Rozprawy doktorskie na temat „Développement de la souris”

Les gènes Msx sont des gènes à homéoboites très conservés qui sont exprimés dans un grand nombre de tissus et de structures embryonnaires. Chez les vertébrés, ces gènes sont exprimés dans la partie dorsale du tube nerveux. C'est à l'aide dès souris mutées pour les gènes Msx1 et 2 que nous avons étudié leurs fonctions à ce site. Les souris mutantes pour Msx1 présentent une hydrocéphalie caractérisée par une dilatation du troisième ventricule et des ventricules latéraux. L'analyse du cerveau de ces mutants révèle que l'organe sub-commissural (SCO), un neuroépithélium à fonctions sécrétrices, est altéré par la mutation. Cet organe se développe au niveau de la partie dorsale du prosomère P1. A ce site, Msx1 est exprimé au niveau de la ligne médiane dorsale. Or, nous avons pu montrer que les profils d'expression de Bmp6, Wnt1, Wnt3a, Msx1nlacZ étaient interrompus au niveau de la ligne médiane dorsale du prosomère P1. La ligne médiane dorsale organise et spécifie la partie dorsale du tube nerveux, et on constate, chez le mutant, une atténuation des gènes exprimés latéralement à la ligne médiane. De plus, nous avons pu mettre en évidence que Msx1 est nécessaire à l'expression de Wnt1, et que chez le poulet, Msx1 est capable d'induire l'expression ectopique de Wnt1. Enfin, chez les doubles mutants Msx1/2, on constate que l'expression de Wnt1 a disparu du diencéphale et est réduite au niveau du mésencéphale, ce qui confirme que Msx1 et 2 sont redondants et qu'ils régulent l'expression de Wnt1. Ces résultats nous ont conduits à proposer un modèle dans lequel les gènes Msx servent de relais entre la signalisation BMP, qui active leur expression, et Wnt1
Msx genes are highly conserved homeobox genes which are expressed prominently at sites of induction during development. In vertebrates, they are expressed at the dorsal midline of the neural tube. Using Msx1 and Msx2 mutant mice, we investigated their functions at this site. Msx1nlacZ mutant mice display a hydrocephalus which is characterised by the enlargement of the third and lateral ventricules. Histological analysis shows that the sub-commissural organ (SCO), a neurosecretory organ that derives from the dorsal part of prosomere 1, is abnormal in the mutant. Furthermore BMP6, Wnt3a, Wnt1, and Msx1nlacz expression profile is interrupted in the dorsal midline of prosomere1. Therefore, morphological and gene expression data indicate that a functional midline is not maintained along the whole prosomere 1 in these mutant mice. This results in the downregulation of genes expressed laterally to the midline in prosomere 1, confirming the importance of the midline as a signaling centre. Wnt1 is essential for dorso-ventral patterning. In the Msx1 mutant, Wnt1 is downregulated before the midline disappears, suggesting that its expression depends on Msx1. Electroporation in the chick embryo further demonstrates that Msx1 can induce Wnt1 expression in the diencephalon neuroepithelium and in the lateral ectoderm. In double Msx1/Msx2 mutants, Wnt1 expression is completely abolished at the dorsal midline of the diencephalon and rostral mesencephalon. This indicates that Msx genes regulate Wnt1 expression at the dorsal midline of the neural tube. Based on these results, we propose a model in which Msx genes are intermediary between BMP and WNT at this site

INTRODUCTION : Le but de ce travail était d'évaluer la faisabilité d'une technique d'étude IRM de la microcirculation placentaire chez la souris et de développer un outil complet d'étude de la perméabilité et de la perfusion placentaire in vivo. MATERIELS ET METHODES : Des souris Balb/c à J16 de gestation ont été observées. Une séquence IRM Fast SPGR a été mise au point pour développer un modèle d'analyse de la perfusion après injection d'agent de contraste. Certaines souris ont été randomisées pour recevoir une injection de noradrénaline avant la mesure de la perfusion. Ensuite a été développé un protocole de mesure de la perméabilité et de la perfusion, utilisant une séquence dynamique à deux temps d'écho. Un modèle d'analyse compartimentale original a été développé pour étudier les paramètres microcirculatoires. RESULTATS : 133 souris gestantes ont été utilisées. La perfusion du placenta in vivo a été mesurée à 1. 3 ml/min/gramme (+/- 0. 6) avec le modèle de perfusion physiologique. Il y avait une diminution significative de la perfusion placentaire in vivo après injection de noradrénaline. Avec le modèle complet, la perfusion était comparable : 1. 80 ml/min/g (+/- 0. 9) et la perméabilité ( PSr ) a pu également être mesurée. CONCLUSION : Ce travail a permis de mettre au point un outil unique et original d'évaluation de la perfusion et de la perméabilité placentaire in vivo. Il serait intéressant pour l'exploration de modèles murins de pathologies placentaires. S'il est transposable à l’Homme, il pourrait ouvrir de nouvelles perspectives pour la compréhension, l'évaluation et la surveillance des palhologies gravidiques liées au placenta
INTRODUCTION : This study was undertaken to develop a new model for placental perfosion and permeability assessment by using MRI with contrast agents in a mouse model. MATERIALS AND METHODS : Balb/c pregnant mice at 16 days of gestation were studied. 2D Fast SPGR sequential MRI was used to analyze placental perfusion following contrast agent injection. Some mice were randomly selected to receive noradrenalin injection prior to perfusion measurement. A complete model for both perfusion and permeability assessment was then developed, based on a single-slice dual echo 2D FSPGR sequence. An original three-compartmental model was developed and used to calculate quantitative microcirculation parameters. RESULTS : 133 mice were studued. Mean placental perfusion was 1,3 ml/min/g (+/- 0. 6) with the simple perfusion model. There was a significant decrease in placental perfusion following noradrenalin injection. Using the complete model, placental perfusion was 1,80 ml/min/g (+/-0. 9) and permeability ( PSr ) was measured as well. CONCLUSION: This approach gives a non invasive access to placental microvascular parameters including the perfusion and the permeability. It shows promises to study mouse model of placental diseases. If this approach is feasible and safe in humans, it may have potential for investigating the origin and course of IUGR, and for the management of compromised pregnancies

La stimulation cérébrale profonde (SCP) est une procédure chirurgicale utilisée dans le traitement de divers contextes pathologiques. Ce système, composé d’électrodes implantées dans une région cible du cerveau et d’un neurostimulateur reliés par un fil, permet de délivrer un courant électrique dans une région voulue du cerveau. À ce jour, les mécanismes d’action de la SCP et les effets cellulaires qu’elle engendre demeurent mal connus. Cette problématique découle du fait qu’il existe peu de prototypes de micro-stimulation dans le domaine de la recherche, sans compter que ceux-ci ne répondent pas bien aux critères de cette recherche. Mes travaux de maîtrise visaient donc à développer un système de microstimulation pouvant être utilisé chez la souris et de développer et valider toutes les techniques nécessaires à l’implantation de ce système chez la souris. Au terme de ces travaux, nous avons développé un système de micro-stimulation : 1) utilisable chez la souris 2) pour des protocoles de stimulation chronique de longue durée (jusqu’à 1 mois), 3) possédant des paramètres électriques, semblables à ceux utilisés chez l’humain en clinique, 4) pouvant être ajustés à différents contextes pathologiques. Nous avons aussi développé toutes les techniques nécessaires à son implantation chez la souris. Cet outil novateur permettra d’approfondir notre connaissance des mécanismes d’action et des mécanismes cellulaires sous-jacents aux effets de la SCP et pourra mener, à long terme, à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
La stimulation cérébrale profonde (SCP) est une procédure chirurgicale utilisée dans le traitement de divers contextes pathologiques. Ce système, composé d’électrodes implantées dans une région cible du cerveau et d’un neurostimulateur reliés par un fil, permet de délivrer un courant électrique dans une région voulue du cerveau. À ce jour, les mécanismes d’action de la SCP et les effets cellulaires qu’elle engendre demeurent mal connus. Cette problématique découle du fait qu’il existe peu de prototypes de micro-stimulation dans le domaine de la recherche, sans compter que ceux-ci ne répondent pas bien aux critères de cette recherche. Mes travaux de maîtrise visaient donc à développer un système de microstimulation pouvant être utilisé chez la souris et de développer et valider toutes les techniques nécessaires à l’implantation de ce système chez la souris. Au terme de ces travaux, nous avons développé un système de micro-stimulation : 1) utilisable chez la souris 2) pour des protocoles de stimulation chronique de longue durée (jusqu’à 1 mois), 3) possédant des paramètres électriques, semblables à ceux utilisés chez l’humain en clinique, 4) pouvant être ajustés à différents contextes pathologiques. Nous avons aussi développé toutes les techniques nécessaires à son implantation chez la souris. Cet outil novateur permettra d’approfondir notre connaissance des mécanismes d’action et des mécanismes cellulaires sous-jacents aux effets de la SCP et pourra mener, à long terme, à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Deep brain stimulation (DBS) is a surgical procedure used in the treatment of various pathologies. This system, composed of electrodes implanted in a target area in the brain and of a neurostimulator connected by a wire, allows the delivery of an electrical current in a specific area in the brain. To this day, mechanisms of action and cellular effects resulting from DBS remain poorly understood because of a lack of micro-stimulation tools available in the domain and by the fact that these tools do not properly address requirements of this research. To address this challenge, the objectives of my master’s research were to develop a micro-stimulation system usable in mice and to develop and validate required techniques to make this system work in small-sized rodents. Through this study, we have developed a micro-stimulation system that is : 1) usable in mice, 2) able to sustain a long term chronic stimulation (up to 1 month), 3) similar to those used in human in terms of electrical parameters and 4) offering the possibility of adjusting those parameters to various pathological contexts. We also developed the required techniques for its use in mice. This novel tool will allow to deepen our knowledge on the mechanisms of action and cellular mechanisms underlying DBS effects and possibly lead to the identification of new therapeutic targets.
Deep brain stimulation (DBS) is a surgical procedure used in the treatment of various pathologies. This system, composed of electrodes implanted in a target area in the brain and of a neurostimulator connected by a wire, allows the delivery of an electrical current in a specific area in the brain. To this day, mechanisms of action and cellular effects resulting from DBS remain poorly understood because of a lack of micro-stimulation tools available in the domain and by the fact that these tools do not properly address requirements of this research. To address this challenge, the objectives of my master’s research were to develop a micro-stimulation system usable in mice and to develop and validate required techniques to make this system work in small-sized rodents. Through this study, we have developed a micro-stimulation system that is : 1) usable in mice, 2) able to sustain a long term chronic stimulation (up to 1 month), 3) similar to those used in human in terms of electrical parameters and 4) offering the possibility of adjusting those parameters to various pathological contexts. We also developed the required techniques for its use in mice. This novel tool will allow to deepen our knowledge on the mechanisms of action and cellular mechanisms underlying DBS effects and possibly lead to the identification of new therapeutic targets.

Le glioblastome représente le sous-type de tumeur cérébrale le plus fréquent et le plus agressif. Malgré une meilleure compréhension de la maladie ainsi que l'émergence de nouvelles cibles, voire de nouveaux outils thérapeutiques, son pronostic reste inchangé. En effet, l'échec de l'extrapolation des résultats vers la clinique met en exergue la nature complexe de la maladie et la dimension décisive des modèles animaux adéquats et prédictifs dans l'étude des nouvelles thérapies. Et pour cause, un modèle animal idéal doit pouvoir reproduire les caractéristiques histo-pahologiques, génétiques et diagnostics de la pathologie humaine. Il doit avoir également une survie suffisante pour permettre la mise en place et l'évaluation de nouveaux traitements. Au cours de ce travail, nous avons développé un nouveau modèle de tumeur orthotopique chez la souris à partir de cellules de glioblastome humain cultivées en neurosphères. D'une façon similaire aux protocoles cliniques de neuro-imagerie, les techniques classiques d'IRM et les critères radiographiques ont été utilisés afin d'étudier la croissance tumorale de ce modèle ainsi que l'évaluation de sa réponse au traitement à base de temozolomide. Les observations par imagerie ont été complétées et/ou confirmées par examen histologique ainsi que par l'étude du transcriptome. Comme en clinique, ce nouveau modèle orthotopique présente une tumeur invasive et nécrotique, une résistance au temozolomide ainsi que des signatures moléculaires associées aux observations histologiques. De plus, ce modèle tumoral est caractérisé par une dynamique de signalisation promouvant l'invasion, la migration et la résistance à l'apoptose à l'origine de sa survie post-thérapeutique. Ainsi, ce modèle préclinique mime, au plus près, les caractéristiques de la pathologie humaine avec une médiane de survie des animaux de 82 jours, ce qui le rend pertinent pour l'évaluation préclinique des nouvelles stratégies thérapeutiques
Glioblastoma is the most common and aggressive subtype of brain tumors. Despite a better understanding of the disease and also the emergence of new therapeutic targets and strategies, the prognosis of patients remains unchanged. The failure to extrapolate preclinical results to the clinics highlights the complex nature of the disease and the importance of appropriate and predictive animal models for the study of new therapies. A pertinent animal model should be able to reproduce the characteristic of the human pathology in terms of disease development pattern, histological and transcriptomic specification, drug failure as well as diagnostic features. In this work, we developed a novel orthotopic mouse model derived from human glioblastoma spheres. Like in clinics, conventional MRI techniques and radiographic criteria were used to characterize tumor growth and treatment response to temozolomide. MRI findings have been completed and/or confirmed by histological examination and transcriptomic studies. Like clinically encountered tumors, this new orthotopic tumor model presents an infiltrating growth pattern, resistance to temozolomide and a molecular signature associated with histological features. In addition, this tumor model is characterized by a dynamic signaling pathway, which promotes cell invasion and migration as well as resistance to apoptosis and consequently to treatment. Thus, this preclinical model mimics clinical features of human glioblastoma and has a median host survival time of 82 days, which would be relevant in the assessment of preclinical therapies

