Rozprawy doktorskie na temat „Développement mammaire”

Le système lymphatique est un réseau vasculaire unidirectionnel transportant la lymphe qui permet le drainage des fluides interstitiels, le transport des lipides intestinaux, ainsi que la surveillance et la tolérance immunitaire. Néanmoins, le système lymphatique est impliqué dans de nombreuses pathologies et particulièrement dans la progression tumorale. En effet, le système lymphatique favorise la dissémination des métastases qui sont acheminées par les vaisseaux lymphatiques jusqu'aux organes distants. Plus récemment, le système lymphatique a été identifié comme un régulateur clé des réponses immunitaires lors du développement tumoral. Le système immunitaire est indispensable à la détection des tumeurs et à l'établissement de réponses lymphocytaires anti-tumorales. Cependant, lors des stades de développement tumoral avancés, des mécanismes d'échappement immunitaire se mettent en place en faveur de la croissance des tumeurs. Ces mécanismes sont notamment médiés par les tumeurs elles-mêmes mais aussi par différents acteurs de l'environnement tumoral. Le système lymphatique est un de ces acteurs, particulièrement retrouvé dans l'environnement tumoral mammaire. Les adénocarcinomes mammaires à des stades avancés répondent aux immunothérapies qui ciblent les points de contrôle immunitaire responsables de l'échappement immunitaire. En effet, le système lymphatique potentialise la réponse des tumeurs à ces immunothérapies car il joue un rôle double dans l'immunomodulation en contexte tumoral. Les vaisseaux lymphatiques sont capables de recruter les lymphocytes T dans la tumeur pour stimuler la surveillance immune anti-tumorale mais sont aussi capables d'engendrer des mécanismes immunosuppresseurs des lymphocytes T par l'expression de points de contrôle immunitaire. Durant de ma thèse, j'ai donc étudié les mécanismes immunomodulateurs du système lymphatique lors du développement des tumeurs mammaires. J'ai observé que le système lymphatique contrôle le passage de la surveillance immune vers l'immunosuppression, particulièrement induite par les ligands du point de contrôle immunitaire TIGIT. J'ai ainsi montré que l'activation des vaisseaux lymphatiques tumoraux entraine la surexpression du ligand Nectine-2 qui va inhiber les lymphocytes T surexprimant TIGIT. Cela va alors réduire la réponse des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques afin de favoriser la croissance tumorale
The lymphatic system is a unidirectional vascular network transporting lymph, enabling drainage of interstitial fluids, transport of intestinal lipids, and also immune monitoring and tolerance. Nevertheless, the lymphatic system is involved in many pathologies, and particularly in tumor progression. Indeed, the lymphatic system promotes the metastatic spread, carried by lymphatic vessels to distant organs. More recently, the lymphatic system has been identified as a key regulator of immune responses during tumor development. The immune system is essential for tumor detection and establishment of anti-tumor lymphocyte responses. However, at advanced stages of tumor development, immune escape mechanisms are established in favor of tumor growth. These mechanisms are mediated not only by tumors themselves, but also by various players in the tumor environment. The lymphatic system is one of these players, particularly found in breast tumor environment. Advanced-stage breast adenocarcinomas respond to immunotherapies that target immune checkpoints responsible for immune escape. Indeed, the lymphatic system potentiates tumor response to these immunotherapies, playing a dual role in immunomodulation in the tumor context. Lymphatic vessels are able to recruit T cells to the tumor site to stimulate anti-tumor immune surveillance, but are also able to generate T cell immunosuppressive mechanisms through the expression of immune checkpoints. During my thesis, I therefore studied immunomodulatory mechanisms of the lymphatic system during mammary tumor development. I observed that the lymphatic system controls a switch from immune surveillance to immunosuppression, particularly induced by ligands of TIGIT immune checkpoint. I have shown that activation of tumor lymphatic vessels leads to overexpression of Nectin-2, which inhibits T cells overexpressing TIGIT. This in turn reduces cytotoxic CD8+ T cell responses to promote tumor growth

L’alimentation peut influencer le développement mammaire des femmes et compromettre la santé de la descendance. La leptine pourrait jouer un rôle majeur dans ces processus. Nous avons montré que chez la lapine, la synthèse mammaire de leptine était peu élevée en gestation puis augmentait en lactation, et que l’allaitement par une mère hyperadipeuse potentialisait les effets d’un régime obésogène ultérieur et induisait un développement mammaire anormal de la descendance. Nous avons également caractérisé la synthèse et la sécrétion mammaire de leptine, dans un modèle cellulaire hétérologue. Enfin, nous avons évalué la variation intra espèce ainsi que la croissance selon deux fenêtres nutritionnelles : alimentation obésogène administré dès la puberté ou dès la naissance, dans deux lignées murines, FVB/N et C57BL/6.Ce travail montre que la composition du lait maternel est altérée par l’alimentation et influe sur la croissance et le développement mammaire de la descendance, chez le lapin
Women’s nutrition can have long-term effects on mammary development and on the development and the health of the offspring. Leptin may play a major role during these processes. In the present work we show that leptin synthesis in the mammary gland slightly increases during pregnancy, but largely increases during lactation. We also show that, in the rabbit, milk consumption from obesogenic-fed dams promote the later effects of an obesogenic diet and leads to an abnormal mammary development observed in the offspring. We also highlight the synthesis and the mammary secretion of leptin in a heterologous cellular model. We also evaluate the intra-species variability as well as the growth considering two nutritional windows: obesogenic feeding from the puberty or from the birth, in two lineages of mice, FVB/N and C57BL /6.This work shows that the consumption of altered maternal milk has long-term effects by influencing the growth and the mammary development of the offspring, in rabbit

Le statut nutritionnel des femmes, en particulier au cours de l’enfance et de l’adolescence, peut influencer ultérieurement l’allaitement, en altérant le développement mammaire. Les mécanismes responsables de ces perturbations au niveau mammaire ne sont que partiellement connus. Le travail de cette thèse est réparti en deux volets. Nous avons d’abord étudié le gène de la leptine dans la glande mammaire de lapin. L’analyse quantitative par RT-PCR en temps réel a montré que le niveau d’expression des ARNm codant pour la leptine augmentait à partir de la fin de la gestation pour atteindre à mi-lactation, un niveau équivalent à celui du tissu adipeux alors que celui des récepteurs suivait une cinétique inverse. L’analyse de la localisation cellulaire de la leptine révèle une expression spécifique dans les cellules éptihéliales luminales. Ces résultats suggèrent que la leptine via un rôle autocrine et/ou paracrine pourrait constituer un médiateur important dans la régulation locale du développement mammaire. Nous nous sommes ensuite intéressés aux conséquences d’une adiposité élevée sur la lactation et sur le phénotype mammaire de la descendance. Au cours de cette étude, nous avons montré que le régime obésogène altérait non seulement la composition du lait mais que ce lait pouvait à son tour provoquer des modifications au niveau du phénotype mammaire chez la descendance. L’ensemble de ce travail soutient l’hypothèse selon laquelle le lait maternel, dont la composition peut être altérée selon l’alimentation de la mère, influerait sur le développement mammaire de la descendance
Nutritional status, mostly during childhood and adolescence, can induce long-term effects in particular on mammary gland development. The mechanisms underlying this phenomenon still remain unknown. We have first studied leptin gene expression inrabbit mammary gland. The real time RT-PCR quantitative analysis showed that the leptin mRNA level rose from the end of pregnancy to reach at mid-lactation, a level equal to that of the adipose tissue, while leptin receptor mRNA concentration was higher during pregnancy as compared to lactation. Cellular localization of leptin reveals an expression in the luminal epithelial cells. These results suggest that leptin, through an autocrine and/or a paracrine role, could participate in the local regulation of mammary gland development. We then analyzed the consequences of adiposity on lactation and on offspring’s mammary gland development in the rabbit. We showed first that the obesogenic diet alters milk composition and second that this altered milk could lead to mammary alterations in the offspring. These results support the hypothesis that maternal milk, which composition can change according to the maternal diet, may have long-term effects on offspring’s mammary gland development

