Rozprawy doktorskie na temat „Détection de l'ADN”

Nous rapportons une nouvelle méthode de détection de l'ADN sans marquage (label-free) basée sur une lecture directe électrique dans une simple micropuce en verre/PDMS. Cette méthode a été appliquée à la long-range-PCR. Elle utilise le phénomène non linéaire d'instabilités électrohydrodynamiques découvert dans les années 1990 : lorsqu'une suspension de grands polyélectrolytes chargés tels que de longues molécules d'ADN est soumise à un champ électrique élevé (ici 320V/cm à 15Hz) dans une géométrie confinée (microcanal par exemple), il en résulte des fluctuations dynamiques de concentration. Ces fluctuations sont associées à de larges hétérogénéités de conductivité. Pour détecter ces hétérogénéités de conductivité, nous avons développé un détecteur de mesure de conductivité en mode contact localisé. Un système électronique original et simple, doublement symétrique et flottant a été développé pour effectuer la détection tout en découplant les systèmes électroniques des interférences venant de l'alimentation haute tension d'excitation. Une analyse en ondelettes a ensuite été appliquée pour extraire du caractère chaotique des instabilités électrohydrodynamiques un signal scalaire qui reflète l'amplification de l'ADN. Ce travail est la première implémentation d'une technologie complètement nouvelle pour la détection en puce de l'ADN. Comme première validation de ce principe de détection, nous avons mesuré en puce les produits de l'amplification hors puce des fragments d'ADN 10Kbp obtenus par amplification à partir de l'ADN phage lambda, atteignant une sensibilité (entre 10 fg et 100fg d'ADN dans un volume initial de 50µl) meilleure que celle obtenue en fluorescence.

L'identification des espèces est une question essentielle dans de nombreux domaines actuels comme l'agro-alimentaire, la médecine, la paléontologie, etc. Dans les produits transformés (d’origine animale ou végétale), l’identification basée sur des caractères morphologiques n’est pas possible car aucun critère diagnostique n’est accessible, d’où la nécessité d’utilisation de méthodes d’identification basées sur l’amplification de l’ADN par PCR (DNA barcoding). Cependant, dans des substrats dégradés, cette molécule est parfois inaccessible à la PCR en raison de la présence d’inhibiteurs et/ou de modifications chimiques bloquant l’activité de la Taq polymérase. Dans une première partie, cette thèse développe une méthodologie d’extraction et d’amplification de l’ADN à partir des cuirs, pris comme modèle des produits les plus réfractaires à l’analyse moléculaire, du fait des traitements utilisés lors de leurs fabrication. En effet, l'ADN présent dans la peau travaillée est fortement dégradé et chimiquement modifié et en particulier il est co-extrait avec des inhibiteurs de la PCR (colorants et tanins). Outre des applications importantes dans la répression des fraudes et la protection de la biodiversité, la restauration des instruments historiques de musique a été un objectif important de notre approche. Comme les nouveaux traitements enzymatiques (réparation de l’ADN) sont pour l’instant limités aux substrats d’ADN déjà amplifiables, il est donc nécessaire de développer une nouvelle approche pour l’ADN inaccessible par la PCR. Dans ce but, la deuxième partie de cette thèse développe une nouvelle méthode non enzymatique. Il s’agit d’une détection physique de l’ADN, basée sur la spectroscopie vibrationnelle Raman (SERRS, Surface Enhanced Resonant Raman Spectroscopy). Dans l’avenir, cette approche pourrait remplacer la PCR, et être appliquée pour les diagnostics moléculaires rapides et fiables, en particulier pour les analyses médicales
Species identification is a key issue in many topical fields such as food forensics, medicine, paleontology, etc. . In processed products (animal or plant), identification based on morphological characters is not possible because no diagnostic test is available, hence the need to use identification methods based on DNA amplification by PCR (DNA barcoding). However, in degraded substrates, this molecule is sometimes unavailable to PCR due to the presence of inhibitors and / or chemical modifications that block the activity of Taq polymerase. In the first part, this thesis develops a methodology for extracting and amplifying DNA from leather, taken as a model of a product which is highly resistant to molecular analysis due to the treatments used in its manufacture. Indeed, the DNA in worked skin is highly degraded, chemically modified and more specifically it is co-extracted with inhibitors of PCR (dyes and tannins). In addition to the important applications in fraud prevention and biodiversity protection, restoration of historical musical instruments was an important goal of our approach. As new enzymatic treatments (DNA repair) are currently limited to already amplifiable DNA substrates, it is necessary to develop a new approach for DNA inaccessible by PCR. Thus, the second part of this thesis develops a new non-enzymatic method. This physical detection of DNA is based on vibrational Raman spectroscopy (SERRS, Surface Enhanced Resonant Raman Spectroscopy). In the future, this approach could replace the PCR, and be applied for rapid and reliable molecular diagnosis, especially in medical tests

L'acide désoxyribonucléique (ADN) est porteur de l'information génétique et les conséquences biologiques des lésions survenant sur cette molécule peuvent être importantes. Nous avons utilisé la chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en mode tandem (CLHP/SM-SM) pour mettre en évidence la formation de nouvelles lésions radio-induites de l'ADN. L'analyse par CLHP/SM-SM en mode « perte de neutre » utilise la perte de 116 unités de masse, spécifique de la fragmentation de la majorité des nucléosides. Ainsi, 4 nouvelles lésions radio-induites, dont la quantité formée est proportionnelle à la dose d'irradiation, ont été détectées dans l'ADN isolé. L'une d'elles, la dCyd341 est de plus formée dans l'ADN cellulaire. Il s'agit d'une modification de la 2'-désoxycytidine (dCyd) ayant un poids moléculaire de 341 uma. La synthèse chimique de ce nucléoside modifié nous a permis de le caractériser par résonance magnétique nucléaire (RMN) et de déterminer sa masse exacte. Un mécanisme de formation a été proposé, dans lequel l'évènement initiateur est l'arrachement de l'atome d'hydrogène en position 4 du 2-désoxyribose (dR) génèrant un intermédiaire aldéhydique capable de réagir sur une cytosine voisine. La dCyd341 peut être considérée comme un dommage complexe, sa formation impliquant une cassure de la chaîne d'ADN et un pontage entre un produit de modification du dR et une dCyd voisine. En plus de sa caractérisation, de premières études biologiques portant sur la réparation de la dCyd341 ont révélé que la lésion est excisée de l'ADN avec une certaine efficacité.

