Rozprawy doktorskie na temat „Genetic engineering”
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Шарапа, Р. В. "Genetic engineering". Thesis, Київський національний університет технологій та дизайну, 2018. https://er.knutd.edu.ua/handle/123456789/10803.
Pełny tekst źródłaПроняєва, Вікторія Едуардівна, Виктория Эдуардовна Проняева, Viktoriia Eduardivna Proniaieva i E. V. German. "Genetic engineering". Thesis, Вид-во СумДУ, 2011. http://essuir.sumdu.edu.ua/handle/123456789/22612.
Pełny tekst źródłaHalliwell, Catherine Mary. "Genetic engineering of metalloproteins". Thesis, University of Oxford, 1998. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.244551.
Pełny tekst źródłaKim, Valeria, Victoria Vostrikova, Nataliya Lepuha, Alina Isay i Vita Martynenko. "Danges of genetic engineering". Thesis, Молодь у глобалізованому світі: академічні аспекти англомовних фахових досліджень (англ. мовою) / Укл., ред. А.І.Раду: збірник мат. конф. - Львів: ПП "Марусич", 2011. - 147 с, 2011. http://er.nau.edu.ua/handle/NAU/20772.
Pełny tekst źródłaFang, Xiaopeng. "Engineering design using genetic algorithms". [Ames, Iowa : Iowa State University], 2007.
Znajdź pełny tekst źródłaRowe, Christine Janet. "Genetic engineering of penicillin biosynthesis". Thesis, University of Oxford, 1995. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.307008.
Pełny tekst źródłaBird, Louise E. "Genetic engineering of brewing yeast". Thesis, University of Oxford, 1992. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.259783.
Pełny tekst źródłaSutherland, John David. "Genetic engineering of penicillin biosynthesis". Thesis, University of Oxford, 1988. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.253132.
Pełny tekst źródłaMorgan, Nicholas. "Genetic engineering of cephalosporin biosynthesis". Thesis, University of Oxford, 1994. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.239322.
Pełny tekst źródłaLong, Paul Frederick. "Genetic engineering of polyketide biosynthesis". Thesis, University of Cambridge, 1999. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.624595.
Pełny tekst źródłaJacob, Claus. "Genetic engineering of redox-active enzymes". Thesis, University of Oxford, 1996. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.337606.
Pełny tekst źródłaZhang, Yingxiao. "Genetic Engineering of Rubber Producing Dandelions". The Ohio State University, 2016. http://rave.ohiolink.edu/etdc/view?acc_num=osu1480626773100647.
Pełny tekst źródłaDe, Lorenzo Andrea. "Genetic Programming Techniques in Engineering Applications". Doctoral thesis, Università degli studi di Trieste, 2014. http://hdl.handle.net/10077/9991.
Pełny tekst źródłaMachine learning is a suite of techniques that allow developing algorithms for performing tasks by generalizing from examples. Machine learning systems, thus, may automatically synthesize programs from data. This approach is often feasible and cost-effective where manual programming or manual algorithm design is not. In the last decade techniques based on machine learning have spread in a broad range of application domains. In this thesis, we will present several novel applications of a specific machine Learning technique, called Genetic Programming, to a wide set of engineering applications grounded in real world problems. The problems treated in this work range from the automatic synthesis of regular expressions, to the generation of electricity price forecast, to the synthesis of a model for the tracheal pressure in mechanical ventilation. The results demonstrate that Genetic Programming is indeed a suitable tool for solving complex problems of practical interest. Furthermore, several results constitute a significant improvement over the existing state-of-the-art. The main contribution of this thesis is the design and implementation of a framework for the automatic inference of regular expressions from examples based on Genetic Programming. First, we will show the ability of such a framework to cope with the generation of regular expressions for solving text-extraction tasks from examples. We will experimentally assess our proposal comparing our results with previous proposals on a collection of real-world datasets. The results demonstrate a clear superiority of our approach. We have implemented the approach in a web application that has gained considerable interest and has reached peaks of more 10000 daily accesses. Then, we will apply the framework to a popular "regex golf" challenge, a competition for human players