Gotowa bibliografia na temat „Homéostasie – génétique”

Le projet Milieu Intérieur vise à élucider les facteurs environnementaux et héréditaires qui façonnent un système immunitaire sain, et à définir ses frontières lors de l’homéostasie et à la suite d’une stimulation immunitaire. Le projet repose sur un phénotypage immunitaire de 1 000 donneurs sains. En corrélant les mesures obtenues par analyse en cytométrie en flux de la composition des cellules immunitaires du sang périphérique en homéostasie avec les métadonnées associées, nous avons défini des valeurs de référence de phénotypes en fonction du sexe et de l’âge et constaté un impact significatif du tabagisme et de l’infection latente par le cytomégalovirus sur les phénotypes mesurés. Nous avons également identifié onze nouveaux polymorphismes (SNP, single-nucleotide polymorphism), associés à des phénotypes spécifiques de certaines cellules immunitaires. Des conduites expérimentales robustes et standardisées ont été établies pour quantifier les signatures protéiques et transcriptionnelles de la réponse immunitaire résultant de la stimulation des cellules du sang périphérique et pour explorer les déterminants génétiques et non-génétiques de la variabilité de cette réponse. Les approches analytiques établies par Milieu Intérieur et l’ensemble des données recueillies pourront ainsi servir de référence pour des études comparatives avec différentes maladies.

LAT (Linker for activation of T cells) assembles an essential platform for recruiting multiple proteins after TCR engagement. Mice homozygous for a single mutation in tyrosine residue 136 of the LAT adaptor showed impeded T cell development. However, later in life they accumulated polyclonal Th2 CD4+ effector T cells, which triggered tissue eosinophilia and massive maturation of B cells into plasma cells secreting high level IgG1 and IgE. To investigate the molecular and cellular pathways that might be involved in the triggering of this pathological condition, we used short-term and long-term adoptive transfer into hosts that were specifically deprived of T cells. We found that CD4 T cells from LATY136F mutant mice displayed similar homeostasis to their wild-type counterpart at the beginning of the reconstitution. However, 8 weeks after reconstitution, transfer of the LATY136F derived CD4 T cells gives rise to a condition that fully reproduce the lymphoproliferative disease originally observed in LATY136F mice. Accordingly, the reconstituted mice showed a large accumulation of CD4 T cells and B cells in secondary lymphoid organs, as well as hypergammaglobulinemia IgG1 and IgE in serum, and eosinophilia in multiple tissues. This demonstrated that the LATY136F disorder was T cell autonomous. Further results derived from comparison between CD3 epsilon-deprived hosts that are either MHCII-sufficient or-deficient showed that in the absence of MHCII molecules, LATY136F CD4 T cells were capable, however with a two-fold reduced efficiency, of proliferating and of helping B cells to mature into IgG1 and IgE plasma cells. These results suggested that the lymphopoliferation of CD4 T cells in LATY136F mutant mice and the ensuing T/B cooperation that leads to massive amount of IgE and IgG1 are largely independent on MHC Class II molecules. This almost TCR-independent and thus “autistic” behavior vis-à-vis MHC Class II molecule appears to be a unique property of CD4 T cells harboring the LATY136F mutation. NTAL (non-T cell activation linker, also called LAB), a newly identified transmembrane adaptor protein, shared structural similarity with LAT. It is highly expressed in B cells, NK cells and mast cells. NTAL/LAB is rapidly phosphorylated by 4 Src-family kinases (Lck or Lyn) and Syk- family kinases (ZAP-70 or Syk) after ligation of BCR, FcγRI and FcεRI receptors. The major proteins that associated with NATL/LAB after phosphorylation were identified as Grb2, SOS1, C-Cbl and Gab1 etc. The disruption of NTAL/LAB expression in B cell line can lead to decreased calcium mobilization and Erk activation, which suggested that NTAL/LAB is acting in BCR-mediated calcium flux and Ras-MAPK activation. To delineate the respective roles of NTAL/LAB and LAT in B cell development and function, Ntal-deficient mice were generated and crossed with Lat-deficient mice. B cells developed with same efficiency in Lat-/- Ntal-/- double-deficient mice and in mice lacking either of the two adaptors and in wild-type mice, which demonstrated that NATL/LAB is dispensable in B