de mélanomes préalablement synchronisés (expression de pKi-67, détection de la phase S et quantification d’ADN). L’architecture nucléaire associée à la reprise de la synthèse des ARNm concerne les compartiments nucléaires PML-NBs et domaines SC35, partenaires indissociables de la transcription et de l’épissage, qui sont étudiés, après immunomarquages, en microscopie confocale suivie d’une reconstruction 3D. Les compartiment PML-NBs et domaines SC35 se réorganisent en fonction d’une part des phases du cycle cellulaire et d’autre part de l’activité transcriptionnelle, passant d’une séquestration du SC35 dans les PML-NBs à une interpénétration des deux compartiments. L’analyse quantitative de ces compartiments complète les résultats architecturaux en 3D. Le peptide se fixe sur le complexe récepteur de l’élastine, et induit de l’activation de la voie MEK ½ ERK ½. Un antagoniste de cette fixation (lactose) ainsi que l’inhibition de la voie ERK ½ (UO126) conduisent à l’abolition des effets dus au peptide tant pour le cycle cellulaire que pour l’organisation des PML-NBs et domaines SC35, confirmant ainsi l’implication de ces voies
Melanoma is an aggressive cancer for which invasion is facilitated by degradation of the extracellular matrix, both by normal fibroplasts and tumor cells. This degradation generates elastin peptides, in particular responsible for the proliferation of normal and tumor cells. The elastin peptide (VGVAPG)3. accelerates recovery and progression in cell cycle of normal fibroblasts and melanoma cells previously synchronized (expression of pKi-67, S-phase detection and quantification of DNA). The nuclear architecture associated with the recovery of the synthesis of mRNA on the PML-NBs nuclear compartments and SC35 domains, inseparable partners of transcription and splicing, which are studied after immunostaining by confocal microscopy followed by 3D reconstruction. Compartments PML-NBs and SC35domains are reorganized according of the phases of the cell cycle and also the transcriptional activity, from SC35 sequestration in PML-NBs to an interpenetration of the two compartments. The quantitative analysis of these compartments consolidates the 3D architectural results. The peptide binds to the elastin receptor complex and induceds the activation of the MEK 1/2 ERK 1/2. An antagonist of the fixation (lactose) and inhibition of ERK 1/2 (UO126) lead to the abolition of effects due to the peptide for both the cell cycle and the organized of PML-NBs and SC35 domains, confirming the involvement of these pathways

L'exocytose régulée, est un processus qui permet la communication entre les cellules à travers la sécrétion des hormones et des neurotransmetteurs. Dans les neurones et les cellules neuroendocrines, l'exocytose est strictement contrôlée par des signaux extracellulaires tels que le potentiel trans-membranaire et la fixation des ligands sur des récepteurs. Des progrès substantiels ont été effectués afin de comprendre le mécanisme moléculaire de l'exocytose. Les composants majeurs de la machinerie de sécrétion ont été dévoilés. Maintenant, la question qui émerge concerne le rôle de la plateforme de protéines qui semble avoir une action coordonnée entre chaque protéine. Dans le cas de la famille des annexines, qui est bien connue pour son action dans l'exocytose, leurs modes d'interactions séquentielles ou concertées avec d'autres protéines ainsi que leurs effets régulateurs sur l'exocytose ne sont pas encore bien établis. Des résultats précédents indiquent que l'Annexine A6 (AnxA6) affecte l'homéostasie du calcium et la sécrétion de la dopamine à partir des cellules PC12, utilisées comme un modèle cellulaire de neurosécrétion (Podszywalow Bartnicka et al., 2010). Afin de déterminer l'effet inhibiteur de l'AnxA6 sur l'exocytose de la dopamine, nous cherchons des partenaires moléculaires de l'AnxA6 dans les cellules PC12. Nous faisons l'hypothèse que l'AnxA6 interagit avec la PLD1, une enzyme active dans l'étape de la fusion des vésicules avec la membrane plasmique. En utilisant la microscopie confocale et la microscopie à onde évanescente, nous avons trouvé que l'isoforme 1 de l'AnxA6 et la PLD1 sont tous les deux recrutés sur la surface des vésicules au cours de la stimulation des cellules PC12. AnxA6 inhibait l'activité de la PLD comme indiqué par notre méthode d'analyse enzymatique au moyen de la spectroscopie infrarouge. En conclusion, nous proposons que l'AnxA6 n'est pas seulement impliquée dans la réorganisation des membranes par ses capacités à se lier avec des phospholipides négativement chargés et avec le cholestérol, mais elle influence également l'activité de la PLD1, changeant la composition lipidique des membranes