Ce manuscrit présente l'étude d'une nouvelle méthode de détection électronique différentielle de l'hybridation entre nucléotides, utilisant des réseaux de transistors à effet de champ et une fixation des ADN sondes de type polylysine. Les structures employées sont des réseaux d'EOSFETs, possédant une interface du type électrolyte/oxyde/semi-conducteur (EOS), qui peuvent être immergés dans un électrolyte de mesure dans lequel est plongée une électrode de référence.
La première partie de ce travail détaille les expériences nous ayant permis de montrer le faisabilité d'une détection électronique d'abord de polylysine, puis d'ADN sur une réseau d'EOSFETs. Des micro- ou macro-gouttelettes de solutions contenant ces bio-polymères chargés ont été déposées en des endroits prédéfinis sur les réseaux de capteurs. Ces dépots locaux induisent des variations des caractéristiques courant-tension des transistors exposés, pouvant être corrélées à un apport de charges soit positives dans le cas de la polylysine, soit négatives en ce qui concerne l'ADN. Le signal électronique est proportionnel au nombre moyen d'oligonucléotides de 20 bases par unité de surface, tant que celui-ci reste inférieur à 1000-10000 molécules par µm², avec une variation de 10 mV pour 100 à 1000 molécules déposées par µm². Une saturation du signal électronique est observée au delà. La détection de micro-dépots de faibles concentrations en bio-polymères est limitée par l'existence de signaux électroniques parasites observés avec des solutions servant aux dilutions. La variations des signaux électroniques en fonction de la concentration en sel a également été caractérisée.
L'utilisation d'un protocole d'hybridation sur fixation polylysine, sans étape de blocage visant à limiter l'adsorption non spécifique de cibles a conduit à la mise en évidence d'un signal différentiel de l'ordre de 5 mV lors d'hybridations et de mesures dans un électrolyte de KCl 20 mM. L'hybridation à haut sel et la détection à bas sel permettent d'obtenir des différences d'environ 15 mV. Aucun signal électronique significatif d'appariement n'a été observé en utilisant un bloqueur. La sensibilité de détection électronique de l'hybridation, estimée à 100-1000 double-brins de 20 paires de bases par µm² est proche de celle associée à la technique classique de fluorescence (0,5 à 80 double-brins par µm²).

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est fréquent dans les régions tropicales, où son diagnostic est tardif et les traitements inefficaces. Pour permettre un diagnostic précoce, il faut identifier des marqueurs moléculaires spécifiques au CHC et détectables dans des prélèvements simples à obtenir tels que les échantillons de sang. Dans ce travail, nous avons étudié l'intérêt des mutations des gènes /TP53/ et /CTNNB1/ comme biomarqueurs pour la détection précoce et l'identification de l'étiologie des CHC. D'une part, nous avons analysé une mutation spécifique au codon 249 du gène /TP53/ (Ser249). Nous avons vu que les variations temporelles de la concentration en mutation Ser249 dans l'ADN circulant sont un marqueur d'exposition à l'aflatoxine B1 et au virus de l'hépatite B, et qu'elles pourraient être prédictives de l'hépatocancérogenèse. D'autre part, nous avons observé que les mutations dans les gènes /TP53/ et /CTNNB1/ peuvent co-exister dans les CHC, révélant des mécanismes complexes intégrant les deux voies, en fonction de l'étiologie. La compréhension de ces mécanismes permettra de déterminer la valeur des mutations comme marqueurs moléculaires du CHC.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est fréquent dans les régions tropicales, où son diagnostic est tardif et les traitements inefficaces. Pour permettre un diagnostic précoce, il faut identifier des marqueurs moléculaires spécifiques au CHC et détectables dans des prélèvements simples à obtenir tels que les échantillons de sang. Dans ce travail, nous avons étudié l'intérêt des mutations des gènes TP53 et CTNNB1 comme biomarqueurs pour la détection précoce et l'identification de l'étiologie des CHC. D'une part, nous avons analysé une mutation spécifique au codon 249 du gène TP53 (Ser249). Nous avons vu que les variations temporelles de la concentration en mutation Ser249 dans l'ADN circulant sont un marqueur d'exposition à l'aflatoxine B1 et au virus de l'hépatite B, et qu'elles pourraient être prédictives de l'hépatocancérogenèse. D'autre part, nous avons observé que les mutations dans les gènes TP53 et CTNNB1 peuvent co-exister dans les CHC, révélant des mécanismes complexes intégrant les deux voies, en fonction de l'étiologie. La compréhension de ces mécanismes permettra de déterminer la valeur des mutations comme marqueurs moléculaires du CHC
Hepatocellular carcinoma (HCC) is frequent in tropical regions where its diagnosis is late and its treatments are inefficient. Early diagnosis implies identification of HCC specific molecular markers which can be detectable in easily collected samples such as blood samples. In this work, we have studied the interest of mutations in TP53 and CTNNB1 genes as biomarkers for early detection and determination of HCC etiology. On one hand, we have analysed a specific mutation at codon 249 of TP53 gene (Ser249). We have shown that variations in concentration of Ser249 mutation in circulating DNA are a marker of exposure to aflatoxin B1 and hepatitis B virus, and that they may predict hepatocarcinogenesis. On the other hand, we have observed that mutations in TP53 and CTNNB1 genes can occur in the same HCC revealing complex mechanisms integrating the two pathways depending on etiology. Understanding these mechanisms will allow us to determine the value of mutations as molecular markers of HCC

L'objectif de mon doctorat est de développer une méthode d'analyse des séquences protéiques permettant de cribler, le plus efficacement possible, les alignements non significatifs produits par le logiciel PSI-BLAST afin d'identifier des relations d'homologies lointaines. La stratégie développée repose sur deux étapes de criblage, une première s'appuyant sur les prédictions de structures secondaires, une seconde tirant profit du développement récent de méthodes de comparaison profil/profil performantes. La méthode développée a été initialement calibrée sur une base de données de séquences particulière. Cette base rassemble des séquences de domaines dont les structures sont connues permettant ainsi de contrôler l'existence effective d'homologues lointains. Cette phase a permis d'établir les seuils de détection optimaux permettant une utilisation semi-automatique du programme. Dans une seconde phase, la méthode a été testée sur un ensemble de 100 protéines impliquées dans la signalisation et la réparation des dommages de l'ADN. Au travers de différents exemples, nous montrons les potentialités du programme développé pour des recherches d'homologies lointaines à grande échelle. En particulier, mon étude suggère une nouvelle hypothèse pour comprendre l'origine d'une maladie rare, le syndrome de Nijmejen, provoqué par une mutation dans la protéine Nbs1.

L'objectif de mon doctorat est de développer une méthode d'analyse des séquences protéiques permettant de cribler, le plus efficacement possible, les alignements non significatifs produits par le logiciel PSI-BLAST afin d'identifier des relations d'homologies lointaines. La stratégie développée repose sur deux étapes de criblage, une première s'appuyant sur les prédictions de structures secondaires, une seconde tirant profit du développement récent de méthodes de comparaison profil/profil performantes. La méthode développée a été initialement calibrée sur une base de données de séquences particulière. Cette base rassemble des séquences de domaines dont les structures sont connues permettant ainsi de contrôler l'existence effective d'homologues lointains. Cette phase a permis d'établir les seuils de détection optimaux permettant une utilisation semi-automatique du programme. Dans une seconde phase, la méthode a été testée sur un ensemble de 100 protéines impliquées dans la signalisation et la réparation des dommages de l'ADN. Au travers de différents exemples, nous montrons les potentialités du programme développé pour des recherches d'homologies lointaines à grande échelle. En particulier, mon étude suggère une nouvelle hypothèse pour comprendre l'origine d'une maladie rare, le syndrome de Nijmejen, provoqué par une mutation dans la protéine Nbs1
The aim of my PhD thesis lay in the development of a new automatic approach for efficiently detecting remote homologues lost in the non significant output of PSI-BLAST program. My strategy is based on a two steps procedure : first, we take advantage of secondary structure predictions, second, based on the recent development of highly sensitive profil/profil comparison method. The method was initially calibrated on a sequence database. This database gathers sequences of domains whose structures so that effective existence of remote homologies could be controlled. This step was essential to deduce the optimal thresholds leading to the best detection capabilities for a semi-automatic use of the program. In a second step, the method was tested on a set of 100 protein sequences involved in DNA damage signalling and repair. Through various examples, we show the potentialities of the developed program for the large scale analysis of remote homologies in protein sequences. In particular, my work stimulated a new hypothesis for the understanding of the defects observed in a rare disease, the Nijmejen breakage syndrome, brought about by a mutation in the Nbs1 gene