L’épithélium mammaire est composé de cellules luminales et basales myoépithéliales. Il comprend des cellules souches et progénitrices qui gouvernent le développement de la glande. Leur dérégulation est probablement à l’origine de certains cancers du sein très agressifs, dits « triple-­‐négatifs » (négatifs pour les récepteurs hormonaux et HER2), pour lesquels il n’existe pas de thérapie ciblée. L’équipe a identifié un nouveau marqueur spécifique du compartiment basal comprenant les cellules souches, la Podoplanine (Pdpn), dont l’expression est concentrée aux contactsintercellulaires basal-­‐luminal. La Pdpn est une glycoprotéine transmembranaire connectée au cytosquelette, impliquée dans le développement denombreux tissus et la tumorigenèse. Son rôle dans la glande mammaire n’a jamais été étudié. A l’aide d’une délétion génique conditionnelle, nous avons trouvé que l’absence de Pdpn dans l’épithélium mammaire perturbe la fonction des cellules souches/progénitrices basales ainsi quel’expression de plusieurs composants du signalosome de la voie Wnt/b-­‐caténine. De plus, la perte de Pdpn dans un modèle murin de tumorigénèsemammaire induite par l’activation de la signalisation Wnt/b-­‐caténine réduit la fréquence des tumeurs mammaires triple-­‐négatives, limite l’expansiondes cellules initiatrices de tumeurs et favorise l’expression de marqueurs moléculaires associés à un programme de transition mésenchymo-­‐épithéliale. Au moyen d’expériences de gain de fonction dans une lignée de cellules basales mammaires, Nous avons montré que les phénotypes décrits précédemment reposent sur des mécanismes moléculaires impliquant la Pdpn dans le contrôle positif de l’activation de la voie Wnt/b-­‐caténine. Notre étude révèle un rôle pour la Pdpn dans le contrôle des cellules souches et de leur réponse à la signalisation Wnt/b-­‐caténine au cours du développement et de la tumorigénèse mammaire
Stem cells (SC) drive mammary development, giving rise postnatally to an epithelial bilayer composed of luminal and basal myoepithelial cells. The molecular identity of SCs and the factors regulating their function remain poorly defined. We identified the transmembrane protein, Podoplanin (Pdpn), as a specific marker of the basal compartment, including multipotent SCs, and found Pdpn localized at the basal-luminal interface. Embryonic deletion of Pdpn targeted to basal cells diminished basal and luminal SC activity and affected expression of several Wnt/b-catenin (Wnt/b-cat) signaling components. Moreover, Pdpn deletion attenuated mammary tumor formation in a mouse model of b-cat-induced breast cancer, limiting tumor-initiating cell expansion and promoting molecular features associated with mesenchymal-to-epithelial cell transition. In line with the loss-of-function data, we demonstrated that mechanistically, Pdpn enhanced Wnt/b-cat signaling in mammary basal cells. Overall, our study reveals a role for Pdpn in mammary development and tumorigenesis through the control of Wnt/b-cat-responsive SCs

La maîtrise de la conduite d’élevage est essentielle pour produire des chevrettes qui expriment pleinement leur potentiel laitier au cours de leur carrière. Elle implique la détermination de phases clés au cours de la période de croissance, notamment pour la mise en place de la glande mammaire. L’objectif de cette thèse était de déterminer les effets d’un sevrage précoce combiné à différentes conduites alimentaires post-sevrage sur les performances zootechniques de chevrettes de race alpine ainsi que sur le développement de leur glande mammaire. Tout d’abord, nous avons montré qu’un sevrage précoce à 10 kg de poids vif n’affectait ni le développement corporel, ni les performances de reproduction, ni même la production laitière (PL) des chevrettesPar contre, un apport plus élevé de concentré pendant la phase d’élevage a augmenté le développement corporel et le poids de la glande mammaire. Toutefois, cela n’a impacté ni le développement du parenchyme mammaire au cours de la phase pré-pubère ou en début de gestation, ni même la proportion de Cellule Epithéliale Mammaire (CEM). La prolifération des CEM était identique quelle que soit la quantité de concentré ingérée. La PL n’a pas été modifiée par l’augmentation de l’ingestion de concentré. La modification de la concentration en énergie et en protéines du concentré en phase pré-pubère n’a eu d’effet ni sur les performances de croissance ou de reproduction, ni sur le développement de la glande mammaire. La chèvre semble donc s’adapter aux modifications de la conduite alimentaire sans pour autant que l’augmentation de croissanc
Control of husbandry management is essential to produce female goat kids that fully express their milk potential during their career. It involves the determination of key periods during growth, particularly for the mammary gland development. The objective of this thesis was to determinate the effects of early weaning combined with different post-weaning feeding strategies on the performances of alpine goat kids as well as on their mammary gland development. On the one hand, we showed that early weaning at 10 kg of body weight did not affect body development, reproductive parameters or milk production (MP). On the other hand, a high concentrate intake during the rearing period increased body development and the weight of mammary glands.However, this did not impact the development of mammary parenchyma during the pre-pubertal phase or at the beginning of gestation, nor even the proportion of Mammary Epithelial Cells (MEC). The proliferation of MEC was identical regardless of the amount of concentrate ingested. MP was not affected by increasing concentrate intake. Modifying the energy and protein concentration of the concentrate in the pre-pubertal period had no effect on growth, reproductive performance, mammary gland development or mammary parenchyma development. Therefore, goats seem to adapt to changes in feeding strategies without a negative effect of the increase in growth on their ability to produce milk

Le comportement des lapereaux nouveaux-nés (Oryctolagus cuniculus) est sous contrôle exclusif des entrées chimiosensorielles et tactiles, les autres systèmes sensoriels entrant en fonction plus tardivement. Parmi les signaux olfactifs qui orientent le comportement néonatal, une phéromone a pu être isolée dans le lait de lapine, la phéromone mammaire (PM). La PM contribue à deux mécanismes essentiels à la survie de l’individu : l’orientation vers la mamelle et sa prise en bouche (la PM contribue ainsi à la tétée) et l’apprentissage olfactif précoce. Dans ce contexte, ce travail de thèse a comporté 3 objectifs : analyser l’impact de l’état prandial et de l’ontogenèse 1) sur la réponse à la PM, 2) sur la réponse aux odeurs apprises en association avec la PM et 3) évaluer les éventuels impacts à long terme des deux fonctions de la PM au cours du développement du lapereau. 1) La réponse du lapereau à la PM semble dégagée de toute influence de la satiété au cours des premiers jours de vie. Puis, on note le passage d’une réponse automatique à ce signal phéromonal maternel à une réponse régulée par des facteurs post-ingestifs ou post-absorptifs. En effet, à J2,les lapereaux répondentoujours très fortement à la PM alors qu’à partir de J5, le signal ne conserve sa valeur motivationnelle qu’en phase pré-prandiale. D’autre part, ce travail montre clairement une évolution de la réponse des lapereaux à la PM au cours de leur développement. 2) Dans certaines conditions d’association, la PM est capable de transférer en un essai sa signification appétitive à une odeur initialement neutre. Ce transfert est modulé par les facteurs prandiaux plus tôt que ne l’est le déclenchement du comportement de tétée. De plus, cette capacité de transfert est limitée aux 4 premiers jours de vie des lapereaux, suggérant l’existence d’une période sensible pour cet apprentissage phéromonalement dirigé. 3) La rétention d’une odeur acquise au cours des 4 premiers jours de vie s’avère effective lors de tests de choix sociaux réalisés à 30 jours, mais pas lors de tests de choix alimentaire. Cette rétention semble néanmoins nécessiter (dans nos conditions) un renforcement plus consistant (allaitement sous la mère) que celui constitué par la PM seule. Ces résultats ouvrent des perspectives quant à l’étude des mécanismes orientant les apprentissages du nouveau-né de mammifère et de leurs conséquences à court comme à plus long terme, et notamment quant à la nature des renforçateurs phéromonaux ou multi-sensoriels véhiculés par la mère et impliqués dans ces apprentissages à finalité adaptée
Newborn rabbits (Oryctolagus cuniculus) are dependent of maternal odour cues to localise the nipples and to suck. During a nursing episode, they display a typical behaviour under the mother’s abdomen constitutedby searching movements of the head usually followed by oral grasping movements. Such responses are in particular released by the mammary pheromone (MP) emitted by lactating females. They may also be induced bya novel odorant after it has been learned by association with the MP. In this context, three objectives have beenpursued in the present thesis: the assessment of the impact of the satiation and of the rabbit pup development on 1) the releasing activity of the MP, 2) the reinforcing impact of the MP on an initially neutral odorant; and 3) the evaluation of the long term impact of the releasing and reinforcing functions of the MP during the development of the young rabbit. 1) During the first postnatal days, the ability of the MP to trigger the orocephalic movements of the pups appears independent of the prandial state. Then, a progressive transition from an “automatic” response to the MP to a response regulated by post-ingestive or post-absorptive factors occurs. Indeed, the response to the MP remains very high along the 24-h cycle on d2, but on d5 the MP is highly active only right before the daily nursing. Moreover, an evolution in the morphology of the response to the MP appears between birth and weaning. 2) The potency of the MP to induce odour-learning is affected by the prandial state as soon as d0. Inaddition, this reinforcing function vanishes after d4, suggesting the presence of a sensitive period for the reinforcing activity of the MP. 3) The neonatal learning of a new odorant seems to impact the behaviour of young rabbits (around 30-day-old) tested for their social preferences, but not for their feeding ones. But this retention seems to require a stronger reinforcement (nursing) than that resulting from the exposure to the MP only. These results open perspectives for the study of the mechanisms engaged in the learning of the mammal newborn and of their consequences in the short as the long term, in particular through the action of pheromonal and of multi-sensory reinforcers dependent of the mother that contribute to the adaptation of the young