The regulated exocytosis is a key process allowing cell-cell communication through the release of hormone and neurotransmitters. In neurons and neuroendocrine cells, it is strictly controlled by extracellular signal such as transmembrane potential and ligand bindings to receptors. Substantial progress has been made to understand the molecular mechanism of exocytosis. Major components of secretory machinery have been brought to light. Now the emergent question concerns the role of scaffolding proteins that are thought to coordinate the action of each other. In the case of annexin family well known to be involved in exocytosis, their modes of –sequential or concerted- interactions with other proteins, and their regulatory effects on exocytosis are not very well established. Previous findings indicated that Annexin A6 (AnxA6) affected calcium homeostasis and dopamine secretion from PC12 cells, used as cellular model of neurosecretion (Podszywalow-Bartnicka et al., 2010). To determine the inhibitory effect of AnxA6 on exocytosis of dopamine, we were looking for molecular partners of AnxA6 in PC12 cells. We hypothesized that AnxA6 interacts with phospholipase D1 (PLD1), an enzyme involved in the fusion step. By using confocal microscopy and total internal reflection fluorescence microscopy, we found that isoform 1 of AnxA6 and Phospholipase D1 are both recruited on the surface of vesicles upon stimulation of PC12 cells. AnxA6 inhibited phospholipase D activity as revealed by our enzymatic assay based on infrared spectroscopy. To conclude, we propose that AnxA6 is not only implicated in membrane organization by its capacity to bind to negative charged phospholipids and to cholesterol, but AnxA6 is also affecting PLD1 activity, changing membrane lipids composition

Les anticorps thérapeutiques sont des molécules de choix pour le traitement standard de nombreuses formes de cancers. Leur application est à ce jour restreinte au compartiment extracellulaire à cause de leur taille trop importante qui les empêche de traverser la membrane cellulaire. Comme la plupart des cibles thérapeutiques du cancer semblent être situées dans le milieu intracellulaire, ce serait un plus de pouvoir exploiter les propriétés des anticorps dans les cellules pour étudier et perturber l’activité de ces cibles. Néanmoins, l’utilisation des anticorps dans le milieu intracellulaire constitue un véritable challenge, notamment à cause de la membrane cellulaire et de l’environnement réducteur du cytoplasme. L’ensemble des travaux de thèse présentés dans ce manuscrit ont permis d’établir les bases de plusieurs stratégies innovantes d’immunociblage intracellulaire et de mettre en lumière l’importance des différentes étapes de validation d’anticorps ou de fragments dérivés utilisés comme anticorps intracellulaires. La vectorisation d’anticorps complets par électroporation, le développement d’un intracorps bispécifique original anti-PCNA et la mise au point d’une méthode de mutagenèse inspirée de l’hypermutation somatique constituent les principales avancées apportées par ce travail dans le domaine de la recherche technologique en immuno biotechnologie
Therapeutic antibodies are interesting molecules used to treat numerous pathologies such as cancer. Because of their size, their application is currently limited to the extracellular space. Indeed, antibodies cannot cross the cell membrane. Almost all therapeutic targets in cancer seem to be located inside cells, it would be beneficial to take advantage of antibodies in cells in order to neutralize the activity of these targets. The use of antibodies inside the cells is a real challenge, because of the cell membrane and the reducing environment of the cytoplasm. Several strategies of intracellular immunotargeting are presented in this thesis

L'utilisation de champs électriques pulsés (PEF) dans les secteurs de la médecine et de la biotechnologie est devenue de plus en plus courante au cours des dernières décennies. La recherche a montré qu'en ajustant la durée du PEF, nous pouvons prédire quels effets seront observés. Alors que les PEF dans la gamme micro - milliseconde ont été utilisés pour perméabiliser la membrane cellulaire et améliorer l'absorption de médicament ou de protéine, le PEF nanoseconde (nsPEF) a démontré des effets uniques sur les organites intracellulaires. Les deux PEF et nsPEF ont démontré un potentiel thérapeutique pour une variété de pathologies humaines, y compris le traitement du cancer. Utilisant l'imagerie des cellules vivantes, cette thèse a étudié in vitro les effets de champs pulsés d'une durée de 10 ns à 10 ms sur des lignées cancéreuses (U87 glioblastome multiforme) et non cancéreuses (neurones hippocampes de souris (HT22) et cellules ovariennes du hamster chinois (CHO)). Des résultats publiés antérieurement ont démontré que les cellules cancéreuses sont plus sensibles aux champs électriques que les cellules saines. Nos résultats sont en accord avec ces résultats, dans la mesure où les cellules U87 ont subi une dépolarisation significativement plus importante de leur potentiel transmembranaire après une seule impulsion électrique à toutes les durées. Dans un ensemble d'expériences parallèles, malgré des seuils de champ électrique similaires pour la perméabilisation membranaire, les cellules U87 ont démontré une absorption significativement améliorée de YO-PRO par rapport aux autres lignées cellulaires. Bien que les cellules U87 aient subi le plus grand changement dans la dépolarisation membranaire et la perméabilisation membranaire, elles ont également montré la constante de rescellement de la membrane la