L’ADN tumoral circulant (ADNtc) porte des altérations spécifiques de la tumeur des patients, qui sont détectables par un acte minimalement invasif. L’ADNtc représente donc un biomarqueur d’intérêt pour le suivi de l’évolution du cancer. Sa détection requière une technique hautement sensible et quantitative. Dans ce contexte, ce travail de thèse a porté sur la quantification et le suivi de l’ADNtc par PCR digitale en gouttelettes (PCRdg). Cet outil permet la détection d’altérations à l’échelle d’un ADN unique, offrant ainsi une sensibilité allant jusqu’à 0.001%. La détection de cet ADNtc a été réalisée par l’évaluation des biomarqueurs tels qu’une mutation spécifique de la tumeur, la fragmentation de l’ADNtc et l’hyperméthylation de séquences cibles. D’une part, nous avons observé que chez les patients atteints de cancer, l’ADN muté circulant est plus fragmenté que l’ADN non muté, et que cet ADN circulant de patients est globalement plus fragmenté que chez les sujets sains. D’autre part, une corrélation entre les pourcentages d’ADN muté et d’ADN hyperméthylé circulants a été observée au cours du suivi de patients. Ceci suggère la possibilité d’un suivi précis et quantitatif de l’ADNtc par l’évaluation de l’hyperméthylation en alternative à la détermination du statut mutationnel. Nous avons ensuite appliqué nos tests de détection de l’ADNtc dans le cadre de deux études cliniques. L’étude PLACOL, incluant 82 patients atteints de cancer colorectal métastatique, a permis de mettre en évidence deux facteurs pronostiques : un seuil de 0.1 ng/mL et la mesure de la pente de décroissance de la concentration en ADN muté ou hyperméthylé circulant. Dans la seconde étude, portant sur le mélanome métastatique dans le contexte d’une thérapie ciblée (vémurafenib), une corrélation inverse entre les concentrations d’ADNtc et de vémurafenib a été observée. Ces résultats suggèrent le potentiel clinique de l’ADNtc pour l’orientation thérapeutique des patients atteints de cancer avancé
Circulating tumor DNA (ctDNA) carries tumor-specific alterations that are detectable by minimally invasive sampling. It represents a highly pertinent marker for cancer monitoring during patients’ follow-up. CtDNA detection requires a highly sensitive and quantitative technique. In this context, this project focused on ctDNA quantification and monitoring by picoliter-droplet digital PCR. Thanks to the compartmentalization in millions of picoliter droplets, this tool allowed the detection of single DNA molecule with a sensitivity reaching 0.001%. Testing of ctDNA was performed through the evaluation of different potential biomarkers: specific mutations, ctDNA fragmentation, and hypermethylation of target sequences. On one hand, we observed in cancer patients that ctDNA is more fragmented than wild-type DNA, and, globally more fragmented than circulating DNA in healthy individuals. On the other hand, a strong correlation between percentages of hypermethylated and mutated DNA was observed during the follow-up of patients. Such results suggest the feasibility to precisely and quantitatively monitor ctDNA by the evaluation of hypermethylation as an alternative to the determination of mutational status. We have applied such ctDNA detection strategies in the context of two clinical studies. The PLACOL study, enrolling 82 metastatic colorectal cancer patients, allowed to highlight two prognostic factors: a ctDNA concentration threshold of 0.1 ng / mL, and the evaluation of ctDNA decreasing slope. In the second study, ctDNA was monitored in 11 melanoma patients in the context of a targeted therapy (vemurafenib). An inverse correlation between the concentrations of vemurafenib and ctDNA was demonstrated. These results suggest the clinical relevancy of ctDNA in advanced cancer patients, for the optimization of therapeutic management

Deux types d'oxydes métalliques transparents conducteurs - SnO2 et Cdln2O4 - ont été déposés en couches minces par la technique de pyrolyse d'aérosol et ont été utilisés comme électrodes semi-conductrices en vue de la détection électrochimique directe de l'hybridation de l'ADN (c'est à dire sans utilisation de marqueurs ). Les conditions de dépôt ont été modifiées de façon à obtenir des couches avec différentes caractéristiques. Les corrélations entre les propriétés microstructurales et électriques des électrodes ainsi réalisées et leur sensibilité électrochimique à l'hybridation de l'ADN ont été particulièrement étudiées. Le résultat majeur de cette étude réside dans le fait que la sensibilité à l'hybridation de l'ADN des électrodes d'oxydes semi-conducteurs étudiés est liée essentiellement à la résistivité électrique de ces électrodes. Cela se vérifie en particulier dans le cas des couches de Cdln2O4 pour lesquelles la microstructure a peu évolué. En revanche, dans le cas des couches de SnO2, la microstructure des couches est un paramètre qui intervient d'une manière importante au même titre que la résistivité électrique
Two kinds of metallic transparent and conductive oxides - SnO2 and CdIn2O4 - have been deposited in thin films using the aerosol pyrolysis technique. They have been used as semi-conductor electrodes in view of the label-free electrochemical detection of DNA hybridization. The deposition conditions have been modified in order to obtain films exhibiting different characteristic. The correlations between micro structural and electrical properties of the as-deposited electrodes and their sensitivity to DNA hybridization have been particularly studied. The major result shows that the sensitivity to DNA hybridization of the studied semi-conductor electrodes is linked to the electrical resistivity of the electrodes. This is particularly true in the case of Cdln2O4 films, the microstructure of which exhibiting nearly no evolution. Ln contrast, in the case of the SnO2 films, the microstructure is an important parameter as well as the electrical resistivity