that are required to generate the shortest regular expression solving a given set of problems. Our results rank in the top 10 list of human players worldwide and outperform those generated by the only existing algorithm specialized to this purpose. Hence, we will perform an extensive experimental evaluation in order to compare our proposal to the state-of-the-art proposal in a very close and long-established research field: the generation of a Deterministic Finite Automata (DFA) from a labelled set of examples. Our results demonstrate that the existing state-of-the-art in DFA learning is not suitable for text extraction tasks. We will also show a variant of our framework designed for solving text processing tasks of the search-and-replace form. A common way to automate search-and-replace is to describe the region to be modified and the desired changes through a regular expression and a replacement expression. We will propose a solution to automatically produce both those expressions based only on examples provided by user. We will experimentally assess our proposal on real-word search-and-replace tasks. The results indicate that our proposal is indeed feasible. Finally, we will study the applicability of our framework to the generation of schema based on a sample of the eXtensible Markup Language documents. The eXtensible Markup Language documents are largely used in machine-to-machine interactions and such interactions often require that some constraints are applied to the contents of the documents. These constraints are usually specified in a separate document which is often unavailable or missing. In order to generate a missing schema, we will apply and will evaluate experimentally our framework to solve this problem. In the final part of this thesis we will describe two significant applications from different domains. We will describe a forecasting system for producing estimates of the next day electricity price. The system is based on a combination of a predictor based on Genetic Programming and a classifier based on Neural Networks. Key feature of this system is the ability of handling outliers-i.e., values rarely seen during the learning phase. We will compare our results with a challenging baseline representative of the state-of-the-art. We will show that our proposal exhibits smaller prediction error than the baseline. Finally, we will move to a biomedical problem: estimating tracheal pressure in a patient treated with high-frequency percussive ventilation. High-frequency percussive ventilation is a new and promising non-conventional mechanical ventilatory strategy. In order to avoid barotrauma and volutrauma in patience, the pressure of air insufflated must be monitored carefully. Since measuring the tracheal pressure is difficult, a model for accurately estimating the tracheal pressure is required. We will propose a synthesis of such model by means of Genetic Programming and we will compare our results with the state-of-the-art.
XXVI Ciclo
1984
Zainuddin. "Genetic transformation of wheat (Triticum aestivum L.)". Title page, Contents and Abstract only, 2000. http://web4.library.adelaide.edu.au/theses/09APSP/09apspz21.pdf.
Pełny tekst źródłaConradie, E. C. (Elizabeth Cornelia). "Promotor engineering in Saccharomyces cerevisiae for transcriptional control under different physiological conditions". Thesis, Stellenbosch : University of Stellenbosch, 2011. http://hdl.handle.net/10019.1/16512.
Pełny tekst źródłaENGLISH ABSTRACT: To manipulate recombinant microorganisms for industrial processes, controllable genetic systems are needed that can coordinate expression of recombinant metabolic pathways. All components are sensitive to change and thus putative targets for modification and genetic elements and regulatory systems need to be understood and determined. Central in gene regulation is the transcription activators that mediate gene transcription mechanisms by binding to promoters in response to environmental signals. Promoter engineering entails the modification of transcription factors and their target promoters. In this study, a metabolic control system in Saccharomyces cerevisiae was constructed that would allow induction in response to physiological environment, specifically hypoxia and low temperature conditions. Two approaches were undertaken to find such a system. Firstly, a bi-directional reporter gene cloning vector was designed to search for novel hypoxiainducible promoters. Secondly, a transcription regulatory