plus rapide, qui était environ 30 secondes plus rapide que les autres lignées cellulaires. Pour élucider certains des mécanismes sous-jacents par lesquels les cellules U87 répondent aux champs électriques, une série d'expériences a examiné le rôle des canaux ioniques transmembranaires. Plusieurs études récentes ont rapporté que les PEF peuvent agir directement sur les canaux ioniques voltage-dépendants. En utilisant divers modulateurs de canaux ioniques pharmacologiques spécifiques et à action large, nous avons démontré que nous pouvions presque entièrement inhiber la dépolarisation membranaire induite par le champ électrique dans les cellules U87 en bloquant certains canaux cationiques. Ces résultats étaient assez spécifiques, tels que le canal de potassium de grande conductance (BK), les canaux calciques de type L et T, et le canal cationique non spécifique, TRPM8, étaient capables d'inhiber la dépolarisation tandis que le blocage d'autres canaux ioniques ne produisait aucun changement significatif. . Les travaux de cette thèse ont montré que la lignée cellulaire maligne U87 présentait une plus grande sensibilité aux champs électriques allant de 10 ns à 10 ms par rapport aux lignées cellulaires non cancéreuses étudiées. Des améliorations potentielles aux protocoles de traitement actuels ont été proposées sur la base des résultats présentés ici
The use of pulsed electric fields (PEF) in medical and biotechnology sectors has become increasingly prevalent over the last few decades. Research has shown that by adjusting the duration of the PEF we can predict what effects will be observed. Whereas PEF in the micro-to-millisecond range have been used to permeabilize the cell membrane and enhance drug or protein uptake, nanosecond PEF (nsPEF) have demonstrated unique effects on intracellular organelles. Both PEF and nsPEF have demonstrated therapeutic potential for a variety of human pathologies, including the treatment of cancer. Using live-cell imaging, this thesis investigated, in vitro, the effects of pulsed fields ranging in duration from 10 ns to 10 ms on cancerous (U87 glioblastoma multiforme) and non-cancerous cell lines (mouse hippocampal neurons (HT22) and Chinese hamster ovary (CHO) cells). Previously published results have demonstrated that cancerous cells have a greater sensitivity to applied electric fields than healthy cells do. Our results are in agreement with these findings, insofar as the U87 cells underwent a significantly greater depolarization of their transmembrane potential following a single electric pulse at all durations. In a parallel set of experiments, despite having similar electric field thresholds for membrane permeabilization, the U87 cells demonstrated significantly enhanced YO-PRO uptake compared to the other cells lines. Although U87 cells underwent the greatest change in both membrane depolarization and membrane permeabilization, they also showed the fastest membrane resealing constant, which was approximately 30 seconds faster than other cell lines. To elucidate some of the underlying mechanisms by which U87 cells respond to electric fields, a series of experiments looked at the role of transmembrane ion channels. Several recent studies have reported that PEFs can act directly on voltage-gated ion channels. Using a variety of specific and broad acting pharmacological ion channel modulators, we demonstrated that we could almost entirely inhibit the electric field-induced membrane depolarization in U87 cells by blocking certain cationic channels. These results were quite specific, such that the big conductance potassium (BK) channel, L- and T-type calcium channels, and the non-specific cationic channel, TRPM8, were able to inhibit depolarization while blocking other ion channels produced no significant change. The work in this thesis showed that the malignant U87 cell line showed a greater sensitivity to electric fields from ranging from 10 ns – 10 ms when compared to the non-cancerous cell lines that were investigated. Potential improvements to current treatment protocols have been proposed based on the findings presented herein

Dans les cellules des eucaryotes, la transcription des gènes est contrôlée par une pléthore de complexes protéiniques. Cependant, la plupart de nos connaissances fondamentales sur la régulation de la transcription viennent des expériences biochimiques ou des expériences d’immunofluorescences utilisant des cellules fixées. Par conséquent, beaucoup d’efforts ont été consacré récemment pour obtenir des informations sur les mouvements dynamiques ou sur l’assemblage des facteurs de transcription directement dans des cellules vivantes. Nous avons développé une stratégie de marquage, appelé « versatile antibody-based imaging approach » (VANIMA), dans laquelle des anticorps marqués avec un fluorochrome sont introduit dans des cellules vivantes pour visualiser spécifiquement des protéines endogènes ou des modifications post-traductionnelle. Nous avons pu montrer que VANIMA peut être utilisé pour étudier des processus dynamique des mécanismes fondamental de la biologie y compris les facteurs de la machinerie de transcription ainsi que les modifications des histones dans des cellules vivantes de cancer humaine en utilisant la microscopie conventionnelle ou à super-résolution. Dans l’avenir VANIMA va servir comme un outil valable pour révéler les dynamiques des processus endogènes en biologie y compris la transcription directement dans des cellules vivantes individuelles