L’analyse de l’ADN circulant a déjà démontré son potentiel en oncologie en tant que biomarqueur pour le diagnostic, le pronostic des rechutes, la détection d’une maladie résiduelle, pour le suivi de l’évolution clonale tumorale et des résistances acquises, ainsi que comme outil théranostique dans la prédiction de l’efficacité de certaines thérapies ciblées. Mais hormis l’approbation récente par la FDA de deux tests pour la recherche de certaines altérations du gène de l’EGFR sur ADN tumoral circulant en vue de l’instauration d’un traitement par Gefitinib ou Afatinib dans le cadre du cancer du poumon non à petites cellules, aucune application de l’ADN circulant en oncologie n’est encore validée en pratique clinique. Un des principaux freins bien identifié depuis des années, et donc un des principaux enjeux pour la communauté scientifique et médicale, est l’harmonisation et la standardisation des procédures pré-analytiques de traitement des échantillons ainsi que des techniques d’analyse associées. Mais il semble que d’autres problématiques plus récentes soient apparues, notamment la nécessité d’avoir des procédures adaptées à des applications cliniques particulières. Toujours dans un but d’optimisation de l’analyse de l’ADN circulant, un des deux objectifs de ma thèse a été de m’intéresser dans un premier temps à l’étude de l’influence de paramètres pré-analytiques et démographiques sur la quantification d’ADN circulant d’origine nucléaire et mitochondriale, sur une cohorte composée de 104 individus sains et 118 patients atteints de cancer colorectal métastatique. Nous avons notamment pu montrer une différence significative entre groupes d’individus sains inférieur et supérieur ou égal à la médiane d’âge (Mann-Whitney U test, Pvalue = 0.009), ainsi qu’entre femmes et hommes (Mann-Whitney U test, Pvalue = 0.048). L’analyse multivariée de ces données à ensuite permis de confirmer que l’âge était le seul critère prédictif d’une concentration élevée en ADNcir d’origine nucléaire chez les individus sains de notre cohorte (Odd Ratio = 2.41, Pvalue = 0.033). Tous les autres paramètres étudiés n’ont montré d’influence sur la quantification d’ADNcir nucléaire ou mitochondrial, chez les individus sains ou les patients atteints de cancer colorectal métastatique. Dans un second temps, conscients des difficultés observées sur le manque d’harmonisation et l’hétérogénéité des résultats dans la littérature, nous avons proposé un guideline plus complet et détaillé que celui proposé par El Messaoudi et al en 2015, mais surtout adapté à différentes applications cliniques en oncologie et à différents autres domaines comme la transplantation d’organes ou le dépistage prénatal. Conçu à partir de nos propres observations ainsi que d’une revue non exhaustive de la littérature, ce guideline est valable uniquement pour l’analyse de l’ADNcir d’origine nucléaire, des spécificités propres à l’étude de l’ADN circulant mitochondrial étant maintenant établies et nécessitant un guide entièrement dédié à son analyse. Le deuxième objectif de ma thèse était l’évaluation de la valeur pronostique de l’analyse de l’ADN circulant dans la détection précoce des récidives chez les patients traités pour un cancer colorectal stade II/III, dans le cadre d’une étude clinique prospective et multicentrique appelée « DNAcir » promue par le CHU de Limoges. Mais à ce stade d’investigation, les résultats de ce projet ne sont que préliminaires et donc les hypothèses émises dans ce manuscrit sont à prendre avec précaution. Ce travail de thèse fournit une revue récente de la littérature sur le domaine des ADN circulants et leur applications cliniques, tout en apportant des nouvelles connaissances en matière de traitement pré-analytique des échantillons mais aussi en ouvrant de nouvelles pistes de réflexion notamment sur l’effet potentiel de la chirurgie sur la quantification d’ADN circulant, voire même de la thérapie adjuvante le cas échéant
The analysis of circulating DNA has already demonstrated its potential in oncology as a biomarker for diagnosis, prognosis of relapses, detection of minimal residual disease, monitoring tumor clonal evolution and acquired resistances, as well as a theranostic tool in predicting the efficacy of some targeted therapies. But apart from the recent approval by the FDA of two tests for the detection of EGFR gene alterations in circulating tumor DNA before the initiation of treatment with Gefitinib or Afatinib in non-small cell lung cancer, no application of circulating DNA in oncology has yet been validated in clinical practice. One of the main hurdles that has been well identified for several years, and therefore one of the main challenges for the scientific and medical community, is the harmonization and standardization of pre-analytical procedures for sample processing and associated analytical techniques. In addition, it seems that other recent issues have emerged, including the need for procedures adapted to particular clinical applications. Still with the aim of optimizing the analysis of circulating DNA, one of the two objectives of my thesis project was to study the influence of pre-analytical and demographic parameters on the quantification of circulating nuclear and mitochondrial DNA on a cohort of 104 healthy individuals and 118 patients with metastatic colorectal cancer. In particular, we showed a significant difference between healthy individuals with an age below and above or equal to the median value (Mann-Whitney U test, Pvalue = 0.009), and between females and males (Whitney U test, Pvalue = 0.048). Multivariate analysis of these data then confirmed that age was the only predictive factor of a high nuclear-related circulating DNA concentration in our healthy individuals’ cohort (Odd Ratio = 2.41, Pvalue = 0.033). All other parameters studied did not show any influence on the quantification of nuclear or mitochondrial circulating DNA in healthy individuals or patients with metastatic colorectal cancer. In a second step, aware of the difficulties observed in the literature regarding the lack of harmonization and heterogeneity of results, we proposed a more complete and detailed guideline than that proposed by El Messaoudi et al in 2015, but mainly adapted to different clinical applications in oncology and other fields such as organ transplantation and non-invasive prenatal testing. Based on our own observations and a non-exhaustive review of the literature, this guideline is only validated for the analysis of nuclear circulating DNA. Specificities relative to the study of mitochondrial circulating DNA are now established and require a guideline entirely dedicated to its analysis. The second objective of my thesis project was to evaluate the prognostic value of circulating DNA analysis in the early detection of recurrences in patients curatively treated for stage II/III colorectal cancer, as part of a prospective multicentric clinical study called "DNAcir" promoted by the Limoges University Hospital. At this stage, the results of this project are preliminary and therefore the hypothesis made in this manuscript should be taken with caution. In addition, this thesis work provide a recent review of the literature in the field of circulating DNA and their clinical applications, while providing new knowledge on pre-analytical treatment of samples and also opening up new avenues for reflection, particularly on the potential effect of surgery on the quantification of circulating DNA, or even adjuvant therapy if necessary

Le syndrome de Rett est une maladie neurodéveloppementale progressive causée par des mutations du gène mecp2. Elle touche essentiellement les filles avec une fréquence d'environ 1/10000 naissances. Différentes fonctions ont été attribuées à MeCP2 : modulateur transcriptionnel, épissage alternatif de certains ARN, maintien de l'état de méthylation des gènes et modification de la structure tridimensionnelle de la chromatine. Initialement, mes travaux de thèse ont consisté à explorer l'hypothèse que MeCP2 aurait la capacité de passer d'une cellule à l'autre. Les résultats obtenus suggèrent que le transfert intercellulaire de MeCP2 ne se produise pas in vivo mais serait dû à une diffusion intercellulaire de la protéine suite à l'étape de fixation cellulaire à l'acétone durant l'expérimentation. Cependant, ces travaux ont permis de mettre au point une nouvelle méthode pour la détection des protéines dans les cellules de mammifères basée sur le système de split-GFP. Dans le cadre de mon projet de thèse, j'ai également produit et caractérisé des anticorps dirigés spécifiquement contre chacune des 2 isoformes de MeCP2. Ces anticorps originaux vont permettre d'étudier les niveaux d'expression et le rôle de chaque isoforme dans l'organisme. Cela va pouvoir améliorer notre compréhension de la pathologie du syndrome de Rett. Plus récemment, mes travaux se sont focalisés sur la relation entre MeCP2 et les mécanismes de réparation de l'ADN, et nous ont permis de mettre en évidence la capacité de MeCP2 de s'accumuler sur l'ADN endommagé. Les futurs projets de l'équipe viseront à élucider les mécanismes impliqués dans cette nouvelle fonction de MeCP2
Rett syndrome is a severe and progressive X-linked neurodevelopmental disorder that affects 1/10000 female birth. RTT is caused by mutations in the mecp2 gene, encoding the Methyl CpG binding Protein 2. MeCP2 binds to methylated DNA and has several roles in: transcription activation or repression, chromatin remodeling, alternative splicing of mRNA. . . Initially, my thesis project was to explore the hypothesis that MeCP2 may be able to transfer between cells. My results suggest that this phenomenon appears after cell fixation with acetone and doesn't occur in vivo. This work, however, allowed us to develop a new staining method to detect and localize proteins in mammalian cells using the split-GFP system. Within the frame of this project, I have also produced antibodies specific for each of the two MeCP2 isoforms. These novel antibodies should prove to be interesting tools to understand the role of each isoform in the pathology of Rett syndrome. More recently, my work was focalized on the relationship between MeCP2 and DNA damage. I was able to show that MeCP2 accumulates on DNA damage. Future work will be aimed at understanding the mechanisms involved in this newly uncovered function of MeCP2, and will hopefully improve our understanding of Rett syndrome pathogenesis