cell development. Upon B cell antigen receptor cross-linking, Ntal-/- B cells exhibited slightly increased Ca2+ mobilization and proliferation. Analysis of T-dependent and T-independent humoral responses showed that Ntal-deficient mice had increased levels of natural antibodies and slightly increased humoral response to a T-dependent antigen. Specific serum immunoglobulins at normal titers were produced in response to T cell-independent antigens. Although NTAL is also expressed in plasma cells, its absence did not affect the hypergammaglobulinemia E and G1 that developed in mice with a mutation in tyrosine 136 of LAT. Therefore, NTAL does not play in B cells a role symmetric to the role played by LAT in T cells
L’adaptateur transmembranaire LAT (Linker for Activation of T cells) constitue une plateforme moléculaire assurant le recrutement de nombreuses protéines impliquées dans la transduction des signaux médiés par le TCR. Les souris homozygotes pour une mutation ponctuelle de la tyrosine 136 du domaine intracytoplasmique de LAT présentent un défaut dans le développement des lymphocytes T. En outre, elles développent progressivement une lymphoprolifération T CD4+ polyclonale qui est associée à une éosinophilie tissulaire et à une maturation massive des cellules B en plasmocytes sécrétant des niveaux élevés d’IgG1 et d’IgE. Pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires associés au développement de cette pathologie, nous avons mis en oeuvre un système de transfert adoptif à court terme et à long terme dans des hôtes présentant une immunodéficience sélective en lymphocytes T. Nous avons montré que les cellules T CD4+ des souris mutantes LATY136F présentent une homéostasie similaire à celle des cellules wt en début de reconstitution. En revanche, 8 semaines après reconstitution, les cellules T CD4+ desLATY136F induisent une pathologie lymphoproliférative qui reproduit en tout point celle observée initialement dans les souris LATY136F. Ainsi, les souris reconstituées présentent-elles une accumulation massive de cellules T CD4+ et de lymphocytes B dans les organes lymphoïdes secondaires, une ypergammaglobulinémie IgG1 et IgE et une éosinophilie marquée dans de nombreux tissus. Ceci démontre que les lymphocytes T sont nécessaires et suffisants pour induire la pathologie LATY136F. Par comparaison des reconstitutions réalisées dans des hôtes déficients en CD3 et exprimant ou non les molécules d’histocompatibilité de classe II, nous avons établi que les lymphocytes T CD4+ LATY136F conservent, en l’absence de molécules d’histocompatibilité de classe II, leur capacité à proliférer et à stimuler la maturation des lymphocytes B en plasmocytes sécrétant des IgG1 et des IgE -avec une efficacité néanmoins deux fois moindre-. Ces résultats suggèrent que la lymphoprolifération des cellules T CD4+ dans les souris mutantes LATY136F et que la coopération T/B associée qui conduit à des concentrations sériques considérables d’IgE et IgG1 sont, pour une large part, indépendants des moléculesd’histocompatibilité de classe II. Ce comportement largement indépendant du TCR et pouvant à ce titre être qualifié de comportement autistique vis-à-vis des molécules de classe II apparaît comme une propriété unique des cellules T CD4+ portant la mutation LATY136F. NTAL (Non T cell Activation Linker, également appelé LAB) est un adaptateur transmembranaire récemment identifié qui possède des similarités structurales avec LAT. NTAL est fortement exprimé dans les cellules B, les cellules NK et les mastocytes. NTAL est rapidement phosphorylé par les kinases de la famille Src (Lck ou Fyn) et de la famille Syk (Zap-70 ou Syk) après engagement du récepteur des cellules B (BCR) ou des récepteurs au fragment Fc des immunoglobulines de type FcγRI et FcεRI. Les principales protéines identifiées comme associées à la molécule NTAL phosphorylée sont Grb2, SOS1, C-Cbl, Gab1. La suppression de l’expression de NTAL dans une lignée B conduit à une diminution des flux calciques et de l’activation des molécules Erk, ce qui suggère que NTAL participe à l’induction des flux calciques et à l’activation de la voie Ras-MAPKassociées à la stimulation du BCR. Pour identifier les rôles respectifs de NTAL et de LAT dans le développement et la fonction des lymphocytes B, des souris déficientes pour Ntal ont été générées et croisées avec des souris déficientes pour LAT. L’ analyse de ces souris a montré que les cellules B se développent avec la même efficacité dans les souris doublement