In eukaryotic cells, gene transcription is controlled by a plethora of protein complexes. However, most of our basic knowledge about transcription regulation originate from biochemical experiments or immunofluorescence experiments using fixed cells. Consequently, many efforts have been devoted recently to obtain information about the dynamic movements or assembly of transcription factors directly from living cells. Therefore, we developed a labeling strategy, named versatile antibody-based imaging approach (VANIMA), in which fluorescently labeled antibodies are introduced into living cells to image specific endogenous proteins or posttranslational modifications. We were able to show that VANIMA can be used to study dynamical processes of fundamental biological mechanisms including factors of the transcription machinery as well as histone modifications in living human cancer cells using conventional or super-resolution microscopy. Hence, in the future VANIMA will serve as a valuable tool to uncover the dynamics of endogenous biological processes including transcription directly in single living cells

Les impulsions de champ électrique nanoseconde de forte intensité (nsPEF) ont été proposées pour le traitement du cancer avec des effets secondaires minimes et peu susceptibles de conduire à une résistance de la tumeur au traitement. Le glioblastome multiforme (GBM) est un cancer du cerveau incurable montrant une résistance aux traitements actuels tels que la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie. Dans cette thèse, l'imagerie des cellules vivantes est utilisée pour étudier in vitro les effets de nsPEF sur une lignée de cellules de glioblastome humain (U87-MG), et pour évaluer la pertinence de l'utilisation des nsPEF en tant que nouveau traitement pour le GBM. En accord avec les résultats publiés précédemment, nous montrons que les cellules U87-MG répondent aux nsPEF avec une poration de la membrane plasmique, une augmentation rapide du calcium intracellulaire et une perte progressive du potentiel de membrane mitochondriale. De nouveaux résultats montrent que 100 impulsions de 10 ns délivrées à 44 kV/cm perturbent la dynamique de croissance des microtubules indépendamment du calcium et du gonflement, ces derniers étant connus pour provoquer la dépolymérisation des microtubules. La microscopie à super-résolution nous a permis de visualiser les flexions et ruptures de microtubules après l'application nsPEF suggérant un effet plus direct des impulsions. L'étude des nsPEF sur le calcium a également été menée via des indicateurs de calcium génétiquement encodés (GECIs) qui permettent une comparaison entre les GECIs et les indicateurs chimiques couramment utilisés. En utilisant le GECI GCaMP, le potentiel d'expression des GECIs dans des endroits subcellulaires spécifiques a permis de mettre en évidence une onde de calcium induite par l'application des nsPEF, grâce à une forme de GCaMP fixée à la membrane plasmatique. Ce phénomène, qui n'est pas habituel avec des indicateurs chimiques cytosoliques classiques en raison de la diffusion, permet de confirmer l'origine extracellulaire des pics de calcium post nsPEF. Cette thèse démontre que les nsPEF appliqués à des cellules U87-MG induisent plusieurs effets cellulaires majeurs et potentiellement destructeurs. La perturbation du réseau de microtubules par les nsPEF pourrait éventuellement être exploitée comme un antimitotique, administré localement, pour le traitement de GBM, avec des effets secondaires systémiques réduits et une faible résistance au traitement
High powered, nanosecond duration pulsed electric fields (nsPEF) have been proposed as a minimal side-effect, electrical cancer therapy that is unlikely to result in tumour resistance. Glioblastoma multiforme (GBM) is an incurable brain cancer showing resistance to current treatments such as surgery, radiotherapy and chemotherapy. This thesis uses live-cell imaging to look in vitro at the effects of nsPEF on a human glioblastoma cell line (U87-MG) in a first step towards assessing its suitability as a novel treatment for GBM. In agreement with previously published results we show that U87-MG cells respond to nsPEF with plasma membrane poration, a rapid increase in intracellular calcium and a gradual loss of mitochondrial membrane potential. We present novel results showing that 100, 10 ns pulses delivered at 44 kV/cm disrupt microtubule growth dynamics in a way that is independent of calcium and swelling, both of which are known to cause microtubule depolymerisation. Super-resolution microscopy allowed us to visualise microtubules bending and breaking following nsPEF application suggesting a more direct effect of the pulse. We look also at the application of genetically encoded calcium indicators (GECIs) to nsPEF calcium studies making a comparison between GECIs and commonly used chemical indicators. Using the GECI GCaMP, we show the advantages of being able to express GECIs in specific subcellular locations by visualising an nsPEF induced calcium wave with a plasma membrane bound form of GCaMP. This event, which is not evident with classic cytosolic chemical indicators due to diffusion, helps confirm the extracellular origin of the post-nsPEF calcium spike. The work in this thesis demonstrates that nsPEF causes several major, and possibly destructive, cellular events when applied to U87-MG cells. The disruption of the microtubule network by nsPEF could potentially be exploited as a locally administered antimitotic, for GBM treatment, with reduced systemic side effects and lower occurrences of resistance