Le chrome, qui est un des métaux le plus utilisé, est à l’origine de nombreuses pathologies. Par contact cutané direct, ce métal provoque des dermatites allergiques et des ulcères. Son absorption par la voie pulmonaire entraîne l’apparition de cancers. Ce métal et certains de ses dérivés sont d’ailleurs classés cancérogènes par l’IARC. Bien que de nombreuses études aient été menées pour comprendre le potentiel toxique de ce métal, sa toxicité et les mécanismes moléculaires mis en jeu restent encore méconnus. Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié l’effet de Cr(VI) au niveau de la bioénergétique cellulaire. Elle revêt deux aspects : l’une concerne la thermogénèse, l’autre la respiration cellulaire. La thermogénèse déterminée par une méthode originale de microcalorimétrie permet de montrer que la production de chaleur par les fibroblastes est un fidèle reflet du catabolisme du glucose, principale source énergétique indispensable à la vie des cellules. En présence du Cr(VI), la thermogénèse est altérée de façon dose dépendante. Ainsi Cr(VI) entraîne à forte dose une diminution du catabolisme du glucose et donc de son utilisation. Le couplage de cette propriété avec l’étude de la respiration cellulaire par oxymétrie permet de montrer que l’action de Cr(VI) se situe au niveau mitochondrial. En effet, une étroite corrélation entre l’effet sur la thermogénèse et la consommation d’oxygène par la cellule est observée. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons donc abordé l’étude de la génotoxicité et de la mutagénicité du Cr(VI). Le test des comètes associé avec l’enzyme spécifique Fpg nous a permis de mettre en évidence les cassures de brin de l’ADN ainsi que l’oxydation des bases. Ensuite le test des micronoyaux a été utilisé pour déterminer l’atteinte chromosomique. La mise en évidence de micronoyaux sous l’effet du Cr(VI) permet de montrer que ce métal est responsable d’un effet mutagène et clastogène. Enfin la formation d’adduits à l’ADN et la production d’ERO ont été étudiés afin de compléter cette évaluation et approcher le mécanisme d’action du Cr(VI). L’observation d’une relation dose-effet entre les dommages de l’ADN et la formation d’adduits permet de penser que les adduits seraient responsables des altérations de l’ADN. Néanmoins l’ensemble des nos résultats ne permet pas de mettre en évidence un lien direct entre cytotoxicité et génotoxicité. En effet, la dégradation de la thermogénèse associée à la respiration cellulaire due principalement à la présence d’ERO est observée pour de fortes concentrations de Cr(VI) alors que la génotoxicité et la mutagénicité sont observées dès les faibles concentrations. Ainsi donc il est possible d’admettre que la bioénergétique cellulaire est ici un reflet d’une toxicité aigüe du Cr(VI), alors que les dommages de l’ADN sont plutôt un reflet de la toxicité chronique du Cr(VI).

Le syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) est provoqué par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Les méthodes usuelles de dépistage n'étant pas applicables dans tous les cas d'infection, nous avons mis au point une technique de détection de l'ADN proviral VIH dans les lymphocytes. Elle comporte une étape d'amplification in vitro de l'ADN cible par « polymerase chain reaction » (PCR) et une analyse avec sondes nucléiques. La limite de détection reproductible est de 10 molécules d'ADN VIH, avec un facteur d'amplification de 10 11. La sensibilité diagnostique est comprise entre 97% (N=64 sujets séropositifs) et 100 % (N=19 homosexuels séropositifs). La spécificité diagnostique est de 100 % (N=29 sujets séronégatifs). Nous avons montré que l'utilisation d'un contrôle d'amplification permet d'éviter certains faux négatifs, et que la vérification de la spécificité des ADN amplifiés permet d'éviter certains faux positifs. L'application de cette technique à des sujets homosexuels séronégatifs à risque (N=19) partenaires de séropositifs, n'a pas mis en évidence d'infection VIH silencieuse. Ce test est donc applicable en complément des tests usuels de dépistage des infections par VIH, notamment dans le cas des sérologies ininterprétables, pour un dépistage plus précoce, chez les sujets séronégatifs à risque et en pédiatrie.

La revue de la littérature montre que la pulpe dentaire est une source utile pour le diagnostic des bactériémies, y compris en paléomicrobiologie. Les précédents travaux en paléomicrobiologie réalisés dans le laboratoire ont tous mis en évidence une amplification possible de courts ou très courts fragments d'ADN bactérien partant de l'hypothèse que l'ADN ancien est fragmenté. Dans le premier travail, le modèle expérimental de dégradation de l'ADN des macrophages murins J774 et de Mycobacterium smegmatis par la chaleur sèche à 90°C a montré une différence statistiquement significative (p < 0.05) entre la vitesse de fragmentation de l'ADN bactérien et eucaryote. Ces résultats suggèrent que les diagnostics paléomicrobiologiques peuvent détecter des fragments plus longs d'ADN bactérien à partir des échantillons anciens. Dans un deuxième travail, un système de détection rapide de 7 agents pathogènes par PCR multiplex en temps réel a été utilisé pour détecter ces pathogènes suspectés à partir de la pulpe dentaire de 1192 dents anciennes collectées dans 12 charniers dont un localisé à Douai (1710 – 1712). Après la détection de Bartonella quintana dans ce charnier, les PCRs en temps réel emboîtées ultra-sensibles et la «PCR suicide» ont été utilisées pour confirmer la présence de Rickettsia prowazekii souche Madrid E génotype B dans 6/55 pulpes dentaires (11%) collectées de 6/21 squelettes (28.6%) de soldats à Douai. Ces résultats supportent l'hypothèse que le typhus a été introduit en Europe par les soldats espagnols au retour des conquêtes en Amérique
Reviewing the literature shows that dental pulp is a useful source for bacteremic and paleomicrobiological diagnoses. In the first work, an experimental model of DNA degradation of the murine macrophage cell line J774 and Mycobacterium smegmatis by exposure to 90°C dry heat showed a statistically significant difference (p < 0.05) of fragmentation level between bacterial and eukaryotic DNA. These results suggest that paleomicrobiological diagnosis can detect more large fragments of bacterial DNA from ancient buried specimens. In the second work, a system of rapid detection of seven pathogens by multiplex real-time PCR was used for detecting suspected pathogens from dental pulp of 1192 ancient teeth collected from 12 multiple burials including a mass grave in Douai, 1710 – 1712. After the Bartonella quintana detection in this site, real-time nested PCR and ultra-sensitive “suicide PCR” were used to confirm the presence of Rickettsia prowazekii strain Madrid E genotype B in 6/55 dental pulp specimens collected from 6/21 (29%) skeletons of soldiers buried in Douai.These results support the hypothesis that typhus was imported into Europe by Spanish soldiers from America. In the last work, DNA extracted from 5 dental pulp specimens collected from multiple burials at Issoudun, 17th – 18th centuries, was analyzed by pyrosequencing which detected Yersinia pestis sequences in the metagenome. For paleomicrobiology, pyrosequencing is a sensitive technic which can be used as baseline test to detect both suspected and unexpected pathogens from ancient specimens. We named this new approach «paleometagenomics»