Les modèles animaux actuellement disponibles pour l’étude des leucémies humaines ne sont pas adaptés pour le développement optimal de nouvelles thérapies ciblées. Au cours de ce projet, qui s’inscrit dans une double perspective fondamentale et industrielle, nous avons cherché à générer un modèle versatile de leucémogénèse humaine chez la souris humanisée BRGS (BALB/c Rag2-/- IL-2Rγc-/- SIRPα.NOD). Les animaux sont greffés avec des progéniteurs hématopoïétiques transduits par des vecteurs lentiviraux surexprimant les oncogènes MYC et BCL2 et placés sous le contrôle d’un promoteur ubiquitaire (EF1α ou SFFV). Le suivi longitudinal des animaux sur une période de 5 mois montre que seule la construction SFFV/Myc-T2A-Bcl2 entraîne la transformation des progéniteurs hématopoïétiques. Entre 12 à 14 semaines post-greffe, >90% des animaux développent des lympho-proliférations de type pro-B (CD19+CD10+CD9+CD20-cytIgM-) infiltrant principalement la rate et la moelle osseuse, et circulant en abondance dans le sang. Le caractère transmissible des tumeurs est validé par des greffes secondaires de tumeurs spléniques. Les cultures in vitro de progéniteurs hématopoïétiques suggèrent que l’émergence des blastes est liée à la réactivation d’un programme B latent dans les précurseurs T, dont le développement est bloqué. Nous avons développé en parallèle un modèle de tumeur autologue. L’ensemble de ces résultats valide le modèle de leucémogénèse humaine développé chez la souris humanisée BRGS et ouvre des perspectives pour la caractérisation fonctionnelle des mécanismes de leucémogénèse, et la validation préclinique de nouvelles stratégies anti-tumorales
Existing animal models for the study of human leukemia are not accurate for the proper development of innovative, targeted therapies. The aim of this project, which contains both a fundamental and an industrial perspective, therefore was to develop a new, versatile model of human leukemogenesis in the BRGS (BALB/c Rag2-/- IL-2Rγc-/- SIRPα.NOD) humanized mouse. Animals are grafted with hematopoietic progenitors transduced with lentivirals vectors to allow overexpression of MYC and BCL2 proteins under the control of an ubiquitous promotor (EF1α or SFFV). Longitudinal monitoring of the animals over five months shows that only the SFFV/Myc-T2A-Bcl2 construction induces the transformation of humans hematopoietics progenitors. Between 12 and 14 weeks post-transplantation, more than 90% of the animals develop pro-B lympho-proliferations (CD19+CD10+CD9+CD20-cytIgM-), with tumor cells being mainly found in the spleen, the bone marrow and in blood. Tumor transferability is achievable through secondary transplantation in immunodeficient mouse recipients. In vitro culture of bone marrow T cell progenitors suggest that the blasts arise from these cells after reactivation of a latent B cell program with blockade of their T cell development. In parallel, we have also developed an autologous tumor model. Altogether, these results validate the human leukemogenesis model constructed here in humanized BRGS mice and provide attractive prospects regarding the functional characterization of leukemogenesis and a preclinical validation of new anti-tumor strategies

Un modèle filarien chez la souris blanche est utile pour comprendre les pathologies filariennes car l'immunologie et la génétique de cet hôte sont beaucoup mieux connues que celles des autres mammifères utilisés en laboratoire. Il devient donc possible d'étudier à la fois les données parasitologiques, génétiques et immunologiques. D'un point de vue parasitologique, l'aptitude de deux filaires animales du genre litomosoides à se développer chez les souris (balb/c) est estimée en comparant les migrations larvaires, les rendements en filaires, les microfilarémies, les tailles des parasites, une dose plus ou moins élevée de larves est inoculée et les premières autopsies sont pratiquées dès le deuxième jour, les dernières deux mois plus tard. Bien que ces deux espèces, l. Sigmodontis et l. Galizai, soient proches, comme le montrent les analyses morphologique et iso-enzymatique, seule l. Sigmodontis arrive à maturité et produit des microfilaires sanguines. Les facteurs métaboliques paraissent ne jouer qu'un rôle très secondaire puisqu'un traitement par la cortisone lève totalement la résistance. Toutes les souches de souris n'ont pas la même réceptivité a l. Sigmodontis ; elle dépend du fond génétique et, dans une moindre mesure, du complexe majeur d'histocompatibilité. Chez les souris b10d2, d'haplotype h-2#d comme les souris BALB/c, le développement avorte quand les filaires sont de jeunes adultes et aucune souris ne devient microfilarienne. La réponse immunitaire a l. Sigmodontis differe chez les deux souches de souris. Les anticorps, particulièrement les IgM, apparaissent plus vite et les antigènes filariens sont plus rapidement reconnus chez les souris b10d2 résistantes. Mais la réponse de type th1 (ifng et il-2), qui active les défenses cellulaires, n'est pas plus importante chez cette souche. La réponse de type th2 (il-4, il-5 et il-10) est, par contre, beaucoup plus forte chez les souris BALB/c sensibles

Le tissu adipeux est un important site extra-hépatique de production de l'angiotensinogène, le précurseur de l'hormone angiotensine II qui possède des activités paracrines au sein de ce tissu. En effet, différentes approches in-vitro ont mis en évidence un rôle de l'ang II sur la différenciation et la maturation adipocytaire. De plus des données épidémiologiques ont montré une corrélation entre les niveaux plasmatiques d'angiotensinogène, la pression artérielle et l'indice de masse corporelle. Au cours de ma thèse j'ai réalisé une étude in-vivo concernant le rôle de l'angiotensinogène adipocytaire, au niveau local, sur le développement du tissu adipeux ainsi qu'au niveau endocrine, sur la régulation de la pression artérielle. Pour cela j'ai réalisé dans un premier temps une étude complète du tissu adipeux de souris déficientes en angiotensinogène (agt-/-) en comparaison à des souris témoins. Les souris agt-/- présentent des altérations dans le développement du tissu adipeux, un défaut de prise de poids en réponse à un régime hyperlipidique ainsi qu'une augmentation de l'activité locomotrice. Dans un second temps j'ai généré des souris transgéniques soit qui sur-expriment l'angiotensinogène adipocytaire, soit chez lesquelles l'expression de l'angiotensinogène est restreinte au tissu adipeux. Dans les deux cas, une expression ciblée de l'angiotensinogène dans le tissu adipeux permet un augmentation de la masse adipeuse ainsi que de la pression artérielle. Au terme de ces études, nos résultats ont montré que l'angiotensinogène adipocytaire joue à la fois un rôle local et un rôle endocrine, en faveur de son implication chez les patients obèses hypertendus
Adipose is an important extra-hepatic site of production of angiotensinogen, the precursor of angiotensin II which acts as a paracrine effector in this tissue. Several in-vitro approaches have shown a role of ang II on adipocyte differentiation and maturation. Moreover, epidemiologic studies have shown a correlation between plasmatic angiotensinogen, blood pressure and body mass index. During my Ph. D. I used to investigate the local role of adipocyte angiotensinogen in-vivo. For this purpose, I developed a characterization of adipose tissue of angiotensinogen deficient mice. These mice exhibit alteration in adipose tissue development, an impairment of diet induced weight gain and an increase in locomotor activity. I have also generated transgenic mice which either over-express adipose angiotensinogen, or in which angiotensinogen expression is restricted to adipose tissue. In both genotypes, targeted expression of angiotensinogen in adipose tissue increases fat mass and blood pressure. Altogether our results show that adipocyte angiotensinogen plays both a local role in adipose tissue development and an endocrine role in the regulation of blood pressure, supporting a role of adipose angiotensinogen in hypertensive obese patients

RORyt est un facteur de transcription exprimé par différentes populations de la famille des cellules lymphoïdes innées (ILC), parmi lesquelles les cellules inductrices d'organes et les cellules NKR⁺RORyt⁺. Nous proposons ici un modèle de différenciation des ILC RORyt⁺ à partir du progéniteur lymphoïde commun (CLP). Par des cultures clonales de CLP de foie fœtal, nous montrons qu'il existe un progéniteur commun aux cellules B, T, NK et RORyt⁺. Le CLP perd successivement le potentiel B puis T, parallèlement à l'acquisition des marqueurs α4ß7 et CXCR6. L'acquisition de RORyt se fait dans l'environnement du foie fœtal. Les précurseurs RORyt⁺ sont retrouvés dans la circulation sanguine et les ébauches des organes périphériques. Nous identifions deux précurseurs RORyt⁺ distincts, l'un se différenciant en cellules RORyt⁺CCR6⁺ et l'autre en cellules NKR⁺RORyt⁻in vitro. Ces deux précurseurs RORyt⁺se différencient indépendamment dans le foie fœtal et sont observés dans la rate et les ébauches des ganglions mésentériques. Nous établissons également leur potentiel de différenciation in vivo. L'analyse de souris permettant de tracer les cellules ayant exprimé RORyt montre que les cellules NK issues de précurseurs RORyt⁺ se développent et se maintiennent dans les organes périphériques déjeunes souris adultes. L'étude des ILC RORyt⁺adultes montre que la moelle osseuse ne contient pas de cellules RORyt+et que les progéniteurs de la moelle osseuse ne se différencient pas en cellules RORyt⁺/n vitro. Par des expériences de transfert, nous identifions le CLP comme le précurseur des ILC RORyt⁺ observées dans les organes périphériques adultes. Des populations présentant un phénotype de CLP sont observées dans la lamina propria et la rate de souris adultes. Ces CLP périphériques son capables de se différencier in vitro en cellules RORyt⁺, indiquant que le progéniteur adulte des ILC RQRyt⁺ doit migrer vers la périphérie pour recevoir le signal nécessaire à sa différenciation
RORyt is a transcription factor expressed by several populations of innate lymphoid cells (ILC), like lymphoid tissue inducer cells and NKR+RORyt+ cells that co-express RORyt and the NK cell receptor, NKp46. Here, we propose a model for RORyt+ ILC differentiation from the common lymphoid progenitor (CLP). Based on clonal assays of fetal liver CLP, we hâve shown that B, T, NK and RORyt+ cells are originating from a common progenitor. CLP lose B and T potential as they express a4b7 and CXCR6 respectively. The acquisition of RORyt occurs in the fetal liver. RORyt+precursors are observed in the blood and in the anlagen of peripheral organs. We have identified two distinct RORyt+ precursors that differentiate into RORyt+CCR6+ and NKR+RORyf cells. These precursors develop independently in the fetal liver. They are also observed in the spleen and the anlagen of mesenteric lymph nodes. We have also established the potential of these precursors in vivo by transfer into immunodeficient mice. The analysis of fate-mapping mice has shown that RORyt+-derived NK cells develop and are maintained in the peripheral organs of young adult mice. In adult mice, the bone marrow does not contain RORyt+ and in vitro cultures of bone marrow progenitors do not give rise to RORyt+ cells. Transfer experiments allowed us to identify the CLP as the progenitor of adult RORyt+ ILC. Populations that display a CLP phénotype are observed in the spleen and the lamina propria of adult mice. These peripheral CLP differentiate into RORyt+cells in vitro, indicating that the adult progenitor of RORyt+ ILC has to migrate to the periphery to receive the signal required for its differentiation

Une méthode simple et rapide d'activation de l'ovocyte par l'ionophore calcique permet de disposer d'un modèle expérimental pour l'étude de l'empreinte génomique : l'embryon parthénogénétique, qui ne possède qu'un génome d'origine maternelle. La comparaison avec l'embryon caryogame (génomes paternel et maternel) permet d'évaluer l'importance de chaque génome pour les fonctions étudiées. Les résultats des dosages de la S-Adénosyl-Méthionine (cofacteur des méthylases), de la S-Adénosyl-Homocystéine (produit des transméthylations), de l'activité ADN méthyltransférase et du taux de méthylation de l'ADN génomique au cours du développement préimplantatoire sont comparables dans l'embryon parthénogénétique et dans l'embryon caryogame. Ainsi, le parthénote possède de bonnes potentialités de régulation de la méthylation de l'ADN et il ne présente pas d'anomalie pour les voies métaboliques en amont de l'ADN méthyltransférase. Quelle que soit l'approche expérimentale utilisée, le développement préimplantatoire se caractérise par une déméthylation de l'ADN, qui semble être un prérequis à l'établissement des profils de méthylation spécifiques des lignées cellulaires différenciées. Les profils d'expression des gènes de trois facteurs de croissance (Transforming growth factor-alpha, transforming growth factor-betal et transforming growth factorbeta2) ont été suivis pendant le développement préimplantatoire par hybridation in situ fluorescente. Ils sont similaires dans dans les deux types d'embryons, ce qui exclut une empreinte maternelle pour ces trois gènes
[A simple and rapid method was used ta activate mouse ovocytes with calcium ionophore. So, we could have an experimental tool to study genomic imprinting by comparing two different sets of embryos: parthenogenetic embryo, that has only a maternal genome and caryogamic embryos, that has bath a maternal and a paternal genome. Dosages of S-Adenosyl methionine (methylase cofactor), S-Adenosyl-Homocysteine (transmethylation product), DNA methyltransferase activity and methylation level of genomic DNA gave similar results for parthenogenetic (maternal genome only) and caryogamie (maternai and paternal genomes) preimplantation embryos. This demonstrates that parthenogenotes are able to regulate DNA methylation and that there is no lack upstream the DNA methyltransferase. Whatever the experimental approach used, preimplantation development is characterised by DNA demethylation, that seems necessary to establish specific methylation patterns of differentiated cell lines. Expression patterns of three growth factor genes (Transforming growth factor-alpha, transforming growth factor-betal et transforming growth factor-beta2) were followed during preimplantation development using fluorescent in situ hybridisation. These patterns were similar in both types of embryos, suggesting that none of these three genes is maternally imprinted. ]