Les microARN sont de petits ARN non-codants qui jouent des rôles importants dans l’extinction de l’expression de gènes cibles. Ils sont impliqués dans la régulation de divers processus cellulaires, tel que la différenciation, la prolifération et l’apoptose. Jusqu'à présent, leur implication dans la biologie de la glande mammaire a été suggérée par quelques études portant principalement sur des situations pathologiques permettant la caractérisation des microARN comme marqueurs de différents types de tumeurs du sein. L'implication des microARN dans la régulation de la biologie normale de la glande mammaire reste à découvrir. Pour comprendre la fonction des microARN dans les différents stades physiologiques de la glande mammaire, nous avons développé trois approches : (i) L’identification de microARN spécifiques de la glande mammaire. Ces microARN ont été recherchés par la réalisation d’une banque de petits ARN. Au total 24 nouveaux microARN ont été clonés dont 6 sont spécifiques de la souris (Sdassi et al. , 2009). (ii) L’invalidation conditionnelle (système Cre-loxP) de Dicer, l'une des enzymes clés impliquées dans la maturation des microARN. L'inactivation a été principalement réalisée dans les cellules épithéliales mammaires par l'utilisation de deux lignées transgéniques MMTV-Cre et WAP-Cre croisées avec les souris Dicerfl/fl. Les souris Dicerfl/+/MMTV-Cre hétérozygotes présentent un défaut de lactation. Les observations histologiques montrent un défaut de développement de la glande mammaire détectable à partir de 6 jours de gestation. Les études transcriptomiques ont été effectuées afin de caractériser les voies de signalisation affectées. Les souris Dicerfl/fl/WAP-Cre présentent également un défaut de la lactation. Les études histologiques montrent des anomalies de la glande mammaire de ces souris en fin de lactation. (iii) La caractérisation de l’expression des microARN à différents stades physiologiques de la glande mammaire de souris (Silveri et al. , 2006; Sdassi et al. , 2009). Le rôle de l'un d'entre eux (miR-30b) a été recherché à partir de l’analyse de souris transgéniques qui surexpriment ce microARN dans les cellules épithéliales mammaires. Les femelles présentent un défaut de la lactation. Les analyses histologiques n’ont pas montré d’anomalies de développement pendant la gestation ou la lactation ; en revanche, des défauts du remodelage de la glande mammaire au Les microARN sont de petits ARN non-codants qui jouent des rôles importants dans l’extinction de l’expression de gènes cibles. Ils sont impliqués dans la régulation de divers processus cellulaires, tel que la différenciation, la prolifération et l’apoptose. Jusqu'à présent, leur implication dans la biologie de la glande mammaire a été suggérée par quelques études portant principalement sur des situations pathologiques permettant la caractérisation des microARN comme marqueurs de différents types de tumeurs du sein. L'implication des microARN dans la régulation de la biologie normale de la glande mammaire reste à découvrir. Pour comprendre la fonction des microARN dans les différents stades physiologiques de la glande mammaire, nous avons développé trois approches : (i) L’identification de microARN spécifiques de la glande mammaire. Ces microARN ont été recherchés par la réalisation d’une banque de petits ARN. Au total 24 nouveaux microARN ont été clonés dont 6 sont spécifiques de la souris (Sdassi et al. , 2009). (ii) L’invalidation conditionnelle (système Cre-loxP) de Dicer, l'une des enzymes clés impliquées dans la maturation des microARN. L'inactivation a été principalement réalisée dans les cellules épithéliales mammaires par l'utilisation de deux lignées transgéniques MMTV-Cre et WAP-Cre croisées avec les souris Dicerfl/fl. Les souris Dicerfl/+/MMTV-Cre hétérozygotes présentent un défaut de lactation. Les observations histologiques montrent un défaut de développement de la glande mammaire détectable à partir de 6 jours de gestation. Les études transcriptomiquesont été effectuées afin de caractériser les voies de signalisation affectées. Les souris Dicerfl/fl/WAP-Cre présentent également un défaut de la lactation. Les études histologiques montrent des anomalies de la glande mammaire de ces souris en fin de lactation. (iii) La caractérisation de l’expression des microARN à différents stades physiologiques de la glande mammaire de souris (Silveri et al. , 2006; Sdassi et al. , 2009). Le rôle de l'un d'entre eux (miR-30b) a été recherché à partir de l’analyse de souris transgéniques qui surexpriment ce microARN dans les cellules épithéliales mammaires. Les femelles présentent un défaut de la lactation. Les analyses histologiques n’ont pas montré d’anomalies de développement pendant la gestation ou la lactation ; en revanche, des défauts du remodelage de la glande mammaire au Les microARN sont de petits ARN non-codants qui jouent des rôles importants dans l’extinction de l’expression de gènes cibles. Ils sont impliqués dans la régulation de divers processus cellulaires, tel que la différenciation, la prolifération et l’apoptose. Jusqu'à présent, leur implication dans la biologie de la glande mammaire a été suggérée par quelques études portant principalement sur des situations pathologiques permettant la caractérisation des microARN comme marqueurs de différents types de tumeurs du sein. L'implication des microARN dans la régulation de la biologie normale de la glande mammaire reste à découvrir. Pour comprendre la fonction des microARN dans les différents stades physiologiques de la glande mammaire, nous avons développé trois approches :(i) L’identification de microARN spécifiques de la glande mammaire. Ces microARN ont été recherchés par la réalisation d’une banque de petits ARN. Au total 24 nouveaux microARN ont été clonés dont 6 sont spécifiques de la souris (Sdassi et al. , 2009). (ii) L’invalidation conditionnelle (système Cre-loxP) de Dicer, l'une des enzymes clés impliquées dans la maturation des microARN. L'inactivation a été principalement réalisée dans les cellules épithéliales mammaires par l'utilisation de deux lignées transgéniques MMTV-Cre et WAP-Cre croisées avec les souris Dicerfl/fl. Les souris Dicerfl/+/MMTV-Cre hétérozygotes présentent un défaut de lactation. Les observations histologiques montrent un défaut de développement de la glande mammaire détectable à partir de 6 jours de gestation. Les études transcriptomiques ont été effectuées afin de caractériser les voies de signalisation affectées. Les souris Dicerfl/fl/WAP-Cre présentent également un défaut de la lactation. Les études histologiques montrent des anomalies de la glande mammaire de ces sourisen fin de lactation. (iii) La caractérisation de l’expression des microARN à différents stades physiologiques de la glande mammaire de souris (Silveri et al. , 2006; Sdassi et al. ,2009). Le rôle de l'un d'entre eux (miR-30b) a été recherché à partir de l’analyse de souris transgéniques qui surexpriment ce microARN dans les cellules épithéliales mammaires. Les femelles présentent un défaut de la lactation. Les analyseshistologiques n’ont pas montré d’anomalies de développement pendant la gestation ou la lactation ; en revanche, des défauts du remodelage de la glande mammaire au cours de l’involution sont détectés chez ces souris. Les études du transcriptome ont permis d’identifier des gènes potentiellement impliqués dans ce phénotype. Nos résultats montrent pour la première fois l'implication des microARN dans la biologie de la glande mammaire normale. Au cours de ces études, nous avons produit plusieurs modèles animaux qui permettent d’identifier la fonction des microARN et les cibles de l’un d’entre eux (miR-30b) dans cet organe
MicroRNA are small non-coding RNA that have been found to play important roles in silencing target genes and that are involved in the regulation of various normal cellular processes. Few studies have described their implication in mammary gland biology, mainly focusing on pathological situations allowing the characterization of microRNA as markers of tumour class in breast cancer. The involvement of microRNA in the regulation of normal mammary gland biology remains to be uncovered. To understand the function of microRNA in the different steps of mammary gland biology we developed three approaches: 1/ Identification of organ- and tissue- (testicles) specific microRNA suggest the existence of specific microRNA in the mammary gland. These microRNA have been investigated by creating a bank of small RNA. Twenty four new microRNA were cloned, of which 6 are specific for the mouse (Sdassi et al. , 2009). The expression profiles of these new microRNA were analysed by qRT-PCR, to allow for better characterization. 2/ Conditional invalidation (system Cre-loxP) of Dicer, one of the key enzymes involved in the microRNA maturation. The inactivation is achieved mainly in the mammary epithelial cells by the use of an MMTV-Cre and WAP-Cre transgenic lines crossed with Dicerfl/fl mice. The heterozygote Dicerfl/+/MMTV-Cre mice present a defect of lactation. Histological observations show a default of mammary gland development detectable from 6 days of gestation onwards. Transcriptomic studies will be conducted to further characterize the affected signaling pathways. The Dicerfl/fl/WAP-Cre KO mice also exhibit a defect of lactation. The histological studies show abnormalities in mammary gland development at 18 days lactation. The genes regulated by microRNA in this model will be characterized by transcriptomic studies. 3/ The characterization of microRNA expression patterns at different physiological stages of the mammary gland development in mice has been described (Silveri et al. , 2006; Sdassi et al. , 2009). The role of one of these microRNA (miR-30b) is currently being analyzed by studying the phenotype of transgenic mice which over express this microRNA in mammary epithelial cells. The females present a defect of lactation associated with a default of this tissue morphology that is observed from the end of gestation onwards. Transcriptomic studies are underway to identify signaling pathways involved in this phenotype as well as the targets of this microRNA in the mammary gland. However, histological analysis did not show any developmental abnormalities associated withdefects of lactation. A remodeling defect of the mammary gland was found in these mice during involution. Transcriptome analysis has identified genes potentially involved in this phenotype. Our results demonstrate for the first time the involvement of microRNA in normal mammary gland biology and have generated animal tools that will help the understanding of microRNA function and targets in this organ

