Rozprawy doktorskie na temat „Glioblastome – Génétique”

SETMAR est un gène chimérique constitué d’un domaine SET (codant des fonctions d’histone méthylase) et du domaine MAR (ayant conservé certaines fonctions de la transposase HsMAR1). Des études ont montré que les deux domaines sont biologiquement actifs et sont impliqués dans la stabilité et/ou dans la régulation de l’expression du génome humain. La littérature suggère que l’expression de SETMAR est plus forte dans les cellules cancéreuses que dans les cellules saines. Notre hypothèse de travail est que la protéine SETMAR est surexprimée en conditions pathologiques, permettant aux cellules de franchir les points de contrôle du cycle cellulaire, contribuant ainsi à augmenter l’instabilité génétique. Notre objectif est d’étudier la régulation de l’expression de SETMAR et son implication dans l’oncogenèse, gliale en particulier<br>SETMAR is a chimeric gene consisting of a SET domain (encoding methylase histone functions) and a MAR domain (having retained some of the of the HsMAR1 transposase functions). Studies have shown that the two domains are biologically active and are involved in the stability and / or in the regulation of the human genome expression. The literature suggests that SETMAR expression is higher in cancer cells than in normal cells. Our working hypothesis is that SETMAR protein is overexpressed in pathological conditions, allowing cells to overcome the cellular cycle checkpoints, helping to increase the genetic instability. Our goal is to study the regulation of the SETMAR expression and its involvement in oncogenesis, glial in particular

Les glioblastomes sont les tumeurs primitives cérébrales les plus agressives de l’adulte. Elles sont caractérisées par une importante néo-angiogenèse, conduisant au développement des anti-VEGF chez ces patients. L’objectif de cette thèse était d’identifier de potentiels marqueurs prédictifs de l’activité du bevacizumab et d’analyser le profil évolutif des facteurs de l’angiogenèse. En situation de récidive d’un gliome de haut grade, si aucun facteur clinique ne semble permettre d’identifier un sous-groupe de patients bénéficiant particulièrement du bevacizumab, les taux plasmatiques avant traitement de MMP2 et MMP9, inversement corrélés entre eux suggérant un rôle biologique distinct mais relié, semblent associés à la réponse, la survie sans progression et la survie globale de patients porteurs de gliome de haut grade traités à la récidive par bevacizumab. Le rôle potentiel de ces marqueurs est renforcé par la cinétique de leurs taux plasmatiques observé sous traitement, Nous avons mis en évidence des résultats superposables chez des patientes porteuses de cancers du sein inflammatoires traités par bevacizumab en situation néo-adjuvante, renforçant l’intérêt de ces marqueurs. Par ailleurs, l’analyse de la signature angiogénique tissulaire des glioblastomes nouvellement diagnostiqués et récidivants nous a permis d’observer une modification de l’expression des facteurs de l’angiogenèse avec un possible switch de la voie VEGFR2-HIF1α en faveur de la voie CXCL12-CXCR4 à la récidive. Ces différents résultats permettent d’ouvrir de nouvelles perspectives dans le ciblage de l’angiogenèse et dans l’approche thérapeutique de patients porteurs de gliome de haut grade<br>Glioblastomas are the most frequent and aggressive primary brain tumors for adult. They are characterized by a high angiogenesis leading to the evaluation of the bevacizumab. Our aim was to identify potential predictive biomarkers of bevacizumab activity and to analyze the evolutive profile of the angiogenic factors during the disease. If no clinical factor allows the identification of patient subgroup benefiting of bevacizumab, MMP2 and MMP9 plasma level at baseline were correlated to response, progression-free survival and overall survival of patients with recurrent high grade glioma treated by bevacizumab. Moreover, plasma levels of these markers change during treatment and significantly varied at the time of progression. We observed similar results for patients with inflammatory breast cancer treated with neoadjuvant bevacizumab, reinforcing the potential value of these prebiomarkers. In tumor tissue, while we did not observed changes in MMP2/MMP9 expression between the initial diagnosis and the recurrence post radio-chemotherapy, we observed a modification of the expression of angiogenic factors with a potential switch from the VEGFR2-HIF1α to the CXCL12-CXCR4 pathway. These results lead to new perspectives in angiogenic modulation and glioblastoma treatment