déficientes Lat-/-Ntal-/-, dans les souris déficientes dans l’un de ces deux gènes et dans les souris wild-type, ce qui démontre que NTAL n’est pas indispensable pour le développement des lymphocytes B. L’agrégation des récepteurs des cellules B induit, par ailleurs, des niveaux de prolifération et des niveaux de flux calciques légèrement augmentés dans les souris déficientes pour Ntal. L’analyse des réponses humorales T dépendantes et T indépendantes a montré que les souris déficientes pour Ntal possèdent, en outre, des niveaux augmentés d’anticorps naturels et des réponses humorales légèrement amplifiées en réponse à des antigènes T dépendants. Des titres normaux d’immunoglobulines sériques spécifiques sont observés en réponse à des antigènes T indépendants. Enfin, bien que NTAL soit également exprimé dans les plasmocytes, son absence n’affecte pas l’hypergammaglobulinémie E et G1 sedéveloppant dans les souris porteuses de la mutation LATY136F. NTAL ne constitue donc pas dans les lymphocytes B l’équivalent fonctionnel de LAT dans les lymphocytes T

Les mécanismes associés à l’encodage du signal "ligand" par le TCR, en particulier les mécanismes d’initiation et de clôture ainsi que les mécanismes d’ajustement de ce codage au cours de la "vie lymphocytaire" font l’objet de ce travail. Deux modèles majeurs ont été proposés pour rendre compte de l’initiation des événements d’activation suite à la reconnaissance du ligand pMHC. Dans le premier modèle dit cinétique, les paramètres cinétiques, en particulier le temps de demi‐vie de l’interaction TCR:ligand, constitue le paramètre crucial gouvernant l’activation T. Dans le second modèle, les événements conformationnels sont proposés comme des événements initiateurs de l’activation. En particulier, l’une des observations majeures récemment rapportée en faveur du modèle conformationnel est l’exposition inductible d’une séquence riche en prolines du domaine intracytoplasmique de la sous‐unité CD3ε du complexe récepteur (CD3εPRS) suite à son engagement avec un ligand activateur. Selon cette hypothèse, l’exposition de cette séquence interviendrait avant tout événement de phosphorylation et permettrait le recrutement de l’adaptateur cytosolique NCK. Afin d’évaluer l’importance physiologique de l’exposition inductible de cette séquence pour l’activation T, nous avons développé une souris knock‐in exprimant une sous‐unité CD3ε dépourvue de motif riche en prolines. L’analyse du phénotype de cette souris a mis en évidence que cette séquence n’est pas nécessaire à l’activation des cellules T et a ainsi invalidé un des arguments expérimentaux majeurs en faveur du modèle conformationnel. En outre, de façon inattendue, cette souris a révélé un élément nouveau dans le codage du signal. En effet, l’absence de cette séquence conduit à des défauts partiels lors de la sélection β et de la sélection γδ, à des niveaux de TCR sélectivement augmentés en surface des thymocytes CD4+CD8+ ainsi qu’à des défauts de sélection positive. La dissection génétique et moléculaire de ce phénotype a montré que ces quatre fonctions sont associées à la colocalisation des kinases LCK au voisinage du TCR via le recrutement constitutif de NCK au niveau de la séquence riche en prolines de CD3ε et une interaction NCK:LCK. Bien que cette dernière interaction reste à démontrer directement, la compensation du phénotype par une kinase LCK pré‐activée suggère fortement que les fonctions associées à l’interaction CD3ε:NCK sont médiées par LCK. Ces observations nous ont conduits à proposer un modèle dans lequel l’interaction tripartite CD3ε:NCK:LCK constituerait un co‐récepteur intracellulaire assurant le couplage des sous‐unités du TCR avec la kinase LCK dans les situations où les co‐récepteurs CD4 et CD8 ne sont pas ou peu efficacement couplés au récepteur T, i. E. Lors de la sélection β, de la sélection γδ, dans les thymocytes CD4+CD8+ pré‐sélectionnés et lors des événements de sélection positive au cours desquels le récepteur T reconnaît des ligands de faible affinité, peu efficaces pour médier le recrutement des co‐récepteurs. L’analyse précise de la fonction de la séquence CD3εPRS dans la régulation des niveaux de TCR exprimés par les thymocytes CD4+CD8+ a montré que cette séquence participe, en coopération avec SLAP et c‐CBL, à la dégradation de CD3ζ. Afin d’analyser les mécanismes de clôture des signaux d’activation, nous avons utilisé le modèle murin LatY136F/Y136F qui présente un adaptateur LAT dépourvu de la tyrosine 136 et qui développe