Rozprawy doktorskie na temat „Collagène dense”

Injecter des gels denses de collagène pour obtenir des matériaux 3D, biomimétiques en termes d’architecture et de propriétés mécaniques, est un enjeu pour la régénération tissulaire car cela pourrait éviter des chirurgies lourdes. Des solutions de collagène très concentrées ont la capacité de former des mésophases dont la géométrie mime celle des tissus biologiques. Ainsi, il est possible d’obtenir des gels de collagène en 3D possédant une meilleure tenue mécanique, sans utiliser de réticulant chimique qui peut induire des inflammations. Cependant, l’injection de solutions de collagène très concentrées est empêchée par l’augmentation drastique de leur viscosité. Comment associer biomimétisme et injectabilité de gels denses de collagène ? Nous proposons de concentrer des solutions acides de collagène par atomisation, produisant des billes denses de collagène. Une simple pesée de ces billes permet de déterminer la concentration des gels. Mélangées à un solvant aqueux, elles sont injectées dans un moule imitant un défaut tissulaire. La fibrillogénèse, induite in vitro dans les solutions de collagène, forme des gels rigides. Les microscopies optique et électroniques révèlent des organisations issues de l’auto-assemblage du collagène à l’échelle macroscopique, selon la concentration en collagène (de 3wt% à 8wt%). Le comportement mécanique des gels imite celui des tissus biologiques, et est fortement lié à l’ultrastructure des fibrilles de collagène. Cette étude ouvre des perspectives dans le domaine de la régénération tissulaire en dessinant le cadre d’une librairie tissulaire, contenant des matériaux en collagène biomimétiques, injectables et denses, permettant l’usage de procédures chirurgicales moins invasives
Injection of dense collagen to obtain 3D biomimetic scaffolds in terms of structure and mechanical properties is challenging for regenerative medicine since it would avoid open-surgery. It is well-known that highly concentrated collagen solutions can form liquid crystal mesophases with tissue-like geometries. Thus, it is possible to obtain 3D collagen gels in vitro with better mechanical properties, without widely used chemical crosslinkers that may lead to inflammatory responses. Nevertheless, the injection of highly concentrated collagen solutions is unlikely due to their high viscosity.How to combine biomimetism and injectability of dense collagen gels?To achieve this goal we concentrate acidic collagen solutions by spray-drying, forming dense collagen beads. A simple weighing of the beads determines the concentration of the gels. Mixed with an aqueous solvent, the beads are injected into a mold mimicking a tissue defect. The fibrillogenesis in vitro is induced within the collagen solutions that transform into stiff gels. Electron and polarized light microscopies show organizations resulting from collagen self-assembly at macroscopic length scale depending on the collagen concentration i.e. from 3wt% to 8wt%. Mechanical tests results reveal tissue-like properties strongly linked to collagen fibrils ultrastructure. This study opens perspectives in tissue repair in setting the framework of a library made of biomimetic (anisotropic, dense and stiff) and injectable collagen gels, enabling minimally invasive procedures

La myopathie de Duchenne est une maladie génétique rare caractérisée par une dégénération progressive des muscles striés notamment squelettiques et cardiaque. A l’échelle de la cellule, l’absence de dystrophine perturbe l'intégrité de la membrane plasmique, la signalisation cellulaire et par conséquent la contraction musculaire. A l’échelle du tissu, ces changements se traduisent par une faiblesse musculaire et par une perturbation de la matrice extracellulaire qui se rigidifie, perd son organisation anisotrope et devient peu poreuse. La matrice joue un rôle essentiel dans l’évolution de la maladie et est souvent négligée dans les modèles existants. Ainsi, ce projet de thèse a eu pour but de développer un nouveau modèle tissulaire cardiaque et musculaire prenant en compte ces modifications structurelles de la matrice pour améliorer la compréhension de la pathologie et générer un modèle physiologique pour tester des molécules thérapeutiques. Tout d’abord, un modèle de matrice extracellulaire saine a été généré par impression 3D de collagène de type I dense. Les paramètres ont été ajustés pour reproduire la matrice physiologique, à savoir une rigidité de 10 kPa, de l’anisotropie et de la porosité. L’impression de collagène dense permet à la fois d’aligner les molécules de collagène et de générer une porosité intrinsèque dans l’hydrogel de collagène. Ensuite, son pendant pathologique a pu être développé en modifiant les paramètres d’impression et de gélification du collagène pour obtenir une matrice de rigidité 50 kPa, isotrope et non poreuse. In vivo, les cellules musculaires et cardiaques sont physiologiquement agencées sous forme de fuseaux. Cette morphologie particulière a été reproduite au sein des matrices développées en créant un pore cylindrique par moulage qui a été colonisé par les cellules. L’enjeu est de recréer au sein de ces pores un microtissu jointif pour mimer les conditions physiologiques. En utilisant des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines ou des myoblastes murins, nous avons respectivement obtenu des microtissus cardiaques et musculaires au contact de matrices saines ou pathologiques. Pour le microtissu musculaire, les cellules saines ensemencées dans la matrice pathologique montrent un stress du à l’hypoxie, associé à un ralentissement du cycle cellulaire et une moins bonne différentiation en myotubes. Pour le microtissu cardiaque, les cellules ensemencées dans le modèle pathologique ont montré une moins bonne contraction sous stimulation. Par ailleurs, les matrices ont été adaptées à une puce microfluidique pour assurer la perfusion de milieu de culture par les pores créés par l’impression 3D. Cette perfusion permet d’améliorer la diffusion de l’oxygène et des nutriments au sein du modèle. Ces nouveaux modèles de tissu cardiaque et musculaire permettent de prendre en compte les interactions cellule/cellule mais aussi cellule/matrice dans l’évolution de la pathologie. Ainsi, les différentes combinaisons entre matrice saine/pathologique et cellules saines/mutées permettrait à l’avenir de mieux comprendre la pathologie et de trouver des stratégies thérapeutiques adaptées
Duchenne Muscular Dystrophy is a rare genetic disease characterized by progressive degeneration of striated muscles, notably skeletal and cardiac. At the cellular level, the absence of dystrophin disturbs the integrity of the plasma membrane, cell signaling, and consequently muscle contraction. At the tissue level, these changes result in muscle weakness and a disturbance of the extracellular matrix which becomes rigid and loses its anisotropic organization with reduced porosity. The matrix plays a crucial role in the evolution of the disease and is often neglected in existing models. The matrix plays a crucial role in the evolution of the disease and is often neglected in existing models. This project aims to develop a new tissue model that considers these structural changes in ECM to improve our understanding of the pathology and discover novel therapeutic solutions. First, the 3D printing of dense type I collagen generated a healthy extracellular matrix model. Its parameters were adjusted to reproduce the physiological matrix, i.e., a stiffness of 10 kPa, anisotropy, and porosity. Dense collagen printing allows collagen molecules alignment and generates porosity. Then, its pathological counterpart could be synthesized by modifying the printing and gelling parameters of collagen to get a matrix with a 50 kPa stiffness, isotropic, and non-porous. In vivo, the muscle and heart cells are physiologically arranged in bundles. A cellularized cylindrical pore generated by molding reproduced this morphology within the matrices. To mimic the physiological conditions, the challenge was to recreate a joined microtissue with densely-packed cells within these pores. We obtained a cardiac and a muscular microtissue with both types of matrices (healthy or pathological) using human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells or murine myoblasts. For the muscle microtissue, the healthy cells seeded in the pathological matrix showed high stress due to hypoxia, associated with cell cycle arrest and weak differentiation into myotubes. For the cardiac microtissue, cells seeded in the pathological model had irregular beatings when stimulated. In addition, the matrices were adapted to a microfluidic chip to ensure the perfusion of the culture medium through the pores created by the 3D printing. This perfusion enhances nutrient and oxygen diffusion in the model. These new cardiac and muscular tissue models take into account cell/cell and cell/matrix interactions in the evolution of the pathology. Thus, the different combinations between healthy/pathological matrix and healthy/mutated cells will allow us a better understanding of the pathology to discover novel and adapted therapeutic strategies