Les mRNP subissent divers remodelages dans la cellule nécessaires à leur localisation, traduction et dégradation. Parmi les composantes de certaines mRNP cellulaire, G3BP est une endoribonucléase capable de cliver spécifiquement les ARNm. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont permis d’établir que cette protéine est impliquée dans la régulation de la traduction de façon dépendante de son état de phosphorylation. Cette phosphorylation contrôle également sa localisation en réponse à un stress oxydatif. En effet, nos travaux montrent que G3BP, est une composante majeure des granules de stress (SG) induites par l’arsenite. Afin d’appréhender le rôle de G3BP in vivo, nous avons réalisé l’invalidation du gène G3BP par recombinaison homologue chez la souris et analysé ses conséquences phénotypiques sur deux fonds génétiques différents (129Sv et 129Sv/Balb-C). Nous avons, ainsi, pu démontré que G3BP est un gène important pour la prolifération cellulaire et la survie des neurones. Deux phénotypes sont, en effet, associés à l’absence de G3BP quelque soit le fond génétique: 1) un retard de croissance de toutes les souris G3BP-/-, 2) une mortalité neuronale massive par apoptose dans les diverses régions du système nerveux central (CNS). L’analyse du transcriptome des fibroblastes sauvages et KO par des puces Affymetrix, a révélé que l’absence de G3BP se traduit par une altération de l’expression de 53 gènes. Parmi ces gènes, deux groupes de gènes ont attiré notre attention : des gènes soumis à l’empreinte génomique et des gènes appelés growth arrest specific genes dont l’expression est souvent corrélée à un arrêt de prolifération
From sites of transcription in the nucleus to of the cytoplasm, messenger RNAs are associated with RNA-binding proteins (RBP). These proteins influence pre-mRNA processing as well as the transport, localization, translation and stability of mRNAs. In our lab, we are interested in an RBP, G3BP, which behaves as an endoribonuclease responsible for mRNA degradation. During my thesis, we have demonstrated that phosphorylation of G3BP regulates its localisation and its function in translation. G3BP is hypo-phosphorylated in cells exposed to arsenite and is recruited to stress granules (SGs). Therefore, G3BP is likely to control the fate of mRNPs after recovery from stress. In order to determine the function(s) of G3BP in vivo, we have employed a gene deletion strategy in mice. All G3BP-/- mice show growth retardation and massive apoptosis of neurons in the central nervous system. Monitoring the global expression pattern, using Affymetrix oligonucleotide arrays, in isolated wild-type (WT) and G3BP knockout (KO) fibroblasts, we show that the expression of the growth arrest specific genes and imprinted genes was specifically increased in the absence of G3BP. The results demonstrate that G3BP is essential for proper embryonic growth and development by mediating the coordinate expression of multiple imprinted growth-regulatory transcripts

Cette thèse comprend cinq manuscrits d'articles. Deux de ces manuscrits sont publiés, l’un est actuellement en révision et deux sont en préparation pour soumission.Les animaux diffèrent de manière stable au cours du temps et dans différents contextes dans leur comportement, un phénomène souvent nommé personnalité animale. Les animaux diffèrent ainsi dans leur niveau d’expression de différents traits de personnalités. Cependant l’étude de la stabilité des traits de personnalité chez les jeunes animaux apporte des résultats controversés. Les deux principaux objectifs de cette thèse ont donc été d’évaluer comment l’environnement précoce des animaux façonnait leur personnalité et si l’expression de leur comportement était stable au cours du développement. Notre modèle d’étude était un petit rongeur d’origine sauvage, la souris glaneuse Mus spicilegus. Cette souris se trouve dans les zones agricoles d’Europe centrale et orientale. Il s'agit d'une espèce monogame et la femelle et le mâle participent aux soins parentaux. Les principaux résultats de cette thèse soulignent la stabilité des réponses comportementales des souris glaneuses dans des contextes sociaux et non-sociaux tôt lors de la période post-natale jusqu’à la maturité. De nombreux traits de personnalité étaient associés à travers différents contextes ; formant ainsi ce qu'il est convenu d'appeler un syndrome comportemental. Cette stabilité dans le comportement était avérée que l'analyse porte sur la totalité de l'échantillon ou qu'elle prenait en compte les différences intra-portées. L’environnement précoce et en particulier la présence du père apparaissent déterminants dans l’émergence et la modulation de la personnalité. Les individus élevés sans père montraient une plus grande réactivité dans deux tests différents par rapport à ceux élevés avec les deux parents. Différentes personnalités étaient associées à des mécanismes physiologiques. Confrontés à un stresseur chronique, les individus exprimant différentes personnalités montraient des différences physiologiques caractérisées par des profils immunologiques et hormonaux distincts. D'autre part les couples possédant des scores similaires d’anxiété, indépendamment du score des deux partenaires du couple, avaient une plus grande probabilité de reproduction durant la période d’observation, que les couples aux scores différents suggérant de potentiels avantages évolutifs. Cette thèse aborde en parallèle les aspects proximaux et ultimes du comportement chez un même modèle biologique ce qui est un but rarement atteint dans une étude éthologique
This thesis includes five manuscripts. Two are already published, one is currently under review and two others are in preparation for submission.Animals frequently show consistent individual differences in behaviour across time and contexts, a phenomenon called animal personality. Animals have been thus described to differ in the expression level of different specific personality traits. However, consistencies in animal personality traits in young animals are especially controversial. One of the main aims of this thesis was therefore to investigate how the early environment experienced shapes the behavioural phenotype and whether the expression of behaviour remains stable over ontogeny. To this end, we used a small rodent of wild origin, the mound-building mouse Mus spicilegus, as an animal model. This monogamous mouse occurs in a variety of agricultural and steppe-like habitats in Central and South Eastern Europe, and is characterized by bi-parental care. The main results of this thesis highlight the consistency of personality traits in the mound building mouse from the early postnatal period until around maturity, both in social and non-social contexts. Various personality traits were associated across context, thus forming a behavioural syndrome. Such consistencies across time and context were present when looking at the individual level but also when focusing on the relative differences among siblings within a litter. The early developmental environment proved to be decisive in modulating the emergence personality of the individual, via the presence or absence of the father. Pups growing up in absence of the father showed indications of a higher responsiveness in two different tests compared to pups raised by mothers only. We showed how personality differences are related to physiological parameters. Different personality types coped physiologically different with a chronic stressor, apparent by their hormonal and immunological profiles. Pairs with similar anxiety scores, independently of the scores of both partners of the pair, had a higher probability of breeding, and brought forward the onset of breeding during the observation period, which carries along potential fitness benefits. This dissertation brings thus together some insights into the proximate and ultimate aspects underlying consistent individual differences in behaviour, which is seldom the case in a same model species

La SLA est une maladie neurodégénérative se caractérisant par la perte progressive et sélective des neurones moteurs. une mutation dans le gène codant pour VAPB a été associée avec la SLA. VAPB est une protéine du réticulum endoplasmique (RE) qui jouerait un rôle dans le transport de protéines et dans la réponse du RE aux protéines mal repliées. J'ai utilisé la technique de transfert viral de gène pour induire l'expression de VAPB humaine (hVAP-Bwt et hVAP-BP56S) dans les neurones moteurs in vitro. Nous avons observé que hVAPBP56S forme des agrégats cytoplasmiques et que la surexpression de hVAPBwt et hVAPBp56s induit la mort des neurones via un mécanisme dépendant du RE et du calcium. Dans les cellules Cos-7, l'expression de hVAP-Bwt et hVAP-Bp(-s bloque l'activité du protéasome via l'activation d'un stress du RE et la séquestration de la sous-unité 20S. Enfin, nous avons développé des souris transgéniques hVAPBp56s mais elles ne développent aucun phénotype moteur
ALS is a neurodegenerative disease characterized by a selective loss of motor neurons. A mutation in VAPB protein has been associated with ALS. VAPB, an endoplamic reticulum (ER) resident protein is proposed to play a role in protein transport and in the unfolded protein response. To manipulate VAPB (hVAPBwt and hVAPBp56s) expression in motor neurons in vitro, I used the viral gene transfer technology. hVAPBp56s induces selective motor neuron death which involved an ER-related pathway dependent on calcium signals. Studies on Cos-7 cells showed that hVAPBwt and hVAPBp56s impair the proteasome activity through the activation of ER stress and the sequestration of the 20S subnit. Moreover, we developed transgenic mice overxpressing hVAPBp56s which do not display any motor disorder

Les premières étapes du développement chez les vertébrés sont sous le contrôle de l’activité combinée de facteurs extrinsèques, dont font partie l’acide rétinoïque (AR) et les protéines Shh et Fgfs. Leur intégration par les progéniteurs conduit d’une part à l’acquisition d’une identité spatiale et, d’autre part à leur différenciation. Lors de mes travaux de thèse, je me suis intéressée à l’importance de la régulation des niveaux d’AR lors de ces étapes, en analysant les phénotypes histologiques et moléculaires de souris porteuses de mutations nulles pour une enzyme de synthèse de l’AR, Raldh2, et pour le cytochrome Por, dont dépendent, entre autres, les enzymes de dégradation de l’AR, Cyp26s. Nous avons montré que des niveaux appropriés d’AR sont nécessaires à la spécification des axes antéro-postérieur et proximo-distal des cellules mésenchymateuses des bourgeons de membres, au maintien de plusieurs territoires du cerveau antérieur, ainsi qu’à la détermination des progéniteurs épiblastiques donnant naissance au mésoderme somitique et au neuroépithélium caudal. Chez ces mutants la morphogénèse de ces différents tissus est également sévèrement affectée, probablement à cause d’anomalies dans le cycle et/ou les mouvements cellulaires des progéniteurs. Enfin, nous avons mis en évidence des interactions entre les voies de signalisation rétinoïde et celles des Fgfs et de Shh au sein des différents tissus. Nos données suggèrent que la compétence des cellules du mésoderme et du neuroectoderme à répondre à Shh dépend de l’activité en AR
The initial steps of vertebrate development are tightly controlled by the combined action of extrinsic factors, such as retinoic acid (RA) and the proteins Shh and Fgfs. Their integration at the level progenitors leads to the establishment of a spatial identity and to their differentiation. My PhD work dealt with the relevance of the regulated RA levels by two sets of enzymes, the RA-synthesizing enzyme Raldh2 and the cytochrome oxidoreductase Por, whose function is required for the activity of the RA degrading enzymes, the Cyp26s. Using two mouse mutants for these enzymes, we show that appropriate levels of RA are required for the specification of limb bud cells along the antero-posterior and the proximo-distal axis, for the maintenance of several progenitor domains within the forebrain, as well as for the correct patterning of the epiblast, that will give rise to the neuroectoderm and the mesoderm. Morphogenesis of tissues was also severely affected in our mutants, probably as a consequence of cell cycle and/or cell movement defects. Our data also indicate that RA signalling interferes with Shh and Fgf signalling at different levels depending on the cell type examined. These findings support the idea that the competence to a cell to respond to Shh signalling relies on RA activity

Le pancréas est une glande mixte à composantes endocrine et exocrine. Le tissu endocrine, essentiellement composé de cellules bêta productrices d’insuline, joue un rôle prépondérant dans le maintient de l’homéostasie glucidique. La perte qualitative ou quantitative des cellules bêta conduit au développement de pathologies caractérisées par une hyperglycémie chronique et connues sous le nom de diabète. Le développement de stratégies thérapeutiques innovantes, thérapie cellulaire ou médecine régénérative, pour guérir le diabète repose sur une connaissance précise des mécanismes développementaux impliqués dans la formation des cellules bêta. Ainsi, au delà de l’intérêt cognitif, il est primordial de comprendre au mieux les évènements cellulaires et moléculaires qui régissent l’organogénèse pancréatique pour offrir des thérapies alternatives. Le développement embryonnaire s’effectue dans un environnement où la pression partielle en oxygène (pO2) est faible. Par ailleurs, une étude menée au sein du laboratoire a montré que la pO2 influence la différenciation des cellules bêta pancréatique in vitro. En effet, lorsque des pancréas embryonnaires sont cultivés sur filtre en hypoxie (pO2=3%), le développement des cellules bêta est drastiquement diminué comparativement à une condition de 21% d’O2. Le facteur de transcription HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor-1), composé d’une sous-unité alpha sensible au niveau d’oxygène et d’une sous-unité bêta constitutivement présente, permet à la cellule de s’adapter à un environnement pauvre en O2, notamment en favorisant la formation de nouveaux vaisseaux sanguins au cours d’un processus appelé angiogénèse. L’objectif de ma thèse était d’étudier le rôle de HIF-1alpha au cours du développement embryonnaire du pancréas in vivo. Pour cela, nous avons utilisé des lignées murines génétiquement modifiées permettant de stabiliser constitutivement la protéine HIF-1alpha dans l’épithélium pancréatique. En utilisant ce modèle murin, nous avons montré que la différenciation endocrine et le développement des cellules bêta est altéré dans les pancréas mutants comparativement aux contrôles. Par ailleurs, en utilisant une approche pharmacologique in vitro conduisant à l’ablation des cellules endothéliales du pancréas, nous avons pu restaurer une différenciation endocrine comparable aux contrôles. Ce travail a permis d’éclaircir le rôle de HIF-1 et de la vascularisation au cours du développement embryonnaire du pancréas. Nos résultats indiquent que ces paramètres doivent être pris en compte pour améliorer les protocoles actuels permettant de générer des cellules bêta in vitro
The pancreas is an endoderm-derived organ which is composed by both an exocrine and an endocrine compartment. Within the endocrine tissu, insulin-producing beta-cells are essential for the regulation of glucose homeostasis. The loss of beta-cells can lead to pathologies such as diabetes. Currently, people suffuring from diabetes can be treated but not permanently cured. The development of innovating therapeutical approaches, like cellular therapy or regenerative medecine, relies on the precise knowledge of the mechanisms regulating the ontogenesis of pancreatic beta-cells. Different studies have linked proper embryonic development and low-oxygen tension (pO2). Specifically, when embryonic pancreases are cultured in vitro under a hypoxic condition (pO2=3%), the beta-cells development is impaired compared to a normoxic condition (pO2=21%). Different pathways are involved in the cell adaptation to hypoxia, such as the ubiquitous Hypoxia Inducible Factor 1-alpha (HIF-1alpha). The aim of my PhD project was to elucidate the role of HIF-1alpha during pancreatic development in vivo. To do so, we used genetically modified mice allowing the constitutive stabilization of HIF-1alpha in pancreatic epithelial cells. We have shown that HIF-1alpha stabilization leads to a reduction of endocrine differentiation and beta-cells development. Moreover, using a pharmacological approach in vitro consisting in deleting endothelial cells, we rescued the endocrine differentiation in the mutant pancreases. In conclusion, my data demonstrated the negative influence of both HIF-1 and endothelial cells on endocrine differentiation processes