circuit was built, consisting of an inducible transcription regulator and promoter with a reporter gene through which it mediates transcription. Advantage was taken of the modular nature of proteins and functional domains originating from different transcriptional proteins were combined. A search for promoter elements sensitive to hypoxia from a S. cerevisiae genomic DNA (gDNA) library, using a bi-directional cloning vector, did not yield highly inducible promoters. It was concluded that a multitude of signals overlap, rendering genetic induction difficult to control. A synthetic regulatory system would minimize the impact of these multiple interactions. Such a genetic circuit was constructed, consisting of a chimeric transcription activator and a target fusion promoter. The chimeric transcription activator consisted of the GAL4 DNA binding domain, ADR1 TADIII transactivation domain and three domains of the MGA2 regulatory protein. The functional domains of Mga2p responsible for unregulated expression (at high basal levels) under both aerobic and hypoxia conditions were located, as well as a further upregulation under low temperature, and were mapped to the Nterminal and mid-Mga2p regions. A target fusion promoter consisting of a partial GAL10/1 promoter sequence and a Trichoderma reesei core xyn2 promoter were constructed as target for this chimeric transactivator. This synthetic promoter was fused to the T. reesei xyn2 open reading frame encoding for a readily assayable β-xylanase activity. Both the chimeric transactivator and fusion promoter-reporter gene cassettes were expressed from the same episomal plasmid, named pAR. Transformed into S. cerevisiae Y294, this regulatory system induced transcription under aerobic and hypoxia conditions. Furthermore, the reporter gene expression was upregulated by the chimeric transactivator at low temperatures. The chimeric transactivator mediated a seven-fold induction of the reporter gene under aerobic conditions in S. cerevisiae Y294 when transformed with plasmid AR. A two- to three-fold induction at 23ºC was reported under anaerobic conditions, relative to a reference strain expressing a transcription activator without the Mga2p domains. At 30ºC, a two- to three-fold induction under aerobic conditions and similar induction under oxygen-limited conditions were observed. Replacing the reporter gene with your favorite gene (for example a recombinant enzyme) and incorporating such a pAR system into a recombinant yeast should induce expression of the chosen gene under low temperatures, both aerobic and anaerobically (thus creating a controllable system). The system also has wider application in identifying other transcription factors’ signal-sensitive domains. The design of this system provides the ability to add a linker to a transactivator and to either create specific signal sensitivity or relieve the regulator of its signal dependence. It creates an easy system for assessing other transactivators and their domains with unknown functions and thus provides a ”workhorse and prospector in one”.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Vir die manipulering van rekombinante mikroörganismes vir industriële prosesse word beheerbare genetiese stelsels benodig om gekoördineerde uitdrukking van rekombinante metaboliese weë teweeg te bring. Alle komponente van sulke stelsels is sensitief vir verandering en genetiese elemente en reguleerbare sisteme moet dus deeglik verstaan of bepaal word. Sentraal tot geenregulering is die transkripsie-aktiveerders wat geentranskripsie beheer deur aan promoters te bind in reaksie op eksterne omgewingsfaktore. Promotoringenieurswese behels wysigings van transkripsiefaktore en hul teikenpromotors. In hierdie studie is 'n genetiese beheerstelsel vir Saccaromyces cerevisiae ontwikkel wat induksie in reaksie tot spesifieke fisiologiese omgewingreaksies, naamlik hipoksie- en lae temperatuur, toelaat. Twee benaderings is gevolg: eerstens is ‘n tweerigting verklikker-geen vektor ontwikkel en gebruik om vir unieke induseerbare hipoksie-promoters te soek. Tweedens is ‘n transkripsie reguleringstelsel gebou wat uit ‘n induseerbare transkripsiereguleerder and promotor met ‘n verklikkergeen bestaan, waardeur transkripsie bemiddel kan word. Hierdie benadering benut die modulêre onderbou van proteïene en funksionele domeine afkomstig vanaf verskillende transkripsiefaktore is gekombineer. 