une lymphoprolifération T CD4+. Pour élucider les mécanismes associés à cette dérégulation, nous avons développé un système d’expression conditionnelle de la mutation dans les cellules T périphériques. Cette approche a prouvé que la pathologie lymphoproliférative n’est pas de nature auto‐immune et qu’une pathologie similaire se développe en l’absence complète d’adaptateur LAT, démontrant que les signaux générés par l’adaptateur LAT altéré ne constituent pas des événements initiateurs de la pathologie. L’existence d’événements de signalisation alternatifs dans les cellules dépourvues d’adaptateur LAT a mis en évidence de façon directe le rôle de LAT dans la terminaison et la régulation négative des signaux d’activation
The mechanisms by which ligand recognition is encoded and converted into a cytoplasmic signal by the T cell receptor (TCR), in particular how signals are initiated and terminated and how this code is adjusted during T cell differenciation are central themes in T cell immunology and constitute the subject of this work. Two main models have been proposed to account for signal initiation following ligand recognition by the TCR. In one model of T cell activation, the half‐lives of TCR:pMHC complexes constitute the main parameter driving T cell activation. In an alternative model, conformational changes of the receptor have been proposed to rationalize the seminal events leading to biochemical cascades. In particular, in one of the most recently advocated conformational model of T cell activation, a proline‐rich motif (PRS) located in the cytoplasmic tail of CD3ε has been proposed to be inducibly exposed following activation and to recruit the cytosolic adaptor NCK. According to that model, this step would occur even prior to phosphorylation events and would constitute a critical step for T cell activation. To assess this model, we constructed a knock‐in mouse deprived of this sequence. The phenotype of this mouse invalidated the conformational model of T cell activation based on an inducible exposure of this motif. Unexpectedly this mouse also unraveled novel functions for the PRS sequence at the β selection checkpoint, but also during γδ selection events and turned out to be a crucial regulator of TCR levels expressed on DP thymocytes and also required for positive selection events. These four functions were linked to the constitutive interaction between CD3εPRS and NCK and to the recruitment of LCK by NCK. Although this last interaction has to be directly demonstrated, the compensation of the phenotype by a pre‐activated LCK kinase strongly suggests that the functions associated with CD3εPRS:NCK interaction are mediated through LCK. These observations led us to formulate a model in which a tri‐molecular complex composed of CD3εPRS:NCK:LCK constitutes an intracellular coreceptor recruiting LCK in situations where the TCR is not or not efficiently coupled with CD4 and CD8 coreceptors, i. E. During β selection, γδ selection, in pre‐selected CD4+CD8+ thymocytes and during positive selection (where thymocytes recognize low‐affinity ligands that do not recruit efficiently the coreceptors due to the short half‐life of these ligands). Lastly, the function associated with the CD3εPRS in CD4+CD8+ thymocytes was linked to the participation of this sequence to a degradation pathway mediated by SLAP and c‐CBL leading to CD3ζ ubiquitination and degradation. In order to analyze signals that participate to the termination of activatory signals, we used the LatY136F/Y136F mouse genetic model in which the LAT adaptor is deprived of the tyrosine 136 and which develops a CD4 lymphoproliferative disorder. To understand the mechanisms at play in this pathology, we developed a conditional model allowing the expression of the mutation in peripheral T cells. This approach demonstrated that this disorder is not mediated by an auto‐immune mechanism and that a similar pathology occurs in complete absence of LAT adaptor, suggesting that altered LAT signals do not participate to the unfolding of the disease. Interestingly, the absence of LAT molecules led to the exacerbation of some of the biochemical events, unraveling in a direct fashion the negative regulatory function of LAT for T cell homeostasis