Les Glioblastomes représentent les tumeurs cérébrales primaires les plus fréquentes chez l'adulte. Nous avons mis en évidence le rôle du récepteur PPARß/delta dans le caractère tumoral des glioblastomes. Nous avons montré que l'activation de ce récepteur stimule la prolifération et la migration des cellules de glioblastome T98G. Nous avons également montré que l'activation de PPARß/delta induit l'expression du gène Siah-1L et que la surexpression de ce gène stimule la prolifération et la migration cellulaire des glioblastomes. Nous avons ensuite étudié la régulation du gène Siah-1L humain et montré que son expression est induite par PPARß/delta. Le clonage du promoteur de ce gène et l'étude de sa régulation a permis de montrer que son induction par PPARß/delta est médiée par un élément de réponse situé au niveau du promoteur<br>Glioblastoma represent the most frequent primary brain tumor in adults. We highlighted the role of PPARß/delta in glioblastoma tumorigenesis. We have shown that activation of this receptor stimulates proliferation and migration of glioblastoma cells T98G. We also showed that activation of PPARß/delta induces the expression of Siah-1L gene and that overexpression of Siah-1L stimulates cell proliferation and migration of glioblastoma cells. We also studied the regulation of Siah-1L gene and showed that its expression is induced by PPARß/delta. Cloning of Siah-1L gene promoter sequence and the study of its regulation showed that the induction of the expression of Siah-1L by PPARß/delta is mediated by a response element located at the promoter sequence

Le glioblastome, tumeur maligne des tissus astrocytaires, est de mauvais pronostic. Malgré un traitement standard invasif (chirurgie, radiochimiothérapie), la médiane de survie des patients n’excède pas 14 mois, essentiellement due à la récidive tumorale (radiorésistance des cellules résiduelles). L’hadronthérapie par ion carbone offre des atouts radiobiologiques importants : i) Balistique très précise (épargne les tissus sains), ii) Efficacité Biologique Relative (EBR) supérieure à la radiothérapie conventionnelle (augmentation de la dose possible), iii) Réponse indépendante de l’effet oxygène (tumeurs hypoxiques). L’hadronthérapie a montré des résultats prometteurs en traitement du glioblastome. Cependant, la rareté des centres offrant cette thérapeutique oblige les cliniciens à utiliser des marqueurs prédictifs de réponse à la radiothérapie conventionnelle afin de mieux orienter les patients diagnostiqués mauvais répondeur. L’homéostasie télomérique est connue pour moduler la radiosensibilité de différents types de cancer. Aussi, ce travail présente deux axes. D’une part, nous avons déterminé que la taille des télomères et l’expression de POT-1 (Protection Of Telomere1) peuvent être utilisées par les cliniciens pour diagnostiquer les patients mauvais répondeurs au traitement standard et ainsi les orienter vers l’hadronthérapie où leurs pronostics seraient meilleurs. D’autre part, nous avons montré qu’un traitement pharmacologique dirigé contre la télomérase (GRN163L, Geron Corp) pouvait améliorer les résultats de la radiothérapie conventionnelle sur un modèle in vivo de glioblastome humain chez la souris<br>Glioblastoma, high grade tumor of neuroepithelial tissue, is poor prognosis cancer. Despite an invasive standard treatment (surgery, radiochemotherapy), the overall survival of patients does not exceed 15 months, largely due to aggressive recurrence (radioresistance of residual cells). Hadrontherapy with Carbon ion beam have strong radiobiological arguments: i) high ballistic precision (save healthy tissues), ii) Relative Biological Efficiency (RBE) above conventional radiotherapy (dose escalation), iii) independent response of oxygen enhancement ratio (hypoxic tumors). Hadrontherapy have shown promising preliminary results in treatment of brain tumors. However, the rareness of health centers which purposed Handrontheray necessitates the use of predictive markers of resistance to conventional radiotherapy to address bad responder patient. Telomere homeostasis is also known to modulate radiosensitivity of different types of cancer. Thus, this work has two arms. On the one hand, we have shown that telomere length and POT1 (Protection Of Telomere1) level (RNA and protein) can be used by clinicians to diagnose bad responder of standard treatment and towards the hadrontherapy. On the other hand, we have shown that pharmacological treatment inhibitory of telomerase (GRN163L, Geron Corp) can improve the radiationinduced responses to conventional radiotherapy on human glioblastoma mice model