Les patientes atteintes d’un cancer du sein bénéficient pour la plupart d’une mastectomie, qui consiste en une ablation du sein dans le but de retirer les cellules tumorales. Cet acte chirurgical entraîne une perte conséquente de tissu et peut être alors suivi d’une opération de reconstruction mammaire afin de combler le volume manquant. Il existe aujourd’hui un certain nombre de méthodes de reconstruction, cependant toutes présentent à la fois des avantages et des inconvénients. Les recherches actuelles sont orientées vers le développement de solutions de reconstruction innovantes à partir des propres tissus des patientes. Parmi elles, la reconstruction par chambre d’ingénierie tissulaire (TEC) semble prometteuse pour reconstruire des volumes plus importants.L’objectif de ce travail de thèse est de proposer une amélioration des TEC en ayant recourt à l’impression 3D de matériaux biorésorbables. L’utilisation de polymères thermoplastiques biorésorbables permet de ne pas avoir à réaliser une seconde chirurgie après la reconstruction qui consisterait en le retrait de l’implant. De plus, utiliser l’impression 3D comme moyen de fabrication permettra à terme de proposer aux patientes des implants sur-mesure adaptés à leur morphologie et donc d’améliorer l’aspect esthétique de la reconstruction.L’étude a d’abord porté sur le choix d’un procédé de fabrication additive et d’une méthode de stérilisation pour le développement de l’implant permettant de minimiser la dégradation des biomatériaux sélectionnés. La fabrication par dépôt de filament fondu ainsi que la stérilisation par oxyde d’éthylène ont été retenues comme moyen de production de l’implant final stérile. Une étude de dégradation in vitro a ensuite été réalisée dans le but de déterminer les profils de résorption des PLGA et PLCL. Enfin, une étude in vivo a été conduite sur un modèle rat qui nous a permis de valider le concept de TEC résorbable imprimée en 3D. Les deux biomatériaux résorbables sélectionnés se sont donc montrés compatibles avec le procédé de reconstruction par chambre d’ingénierie tissulaire et ont donc permis la croissance du lambeau graisseux au cours du temps au sein de la TEC
Mastectomy is one of the most common way to treat breast cancer, it consists in the removal of breast tissue to remove tumor cells. This surgical act causes a consequent loss of tissue and can then be followed by a breast reconstruction operation to fill in the missing volume. Implant based or autologous fat grafting (fat flap or lipofilling) are some of breast reconstruction method, however they all have advantages and drawbacks. Tissue engineering chamber (TEC) using fat flap from the patient’s own tissue could be a promising solution to restore large volume of mature and vascularized adipose tissue and a therapeutic alternative to current breast reconstruction techniques.The main objective of this thesis it to improve TEC by using additive manufacturing and bioabsorbable polymers. The use of bioresorbable thermoplastic polymers eliminates the need for a second surgery, which would consist of removing the implant after breast reconstruction. In addition, using 3D printing to manufacture the TEC will allow patients to be offered tailor-made implants adapted to their morphology and therefore improve the aesthetic aspect of the reconstruction.The study first focused on the choice of an additive manufacturing process and a sterilization method for the development of the implant to minimize the degradation of the selected biomaterials. Fused Filament Fabrication (FFF) as well as ethylene oxide sterilization were chosen as means of producing the final sterile device. An in vitro degradation study was then carried out to determine the resorption profiles of PLGA and PLCL. Finally, an in vivo study was carried out on a rat model which enabled us to validate the concept of 3D-printed bioabsorbable TEC. The two selected polymers were therefore shown to be compatible with the tissue engineering chamber reconstruction process and thus allowed the growth of the fat flap over time within the TEC

L'incidence de cancers hormono-dépendants ne cesse d'augmenter dans les pays occidentaux ; une infertilité accrue et des anomalies du système reproducteur ont également été notées dans ces mêmes pays. L'hypothèse a été émise selon laquelle des composés faisant partie de notre environnement, appelés perturbateurs endocriniens (PE), pourraient être liés à ces phénomènes. Afin d'évaluer le risque de PE sur le développement de la glande mammaire, nous avons développé un modèle original d'exposition, où un phyto-œstrogène de soja (génistéine) et un fongicide anti-androgénique retrouvé dans les légumes et les fruits (vinclozoline), sont administrés à de faibles doses (1 mg/kg/jour) chez le rat. Nous avons mis en avant que l'exposition in utero et pendant la lactation à ces composés altère le développement de la glande mammaire chez les animaux pubères [augmentation du branchement et de prolifération épithéliale, hyperplasie ductale et changement de la réceptivité hormonale] ainsi que chez les animaux cycles [augmentation de la surface mammaire et développement des structures lobulo-alvéolaires sécrétrices]. L'analyse transcriptomique montre que cette exposition in utero altère également le profil d'expression génique de la glande mammaire ; ces altérations moléculaires sont compatibles avec les modifications histologiques. Par ailleurs, l'exposition du sevrage jusqu'à l'âge adulte à la génistéine et à la vinclozoline induit des altérations morphologiques de la glande mammaire des animaux adultes. Ce travail apporte de nouvelles connaissances concernant les effets d'un androgène/anti-androgène sur le développement de la glande mammaire chez la femelle. Cette étude montre pour la première fois que l'exposition à un mélange de deux perturbateurs endocriniens, appartenant à deux familles différentes, perturbe le développement de la glande mammaire chez le rat femelle. Les conséquences d'une exposition au mélange apparaissent plus sévères comparées à celles observées avec les molécules isolées, ce qui souligne le risque de la multi-exposition
The incidence of hormone-dependent cancers is increasing in Western countries; increased infertility and reproductive abnormalities were also noted in these same countries. This has raised the hypothesis that compounds found in our environment, called endocrine disruptors (EDs), could be related to these pathologies. This thesis aims at identifying the effects and mechanisms of EDs on the development of rat mammary gland following the administration of two xeno-hormones having distinct endocrine properties: genistein (soy phytoestrogen with major estrogen receptor affinity) and vinclozolin (anti-androgenic fungicide found in vegetables and fruit). The particularises of this project were: 1) a study following in utero and gestational exposure at peri-pubertal period (PND35 and PND50); 2) a long life exposure study on adult rats; 3) doses relevant overall human exposure (1 mg/kg/day). We show that exposure in utero and during lactation to these compounds alter the development of the mammary gland in pubertal animals [increase in branching and epithelial proliferation, ductal hyperplasia and changes in hormonal receptivity] and in cycled animals [increase of the mammary gland area and development of lobulo-alveolar structures]. Using a transcriptomic approach, we also evaluated gene expression changes in mammary gland. Molecular changes are dependent on the period of postnatal development and the compound considered. The molecular data concerning in utero and lactational exposure are consistent with the histological observations. Furthermore, exposure from weaning to adulthood induces different alterations of the mammary gland at adulthood. In summary, this work provides new observations on the effects of a chemical anti-androgen on the development of the mammary gland in females. These studies also show for the first time that exposure of a mixture of two endocrine disruptors, belonging to two different families, disrupts the development of the mammary gland in female rats with more severe effects compared to those observed with the isolated molecules; these results highlight the risk of multiple exposure