Ce travail présente des outils pour analyser la régulation de la transcription dans les cellules eucaryotes, en particulier pour le suivi de facteurs de transcription (TF) individuels dans les cellules de mammifères. Un noyau de cellule eucaryote est complexe et contient de nombreuses molécules (ADN, ARN, protéines, ATP, etc). Ces molécules interagissent avec des TF et influencent la transcription. Certaines de ces interactions peuvent être étudiées par des techniques de biochimie. La plupart, en particulier les interactions faibles, non covalentes, sont invisibles par ces méthodes. La microscopie de cellules vivantes et le suivi de molécules uniques (SPT en anglais) sont de plus en plus utilisées pour étudier ces phénomènes. L'inférence des paramètres biophysiques d'un facteur de transcription, par exemple son coefficient de diffusion, son nombre de sous-populations ou son temps de résidence sur l'ADN sont cruciaux pour comprendre sa dynamique et son influence sur la transcription. Des outils validés et précis sont donc nécessaires pour analyser les données de SPT. Pour être utile, un outil de SPT doit être non seulement validé, mais aussi accessible à des non-programmeurs. Ils doivent aussi tenir compte des biais expérimentaux présents dans les données. Nous proposons un outil d'analyse de SPT, qui se fonde sur l'estimation du propagateur de la diffusion. Ce outil a été validé et est accessible par une interface web. Nous avons montré qu'il donne des résultats proches de l'état de l'art. Il a été testé dans deux cadres : (1) l'étude de la diffusion augmentée par la catalyse enzymatique in vitro et (2) l'analyse de la dynamique du TF c-Myc dans des cellules de mammifères
This work aims at providing tools to dissect the regulation of transcription in eukaryotic cells, with a focus on single-particle tracking of transcription factors in mammalian cells. The nucleus of an eukeryotic cell is an extremely complex medium, that contains a high concentration of macromolecules (DNA, RNA, proteins) and other small molecules (ATP, etc). How these molecules interact with transcription factors, and thus influence transcription rates is an area of intense investigations. Although some of these interactions can be captured by regular biochemistry, many of them, including weak, non-covalent interactions remain undetected by these methods. Live-cell imaging and single-particle tracking (SPT) techniques are increasingly used to characterize such effects. The inference of biophysical parameters of a given transcription factor (TF), such as its diffusion constant, the number of subpopulations or its residence time on DNA, are crucial to understanding how TF dynamics and transcription intertwine. Accurate and validated SPT analysis tools are needed. To be used by the community, SPT tools should not only be carefully validated, but also be easily accessible to non-programmers. They should also be designed to take into account known biases of the imaging techniques. In this work, we first propose a tool, accessible through a web interface, based on the modeling of the diffusion propagator. We validate it extensively and show that it exhibits state-of-the art performance. We apply this tool to two experimental settings: (1) the study of catalysis-enhanced diffusion in-vitro and (2) the analysis of the dynamics of the c-Myc transcription factor in mammalian cells

Le développement récent de l’endoscopie interventionnelle digestive nous a conduit à prendre en charge deux types de pathologies préoccupantes. Il s’agit d’une part des fistules digestives souvent responsables d’une morbi-mortalité élevée et d’autre part des sténoses œsophagiennes après résection tumorale endoscopique étendue. Dans ces deux situations, des phénomènes inflammatoires chroniques conduisent soit à l’absence de fermeture de la fistule soit à une fibrose importante responsable de sténose de l’œsophage. La thérapie cellulaire a déjà été utilisée pour diminuer ces phénomènes inflammatoires et entrainer une cicatrisation. La thérapie tissulaire par cellules souches organisées en construction 3D représente un avantage important en permettant de cibler le site d’action par dépôt direct du feuillet cellularisé. Notre objectif était d’évaluer l’effet thérapeutique de ces nouveaux outils pour fermer les fistules digestives et pour prévenir la survenue des sténoses œsophagiennes. La première étape