'n Soektog na hipoksie-sensitiewe promotors vanuit 'n Saccharomyces cerevisiae-genoom- DNA (gDNA), deur van ‘n tweerigting verklikker-vektor gebruik te maak, het ongelukkig nie hoogs-induseerbare promotors opgelewer nie. Die gevolgtrekking was dat ‘n veelvoud van seine met mekaar oorvleuel en die beheer van genetiese induksie dus bemoeilik. Die ontwikkeling van ‘n sintetiese regulering-sisteem kan die impak van die veelvuldige interaksies verminder. Vir dié doel is ‘n sintetiese reguleringstelsel ontwerp, bestaande uit ‘n chimeriese transkripsie-aktiveerder met ‘n teiken fusie-promotor. Die chimeriese transaktiveerder bestaan uit die GAL4 DNA bindingsdomein, die ADR1 TAD III transaktiveringsdomein en drie domeine van die Mga2 reguleringsproteïen. In die studie is die funksionele domeins van Mga2p betrokke by lae temperatuur-respons en ongereguleerde uitdrukking (teen hoë basale vlakke) onder beide aërobiese en anaërobiese toestande aangedui en is tot die N-terminaal en middel-Mga2p areas gekarteer. ‘n Teiken-fusie-promoter, bestaande uit 'n gedeeltelike GAL1/10 DNA promotoropeenvolging en ‘n Trichoderma reesei kern xyn2-promoter, is as teiken vir hierdie chimeriese transaktiveerder saamgestel. Hierdie sintetiese promotor is aan die T. reesei xyn2 oopleesraam, wat vir ‘n maklik meetbare β-xylanase aktiwiteit kodeer, gekoppel. Beide die chimeriese transaktiveerder and fusie-promoter-verklikker-geenkaset word vanaf dieselfde episomale plasmied, bekend as pAR, uitgedruk. Hierdie reguleringsisteem induseer transkripsie onder aërobiese en hipoksie toestande in S. cerevisiae Y294. Verder word die verklikkergeen se uitdrukking deur die chimeriese transaktiveerder by lae temperature verhoog. Die chimeriese transaktiveerder induseer ‘n sewe-voudige induksie van die verklikkergeen onder aërobiese toestande by 23ºC vanaf die pAR-stelsel in S. cerevisiae Y294. ‘n Twee- tot drie-voudige induksie teen 23ºC is onder hipoksie toestande gevind, relatief tot induksievlakke van ‘n verwysingstam met ‘n transaktiveerder sonder die Mga2 domeine. By 30ºC is ‘n twee- tot drie-voudige induksie onder aërobiese en lae suurstofvlakke waargeneem. Deur die verklikker geen met ‘n jou-gunsteling-geen te vervang (bv. ‘n rekombinante ensiem) en so 'n pAR-sisteem in ‘n rekombinante gis te inkorporeer, word uitdrukking onder lae temperature onder beide aërobiese- en anaërobiese toestande geïnduseer (en sodoende word ‘n reguleerbare sisteem geskep). Die sisteem het wyer toepassing om sein-sensitiewe domeine van ander transkripsiefaktore te identifiseer. Die ontwerp van die stelsel maak dit moontlik om 'n skakel tot die transaktiveerder by te voeg wat óf sensitiwiteit tot 'n spesifieke sein skep, óf die reguleerder vanaf seinafhanklikheid verlos. So word ‘n bruikbare stelsel vir die bestudering van ander transaktivators en hul domeine met onbekende funksie geskep – ‘n “werksesel en prospekteerder in een”.
au, dweston@ncwa com, i Delys Eleanor Weston. "Democracy and political economy of genetic engineering". Murdoch University, 2007. http://wwwlib.murdoch.edu.au/adt/browse/view/adt-MU20070327.143205.
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Pełny tekst źródłaShyshenko, V., Нiна Володимирiвна Мальована, Нина Владимировна Малеванная i Nina Volodymyrivna Malovana. "Modern achievements of genetic engineering and biotechnologies". Thesis, Sumy State University, 2020. https://essuir.sumdu.edu.ua/handle/123456789/78061.
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by Jason C. Miller.
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Pełny tekst źródłaGundllapalli, Sarath B. "Genetic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient polysaccharide utilisation /". Link to online version, 2005. http://hdl.handle.net/10019.1/1479.
Pełny tekst źródłaMück-Häusl, Martin Andreas. "Genetic engineering of adenoviral vectors for improved therapeutic applications". Diss., lmu, 2011. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:19-138269.
Pełny tekst źródłaHe, Zhong. "Modifying xenogeneic immune recognition and engraftment by genetic engineering /". Stockholm, 2005. http://diss.kib.ki.se/2005/91-7140-353-1/.
Pełny tekst źródłaFonseca, Carlos Manuel Mira da. "Multiobjective genetic algorithms with application to control engineering problems". Thesis, University of Sheffield, 1995. http://etheses.whiterose.ac.uk/1887/.
Pełny tekst źródłaTodd, David. "Multiple criteria genetic algorithms in engineering design and operation". Thesis, University of Newcastle Upon Tyne, 1997. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.362410.