To date, only engineered tissues of planar geometry, such as epidermal and dermal layer substitutes, have successfully reached the market, mainly due to their relative low complexity and simple geometry. In contrast, the mechanical and functional requirements of tubular tissues are more stringent compared to planar tissues. Tubular tissues, which are the main components of several biological systems (e.g. circulatory, urinary or respiratory), not only present an increased complexity in geometry and tissue architecture, they are also populated by mixed cell types. In addition, these are continuously exposed to cyclic mechanical stimuli, which modulate cellular responses and ultimately the functionality of the tissues. Therefore, the understanding and the ability to reproduce physiologically equivalent environments are critical to generate mechanically and biologically functional neo-tissues or tissue models. The aim of this doctoral research was to produce and characterize 3D DC-based tubular constructs as tissue models for airway tissue engineering in physiologically relevant culture conditions. The first objective was to develop DC-based constructs and evaluate, in real-time, the responses of seeded fibroblasts to PC and to culturing with the DC environment; the fabrication and characterization of mesenchymal stem cell (MSC) seeded multilayered DC-SF-DC hybrids; and to evaluate the differentiation of MSCs cultured within multilayered DC-SF-DC hybrids.The second objective was to develop and characterize cell-seeded tubular dense collagen constructs (TDCCs) with bioinspired mechanical properties.The third objective was to implement tubular dense collagen-based constructs as an airway tissue model through the evaluation of airway smooth muscle cell (ASMC) responses within TDCC under physiological mechanical stimuli, and the development of a multilayered tubular dense collagen-silk fibroin construct (TDC-SFC) that mimicked airway tract architecture in order to study MSC responses under physiological mechanical stimulation.By providing ASMCs with a physiologically equivalent niche, and through pulsatile flow stimulation, in vitro, ASMCs exhibited their native orientation, maintained their contractile phenotype and enhanced the mechanical properties of the TDCC through matrix remodelling. The ability of TDC-SFC to transfer physiological pulsatile stimulation to resident MSCs resulted in native-like cell orientation (i.e. parallel to circumferential strain), and induced MSC contractile phenotype expression.In conclusion, the tubular dense collagen-based constructs developed and implemented, in this doctoral dissertation, effectively provided an in vitro airway tissue model for potential preclinical studies to mimic physiological and pathological conditions (e.g. inflammatory and degenerative diseases) in a relevant biomechanical environment, as alternatives to simple tissue culture techniques or complex animal models.
À ce jour, seuls les tissus synthétisés de forme plane, comme les substituts dermiques et épidermiques, ont réussi à percer le marché, surtout en raison de leur complexité relativement faible et de leur géométrie simple. À l'opposé, les exigences mécaniques et fonctionnelles des tissus tubulaires imposent un plus grand nombre de contraintes que les tissus planaires. Principales composantes de plusieurs systèmes biologiques (circulatoire, urinaire ou respiratoire), les tissus tubulaires sont non seulement plus complexes sur le plan de la géométrie et de l'architecture tissulaire, mais ils sont aussi composés de cellules de différents types. De plus, ils sont continuellement exposés à des stimuli mécaniques cycliques. Voilà pourquoi il est essentiel de comprendre les milieux physiologiquement équivalents et de pouvoir les reproduire si on veut obtenir des néotissus ou des modèles tissulaires fonctionnels sur le plan mécanique et biologique.La présente recherche de doctorat visait donc à produire et à caractériser des constructions tubulaires 3D à base de CD, les tissus des voies respiratoires dans des conditions de culture physiologiquement pertinentes. Le premier objectif était de concevoir des constructions à base de CD et d'évaluer la réaction des fibroblastes ensemencés à la CP et à la culture dans un milieu à base de CD; de fabriquer et de caractériser des hybrides multicouches CD-fibroïne-CD ensemencés de cellules souches mésenchymateuses (CSM); et d'évaluer la différenciation.Le deuxième objectif de la présente recherche était de concevoir et de caractériser des constructions tubulaires faites de collagène dense (CTCD). Le troisième objectif était d'implanter des constructions tubulaires à base de CD comme modèle tissulaire des voies respiratoires par l'évaluation de la réponse des cellules musculaires lisses (CML) des voies respiratoires dans les CTCD en présence de stimuli mécaniques physiologiques.En leur fournissant une niche physiologiquement équivalente, et grâce à la stimulation de l'écoulement pulsatoire, in vitro, les CML des voies respiratoires ont pris leur orientation naturelle, maintenu leur phénotype contractile et amélioré les propriétés mécaniques de la CTCD grâce au remodelage matriciel. La capacité de la CTCD à transférer la stimulation physiologique pulsatile aux CSM résidentes a donné une orientation des cellules s'apparentant à leur orientation naturelle et induit l'expression phénotypique.En conclusion, les constructions tubulaires à base de collagène dense qui ont été développées et implantées sont parvenues à fournir in vitro un modèle tissulaire des voies respiratoires pour d'éventuelles études précliniques visant à reproduire les conditions physiologiques et pathologiques.