Les glioblastomes sont les tumeurs du système nerveux central les plus fréquentes et agressives. Avec une survie médiane inférieure à 2 ans, les thérapies actuelles restent inefficaces. Cet échec pourrait être expliqué en partie par l’existence de cellules particulières, les cellules souches cancéreuses. Ces cellules ont plusieurs propriétés communes aux cellules souches, qui les rendent résistantes aux traitements des glioblastomes. Il est donc important de pouvoir les identifier et les cibler pour pouvoir éliminer totalement la tumeur. L’objectif de ce travail de thèse est de déterminer des biomarqueurs des cellules souches de glioblastomes (gCSCs). Pour cela, nous avons d’abord développé une méthode générique permettant de prédire des antigènes spécifiques de cancer à partir de données de puces d’expression. Puis, nous avons travaillé sur les gCSCs, en identifiant des biomarqueurs potentiels, puis en étudiant les modifications du signal calcium, dérégulé dans de nombreux cancers<br>Glioblastoma are the most common and aggressive nervous system tumors. With a median overall survival smaller than 2 years, usual therapies remain inefficient. This failure could be explained in part by the existence of cancer stem cells. These cells share several properties with stem cells which make them resistant to glioblastoma treatments. This is why it is important to identify and target them to suppress the whole tumor.The goal of this thesis work is to identify glioblastoma stem cells (gCSCs) biomarkers. To this end, we first developed a global method predicting cancer antigens from microarray data. Then, by studying gCSCs we identified several putative biomarkers and generated insights concerning the calcium signals which are deregulated in numerous cancers

Ce projet de thèse se focalise sur l’étude du potentiel rôle mécanosensible de PARP3 dans un modèle de cancer agressif, le glioblastome. PARP3 fait partie de la famille des poly(ADP-ribose) polymérases, une famille de 17 membres qui catalysent l’ajout d’un ou de plusieurs résidus d’ADP-ribose sur des protéines acceptrices. Il s’agit d’une protéine identifiée dans la réparation de cassures double-brins de l’ADN, dans la différenciation cellulaire mais également dans la progression tumorale. Dans ce travail, nous révélons que la disruption de PARP3 (Crispr/Cas9) dans un modèle cellulaire de glioblastome (lignée U373-MG) modifie différents processus cellulaires mécanosensibles (prolifération, adhésion, migration) et la structure du cytosquelette d’actomyosine et de lamines. Par RNAseq, nous montrons que la disruption de PARP3 altère l’expression transcriptionnelle de différents gènes relatifs à des éléments mécanosensibles (voies de signalisation, matrice extracellulaire). Par microscopie à force atomique et par test de digestion à la MNase, nous révélons respectivement que l’absence de PARP3 modifie la rigidité nucléaire et la compaction de la chromatine. Des expériences d’immunofluorescence, nous ont permis de définir PARP3 comme une protéine mécanosensible car sa localisation subcellulaire est dépendante de la rigidité du support de culture. Enfin, ce travail offre également un large panel de données (ATACseq, RNAseq, protéomique) permettant une approche mécanistique du rôle de PARP3 dans la mécanoréponse cellulaire<br>This thesis project focuses on studying the potential mechanosensitive role of PARP3 in an aggressive cancer model, the glioblastoma. PARP3 belongs to the poly(ADP-ribose) polymerase family, a family of 17 members that catalyze the addition of one or more ADP- ribose residues onto acceptor proteins. PARP3 plays a role in DNA double-strand breaks repair, in cell differentiation, but also in tumor progression. In this work, we reveal that disrupting PARP3 (Crispr/Cas9) in a glioblastoma cell model (U373-MG cell line) impacts various mechanosensitive cellular processes (proliferation, adhesion, migration) as well as the structure of the actomyosin and lamin cytoskeletons. RNAseq studies reveals that the absence of PARP3 alters the transcriptional expression of various genes related to mechanosensitive elements (signaling pathways, extracellular matrix). By atomic force microscopy and MNase digestion tests, we respectively reveal that the absence of PARP3 modifies nuclear rigidity and chromatin compaction. By immunofluorescence experiments, we show that PARP3 is a mechanosensitive protein since its subcellular localization depends on the stiffness of the culture substrate. Finally, this work also provides a wide range of data (ATACseq, RNAseq, proteomics) that permit to progress on the mechanistic role of PARP3 in the mechanoresponse of tumour cells