Etudier l'homogénéité des cellules humaines T régulatrices (Treg) CD4+FOXP3+ et leur potentiel de reprogrammation des lignées est crucial pour appliquer les Treg thérapies dans les études cliniques. Grâce aux techniques d'analyse à l'échelle unicellulaire, nous avons exploré l'hétérogénéité et la diversité fonctionnelle des Treg chez des donneurs sains et chez des patients atteints d'une leucémie, après une transplantation allogénique des cellules souches hématopoiétiques (alloHSCT). Les cellules Treg révèlent un niveau de complexité simillaires aux cellules effectrices T CD4+ concernant l'expression des facteurs de transcription, des récépteurs ainsi que les cytokines inflammatoires. L'analyse unicellulaire des rares Treg qui expriment IL-17A ou IFN-y montre un chevauchement de l'expression des principaux gènes présents dans les cellules Th1, Th17 et les Treg. Afin d'évaluer si l'homéostasie des Treg est affectée par un environnement inflammatoire et lymphopénique, nous avons caractérisé le compartiment des Treg chez les patients après une alloHSCT. Cette analyse suggère une déplétion remarquable des Treg avec un phénotype naïve chez les patients présentant une maladie aigue du greffon contre l'hôte, par rapport aux patients tolérants. Néanmoins, l'analyse unicellulaire a montré que les lymphocytes T CD4+FOXP3+ maintiennent l'expression des gènes de Treg et que ces cellules préservent leur activité suppressive. Notre étude montre que l'hétérogénéité au niveau unicellulaire, plutôt que la reprogrammation des lignées lymphocytaires T CD4+FOXP3+, explique la complexité remarquable et la diversité fonctionnelle des Tregs humains
Understanding the heterogeneity of human CD4+FOXP3+ regulatory T cells (Treg) and their potential for lineage-reprogramming is of critical importance for moving Treg therapy into the clinics. Using multi-parameter single-cell analysis techniques we explored the heterogeneity and functional diversity of human Treg in healthy donors and in patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (alloHSCT). Human Treg displayed a level of complexity similar to conventional CD4+ effector T cells with respect to the expression of transcription factors, homing receptors and inflammatory cytokines. Single-cell profiling of the rare Treg producing IL-17A or IFN-y showed an overlap of gene expression signatures of Th17 or TH1 cells and of Treg. To assess if Treg homeostasis is affected by an inflammatory and lymphopenic environment, we characterized the Treg compartment in patients early after alloHSCT. This analysis suggested a marked depletion of Treg with a naive phenotype in patients developing acute graft-versus-host disease, compared to tolerant patients. However, single-cell profiling showed that CD4+FOXP3+ T cells maintain the Treg gene expression signature and Treg suppressive activity was preserved. Our study establishes that heterogeneity at the single-cell level, rather than lineage-reprogramming of CD4+FOXP3+ T cells, explains the remarkable complexity and functional diversity of human Treg

L'hypercholestérolémie est un facteur de risque majeur des maladies cardiovasculaires. La compréhension des mécanismes régissant l'homéostasie du cholestérol est cruciale puisqu'elle peut concourir au développement de nouvelles thérapies hypocholestérolémiantes. Les acides biliaires (AB) sont des dérivés terminaux du métabolisme du cholestérol. Ces molécules, produites dans le foie, jouent un rôle clef dans la digestion et l'absorption intestinale des lipides. Par ailleurs, elles représentent la principale voie d'élimination physiologique du cholestérol. Les résultats obtenus au cours de cette thèse montrent qu'il existe une régulation coordonnée des gènes codant pour les transporteurs d'AB dans l'intestin, le foie et rein. Ce mécanisme assure une élimination efficace des AB par voie fécale et urinaire et contribue à expliquer la résistance de la souris à l'hypercholestérolémie induite par voie alimentaire. Les facteurs de transcription SREBP-2 et HNF-1, et le récepteur nucléaire PPAR, jouent un rôle clef dans ce mécanisme adaptatif puisqu'ils assurent la régulation cholestérol-dépendante de plusieurs transporteurs clefs d'AB, en particulier l'ASBT dans l'iléon et le rein, et la L-FABP dans le foie