La dégénérescence du disque intervertébral est une pathologie irréversible entraînant des maux de dos intenses. Les disques intervertébraux sont composés de trois parties : le Nucleus Pulposus (NP) situé au centre, entouré par l’Annulus Fibrosus (AF) et deux plateaux cartilagineux de part et d’autre. La dégénérescence du disque est caractérisée par une baisse d’hydratation du NP qui devient fibreux et ne joue plus son rôle d’absorbeur de chocs. Les forces exercées par le NP sur l’AF vont le rompre provoquant l’écoulement du NP ce qui génère une hernie discale. De nombreux traitements ont été développés mais ils ne permettent pas de freiner la dégénérescence du disque. Ceci est dû en partie à une méconnaissance de la maladie. La plupart des modèles animaux sont quadrupèdes et ne reproduisent pas les caractéristiques de la pathologie humaine. C’est pourquoi il est essentiel de développer de nouveaux modèles in vitro utilisant des cellules humaines. De plus, des biomatériaux à bases de polymères naturels semblent être les plus adéquats pour le développement de tels modèles car ils sont le support naturel des cellules. Ce projet de thèse a eu pour but de développer un nouveau modèle d’Annulus Fibrosus. Pour cela, deux biopolymères présents dans le tissu natif ont été sélectionnés : l’acide hyaluronique qui apporte l’hydratation au disque et le collagène qui sert de support aux cellules. Dans un premier temps, une encre imprimable reproduisant la matrice extracellulaire de l’AF a été développée. Pour cela, une étude physicochimique a été effectuée sur les interactions collagène I/acide hyaluronique (HA). Lorsqu’ils sont mélangés, ces deux biopolymères forment des complexes poly-ioniques (CPIs) du fait de leurs charges opposées. Ces CPIs précipitent et ne permettent pas d’obtenir une encre homogène. L’inhibition des CPIs est efficace à des pH très acides (pH 1) en présence de sels mais ces conditions sont incompatibles avec la survie cellulaire. En modulant le pH et la force ionique, nous avons découvert une nouvelle méthode pour formuler une encre collagène/HA homogène. En se plaçant proche du point isoélectrique du collagène (pH 5,5) et en présence de NaCl, des fibrilles de collagène se forment en solution. Dans ces conditions, les interactions avec l’HA sont inhibées et les CPIs ne se forment pas. Il est ensuite possible de former des hydrogels de collagène fibrillaire par remontée de pH à 7 et de photo réticuler l’HA pour obtenir des hydrogels avec des propriétés physiques optimisées. Le second objectif était de générer le modèle in vitro d’Annulus Fibrosus. L’AF étant un tissu anisotrope, nous avons procédé à une impression 3D de solutions denses de collagène pour induire son alignement. Deux stratégies ont été adoptées pour cette étude. (i) L’encre précédemment formulée en phase diluée a été utilisée à plus haute concentration (30 mg.mL-1 en collagène, 7,5 mg.mL-1 en HA) avec un ratio collagène/HA de 4 pour 1 comme c’est le cas dans l’AF natif. Cette encre est imprimée en bain de gélification (PBS 2X, NaOH 10-3M) et photo-réticulée sous lumière verte en présence d’éosine Y. (ii) Une seconde encre a été formulée composée de collagène concentré imprimée dans le bain de gélification. Après imprégnation avec l’HA, la photoréticulation a été effectuée. Les deux méthodes ont permis d’obtenir des lamelles d’hydrogels anisotropes avec une structure ressemblant à celle de l’AF et des propriétés rhéologiques intéressantes (G’ = 6kPa). Ces lamelles ont été cellularisées avec des fibroblastes en reproduisant leur environnement natif confiné entre deux couches imprimées. La viabilité cellulaire et la morphologie des cellules étaient similaires à celles observées dans le tissu natif après 14 jours de culture. Si les propriétés mécaniques n’ont pas été atteintes, la bioactivité, la structure et l’anisotropie des matériaux développés lors de cette thèse ont été proches du tissu natif, les validant en tant que modèle 3D de l’Annulus Fibrosus
The intervertebral disc degeneration is an irreversible pathology leading to low back pain. The intervertebral disc is composed of three tissues: the Nucleus Pulposus located in the center, surrounded by the Annulus Fibrosus (AF) and two cartilaginous plates located above and below. Disc degeneration is characterized by a hydration loss of the Nucleus Pulposus (NP), which becomes fibrous and no longer acts as a shock absorber. The forces exerted by the NP on the AF break it, causing the leakage of the NP leading to disc herniation. Several drug and surgical treatments have been developed but none stops or slows down the disc degeneration. This is due to a lack of knowledge of this disease. Most animal models are quadrupedal and do not reproduce the characteristics of the human pathology. This is why it is essential to develop novel in vitro models using human cells. Furthermore, biomaterials based on natural polymers are the most suitable for the development of three-dimensional in vitro models because these biopolymers are the natural support of cells. In order to mimic a complete intervertebral disc, it is essential to reproduce the three parts of this tissue. This thesis project aimed to develop a novel model of Annulus Fibrosus. For this purpose, two biopolymers present in the native tissue were selected: hyaluronic acid which gives hydration to the disc and collagen which is the natural support of cells. The first objective of this thesis was devoted to the formulation of a printable ink to reproduce the AF extracellular matrix. To do this, a physicochemical study was carried out on collagen/hyaluronic acid (HA) interactions. After mixing, these two biopolymers form polyionic complexes (PICs) and precipitate due to their opposite charges. So, a homogeneous ink cannot be obtained. Inhibition of PICs formation is effective at very acidic pH (pH 1) in with salt addition. Nevertheless, these conditions are incompatible with cell survival. By modulating the pH and ionic strength, we discovered a new method to formulate a homogeneous collagen/HA ink. Using a collagen solution close to its isoelectric point (pH 5.5) in presence of NaCl, we triggered the formation of collagen fibrils in solution. Interactions with HA are inhibited in these conditions and PICs are not formed anymore. Then, a fibrillary collagen hydrogel can be formed by raising the pH to 7 and HA can be crosslinked to obtain hydrogels with optimized physical properties. The second objective was to design the in vitro model of Annulus Fibrosus. Since AF is an anisotropic tissue, we 3D printed dense collagen solutions to induce alignment. Indeed, the shearing of dense solutions during printing aligns collagen. Two strategies were tested in this study. (i) The ink previously formulated was used at high concentration (30 mg.mL-1 for collagen, 7.5 mg.mL-1 for HA) with a 4:1 collagen/hyaluronic acid ratio to resemble the native AF. This ink was printed in a gelation bath (2X PBS, 10-3M NaOH) and photocrosslinked under green light (eosin Y used as photo initiator). (ii) A second ink was used, only composed of concentrated collagen and printed in the same gelling bath. Then, an impregnation process with HA was carried out followed by the photocrosslinking with green light. The two methods allowed the production of anisotropic lamellae with structural features resembling those of AF as well as interesting rheological properties (G' = 6kPa). These lamellae were cellularized with fibroblasts confined between two printed layers. Cell viability and morphology were similar to that observed within the native tissue. If the physiological mechanical properties were not reached, biocompatibility, bioactivity, structure and anisotropy of these biomaterials were close to the native tissue, this allows to validate them as a novel 3D model of Annulus Fibrosus

Plastic compression of collagen is based on unidirectional expulsion of fluid from hydrated collagen gel. The process results in dense collagen sheet, with higher density of collagen at the fluid leaving surface (FLS) than non-FLS. Compression process is completely cell-independent and at the same time cell-friendly. However, engineered tissues should replicate not only components of tissues in vivo (extracellular matrix and cells) but also their complex micro-architecture. Therefore the aim of this work was to develop collagen-based scaffolds with controllable micro-architecture for biomedical and tissue engineering applications using plastic compression (PC) of collagen. The objectives of this project were: i. to test formation of progressively opening channels in the PC collagen, ii. to investigate stable and predictable PC collagen patterning, iii. to adapt PC method in a upward-flow system as a route to process automation, iv. to investigate formation of channels using in layered PC collagen constructs. Two approaches were used in this work. Firstly, internal channels were introduced using lost fibre approach, where soluble glass fibres are incorporated in the scaffold and leave channel when dissolved. Shape and potentially progression of the channels’ opening is controlled by the shape of the template. The shape of the fibres was altered from cylindrical to conical in a controlled manner and incorporated into the PC constructs, resulting in conically-shaped channels, giving predictable internal 3D structures. The second approach relied on formation of dense collagen zone at the fluid leaving surface of the compressed collagen constructs. Formation of the densely packed collagen zone at the fluid leaving surface is essential for stable and faithful pattern formation in the process of micro-moulding. This finding has been applied in a novel upward-flow compression system to create channels using a ‘roofing’ technique. ‘Roof’ is formed by a compression of a new collagen gel on top of a patterned one; process results in open lumen channels. This appears to be due to a combination of the small dimension of the grooves in the base layer and viscosity of the collagen in the upper layer. This work demonstrates a new, previously unknown level of subtlety by which collagen fibrils can be packed and aggregated due to directional fluid flow. The outcome of this work is important for understanding pattern formation in PC collagen in vitro and potentially tissue morphogenesis in vivo. It also introduces new generation of implantable living tissue equivalents with complex micro-architecture. The multi-well compression technique has already been implemented in semi-automative working station for biomedical applications.

L'objectif de ce travail consiste en l'étude in vitro des phénomènes d'autoassemblage des molécules de collagène de type I en phases denses. Dans un premier temps nous nous sommes consacrés à l'étude de solutions colloïdales de collagène solubilisé en milieu acide. Nous avons étudié la transition isotrope/cholestérique ainsi que la structure de la phase cristal-liquide obtenue à l'aide de la microscopie optique à lumière polarisée et de la diffusion des rayons X aux petits angles. De plus, nous avons décrit les propriétés rhéologiques de ces solutions à l'aide d'expériences en régime oscillant en géométrie cône-plan. Ensuite, nous avons cherché à déterminer l'influence de quelques paramètres physicochimiques simples sur la formation de gels fibrillaires à partir des solutions acides (la « fibrillogenèse »). Ces gels ont été caractérisés par diffusion des rayons X et microscopie électronique à transmission sur coupes ultrafines. Enfin, nous présentons quelques expériences de minéralisation de ces matrices fibrillaires ordonnées ; nous y montrons comment nous avons réussi à obtenir une phase minérale coalignée avec la phase organique. Ce travail s'inscrit dans un contexte plus large de compréhension de la morphogenèse tissulaire et de la synthèse de biomatériaux ordonnés.