Les puces à ADN sont devenues en l'espace d'une décennie des outils incontournables du paysage scientifique actuel. Situées à l'interface des disciplines traditionnelles, elles ont trouvé. Des applications dans des domaines aussi variées que l'expression des gènes, la détection des SNP ou l'évolution de l'espèce humaine au cours du temps. Le travail présenté ici utilise pour la première fois la technique d'imagerie de résonance des plasmons de surface (SPRi) alliée à un contrôle de la température - allant de 20°C à 80°C - pour l'étude des puces à ADN. Dans une première partie, le processus d'hybridation sur support solide est étudié en détail à l'aide du modèle de Langmuir, tant des points de vue cinétique que thermodynamique. Les paramètres ΔH et ΔS, caractéristiques des séquences utilisées, sont estimés et présentent une évolution inhabituelle en fonction de la longueur des sondes, probablement due à des problèmes d'accessibilité sur la puce. Dans une seconde partie, une technique de détection de mutations ponctuelles basée sur l'utilisation de rampes de température a été développée. Les résultats obtenus sur deux cas modèles (K-ras et Cycline D1) présentent un excellent accord avec les prédictions théoriques en solution et permettent d'envisager l'application de cette méthode pour la détection des SNP (Single Nucleotide Polymorphism) sur des échantillons biologiques. Une dernière application à l'étude des interactions entre l'ADN-glycosylase Fpg et l'ADN lésé est finalement présentée. Deux lésions de l'ADN, la 8-oxo-guanine et la 5',8-Cyclo-2'desoxyadénosine, ont été étudiées. Une activité catalytique a été détectée par une méthode thermique originale uniquement pour la lésion 8-oxoG
Ln the space of one decade, DNA-chips became tools which cannot be ignored in the present scientific context. Placed at the interface between traditional disciplines, th. Ey are currently used for gene expression studies, SNP detection or who le genome analysis. This work uses for the first time surface plasmon resonance imaging coupled with tempe rature control - from 20°C to 80°C - applied to DNA-chip studies. Ln the first part, we study the DNA hybridization process on a solid support from a both kinetic and thermodynamic point of view, assuming the theoretical Langmuir model, ΔH and ΔS parameters are estimated as a function of probes length and show a non-conventional behaviour compared to the theoretical prediction. We assume that it could be due to a lack of accessibility on the DNA-chip surface. The second part is dedicated to point mutation detection using tempe rature scan technique. Our results, obtained with two models (K-ras and Cycline D1), are in good agreement with theoretical predictions in solution and let assume that this method could be applied for SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) detection on biological samples. A last application concerns the DNAglycosylase Fpg interactions with damaged DNA duplexes. Two lesions, 8-oxo-guanine and 5',8Cyclo-2'-desoxyadenosine, are used and Fpg enzymatic activity is only detected for the first one using an original thermal method

Le développement de microcapteurs telles que les puces à ADN permet de réaliser des analyses multiparamétriques tant pour le contrôle et la traçabilité alimentaire que pour la détection de mutations responsables de maladies génétiques. De nombreux dispositifs ont été réalisés comme le puces à ADN constituées de polymères conducteurs électroniques (PCE), en particulier le polypyrrole. C'est dans ce contexte que nous avons étudié de nouvelles voies de lecture de la reconnaissance entre l'ADN sonde ancré au PCE et l'ADN cible en solution. Deux modes de lecture de l'hybridation ADNsonde/ADNcible, ont été étudiés. L'un est basé sur la variation de l'électroactivité d PCE support et l'autre sur le phénomène d'électrochimiluminescence (ECL). Le premier n'apparaît pas asez sensible pour être considér comme une méthode fiable. En effet l'électroactivité du polypyrrole est très sensible au milieu électrolytique d'analyse et garde un" effet mémoire" qui masque sensiblement l'effet de transduction de l'hybridation. Par contre, l'électrochimiluminescence via un complexe Ru(bpy)32+ (bpy=2,2'-bipyridine) est une méthode sensible. Nous avons montré que l'ECL de ce complexe est possible sur PCE à condition que l'adéquation entre le potentiel d'initiation du processus d'ECL et une conductivitè électronique suffisante du PCE, soit satisfaite
The study of this work concernes the detection of hybridization between DNA probes anchoring to a ECP film (ECP, electronic conductin pol ymer) and DNA target in solution. Two methodes have been investigated. The first is based on the variation of the ECP electroactivity. Nevertheless, this way is not enough sensitive to be used as a detection method. Indeed the ECP eiectroactivity change strongly in function of the analytical medium. The second method used the electrochemiluminescence (ECL) of Ru(bpy)32+ (bpy=2,2'-bipyridine) as a tool to detect the recognition DNAprobe/DNAtarget. We have studied the ECL of Ru(bpy)32+ to the interface of an ECP film. From a good agreement between the potential value to induce the ECL process and the electronic conductivity of ECP, the ECL of Ru(bpy)32+ onto an ECP film is then possible

L'objectif de ce travail était d'évaluer, dans le cadre du dépistage du cancer du col de l'utérus, la performance de l'auto-prélèvement vaginal sec (APV-Sec) ou avec milieu de transport liquide (APV-Liq) pour la détection d'infections cervicales à papillomavirus humain (HPV) puis d'évaluer l'efficacité sur la participation de l'envoi d'un kit pour APV au domicile de femmes non dépistées. Dans un premier temps, 722 femmes ont réalisé en consultation un APV-Sec, un APV-Liq puis un frottis. La sensibilité et la spécificité des APV-Sec (88,7% et 92,5%) et des APV-Liq (87,4% et 90,9%) pour détecter de. Infections cervicales à HPV étaient élevées. L'APV-sec est une méthode performante pour la détection d'infections cervicales à HPV ; il a été retenu pour la suite du projet pour sa facilité de transport et son coût inférieur. Dans un second temps, 6000 femmes de 30 à 65 ans, non dépistées depuis plus de 3 ans, résidant en Indre-et-Loire ont été randomisées en 3 groupes : sans intervention, courrier de relance incitant à réaliser un frottis ou envoi au domicile d'un kit pour APV. La participation 9 mois après la randomisation était significativement supérieure dans le groupe « auto-prélèvement » (22,5%) que dans le groupe « relance » (11,7%) et « sans intervention » (9,9%). Les ratios différentiels coût-résultat par femme supplémentaire dépistée étaient respectivement de 77,8€ pour le groupe « relance » et de 63,2€ pour le groupe « auto-prélèvement » par rapport au groupe « sans intervention ». L'envoi de kits pour APV au domicile est une méthode efficace et coût-efficace pour atteindre les femmes noi dépistées dans un programme de dépistage organisé du cancer du col de l'utérus
The aim of this study was to assess, for cervical cancer screening, the accuracy of vaginal self-collection transported dry (vsc-DRY) or in liquid medium (vsc-LIQ) for the detection of cervical infection with human papillomavirus (HPV) and to assess the effectiveness of home-mailed kit for vaginal self-sampling in unscreened women. As a first step, 722 women attending a Pap smear underwent a vsc-DRY and a vsc-LIQ. The sensitivity and specificity of vsc-DRY (88. 7% and 92. 5%) and vsc-LIQ (87. 4% and 90. 9%) for detecting cervical HPV infections were high. The vsc-DRY is accurate for the detection of cervical HPV infections. This low-cost and easy-to-ship sampling method was selected for the second phase of our project. As a second step, 6000 women aged 30 to 65 years, unscreened for more than 3 years, living in Indre-et-Loire were randomized into 3 groups: no intervention, recall letter to have a Pap smear or home-mailed vaginal self-sampling kit. Nine months after randomization, participation was significantly higher in the "self-sampling" group (22. 5%) than in the "recall" group (11. 7%) and the "no intervention" group (9. 9%). The incremental cost-effectiveness ratios per extra screened woman was 77. 8€ for the "recall" group and 63. 2€ for the "self-sampling" group, relative to the "no intervention" group. Offering an in-home, return-mail kit for vaginal self-sampling with a dry swab is more effective and cost¬effective than a recall letter in increasing participation in cervical-cancer screening