Le mucus recouvre et protège les épithéliums des tractus respiratoire, gastro-intestinal et reproducteur. Les mucines sécrétées sont des molécules mosaïques de très grande taille moléculaire, fortement O-glycosylées et responsables des propriétés rhéologiques du gel de mucus. MUC5B est l’une des cinq mucines gélifiantes et est principalement sécrétée dans le tractus respiratoire. Chez l’Homme, MUC5B est impliquée dans le cancer mammaire et la mucoviscidose. MUC5B est exprimée dans plus de 80% des cancers mammaires alors que MUC5B n’est pas exprimée dans le tissu mammaire sain. Par ailleurs, MUC5B pourrait jouer un rôle majeur dans le poumon de patients atteints de mucoviscidose. Pour étudier la fonction de MUC5B, nous avons utilisé des protéines recombinantes composées de différents domaines de MUC5B et des modèles animaux. Nous avons montré que MUC5B favorise la prolifération cellulaire et l’invasion in vitro et favorise la croissance tumorale et la dissémination métastatique chez des souris immunodéprimées. MUC5B apparait donc comme une cible thérapeutique intéressante pour ralentir la prolifération cellulaire et la dissémination métastatique dans le cancer du sein. Nous avons également montré que l’expression de Muc5b et le nombre de cellules Muc5b positives sont plus élevés dans un modèle murin de mucoviscidose (Cftr–/–) que chez les souris frères-sœurs contrôles, ce qui suggère que les souris Cftr–/– sont prédisposées à former des bouchons bronchiques. Les souris Cftr–/– infectées expérimentalement par Pseudomonas aeruginosa développent des bouchons bronchiques AB-PAS positifs principalement composés de la mucine Muc5b et d’ADN. MUC5B semble être une cible thérapeutique intéressante pour diminuer la viscosité du mucus dans la mucoviscidose. Enfin, nous avons montré que la protéine Muc5b est exprimée très précocement (dès E8.5) au cours du développement embryonnaire murin. A E11.5, Muc5b est exprimée dans le bourgeon pulmonaire, dans le bourgeon formant la trachée et l’œsophage et dans l’estomac. De manière inattendue, Muc5b est exprimée au niveau baso-latéral des cellules épithéliales suggérant un rôle clé de MUC5B dans la morphogenèse
Respiratory, gastrointestinal and reproductive tracts are protected by a mucus layer. Secreted mucins are large, high molecular weight and heavily O-glycosylated mosaic proteins that are responsible for the rheological properties of mucus gel. MUC5B is one of the five secreted gel-forming mucins and is mainly secreted in the respiratory tract. In human pathology, MUC5B has been implicated in breast cancer and cystic fibrosis (CF). This ‘non mammary’ mucin is expressed in more than 80% of breast cancer and it has been suggested that MUC5B may represent the main mucin to be implicated in the lung disease of CF.To investigate the function of MUC5B, we used recombinant proteins of several MUC5B domains and animal models. We show that MUC5B promotes cell proliferation and invasion in vitro and tumor growth and metastasis using SCID mice suggesting that MUC5B may represent a therapeutic target to slow down the tumor growth and dissemination in breast cancer. We show also that Cftr–/– mice harbor more Muc5b positive Clara cells than do control littermates suggesting that CF mice are predisposed to develop mucus plugs. Experimental infection with Pseudomonas aeruginosa increased the number of Muc5b-positive cells and the formation of mucus plugs in bronchi or bronchioles of Cftr–/– mice. These plugs are mainly composed of Muc5b and DNA suggesting that MUC5B may be a valuable target for decreasing mucus viscosity in CF. Finally, Muc5b protein was detected very early in mouse embryogenesis (at day 8.5). At E11.5, Muc5b is expressed in pulmonary bud, in tracheo-esophagal groove and in stomach. Unexpectedly, Muc5b is expressed at the basal and lateral membrane of epithelial cells of the buds suggesting a key role in epithelial morphogenesis

Dans les tumeurs, les cellules cancéreuses invasives induisent l'expression de la métalloprotéase matricielle 11 (MMP-11) dans les adipocytes adjacents (cancer-associated adipocytes) entrainant leur " dédifférenciation " en fibroblastes, la MMP-11 régulant négativement l'adipogénèse. Au cours de ma thèse, j'ai étudié la fonction de la MMP-11 sur le développement mammaire postnatal. La structure de la glande ainsi que la production de lait sont altérées dans les souris déficientes pour la MMP-11. De plus, la MMP-11 régule l'homéostase du collagène. In vivo, des transplantations montrent une fonction locale paracrine de la MMP-11 essentielle à la morphogenèse mammaire. In vitro, la MMP-11 adipocytaire favorise le branchement d'organoïdes primaires. Ainsi, la MMP-11 est un facteur paracrine majeur pour le développement de la glande mammaire. Enfin, pour poursuivre ces travaux, j'ai établi des souris transgéniques conditionnelles ciblant l'expression de la MMP-11 dans les adipocytes.

Le gene h19 est fortement exprime avant la naissance et reprime ensuite ; son expression persiste dans la glande mammaire adulte. Cette activite a motive notre interet pour cet organe, mais nous avons considere d'autres modeles, dans le but d'elucider dans le temps et dans l'espace le devenir des transcrits h19, les modalites de la transcription du gene et sa regulation via son promoteur. Nous resumons nos principaux resultats. - h19 est fortement exprime dans les ebauches mammaires ftales ; reprime a la naissance ; il est fortement active a la puberte. Il est alors reprime jusqu'a la gestation, au cours de laquelle il est a nouveau active. H19 est inhibe pendant l'allaitement et recouvre une activite basale lors de l'involution. - dans l'uterus murin, au cours du cycle strien h19 est fortement exprime lors de l'strus et du metstrus, faiblement en prostrus et inhibe en distrus. - une etude statistique d'adenocarcinomes humains indique : a) h19 est surexprime dans 72% des cancers ; souvent dans le stroma (92%), rarement dans les cellules cancereuses (3%) ; b) les transcrits h19 sont abondants a l'interface epithelium-mesenchyme ; cette situation pourrait les impliquer dans le dialogue de ces deux tissus ; d) la surexpression de h19 est significativement correlee au facteur t et a la presence des recepteurs aux steroides (re et rp). - le role des steroides dans la regulation de h19 a ete recherche en mode systemique chez des souris ovariectomisees et surrenalectomisees.