Intake of dietary sources of collagen may support the synthesis of collagen in varying tissues, with the availability of key amino acids being a likely contributor to its effectiveness. This study analyzed commonly consumed preparations of bone broth (BB) to assess the amount and consistency of its amino acid content. Commercial and laboratory prepared samples, made with standardized and variable (non-standardized) protocols were analyzed for key amino acids (glycine, lysine, proline, leucine, hydroxyproline and hydroxylysine). The main finding of the study was that amino acid concentrations in BB made to a standardized recipe were significantly lower for hydroxyproline, glycine, proline; P = 0.003 and hydroxylysine, leucine and lysine; P = 0.004 than those provided by a potentially therapeutic dose (20 g) of reference collagen supplements (P > 0.05). There was large variability in the amino acid content of BB made to non-standardized recipes, with the highest levels of all amino acids found within the café prepared varieties. For standardized preparations, commercial BB were lower in all amino acids than the self-prepared varieties. There were no differences (P > 0.05) in the amino acid content of different batches of BB when prepared according to a standardized recipe. If the intake of collagen precursors is proven to support the synthesis of new collagen in vivo, it’s unlikely that bone broth can provide a consistently reliable source of key amino acids. Focus on the provision of key amino acids from dietary sources should continue to focus on the standard sources currently being researched.

La région cranio-faciale est particulièrement vulnérable aux pertes de structures. Sa localisation et sa visibilité font qu'une atteinte entraîne des troubles, aussi bien physiques (alimentation, phonation...) que psychologiques (intégrité de la personne...). Les traitements actuels (régénération osseuse guidée, autogreffe osseuse ou allogreffe) sont particulièrement invasifs et présentent un taux d'échec élevé. Tout cela affecte fortement la qualité de vie du patient. De plus, le coût direct de ces traitements est important pour les systèmes de santé et le patient. Il existe donc un réel besoin de développer des traitements innovants basés sur des approches biomimétiques d'ingénierie tissulaire pour la régénération/réparation osseuse. L'objectif de ce travail est de développer une approche d'ingénierie tissulaire pour la réparation/régénération de tissus osseux cranio-faciaux lésés. Il est basé sur l'utilisation de matrices cellularisées avec des cellules souches mésenchymateuses issues de la pulpe dentaire : les Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). De nombreux travaux ont démontré la grande plasticité de ces cellules, qui dérivent initialement de la crête neurale, mais aussi leur rôle trophique dans la réparation de tissus lésés par leur capacité de différenciation ostéogénique et chondrocytaire. Par ailleurs, ces cellules présentent des propriétés pro-angiogéniques supérieures aux cellules mésenchymateuses de la moelle osseuse (MSCs) et l'accès à cette réserve est aisé puisqu'elles peuvent être obtenues à partir de dents extraites. Dans ce contexte, nous avons à ce jour utilisé des matrices denses de collagène contenant des cellules souches pulpaires pour régénérer un tissu osseux crânien après réalisation de défauts critiques. L'objectif est d'induire très précocement une néo-angiogenèse favorisant à court terme la survie des cellules implantées, puis de stimuler leur maintien à long terme au sein du néo-tissu implanté, pour enfin provoquer une ostéoformation. Nous avons, ainsi, pu étudier et valider différents aspects de cette thématique : .1 L'impact positif de l'utilisation de matrices denses de collagène comme support ostéoconducteur, .2 Le suivi à long terme des cellules après implantation in vivo .3 L'impact positif d'un pré-traitement à l'hypoxie sur i/ la survie des cellules après implantation in vivo ii/ la potentialisation de leur apport pour la régénération/réparation osseuse en orientant leur différenciation vers une voie ostéoblastique, .4 L'apport significatif des techniques d'imageries pour le suivi des animaux grâce à la tomographie par émission de positons (utilisation de traceurs spécifiques de la minéralisation au sein des matrices et de la néo-angiogenèse) et au microscanner à rayons X (suivi cinétique de la qualité et de la quantité de matrice osseuse régénérée), .5 La validation et la confirmation de l'ensemble de ces résultats par l'histologie. Ainsi, ces résultats nous ont permis de répondre à l'objectif de travail et de perfectionner certains aspects de la composante cellulaire. Toutefois, il reste nécessaire d'optimiser le biomatériau lui-même. Il est en effet envisageable d'améliorer les matrices de collagène compressées que nous utilisons actuellement, en y intégrant par exemple des céramiques bioactives. En perspective, potentialiser les biomatériaux des matrices et combiner les DPSCs avec un support plus adapté à leur survie et à leur croissance permettrait d'améliorer considérablement la cicatrisation osseuse. Ces dernières années, l'étude des cellules souches a progressé d'approche in vitro vers l'in vivo. Les modèles in vivo établis pour étudier ces cellules dans le domaine cranio-facial ont déjà apporté des renseignements et ce travail s'inscrit dans leur continuité en cherchant à concevoir des stratégies adaptées pour l'utilisation future des DPSCs en ingénierie tissulaire
The craniofacial area is particularly vulnerable to structural loss. Its location and visibility make a loss causes disorders, both physical (food, phonation...) than psychological (integrity of the person...). Current treatments (autografts, allografts or synthetic bone grafts) are particularly invasive and have a high failure rate. All this strongly affects the quality of life of the patient. In addition, the cost of these treatments is significant for the health systems and the patient. Therefore, there is a real need to develop innovative treatments based on biomimetic tissue approaches for bone repair. The purpose of this thesis is to develop a tissue engineering approach for the repair/regeneration of injured cranial-facial bone tissue. It is based on the use of cellularized scaffolds with mesenchymal stem cells derived from the dental pulp: Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). Many studies have demonstrated the high plasticity of these cells, which initially derive from the neural crest, but also their trophic ability in the repair of damaged tissues by their osteogenic and chondrocyte differentiation capacity. Moreover, these cells have better's pro-angiogenic properties than mesenchymal cells of the bone marrow (MSCs) and access to this reserve is easy since they can be obtained from extracted teeth. In this context, we have used dense collagen scaffolds seeded with DPSCs to regenerate cranial bone tissue on critical defects model. The objective is to induce a very early neo-angiogenesis for improved short-term survival of implanted cells, then stimulate the long-term maintenance of cells in the implanted neo-tissue, finally to cause osteoformation. We were able to study and validate various aspects of this theme: 1- The positive impact of the use of dense collagen scaffold as osteoconductive support, 2- Long-term follow-up of the cells after implantation in vivo (thanks to the use of a cell line constitutively expressing an intracellular fluorescence protein), 3- The positive impact of a pre-treatment with hypoxia on i/ the survival of the cells after implantation in vivo ii/ their contribution to bone regeneration / repair by orienting their differentiation towards an osteoblastic pathway, 4- The significant contribution of imaging techniques for the monitoring of animals (less sacrifice and longitudinal follow-up...) thanks to positron emission tomography (use of specific tracers of the mineralization within the scaffolds and neo-angiogenesis) and X-ray microscanner (kinetic monitoring of the quality and quantity of regenerated bone matrix) 5- Validation and confirmation of all these results by histology. Thus, these different results allowed us to respond to the working hypothesis and optimize some aspects of the cellular component. However, it remains necessary to optimize the biomaterial itself. It is indeed possible to improve the compressed collagen scaffolds that we currently use, for example by incorporating bioactive ceramics such as bioglasses or hydroxyapatite. In recent years, the study of stem cells has progressed from in vitro to in vivo. The in vivo models established to study these cells in the craniofacial area have already provided valuable information and this work is a continuation of these previous studies by seeking to build on better strategies (right characterization, environment oriented...) for the future use of DPSCs for tissue engineering purposes. In view of this work, potentiating the biomaterials of the scaffolds and combining the DPSCs with a support more adapted to their survival and their growth would considerably improve bone healing, as well as bone regeneration / repair