La régulation de la neurogenèse embryonnaire implique de nombreux facteurs intrinsèques et extrinsèques délivrés avec une séquence temporelle stricte. Parmi ces facteurs, l’oxygène joue un rôle important dans la maintenance et la différenciation des cellules souches neurales (CSN). Dans ce contexte, le facteur de transcription HIF-1α, un des principaux intervenants dans les réponses adaptatives aux variations d’oxygène, pourrait jouer un rôle majeur dans la neurogenèse embryonnaire notamment au niveau des CSN. Dans ce but, nous avons évalué les conséquences de la perte de HIF-1α sur la neurogenèse en développant un modèle de souris transgénique Glast-YFP-CreERT2 ; HIF-1α flox/flox dans lequel HIF-1α est spécifiquement inhibé dans les cellules de la glie radiaire GLAST+, cellules faisant office de CSN chez l'embryon. Dans ce modèle HIF-1α CKO, une altération importante et rapide de l’angiogenèse corticale associée à une diminution de l’épaisseur du néocortex est observée. Ces changements ne sont pas corrélés à une mort cellulaire corticale mais sont associés à une diminution significative du nombre de mitoses et de la prolifération cellulaire au niveau des régions ventriculaire et sous-ventriculaire. Cette perte fonctionnelle de HIF-1α provoque également une diminution du nombre des cellules Sox2+ et Pax6+ et une augmentation des progéniteurs intermédiaires (Tbr2+). Ces données suggèrent donc que HIF-1α dans les CSN joue un rôle essentiel sur la neurogenèse embryonnaire. Parallèlement, j’ai participé à l’identification d’acteurs moléculaires impliqués dans la migration/invasion radio-induite des cellules souches de gliomes (CSG) précédemment mise en évidence au laboratoire. Nos résultats démontrent que la migration radio-induite des CSG est dépendante de HIF-1α qui intervient en régulant positivement la protéine JMY qui, de par son activité de polymérisation des filaments d’actine favorise la migration cellulaire. A l’instar des CSG, des expériences de vidéo-microscopie montrent que la migration radio-induite observée dans les CSN est également dépendante de HIF-1α. En conclusion, le développement d’un modèle transgénique knockout conditionnel inductible Glast-YFP-CreERT2 ; HIF-1αflox/flox nous a permis de caractériser l’importance de HIF-1α dans les CSN au cours de la neurogenèse. Son utilisation devrait également nous permettre d’identifier de nouveaux acteurs moléculaires dépendants de HIF-1α impliqués dans la migration radio-induite des CSN et des CSG. De par leurs caractéristiques communes avec les CSG, l’identification de ces nouveaux acteurs identifiés dans les CSN pourrait représenter de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’améliorer à plus long terme l’efficacité des traitements des patients atteints de glioblastomes par l’inhibition de mécanismes moléculaires stimulant la migration radio-induite des CSG au cours de la radiothérapie<br>The regulation of embryonic neurogenesis involves many intrinsic and extrinsic factors delivered within a strict temporal sequence. Among these factors, oxygen plays an important role in the maintenance and the differentiation of neural stem cells (NSCs) located in hypoxic areas of the brain. In this context, the transcription factor HIF-1α, one of the main contributors in adaptive responses to oxygen variations, could play a major role in embryonic neurogenesis. We evaluated the consequences of the loss of HIF-1α on neurogenesis by developing a model of transgenic mice Glast-YFP-CreERT2 ; HIF-1αflox/Flox in which HIF-1α is specifically inhibited in the GLAST+ radial glia cells, which play the role of neural stem cells in the embryo. In this model, the loss of HIF-1α caused a significant and rapid alteration of cortical angiogenesis associated with a decrease in the neocortex thickness. These changes were not correlated with cortical cell death but to a decrease in the number of mitoses and in cell proliferation in the ventricular and subventricular regions. HIF-1α inactivation caused a loss of Sox2 + and Pax6 + cells and an increase in intermediate progenitors (Tbr2+). These data suggest that HIF-1α plays an essential role in embryonic neurogenesis. At the same time, I participated in the identification of molecular actors involved in the radiation-induced migration of glioma stem cells (GSCs) which was previously demonstrated in our laboratory. Our data show that the radiation-induced migration of the GSCs is HIF-1α dependent and enhances JMY expression, a protein that has the ability to promote cell motility by enhancing the polymerization of actin filaments. Like the GSCs, in vitro video-microscopy experiments demonstrate that sublethal irradiation induced an HIF-1α dependent migration in NSCs. These in vitro results were confirmed in vivo in our transgenic model. In conclusion, the development of the transgenic inducible conditional knockout model Glast-YFP-CreERT2 ; HIF-1αflox/Flox allowed us to characterize the role of HIF-1α in NSCs during embryonic neurogenesis. This model will allow us to identify new HIF-1α dependent molecular actors involved in the radiation-induced migration of NSCs and GSCs. Due to their common characteristics with GSCs, the identification of the newly identified molecules in NSCs could represent new therapeutic targets destinated to improve in the longer term the efficacy of glioblastomas patients treatment. The inhibition of these new molecular mechanisms during radiotherapy may be effective to prevent the radiation-induced migration of GSCs