Hypercholesterolemia is a major risk factor of cardiovascular diseases. Understanding of mechanisms ensuring the maintenance of body cholesterol homeostasis is crucial, since it can allow the development of new hypocholesterolemiant therapies. Bile Acids (BA) are end-products of cholesterol metabolism. These molecules, produced in the liver, participate to fat digestion and absorption in the intestine. Moreover, BA represent the main pathway of body cholesterol removal. The results presented in this thesis show that genes encoding intestinal, hepatic and renal BA transporters are coordinately regulated. This mechanism ensures efficient BA elimination through faecal and urinary route, and thus contributes to explain the resistance of mice to diet-induced hypercholesterolemia. The transcription factors SREBP-2 and HNF-1, and the nuclear receptor PPAR, play a key role in this adaptative process since they allow cholesterol-dependent regulation of several key BA transporters, particularly ASBT in the ileum and the kidney, and L-FABP in the liver

Les métaux de transition sont des micronutriments essentiels dans le cycle de vie de nombreux organismes vivants, y compris les bactéries. Ils jouent un rôle important à l'interface hôte-pathogène : l'hôte restreint l'accès au fer, au manganèse et au zinc pour les bactéries qui l'infectent, tout en les intoxiquant avec du cuivre ou du zinc pendant la phagocytose. Les bactéries ont donc acquis différents mécanismes d'homéostasie afin de s'adapter à ces conditions. Alors que des systèmes d'importation du fer, du manganèse ou du zinc ont été caractérisés, peu de choses sont connues pour le cuivre, pour lequel les études se sont concentrées sur les mécanismes de défense. Par ailleurs, alors que plusieurs mécanismes de régulation post-transcriptionnels sont connus pour d'autres métaux, seuls des régulateurs transcriptionnels ont été identifiés en réponse au cuivre.Des travaux antérieurs menés sur l'homéostasie du cuivre chez le pathogène humain Bordetella pertussis, responsable de la maladie de la coqueluche, ont montré que cette bactérie a perdu la plupart des mécanismes de défense connus contre l'excès de cuivre. En revanche, nous avons identifié un opéron de trois gènes appelés bp2923-bfrG-bp2921, dans lequel les deux derniers gènes sont régulés négativement par un excès de cuivre. bfrG est prédit pour coder un transporteur TonB-dépendant, une famille de protéines connue pour l'importation de métaux à travers la membrane externe des bactéries à Gram négatif, et bp2921 a un homologue prédit pour coder une sidérophore réductase. Ceci indique que ce système pourrait être impliqué dans l'acquisition du cuivre. Nous avons montré que la protéine codée par le premier gène, membre de la famille de protéines DUF2946, représente un nouveau type d'upstream Open Reading Frame (uORF) impliquée dans la régulation post-transcriptionnelle des gènes en aval. En l'absence de cuivre, l'opéron entier est transcrit et traduit. La perception du cuivre par la protéine naissante codée par bp2923 via un motif conservé CXXC déclenche la terminaison de transcription Rho-dépendante entre le premier et le deuxième gène en libérant le ribosome arrêté sur un motif conservé C-terminal RAPP. Les homologues de bp2923 sont répandus dans les génomes bactériens, dans lesquels ils sont en tête d'opérons prédits pour coder des mécanismes d'importation ou d'utilisation du cuivre. Nous avons donc identifié un nouveau mode de régulation génétique par un métal de transition et identifié une fonction de régulation pour un membre d'une famille de protéines bactériennes non caractérisées que nous avons appelé CruR, pour Copper responsive upstream Regulator. Des travaux supplémentaires sur ce système ont mis en lumière la complexité de la régulation bactérienne, car notre opéron est régulé non seulement par le cuivre, mais est aussi surexprimé par la modulation de la virulence et en phase stationnaire de croissance.Par ailleurs, nous avons commencé à caractériser la fonction de cet opéron. Nous avons montré que BfrG lie du cuivre in vitro, et des analyses phénotypiques ont montré le rôle de l'opéron pour la croissance bactérienne lorsque B. pertussis rencontre des conditions de faible oxygénation. Parmi les protéines à cuivre produites par B. pertussis, on trouve plusieurs cytochrome-oxydases de la chaîne respiratoire, ce qui suggère que BfrG et Bp2921 joueraient un rôle dans l'acquisition du cuivre pour leur assemblage. Combinées aux résultats de régulation, ces données suggère que notre opéron pourrait contribuer à dans la persistance bactérienne dans le tractus respiratoire lors de l'infection. Beaucoup d'aspects de ce système restent méconnus et nécessiteront d'être étudiés