Un des mécanismes qui contribuent à maintenir une tolérance vis-à-vis de ses propres constituants est l'immunosuppression active exercée par des sous-populations lymphocytaires immunorégulatrices. Parmi celles-ci, une population de lymphocytes T (LT) CD8+ régulatrice est caractérisée par un niveau très faible d'expression de la molécule de co-stimulation CD28. Les lymphocytes T régulateurs CD8+CD28low (Treg) fraîchement isolés préviennent le développement d'une maladie inflammatoire intestinale induite par le transfert de cellules T naïves CD4+CD45RBhigh chez la Souris immunodéficiente. L'IL-10 et le TGF-ß sont deux cytokines immunosuppressives indispensables à cette protection. De façon intéressante, un défaut de l'activité suppressive des LT CD8+ (mais pas CD4+) isolés à partir du côlon de patients atteints de maladies inflammatoires chroniques intestinales a été décrit. L'ensemble de ces données suggère un rôle important des Treg CD8+ dans le maintien de l'homéostasie immunologique de l'intestin. La sélection du répertoire des Treg capables d'inhiber l'inflammation intestinale reste inconnue. Nous avons testé la capacité des Treg CD8+CD28low isolés à partir de souris déficientes pour AIRE à prévenir le développement d'une colite expérimentale. Ce facteur de transcription permet l'expression d'antigènes des tissus périphériques dans les cellules épithéliales de la medulla du thymus ainsi que dans les cellules stromales des nœuds lymphatiques et participe ainsi à l'induction d'une tolérance envers les antigènes du soi. Alors que les lymphocytes T CD8+CD28low AIRE-/- sont fonctionnels in vitro, ces cellules sont incapables de prévenir une colite expérimentale. Cette observation suggère fortement qu'AIRE est impliqué dans la sélection des Treg CD8+CD28low et pourrait moduler le TCR-répertoire de cette population. Nous nous sommes également intéressés à l'identification des cibles de l'IL10 ainsi qu'au rôle de l'enzyme IDO (indoléamine 2,3-dioxygénase) dans la protection de la colite expérimentale par les LTreg CD8+CD28low. Une meilleure compréhension des mécanismes d'action et du développement des Treg CD8+CD28low capables de contrôler l'inflammation intestinale devrait ouvrir la voie au ciblage de cette population à des fins thérapeutiques
Immunological unresponsiveness to self and innocuous non-self antigens is in large part assured by regulatory T lymphocytes. While CD4+ T lymphocytes have recently attracted most attention, several CD8+ regulatory T cell populations are also thought to play an important role in immunoregulation. One of these CD8+ populations is characterized by low-level expression of the co-stimulatory molecule CD28. CD8+CD28low regulatory T cells (Treg), freshly isolated from unmanipulated wildtype mice, prevent inflammatory bowel disease (IBD) induced by transfer of CD4+CD45RBhigh T-cells into immunodeficient mice. IL-10 and TGF-ß play a crucial and non-redundant role in prevention of experimentally induced colitis. Importantly, defects in the immunosuppressive activity of CD8+ (but not CD4) cells from colonic biopsies of patients affected by inflammatory bowel disease have been described, suggesting a critical role of CD8+ Treg in the prevention of this pathology. The selection of the Treg TCR-repertoire inhibiting intestinal inflammation remains a largely unexplored issue. We have assessed the capacity of CD8+CD28low Treg isolated from AIRE-deficient mice to prevent experimental colitis. This transcription factor allows for expression of tissue-antigens in thymic medullary epithelial as well as lymph node stromal cells and thereby induces tolerance to self-antigens. Whereas they were fully functional in in vitro suppression assays, AIRE-deficient CD8+CD28low failed to prevent experimental colitis. This observation strongly suggests that AIRE shapes the TCR-repertoire CD8+CD28low Treg. We also searched for the cellular target of Treg-derived IL-10 and assessed the potential role of IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase) in the prevention of colitis by CD8+CD28low Treg. A better comprehension of the molecular suppressor mechanisms and of the development of CD8+CD28low Treg involved in control of intestinal inflammation should ultimately lead to development of novel and genuinly curative therapies for the treatment of IBD

La divergence des deux premiers lignages de l'embryon de souris (trophectoderme et masse cellulaire interne, MCI) résulte de divisions asymétriques lors de la transition 8/16 cellules. La formation d'un pôle de microvillosités au stade 8 cellules, et sa stabilité durant la mitose sont essentiels pour cette divergence. Nous nous sommes intéressés à l'ezrine, une protéine impliquée dans la formation des microvillosités. Cette protéine est présente pendant tout le développement précoce de la souris, et suit strictement la distribution des microvillosités : elle disparaît des contacts cellulaires après la compaction, et s'accumule au pôle de microvillosités où elle se maintient durant la mitose. Une nouvelle forme apparait au stade 8, et sa quantité augmente durant les stades suivants. Nous avons isolé des MCI à partir de jeunes blastocystes, lesquelles réalisent une rapide différenciation éphitéliale de novo lorsqu'elles sont cultivées in vitro. .
The divergence between the first two lineages of the early mouse embryo (trophectoderm and inner cell mass, ICM) results from asymmetric divisions that take place at the 8-to 16 cell transition. The formation of a pole of microvilli at compaction during the 8-cell stage and its stability during mitosis are crucial for this divergence. Thus, we were interested in ezrin, an actin-binding protein involved in the formation of microvilli. In the mouse embryo, it is present throughout preimplantation development, and it follows exactly the distribution of microvilli : it disappears from cell contacts after compaction and accumulates specifically at the microvillous pole where it remains stable during mitosis. A new form appears at the 8-cell stage, and its amount increases during the following stages. We have isolated ICM from young blastocysts, which undergo a rapid epithelial differentiation de novo when cultured in vitro. .

La dégénérescence striatonigrique (DSN) est une maladie neurodégénérative qui associe l'atteinte de la substance noire pars compacta (SNc) et du striatum. Après avoir validé un test de mesure de la longueur du pas chez la souris, nous avons étudié les conséquences de lésions induites par l'acide 3-nitropropionique (3-NP) et avons caractérisé un syndrome moteur spécifique corrélé au degré d'atteinte striatale ainsi qu'une altération des performances motrices et une perte neuronale dans la SNc dose-dépendantes. Nous avons ensuite étudié le rôle de la dopamine sur l'intégrité striatale et avons mis en évidence une augmentation de l'effet du 3-NP chez des souris hyperdopaminergiques ainsi que des troubles moteurs spontanés associés à une atteinte striatale modérée. Nous avons ensuite développé un modèle de DSN par intoxication combinée au 3-NP+MPTP, caractérisé par une absence d'interactions entre les deux neurotoxiques et une augmentation des troubles moteurs et de l'atteinte striatale
Striatonigral degeneration (SND) is a neurodegenerative disease combining loss of substantia nigra pars compacta (SNc) and striatal neurons. We first validated a stride length test in the mouse and studied the consequences of 3-nitropropionic acid (3-NP) induced lesions and demonstrated a characteristic motor syndrome correlated with the extent of striatal neuronal loss while a dose-dependant motor impairment and neuronal loss in the SNc. We then studied the role of dopamine upon striatal functioning and demonstrated a hypersensitivity to 3-NP in hyperdopaminergic mice, together with spontaneous motor deficits and striatal neuronal loss. Finally, we developped a model of SND using combined MPTP+3-NP intoxication and characterized by a lack of interactions between the two neurotoxins, increased behavioural troubles, motor impairments and striatal injury

La méthylation des cytosines est une modification épigénétique catalysée par la famille des ADN méthyltransférases (DNMTs). C’est une marque répressive lorsqu’elle est adressée sur les îlots CpG des promoteurs de gènes. Le développement embryonnaire murin est caractérisé par une reprogrammation de la méthylation de l’ADN qui est critique pour le développement de l’embryon. Cependant, la contribution des différentes DNMTs dans la méthylation du génome ainsi que les mécanismes qui ciblent la méthylation de l'ADN vers certains gènes durant le développement embryonnaires sont mal connus. En combinant des approches de cartographie génomique avec des lignées génétiquement modifiées de souris, mes travaux de Thèse ont permis de clarifier la contribution des différentes DNMTs dans la méthylation du génome dans l’embryon : DNMT3A et DNMT3B sont strictement impliqués dans la méthylation de novo, et DNMT1 est strictement impliqué dans son maintien au cours des divisions cellulaires. De plus, l’analyse d’embryons globalement déméthylés a révélé de nombreuses fonctions de la méthylation de l’ADN dans le maintien de l'intégrité transcriptomique de l'embryon en réprimant des gènes gamétiques, des gènes du développement, des promoteurs cryptiques ainsi qu’un large panel de transposons. Dans un deuxième temps, j’ai étudié le rôle du facteur de transcription E2F6 dans le ciblage de la méthylation de l'ADN in vivo chez la souris. Mes résultats démontrent que E2F6 facilite l’acquisition de la méthylation de l’ADN au niveau du promoteurs des gènes gamétiques et est nécessaire pour initier leur répression à long terme au cours de l'embryogenèse. Dans leur ensemble, ces travaux contribuent à mieux comprendre les fonctions et mécanismes de ciblage de la méthylation de l'ADN au cours de l'embryogenèse des mammifères
Cytosine methylation is an epigenetic modification catalyzed by the family of DNA methyltransferases (DNMTs). This modification is involved in gene repression when it is addressed to CpG islands in gene promoters. Global DNA methylation reprogramming occurs in mice during the early phases of embryogenesis, which is critical for proper embryo development. However, the contribution of different DNMTs in genome methylation and the mechanisms that target DNA methylation to specific genes during embryonic development are poorly understood. By combining genomic mapping with genetically modified mouse lines, my Thesis work clarified the contribution of the different DNMTs in genome methylation in the embryo: DNMT3A and DNMT3B are strictly involved in de novo methylation, and DNMT1 is strictly involved in the maintenance of DNA methylation during cellular divisions. In addition, the analysis of globally demethylated embryos revealed numerous functions of DNA methylation in maintaining the transcriptomic intergrity of the embryo by repressing germline genes, developmental genes, cryptic promoters as well as a large panel of transposons. In the second part of my Thesis, I studied the role of the E2F6 transcription factor in the targeting of DNA methylation in vivo in mice. My results demonstrate that E2F6 facilitates the acquisition of DNA methylation in the promoters of germline genes and is required to initiate their long-term epigenetic silencing during embryogenesis. Collectively, this work contributes to a better understanding of the functions and targeting mechanisms of DNA methylation during mammalian embryogenesis

Le génome des mammifères contient deux gènes ERK/MAP kinase kinase, soient Mek1 (Map2k1) et Mek2 (Map2k2), qui codent pour des enzymes responsables de l’activation de ERK1/2. Chez la souris, la perte de fonction de Mek1 engendre une mortalité embryonnaire, tandis que les mutants Mek2 survivent sans aucun phénotype apparent. Afin d’élucider les fonctions potentielles associées à MEK2 durant l’embryogenèse, la perte de Mek2 a été étudiée en présence d’une haplo-insuffisance de Mek1. La majorité des embryons Mek1+/-Mek2+/- meurent durant la gestation due à des défauts placentaires affectant les tissus extraembryonnaires. Ainsi, bien que Mek1 joue un rôle prédominant, ces résultats mettre en lumière l’implication de Mek2 durant le développement du placenta. La caractérisation histologique des placentas Mek1+/-Mek2+/- a révélé une diminution de la vascularisation et la formation aberrante de cellules trophoblastiques géantes multinucléées (MTG). Des expériences génétiques de traçage cellulaire in vivo ont démontré que les cellules MTG dérivent d’une différenciation aberrante des SynT-II et que leur formation découle en partie d’un effet cellule autonome. Un second objectif de cette thèse était de mieux caractériser le ou les types cellulaires nécessitant une activation de la voie ERK/MAPK essentielle au développement placentaire. Des analyses génétiques et histologiques ont démontré que la formation des cellules MTG résulte d’une fusion ectopique entre les deux couches de SynT qui participent normalement de façon indépendante à la barrière hématoplacentaire. La barrière hématoplacentaire est constituée d’une double couche de SynT et de cellules dérivées de l’allantoïs, soient les cellules endothéliales et leurs péricytes. La délétion d’un allèle supplémentaire de Mek1 dans l’allantoïs des mutants Mek1+/-Mek2+/- augmente la pénétrance et l’expressivité du phénotype placentaire. De plus, les expériences d’ablation cellulaire in vivo ont permis de démontrer que le développement des SynT-I en une fine couche de cellules multinucléées dépend de la présence de la deuxième couche de SynT. Finalement, par approche de gènes candidats et par analyse de biopuces dans les placentas mutants Mek1Mek2, nous avons montré une expression dérégulée de cibles potentielles de ERK1/2 impliquées dans la déterination, la polarité et la fusion cellulaire, ce qui contribue à la compréhension du phénotype observé.
The mammalian genome contains two ERK/MAP kinase kinase genes, Mek1 and Mek2, which encode dual-specificity kinases responsible for ERK/MAP kinase activation. In the mouse, the loss of Mek1 function causes embryonic lethality, whereas Mek2 mutants survive with a normal lifespan, suggesting that Mek1 rescues the lack of Mek2 function. The first objective of my thesis was to clarify potential functions of Mek2 during mouse embryogenesis. To do, I have analyzed the loss of Mek2 function in the presence of Mek1 haploinsufficiency. Most Mek1+/-Mek2+/- embryos die during gestation from placenta defects affecting extra-embryonic tissues. Thus, even though Mek1 plays a predominant role, these results enlightened the function of Mek2 in placenta development. The histological characterization of Mek1+/-Mek2+/- placentas revealed a diminution of the vascularization and an aberrant formation of multinucleated trophoblast giant (MTG) cells. Genetic experiments on the SynT-II cellular lineage in vivo demonstrated that MTG cells derive from the aberrant SynT-II differentiation and that their formation results from a cell-autonomous effect. The second objective of my thesis was to determine in which cell types the ERK/MAPK activation is essential for placenta development. Genetic analyses combined with histological studies revealed that MTG formation resulted from the ectopic fusion between both layers of SynT, which normally participate in an independent way in the blood-placental barrier. The blood-placental barrier is constituted of a double layer of SynT and by the cells derived from the allantois, the endothelial cells and their perycites. The deletion of both Mek1 alleles in allantois-derived tissues in a Mek1+/-Mek2+/- placenta environment increases the penetrance and the expressivity of the MTG phenotype. These results demonstrate the role of the ERK/MAPK pathway in defined embryonic and extraembryonic cell populations for correct placenta formation. Using mouse genetics, we also demonstrated that the normal development of syncytiotrophoblasts type I into a thin layer of multinucleated cells depends on the presence of the syncytiotrophoblasts type II. Finally, the combined mutations of Mek1 and Mek2 genes alter the expression of several genes involved in cell fate specification, cell fusion and cell polarity that likely explain the underdeveloped placenta and the MTG phenotype seen in Mek1Mek2 mutants.