a consisté a évaluer l’efficacité du traitement par des cellules souches mésenchymateuses provenant de moelle osseuse humaine, marquées puis organisées en doubles feuillets, dans un modèle de fistule entéro-cutanée post-chirurgicale chez la souris nude. L’évaluation clinique et en imagerie (IRM et microscopie confocale) a montré une meilleure cicatrisation avec une augmentation de la microvascularisation et une accélération de la fermeture de la fistule chez les souris greffées. Les effets observés semblent liés à une augmentation précoce de la synthèse des facteurs de réparation (EGF et le VEGF) et des cytokines anti-inflammatoires (TGF-ß2 et IL-10). Après avoir développé un modèle inédit de fistule oeso-cutanée chez le porc grâce à la mise en place par voie endoscopique et chirurgicale de prothèses plastiques entre la lumière œsophagienne et la peau, nous avons évalué l’efficacité thérapeutique d’un gel contenant des vésicules extracellulaires issues de cellules souches isolées du tissu adipeux de porc. Ce gel injecté dans la fistule par voie endoscopique a permis la fermeture des fistules. Enfin, la troisième partie de notre travail a consisté à évaluer l’efficacité de la greffe allogénique de doubles feuillets de cellules souches mésenchymateuses pour prévenir la survenue des sténoses œsophagiennes dans un modèle porcin après dissection sous muqueuse étendue. Il existait une réduction significative du taux de sténose œsophagienne cicatricielle dans le groupe greffé avec une fibrose moins importante. En conclusion, l’effet paracrine antifibrosant des cellules souches mésenchymateuses organisées en feuillets est efficace à la fois pour fermer les fistules entéro-cutanées chez la souris et pour prévenir les sténoses œsophagiennes chez le porc. Un gel avec des vésicules extracellulaires issues des cellules souches a de la même façon un effet cicatrisant anti-inflammatoire permettant la fermeture des fistules œsophagiennes chez le porc. Ces résultats sont très encourageants et posent la question d’une évaluation future chez l’homme
Recent developments in digestive interventional endoscopy lead us to manage two types of digestive disease. First, it is digestive fistulas associated in many cases with high morbi-mortality; and second is oesophageal stenosis after extended superficial endoscopic resection. In both situations, chronic inflammatory process resulted in delayed or no fistula healing for the first case or oesophageal stenosis due to fibrosis. Cellular therapy has proved to be successful in reducing the inflammatory process and to promote tissue healing. Tissue therapy with 3D construct stem cells represents a major advantage by allowing a direct adaptation on the right place. Our objective was to evaluate the therapeutic effect of new strategy to close the digestive fistula and to prevent oesophageal stenosis. First step was to evaluate the effect of labelled human bone marrow derived mesenchymal stem cells engraftment in the form of double cellsheet in a post-surgical fistula model in nude mice. Clinical and radiological (MRI and probe based confocal microscopy) evaluation showed a better fistula healing with higher microvascularization and a faster fistula closing in grafted mice. These effects appear to be related to an increase production of factors involved in tissue repair (EGF et le VEGF) and anti-inflammatory cytokines (TGF-ß2 et IL-10). We developed an unpublished eso-cutaneous fistula in a porcine model after plastic catheters placement by surgical and endoscopic way between the oesophageal lumen and the skin. We evaluated the therapeutic effect of a hydrogel with extracellular vesicles extracted from porcine adipose derived stem cells. The hydrogel with vesicles was injected into the fistula by endoscopy. Radiological and histological evaluation 15 days after injection showed a fistula tract closure in treated group.The third part of this work was to evaluate the effect of allograft of adipose derived stem cells 3D construct to prevent the stenosis after extended endoscopic submucosal dissection in a porcine model. There was a significant reduction of number and degree of stenosis with decrease fibrosis infiltration in the grafted group.In summary, thanks to their paracrine and antifibrotic effect, the mesenchymal stem cells organised as 3D construct allowed fistula closure in an entero-cutaneous model in mice and prevention of stenosis after extended oesophageal submucosal dissection in a porcine model. Moreover, endoscopic hydrogel and extracellular vesicles injection allowed oesophageal fistula healing in a porcine model. These promising results pose the challenge of future clinical studies