SPÉCIFICATION DU DESTIN CELLULAIRE DES CELLULES SOUCHES MAMMAIRES EN 4DAu cours du développement, une coordination entre la spécification du destin cellulaire et la morphogenèse tissulaire est nécessaire à la formation des organes. Par conséquent, la façon dont différents types de cellules se différencient dans le temps et l'espace reste une question majeure en biologie du développement.La glande mammaire est constituée d'un épithélium ramifié composé d'une couche externe de cellules basales (BCs) et d'un compartiment interne de cellules luminales (LCs). Dans ce tissu, l'homéostasie adulte est exclusivement maintenue par des progéniteurs unipotents, alors que des cellules souches mammaires multipotentes (MaSC) ne se trouvent que dans la glande embryonnaire, ce qui en fait un paradigme tissulaire idéal pour étudier leur comportement dynamique et leur contribution à la morphogenèse tissulaire.HYPOTHÈSE DE TRAVAILNous avons récemment montré que les cellules souches mammaires deviennent unipotentes lors de la tubulogenèse de la glande, suggérant un lien étroit entre spécification cellulaire et morphogenèse. Notre hypothèse implique que la perte de multipotence soit liée aux remaniements cellulaires qui guident la morphogenèse. Cependant, le moment exact et les mécanismes responsables du passage de la multipotence à l'unipotence sont encore inconnus.OBJECTIF ET MÉTHODOLOGIEL'objectif principal de ce projet était d'intégrer les circuits transcriptionnels définissant le potentiel de différenciation des cellules souches à l'analyse de la morphogenèse cellulaire et tissulaire en temps réel, afin de déchiffrer les mécanismes qui sous-tendent l'acquisition de l'identité cellulaire et d'étudier la coordination entre spécification des cellules souches et morphogenèse. Nous avons abordé cet objectif ambitieux en combinant deux approches : 1) des analyses transcriptomiques en cellule unique intégrées dans l’espace, au cours du développement mammaire, et 2) une approche de suivi du lignage en temps réel dans des cultures mammaires embryonnaires ex vivo, afin d'étudier les comportements et réarrangements cellulaires au cours des premières phases de la croissance mammaire.RÉSULTATSNous avons constaté que la restriction du potentiel des cellules souches est progressive pendant le développement embryonnaire. Par transcriptomique sur cellules uniques, nous avons pu distinguer trois types cellulaires distincts très tôt (E15). L'intégration dans l’espace de ces données transcriptomiques nous a révélé que des cellules de type BC et LC sont positionnées différemment dans le bourgeon mammaire très précocement. Cette analyse a donc révélé de nouveaux marqueurs moléculaires des LC et BC embryonnaires, qui ne peuvent pas être distingués avec les marqueurs mammaires adultes connus.De plus, nous avons défini les signatures transcriptionnelles qui distinguent deux populations de cellules stromales mammaires embryonnaires délimitées dans l'espace. Nous avons aussi montré qu’une signalisation paracrine du mésenchyme aux cellules épithéliales, via Fgf10-Fgfr2, influence la morphogenèse de la glande mammaire.Nous avons ensuite développé une approche d’analyse d’images semi-automatique aux niveaux cellulaire et tissulaire dans nos explants mammaires analysés par microscopie time-lapse. Nous montrons que les étapes initiales de la morphogenèse sont caractérisées par des réarrangements cellulaires très dynamiques. De plus, l'activation épithéliale de la beta-catenin empêche la formation de branches, indiquant que Wnt est un régulateur essentiel de la morphogenèse mammaire.Ces travaux mettent en lumière les circuits transcriptionnels qui régissent le branchement mammaire et qui lient la différenciation des cellules souches à leur dynamique cellulaire pendant la morphogenèse. Les mécanismes ainsi dévoilés nous fournissent des biomarqueurs potentiels du cancer du sein, qui résulte souvent de la réactivation de programmes de multipotence embryonnaires
DEFINING CELL FATE SPECIFICATION OF MOUSE MAMMARY STEM CELLS IN 4DCoordination of cell fate specification and branching morphogenesis is necessary to generate an organ with its specialized final structure and function. Accordingly, how different cell types are specified in a tightly regulated manner in time and space, in order to drive the morphogenesis of a complex tissue, remains a major question in the field of developmental biology.The mammary gland (MG) consists in a branched bi-layered epithelium composed of an outer layer of basal cells (BCs) and an inner compartment of polarised luminal cells (LCs). In this tissue, adult homeostasis is exclusively maintained by lineage-restricted unipotent progenitors, whereas multipotent mammary stem cells (MaSCs) are only found in the embryonic gland, making it an ideal tissue paradigm to study stem cell dynamics and lineage specification, as well as their contribution to tissue morphogenesis.WORKING HYPOTHESISOur recent results showed that multipotent MaSCs become lineage-restricted around embryonic day E15.5, coinciding with the first morphogenetic events that establish the mammary ductal network. We thus hypothesized that loss of multipotency in the mammary gland was linked to cell rearrangements, leading to the branching of embryonic mammary buds. However, the exact timing and the mechanisms responsible for the switch from multipotency to unipotency during embryonic MG are still unknown.AIM AND METHODOLOGYThe overarching aim of this project was to characterise the stem cell dynamics underlying MaSCs differentiation during MG development, and to define the transcriptional signals underpinning this process. We have approached this ambitious objective combining two approaches: 1) single-cell RNA sequencing analysis at different embryonic times, to discover which signals determine cell identity during mammary development, and 2) a live lineage tracing approach in ex vivo embryonic mammary cultures to study dynamic cell behaviours and rearrangements during the earliest phases of mammary growth.RESULTSWe found that lineage restriction is a progressive developmental process. By single cell transcriptomics, we identified a single population of mammary epithelial cells at E13.5, but we could distinguish three transcriptionally distinct cell subsets at E15.5, which included luminal-like, basal-like and hybrid cells co-expressing luminal and basal genes. Spatial transcriptomic analysis revealed that the basal-like and luminal-like clusters were indeed already spatially restricted in the embryonic mammary bud, being positioned either in close proximity to the basement membrane or in the inner bud region, respectively. Importantly, this analysis revealed novel molecular markers of committing LCs and BCs, that cannot be distinguished with known adult MG markers.Additionally, we report the transcriptional signatures distinguishing two spatially restricted embryonic mammary mesenchymal cell populations, representing sub-epithelial and dermal mesenchyme. Long-term live-imaging revealed that paracrine signalling from embryonic mesenchyme to epithelial cells, via Fgf10-Fgfr2, influences epithelial branching.We then developed a deep learning-based pipeline to semi-automatically track individual cells and tissue branches in embryonic mammary explants analysed by time-lapse microscopy. We show that the initial steps of morphogenesis are characterized by highly dynamic cell rearrangements in the growing branch tips. However, forced activation of the Wnt/b-catenin pathway in the embryonic mammary epithelium precluded branching in vivo and ex vivo, indicating that epithelial Wnt signalling is an essential regulator of mammary branching morphogenesis.This work sheds light on the timing and mechanisms governing mammary cell fate decisions, providing potential biomarkers of breast cancer, which often arises from reactivation of embryonic multipotency programs

Les facteurs de transcription du groupe PEA3, Erm, Er81 et Pea3 (famille ETS) sont exprimés dès les stades d'embryogenèse précoce dans un grand nombre de tissus et organes. Leur surexpression est souvent corrélée au statut tumorigène des cellules et à l'évolution métastatique, notamment dans le modèle mammaire. Des cellules mammaires murines à caractère «normal» surexprimant les facteurs Erm et Pea3 présentent la capacité de faire spontanément de la morphogenèse et des propriétés invasives in vitro. Ces modèles ont permis la mise en évidence de nouvelles cibles moléculaires de ces facteurs. Les gènes bax, cycline D2 et p55cdc. Le travail de thèse s'est orienté autour de deux axes. La mise au point de modèles cellulaire, manmaires d'inhibition de l'expression des facteurs Erm et Pea3 et l'étude de la régulation des gènes cibles bax,cycline D2 et p55cdc. Nous avons pour cela utilisé deux lignées de cellules mammaires murines, une lignée de cellules à caractère «normal », les TAC (comme modèle cellulaire de morphogenèse) et une lignée cancéreuse, les MMT (comme modèle cellulaire de tumorigenèse), et le processus d'ARN interférence pour réprimer l'expression des facteurs Erm et Pea3. L'étude des modifications morphogénétiques des cellules MMT dont l'expression du facteur Enn comme celle du facteur Pea3 est inhibée, montre que ces cellules présentent une perte de leur capacité de prolifération, de migration et d'invasion in vitro
Injectées en sous-cutané à des souris immunodéficientes, ces même cellules induisent la formation de tumeurs de taille réduite par rapport aux cellules contrôles, confinnant l'implication des facteurs du groupe PEA3 dans les événements conduisant à la cancérogenèse. La caracténsation de la régulation du gène bax par les facteurs du groupe PEA3 a permis de mettre en évidence un nouveau mode de régulation non encore décrit pour ces facteurs, impliquant une interaction avec le facteur USF-I sans liaison directe des facteurs PEA3 à l'ADN. Celle des deux autres gènes cibles cycline D2 et p55cdc est en cours. La modulation de leur expression a été confirmée dans les modèles cellulaires de répression de l'expression des facteurs Erm et Pea3. L'étude de leur région promotrice a permis de définir des sites de régulation dont la caractérisation reste à affiner. La mise au point des différents modèles dans lesquels l'expression des membres du groupe PEA3 est modulée nous a conduit à initier une recherche plus complète des cibles moléculaires des facteurs Erm et Pea3 par utilisation de micro-arrays (Applied Biosystems) avec pour but la corrélation avec les modifications phénotypiques liées à la modulation de l'expression des facteurs du groupe PEA3

ZNF217 est un oncogène codant pour un facteur de transcription de la famille Krüppel-like. Nos objectifs sont d'explorer le rôle de l'oncogène ZNF217 dans le développement de métastases du cancer du sein à tropisme osseux et la valeur pronostique ainsi que les fonctions d'une nouvelle isoforme de ZNF217. Nous avons identifié que de forts niveaux d'expression de l'ARNm de ZNF217 dans les tumeurs primitives du sein pourrait être un indicateur d'un développement ultérieur de métastases osseuses. Nous avons montré que ZNF217 est un nouvel activateur de la voie BMP et que l'inhibition de cette voie permet de reverser les propriétés métastatiques des cellules ZNF217 positives in vitro (migration, invasion et chimiotactisme vers des cellules osseuses). In vivo chez la souris, les cellules ZNF217-positives de cancer du sein développent très rapidement des métastases ostéolytiques. Dans notre deuxième axe de travail, nous avons prouvé l'existence de l'isoforme ZNF217-?E4 et montré qu'elle possède une valeur de mauvais pronostic dans le cancer du sein ER-a+. Les cellules surexprimant ZNF217-?E4 développent un phénotype encore plus agressif que les cellules possédant la forme WT (prolifération, résistance au paclitaxel), et de manière intéressante, ZNF217-?E4 semble jouer un rôle de régulateur de l'expression de ZNF217-WT. En conclusion, ZNF217 et/ou la voie BMP pourraient représenter des cibles thérapeutiques dans le traitement des cancers du sein ZNF217-positif
ZNF217 is an oncogene encoding for a Krüppel-like transcription factor. Our aims were to explore the roles of the ZNF217 oncogene in the development of breast cancer metastases to the bone and to decipher the prognostic value and the functions of a new ZNF217 isoform. Our work identified that high ZNF217 mRNA expression levels within the primitive breast tumor could represent an indicator for future recurrence to the bone. Further in vitro experiment demonstrated that ZNF217 is a new activator of the BMP pathway and that the inhibition of this pathway could inhibit the metastatic properties of ZNF217-positive breast cancer cells in vitro (migration, invasion, chemotaxis to bone cells). In vivo in mice, ZNF217-positive breast cancer cells developed osteolytic metastases very faster. In our second axis, we have proven the existence of the ZNF217-?E4 isoform and we found that this isoform possesses a prognostic significance associated with a poor prognosis in ER-a+ breast cancer. Furthermore, cells overexpressing ZNF217-?E4 developed a more aggressive phenotype than cells overexpressing ZNF217-WT (proliferation, paclitaxel resistance). Interestingly, ZNF217-?E4 seems to play a regulatory role regarding ZNF217-WT expression. In conclusion, ZNF217 and/or the BMP pathway could represent potential therapeutical targets in the management of ZNF217 positive breast cancer