"Durant le développement embryonnaire préimplantatoire, le glucose apparaît plutôt inhibiteur. Chez la femme, les transcrits codant pour la glucose- 6-phosphate isomérase (GPI), la phosphofructokinase (PFK) et l'hexokinase II (HKII) sont exprimés aux stades VG et MII. Chez la souris, tous les transcrits (sauf HKII) sont également détectés. La "toxicité du glucose" apparaît liée à des régulations post-transcriptionnelles (HKII et PFK) ou à des inhibitions stoechiométriques (PFK). Une augmentation des radicaux libres oxygénés (RLOs) y serait par ailleurs associée. Aussi les systèmes protecteurs contre les RLOs ont été étudiés. Chez les deux espèces étudiées, les transcrits codant pour la superoxyde dismutase (Cu-Zn-SOD et Mn-SOD), la glutamyl-cystéine synthétase (GCS) et la glutathion peroxydase (GPX) sont exprimés au stade MI!. Dans l'ovocyte de souris au stade VG, tous les transcrits sont exprimés, sauf la catalase. Les transcrits de GPX et Mn-SOD sont soumis, dans l'ovocyte humain, à une (ré)adénylation maternelle spécifique, initiée au stade MI!. Ils représentent donc de véritables marqueurs de maturation cytoplasmique chez la femme. La catalase n'est exprimée qu'après la mise en route du génome embryonnaire. Les différences observées dans ces protections expliquent, pour partie, les différences observées quant au maintien de la viabilité embryonnaire en culture in vitro. Chez la femme, seuls les transcrits GPX, Cu-Zn-SOD et catalase sont exprimés dans l'oviducte. Les transcrits GCS et Mn-SOD n'y sont jamais détectés, à l'inverse de la souris qui présente les transcrits codant pour toutes les enzymes testées. L'embryon des mammifères est donc protégé contre le stress oxydatif par des systèmes endogènes et exogènes redondants. "
The low involvement of glucose metabolism in early preimplantation embryos has suggested the presence of metabolic locks in the glycolysis pathway. In human transcripts encoding for glucose-6-phosphate isomerase (GPI), phosphofructokinase (PFK) and hexokinase II (HKII) are expressed at germinal vesicle (GV) and metaphase II (Mil) stages. In the mouse all transcripts (except HKII) are also detected. The toxicity of glucose is more than probably related to problems at the HKII and PFK posttranscriptionallevel or to stoechiometrie inhibition of PFK. An increased level of ROS may also be involved. In this study, gene tic expression of five antioxidant enzymes was studied in human and mouse oocytes: catalase, Cu-Zn-superoxide dismutase (Cu-ZnSOD), Mn-superoxide dismutase (Mn-SOD), glutathione peroxidase (GPX), and gammaglutamylcysteine synthetase (GCS). For both species, except for catalase, all transcripts encoding for antioxidant enzymes were expressed at Mil stage. In the mouse, no qualitative differences were detected between GV and Mil oocytes. In human, transcripts corresponding to GPX and Mn-SOD were not detected at GV stage but only at MIL The presence of a maturation-specific polyadenylation of GPX and Mn-SOD transcripts suggest that these enzymes can be considered as markers of cytoplasmic maturation in human. Catalase transcripts are neither detected neither in mouse nor in human oocytes whatever the stage of maturation but at a low level in the mouse blastocyst. This confirms that catalase transcripts are rather detected in embryos after genomic activation. The variations observed in this protection process against ROS explain, in part, the differential developmental capacity and viability of mo use and human preimplantation embryos in vitro. In human, only GPX, Cu-Zn-SOD and catalase are expressed in oviduct. GCS and Mn-SOD transcripts were never detected. At the opposite, mouse oviduct express ail the antioxidant enzymes tested. These results suggest that mammalian embryos can be protected against oxidative stress by endogen and exogenous redundant systems and ought to lead us to reinforce the protection systems in “in vitro” culture conditions for human Assisted Reproductive Technology

Ce travail a pour but d’étudier expérimentalement, à travers la spécificité des relations parents-jeunes, le déterminisme précoce du développement des comportements chez la souris (mus musculus). Il repose d'un point de vue méthodologique sur la substitution des parents géniteurs (souris) par des parents d'une autre espèce (hamster, mesocricetus auratus, ou rat, rattus norvegicus). Les points essentiels abordés lors de cette étude concernent le développement des comportements d'exploration, le déterminisme de la reconnaissance spécifique, des conduites agonistiques intraspécifiques, ainsi que des premiers comportements de soins aux jeunes chez les femelles et d'infanticide chez les mâles. Outre son approche causale, la méthode des adoptions inter-espèces utilisée ici, a permis également une étude longitudinale descriptive et comparée des relations parents-jeunes entre les différentes espèces utilisées, mettant plus particulièrement en évidence chez chacune la spécificité et la plasticité des comportements parentaux. L'ensemble des résultats souligne l'importance de la spécificité de l'environnement parental chez la souris sur les processus de reconnaissance spécifique homo et hétérosexuels, sur les capacités adaptatives des mâles à supplanter au cours de rencontres leurs congénères ainsi que sur les relations adultes-jeunes.

Les cellules gliales du système nerveux central ont des fonctions nombreuses et variées dont la phagocytose (cellules de la microglie et astrocytes), la migration neuronale (glie radiale), la formation de la barrière hémato-encéphalique (astrocytes) et la myélinisation des axones (oligodendrocytes (OLs)), (). Mon travail de thèse fut d'étudier l'implication des OLs dans le développement postnatal du SNC. Dans ce but, nous avons utilisé une lignée de souris transgéniques générée au laboratoire, les souris MBP-TK. Chez ces animaux, il est possible d'éliminer de manière sélective les OLs en division grâce à l'injection systémique d'un analogue de nucléoside, le FIAU. La première étape de mon travail fut de caractériser l'expression du transgène MBP-TK dans tout le lignage oligodendrocytaire. J'ai également montré que les OLs sont des acteurs majeurs du développement postnatal du cervelet. Dans la seconde partie de mon travail, j'ai montré que le SNC de souris a la capacité de reproduire le processus de myélinisation après élimination des OLs durant la première semaine de vie postnatale. Ces données démontrent la surprenante plasticité des OLs et du tissu nerveux. Enfin, j'ai montré que lorsque le processus de rémyelinisation est accompagné par un entraînement physique, il est possible d'observer une amélioration du phénotype moteur engendré par la myelinisation retardée. L'ensemble de mes résultats élargi nos connaissances sur le rôle des OLs in vivo en assignant des nouvelles fonctions à ces cellules
The glial cells of the central nervous system participate in many different physiological functions in the brain, such as phagocytosis (microglia and astrocytes), axonal guidance (radial glia), myelination (oligodendrocytes, OLs), (). During my thesis, I have studied the implications of the OLs in the postnatal brain development with a particular attention to cerebellar development. For this purpose, I have used a transgenic mouse model, the MBP-TK mice, in which we can specifically ablate dividing OLs by systemic injection of the nucleosid analog FIAU. In the first part of my thesis, I characterized the expression of the MBP-TK transgene in the oligodendrocyte lineage. Moreover, I showed that OLs are absolutely required for the normal cerebellar development and functionality. I also showed that myelination can be completely resumed after OLs ablation during the first postnatal week. Finally, I have shown that motor training is a key factor in the complete recovery of motor skills after a dysmyelinating event. Altogether, these data shed light on new roles for OLs in vivo and show the participation of these cells in previously unknown functions

Le développement et la croissance du muscle squelettique sont conditionnés par des processus complexes impliquant de nombreux facteurs moléculaires dans les différentes étapes de prolifération, de différenciation, et de fusion cellulaire. La compréhension de la régulation de la masse musculaire représente de réels enjeux aussi bien dans le domaine de la santé que d’un point de vue agronomique. Ainsi, l’identification des mécanismes moléculaires participant à l’hypertrophie musculaire a un intérêt particulier pour l'amélioration des thérapies lors d’atrophies musculaires ou pour des applications liées à la production de viande. Dans ce contexte, mes travaux de cette thèse ont porté sur le développement et la caractérisation de deux lignées murines présentant un phénotype hypermusclé. Le premier modèle, dénommé surGasp1, m’a permis de démontrer que la surexpression ubiquitaire du gène Gasp1, codant pour un inhibiteur de la myostatine, entraîne une augmentation généralisée de la masse musculaire due à une hypertrophie des fibres de types I, IIa et IIb sans qu’aucune altération du tissu adipeux ne soit observée. Ce modèle constitue un excellent outil pour appréhender le rôle de GASP1 lors du développement musculaire, en particulier ses relations avec la myostatine (GDF8) qui est un élément clé dans la régulation de la croissance du muscle. Par ailleurs, j’ai entrepris une étude de la protéine GASP1 au cours de l’évolution. L’analyse du taux de substitutions des protéines GASP de l’ancêtre de Ciona aux tétrapodes a permis de montrer que les domaines importants dans l’interaction avec la myostatine étaient les plus conservés. L’ensemble des résultats obtenus m’a conduit à proposer un modèle en trois dimensions qui permet de décrire l’action de la protéine GASP. La deuxième lignée murine analysée, GMA06, issue d’un crible de mutagenèse chimique sensibilisé, présente un phénotype hypermusclé qui diffère de celui observé chez des souris knockout pour la myostatine. L’identification de la mutation responsable de ce phénotype permettra de mieux comprendre les éventuelles interactions et régulations qui peuvent exister entre cette dernière et la myostatine et constitue par conséquent un modèle intéressant pour l’étude fonctionnelle de gènes modificateurs du phénotype Gdf8-/-
Skeletal muscle development and growth are tightly regulated processes involving multiple factors which control different cellular programs such as proliferation, differentiation and fusion. Understanding muscle mass regulation represents key issues in public health or agronomy. Thus, the identification of molecular mechanisms participating in muscular hypertrophy has major interest for therapies improvement of muscular atrophy or for applications in meat production. In this context, the work of my thesis concerned the development and characterisation of two mouse lines presenting a hypermuscular phenotype. The analysis of the first model, called surGasp1, showed that the ubiquitous overexpression of the Gasp1 gene leads to a generalized increase of muscular mass due to a hypertrophy of the type I, IIa and IIb fibres without change of the fatty tissue amount. This model provides an excellent tool to study the GASP1 function during the muscular development, in particular its role in relationship with the myostatin, a key factor in muscle growth regulation. I have also undertaken a study of the GASP1 protein during evolution. The substitution rate analysis from the ancestor of Ciona to tetrapods showed that the important domains in the interaction with the myostatin (GDF8) were the most preserved. These data allow me to propose a three dimensional model describing the GASP protein action. The second mouse line, GMA06, resulting from a sensitized mutagenesis screen, presents a hypermuscular phenotype which differs from the one observed in myostatine knockout mice. The identification of the causal mutation in this line will allow to better understand the interactions which could exist between this last one and the myostatin and constitutes an interesting model for functional studies of gene modifiers of the Gdf8-/- phenotype

Les hormones thyroïdiennes (HT) ont un rôle majeur dans le développement du système nerveux central (SNC). Trois récepteurs nucléaires dirigent l’action des HT et deux sont majoritairement exprimés dans le cerveau : TRα1 et TRβ1. L’ontogenèse du récepteur TRβ1 coïncide avec la fenêtre d’action des HT, ce qui suggère un rôle majeur dans les effets postnataux des HT chez les rongeurs. Pour étudier son rôle in vivo, nous avons créé des souris transgéniques surexprimant, spécifiquement dans les neurones, un récepteur TRβ1 muté pour sa liaison à l’hormone. Le cervelet de ces souris présente les mêmes altérations de développement que les souris hypothyroïdiennes. L’inhibition de l’expression du facteur de transcription BTEB, régulé par les HT probablement via TRβ1, dans des cultures primaires de neurones affecte la ramification mais pas l’élongation neuritique dépendante de la T3. La phosphorylation spécifique de certains sites des protéines MAP2 et Tau par la T3 pourrait participer à ces processus.