Résumé: L’expression des gènes modifiés contribue à l’initiation et la progression du cancer. Malheureusement, les recherches actuelles s’attardent essentiellement à l’expression globale des gènes sans tenir compte des différentes isoformes des ARNm résultant de l’épissage alternatif, codant potentiellement pour des protéines de fonctions différentes. En effet, la haute similitude et la complexité des isoformes ARNm rendent la discrimination des isoformes laborieuse, raisons pour lesquelles l’épissage alternatif est historiquement étudié gène par gène. C’est la raison pour laquelle nous avons développé une méthodologie à haut débit pour la quantification des isoformes d’ARNm. Basé sur cette technique, cette Thèse présente une série d’évidences qui appuie l’hypoThèse selon laquelle certaines isoformes d’ARNm sont nécessaires à la tumorigénèse. Précédemment, des études bioinformatiques à grande échelle ainsi que des validations expérimentales à petite échelle ont révélé la présence d’isoformes spécifiques à certains types de cancers. Toutefois, ces conclusions ont été tirées à partir de tumeurs dont le contenu cellulaire est hétérogène. Or, il est bien connu que les niveaux des isoformes d’ARNm diffèrent largement en fonction du type cellulaire et il est possible que les différences observées dans des tumeurs entières soient des artéfacts résultant de la complexité cellulaire des tissus comparés. En nous basant sur le cancer de l’ovaire comme modèle, nos préparations homogènes de différents types cellulaires nous ont permis de révéler la présence d’isoformes associées au cancer indépendamment de l’hétérogénéité des tumeurs. Étonnamment, les changements les plus intéressants ne se retrouvent pas dans les cellules cancéreuses à proprement dites, mais dans les cellules "normales" en bordure de la tumeur. Notre analyse des facteurs de régulation de ces isoformes nous a permis d’affirmer que ces changements ne sont pas dûs à un dérèglement anarchique des cellules cancéreuses, mais découlent plutôt d’un programme destiné à avantager les cellules cancéreuses. Pour évaluer la fonction des isoformes d’ARNm, nous avons généralisé des outils moléculaires permettant de reprogrammer spécifiquement l’expression d’isoformes de gènes cible dans des lignées cellulaires cancéreuses. Ainsi, le criblage systématique d'isoformes d’ARNm de gènes cibles associés au cancer a permis de révéler leur caractère pro-cancer dans des essais in vitro. L'ensemble de ces travaux démontrent la contribution des isoformes d’épissage dans le développement des tumeurs solides. // Abstract: Cancer cells modify their gene expression pattern to promote tumor growth. Unfortunately, current research focuses almost exclusively on global gene expression changes, without taking into account the fact that the majority of genes produce multiple alternative splicing variants, which potentially code for proteins of different functions In fact, the main reason splicing isoforms are still studied on a gene by gene basis is because the high sequence similarity and complexity of mRNA isoforms make it very difficult to detect and quantify them. To overcome this difficulty, we developed a high-throughput methodology to accurately quantify splicing isoforms. This methodology has been applied in this thesis to generate evidence supporting a causal role for splicing isoforrns in the tumorigenesis of solid tumors. A few years ago, genome-wide bioinformatics predictions, and some experimental validations in human tissues, suggested the existence of cancer-specific splicing isoforms. However, these conclusions may be simply explained by the cellular heterogeneity of tumor. In fact, it is well established that alternative splicing is a cell type-specific process. To address this, we microdissected cancer tissues and demonstrated that some splicing isoforms are truly cancer-associated and independent of tumor cell type content. Surprisingly, the most interesting changes were found in the "normal" stromal cells surrounding the tumor and not within the cancer cells. Our analysis of splicing-factor expression changes using the same tissue set allowed us to confirm that these splicing shifts were not a random process, but rather part of a defined splicing program promoting tumor development. To evaluate the functional contribution of splicing isoforms, we developed molecular tools that modulate splicing of endogenous targets in cancer cell lines. We used these tools to decipher the pro-cancer properties of cancer-associated splicing isoforms using in vitro assays. Overall, this work demonstrated the contribution of splicing isoforms in solid tumor development.

Le plum pox potyvirus (ppv) est l'agent responsable de la sharka, la maladie virale actuellement la plus grave pour les arbres fruitiers a noyau. A cause de la faible concentration et de la repartition irreguliere du virus dans les arbres infectes, des techniques de detection du virus extremement sensibles sont necessaires. Un test de detection du ppv par hybridation moleculaire utilisant des sondes arnc marquees au #3#2p correspondant a des genes codant pour des proteines virales non structurales de ppv-d ont permis une augmentation de la polyvalence du test par rapport a une sonde correspondant au gene de la proteine de capside. Ces sondes ont detecte avec une sensibilite maximale un grand nombre d'isolats de ppv a l'exception d'un isolat egyptien: ppv-e1 amar. L'arn genomique de ppv-e1 amar a ete clone et sa moitie 3 a ete sequencee. Des niveaux de divergence de 20% ont ete observes au niveau des acides nucleiques, 10% au niveau des acides amines, par rapport aux sequences correpondantes de 3 autres souches de ppv, homologues a 98% entre elles. Ppv-e1 amar se presente donc comme une souche atypique de ppv. Un protocole de detection du ppv par pcr, dans un seul tube s'est avere polyvalent et a demontre une plus grande sensibilite par rapport a l'hybridation moleculaire utilisant des sondes arnc radiomarquees. Un protocole modifie de pcr par l'introduction d'une etape prealable d'immunocapture du virus (ic/pcr), a permis d'augmenter la sensibilite de 100 fois, 250 fois et 2000 fois par rapport a la pcr, l'hybridation moleculaire et le test elisa respectivement