Several transition metals are essential micronutrients for most living beings, including bacteria. In addition, they play important roles at the host-pathogen interface: the host tends to restrict bacterial access to iron, manganese and zinc, while intoxicating invading microorganisms with copper or zinc during phagocytosis. Bacteria have therefore acquired various homeostasis mechanisms in order to adapt to those conditions. Whereas iron, zinc or manganese import systems have been extensively characterized, very little is known for copper, for which studies have mostly focused on defense mechanisms. Besides, while several post-transcriptional regulation mechanisms are known for other metals, only transcriptional regulators have been identified in response to copper.Previous work performed in the laboratory on copper homeostasis in the human-restricted pathogen Bordetella pertussis, responsible for the whooping cough disease, has shown that this bacterium has shed most of its defense mechanisms against excess copper. On the other hand, we have identified a three-gene operon called bp2923-bfrG-bp2921, in which the last two genes are down-regulated by copper excess. bfrG is notably predicted to encode a TonB-dependent transporter, a protein family well-known for metal import across the outer membrane in Gram-negative bacteria, and bp2921 has a characterized homolog encoding a siderophore reductase, which hints at a system involved in copper acquisition. We have shown that the protein encoded by the first gene, a member of the DUF2946 protein family, represents a new type of upstream Open Reading Frame (uORF) involved in post-transcriptional regulation of the downstream genes. In the absence of copper, the entire operon is transcribed and translated. Perception of copper by the nascent bp2923-coded protein via its conserved CXXC motif triggers Rho-dependent transcription termination between the first and second genes by relieving translation arrest on a conserved C-terminal RAPP motif. Homologs of bp2923 are widespread in bacterial genomes, where they head operons predicted to participate in copper importation or utilization. We have thus identified a new mode of genetic regulation by a transition metal and identified a regulatory function for a member of an uncharacterized family of bacterial proteins that we have named CruR, for Copper responsive upstream Regulator. Additional work on this system has shed a light on the complexity of bacterial regulation, as our operon is regulated not only by copper, but is also overexpressed upon virulence modulation or in stationary growth phase.We have also initiated the characterization of the function of this operon. BfrG has been shown to specifically bind copper in vitro, and phenotypic analyses have shown a crucial role for the operon when B. pertussis is placed in low-oxygen conditions. Among the cuproproteins produced by B. pertussis are several cytochrome oxidases in the respiratory chain, which suggests that BfrG and Bp2921 could play a role in delivering copper for their assembly. Combined with results on the regulation, this suggests a possible role for copper and our operon in bacterial persistence in the respiratory tract during infection. Many aspects of this system remain to be further investigated

Le zinc est un oligo-élément essentiel pour la vie. Le zinc n'est pas seulement un nutriment important, ou un cofacteur de nombreuses enzymes et de facteurs de transcription, il est désormais considéré comme un médiateur intracellulaire. L'homéostasie du zinc résulte de la coordination de diverses protéines: les ZIP, les métallothionéines et les ZnT appartenant à la famille CDF. Le récent décryptage du génome humain a permis d'identifier de nouveaux gènes, ainsi nous avons pu caractériser deux nouveaux gènes de la famille SLC30, nommés SLC30A8 et SLC30A JO. L 'homéostasie du zinc est maintenue par l'action de ces protéines dont la transcription est ellemême dépendante en partie de la concentration en zinc extracellulaire. En cas de carence, les taux de transcription de ZnT -S,-Sc et 7 sont augmentés. Ces transporteurs, que nous avons localisés au niveau de l'appareil de Golgi, pourraient permettre aux protéines néo-synthétisées l'apport en zinc nécessaire à leur fonctionnalité. Nous avons également montré que la protéine ZnT-8 est un transporteur du zinc spécifique des cellules sécrétrices d'insuline, localisé au niveau même des vésicules contenant l'insuline, et dont la régulation de la transcription, tout comme l'insuline, est dépendante du taux de glucose extracellulaire. Le zinc est impliqué dans tous les aspects métaboliques et structuraux des différents compartiments cellulaires. C'est pourquoi la connaissance de ce contrôle cellulaire du zinc est indispensable à une modélisation et à une compréhension du fonctionnement de la cellule