L'activateur du plasminogene de type urokinase (upa) et l'un de ses inhibiteurs, le pai-1, sont impliques dans la cascade protéolytique qui aboutit a la dégradation de la matrice extracellulaire. Dans ce travail, nous avons mis au point des modèles in vitro de reconstitution mammaire normale ou cancéreuse afin d'analyser les variations d'activité upa et de pai-1 lors de phénomènes de migration et d'invasion cellulaires. Dans un premier temps, nous avons cultive en gel de collagène des explants mammaires embryonnaires de souris en présence de fibroblastes inducteurs et observe leur comportement. Dans un second temps, nous avons cultive des cellules épithéliales mammaires humaines normales et cancéreuses en 2 ou 3 dimensions en présence de fibroblastes mrc-5 producteurs d'hgf/sf. Apres avoir caractérise leur comportement morphologique, nous avons détermine les niveaux d'activité upa et de pai-1 présentes par les cellules épithéliales dans ces conditions. Aussi bien en 2d qu'en 3d, la migration ou l'invasion des cellules épithéliales mammaires peut être corrélée a une augmentation de l'activité upa. L'absence de réarrangement morphologique peut être corrélé, quant a lui, a une augmentation a la fois de l'activité upa et des taux de pai-1
Enfin, nous avons stimule les fibroblastes mrc-5 par du milieu conditionne par les différents types épithéliaux mammaires. Les cellules épithéliales sensibles a une induction par les fibroblastes mrc-5 provoquent chez ces fibroblastes un accroissement de leur capacité protéolytique. Ces modèles in vitro de reconstitution mammaire nous ont permis de montrer que chacun des compartiments mis en présence jouait un rôle actif dans l'établissement du comportement morphologique des cellules épithéliales mammaires et que ces modifications pouvaient être corrélées a des variations des capacités de dégradation matricielle présentées aussi bien par les cellules épithéliales que par les fibroblastes

Le développement de traitements thérapeutiques du cancer du sein reste limité par le niveau de connaissance des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués lors du développement normal et tumoral de la glande mammaire. L’épithélium mammaire est entouré d’une matrice extracellulaire (MEC) organisée, la membrane basale, dont le constituant principal est la laminine. Des études ont montré que les interactions entre les cellules mammaires et la MEC, dépendantes des intégrines, jouent un rôle majeur dans le développement et la tumorigenèse mammaires. Ces études n’ont cependant pas permis de déterminer les hétérodimères d’intégrine spécifiquement impliqués. Dans ce contexte, mon projet de thèse a visé à définir le rôle joué par les intégrines liant la laminine (dimères contenant les sous-unités 3 et/ou 6) dans le développement mammaire, dans le maintien de cellules souches mammaires fonctionnelles dans la glande adulte et dans le développement tumoral. Les résultats de mon travail suggèrent que :(i) l’intégrine 31 présente une fonction unique au cours de la lactation. Les mécanismes moléculaires impliqués en aval de 31 font intervenir la voie FAK/Rac1/PAK1 menant à l’inhibition de la MLCK, nécessaire à la relaxation des cellules myoépithéliales mammaires et permettant de nouveaux cycles de contraction. (ii) les interactions régulées par les intégrines entre les cellules basales mammaires et la laminine sont essentielles pour régénérer l’épithélium mammaire. Cependant, les intégrines 3 et 6 présentent des fonctions redondantes dans les cellules souches mammaires. (iii) l’intégrine 31 joue un rôle clef dans le développement tumoral mammaire. L’intégrine 31 active des voies de signalisation intracellulaires FAK/Rac1/PAK1, MAPK et JNK qui favorisent la survie et la prolifération des cellules tumorales. Ensembles, ces données permettent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le développement mammaire, la fonction de la glande adulte et la tumorigenèse
The improvement of breast cancer therapy requires thorough analysis of the pathways leading to tumorigenesis and clear understanding of the molecular and cellular mechanisms involved in normal mammary gland development. Mammary epithelium is surrounded by a specifically organized extracellular matrix (ECM), basement membrane, and secreted glycoproteins, laminins, are among its major constituents. Integrin-mediated interactions between mammary epithelial cells and ECM have been shown to play an essential role in the control of mammary development and tumorigenesis. However, specific roles played by distinct integrin heterodimers are yet poorly understood. My thesis project aimed to define the functions of laminin-binding integrins, i.e., heterodimers, containing 3 or 6 subunits, in normal mammary gland development, in control of mammary stem and progenitor cell functions in adult gland, and in mammary tumorigenesis. The results of my work suggest that: (i31 integrin has a unique function in the control of the myoepithelial cell contractile activity during lactation; it contributes to the activation of the FAK/Rac1/PAK1 pathway leading to MLCK inhibition required for myoepithelial cell relaxation, thereby, permitting further contractile cycles. (ii) integrin-mediated interactions of mammary basal cells with laminins are essential for the regeneration of the mammary epithelium. However, 31 and 6-contaning integrins have redundant functions in mammary stem cells.(iii) 31 integrin plays a major role in mammary tumorigenesis, it promotes survival and proliferation of tumor cells activating intracellular signaling pathways involving FAK/Rac1/PAK1, MAPK and JNK pathways. Altogether, these data provide new insights into the molecular mechanisms of mammary development, adult gland function and tumorigenesis

Les Facteurs de transcription du groupe PEA3 (Pea3, Erm et Er81) font partie de la famille d'oncogènes ETS. Leur expression est souvent observée lors de la mise en place des organes par morphogenèse de branchement tels que les poumons ou encore la glande mammaire. De plus une expression aberrante de ces facteurs de transcription est corrélée au caractère cancéreux de nombreux tissus tels que le côlon, les poumons ou encore le sein. Ainsi, l'expression d'Erm dans les tumeurs du sein est associée à un mauvais pronostic pour les patientes et celle de Pea3 constitue un marqueur de l'agressivité tumorale. Enfin, en qualité de facteur de transcription Pea3 module l'expression de gènes spécifiques alors appelés gènes cibles. Même si certains de ces gènes sont déjà bien caractérisés beaucoup de choses restent à faire pour comprendre les mécanismes moléculaires régulés par Pea3. Dans ce contexte lors de ma thèse je me suis intéressé à l'étude du rôle du facteur de transcription Pea3 dans les processus de morphogenèse et de tumorigenèse mammaires selon deux approches complémentaires : 1- l'étude des propriétés morphogénétiques modulées par Pea3 lors des étapes de morphogenèse et de tumorigenèse mammaires, 2- la recherche et la caractérisation de gènes régulés par Pea3 dans ce même contexte, par une analyse transcriptomique à grande échelle en utilisant des puces à ADN. Ces deux points sont développés grâce à l'utilisation de modèles cellulaires dans lesquelles nous modulons l'expression de Pea3. Les cellules épithéliales mammaires TAC 2.1 modèle de morphogenèse mammaire dans lesquelles nous surexprimons Pea3 et les cellules mammaires transformées MMT, modèle de tumorigenèse mammaire dans lesquelles nous inhibons l'expression du facteur de transcription Pea3. Au cours de ma thèse nous avons ainsi pu montrer l'importance du facteur de transcription Pea3 dans le contrôle des propriétés de migration, d'invasion et de prolifération des cellules cancéreuses TAC et MMT. En accord avec ces données, la recherche des gènes dont l'expression est régulée par Pea3 dans nos deux modèles cellulaires suite à la modulation de Pea3, a permis d'identifier de nombreux gènes capables de réguler la prolifération, la migration et l'invasion des cellules. Parmi ces gènes nous nous sommes intéressés au gène cycline d2 bien connu pour son implication dans le contrôle de la progression du cycle cellulaire. Nous avons pu montrer que le gène cycline d2 est un gène cible direct du facteur de transcription Pea3 qui module l'expression dans le modèle cellulaire TAC des deux transcrits (cycline d2 et cycline d2 trc) issus de ce gène et décrits à ce jour. L'étude de la fonction des protéines Cycline D2 et Cycline D2 Trc dans les cellules TAC a été entreprise. Tout d'abord la surexpression de l'une ou l'autre de ces isoformes dans les cellules TAC 2.1 modifie de façon opposée leur capacité à s'organiser dans un gel de collagène mimant l'environnement d'une glande mammaire, la Cycline D2 réprimant cette capacité et la Cycline D2 Trc l'augmentant. L'utilisation de petits ARN interférents permettant de réprimer l'expression de ces deux protéines a permis de montrer une relation fonctionnelle, toujours opposée, des deux isoformes avec le facteur de transcription Pea3 pour le contrôle de la progression du cycle cellulaire mais aussi pour l'induction d'une transition épithélio-mésenchymateuse étroitement reliée au pouvoir de migration des cellules épithéliales lors du développement des organes comme la glande mammaire mais aussi lors de la progression tumorale. Notre étude a ainsi permis de mieux définir l'implication du facteur de transcription Pea3 lors des événements de morphogenèse et de tumorigenèse de la glande mammaire. De plus elle ouvre la réflexion sur le rôle du gène cycline d2 lors de ces événements.