Pełny tekst źródłaGossner, Anton Gerhard. "Bio-engineering and genetic manipulation of ovine interleukin-2". Thesis, University of the West of England, Bristol, 1998. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.297877.
Pełny tekst źródłaGundllapalli, Sarath Babu. "Genetic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient polysaccharide utilisation". Thesis, Stellenbosch : University of Stellenbosch, 2005. http://hdl.handle.net/10019.1/1479.
Pełny tekst źródłaBiomass is the sole foreseeable sustainable source of organic fuels, chemicals and materials. It is a rich and renewable energy source, which is abundant and readily available. Primary factors motivating the use of renewable enrgy sources include the growing concern over global climate change and the drastic depletion of non-renewable resources. Among various forms of biomass, cellulosic feedstocks have the greatest potential for energy production from. The biggest technological obstacle to large-scale utilisation of cellulosic feedstocks for the production of bioethanol as a cost-effective alternative to fossil fuels is the general absence of low-cost technology for overcoming the recalcitrance of cellulosic biomass. A promising strategy to overcome this impediment involves the production of cellulolytic enzymes, hydrolysis of biomass and fermentation of resulting sugars to ethanol in a single process step via a single microorganism or consortium. Such “consolidated bioprocessing” (CBP) offers very large cost reductions if microorganisms, such as the yeast Saccharomyces cerevisiae, can be developed that possess the required combination of efficient cellulose utilisation and high ethanol yields. Cellulose degradation in nature occurs in concert with a large group of bacteria and fungi. Cellulolytic microorganisms produce a battery of enzyme systems called cellulases. Most cellulases have a conserved tripartite structure with a large catalytic core domain linked by an O-glycosylated peptide to a cellulose-binding domain (CBD) that is required for the interaction with crystalline cellulose. The CBD plays a fundamental role in cellulose hydrolysis by mediating the binding of the cellulases to the substrate. This reduces the dilution effect of the enzyme at the substrate surface, possibly by helping to loosen individual cellulose chains from the cellulose surface prior to hydrolysis. Most information on the role of CBDs has been obtained from their removal, domain exchange, site-directed mutagenesis or the artificial addition of the CBD. It thus seems that the CBDs are interchangeable to a certain degree, but much more data are needed on different catalytic domain-CBD combinations to elucidate the exact functional role of the CBDs. In addition, the shortening, lengthening or deletion of the linker region between the CBD and the catalytic domain also affects the enzymatic activity of different cellulases. Enzymes such as the S. cerevisiae exoglucanases, namely EXG1 and SSG1, and the Saccharomycopsis fibuligera β-glucosidase (BGL1) do not exhibit the same architectural domain organisation as shown by most of the other fungal or bacterial cellulases. EXG1 and SSG1 display β-1,3-exoglucanase activities as their major activity and exhibit a significant β- 1,4-exoglucanase side activity on disaccharide substrates such as cellobiose, releasing a free glucose moiety. The BGL1 enzyme, on the other hand, displays β-1,4-exoglucanase activity on disaccharides. In this study, the domain engineering of EXG1, SSG1 and BGL1 was performed to link these enzymes to the CBD2 domain of the Trichoderma reesei CBHII cellobiohydrolase to investigate whether the CBD would be able to modulate these non-cellulolytic domains to function in cellulose hydrolysis. The engineered enzymes were constructed to display different modular organisations with the CBD, either at the N terminus or the C terminus, in single or double copy, with or without the synthetic linker peptide, to mimic the multi-domain organisation displayed by cellulases from other microorganisms. The organisation of the CBD in these recombinant enzymes resulted in enhanced substrate affinity, molecular flexibility and synergistic activity thereby improving their ability to act and hydrolyse cellulosic substrates, as characterised by adsorption, kinetics, thermostability and scanning electron microscopic (SEM) analysis. The chimeric enzyme of CBD2-BGL1 was also used as a reporter system for the development and efficient screening of mutagenised S. cerevisiae strains that overexpress CBD-associated enzymes such as T. reesei cellobiohydrolase (CBH2). A mutant strain WM91 was isolated showing up to 3-fold more cellobiohydrolase activity than that of the parent strain. The increase in the enzyme activity in the mutant strain was found to be associated with the increase in the mRNA expression levels. The CBH2 enzyme purified from the mutant strain did not show a significant difference in its characteristic properties in comparison to that of the parent strain. In summary, this research has paved the way for the improvement of the efficiency of the endogenous glucanases of S. cerevisiae, and the expression of heterologous cellulases in a hypersecreting mutant of S. cerevisiae. However, this work does not claim to advance the field closer to the goal of one-step cellulose processing in the sense of technological enablement; rather, its significance hinges on the fact that this study has resulted in progress towards laying the foundation for the possible development of efficient cellulolytic S. cerevisiae strains that could eventually be optimised for the one-step bioconversion of cellulosic materials to bioethanol.