Le génome humain est constitué de 35000 gènes soit seulement 2 à 3 fois plus que celui d'organismes modèles tels que le nématode et la mouche. Ce nombre de gène n'est pas compatible avec la perception de la complexité moléculaire que l'on se faisait de ces différents organismes. Il est apparu que cette complexité moléculaire n'était pas générée uniquement par le nombre de gène mais aussi par des mécanismes de régulation de l'expression des gènes tels que l'usage de différents promoteurs et le processus d'épissage alternatif. Dans le laboratoire, nous avons étudié la régulation de l'expression du gène Otx2. Ce gène code pour un facteur de transcription à homéodomaine dont le rôle est crucial pour la formation du cerveau. En effet, les souris déficientes pour ce gène ne développent pas de structures antérieures du cerveau et meurent in utero. L'analyse moléculaire du gène Otx2 a permis de montrer que sa structure est plus complexe que celle qui était décrite dans la littérature. En effet, nos résultats ont révélé l'existence de trois sites d'initiation de la transcription et l'épissage alternatif d'un petit exon de 24 nucléotides dans la séquence codante. Le gène Otx2 est donc transcrit en 6 ARNm responsables de la synthèse de deux types de protéine Otx2 distinctes de 8 acides aminés dans la région N-terminale. L'étude des patrons d'expression de ces ARNm montre que les domaines d'expression sont identiques à ceux décrits dans la littérature. Cependant, cette analyse montre qu'au cours du développement embryonnaire, tous les ARNm du gène Otx2 sont exprimés dans les mêmes régions du cerveau alors qu'au stade adulte, seul un des trois sites d'initiation de la transcription semble être utilisé pour exprimér le gène Otx2. L'ensemble de nos résultats ainsi que ceux de la littérature nous permettent d'entrevoir les différents mécanismes potentiels de la régulation de l'expression du gène Otx2 et de proposer des hypothèses concernant les fonctions des protéines Otx2 dans le cerveau des mammifères.

Lorsqu’une femme est à risque d’accoucher prématurément, des glucocorticoïdes lui seront administrés afin d’accélérer la maturation pulmonaire du bébé. Après la naissance, différents protocoles peuvent être mis en place pour aider l’enfant à respirer dont l’administration du surfactant et la ventilation. Les glucocorticoïdes ont un effet positif sur la maturation pulmonaire. Par contre, ils nuisent au processus de la septation après la naissance. Les glucocorticoïdes retrouvés dans le poumon en développement peuvent provenir de deux sources, soit de la voie classique de la synthèse des glucocorticoïdes par les surrénales, soit des gènes exprimés dans le poumon. Les sites d’expression des gènes codant pour les enzymes de la synthèse des glucocorticoïdes dans le poumon sont inconnus ainsi que le gène de la 20α-hydroxystéroïde déshydrogénase (20α-HSD). Cette dernière inactive le substrat et le produit de la 21-hydroxylase. Des poumons de fœtus de souris au jour de gestation 15,5, 17,5 et 19,5 ainsi que de souriceaux âgés de 0, 5 et 15 jours ont été utilisés pour des hybridations in situ. Cette étude a montré qu’avant la naissance, l’ARNm de la 21-hydroxylase est situé au niveau des cellules épithéliales distales alors que l’ARNm de la 20α-HSD se retrouve plutôt au niveau des capillaires. Les gènes de la 21-hydroxylase et de la 20α-HSD sont exprimés dans les cellules épithéliales proximales ainsi que dans les cellules endothéliales de veines dans la période entourant la naissance. À la fin du stade sacculaire et pendant le stade alvéolaire, le gène de la 21-hydroxylase est exprimé seulement dans les septa et les parois minces tout comme le gène de la 20α-HSD sauf dans le stade alvéolaire où il n’y avait pas de signal significatif. Ainsi, ces résultats suggèrent que la 20α-HSD pourrait participer au contrôle du niveau d’activité de la 21-hydroxylase en modulant la disponibilité de son substrat.
For many years, to reduce the risk of respiratory distress in newborns, antenatal glucocorticoids are administered to the mother about to deliver prematurely to accelerate fetal lung maturation. At birth, surfactant therapy can be used with several assisted ventilation strategies according to the morbidity of the neonate. Postnatal administration of glucocorticoids to the neonate is not recommended as they interfere with organ systems including the lung development process named septation. Previous studies performed in the Dr Tremblay’s laboratory have shown in the whole lung of the mouse: 1) the capability of the fetal lung to express several steroidogenic enzyme genes involved in glucocorticoid synthesis and; 2) the presence of a steroid-metabolizing activity compatible with the regulation of the substrate levels. The major enzymes involved in these processes are the 21-hydroxylase and the 20α-hydroxysteroid dehydrogenase, which are respectively encoded by Cyp21a1 and Akr1c18. The objective of my study was to find the sites of expression for these two genes. To do so, mouse fetal lungs isolated on gestation days 15.5, 17.5, and 19.5, and on postnatal days 0, 5, and 15 days were used for in situ hybridization with 21-hydroxylase and 20α-HSD mRNAs. My results indicate that before birth, 21-hydroxylase mRNA is found in epithelial distal cells whereas the 20α-HSD gene is primarily expressed in capillaries. Around birth, 21-hydroxylase mRNA are associated with the proximal epithelium and endothelial cells of several veins. From the late saccular stage up to the half of the alveolar period, 21-hydroxylase mRNA is only associated with thin walls and septae. The situation was the same for 20α-HSD mRNA except for the alveolar stage during which no signal was detected. These results indicate that the expression profile of these two genes is compatible with the modulation of 21-hydroxylase substrates by the 20α-HSD.

Les microARN sont de petits ARN non-codants qui jouent des rôles importants dans l’extinction de l’expression de gènes cibles. Ils sont impliqués dans la régulation de divers processus cellulaires, tel que la différenciation, la prolifération et l’apoptose. Jusqu'à présent, leur implication dans la biologie de la glande mammaire a été suggérée par quelques études portant principalement sur des situations pathologiques permettant la caractérisation des microARN comme marqueurs de différents types de tumeurs du sein. L'implication des microARN dans la régulation de la biologie normale de la glande mammaire reste à découvrir. Pour comprendre la fonction des microARN dans les différents stades physiologiques de la glande mammaire, nous avons développé trois approches : (i) L’identification de microARN spécifiques de la glande mammaire. Ces microARN ont été recherchés par la réalisation d’une banque de petits ARN. Au total 24 nouveaux microARN ont été clonés dont 6 sont spécifiques de la souris (Sdassi et al. , 2009). (ii) L’invalidation conditionnelle (système Cre-loxP) de Dicer, l'une des enzymes clés impliquées dans la maturation des microARN. L'inactivation a été principalement réalisée dans les cellules épithéliales mammaires par l'utilisation de deux lignées transgéniques MMTV-Cre et WAP-Cre croisées avec les souris Dicerfl/fl. Les souris Dicerfl/+/MMTV-Cre hétérozygotes présentent un défaut de lactation. Les observations histologiques montrent un défaut de développement de la glande mammaire détectable à partir de 6 jours de gestation. Les études transcriptomiques ont été effectuées afin de caractériser les voies de signalisation affectées. Les souris Dicerfl/fl/WAP-Cre présentent également un défaut de la lactation. Les études histologiques montrent des anomalies de la glande mammaire de ces souris en fin de lactation. (iii) La caractérisation de l’expression des microARN à différents stades physiologiques de la glande mammaire de souris (Silveri et al. , 2006; Sdassi et al. , 2009). Le rôle de l'un d'entre eux (miR-30b) a été recherché à partir de l’analyse de souris transgéniques qui surexpriment ce microARN dans les cellules épithéliales mammaires. Les femelles présentent un défaut de la lactation. Les analyses histologiques n’ont pas montré d’anomalies de développement pendant la gestation ou la lactation ; en revanche, des défauts du remodelage de la glande mammaire au Les microARN sont de petits ARN non-codants qui jouent des rôles importants dans l’extinction de l’expression de gènes cibles. Ils sont impliqués dans la régulation de divers processus cellulaires, tel que la différenciation, la prolifération et l’apoptose. Jusqu'à présent, leur implication dans la biologie de la glande mammaire a été suggérée par quelques études portant principalement sur des situations pathologiques permettant la caractérisation des microARN comme marqueurs de différents types de tumeurs du sein. L'implication des microARN dans la régulation de la biologie normale de la glande mammaire reste à découvrir. Pour comprendre la fonction des microARN dans les différents stades physiologiques de la glande mammaire, nous avons développé trois approches : (i) L’identification de microARN spécifiques de la glande mammaire. Ces microARN ont été recherchés par la réalisation d’une banque de petits ARN. Au total 24 nouveaux microARN ont été clonés dont 6 sont spécifiques de la souris (Sdassi et al. , 2009). (ii) L’invalidation conditionnelle (système Cre-loxP) de Dicer, l'une des enzymes clés impliquées dans la maturation des microARN. L'inactivation a été principalement réalisée dans les cellules épithéliales mammaires par l'utilisation de deux lignées transgéniques MMTV-Cre et WAP-Cre croisées avec les souris Dicerfl/fl. Les souris Dicerfl/+/MMTV-Cre hétérozygotes présentent un défaut de lactation. Les observations histologiques montrent un défaut de développement de la glande mammaire détectable à partir de 6 jours de gestation. Les études transcriptomiquesont été effectuées afin de caractériser les voies de signalisation affectées. Les souris Dicerfl/fl/WAP-Cre présentent également un défaut de la lactation. Les études histologiques montrent des anomalies de la glande mammaire de ces souris en fin de lactation. (iii) La caractérisation de l’expression des microARN à différents stades physiologiques de la glande mammaire de souris (Silveri et al. , 2006; Sdassi et al. , 2009). Le rôle de l'un d'entre eux (miR-30b) a été recherché à partir de l’analyse de souris transgéniques qui surexpriment ce microARN dans les cellules épithéliales mammaires. Les femelles présentent un défaut de la lactation. Les analyses histologiques n’ont pas montré d’anomalies de développement pendant la gestation ou la lactation ; en revanche, des défauts du remodelage de la glande mammaire au Les microARN sont de petits ARN non-codants qui jouent des rôles importants dans l’extinction de l’expression de gènes cibles. Ils sont impliqués dans la régulation de divers processus cellulaires, tel que la différenciation, la prolifération et l’apoptose. Jusqu'à présent, leur implication dans la biologie de la glande mammaire a été suggérée par quelques études portant principalement sur des situations pathologiques permettant la caractérisation des microARN comme marqueurs de différents types de tumeurs du sein. L'implication des microARN dans la régulation de la biologie normale de la glande mammaire reste à découvrir. Pour comprendre la fonction des microARN dans les différents stades physiologiques de la glande mammaire, nous avons développé trois approches :(i) L’identification de microARN spécifiques de la glande mammaire. Ces microARN ont été recherchés par la réalisation d’une banque de petits ARN. Au total 24 nouveaux microARN ont été clonés dont 6 sont spécifiques de la souris (Sdassi et al. , 2009). (ii) L’invalidation conditionnelle (système Cre-loxP) de Dicer, l'une des enzymes clés impliquées dans la maturation des microARN. L'inactivation a été principalement réalisée dans les cellules épithéliales mammaires par l'utilisation de deux lignées transgéniques MMTV-Cre et WAP-Cre croisées avec les souris Dicerfl/fl. Les souris Dicerfl/+/MMTV-Cre hétérozygotes présentent un défaut de lactation. Les observations histologiques montrent un défaut de développement de la glande mammaire détectable à partir de 6 jours de gestation. Les études transcriptomiques ont été effectuées afin de caractériser les voies de signalisation affectées. Les souris Dicerfl/fl/WAP-Cre présentent également un défaut de la lactation. Les études histologiques montrent des anomalies de la glande mammaire de ces sourisen fin de lactation. (iii) La caractérisation de l’expression des microARN à différents stades physiologiques de la glande mammaire de souris (Silveri et al. , 2006; Sdassi et al. ,2009). Le rôle de l'un d'entre eux (miR-30b) a été recherché à partir de l’analyse de souris transgéniques qui surexpriment ce microARN dans les cellules épithéliales mammaires. Les femelles présentent un défaut de la lactation. Les analyseshistologiques n’ont pas montré d’anomalies de développement pendant la gestation ou la lactation ; en revanche, des défauts du remodelage de la glande mammaire au cours de l’involution sont détectés chez ces souris. Les études du transcriptome ont permis d’identifier des gènes potentiellement impliqués dans ce phénotype. Nos résultats montrent pour la première fois l'implication des microARN dans la biologie de la glande mammaire normale. Au cours de ces études, nous avons produit plusieurs modèles animaux qui permettent d’identifier la fonction des microARN et les cibles de l’un d’entre eux (miR-30b) dans cet organe
MicroRNA are small non-coding RNA that have been found to play important roles in silencing target genes and that are involved in the regulation of various normal cellular processes. Few studies have described their implication in mammary gland biology, mainly focusing on pathological situations allowing the characterization of microRNA as markers of tumour class in breast cancer. The involvement of microRNA in the regulation of normal mammary gland biology remains to be uncovered. To understand the function of microRNA in the different steps of mammary gland biology we developed three approaches: 1/ Identification of organ- and tissue- (testicles) specific microRNA suggest the existence of specific microRNA in the mammary gland. These microRNA have been investigated by creating a bank of small RNA. Twenty four new microRNA were cloned, of which 6 are specific for the mouse (Sdassi et al. , 2009). The expression profiles of these new microRNA were analysed by qRT-PCR, to allow for better characterization. 2/ Conditional invalidation (system Cre-loxP) of Dicer, one of the key enzymes involved in the microRNA maturation. The inactivation is achieved mainly in the mammary epithelial cells by the use of an MMTV-Cre and WAP-Cre transgenic lines crossed with Dicerfl/fl mice. The heterozygote Dicerfl/+/MMTV-Cre mice present a defect of lactation. Histological observations show a default of mammary gland development detectable from 6 days of gestation onwards. Transcriptomic studies will be conducted to further characterize the affected signaling pathways. The Dicerfl/fl/WAP-Cre KO mice also exhibit a defect of lactation. The histological studies show abnormalities in mammary gland development at 18 days lactation. The genes regulated by microRNA in this model will be characterized by transcriptomic studies. 3/ The characterization of microRNA expression patterns at different physiological stages of the mammary gland development in mice has been described (Silveri et al. , 2006; Sdassi et al. , 2009). The role of one of these microRNA (miR-30b) is currently being analyzed by studying the phenotype of transgenic mice which over express this microRNA in mammary epithelial cells. The females present a defect of lactation associated with a default of this tissue morphology that is observed from the end of gestation onwards. Transcriptomic studies are underway to identify signaling pathways involved in this phenotype as well as the targets of this microRNA in the mammary gland. However, histological analysis did not show any developmental abnormalities associated withdefects of lactation. A remodeling defect of the mammary gland was found in these mice during involution. Transcriptome analysis has identified genes potentially involved in this phenotype. Our results demonstrate for the first time the involvement of microRNA in normal mammary gland biology and have generated animal tools that will help the understanding of microRNA function and targets in this organ