Il a été mis en évidence que le canal SK3 est un médiateur de la migration de cellules cancéreuses mammaires, une propriété essentielle à la formation de métastases. Par ailleurs, ce canal est inhibé par l’édelfosine, un éther-lipide ayant des propriétés anti-tumorales in vitro mais son usage en clinique a été abandonné en raison d’effets secondaires. Une première partie de ce travail a permis de déterminer les parties de l’édelfosine nécessaires à l’inhibition du canal SK3 et de la migration cellulaire. Ceci nous a permis de sélectionner l’Ohmline (1-O-Hexadécyl-2-O-Méthyl-sn-glycéro-lactose), un analogue non toxique de l’édelfosine qui conserve son activité inhibitrice de SK3 et de la migration. Dans un deuxième temps, nous avons testé ce lipide dans un modèle murin de développement tumoral et nous avons montré qu’il réduisait le développement des métastases sans modifier la tumeur primaire. En conclusion, nous avons décrit l’Ohmline qui est le premier inhibiteur lipidique de SK3 et qui pourrait devenir le premier membre d’une famille de composés lipidiques inhibiteurs de la formation de métastases
It has been shown that SK3 channel was a mediator of breast cancer cells migration, a fundamental property for metastasis formation. In addition, edelfosine inhibits SK3 channel. This ether-lipid owns a high anti cancerous potential in vitro but its clinical use was hampered by some side effects, Firstly, we showed the structural parts of edelfosine required for SK3 channel inhibition and cell motility inhibition. Moreover, we selected Ohmline (1-O-Hexadécyl-2-O-Méthyl-sn-glycéro-lactose), an edlefosine’s analogue that preserves SK3 channel and motility inhibitory properties. Secondly, we evaluated this lipid on tumor development in nude mice model. We showed that this lipid reduces metastasis formation without effect on primary tumor. To conclude, we described Ohmline, the first lipid inhibitor of SK3. This compound should become the first member of a new family of metastasis lipid inhibitors

Les cellules souches assurent le développement des tissus, leur renouvellement ainsique leur réparation suite à des blessures. L’une des questions clés du domaine de labiologie des cellules souches est l’identification des différents types cellulaires qu’unecellule souche peut donner. Les cellules souches peuvent être multipotentes, c’est-à-direcapables de donner naissance à plusieurs types cellulaires différents, ou unipotentes,c’est-à-dire qu’elles ne peuvent alors se différencier qu’en un seul type cellulaire. Lesexpériences de traçage cellulaire sont réalisées quotidiennement en biologie dudéveloppement et en biologie des cellules souches afin d’évaluer le devenir des cellulessouches in vivo. Cependant, il n’existe à ce jour aucune méthode rigoureuse permettantd’interpréter les résultats d’expériences de traçage cellulaire de manière non ambigüe etde déterminer la multipotence ou l’unipotence des cellules souches avec grande précisionet de manière statistiquement fiable. Nous avons développé de nouvelles méthodes afind’évaluer avec une très grande précision le caractère unipotent ou multipotent descellules souches du sein et de la prostate. Ces nouvelles découvertes démontrent demanière non ambigüe que la prostate provient de cellules souches multipotentes, alorsque seules des cellules souches unipotentes contribuent au développement et auremodelage de la glande mammaire au stade adulte. D’autre part, nous montrons que cesont des cellules souches multipotentes qui sont responsables des phases précoces dudéveloppement embryonnaire de la glande mammaire, et que ces cellules deviennentunipotentes peu avant la naissance. Nous avons étudié les mécanismes régulant le passagede l’état multipotent à l’état unipotent et démontrons que le facteur de transcription p63joue un rôle crucial dans la restriction du potentiel de différenciation des cellules souchesmammaires embryonnaires. Enfin, nous montrons que les cellules souches mammairesadultes, normalement unipotentes, peuvent redevenir multipotentes en conditionsphysiopathologiques telles que l’ablation spécifique d’une lignée cellulaire mammaire ouau cours de l’initiation tumorale. Nous essayons donc de comprendre de manière généraleles mécanismes impliqués dans le passage de l’état unipotent à l’état multipotent descellules souches mammaires adultes, et d’élucider les similarités existant entre lesdifférentes conditions dans lesquelles des cellules souches mammaires multipotentessont observées.
Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine)
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Le troisième Plan Cancer lancé en 2013 désigne la précocité du diagnostic comme l'un des enjeux majeurs pour l'amélioration de la prise en charge des patients. Malgré l’essor des modalités et des performances de l’imagerie médicale, il reste des défis à relever pour l’aide au diagnostic et optimiser le recourt à la biopsie.L’imagerie photonique et spécialement la fluorescence résolue spectralement a déjà été éprouvée pour la caractérisation ex vivo des tumeurs mammaires et pulmonaires, sans agent de contraste ou traitement des échantillons. Notre objectif est de caractériser les capacités d'un dispositif médical innovant, développé au laboratoire, utilisant une aiguille fibrée de faible calibre pour l’analyse spectrale de la fluorescence endogène de ces lésions in situ. Nos premiers travaux dans le cadre d’études précliniques et cliniques ont montré des différences significatives de signatures spectrales entre tumeurs bénignes et malignes ex vivo et in vivo. Nos résultats ont également mis en évidence les limites d’utilisation du dispositif, en termes de spécificité, pour certains types de lésions.Une étude secondaire a été entreprise sur des tumeurs mammaires afin d'identifier les entités tissulaires majeures à l'origine des signatures spectrales obtenues avec notre dispositif fibré. L'imagerie spectrale en microscopie confocale et seconde harmonique (SHG), en multiphoton, ont été mises en œuvre afin d’établir une cartographie de biomarqueurs endogènes des tissus mammaires. Nous avons confronter ses résultats aux données obtenues avec le dispositif d'aiguille fibrée afin de pouvoir le positionner non seulement comme une aide au diagnostic mais aussi comme une méthode prometteuse pour l’histopathologie in situ
The third Cancer Plan, launched in 2013, identifies early diagnosis as one of the major challenges for improving patient care. Despite the growth in medical imaging modalities and performance, challenges remain in diagnosis aid and optimizing the use of biopsy.Photonic imaging and especially spectrally resolved fluorescence has already been tested for the ex vivo characterization of breast and lung tumors, without contrast agent or sample processing. Our goal is to characterize the capabilities of an innovative medical device, developed in the laboratory, using a low-caliber fibered needle for the spectral analysis of the endogenous fluorescence of these lesions in situ. Our early work in preclinical and clinical studies showed significant differences in spectral signatures between benign and malignant tumors ex vivo and in vivo. Our results also highlighted the limits the device, in terms of specificity, for certain types of lesions.Another study was conducted on mammary tumors in order to identify the major tissue entities at the origin of the spectral signatures obtained with our fibered device. Spectral imaging in confocal and second harmonic microscopy (SHG), in multiphoton, has been implemented in order to establish a mapping of endogenous biomarkers of mammary tissues. We compare its results with the data obtained with the fibered needle device in order to position it not only as an aid to diagnosis but also as a promising method for in situ histopathology