Zinc is an essential trace element. It is involved in many cellular processes because it is a cofactor of enzymes, nuc1ear factors and hormones. Therefore, is a very important component of cell viability Zinc homeostasis results from a coordinated regulation of different proteins: ZIP (uptake), metallothioneins (intracellular storage/trafficking), and ZnT (excretion). Using genomic databanks, we have analyzed and identified two novel SLC30 genes: SLC30A8 and SLC30A10. Zinc homeostasis is maintained by the action of these proteins, and their transcription is partly dependent of extra cellular zinc concentration. Ln case of zinc deficiency, ZnT-5, -5c and -7 genes are over-expressed. These transporters that we have localized in the Golgi apparatus could provide essential zinc to neo-synthesised proteins for their functionality. Furthermore, we showed that ZnT-8 is a zinc transporter specifie of pancreas and expressed in beta cells. ZnT -8 facilitates the accumulation of zinc from the cytoplasm into insulin vesic1es, and its transcription regulation is dependent, like insulin, of extra cellular glucose concentration. Zinc is implicated in all metabolic and structural aspects of the different cellular compartments. Therefore the cellular control of Zinc requires to be understood and is essential tot fear the cellular working

La recherche de mutations rares ou de remaniements chromosomiques, a permis récemment de formuler de nouvelles hypothèses concernant les mécanismes génétiques en cause dans l'autisme. De précédents travaux du laboratoire ont permis de mettre en évidence des mutations des Neuroligines 3 et 4, qui codent des molécules d'adhérence cellulaire neuronales. Mon travail de thèse s'est situé dans la continuité de ces travaux, poursuivant une stratégie de recherche de mutations rares, dans des gènes candidats. J'ai d'une part étudié le gène MAGI2, qui code un partenaire des Neuroligines, chez 96 sujets autistes. D'autre part, j'ai étudié les gènes de la voie de signalisation de la mélatonine chez des sujets autistes, et des sujets hyperactifs, afin de préciser les mécanismes et la spécificité de l'atteinte de la voie mélatoninergique. Par ailleurs mon travail a comporté une partie clinique de réévaluation de patients, qui portaient des mutations de SHANK3. L'étude des gènes MAGI2 et SHANK3 a montré que des mutations des partenaires des neuroligines peuvent avoir un rôle prépondérant dans l'apparition d'un syndrome autistique « isolé ». Néanmoins, le gène MAGI2 ne semble pas être particulièrement impliqué dans l'autisme, et pourrait être associé à un phenotype plus sévère. L'étude de la voie mélatoninergique confirme la probable prépondérance d'un défaut de synthèse de la mélatonine comme mécanisme d'atteinte de cette voie dans l'autisme, et que la voie mélatoninergique n'est pas spécifique à l'autisme. Enfin, les deux processus explorés dans ce travail de thèse pourraient jouer un rôle dans un processus commun: le maintien de l'homéostasie synaptique
The search for rare mutations or chromosomal rearrangements, has recently allowed new hypotheses regarding the genetic mechanisms involved in autism. Previous studies in the laboratory have allowed to show mutations of neuroligins 3 and 4, which encode neuronal cell adhesion molecules. My thesis was in the continuity of this work, pursuing a strategy of search of rare mutations in candidate genes. I studied the one hand MAGI2 gene, which encodes a partner of neuroligins, in 96 subjects with autism. On the other hand, I studied genes of the melatonin pathway in patients with autism, and ADHD subjects, to clarify the mechanisms and specificity of alterations of this pathway. Also my work has included clinical reevaluation of patients who carried mutations of SHANK3. The study of MAGI2 and SHANK3 genes showed that mutations in neuroligins partners may have a role in the emergence of an "isolated" autistic syndrome. However, the gene MAGI2 does not seem particularly involved in autism, and may be associated with a more severe phenotype. The study of the melatonin pathway confïrms the likely preponderance of a deficit of melatonin synthesis as a mechanism for alteration of this pathway in autism and that alteration of this pathway is not specific to autism. Finally, the two processes explored in this thesis could play a role in a common process; the maintenance of synaptic homeostasis