Le microscope à force atomique (AFM) fait partie des microscopies de champ proche dites à sonde locale. De par sa versatilité, un grand nombre de domaines des nanosciences tant en physique, que chimie ou biologie utilisent cette technique. Cependant, le champ d’investigation de la microscopie AFM classique est restreint temporellement et spatialement. En effet, en raison de sa limite de vitesse d’acquisition d’image et sa limite de caractérisation des interactions en surface, des études de dynamique moléculaire ou d’éléments sub-surface ne sont pas envisageables. Nous montrons donc que la caractérisation en volume est permise en utilisant une méthode d’imagerie non destructive, la microscopie de champ proche holographique ultrasonore (SNFUH). Cette méthode développée pour étudier à l.air et en liquide, a fourni des informations localisées en profondeur avec une haute résolution spatiale, en utilisant des fréquences de résonance dans la gamme du MHz. Une calibration a été effectuée sur des échantillons de structures enterrées ou non, réalisés par lithographie e-beam. Ces échantillons ont été utilisés pour ajuster les fréquences de résonance et comprendre la formation des images en mode acoustique (profondeur investiguée et inversion de contraste). Cet outil non invasif et innovant de caractérisation a donc été développé. Il présente un énorme potentiel pour des échantillons biologiques en termes de résolution et d’information. Les microscopes AFMclassique et acoustique SNFUH sont soumis à des contraintes de temps. Pour s’en affranchir, un prototype, le microscope à force atomique haute-vitesse (HS-AFM) a été développé par l’équipe du Professeur T. Ando à l’Université de Kanazawa (Japon). Il autorise ainsi le balayage à vitesse vidéo, i.e. 25 images/s, en milieu liquide. Nous avons amélioré le prototype avec une nouvelle génération de boucle d’asservissement et augmenté la zone de caractérisation. La résolution dépend fortement du levier utilisé. De plus une qualité d’image supérieure est obtenue grâce à l’utilisation de surpointes en carbone sur ces mêmes leviers. Finalement, nous montrons des résultats obtenus avec ces deux techniques de microscopies sur différents édi.ces biologiques en milieu liquide. Ainsi, avec le microscope AFM haute-vitesse, des dynamiques biomoléculaires ont pu être visualisées (ex : structures protéine-ADN) avec une résolution nanométrique. Puis une étude des changements conformationnels intracellulaires de kératinocytes vivantes dans leur milieu physiologique a été réalisée par microscopie acoustique SNFUH et montre la dégradation du matériel biologique. L’ensemble de ces résultats ouvre un nouveau champ d’investigation dans le domaine de la biologie
The atomic force microscope (AFM) made part of scanning near-field probe microscopy. Thanks to its versatility, many fields as physics, chemistry or biology use this technique. However, the field of investigation of the classical AFM microscope is limited temporally and spatially. Indeed, due to his scan speed limitation and surface interaction caracterisation limitation, studies of molecular dynamics and sub-surface elements are not possible. We show that the volume caracterisation is permitted using a non-destructive imaging method, called Scanning Near-Field by Ultrasound Holography (SNFUH). This tool developed for study in air and liquid has provided depth information as well as spatial resolution at the nanometer scale using resonant frequencies of about range of MHz. Calibration has been performed on samples of buried or not structures made by e-beam lithography and have been used to adjust the resonant frequency and understand the acoustic image formation (depth investigation and contrast in-version). We have developed a non-invasive and innovative tool of characterization for biology : he presents a huge potential for biological samples in terms of resolution and information. Classical AFM and acoustic SNFUH microscopes are time resolution limited. To overcome this time constraint, a prototype, High Speed Atomic Force Microscope (HS-AFM), has been developed by the team of Prof. T. Ando, Kanazawa University (Japan). It allows a scan rate at video speed, i.e. 25 frames/s, in liquid medium. We have improved the prototype, through a new generation of feedback control and increased the scan area. The resolution depends strongly of the probe used. Moreover a better image quality is obtained through the use of carbon tips on these cantilevers. Finally, we show our results obtained with these two microscopy techniques about biological buildings in liquid environment. Thereby, with the HS-AFM microscope, biomolecular dynamics have been visualized (e.g. protein-DNA structures) with nanometric resolution. Then a study about intracellular conformational changes of keratinocytes living cells in their physiological medium has been realized by acoustic microscopy SNFUH and show deterioration of biological components. All of these results provide new insights in biology field