Bone tissue engineering (BTE) has emerged as a promising solution to heal the millions of people worldwide that suffer from bone degenerative pathologies and bone fractures. Since bone is a biocomposite of type I collagen nanofibres (namely osteoid) reinforced with nanocrystals of carbonated hydroxylapatite (CHA), reconstituted type I collagen gels are an attractive choice as scaffolds for BTE. However, to date, the design of a collagenous bone-like construct ready to be implanted is far from being accomplished, as collagen matrices are difficult to mineralize. The aim of this doctoral research was to design and evaluate strategies to rapidly achieve an acellular mineralization of an osteoid-like dense collagen gel for potential applications in bone regeneration. It was hypothesized that the collagen fibrillar density (CFD) affects the microenvironment and the physical properties of the framework of collagen gels. To test this hypothesis, and as a first objective, the mineralization of collagen gel with increasing CFDs was investigated in simulated body fluid (SBF). Collagen gels with physiologically relevant CFDs led to greater extent of mineralization, when compared to highly hydrated gels. It was therefore proposed that the increase in gel CFD led to a more physiological microenvironment, which facilitated the mineral formation and validated the proposed osteoid model. As a second objective, the mineralization of dense collagen (DC) gels was enhanced and accelerated by mimicking the role of anionic non collagenous proteins (NCPs) in the native osteoid, which act as CHA nucleators. Two strategies were implemented: first, the influence of collagen fibrillization pH on the extent of DC gel mineralization was investigated. Since the collagen molecule is slightly positively charged at physiological pH, it was hypothesized that it would be more negatively charged if formed in an alkaline environment, i.e., above its isoelectric point. This hypothesis was validated by investigating the electrostatic properties of collagen gels formed at physiological pH (7.4) and at pH values of 8.2 and 9.0. The effect of alkaline fibrillization pH on DC gel mineralization was evident by the extensive mineralization and the soft to hard transition of the gels by day 14 in SBF. Second, anionic fibroin derived polypeptides (Cs) were introduced, for the first time as easily produced alternatives to NCPs. Apatite was formed within 6 hours in SBF and by day 7, CHA crystals were homogenously distributed throughout the roll gels resulting also in a transition from soft-to-hard tissue-like response to compressive testing. As a third objective, a bioinorganic approach to enhance and accelerate the mineralization of collagen was developed. DC gels were combined with silica-based 45S5 bioactive glass of micron- and nano-sized particles (μBG and nBG, respectively) to investigate the effect of an osteoconductive and osteoinductive bioactive glass on collagen mineralization. DC-μBG gels conditioned in SBF resulted in the extensive mineralization of the collagenous framework. Furthermore, the effect of nBG on the mineralization of DC and its effect on seeded pre-osteoblastic cells, were also investigated. Compared to μBG, nBG particles resulted in an enhanced and accelerated mineralization of the collagen matrix when immersed in SBF. Apatite formation was immediately detected within as processed DC-nGB hybrid gels, and by day 7 there was a 13 fold increase in the hybrid gel scaffold compressive modulus. The metabolic activity of MC3T3-E1 cells was affected by the presence of nBG, indicating accelerated osteogenic differentiation in the absence of osteogenic supplements, suggesting the potential of DC-nBG scaffolds to be used as cell-seeded constructs. In conclusion, since the role of the collagen framework microstructure on its mineralization has been previously ignored, the present doctoral dissertation provides new insights into collagen mineralization.
Des millions de personnes dans le monde souffrent de maladies osseuses. Les techniques chirurgicales actuelles font appel à l'autogreffe, à l'allogreffe, à la xénogreffe et à la greffe de matériaux artificiels. Cependant, comme ces interventions comportent plusieurs inconvénients, l'ingénierie tissulaire de l'os (ITO) est apparue comme une solution prometteuse. Comme l'os est un biocomposite constitué de nanofibres de collagène de type I renforcées de nanocristaux d'hydroxylapatite carbonatée (HAC), les gels de collagène de type I représentent un choix attrayant pour la production de ces matrices. Toutefois, la minéralisation in vivo de ces matrices de collagène est difficile et la minéralisation in vitro n'est obtenue qu'après avoir soustrait les matrices des contraintes physiologiques, ce qui limite leur utilisation.Ces travaux s'appuyaient sur l'hypothèse selon laquelle la densité en fibrine du collagène (DFC) influe sur le microenvironnement et les propriétés physiques de la charpente de gels de collagène. Afin de vérifier cette hypothèse, et d'atteindre l'objectif premier de l'essai, la minéralisation de gel de collagène d'une DFC croissante a été réalisée dans du liquide organique simulé (LOS). Les gels de collagène d'une DFC physiologique ont permis d'obtenir une plus grande minéralisation et a aussi influé sur les propriétés électrostatiques des gels. Cette découverte suggère donc que l'augmentation de la DF du gel de collagène a permis de créer un microenvironnement plus physiologique, ce qui a facilité la formation minérale et a permis de valider le modèle proposé. Comme deuxième objectif, la minéralisation de gels de collagène dense a été améliorée et accélérée en reproduisant le rôle des protéines anioniques (PANC) au sein des ostéoïdes indigènes. Deux stratégies ont été mises en œuvre : étude de l'influence du pH des fibrines du collagène et de polypeptides anioniques dérivés de la fibroïne. Premièrement, la charge de la molécule de collagène étant légèrement positive dans un milieu doté d'un pH physiologique l'hypothèse est que un milieu dont le pH se situe au-dessus de son point isoélectrique, a été posée et validée. L'effet du pH alcalin durant la formation de fibrines sur la minéralisation du gel de collagène dense a été constaté par la quantité d'HAC formée; la matrice s'était largement minéralisée au jour 3. De plus, la minéralisation a significativement augmenté le module apparents des gels, rendant les structures autoportantes. Deuxièmement, la minéralisation de gels de collagène dense additionnés de 10 % poids de polypeptides anioniques dérivés de la fibroïne a été évaluée dans du LOS. De l'apatite s'était formée dans les 6 heures et des cristaux d'HAC étaient distribués de façon homogène dans les rouleaux de gels au jour 3.Le troisième objectif a été la mise au point d'une approche bio-inorganique en vue d'améliorer et d'accélérer la minéralisation du collagène. Des gels de collagène dense ont été additionnés de micro- et de nanoparticules de verre bioactif (μBG et nBG, respectivement) 45S5 à base de silice. Les gels de collagène dense additionnés de μBG préparés dans un LOS ont produit une importante minéralisation de la matrice de collagène. De plus, l'effet des nBG sur la minéralisation du collagène dense et son effet sur des cellules préostéoblastiques ensemencées ont aussi été étudiés. La formation d'apatite a immédiatement été détectée par la présence de gels hybrides de collagène dense contenant des nBG. Au jour 7, le module à la compression de la construction de gel hybride était 13 fois plus élevé. De plus, l'activité métabolique des MC3T3 cellules a été altérée par la présence des nBG, indiquant une différenciation ostéogénique accélérée en l'absence de suppléments ostéogéniques.En conclusion, le rôle des matrices de collagène à microstructures dans la minéralisation ayant été ignoré jusqu'ici, la présente dissertation doctorale jette un nouvel éclairage sur la minéralisation du collagène.