L'objectif général de ce travail de recherche a été de déterminer l'implication potentielle du neurotransmetteur sérotonine (5-hydroxytriptamine ou 5-HT), dans la formation et l'innervation des bourgeons et papilles gustatives. Les bourgeons gustatifs constituent l'unité structurelle et fonctionnelle du système gustatif chargé de détecter, traduire et véhiculer les informations sapides contenues dans l'eau ou les aliments au cerveau. Un deuxième objectif a été de mieux cerner le rôle de la 5-HT et d'autres neuromédiateurs mono-aminérgiques dans la signalisation gustative au niveau périphérique. Nous avons focalisé notre attention sur la sérotonine parce que diverses évidences expérimentales montrent la présence de ce neurotransmetteur et de son système de transport dans l'épithélium lingual au cours du développement embryonnaire. De plus, de très nombreuses études montrent que la sérotonine est impliquée dans la détection et la transmission des stimuli gustatifs. Le blocage pharmacologique ou l'inactivation génétique de la tryptophane hydroxylase (TPH), l'enzyme clé dans la biosynthèse de la sérotonine, entraînent une désorganisation quasi complète du profil d'innervation des papilles caliciformes ainsi qu'une réduction la densité de leur innervation. Chez les animaux Knock out TPHI, ses modifications s'accompagnent des altérations morphologiques des papilles caliciformes qui se traduisent par un élargissement au niveau latéral et une diminution de l'hauteur de la papille. En plus de ces effets sur les papilles caliciformes, le blocage ou l'inactivation de la TPH1 diminuent le nombre total de papilles fongiformes. Par ailleurs, grâce à des expériences de RT-PCR et d'immuno-histochimie, nous avons mise en évidence l'expression de la tryptophane hydroxylase dans les fibres gustatives pendant l'embryogenèse. Sur la base de ces observations, et d'autres données de la littérature, nous proposons que les actions trophiques de la 5-HT sur le système gustatif sont modulées par un système sérotoninergique inhérent à l'épithélium lingual. Nous avons produit un anticorps polyclonal permettant d'identifier et de visualiser sélectivement les cellules gustatives exprimant les récepteurs du goût sucré de type T1R3. Grâce à l'utilisation de cet outil, nous avons montré que les cellules gustatives impliquées dans la détection des sensations sapides sucrées, présentent une grande hétérogénéité phénotypique aussi bien en ce qui concerne leur type cellulaire que le type de neuromédiateur qu'elles contiennent. Ces résultats, favorisent le modèle de codage de l'information gustative selon lequel la qualité et la intensité des stimuli gustatifs transmis au cerveau serait détermine par des interactions cellulaires de type paracrine à l'intérieur du bourgeon.

Les astrocytes représentent une des populations cellulaires les plus nombreuses du cerveau. Ces cellules gliales extrêmement ramifiées y jouent un rôle essentiel, notamment dans le cortex cérébral, où elles forment un réseau tridimensionnel continu tout en présentant une hétérogénéité importante au niveau morphologique, moléculaire et fonctionnel. Afin de déterminer comment le réseau astrocytaire est établi au cours du développement cortical murin, des analyses clonales ont été effectuées grâce à une stratégie de marquage multicolore permettant d’étudier simultanément la descendance de nombreux progéniteurs. Les résultats de ces travaux montrent que les clones d’astrocytes corticaux s’imbriquent avec leurs voisins et présentent une variabilité importante au niveau de leur composition en termes de nombre et sous-types cellulaires, leur organisation et leur dispersion spatiale. Le réseau astrocytaire se développe au cours d’une première phase dynamique de prolifération et de dispersion pendant la première semaine postnatale, suivie par une phase de maturation à l’échelle de la cellule avec augmentation du volume des astrocytes et de la complexité de leur arborisation. Ces travaux montrent par ailleurs la contribution non négligeable de progéniteurs postnataux au réseau astrocytaire, qui s’ajoute à celle des cellules souches neurales corticales embryonnaires. La grande variabilité du réseau astrocytaire à l’échelle clonale suggère que son développement repose sur des unités clonales plastiques composées de cellules dont l’organisation spatiale et les caractéristiques finales dépendent probablement de leurs interactions avec leur environnement neuronal via des acteurs moléculaires qui restent à caractériser
Astrocytes are one of the most numerous cell types in the brain. They consist in ramified glial cells that play essential roles in neural tissue where they form an uninterrupted tridimensional network, while displaying important local heterogeneity in terms of morphology and molecular marker expression. To determine how this network is established during development, multiclonal lineage tracing was performed to analyzed large numbers of astrocyte clones issued from nearby mouse cortical progenitors. Results show that cortical astrocyte clones intermix with their neighbors, display extensive variability in terms of spatial organization, numbers and subtypes of generated cells, and increase in size towards the upper part of the cortex. Furthermore, this organization develops through two stages that comprise a dynamic phase of proliferation accompanied by spatial dispersion, and a maturation phase where morphological complexity and volume increase at the single cell level. Moreover a significant contribution of subependymal postnatal progenitors to the generation of astrocytes, independent of their subtype and location, was uncovered in addition to prenatal delaminating apical progenitors. Thus cortical astrocyte network development appears unstereotyped at the clonal level. This suggests that the construction of this network relies on plastic clonal units issued from non-specified astrocyte progenitors that differentially expand and mature, and whose descendants probably acquire their final characteristics through interactions with their neuronal environment through molecular mechanisms that still need to be defined

La sérotonine a été impliquée dans le processus développemental de raffinement périnatal des connections synaptiques. D’autre rôle important est joue par des cellules immunitaires du cerveau, la microglie.Pendant ma thèse j’ai teste l’hypothèse qu’une interaction entre la microglie et la sérotonine est nécessaire pour l’établissement des circuits neuronaux correct dans le cerveau de la souris.Les résultats récents du laboratoire ont montré que la microglie exprime un des récepteurs à la sérotonine: le 5-HT2B. En utilisant comme model la ségrégation des axons retiennes dans le thalamus j’ai observé que la souris invalide pour ce récepteur présente des altérations anatomiques dans les régions des projections rétiniennes du thalamus.En parallèle, j’ai testé l’effet de la sérotonine sur la microglie. La libération locale de la sérotonine sur les coupes aigue du cerveau a un effet chemoattractant sur la microglie (2-photon microscopie).En plus, les analyses d'expression d’ARN de microglie dans une culture cellulaire primaire ont montres une augmentation de certains marqueurs d'activation dans la souris invalidée pour le récepteur 5-HT2B.Afin de tester quelle(s) cellule(s) sont responsable(s) pour les altérations observées dans le thalamus j’ai teste un nombre de souris avec une invalidation conditionnelle du récepteur 5-HT2B. Les résultats que j’ai obtenus pendant mon doctorat support l’hypothèse que la sérotonine interagit avec la microglie et que cette interaction pouvait être importante dans la maturation du cerveau
Serotonin, besides its functions as a neurotransmitter, actively participates in postnatal establishment and refinement of brain wiring in mammals. Another important role is played by the brain resident macrophages, microglia, in developmentally-regulated neuronal death as well as in synaptic maturation or elimination.During my thesis, I tested the hypothesis of cross-regulations between microglia and serotonin during postnatal brain development in a mouse model. The laboratory data show a major expression of the serotonin 5-HT2B receptor by postnatal microglia, suggesting that serotonin could participate in temporal and spatial synchronization of microglial functions. Using an in vivo model of synaptic refinement during early brain development, the maturation of retinal projections to the thalamus, I observed that Htr2B-/- mice present anatomical alterations of the projecting area of retinal axons into the thalamus.Parallelly, I tested the effects of serotonin on microglial cells. A local delivery of serotonin attracted microglial processes on acute brain slices (two-photon microscopy).Moreover, after comparing mRNA expression level in microglial primary cultures, we have found that some activation markers are upregulated in microglia from Htr2B-/-.In the second part of my PhD, by using a number of conditional Htr2B-/- mice, I investigated which cell type(s) could be responsible for the altered segregation of retinal axons in the thalamus of the total Htr2B-/- mice.Overall, my results support the hypothesis that serotonin interacts with microglial cells and that these interactions could participate in brain maturation

La mise en place de la carte retinotectale ferait intervenir des mécanismes de reconnaissance entre les axones rétiniens et leurs cellules cibles. L'expression en gradients de molécules de guidage dans le toit optique (colliculus superieur, cs, chez les mammifères) et/ou la rétine, ainsi que leur action in vitro sur la croissance des fibres rétiniennes ont suggéré un rôle pour ces molécules dans le guidage des axones rétiniens vers leurs cibles. Cependant, l'imprécision initiale de la topographie laisse supposer que la rétinotopie adulte proviendrait d'un remodelage des collatérales et arborisations rétiniennes. Chez l'adulte, la rétine temporo-nasale (t-n) se projette sur l'axe antero-postérieur (a-p) du cs. Pour étudier la fonction des signaux colliculaires au cours du développement précoce de la projection rétinienne chez l'embryon de souris, nous avons examine in vitro et in vivo leurs effets sur la dynamique de croissance des fibres rétiniennes t et n. In vitro, le comportement dynamique des fibres t et n est modulé spécifiquement par des fractions membranaires issues des parties a et p du cs. In situ, dans le cs, la morphologie des cônes de croissance rétiniens varie selon leur origine topographique rétinienne et leur situation a-p dans le cs, de manière corrélée aux résultats in vitro. Ainsi, précocement, à la phase d'invasion de la cible, des signaux positionnellement distribués dans le cs, moduleraient différentiaient la dynamique de croissance des fibres rétiniennes selon qu'elles se trouvent en amont (activation), dans (exploration), ou au-delà (inhibition) de leurs régions cibles prospectives. L'étude de la fonction du facteur de transcription engrailed-1 dans le développement de la projection rétinocolliculaire a été réalisée chez des embryons de souris mutants nuls pour engrailed-1n, en combinant l'examen des morphologies des cônes de croissance rétiniens in situ dans le cs, et celui de la différenciation colliculaire. Des résultats préliminaires sont rapportés.

Dlx5 est un facteur de transcription à homéodomaine exprimé dans les ostéoblastes au cours du développement du squelette. Notre première étude avait pour objet le rôle de Dlx5 dans le développement osseux. Nous avons montré que chez l'embryon de la souris âgé de 18,5 jours du développement, l'invalidation génique de Dlx5 conduit à des altérations de l'architecture osseuse et qu'/n vitro, l'absence de Dlx5 est responsable d'une réduction de la prolifération et de la différenciation des ostéoblastes. Une altération du couplage ostéoblastes-ostéoclastes conduisant à une résorption osseuse augmentée a également été mise en évidence. L'objectif de la deuxième étude était de définir l'implication de Dlx5 dans le processus du remodelage osseux. La fonction de Dlx5 dans l'os adulte a été étudiée chez les souris hétérozygotes (Dlx5 ⁺/ ⁻) âgées de 10 et 20 semaines, l'invalidation génique de Dlx5 étant létale. Nous montrons que Dlx5 est encore exprimé dans des os longs adultes et que cette expression diminue avec le temps. La densité minérale osseuse (DMO) mesurée aux fémurs est plus faible chez les souris Dlx5⁺/ ⁻. Cette baisse de la DMO résulte d'une réduction de l'épaisseur corticale qui est due à une augmentation de la résorption osseuse sur la surface endostée. Ces deux études nous permettent de suggérer que Dlx5 joue un rôle dans l'acquisition et le maintien de la masse osseuse corticale en agissant sur le couplage entre ostéoblastes et ostéoclastes
Dlx5 is an homeodomain transcriptional factor expressed in osteoblasts during skeletal development. Our first aim was to examine developmental defects in long bones of Dlx5-null mice at the end of gestation (18. 5 dpc). Herein, we report that Dlx5 deficiency in vivo affects bone formation and leads to bone architecture defects in mouse embryo. In vitro, the absence of Dlx5 is responsible for a reduction in osteoblasts proliferation and differentiation. This study also highlighted an alteration of osteoblast-osteoclast coupling leading to increased bone resorption. As Dlx5-null mice exhibit perinatal lethality, in the second study we examined the role of Dlx5 in 10- and 20- week-old postnatal bone modeling/remodeling of Dlx5 heterozygous mice. We found that Dlx5 is still expressed at high levels in long bones of adult mice and that its expression decreases with time. DXA study of femurs revealed that Dlx5 ⁺/ ⁻ mice exhibit lower bone mineral density than WT littermates. This reduction in heterozygous mice results from a reduced cortical thickness which was, in turn, due to an enhanced endosteal resorption activity. In conclusion, we show that the total or partial invalidation of Dlx5 triggered a bone phenotype resulting from an altered osteoblast/osteoclast coupling inducing an increased resorption activity. Moreover, Dlx5 significantly interferes with long bones remodeling mainly affecting the cortical thickness in adult mice