Les gliomes sont les tumeurs primitives les plus fréquentes du système nerveux central. Cette dernière décennie, l’apport de la biologie moléculaire a permis de mieux appréhender leurs comportements et de mieux préciser leur origine. Nous avons montré que le profil moléculaire des glioblastomes (grade IV dans la classification de l’OMS) et celui des astrocytomes pilocytiques (grade I dans la classification de l’OMS) différait notamment par l’expression d’un gène nommé KIAA 0510. La caractérisation de sa séquence nous a mené à nous intéresser à la Ténascine R, une glycoprotéine de la matrice extracellulaire impliquée dans les processus de migration et de différenciation cellulaire. Par ailleurs, l’expression de la Ténascine R pendant le développement, suggère son implication au cours de la corticogenèse.Dans le but de mieux comprendre l’origine des astrocytomes pilocytiques, notamment ceux de la région des voies optiques, nous avons mis en évidence au niveau du chiasma optique en développement des cellules de la glie radiaire à partir desquelles les astrocytomes pilocytiques des voies optiques pourraient dériver<br>Gliomas are the most frequently occurring primary tumors in the central nervous system. These last years, molecular biology technics allowed a better understanding of the gliomagenesis as well as behaviour of these tumors. We have previously shown that molecular profiling of glioblastomes (WHO grade IV) and pilocytic astrocytomas (WHO grade I) differed for KIAA 0510 gene expression. This sequence was fully characterized and shown to be part of the tenascin R gene encoding for an extracellular matrix glycoprotein involved in migration and cell differentiation. In addition, during development, Tenascin-R may be involved in corticogenesis.In parallel, in the developing optic chiasm, we evidenced cells with radial glial characteristics from which the hypothalamo-chiasmatic pilocytic astrocytomas could derive

Depuis l'émergence du concept de cellules souches cancéreuses (CSC), de telles cellules ont été isolées à partir de diverses tumeurs solides, dont les glioblastomes. Les CSC et les propriétés qui les caractérisent permettent de mieux comprendre l'hétérogénéité tumorale, ainsi que l'agressivité de certaines tumeurs et les récidives après traitement. Avec la mise en évidence des CSC, un nouveau paradigme est apparu dans le domaine de la thérapie anticancéreuse visant à cibler non seulement les cellules de la masse tumorale, mais également les CSC, plus résistantes aux chimio- et radiothérapies, mais aussi capables d'entrer en quiescence et de reformer la tumeur d'origine. L'isolement de CSC à partir des tumeurs, leur physiopathologie et la recherche de molécules capables de les détruire ou de les différencier afin de les rendre plus sensibles aux traitements mobilisent un nombre croissant d'équipes de recherche et certaines industries pharmaceutiques. Cette thèse présente un travail sur des CSC isolées de glioblastomes humains et s'inscrit dans la démarche énoncée ci-dessus.

La protéine L-isoaspartate (D-aspartate) méthyltransférase (PIMT) est une enzyme de réparation qui cible les protéines endommagées par l'accumulation de résidus L-isoaspartates anormaux. Les voies de signalisation qui contrôlent l'expression de la PIMT sont peu connues. D'autre part, la kinase mTOR est une protéine centrale pour les cellules. Elle contrôle la synthèse des protéines, le cycle cellulaire et l'intégration des voies de signalisation régulées par des facteurs de croissance et des nutriments. Or, nous démontrons dans cette étude que l'expression de la PIMT est dépendante de mTOR. En utilisant des analyses par immunobuvardage de type Western et RT-PCR, nous montrons qu'une concentration physiologique (0.02 µM) et élevée (1 µM) de l'inhibiteur spécifique de mTOR, la rapamycine, inhibe (40% et 70%) l'expression de la PIMT sans modulation du niveau d'ARNm. D'un autre côté, l'expression de la PIMT diminue lorsqu'on prive les cellules en glutamine, une condition expérimentale connue pour inhiber mTOR. De plus, nous montrons que l'inhibition de l'expression de la PIMT est dépendante de mTOR mais semble indépendante de la PI3K. Pour cela, nous avons employé des inhibiteurs de la PI3K (Wortmannin, LY294002), un analogue inactif (LY303511) qui n'agit pas sur la PI3K mais qui a été rapporté pour inhiber l'activité de mTOR, et un inhibiteur d'AKT. Enfin, nous avons utilisé un siRNA dirigé contre mTOR et montré que cela entraînait une diminution de 50% de l'expression de mTOR et de la PIMT. Ces résultats suggèrent fortement un mécanisme de régulation de la PIMT par mTOR. Sachant que mTOR est surexprimée dans certains cancers, l'inhibition de l'expression de la PIMT par l'inhibition de mTOR pourrait avoir une implication thérapeutique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Protéine L-isoaspartate (D-aspartate) méthyltransférase (PIMT), Mammalian target of rapamycin (mTOR), Glioblastomes, Inhibiteurs des kinases, Voies de signalisation.