L'os, tissu conjonctif minéralisé, assure les fonctions de protection, de support et de motilité. De nombreuses pathologies osseuses requièrent l'utilisation d'implants naturels ou synthétiques et le vieillissement de la population accroît cette demande. La thèse a eu pour objet d'évaluer les potentiels de reconstruction osseuse de matériaux préparés à partir de solutions de collagène de concentration moyenne (5mg/mL) et haute (40mg/mL). Ces matériaux fibrillaires, simple à façonner, ont été caractérisés par microscopie photonique et électronique et comparés aux éponges de collagène déjà utilisées en thérapeutique. En culture in vitro à long terme, des ostéoblastes humains, primaires ou transformés, se multiplient et s'organisent en une monocouche épithélioïde sur les matrices à 5mg/mL, ou en cellules plates et allongées sur les matrices à 40mg/mL. La minéralisation des matrices, en conditions standard, n'a lieu qu'en présence d'ostéoblastes tandis que les éponges minéralisent de façon spontanée. Dans un défaut crânien engendré chez le rat, les matrices ont permit son comblement à plus de 80%. Elles sont colonisées par les ostéoprogéniteurs qui se différencient et synthétisent de l'os minéralisé ; leur concentration module leur dégradation. En contact en 3D avec le réseau fibrillaire les otéoblastes primaires apparaissent dendritiques et s'organisent en syncytium, reliés par des jonctions communicantes. Cette transition morphologique est décrite in vitro par une approche combinée de microscopies. Ces travaux valident l'utilité des matrices fibrillaires de collagène pour l'ingénierie de l'os. Ils confirment également l'intérêt que peut tirer la recherche fondamentale de disposer de matrices extracellulaires modèles.

Success of osteochondral tissue engineering (TE) requires stratified scaffolds that mimic the biophysicochemical composition of the cellular environment of both the cartilage and subchondral bone. In vitro reconstituted collagen type I (Coll) hydrogels are widely used as biomimetic scaffolds for TE, however due to their highly-hydrated nature they collapse due to gravitational forces (self-compression; SC). Plastic compression (PC) is a method that rapidly enables the generation of dense scaffolds with solid weight percent approaching native tissues values.The aim of this doctoral research was to develop and characterize a bilayered model system for osteochondral TE applications based on the incorporation of a GAG-analog (i.e. chitosan; CTS), within a dense Coll hydrogel, to closely mimic the native extracellular matrix (ECM) of the osteochondral interface. The first objective was to develop and optimize a co-gelling system for the generation of highly-hydrated Coll/CTS hybrid gels with different CTS proportions. PC was shown to be an effective and rapid process able to generate, within minutes, dense Coll/CTS hybrid gels with increased solid weight percent, compressive modulus and resistance to enzymatic degradation, as dictated by CTS content. As a second objective, the effect of CTS incorporation on modulating MC3T3-E1 pre-osteoblast seeded-cell function within dense Coll gels was investigated. Dense Coll/CTS hydrogels supported MC3T3-E1 cell viability, proliferation, and differentiation under osteogenic-inducing conditions. These findings demonstrated that dense Coll/CTS hybrids provide an osteoid-like structure as an in vitro model for bone TE.As a third objective, the effect of CTS incorporation into dense Coll gel discs was investigated to support RCJ3.1C5.18 chondroprogenitors (RCJ) differentiation. Immunohistochemistry for collagen type II, in combination with Safranin O staining and GAG quantification, indicated greater chondroprogenitor differentiation within Coll/CTS scaffolds, compared to Coll alone. The results demonstrated the suitability of dense Coll/CTS scaffolds to be used as in vitro models for cartilage repair. The fourth objective was to develop a bilayered dense Coll/CTS hydrogel with ratios approaching those of Coll/GAGs found in the ECM at the osteochondral interface. In addition, the optimization of the co-culturing conditions to maintain the simultaneous chondro- and osteogenesis was investigated. The results demonstrated the potential of bilayered dense Coll/CTS hydrogels to be used as effective in vitro osteochondral models. As the fifth objective, CTS effect on Coll gel consolidation was investigated by monitoring the spatiotemporal distribution of fluorescent beads using confocal microscopy during Coll/CTS hydrogels consolidation. The Happel model was used to predict the hydraulic permeability of the hydrogels. In addition, the effect of CTS fixed charge on Coll hydrogels was investigated through structural, mechanical and swelling characterizations under isotonic and hypertonic conditions. The results indicate the ability of a charged GAG-analog to tailor the biophysicochemical properties of Coll hydrogels, thus providing a reliable 3D in vitro tissue model for various TE applications. In conclusion, the integrated bilayered dense Coll/CTS construct developed and characterized in this doctoral research effectively provided a tailored in vitro cell culture milieu that closely mimics a complex physiologic ECM to be used as a three-dimensional model and with the potential for clinical use as a biomimetic implant with osteochondral regenerative capacity.
Le succès de régénération du tissu ostéochondral requiert le développement des matrices stratifiées afin d'imiter la composition biophysiquechimiques du cartilage et l'os sous-chondral. Les hydrogels de collagène de type I (Coll) reconstitués in vitro sont grandement utilisés en tant que matrices biomimétiques pour le génie tissulaire (GT). En raison de leur nature hautement hydratée s'affaissent à cause des forces gravitationnelles (auto-compression; SC). La compression plastique (CP) est un procédé rapide qui génère des matrices denses avec un pourcentage massique de solide que se rapprochant du taux de solide des tissus naturels. Cette recherche de doctorat a pour but de développer et caractériser un modèle à deux couches pour des applications en GT ostéochondral basés sur l'incorporation de GAGs analogiques (i.e. chitosan; CTS) dans un hydrogel Coll dense afin de reproduire de près la matrice extra-cellulaire (MEC) naturelle de l'interface ostéochondrale. Le premier objectif était de développer et d'optimiser un système co-gélifiant pour la génération de gels hybrides de Coll/CTS hautement hydraté avec diverses proportions de CTS. In a été démontré que la CP est un procédé rapide capable de générer des gels hybrides de Coll/CTS dense avec un taux de solide accru, un module de compression et une résistance à la dégradation enzimatique, le tout dicté par la teneur en CTS.Comme second objectif l'effet de l'incorporation de CTS sur la modulation de la fonction de cellules ensemencées pré-ostéoblastes MC3T3-E1 à l'intérieur de gels Coll denses a été étudié. Les hydrogels de Coll/CTS dense ont permis la viabilité et la prolifération de cellules ainsi que leur différentiation dans des conditions ostéogéniques. Ces résultats démontrent que les hybrides de Coll/CTS denses sont une approche pour l'assemblage de structures de type ostéoïdes en tant que modèle in vitro pour GT. En tant que troisième objectif l'effet de l'incorporation de CTS à des disques de gel Coll dense afin de supporter la différentiation de chondro-progéniteurs RCJ3.1C5.18 (RCJ) a été étudié. L'immunohistochimie du colagène de type II, combiné avec la coloration avec du Safranin O et la quantification des GAGs, ont indiqué que la différentiation des chondro-progéniteurs est meilleures avec les matrices de Coll/CTS. Les résultats ont démontré la pertinence de les hybrides de Coll/CTS denses pour être utilisé comme modèles in vitro pour la réparation du cartilageLe quatrième objectif était de développer une structure à deux couches d'hydrogel de Coll/CTS denses avec des ratios se rapprochant celui de Coll/GAGs se retrouvant dans l'interface ostéochondrale. De plus l'optimisation des conditions de co-culture permettant de supportent les réactions concurrentes de chondrogénèse et d'ostéogénèse. Les résultats démontrent la possibilité d'utiliser les hydrogels de Coll/CTS denses à deux couches en tant que modèles ostéochondraux in vitro. En tant que cinquièmes objectif l'effet des CTS sur la consolidation du gel de colagène a été étudié en surveillant la distribution spatiotemporelle de billes fluorescentes par microscopie confocale. Le modèle de Happel a été utilisé afin de prédire la perméabilité hydraulique des hydrogels. Aussi l'effet de la charge fixe des CTS sur les hydrogels Coll/CTS a été étudié par leur caractérisation structurelle, mécanique et de gonflement dans des conditions isotoniques et hypertoniques. Les résultats ont indiqué la capacité d'un analogue de GAG chargé à s'adapter aux propriétés biophysicochimiques des hydrogels Coll, offrant un modèle de tissus in vitro pour diverses applications de GT. En conclusion la structure à deux couches de Coll/CTS dense développée et caractérisée dans le cadre de ce doctorat a procuré un milieu de culture de cellules in vitro reproduisant la MEC complexe. Cette structure pourrait potentiellement être utilisé cliniquement en tant qu'implant biomimétique avec des capacités régénératrices ostéochondrales.