Cantor, Michael Nathaniel. "Rational engineering in synthetic biology : a genetic pulse generator /". May be available electronically:, 2009. http://proquest.umi.com/login?COPT=REJTPTU1MTUmSU5UPTAmVkVSPTI=&clientId=12498.
Pełny tekst źródłaBellan, Alessandra. "Genetic engineering approaches to increase microalgae light use efficiency". Doctoral thesis, Università degli studi di Padova, 2018. http://hdl.handle.net/11577/3427159.
Pełny tekst źródłaSi stima che nei prossimi 50 anni la popolazione mondiale aumenterà fino a raggiungere i 9-10 miliardi di persone. Un incremento di queste proporzioni porterà inevitabilmente ad una maggior richiesta di produzione di cibo ed energia. L’attuale metodo di approvvigionamento di queste risorse non è sostenibile in quanto è la causa principale dell’aumento delle emissioni di CO2 in atmosfera, le quali stanno alimentando il cambiamento climatico. Nella conferenza che si è tenuta a Parigi nel 2015 sul cambiamento climatico è emersa chiaramente la necessità di un cambio di tendenza per poter evitare il collasso ambientale, che sta già portando alla desertificazione di molti terreni un tempo fertili, all’estinzione di massa di specie animali e vegetali e all’acidificazione degli oceani. Per invertire questa tendenza quindi bisogna rivedere il nostro sistema di produzione alimentare ed energetica. Tra le possibilità al vaglio le microalghe stanno emergendo come un interessante candidato sia per la produzione di energia che di cibo. Infatti le microalghe sono organismi fotosintetici che producono biomassa fissando CO2. Molte specie sono ricche di proteine e lipidi utilizzabili come nutrimento o come matrice per la produzione di biodiesel. Tuttavia nonostante le loro potenzialità le microalghe non sono ancora utilizzate su larga scala perché la loro produzione continua ad aver un costo troppo elevato a fronte di produttività insufficienti. Uno dei maggiori limiti è legato al calo di efficienza fotosintetica che si registra nel passaggio in scala industriale, la quale impatta negativamente sulla crescita delle microalghe e quindi sulla produzione di biomassa. Tuttavia bisogna tenere conto che ad ora si stanno coltivando ceppi wild type, che quindi si sono evoluti ed adattati per crescere al meglio in un ambiente naturale estremamente diverso da quello industriale. Perciò come si è fatto con la domesticazione delle piante per uso alimentare, sarà necessario un passaggio di ingegnerizzazione dei ceppi parentali per ottenere dei nuovi ceppi più adatti alle condizioni industriali e quindi più produttivi una volta coltivati su larga scala. Ci sono svariate specie algali al vaglio come candidati per la produzione alimentare ed energetica, ma questo lavoro si focalizza principalmente su Nannochloropsis gaditana. Questa è una microalga marina capace di accumulare sia lipidi sia molecole di interesse per la nutraceutica come il β-carotene. Dopo una introduzione generale, nel capitolo 2 viene descritto l’ottenimento di una collezione di mutanti casuali generati attraverso due diversi approcci di mutagenesi. Il primo è un approccio di mutagenesi chimica, che utilizza come agente mutageno l’etil-metano-sulfonato (EMS) e il secondo è un approccio di mutagenesi inserzionale che sfrutta l’inserimento casuale nel genoma di DNA esogeno che conferisca al ceppo la resistenza per la zeocina. Da questa collezione si sono isolati solo i mutanti alterati nell’apparato fotosintetico utilizzando cicli progressivi di selezione attraverso misure di fluorescenza in vivo. In Appendice 1 è riportata la collaborazione nella valutazione delle produttività di uno dei mutanti ottenuti con EMS (E2), in condizioni di semi continuo che mimano una coltura industriale. E2 è stato selezionato perché presentava un ridotto contenuto di clorofilla abbinato anche ad una riduzione del numero di proteine antenna legate al PSII. Infatti uno dei maggiori problemi su scala industriale è la scarsa penetrazione della luce, dovuta alle