La quantification de biomarqueurs spécifiques est un outil de diagnostic important. Les tests immunologiques standards tels que ELISA nécessitent de nombreuses étapes de lavage et une amplification du signal, en particulier à faible concentration. D'autre part, le transfert d'énergie résonant de type Förster (FRET) a été utilisé pour concevoir des tests biologiques homogènes en une seule étape qui ne nécessitent aucune étape de lavage, où le biomarqueur permet la formation d'un complexe "sandwich" impliquant des anticorps marqués par le donneur et d'autres marqués par l'accepteur. Le FRET du donneur vers l'accepteur fournit alors une signature optique de la formation du complexe, et donc du biomarqueur d'intérêt. Cependant, le FRET, qui est très sensible à la distance donneur-accepteur, ne se produit à un taux significatif que lorsque la distance donneur-accepteur est inférieure à 10 nm; la grande taille de nombreux complexes biologiques limite l'efficacité du transfert d'énergie, empêchant une détection sensible. Je propose ici une nouvelle modalité de transfert d'énergie qui utilise des microcavités optiques en solution. Ensuite, je décris un schéma de biodétection pour détecter un oligonucléotide biomarqueur de cancer en solution.À cette fin, j'ai conçu des structures de microcavité dans lesquelles des nanocristaux fluorescents sont placées à l'intérieur de microsphères diélectriques pour permettre un couplage fort de leur émission de fluorescence avec les modes de résonance de la cavité, appelés modes de galerie (WGM). J'ai étudié les propriétés structurelles et optiques de ces microcavités optiques. J'ai également caractérisé le transfert d'énergie entre ces modes et des nanoparticules acceptrices chargées de colorants présentes dans le champ évanescent, à quelques dizaines de nm au-dessus de la surface des microsphères. J’ai développé un modèle analytique pour caractériser les mécanismes de transfert d'énergie médié par les WGM (WGET). De plus, une comparaison entre WGET et FRET a révélé la supériorité du WGET dans le contexte de la construction de capteurs en termes de sensibilité et de portée de détection. Dans la dernière partie de la thèse, j’ai développé une stratégie pour fonctionnaliser ces microcavités optiques et leur permettre d'interagir avec des analytes cibles tels que l'ADN, l'ARN et les protéines avec une bonne spécificité. Cette stratégie a ensuite été adaptée pour fixer des sondes de capture d'ADN sur les microcavités activées par WGM. En utilisant les microsphères fixées à l'ADN comme donneur optique en combinaison avec des nanoparticules de colorants fonctionnalisées par un ADN complémentaire comme accepteurs optiques, un test de biodétection a été démontré avec succès pour détecter en solution un biomarqueur de cancer appelé survivine. Ce test a démontré une bonne sensibilité envers la cible, et s'est également avéré très spécifique. Le schéma de détection a été démontré dans un microscope confocal, au niveau de microsphères individuelles, puis transposé avec succès dans un instrument beaucoup plus simple tel qu'un spectrofluoromètre qui mesure la fluorescence de l'ensemble de la solution; la signature de la formation d'un complexe sandwich a été détectée efficacement.En conclusion, j'ai démontré que le transfert d'énergie assisté par microcavité présente plusieurs avantages par rapport aux tests FRET ordinaires. Un véritable test de biodétection basé sur le principe du WGET a également été conçu avec succès pour détecter des biomarqueurs du cancer avec une sensibilité et une spécificité élevées. Cette étude ouvre donc de nombreuses possibilités pour concevoir des tests plus performants et plus précis pour détecter diverses entités biologiques
Quantification of specific biomarkers is an important diagnostic tool. Standard immunoassays such as ELISA require extensive washing steps and signal amplification, in particular when the biomarker of interest is only present at very low concentrations. On the other hand, non-radiative Förster resonance energy transfer (FRET) has been used to design one-step homogenous bioassays which do not require any washing steps, where the biomarker enables the formation of a sandwich complex involving donor-labeled and acceptor-labeled antibodies. FRET from the donor to the acceptor then provides an optical signature of the complex formation, hence of the biomarker of interest. However, FRET which is highly sensitive to the donor-acceptor distance, only occurs in a significant rate when the distance between the donor and acceptor is less than 10 nanometers; thus the large size of many biological complexes limits the efficiency of energy transfer, preventing sensitive detection. Here I propose a novel energy transfer modality that uses solution-phase optical microcavities to enhance energy transfer. Following that, I describe a bio-sensing scheme designed to detect a cancer biomarker DNA in solution.To this aim, I have designed microcavity structures in which fluorescent colloidal quantum dots are located inside dielectric polymer microspheres to enable strong coupling of their fluorescence emission with the cavity resonance modes or whispering gallery modes (WGMs) of the microspheres. A detailed study was carried out to comprehend the structural and optical properties of these optical microcavities. I also characterized the energy transfer between these modes and acceptor dye-loaded nanoparticles present in the evanescent field, within a few tens of nanometers above the microsphere surface. An analytical model was constructed to provide insights into the WGM mediated energy transfer (WGET) mechanisms. Moreover, a comparison between WGET and FRET revealed the superiority of WGET in the context of building sensors with improved sensitivity and longer range of detection. In the last part of the thesis, a strategy is discussed in detail to provide biological functionalities to these optical microcavities which would enable them to interact with target analytes such as DNA, RNA, and proteins with high specificity, and moreover to reduce non-specific interactions. This strategy then was adapted to attach DNA capture probes onto the WGM enabled microcavities. Using the DNA attached microspheres as optical donor in combination with probe-DNA functionalized dye nanoparticles as optical acceptors, a biosensing assay has been successfully demonstrated to detect a cancer biomarker DNA called survivin in the solution phase. This assay did not only show good sensitivity towards the target, but also it has proven to be highly specific. The detection scheme has been demonstrated in a sophisticated confocal microscope at the single microsphere level, then successfully translated to a much simpler spectrofluorometer that measures fluorescence from the whole sample solution; the signature of the sandwich complex formation was also effectively detected.In conclusion, I demonstrated that microcavity-assisted energy transfer has several advantages over regular FRET assays. A real bio-sensing assay based on the WGET principle has also been successfully designed to detect cancer biomarkers with high sensitivity and specificity. This study thus opens up many possibilities to design high-performing and more accurate assays to detect varieties of biological entities

Le traitement de l'hépatite chronique C a pour objectif d'éliminer la réplication virale afin d'arrêter l'évolution des lésions histologiques hépatiques (nécro-inflammation et fibrose) pour prévenir l'évolution vers la cirrhose et ses complications, en particulier le carcinome hépato-cellulaire. La réponse virologique soutenue (RVS) est définie par l'absence de détection de l'ARN du virus de l'hépatite C (VHC) 6 mois après l'arrêt du traitement. La possibilité d'une éradication de l'infection par le VHC chez les patients avec RVS est controversée. Dans la première partie de notre travail, nous avons démontré, en utilisant une méthode très sensible de détection de l'ARN VHC (transcription mediated amplification, TMA, sensibilité de 10 UT/mi), que chez les patients avec RVS, l'ARN VHC n'était pas détectable dans le sérum (n = 344), le foie (n = 114) et les cellules mononucléées du sang périphérique (n = 156) chez 98 % des patients étudiés avec un suivi allant jusqu'à 18 ans après l'arrêt du traitement. La RVS était associée à une amélioration histologique et à une régression de la cirrhose chez 88 % et 64 % des patients respectivement. Nous avons pu également montrer une diminution progressive des anticorps anti-VHC chez les malades avec RVS avec disparition de certains types d'anticorps. Cependant, les anticorps contre la capside du virus (anti-C22) persistaient chez tous les malades. Une autre partie du travail avait pour objectif d'évaluer l'influence de la charge virale (ARN VHC intra-hépatique) sur la sévérité de la maladie du foie et sur la réponse au traitement anti-viral en utilisant la méthode de l'ADN branché (bDNA), technique standardisée et fiable, que la charge virale intra-hépatique était corrélée à la charge virale sérique. Nous avons trouvé que la charge virale intra-hépatique n'était pas associée à la sévérité des lésions histologiques, confirmant le rôle de la réponse immunitaire et de la fibrogénèse liée à l'hôte et non pas à un effet cytopathogène direct du virus dans la pathogénèse des lésions hépatiques. Nous avons pu également montrer qu'une charge virale intra-hépatique élevée était associée à une probabilité plus faible de RVS suggérant que le nombre de cellules infectées et/ou l'intensité de la réplication virale étaient des facteurs importants impliqués dans la réponse au traitement. Nos résultats montrent qu'on peut considérer que la RVS correspond généralement à une éradication virale. Ce résultat est très important car il confirme l'impact positif du traitement sur le pronostic à long terme de l'hépatite chronique C et permet de motiver les patients à suivre un traitement de longue durée associé à de nombreux effets secondaires.