Among various natural biopolymers, type I collagen gels have demonstrated the highest potential as biomimetic scaffolds for tissue engineering (TE). However, the successful application of collagen gels requires a greater understanding of the relationship between their microstructure and physical-mechanical properties. Therefore, a precise method to modulate collagen gel microstructure in order to attain optimal scaffold properties for diverse biomedical applications is necessary. This dissertation describes a new approach to produce collagen gels with defined microstructures, quantified by hydraulic permeability (k), in order to optimize scaffold properties for TE applications. It was hypothesized that the measurement of k can be used to study the role of microstructure in collagen gel properties, as well as cell function and cell-scaffold interactions. Applying increasing levels of plastic compression (PC) to the highly hydrated collagen gels resulted in an increase in collagen fibrillar density, reduced Happel model derived k values, increased gel stiffness, promoted MSC metabolic activity, osteogenic differentiation, and mineral deposition, while cell-induced gel contraction diminished. Thus, collagen gels with lower k and higher stiffness values exhibited greater potential for bone tissue engineering.Correlating between collagen gel microstructure, k, and fibroblast function within collagen gels indicated that increasing the level of PC yielded a reduction in pore size and an increase in fibril bundle diameter. Decrease in k values resulted in a decrease in gel contraction and an increase in cell metabolic activity. An increase in cell density accelerated contraction. Therefore, fibroblast function within collagen gels can be optimised by a balance between the microstructure, k, and cell seeding density.Developing a micromechanical model to measure experimental k of collagen gels during confined compression revealed the formation of a dense collagen lamella at the fluid expulsion boundary, thereby generating a two-layer model. By applying gel mass loss into Darcy's law, experimental k values of the lamella, along with the thickness of lamella (c) and hydrated gel layer (b) were measured. An increase in either compression level or compression time resulted in a decrease in k, decrease in b, and an increase in c. In conclusion, controlled compression of collagen gels can be used to produce multi-layered biomimetic scaffolds with defined microstructures and k in order to attain optimal properties for tissue engineering applications.
Parmi les biopolymères naturels couramment utilisés, les gels de collagène de type I se sont révélés être parmi les matrices biomimétiques les plus prometteuses pour l'ingénierie tissulaire. Cependant, le succès des applications thérapeutiques des matrices collagéniques nécessite une meilleure compréhension de la relation entre leur microstructure et leurs propriétés mécaniques. C'est pourquoi une méthode précise permettant de moduler la microstructure du gel de collagène est nécessaire pour pouvoir espérer atteindre les propriétés optimales de la matrice pour des applications médicales diverses. Cette thèse de doctorat décrit le développement et l'évaluation d'une nouvelle approche pour produire des gels de collagène avec une microstructure définie. Cette méthode permet de quantifier la perméabilité hydraulique (k) afin d'optimiser les propriétés de la matrice pour des applications en ingénierie tissulaire. Il a émis l'hypothèse que la mesure de k peut être utilisée pour étudier le rôle de la microstructure dans les propriétés du gel de collagène ainsi que la fonction cellulaire et les interactions matrice-cellules a été formulée.Appliquant des différents niveaux de compression plastique (PC) à des gels de collagène a entraîné une augmentation de la densité de fibrillaire, réduit les valeurs de k dérivées du modèle de Happel, augmentation de la rigidité du gel, stimulé l'activité métabolique des MSC, la différenciation ostéogénique et le dépôt de minéral, alors que la contraction du gel induite par les cellules a été réduite. Ainsi, les gels de collagène qui présentent une valeur de k plus faible et des valeurs de rigidité plus élevées ont présenté un potentiel plus élevé pour des applications en ingénierie tissulaire osseuse. Corréler la microstructure du gel de collagène, la perméabilité, et la fonction des fibroblastes cultivés dans des gels de collagène a indiqué que l'augmentation du niveau de PC résultait en la diminution de la taille des pores et une augmentation du diamètre des faisceaux de fibres. Diminution des valeurs de k résultait en une diminution de la contraction du gel et une augmentation de l'activité cellulaire métabolique. C'est pourquoi la fonction des fibroblastes, cultivés à l'intérieur de matrices de collagène, peut être optimisée en réalisant une balance entre les propriétés de microstructure, définie par k et par la densité cellulaire.Développement d'un modèle micromécanique pour mesurer la valeur expérimentale de k des gels de collagène pendant l'auto-compression radiaire confinée (SC) a révélé la formation d'une lamelle de collagène dense à la limite de l'expulsion de fluide, générant ainsi un model à deux couches. En appliquant la perte de masse de gel à la loi de Darcy, les valeurs expérimentales de k de la lamelle, ainsi que l'épaisseur de la lamelle (c) et hydratée couche de gel (b) ont été mesurés. Une augmentation soit au niveau de compression ou de temps de compression résultait en une diminution de k, diminution de b, et une augmentation de c.En conclusion, la compression contrôlée des gels hydratés de collagène peut être utilisée afin de produire des matrices multicouches biomimétiques présentant une microstructure définie et des valeurs de perméabilité permettant d'atteindre des propriétés optimales pour des applications en ingénierie tissulaire.

Among various natural biopolymers, type I collagen gels have demonstrated the highest potential as biomimetic scaffolds for tissue engineering (TE). However, the successful application of collagen gels requires a greater understanding of the relationship between their microstructure and physical-mechanical properties. Therefore, a precise method to modulate collagen gel microstructure in order to attain optimal scaffold properties for diverse biomedical applications is necessary. This dissertation describes a new approach to produce collagen gels with defined microstructures, quantified by hydraulic permeability ( k), in order to optimize scaffold properties for TE applications. It was hypothesized that the measurement of k can be used to study the role of microstructure in collagen gel properties, as well as cell function and cell-scaffold interactions. Applying increasing levels of plastic compression (PC) to the highly hydrated collagen gels resulted in an increase in collagen fibrillar density, reduced Happel model derived k values, increased gel stiffness, promoted MSC metabolic activity, osteogenic differentiation, and mineral deposition, while cell-induced gel contraction diminished. Thus, collagen gels with lower k and higher stiffness values exhibited greater potential for bone tissue engineering.
Correlating between collagen gel microstructure, k, and fibroblast function within collagen gels indicated that increasing the level of PC yielded a reduction in pore size and an increase in fibril bundle diameter. Decrease in k values resulted in a decrease in gel contraction and an increase in cell metabolic activity. An increase in cell density accelerated contraction. Therefore, fibroblast function within collagen gels can be optimised by a balance between the microstructure, k, and cell seeding density.
Developing a micromechanical model to measure experimental k of collagen gels during confined compression revealed the formation of a dense collagen lamella at the fluid expulsion boundary, thereby generating a two-layer model. By applying gel mass loss into Darcy's law, experimental k values of the lamella, along with the thickness of lamella (c) and hydrated gel layer (b) were measured. An increase in either compression level or compression time resulted in a decrease in k, decrease in b, and an increase in c. In conclusion, controlled compression of collagen gels can be used to produce multi-layered biomimetic scaffolds with defined microstructures and k in order to attain optimal properties for tissue engineering applications.