densità elevate raggiunte dalle colture, la quale ha un impatto negativo sulla produzione. Un mutante con una ridotta capacità di assorbimento della luce può essere vantaggioso perché migliora la distribuzione della luce nel sistema con un conseguente incremento nella crescita. Questo lavoro infatti dimostra come E2 sia più produttivo del WT, ma sottolinea anche che le condizioni di coltura sono fondamentali per utilizzare al meglio il potenziale del ceppo mutato. La maggior parte di questa tesi è stata poi dedicata alla caratterizzazione di due ceppi promettenti ottenuti per mutagenesi inserzionale. Il primo è I29 ed è presentato nel capitolo 3. Questo mutante è stato selezionato perché presentava un ridotto contenuto di clorofilla anche se il numero di proteine antenna per PSII è analogo al WT. In beuta la coltura di I29 mostra un 20% in meno di clorofilla rispetto al WT, che si accompagna con un trasporto elettronico che si satura ad intensità di luce maggiori (maggiore ETR electron transport rate). Il sito di inserzione della cassetta è stato identificato come singolo, ma sembra non influenzare i livelli di trascrizione dei geni vicini. Il completo ri-sequenziamento del genoma ha evidenziato una mutazione puntiforme in un gene chiave nella biosintesi della clorofilla, che può essere un promettente candidato per giustificare il fenotipo di I29. Di questo mutante si è valuta anche la produttività e si è visto un incremento del 14% rispetto al WT. Un lavoro analogo è stato fatto per il mutante I48, isolato sempre nel capitolo 2. Questo mutante ha una importante riduzione nell’attivazione dei meccanismi di dissipazione dell’eccesso di energia luminosa come calore (NPQ). Non è stato possibile individuare il sito di inserzione a causa della presenza di inserzioni multiple in tandem, perciò anche in questo caso il genoma è stato ri-sequenziato. Il sequenziamento ha evidenziato nuovamente la presenza di mutazioni puntiformi dovute al protocollo di trasformazione. Tra queste è emersa una mutazione nel gene codificante per la proteina LHCX1. Questa è una proteina antenna coinvolta nella risposta allo stress luminoso, il cui ruolo chiave nella risposta rapida del NPQ è già stato evidenziato in altre specie come Phaeodactylum tricornutum. Il mancato accumulo di questa proteina è stato confermato attraverso Western Blot. Si è valutata la capacità di questo ceppo di crescere in diverse condizioni luminose. È emerso che I48 è in grado di crescere anche in alta luce nonostante questa riduzione nella risposta di NPQ. L’ultima parte della caratterizzazione ne ha valutato invece la produttività. Infatti una riduzione nel NPQ può essere vantaggiosa in condizioni industriali in quanto in una coltura densa solo lo strato esterno è esposto a luci intense. Perciò un NPQ ridotto può evitare una dissipazione indesiderata di energia negli strati più interni dove la luce è già limitante. I48 ha mostrato un aumento di produttività del 24% rispetto al WT, ma come già discusso in Appendice 1 questo è strettamente dipendente dalle condizioni di coltura. Nelle diatomee il NPQ è stato associato non solo alla risposta ad alta luce ma anche a quella alla luce fluttuante (FL), una condizione facilmente sperimentabile nei sistemi di coltura all’esterno. Abbiamo sfruttato questo mutante con una marcata riduzione nel NPQ per verificare qual è l’impatto di questi meccanismi nella risposta di N.gaditana alla luce FL. Nel capitolo 5 quindi è stato messo a punto un esperimento in cui le colture sono state esposte ad una intensità luminosa di 150 μmol di fotoni m-2s-1, i quali nel controllo sono somministrati in modo costante, mentre nelle FL sono frutto di una combinazione di una bassa luce di base inframmezzata da flash di alta luce, dati con frequenze e durate diverse. Il risultato è un forte impatto delle FL sulla crescita del WT. Il difetto di crescita è proporzionale alla frequenza dei flash ed è più marcato alle frequenze maggiori. Tuttavia I48 