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de mortalité dans les pays industrialisés. L'hypercholestérolémie constitue un facteur de risque majeur pour les MCV. Elle est caractérisée par des niveaux élevés de lipoprotéines de faible densité (LDL, aussi appelé “mauvais cholestérol”). La présence prolongée de haut niveaux de LDL dans la circulation augmente le risque de formation de plaques athérosclérotiques, ce qui peut conduire à l'obstruction des artères et l'infarctus du myocarde. Le LDL est normalement extrait du sang par sa liaison au récepteur du LDL (LDLR) qui est responsable de son endocytose dans les hépatocytes. Des études génétiques humaines ont identifié PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) comme le troisième locus responsable de l'hypercholestérolémie autosomique dominante après le LDLR et son ligand l’apolipoprotéine B-100. PCSK9 interagit avec le LDLR et induit sa dégradation, augmentant ainsi les niveaux plasmatiques de LDL. Les mutations gain de fonction (GF) de PCSK9 sont associées à des niveaux plasmatiques élevés de LDL et à l'apparition précoce des MCV, alors que les mutations perte de fonction (PF) de PCSK9 diminuent le risque de MCV jusqu’à ~ 88% grâce à une réduction du LDL circulant. De ce fait, PCSK9 constitue une cible pharmacologique importante pour réduire le risque de MCV. PCSK9 lie le LDLR à la surface cellulaire et/ou dans l'appareil de Golgi des hépatocytes et provoque sa dégradation dans les lysosomes par un mécanisme encore mal compris. Le but de cette étude est de déterminer pourquoi certaines mutations humaines de PCSK9 sont incapables de dégrader le LDLR tandis que d'autres augmentent sa dégradation dans les lysosomes. Plusieurs mutations GF et PF de PCSK9 ont été fusionnées à la protéine fluorecente mCherry dans le but d'étudier leur mobilité moléculaire dans les cellules hépatiques vivantes. Nos analyses quantitatives de recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) ont montré que les mutations GF (S127R et D129G) avaient une mobilité protéique plus élevée (> 35% par rapport au WT) dans le réseau trans- Golgien. En outre, nos analyses quantitatives de recouvrement de fluorescence inverse après photoblanchiment (iFRAP) ont montré que les mutations PF de PCSK9 (R46L) avaient une mobilité protéique plus lente (<22% par rapport au WT) et une fraction mobile beaucoup plus petite (<40% par rapport au WT). Par ailleurs, nos analyses de microscopie confocale et électronique démontrent pour la toute première fois que PCSK9 est localisée et concentrée dans le TGN des hépatocytes humains via son domaine Cterminal (CHRD) qui est essentiel à la dégradation du LDLR. De plus, nos analyses sur des cellules vivantes démontrent pour la première fois que le CHRD n'est pas nécessaire à l'internalisation de PCSK9. Ces résultats apportent de nouveaux éléments importants sur le mécanisme d'action de PCSK9 et pourront contribuer ultimement au développement d'inhibiteurs de la dégradation du LDLR induite par PCSK9.
Coronary heart diseases (CHD) are a leading cause of death in Western societies. Hypercholesterolemia is a major risk factor for CHD. It is characterized by high levels of circulating low-density lipoprotein cholesterol (LDL, also called "bad cholesterol"). The prolonged presence of elevated levels of LDL in the circulation increases the risk of formation of atherosclerotic plaques, which can lead to obstruction of arteries and myocardial infarction. LDL is normally cleared from the blood through the binding of its sole protein constituent apolipoprotein B100 to hepatic LDL receptor (LDLR), which mediates its endocytosis in the liver. Human genetic studies have identified PCSK9 as the third gene responsible of autosomal dominant hypercholesterolemia after LDLR and its ligand apolipoprotein B100. PCSK9 interacts with the LDLR and induces its degradation thereby causing plasma LDL levels to rise. PCSK9 gain-of-function (GOF) mutations are associated with elevated plasma LDL levels and premature CHD while PCSK9 loss-offunction (LOF) mutations reduce the risk of CHD up to ~88% owing to reduction of circulating LDL. Accordingly, PCSK9 is recognized as a major pharmacological target to lower the risk of CHD. PCSK9 binds the LDLR at the cell surface and/or in the Golgi apparatus of hepatocytes and causes its degradation in lysosomes by a mechanism not yet clearly understood. The goal of this study was to determine why some human PCSK9 mutations fail to induce LDLR degradation while others increase it in lysosomes. Several PCSK9 LOF and GOF mutations were fused to the fluorescent protein mCherry to study their molecular mobility in living human liver cells. Our quantitative analysis of fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) showed that PCSK9 GOF mutations S127R and D129G have a higher protein mobility (>35% compared to WT) at the trans- Golgi network (TGN). Our quantitative analysis of inverse fluorescence recovery after photobleaching (iFRAP) showed that PCSK9 LOF mutation R46L presented a much slower protein mobility (<22% compared to WT) and a much slower mobile fraction (<40% compared to WT). In addition, our confocal and electron microscopy analyses demonstrate for the first time that PCSK9 is localized and concentrated at the TGN of human hepatocytes. Furthermore, our results demonstrate that PCSK9 localization in the TGN is mediated through its C-terminal cysteine and histidine-rich domain (CHRD), which is essential for LDLR degradation. Also, our live-cell analyses demonstrate for the first time that the CHRD is not required for internalization of PCSK9. These results provide important new information on the mechanism of action of PCSK9 and may ultimately help in the development of inhibitors of the PCSK9-induced LDLR degradation.