This arts-informed inquiry is grounded in the lived experiences of five self-proclaimed artists including the researcher, who have turned to careers in teaching at varying stages of their lives. The stories of their transitions and evolving identities as both artists and teachers provide the investigative focus for this study. Although this research is relevant to teachers more generally, it specifically focuses on those who have chosen to teach Visual Arts. Particularly suited to a postmodern, arts-informed inquiry, the diverse forms of knowing that create our everyday experiences are acknowledged. The researcher became the bricoleur who collaged the individual stories of the first year artist-teachers into an integrated work of art. This constructivist approach included the use of visual imagery to transcend linguistic description. Through artworks, photographs, a self-narrative and novelette, the multiple ways these early career Visual Arts teachers came to understand themselves and their journeys are explored. This study has the potential to inform novice teachers of the transitions they may experience as they enter the teaching profession. Possible challenges, including the recognition that idealised beliefs might be traded in for more realistic representations, are discussed along with the notions of teaching as an art and the concept of resilience.

Doctor of Philosophy
This arts-informed inquiry is grounded in the lived experiences of five self-proclaimed artists including the researcher, who have turned to careers in teaching at varying stages of their lives. The stories of their transitions and evolving identities as both artists and teachers provide the investigative focus for this study. Although this research is relevant to teachers more generally, it specifically focuses on those who have chosen to teach Visual Arts. Particularly suited to a postmodern, arts-informed inquiry, the diverse forms of knowing that create our everyday experiences are acknowledged. The researcher became the bricoleur who collaged the individual stories of the first year artist-teachers into an integrated work of art. This constructivist approach included the use of visual imagery to transcend linguistic description. Through artworks, photographs, a self-narrative and novelette, the multiple ways these early career Visual Arts teachers came to understand themselves and their journeys are explored. This study has the potential to inform novice teachers of the transitions they may experience as they enter the teaching profession. Possible challenges, including the recognition that idealised beliefs might be traded in for more realistic representations, are discussed along with the notions of teaching as an art and the concept of resilience.

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A mensuração da degradação de colágeno radicular é um importante parâmetro para avaliar a progressão de cáries na dentina ou a eficácia de métodos terapêuticos na prevenção de lesões não cariosas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a degradação do colágeno da dentina radicular frente a métodos de prevenção de cárie, utilizando o teste da Hidroxiprolina e a microradiografia. Foram obtidos 40 blocos de dentina radicular com aproximadamente 1,5 mm de profundidade x 6 mm de diâmetro, a partir de incisivos bovinos, os quais foram submetidos ao processo de desmineralização artificial em tampão acetato (pH=5), a fim de induzir a formação de uma lesão cariosa. Em seguida as amostras foram submetidas aos tratamentos preventivos de cárie radicular: 1) Clorexidina 0,12% 1 min, 2) Flúor neutro 2% 1 min, 3) Nd: YAG Laser- 60 mJ 10 s e 4) Água Deionizada (controle) 1 min. Após os tratamentos as amostras foram expostas à degradação pela enzima colagenase (Tipo VII, Produto No. C0773, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) por um período de 5 dias. Ao final do desafio da colagenase, a solução contendo a enzima foi coletada para ser submetida ao teste da hidroxiprolina, para a mensuração da quantidade de colágeno degradado por meio de colorimetria em espectrofotômetro. Em seguida as mesmas amostras foram submetidas à mais 2 dias de desmineralização. Em complemento ao ensaio da hidroxiprolina as amostras foram expostas à microradiografia transversal para visualização e medição da área degradada. Uma análise descritiva dos dados obtidos foi realizada de modo a determinar o teste estatístico a ser aplicado. A análise de variância (ANOVA) para a HYP revelou que não houve diferença estatisticamente significativa entre os tratamentos empregados (p>0,05). Os dados obtidos na microradiografia foram submetidos ao teste de Kruskal Wallis e teste de comparações múltiplas, Dunn. Os dados de reptetição, comparações entre a desmineralização inicial (5 dias) e a segunda desmineralização (2 dias), foi realizado individulamente em cada grupo por teste T de medidas repetidas ou Wilcoxon. Houve diferença significativa entre os grupos (p<0,0001). Dos tratamentos empregados, a clorexidina e o flúor foram eficazes na prevenção da progressão da cárie radicular.
Quantification of collagen degradation is an important parameter to evaluate dentin caries progression of caries prevention aid. The aim of this study was to evaluate root collagen degradation against preventive methods by using the hydroxyproline assay and microradiography technique. Forty root dentin blocks were obtained with 1,5x6 mm (depth x diameter) from bovine incisors, which were submitted to artificial demineralization process by acetate buffer (PH=5), in order to induce a carious lesion. Then, the samples were submitted to preventive therapeutic treatment of root caries: 1) Chlorhexidine 0,12% 1 min, 2) Fluoride 2% 1 min, 3) Nd:YAG Laser - 60 mJ 10s, 4) Deionized Water (control) 1 min. After that, the samples were exposed to degradation by the collagenase enzyme (Type VII, Product No. C0773, Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) for 5 days. Following the collagenase challenge, the enzyme solution was collected for assaying hydroxyproline released from collgen matrix, where it is possilble to measure the amount of degraded collagen by colorimetry in a spectrophotometer. Soon after, the same samples were submitted to a further 2 days of demineralization process. In addition to the hydroxyproline assay the samples were exposed to the transverse microradiography for a visualization of the degraded area. Soon after the colorimetric test the same samples were submitted to further two days of demineralization. A descriptive analysis of the data will be performed to determine the statistical test to be applied. ANOVA test revealed that there was no difference between the treatments (p>0,05). The microradiography data were submitted to the Kruskal Wallis test and multiple comparison test, Dunn. The repetition data, comparisons between the initial (5 days) and the second (2 days) demineralization, were performed individually in each group by repeated measures T-test or Wilcoxon (p<0,0001). Among the proposed treatments, chlorhexidine and fluoride were effective in preventing root caries progression.

The skin provides protection and maintains homeostasis, making it essential for survival. Additionally, skin has the impressive ability to grow, as observed in children as they grow into adults. However, skin functions are compromised in large skin defects, a serious problem that can be fatal. The gold standard treatment is to use an autologous skin graft; however, due to donor site morbidity and limited availability, when full-thickness defects surpass 2% total body surface area (TBSA), skin substitutes are preferred. Unfortunately, current skin substitutes on the market: are slow to revascularize (2+ weeks), have low graft survival rates (<50% take), and lead to significant scarring and contracture. Fortunately, a promising solution is to prevascularize engineered skin substitutes in vitro, which has been shown to facilitate rapid tissue integration upon grafting by providing an intact vascular network that readily connects to the host’s circulation. However, current approaches for prevascularizing tissue constructs require long in vitro culture times or implement low extracellular matrix (ECM) density tissue constructs – both which are problematic in a clinical setting. To address this, we implemented a novel multitissue interface culture model to define the design parameters that were essential for rapid vascularization of soft tissue constructs in vitro. Here, we identified endothelial colony forming cell (ECFC) density and maintenance of cell-matrix tensional forces as important factors for rapid in vitro tissue vascularization (18% vessel volume percentage after 3 days of culture). We then applied these parameters to achieve rapid in vitro vascularization of dense, oligomer tissue constructs (12, 20, and 40 mg/mL). We demonstrated, for the first time, rapid in vitro vascularization at 3 days within dense matrices (ECM concentration > 10 mg/mL). Lastly, a rat full-thickness excisional wound model was developed to determine the acellular densified oligomer’s (20 and 40 mg/mL) ability to resist wound contraction and facilitate a wound healing response (recellularization and vascularization) when grafted into wounds. Future work will implement the vascularized, dense tissue constructs into the developed animal model to assess the vascularized graft’s efficacy on treating wounds to reduce scarring and contracture outcomes.