Les anomalies congénitales des reins et des voies urinaires (CAKUT) sont un groupe de malformations fréquemment trouvées chez les patients humains qui résultent de défauts dans le programme de développement de ces organes. Sox11 fait partie de la famille des facteurs de transcription SoxC, qui joue un rôle important dans le développement de divers organes chez les vertébrés. Les souris Sox11-/- meurent juste après la naissance et présentent une grande variété de CAKUT. Alors que les reins duplex sont une anomalie courante du développement rénal, le mécanisme moléculaire qui amène les mutants Sox11 à développer cette malformation reste incertain. Dans ce projet, j'ai analysé le phénotype rénal des souris Sox11-/- et montré que les reins duplex sont causés par l'expansion du mésenchyme métanéphrique (MM). D'autres expériences ont été réalisées pour déterminer si l'origine de cette expansion résidait dans une apoptose insuffisante ou dans l'absence de migration des cellules du MM. Une analyse tridimensionnelle par microscopie confocale des cellules apoptotiques a révélé que chez les embryons Sox11-/- le MM subissait une apoptose dans la région d'intérêt similaire à celles des embryons de type sauvage. Un test in vitro de cicatrisation des plaies a démontré que les gènes SoxC sont nécessaires pour la migration des cellules du MM. La délétion de ces gènes à un stade tardif du développement conduit à une hypoplasie rénale et à une diminution du nombre de néphrons due à l'arrêt de la néphrogenèse. Pour étudier le rôle des gènes SoxC au cours de la formation des reins, j'ai établi une culture de cellules progénitrices rénales permettant l’invalidation de ces gènes en présence de 4OH-Tamoxifène. L'analyse de l'expression génique a confirmé la suppression efficace des gènes SoxC, tout en maintenant l'identité des cellules progénitrices du néphron. Après induction de la délétion, ces cellules sont incapables de s'épithélialiser, du fait d’une activité accrue de la voie Wnt/β-caténine. Afin de valider ces résultats et d’identifier les cibles en aval des gènes SoxC, j'ai effectué une analyse ARN-seq d’organoïdes rénaux subissant une transition mésenchymateuse-épithéliale. Les données acquises par ces expériences révèlent que de nombreuses voies de signalisation sont affectées. En particulier, l’insuffisance du gène Ezh2 codant pour une protéine du groupe Polycomb, pourrait être à l’origine de changements transcriptomiques généralisés empêchant les cellules progénitrices déficientes en SoxC de se différencier. L’ensemble de ces données démontre l'importance des gènes de la famille SoxC dans le développement précoce et tardif du rein, dont l'analyse moléculaire conduira à des orientations possibles pour les recherches et les traitements futurs
Congenital Anomalies of Kidneys and Urinary Tract (CAKUT) are a group of birth defects that arise from defects in the developmental program of organ development and are frequently found in human patients. Sox11 is a member of SoxC family of transcription factors, which plays an important role in the development of various organs in vertebrates. Sox11 knockout mice die soon after birth and display a wide variety of CAKUT, including duplex kidneys and nephrogenesis defects. While duplex kidneys are a common renal development anomaly, the molecular mechanism causing Sox11 mutants to develop duplex kidneys remains unclear. In this project, I analyzed the renal phenotype of Sox11 knockout mice and discovered that the duplex kidneys are caused by the expansion of metanephric mesenchyme (MM). Further experiments were performed to determine whether the origin of this expansion lies in insufficient apoptosis of MM cells or lack of MM cell migration. Three-dimensional confocal microscopy analysis with Lysotracker Red staining of apoptotic cells revealed that MM undergoes apoptosis in the region of interest in wildtype embryos, however the apoptosis seems to persist in Sox11-/- embryos as well. However, in vitro scratch wound assay provided evidence that SoxC genes are necessary for migration of MM cells. In the late kidney development, SoxC deletion is leading to renal hypoplasia and reduced nephron number due to cessation of nephrogenesis. To study the role of SoxC in nephrogenesis, I set up an in vitro renal progenitor cell culture which allows for the timed deletion of SoxC genes by a 4OH-tamoxifen induced knockout. Gene expression analysis confirmed efficient deletion of SoxC genes, while maintaining nephron progenitor cell identity. After deletion, renal progenitor cells were found to be unable to epithelialize, linked with increased activity of Wnt/β-catenin pathway. To validate these findings and discover the downstream targets of SoxC genes, I developed a system for an RNA-seq analysis of renal organoids undergoing mesenchymal-to-epithelial transition. Data acquired in these experiments reveal numerous regulatory pathways affected in SoxC-knockout renal progenitor cells, with the deficiency of Polycomb group gene Ezh2 as a likely origin of widespread transcription changes leading to the inability of SoxC-deficient progenitor cells to differentiate. Taken together these data demonstrate the importance of Sox11 and other SoxC genes in early and late kidney development, with molecular analysis providing plausible directions for future research and interventions

Les gènes Hox sont essentiels à la mise en place de l’identité des cellules le long de l’axe antéropostérieur des embryons et pourraient agir en aval de l’acide rétinoïque pendant la formation du cœur. Nous montrons que les gènes Hoxb1, Hoxa1 et Hoxa3 définissent des sous-domaines du second champ cardiaque. L’analyse de lignage génétique révèle que les progéniteurs cardiaques Hoxb1+ contribuent aux oreillettes et à la partie inférieure de la voie efférente, futur myocarde sous-pulmonaire. Les progéniteurs Hoxa1+ contribuent à la partie distale de la voie efférente, suggérant un rôle de ces gènes Hox antérieurs dans sa régionalisation proximo-distale. Alors qu’aucune anomalie cardiaque n’avait été décrite chez les mutants Hoxb1, notre étude détaillée des fœtus Hoxb1-/- révèle des défauts d’alignement des gros vaisseaux ainsi que des communications interventriculaires. L’utilisation d’un marqueur du myocarde sous-pulmonaire, montre une contribution anormale des cellules du second champ cardiaque à cette région chez les mutants. Nous montrons que ces défauts sont la conséquence de la dérégulation des voies de signalisation présentes dans le second champ cardiaque. En accord avec ces observations, les embryons ont une voie efférente plus courte. L’étude des mutants Hoxa1 révèle des malformations des arcs pharyngés puis des anomalies de la crosse aortique chez les fœtus. L’analyse des doubles mutants, montre une augmentation de la pénétrance et de la sévérité de ces défauts, suggérant une interaction synergique entre Hoxa1 et Hoxb1 lors de la formation des gros vaisseaux. Ces résultats révèlent un rôle crucial des gènes Hox antérieurs dans le développement du cœur
Hox genes are known to be involved in the establishment of cell position and identity along the anterior-posterior axis in embryos and could act as key downstream effectors of retinoic acid during heart development. In situ hybridization experiments show that Hoxb1, Hoxa1 and Hoxa3 define sub-domains within the second heart field (SHF). Our genetic lineage analysis reveals the contribution of Hoxb1+ cardiac progenitors to the atria and to the inferior wall of the outflow tract (OFT), which then gives rise to the myocardium at the base of the pulmonary trunk. Interestingly, Hoxa1+ progenitors contribute to the distal part of the OFT suggesting that these anterior Hox genes could play a role in its proximo-distal patterning. No cardiac anomalies had been reported so far in Hoxb1 mutant mice. However, our detailed study shows that mutant fetuses exhibit OFT misalignment and ventricular septal defects associated or not with ventricular wall and epicardium anomalies. Using a marker of the sub-pulmonary myocardium, we observe an abnormal contribution of SHF cells in Hoxb1-/- hearts. This defect is the consequence of the dysregulation of the signaling pathways controlling SHF regulation. Accordingly, those embryos exhibit a shorter OFT. The study of Hoxa1 mutant embryos reveals pharyngeal arch arteries patterning defects causing anomalies of the aortic arch and right subclavian artery at fetal stages. Using compound mutants, we show an increase in the penetrance and severity of these defects, suggesting a synergistic interaction between Hoxa1 and Hoxb1 during aortic arch patterning. Together, these data support a crucial role for anterior Hox genes in cardiac development

L’hormone thyroïdienne (T3) a des fonctions pléiotropiques au cours du développement. Un déficit congénital de T3 est responsable d’un retard mental sévère. Grâce à des souris possédant un transgène rapporteur, nous avons montré que l’activité de l’hormone est très hétérogène dans le cerveau pré et post-natal. T3 agit via les récepteurs nucléaires TR pour réguler la transcription de gènes-cibles. De nouveaux gènes-cibles ont été identifiés dans le cervelet post-natal, mais la cascade de signalisation demeure inconnue, en raison d’interactions cellulaires complexes. Pour supprimer la réponse à T3 à un moment donné, dans une cellule donnée, des souris exprimant de façon conditionnelle un récepteur TR1 muté ont été générées. Les mutants constitutifs ont un phénotype très proche de l’hypothyroïdie, ce qui confirme l’implication majeure du récepteur TR1 non lié à T3 dans la pathogénie de l’hypothyroïdie. Le système conditionnel permettra de disséquer le mécanisme d’action de T3 in vivo
Thyroid hormone (T3) has pleiotropic functions during development. Congenital hypothyroidism results in severe mental retardation. Using transgenic reporter mice, we showed that T3 action is highly heterogeneous in pre and post-natal brain. The regulation of gene expression by T3 involves binding of the hormone to TR nuclear receptors acting as T3-dependant transcription factors. We identified new T3 direct target genes in postnatal cerebellum, but the T3 signaling cascade is still unknown, because of complexe cell cell interactions. To suppress T3 response in a specific cell type and at a specific time, we created new transgenic mice expressing a mutated TR?1 in a conditional manner. Constitutive mutants have a hypothyroid like phenotype. This confirms the importance of unliganded TR?1 receptor in hypothyroidism pathogenesis. The conditional system will permit to dissect in vivo T3 action

L’hormone thyroïdienne (T3) joue un rôle pleiotropique au cours du développement. Un déficit congénital en T3 provoque une pathologie nommée crétinisme, notamment caractérisée par un retard mental. In vitro, la différenciation oligodendrocytaire peut être induite par ajout de T3 au milieu de culture. Toutefois, en contradiction avec ces observations, l’inactivation des récepteurs de la T3 n’a qu’un effet marginal sur la différenciation oligodendrocytaire in vivo. Différentes lignées murines exprimant un récepteur dominant négatif de l’hormone thyroïdienne TRα1 spécifiquement dans un type cellulaire ont été générées au laboratoire. Cette stratégie nous a permis de préciser le rôle de la signalisation induite par la T3 sur la différenciation oligodendrocytaire au niveau du cervelet, mettant une évidence une double action de la T3 sur ce lignage. La même stratégie appliquée au développement prénatal a également permis de préciser les bases sous-jacentes à l’altération corticale décrite en cas d’hypothyroïdie prénatale
Thyroid hormone (T3) has pleiotropic functions during development. Congenital hypothyroidism results in severe mental retardation, named cretinism. In vitro, adding physiological doses of T3 in oligodendrocyte precursor cells induce massive differentiation. Surprisingly, in vivo analysis only reveals a slight delay in oligodendrocyte differentiation in case of invalidation of T3 receptors. Several mouse strains have been generated in the lab to express dominant negative thyroid hormone receptors alpha 1 in a cell specific manner. This genetic dissection strategy allows us to understand the function of T3 signalling on oligodendrocyte differentiation in the cerebellum. The same strategy has been applied to prenatal neurodevelopment, to understand mechanisms underlying corticogenesis alteration in case of prenatal hypothyroidism

Depuis de nombreuses années, il existe un débat sur le mode de formation des neurones et des cellules gliales, précocement, à partir de la zone ventriculaire. Ces deux types cellulaires sont-ils issus d’une même cellule ventriculaire où bien existe-t-il deux progeniteurs chacun dédié à la mise en place d’un seul lignage ? Pour répondre à cette question, nous avons cherché un marqueur exprimé dans un domaine restreint de la zone ventriculaire au cours des périodes de neurogénèse et de gliogénèse et notre choix s’est porté sur le transcrit plp. L’étude des cellules plp+ ventriculaires à deux stades de développement, E9,5 et E13,5 nous a permis de démontrer par des cultures clonales in vitro et grâce a un marquage génétique permanent, in vivo, l’existence de deux progeniteurs plp+ indépendants : un progeniteur neuronal précoce et un progeniteur glial plus tardif. Ces résultats sont donc en faveur de l’existence de deux progeniteurs distincts, chacun dédié a un lignage neural, dans la zone ventriculaire. Par la suite, l’analyse du lignage plp par utilisation d’une souris transgénique plp-Cre a confirmé que ces cellules étaient capables de donner naissance à des cellules gliales et à des neurones et nous a permis d’établir un cartographie diencéphalique des dérivés neuronaux. Ceux-ci se repartissent dans différents noyaux prethalamiques et hypothalamiques, à l’intérieur desquels ils représentent une sous-population. Nous avons également cherché à mettre en évidence des facteurs impliqués dans la transition neurone/glie. Pour cela, nous avons comparé, par la technique des puces à ADN, le transcriptome des progeniteurs neuronaux plp+ avec celui des progeniteurs gliaux. Cette technique nous a permis de sélectionner trois gènes candidats potentiellement impliqués dans la gliogenèse.

Les souris KO STOP présentent des troubles comportementaux mimant différents symptômes de la schizophrénie associés à une transmission glutamatergique réduite et à une transmission dopaminergique exacerbée, anomalies correspondant aux hypothèses neurochimiques de la schizophrénie. Les altérations retrouvées chez les souris KO STOP sont améliorées par les neuroleptiques ; les souris KO STOP constituent donc un très bon modèle pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ainsi, nous avons testé l’épothilone D et montré qu’il améliore de nombreuses altérations retrouvées chez les souris KO STOP ; Il représente un traitement innovant très prometteur. Les souris KO STOP présentent une progression au cours du temps des anomalies comportementales. Les souris KO STOP constituent donc un modèle pour étudier le décours temporel de la schizophrénie et pour comprendre les facteurs intervenant dans l’apparition des symptômes à l’adolescence
STOP null mice exhibit many behavioural disturbances mimicking schizophrenia symptoms associated with a reduced glutamatergic transmission and an exacerbated dopaminergic one, alterations suitable with the neurochemical hypothesis of schizophrenia. Alterations displayed by STOP null mice are alleviated by a neuroleptics treatment. Thus, STOP null mice represent a useful tool to develop new therapeutic strategy. Then, we tested Epothilon D, a antimitotic agent, and showed that it improves many alterations seen in STOP null mice, more especially cognitive deficits. It represents an exciting innovative treatment. Finally, STOP null mice exhibit a progression of behavioural defects over time suggesting that juvenile STOP null mice exhibit only subtle alterations in dopaminergic reactivity without major glutamatergic disturbance. STOP null mice provide thus a model to study the time course of schizophrenia and to identify factors leading to the onset of the disease in the late adolescence