non mostra una sensibilità maggiore a questo genere di trattamento rispetto al WT, perciò il NPQ non sembra essere coinvolto in modo significativo nella risposta di N.gaditana alla luce FL. Approfondite analisi sulla funzionalità dell’apparato fotosintetico hanno evidenziato che l’attività del PSII non è compromessa, bensì è il PSI ad essere pesantemente inattivato. Questo risultato suggerisce che i trasporti alternativi attorno al PSI, che in altri organismi fotosintetici sono attivati per evitare la sovraeccitazione del PSI, non sono così efficienti in N.gaditana. I primi 5 capitoli quindi hanno evidenziato il potenziale dell’ingegnerizzazione delle microalghe per trovare ceppi più produttivi rispetto al WT. Gli esperimento in FL in particolare non solo hanno aiutato a chiarire il ruolo del NPQ in questa microalga, ma tenendo conto che la FL è una condizione facilmente trovabile in sistemi industriali che utilizzano la luce del sole come fonte di energia, può fornire un punto di partenza per trovare nuovi targets di ingegnerizzazione per aumentare la produttività. Inizialmente ci siamo focalizzati su un approccio inserzionale, perché avrebbe dovuto facilitare l’identificazione dei geni responsabili del fenotipo. In questo caso la frequente presenza di inserzioni in tandem e l’accumulo di mutazioni puntiformi ha vanificato questo vantaggio, perciò strategie alternative sono in fase di ottimizzazione per il futuro. Nel capitolo 6 abbiamo invece testato l’approccio di mutagenesi chimica ed il protocollo di selezione, ottimizzati per N.gaditana, su un’altra specie: Scenedesmus obliquus, per valutare se questo metodo può essere applicato con successo a qualsiasi specie di interesse. Almeno un ceppo promettente è stato isolato (SOB17). In questo lavoro si è messo a punto anche un diverso sistema di valutazione delle produttività, attraverso un pannello messo in coltura in continuo. Infatti la geometria del pannello migliora la distribuzione della luce, rendendola più omogenea rispetto ad altri sistemi come la bottiglia. Inoltre la coltura in continuo fornisce una coltura stabile che ha una produzione continua di biomassa. Questa coltura ha avuto una buona stabilità nel tempo, arrivando ad essere, mantenuta per più di 30 settimane e SOB17 ha mostrato anche una maggiore produttività in una delle condizioni testate, anche se di nuovo come si era visto per N.gaditana, le condizioni di coltura sono fondamentali per ottenere il miglior risultato da ogni ceppo. In aggiunta all’Appendice 1 descritta prima, altre due appendici sono incluse nella tesi. Queste sono il risultato di due diverse collaborazioni in cui gli approcci sperimentali messi a punto in questa tesi sono stati applicati con fini diversi. In Appendice 2 è riportato il lavoro già pubblicato “Genetic Engineering of algae photosynthetic productivity using mathematical models” che descrive lo sviluppo di un modello matematico per valutare i fattori che influenzano la produttività delle microalghe nei fotobioreattori. Il modello è in grado di predire gli effetti di modifiche genetiche in un contesto di produzione industriale, fornendo uno strumento per identificare i genotipi più vantaggiosi in termini di produttività. In Appendice 3 è riportata una collaborazione con la Prof.ssa Angela Falciatore (Diatom Functional Genomics team, UPMC-Paris). In questo lavoro è stato adattato il protocollo di selezione ottimizzato per N.gaditana per trovare fenotipi fotosintetici in una collezione di mutanti di Phaeodactylum tricornutum, ottenuti per RNA interference così da modulare l’espressione di diversi fattori di trascrizione. Con questo approccio è stato possibile stabilire alcune promettenti correlazioni tra fenotipo e modulazione di una determinata classe di fattori di trascrizione, che ora saranno validati con un’analisi approfondita del fenotipo di questi mutanti e dei livelli di trascrizione in questi ceppi mutati.
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